CN1997381B - 含有pacap及其衍生物的角膜神经突形成促进剂 - Google Patents

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Abstract

意欲提供用于角膜神经突形成促进剂，其中含有PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐，具体地，提供促进目的在于通过促进角膜神经突形成的作用而改进角膜感觉、治疗干眼症和治疗角膜上皮损伤的角膜神经突形成促进剂。该促进角膜神经突形成促进剂用作改善诸如激光角膜磨镶术(LASIK)和角膜移植或青光眼手术后的角膜感觉减弱、伴随角膜神经退化的角膜感觉减弱和伴随所述角膜感觉减弱的干眼症状和角膜上皮损伤。此外，将其用作改善干眼症患者中的干眼症状、角膜感觉减弱和角膜上皮损伤的药物，和用作改善角膜上皮损伤和伴随其的干眼症状以及角膜感觉减弱的药物。

Description

含有PACAP及其衍生物的角膜神经突形成促进剂
技术领域
本发明涉及用于促进角膜神经突形成的试剂、用于改进角膜敏感性的试剂、干眼症的治疗剂和角膜上皮损伤的治疗剂。本发明也涉及用于促进角膜神经突形成的试剂，其可以基于神经突形成促进作用改进角膜敏感性、治疗干眼症和治疗角膜上皮损伤。
背景技术
通常认为角膜敏感性在角膜手术，如屈光性角膜切削术(PRK)、激光辅助的原位角膜磨镶术(LASIK)或由于手术切断角膜神经而进行的角膜移植后发生，并且持续约3周到1年。例如，在LASIK后角膜神经明显切断(参见Linna，Tuuli U et al.，Experimental EyeResearch，1998，vol.66，p755-763)，在角膜中不能观察到神经图像或神经束太短以至于不能连接的区域，角膜敏感性降低(参见Linna，Tuuli U et al.，Investigative Ophthalmology & Visual Sciences，2000，vol.41，p393-397)。
提出了PRK或LASIK后角膜敏感性的降低导致泪腺的反应缓慢和泪液分泌减少(参见Robert T.Ang et al.，Current Opinion ofOphthalmology，2001，vol.12，p318-322)。角膜手术后角膜敏感性功能的降低导致患者眨眼频率降低，导致干眼症状。另一方面，在干眼症患者的情况下，流泪功能的降低导致角膜敏感性降低，这进一步破坏减少的流泪功能，结果导致角膜表面的严重症状。此外，PRK或LASIK导致的干眼症状干扰角膜的伤口愈合(参见Ang R.T.et al.，Current Opinion of Ophthalmology，2001，vol.12，p318-322)，在LASIK手术后观察到复发的角膜侵蚀(参见Solomon R.et al.，TheOcular Surface，2004，vol.2，p34-42)。
但是，目前，角膜手术导致的角膜敏感性降低的恢复仍然需要自发恢复。同样，在干眼症的治疗中，没有提供角膜敏感性恢复的积极治疗。在具有角膜神经退化的疾病如神经麻痹性角膜病、角膜溃疡或糖尿病角膜炎中也诱导角膜敏感性的降低。但是，还没有发现角膜敏感性降低的合适疗法。
VIP(血管活性肠肽)是由28个氨基酸残基组成的肽，其首先分离自猪肠道(参见，例如Said，S.I.et al.，Science，USA，1970，vol.169，p1217-1218)，并且具有多种生物活性，包括松弛消化道和血管的平滑肌。至于其对泪腺的作用，报道了VIP促进从泪腺分泌蛋白(参见，例如Dartt，D.A.et al.，American Journal of Physiology，1984，vol.247，pG502-509)。尽管WO 03/039577公开了用VIP衍生物作为干眼症的治疗剂，但其中没有关于角膜敏感性的描述。
PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活多肽)是由38个氨基酸残基组成的肽，在1989年，用激活下丘脑培养细胞的腺苷酸环化酶(其作为指标)的生物测定系统从绵羊的下丘脑分离了该肽，然后确定了其结构。存在两种类型的PACAP，即，由38个氨基酸残基组成的PACAP38和由PACAP38的27个N末端氨基酸残基组成的PACAP27(参见，例如Miyata A.et al.，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，1989，vol.164，p567-574)。PACAP的27个N末端氨基酸的氨基酸序列非常类似于VIP的序列。此外，认为VIP和PACAP属于胰高血糖素-促胰液素超家族，因为它们的氨基酸序列类似于促胰液素和胰高血糖素的序列。鉴定了三种类型的PACAP受体(PAC1、VPAC1和VPAC2)，VPAC1和VPAC2受体也具有对VIP的结合亲和力，其与对PACAP的结合亲和力类似(参见Vaudry D.et.al.，Pharmacological Review，2000，vol.52，p269-324)。除了舒张支气管平滑肌和扩张外周血管，PACAP的作用包括保护神经细胞，作为核心作用(参见，例如Arimura A.et al.，Annuals of New YorkAcademy of Science，1994，vol.739，p228-243)。尽管报道了PACAP促进培养的PC12细胞(其是非神经细胞)的细胞突起形成，没有报道PACAP对分布在角膜中的神经细胞或泪液分泌的作用(参见，例如Deutsch P.J.et al，The Journal of Biological Chemistry，1992，vol.267，p5108-5113)。
一些文献公开了基于PACAP和VIP的氨基酸序列差异合成的衍生物具有支气管扩张或降血压作用、增加血流的作用、毛发恢复作用、性行为激活作用(参见，例如JP-A 11-100399)、消化道运动抑制作用(参见，例如JP-A 2001-151799)和用于改善阿尔茨海默病、帕金森病等的神经突形成诱导作用(参见，例如JP-A 2001-226284)。但是，他们没有表明或提示所述衍生物具有角膜敏感性改进作用、泪液分泌促进作用或角膜上皮损伤治疗作用。
尽管WO 03/020281公开了促进神经元再生或轴突延长的化合物可以用于治疗LASIK手术等之后的角膜神经损伤，并且该化合物的一个例子是neotrophin(其是神经营养因子刺激物质)，但没有表明或提示VIP、PACAP或其衍生物的说明。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供用于改善角膜手术后角膜敏感性降低的药物组合物，所述手术如激光辅助的原位角膜磨镶术(LASIK)或角膜移植、伴随角膜神经退化性疾病的角膜敏感性降低，和伴随角膜敏感性降低的干眼症状或角膜上皮损伤，并且提供用于改善干眼症状、干眼症患者的角膜敏感性降低和角膜上皮损伤的组合物；进一步提供改善角膜上皮损伤和伴随角膜上皮损伤的干眼症状的角膜敏感性降低的组合物。
解决问题的手段
本发明的发明人进行了研究，以便提供用于改善角膜手术后的角膜敏感性降低和由于干眼症导致的角膜敏感性降低的药物组合物。结果，他们首次发现了PACAP及其在溶液状态下稳定性增加的新衍生物(下文中可以称作PACAP衍生物)在三叉神经细胞(下文中也可以称作角膜神经细胞)中具有神经突形成促进作用，因此具有角膜敏感性改进作用以及泪液分泌促进作用和角膜上皮创伤愈合作用。它们基于这些发现进行了进一步研究，结果，完成了本发明，其中将PACAP和PACPA衍生物用作药物，用于促进角膜神经突形成，用于改进角膜敏感性，用于治疗干眼症，和用于治疗角膜上皮损伤。
因此，本发明涉及：
(1)促进角膜神经突形成的试剂，包括PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(2)改进角膜敏感性的试剂，包括PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(3)干眼症的治疗剂，包括PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(4)角膜上皮损伤的治疗剂，包括PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(5)上文(1)的促进角膜神经突形成的试剂，其中所述PACAP衍生物是肽(SEQ ID Nos.1-14)或其药学可接受的盐，所述肽包含下面式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12    (I)
其中，
X1代表Val或Ile；
X2代表Asp、Ala或Glu；
X3代表Asn或Ser；
X4代表Thr或Ser；
X5代表Leu或Tyr；
X6、X8和X9代表Lys或Arg；
X7代表Leu或Nle；
X10代表Ile、Val或化学键；
X11代表Leu、Leu-Asn、Leu-Gly、Leu-Gly-Lys、Leu-Gly-Arg、Leu-Gly-Lys-Lys、Leu-Gly-Lys-Arg、Leu-Gly-Arg-Arg、Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys、Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg或化学键；并且
X12修饰C-末端氨基酸的α-羧基，并且代表-NH2或-OH；
(6)上文(2)的改进角膜敏感性的试剂，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(7)上文(3)的干眼症的治疗剂，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(8)上文(4)的角膜上皮损伤治疗剂，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(9)上文(5)的促进角膜神经突形成的试剂，其中所述PACAP衍生物是上文式(I)所示的肽，其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，并且X11是Leu-Gly-Arg-Arg；
(10)上文(6)的改进角膜敏感性的试剂，其中所述PACAP衍生物是上文式(I)所示的肽，其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，并且X11是Leu-Gly-Arg-Arg；
(11)上文(7)的干眼症的治疗剂，其中所述PACAP衍生物是上文式(I)所示的肽，其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，并且X11是Leu-Gly-Arg-Arg；
(12)上文(8)的角膜损伤的治疗剂，其中所述PACAP衍生物是上文式(I)所示的肽，其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，并且X11是Leu-Gly-Arg-Arg；
(13)PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备用于促进角膜神经突形成的试剂中的用途。
(14)上文(13)的用途，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(15)PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备用于改进角膜敏感性的试剂中的用途。
(16)上文(15)的用途，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(17)PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备干眼症的治疗剂中的用途；
(18)上文(17)的用途，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(19)PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备角膜上皮损伤的治疗剂中的用途；
(20)上文(19)的用途，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(21)促进角膜神经突形成的方法，该方法包括给有需要的受试者施用有效量的PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(22)上文(21)的方法，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(23)改进角膜敏感性的方法，该方法包括给有需要的受试者施用有效量的PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(24)上文(23)的方法，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(25)治疗干眼症的方法，该方法包括给有需要的受试者施用有效量的PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(26)上文(25)的方法，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
(27)治疗角膜上皮损伤的方法，该方法包括给有需要的受试者施用有效量的PACAP、PACAP衍生物或其药学可接受的盐；
(28)上文(27)的方法，其中所述PACAP衍生物是包含上文式(I)所示肽从N-末端开始的至少23个残基的肽或其药学可接受的盐；
此处用到的“角膜神经”是在三叉神经的控制下，该三叉神经是感觉神经，是指围绕角膜形成的环状神经丛，以网状形式分布在角膜基质中的基质内神经丛，在Bowman膜下形成的表皮下神经丛，在跨Bowman膜的部位形成的基底细胞神经丛，和神经纤维。此处用到的“神经突”是指从神经元(神经细胞)伸出的突起(树突和轴突)，“形成”是指上文定义的神经突在细胞上形成和/或延伸。
本发明的效果
由于本发明的包含PACAP或PACAP衍生物的药物组合物具有对三叉神经细胞中的神经突形成的促进作用，角膜敏感性改进作用、泪液分泌促进作用和角膜上皮创伤愈合促进作用，它可以用于(1)改进由角膜神经损伤等导致的角膜敏感性降低和改善伴随角膜敏感性降低的干眼症状和角膜上皮损伤；(2)改善干眼症状、干眼症患者中的角膜敏感性降低和角膜上皮损伤；和(3)改善角膜上皮损伤和伴随角膜上皮损伤的角膜敏感性降低和干眼症状。
附图简述
图1显示了测试实施例1中培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像。示出了(A)未添加组，(B)PACAP27(1μM)添加组和(c)17号肽(1μM)添加组的细胞。条＝100μm。
图2显示了测试实施例1中细胞总数中神经突形成细胞的比例(％)。纵轴显示了总细胞中神经突形成细胞的比例。图中的符号＊＊＊表示相对于未添加组的显著差异(p＜0.001)。
图3显示了测试实施例2中兔角膜敏感性的时间依赖性改变。图中的符号＊和＊＊表示相对于对照组的显著差异(＊：p＜0.05；＊＊：p＜0.005)。
图4显示了测试实施例3中从兔分离的泪腺的蛋白分泌率的时间依赖性改变。图中的符号＊表示相对于对照组的显著差异(p＜0.05)。
图5显示了测试实施例4中培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像。示出了(A)未添加组，(B)PACAP27(1μM)添加组和(c)24号肽(1μM)添加组的细胞。条＝100μm。
图6显示了测试实施例4中检验的PACAP27和24号肽的神经突形成促进作用。纵轴显示了总细胞中神经突形成细胞的比例(％)。图中的符号＊表示相对于未添加组的显著差异(p＜0.05，每组三个样品，平均值±标准差)。
图7显示了测试实施例5中从兔分离的泪腺的蛋白分泌率。图中的符号＊表示相对于未添加组的显著差异(p＜0.05，每组三个样品，平均值±标准差)。
图8显示了测试实施例6中兔泪液分泌量的时间依赖性改变。图中的符号＊表示相对于未添加组的显著差异(p＜0.05，每组10个样品，平均值±标准差)。
图9显示了测试实施例7中切断兔角膜神经之前和之后角膜敏感性的改变。纵轴表示用于测量角膜敏感性的触觉测量器中尼龙丝的长度。水平轴显示建立角膜瓣(切断角膜神经)后的时间(周)。每个测量值表示为平均值(对照组中8个样本，用24号肽的滴眼液的组中7个样本)±标准差。图中的符号＊表示相对于对照组的显著差异(p＜0.05)。
图10显示了测试实施例8中将24号肽或PACAP27加入细胞时培养的人角膜上皮细胞的增殖。纵轴显示了测试物质添加组的细胞数目相对于对照组的细胞数目的比例(％)。图中的符号＊表示相对于对照组的显著差异(平均值±标准误，n＝8-16，p＜0.05)。
图11显示了测试实施例9中兔角膜创伤愈合中的改变。纵轴显示了角膜上皮缺损区的剩余(％)。水平轴表示时间(小时)。用10μM和100μM PACAP27作为滴眼液的组显示出相对于对照组的显著差异(＊p＜0.05vs.对照组，Dunnet检验，平均值±标准差)，N＝4：对照组和100μM PACAP27组，N＝5：10μM PACAP27组)。
实施本发明的最佳方式
在本发明使用的肽中，PACAP是PACAP27(SEQ ID No.15)或PACAP38(SEQ ID No.16)肽。PACAP的衍生物是通过用其它氨基酸取代构成PACAP的部分氨基酸、通过将其它氨基酸插入PACAP的氨基酸序列或通过去除PACAP的部分氨基酸而制备的。具体地，所述肽优选包含式(I)所示氨基酸序列或其药学可接受的盐。式(I)所示的肽的N末端可以是氨基，或在需要时进行化学修饰。由于PACAP(Kitada，C.et al.，Peptide Chemistry，1990，239-244，1991)或VIP(Onoue，S.et al.，Eur.Journal Pharamacol.，485：307-16，2004)的最小活性单位包含从N-末端开始的23个氨基，本发明的PACAP衍生物必须保留从N-末端开始的至少23个残基。式(I)所示的代表性的肽的实例示于表1。此处示出的1-24号肽相应于SEQ ID Nos.17-40示出的肽，1、13、15、22和23号肽是从N-末端开始的23个残基组成的肽，乙酰基连接于4、19和23号肽的N-末端氨基，硬脂酰基连接于5号肽的N-末端氨基。在这些肽中，优选的是1、3、12、14、16、17、20、22和24号肽，更优选的是17和24号肽。
[表1]
  *   X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7   X8   X9   X10   X11   X12
  1   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   -   -   NH2
  2   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Lys   Leu   Lys   Lys   Ile   Leu-Asn   NH2
  3   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  4   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  5   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  6   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   OH
  7   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Nle   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  8   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly   NH2
  9   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Lys   NH2
  10   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg   NH2
  11   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Lys-Arg   NH2
  12   Val   Glu   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  13   Val   Glu   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   -   -   NH2
  14   Val   Ala   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  15   Val   Ala   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   -   -   NH2
  16   Val   Asp   Asn   Thr   Leu   Arg   Leu   Arg   Arg   Val   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  17   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Val   Leu-Gly-Arg-Arg   OH
  18   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  19   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Val   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
  20   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Val   Leu-Gly-Arg-ArgTyr-Arg-Gln-ArgVal-Arg-Asn-Arg   NH2
  21   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Ile   Leu-Gly-Arg-ArgTyr-Arg-Gln-ArgVal-Arg-Asn-Arg   NH2
  22   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   -   -   NH2
  23   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   -   -   NH2
  24   Ile   Asp   Ser   Ser   Tyr   Arg   Leu   Arg   Arg   Val   Leu-Gly-Arg-Arg   NH2
＊：肽编号
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12    (I)
(其中X12代表C-末端氨基酸的α-羧基修饰)
包含从式(I)所示肽的N-末端开始的至少23个残基的肽如下式所示：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-X13    (I’)
(其中X13代表X12、Ala-X12或Ala-Ala-X10-X11-X12)。
本发明化合物的药学可接受的盐的实例包括与碱金属，如钠和钾形成的盐；与碱土金属，如钙和镁形成的盐；与无机碱形成的盐，如铝盐和铵盐；与有机碱，如三甲胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺和N，N-二苄基乙二胺形成的盐；与无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸形成的盐；与有机酸，如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸形成的盐；和与聚合酸如丹宁酸、羧甲基纤维素、聚乳酸和聚乙醇酸等形成的盐。
可以通过常规公知的肽合成方法合成用于本发明的肽，例如，根据“The Peptides”，vol.1，1966，Schreder and Luhke，Academic Press，New York，U.S.A.or“Peptide Synthesis”，Izumiya et.al.，MaruzenCo.，1975中的描述，包括，但不限于叠氮化物法、酸氯化物法、酸酐法、混合的酸酐法、DCC法、活性酯法(如对硝基苯酯法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法、氰基甲基酯法等)、采用Woodward′s试剂K的方法、碳咪唑法、氧化-还原法、DCC-加合物(HONB、HOBt、HOSu)法。上述方法可以用于固态合成或液相合成。
在本发明中，通过上述常规多肽合成法完成肽合成，例如，通过所谓的逐步法，其包括在末端氨基酸后逐个连续缩合氨基酸，或通过包括偶联一些肽片段的方法。
可以按照下文，根据Merrifield法(Merrifield，R.B.，Solid PhasePeptide Synthesis，J.Amer.Chem.Soc.，85，2149-2159，1963)，通过逐步法进行固相合成。首先，通过其羧基将C-末端氨基酸(其氨基被保护)结合于不溶性树脂。然后，除去C-末端氨基酸的氨基的保护基。根据需要的肽的氨基酸序列，通过缩合反应在由此获得的游离反应性氨基上偶联氨基受保护的氨基酸的反应性羧基。在通过该方法逐步合成完整序列后，使合成的肽从不溶性树脂脱离。
只要反应性羧基能够连接于不溶性树脂，可以将任何不溶性树脂用于上述固相合成。不溶性树脂的实例包括二苯甲基胺树脂(BHA树脂)、氯甲基树脂、氧甲基树脂、氨基甲基树脂、甲基二苯甲基树脂(MBHA树脂)、4-氨基甲基苯氧基甲基树脂、4-羟基甲基苯氧基甲基树脂和4-氧甲基苯基乙酰氨基甲基树脂。
当将9-芴基甲氧羰基(Fmoc)用作α-氨基的保护基时，优选使用可以用四氟乙酸(TFA)使肽从其上脱离的树脂，如4-羟基甲基苯氧基甲基树脂。当将叔丁氧羰基(Boc)用作α-氨基的保护基时，优选使用可以用氟化氢使肽从其上脱离的树脂，如4-氧甲基苯基乙酰氨基甲基树脂(PAM树脂)。每1g树脂的肽量优选是0.5mmol或更少。
上述方法需要将保护基与参与氨基酸之间的肽键的氨基偶联，去除保护基和活化参与氨基酸之间的肽键的羧基。
氨基的保护基的实例包括苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、叔氨氧羰基(Aoc)、异冰片基氧羰基、对-甲氧基苄基氧羰基、2-氯-苄基氧羰基、金刚烷基氧羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、邻-硝基苯基亚磺基和diphenylphosphinothioyl。
在侧链具有官能团的氨基酸，如His、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg和Ser的情况下，优选保护侧链的官能团。官能团的保护是通过根据常规方法连接下文提到的常规保护基而实现的。在反应后除去保护基。
His的亚氨基的保护基的实例包括苄氧甲基(Bom)、对-甲苯磺酰基(Tos)、苄基(Bzl)、苄氧羰基(Z)和三苯甲基。
尽管可以通过酯化或醚化保护Ser和Thr的羟基，保护不是必须的。适于酯化的基团的实例包括烷酰基，如乙酰基、芳酰基，如苯甲酰基，和衍生自碳酸的基团如苯甲酰氧羰基或乙氧羰基。适于醚化的基团的实例包括苄基(Bzl)、四氢吡喃基和叔丁基。
Tyr的羟基的保护基的实例包括苄基(Bzl)、溴苄氧羰基(Br-Z)、二氯苄基(Cl2-Bzl)、苄氧羰基(Z)、乙酰基和对-甲苯磺酰基(Tos)。
Lys的氨基的保护基的实例包括苄氧羰基(Z)、氯苄氧羰基(Cl-Z)、二氯苄基(Cl2-Bzl)、叔丁氧羰基(Boc)和对-甲苯磺酰基(Tos)。
Arg的胍基的保护基的实例包括对-甲苯磺酰基(Tos)、硝基、苄氧羰基(Z)、和叔氨氧羰基(Aoc)。
Asp的羧基通过用例如苯甲醇、甲醇、乙醇、叔丁醇、环己基(cHex)等酯化而保护。
Trp的吲哚基的保护基的实例包括甲酰基、苄氧羰基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基和2，2，2-三氯乙氧羰基，但保护不是必须的。
可以通过转化为甲基亚砜然后还原而保护Met的硫甲基，但保护不是必须的。
可以通过常规方法活化羧基，用于该方法的试剂可以合适地选自公知的试剂。例如，通过以下方法活化羧基：使羧基与多种试剂反应形成相应的酸氯化物、酸酐或混合的酸酐、叠氮化物、活化的酯(与五氯苯酚、对-硝基苯酚、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺等形成的酯)等。
只要溶液可以用于肽键形成，可以将任何溶剂用于反应性氨基和反应性羧基之间的上述固相缩合反应(肽键形成反应)。溶剂的实例包括作为单一溶剂的无水或水合的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、吡啶、氯仿、二噁烷、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮和六甲基磷酸三酰胺(HMPA)或其中两种或更多种的混合溶剂。
可以在缩合剂的存在下实施上述缩合反应，所述缩合剂例如碳二亚胺试剂，如二氯己基碳二亚胺(DCC)或碳二咪唑、四乙基焦磷酸酯、苯并三唑-N-六氟磷酸羟基三二甲基氨基鏻(Bop试剂)等。
可以通过常规方法对合成的肽进行脱盐和纯化，例如，在DEAE-纤维素等上进行离子交换层析，在Sephadex LH-20、Sephadex G-25等上进行分配层析，在二氧化硅凝胶等上进行正常相层析，在ODS-二氧化硅凝胶等上进行反向层析，高效层析等。
本发明的药物组合物用作在哺乳动物(如人、猴、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、犬科动物和猫科动物)和鸟类(家禽、鸽子和火鸡)中促进角膜神经突形成和改进角膜敏感性降低、干眼症状和角膜上皮损伤的疗法。也就是说，本发明的药物组合物用作改进由损伤、角膜神经切断或缺陷导致的角膜敏感性降低，用于改善伴随角膜敏感性降低的干眼症状和角膜上皮损伤的疗法。此外，本发明的药物组合物用作改善不依赖于角膜敏感性降低而发生的干眼症状和角膜损伤的疗法。例如，本发明的药物组合物用作改进由角膜手术而导致的角膜敏感性功能降低的疗法，所述手术如青光眼手术、PRK、LASIK、LASEK(激光上皮角膜磨镶术；Jatta Horwath-Winter et al.，J.CataractRefract Surg.，30：2316-2321，2004)或角膜移植；作为改进与包括神经麻痹性角膜炎、角膜溃疡和糖尿病角膜病的角膜神经退化性疾病相关的角膜敏感性功能降低的疗法；和作用改善干眼症和伴随角膜敏感性降低的角膜上皮损伤的治疗剂。本发明的药物组合物也用作改善泪液缺乏、干燥综合征、干性角结膜炎或Steven-Johnson综合征的患者中的干眼症状疗法；和作为改善与包括角膜上皮糜烂、睑缘炎、眼天疱疮、春季卡他和过敏性结膜炎或VDT(视觉显示终端)工作的疾病相关的干眼症状和角膜敏感性降低以及伴随干眼症状的角膜上皮损伤的疗法。本发明的药物组合物也用作改善与角膜上皮糜烂、睑缘炎、眼天疱疮、春季卡他和过敏性结膜炎等相关的角膜上皮损伤和伴随角膜上皮损伤的干眼症状和角膜敏感性降低的疗法。
本发明的药物组合物是系统或局部施用。系统施用包括口服施用和肠胃外施用，包括静脉内注射、皮下注射和肌内注射。通过滴眼进行局部施用。
本发明的药物组合物可以配制成各种剂型，包括固体剂型，如粉末、颗粒、片剂、胶囊或栓剂，也包括液体剂型，如糖浆、注射液或滴眼液。对于胶囊和片剂，可以用赋形剂(如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、晶体纤维素等)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙等)、崩解剂(如淀粉、carmellose sodium、碳酸钠等)、粘合剂(如淀粉糊、羟丙基纤维素溶液、carmellose溶液、阿拉伯树胶溶液、明胶溶液、藻酸钠溶液等)等制备需要的剂型。可以用合适的包衣剂(如明胶、蔗糖、阿拉伯树胶、巴西棕榈蜡等)、肠衣剂(如乙酸纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸酯共聚物、羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素等)等包被颗粒和片剂。
可以通过以下方法制备胶囊：在本发明的化合物中加入合适的赋形剂，如用于改进流动性和润滑性的硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉或轻硅酸酐和用于产生加压的流动性的晶体纤维素或乳糖，上述赋形剂等；将其混合或均匀粒化；如果必要，用合适的包衣剂包被得到的颗粒；然后用得到的混合物或颗粒填充胶囊壳。或者可以通过用胶囊基包被上述混合物或颗粒而制备胶囊，所述胶囊基的可塑性可通过在合适的胶囊基(如明胶)中加入甘油、山梨糖醇等而增加。如果必要，所述胶囊可以包含色素、防腐剂[如二氧化硫或对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或丙酯)]等。所述胶囊可以是常规胶囊或者可以是肠衣胶囊、在胃内具有抗性的胶囊或控释胶囊。可以通过以下方法制备肠胶囊：用肠衣剂包被化合物，如果必要，将化合物与上述赋形剂混合，然后用得到的化合物或混合物填充常规胶囊。或者，可以用肠衣剂包被胶囊本身，或可以用肠衣聚合物作为胶囊基形成胶囊。
可以用合适选择的栓剂基(如可可脂、macrogol等)制备栓剂。
可以用合适选择的稳定剂(如乙二胺四乙酸钠等)、悬浮剂(如阿拉伯树胶、carmellose等)、校正剂(如简单的糖浆、葡萄糖等)、调味剂等制备糖浆。
当将本发明的药物组合物配制为注射液或滴眼液时，可以通过将本发明的化合物溶解或分散在含有合适的药学可接受的添加剂的溶液中而制备需要的剂型，所述添加剂如等渗剂(如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、聚乙二醇等)、缓冲剂(如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris缓冲液、谷氨酸缓冲液、ε-氨基己酸缓冲液等)、防腐剂(如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、乙二胺四乙酸钠、硼酸、硼砂等)、增稠剂(如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素等)、稳定剂(如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等)、pH调节剂(如盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等)等。
糖浆、注射液或滴眼液中添加剂的量根据要添加的添加剂的种类和目的等而改变，添加剂的量使得能够达到实现添加剂的目的足够的浓度。糖浆、注射液或滴眼液中通常含有大约0.5-大约5.0w/v％的等渗剂，使得渗透压为大约229-大约343mOsm。糖浆、注射液或滴眼液中含有大约0.01-大约2.0w/v％的缓冲液。糖浆、注射液或滴眼液中含有大约0.01-大约1.0w/v％的增稠剂。糖浆、注射液或滴眼液中含有大约0.001-大约1.0w/v％的稳定剂。适当添加pH调节剂，使得糖浆、注射液或滴眼液的pH为大约pH3-大约pH9，优选大约pH4-大约pH8。
具体地，在滴眼液的情况下，滴眼液中的肽浓度通常是至少大约0.00001w/v％、大约0.00005w/v％或0.0001w/v％，最多大约0.1w/v％、大约0.05w/v％、大约0.01w/v％、大约0.005w/v％或大约0.001w/v％。
在本发明中，肽的剂量根据要治疗的疾病和症状、要施用的受试者、施用方法等而改变。例如，当在LASIK手术后给成年患者的眼局部施用改进角膜敏感性的试剂时，可以以每次大约20-大约50μL的量每天施用数次含有大约0.001w/v％肽的滴眼液。
也可以将本发明的药物组合物与其它药学有效的成分联合使用，只要它们不干扰本发明的目的。
将参考以下实施例详细对本发明作进一步解释，以下实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1
肽的合成
通过用于固相肽合成的常规方法制备具有SEQ ID No.19中所示氨基酸序列的3号肽。
将MBHA树脂的盐酸盐(聚苯乙烯-1％二乙烯基苯共聚物，100-200目)置于人工合成反应器(由玻璃制成，6.0cm(直径)×29.5cm(高度))，在搅拌下用树脂体积2-3倍的甲醇洗涤，然后在搅拌下用二氯甲烷(树脂体积的2-3倍)洗涤，使树脂膨胀。用二氯甲烷中的10％三乙胺中和树脂，通过使用二环己基碳二亚胺和N-羟基苯并三唑，用大约2当量的相应于C-末端氨基酸的Boc-Arg(Tos)-OH进行缩合。在缩合反应进行大约2小时(搅拌下)后，用甲醇和二氯甲烷洗涤树脂。通过Kaiser测试证实α-氨基消失后，用二氯甲烷中的50％三氟乙酸处理树脂30分钟，使α-氨基去保护。然后，用二氯甲烷中的10％三乙胺中和树脂，用甲醇和二氯甲烷再次洗涤。随后，通过Kaiser测试证实去保护。此后，重复上述相同程序，将从C-末端开始的第二个氨基酸Boc-Arg(Tos)-OH偶联到树脂。随后，按以下顺序进行Boc-Gly-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Val-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln(Xan)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH，Boc-Asn(Xan)-OH，Boc-Asp(OcHex)-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe-OH，Boc-Val-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHex)-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH和Boc-His(Bom)-OH的偶联/去保护反应，以获得相应于3号肽的受保护的肽：His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala-Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Cl2-Bzl)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Cl2-Bzl)-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg(Tos)-Arg(Tos)-MBHA。在乙二硫醇和苯甲醚的存在下使由此获得的受保护的肽-MBHA树脂与无水氟化氢反应。反应后，通过在真空中蒸发而除去无水氟化氢。用醚洗涤残留物后，在残留物中加入10％的乙酸，以提取肽。通过反相柱层析纯化提取溶液，然后冻干获得3号肽。
以与上文所述相同的途径化学合成以下PACAP27、PACAP38和1-24号肽。
PACAP27(SEQ ID No.15)：
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2
PACAP38(SEQ ID No.16)：
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2
1号肽(SEQ ID No.17)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
2号肽(SEQ ID Nos.18)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Asn-NH2
3号肽(SEQ ID No.19)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
4号肽(SEQ ID No.20)：
乙酰-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
5号肽(SEQ ID No.21)：
硬脂酰-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Lue-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
6号肽(SEQ ID No.22)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-OH
7号肽(SEQ ID No.23)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Nle-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
8号肽(SEQ ID No.24)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-NH2
9号肽(SEQ ID No.25)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-NH2
10号肽(SEQ ID No.26)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gy-Arg-NH2
11号肽(SEQ ID No.27)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Lys-Arg-NH2
12号肽(SEQ ID No.28)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
13号肽(SEQ ID No.29)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Arg-Lue-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
14号肽(SEQ ID No.30)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
15号肽(SEQ ID No.31)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ala-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Vla-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
16号肽(SEQ ID No.32)：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Tyr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
17号肽(SEQ ID No.33)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-OH
18号肽(SEQ ID No.34)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
19号肽(SEQ ID No.35)：
乙酰-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
20号肽(SEQ ID No.36)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2
21号肽(SEQ ID No.37)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Ile-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg-NH2
22号肽(SEQ ID No.38)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
23号肽(SEQ ID No.39)：
乙酰-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-NH2
24(SEQ ID No.40)：
His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH2
测试实施例1
对培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成的促进作用(1)
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd.购买的日本白兔(2-3日龄)。
2.测试物质
PACAP27和17号肽
3.测试方法
(1)细胞培养
根据Chan等(Kwan Y.Chan and Richard H.Haschke，Exp.EyeRes.41：687-699，1985)报道的方法分离兔三叉神经细胞。在乙醚麻醉下用生理盐水对兔进行心脏灌注。从兔切下三叉神经节，然后分散在神经分散液(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)中以制备三叉神经细胞。在5％CO2和95％空气中，100％湿度和37℃的温度下，在补加了B27补充物(Invitrogen Corp；终浓度：2％v/v)和L-谷氨酰胺(Invitrogen Corp；终浓度：1mM)的Neurobasal培养基(InvitrogenCorp)中培养三叉神经细胞。以大约3×103个细胞/孔，将细胞接种在24孔板中的聚赖氨酸/昆布氨酸包被的盖玻片(Sumitomo BakeliteCo.，Ltd.)上。将PACAP27(终浓度：1μM)或17号肽(终浓度：1μM)加入培养基，并且将没有加入这两种物质的培养基作为对照(未添加组)。
(2)染色
培养48小时后，用4％的低聚甲醛在室温下将兔三叉神经细胞固定2小时。用特异性识别构成神经细胞体和神经突的神经丝的抗神经丝200抗体(Sigma)和与抗神经丝200抗体反应的荧光第二抗体(Molecular Probes，Inc.)用于对固定的样品进行荧光染色。用荧光显微镜观察染色的细胞，将细胞图像扫描到计算机。
(3)图像分析
为了评估培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成，用图像分析软件(Image-Pro Plus ver.4.0，Planetron，Inc.)测量扫描到计算机中的染色的细胞图像中最长的神经突和细胞体主轴的长度。测量了每个组中3个孔的细胞。神经突长度比细胞体主轴长度长2或3倍的细胞定义为神经突形成细胞。计算总细胞数目中神经突形成细胞的比例(％)(Otori，Y.，Wei，J.Y.，Barnstable，C.J.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sic.，(1998)39，972-981)。
4.测试结果
图1显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像，并且示出了(A)未添加组，(B)PACAP27添加组和(C)17号肽添加组。在未添加组中，观察到了通过荧光免疫染色而染色的具有伸长的神经突的神经突形成细胞。在PACAP27添加组和17号肽添加组中，观察到了更大数目的神经突形成细胞。
图2显示每个添加组中神经突细胞在总细胞数目中的比例(％)。对照组中神经突形成细胞的比例(％)是24.1％，PACAP27添加组是59.5％，17号肽添加组是54.1％。作为统计学分析的结果，与未添加组相比，PACAP27添加组和17号肽添加组显示了对神经突形成的显著促进作用(N＝3，平均值±标准差，＊＊＊：p＜0.001vs未添加组，Dunnett’s多重比较分析)。
如上述结果可见，PACAP27和17号肽对培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成具有促进作用。
测试实施例2
对微型角膜刀导致的兔角膜敏感性降低的改进作用(1)
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd购买的体重为1.5-2.0kg的日本白兔。将每只动物放在室内分开的笼子中，其中保持23±3℃的温度和55±10％的湿度，每天光照12小时(8:00光照开始，20:00光照结束)，在到达后进行饲养，直到测试的最后一天。每天给予动物100g固体饲料(Labo R Stock，Nosan Corporation)，可以自由引用自来水。
2.测试物质
将PACAP27用作测试物质。将测试物质以10μM(大约0.003％)溶解于以下载体(vehicle)溶液，以制备滴眼液。作为对照，使用了以下不含测试物质的载体溶液。
载体溶液的配方：
二水合磷酸二氢钠    0.1g
氯化钠              0.9g
氢氧化钠            适量
纯净水              适量
100 mL(pH 7.0)
3.测试方法
(1)分组
在滴眼液开始施用前一天，肉眼观察动物的前眼，同时观察荧光素染色的角膜斑点。选择了通过观察没有发现异常的兔。在施用滴眼液开始前，用Cochet-Bonnet触觉计(Luneau)测量选择的兔的角膜敏感性的初始值。用SAS临床前软件包(5.0版，SAS institute Japan)通过多变量区块分配方法将兔分组，使得所有组中初始的角膜敏感性是相同的。
(2)建立角膜瓣
通过肌内注射(0.9 mL/kg)比例为0.5∶1的Ceractal(2％甲苄噻嗪)和Ketaral(5％氯胺酮)的混合物对动物进行全身麻醉。对眼球充分暴露后，将兔眼的适配器连接到抽吸环内。用带有厚度为130μm的刀刃的微型角膜刀(MK2000，Nidek Co.，Ltd.)(Arbelaez，M.C.et al.，J.Refract.Surg.2002，May-jun；18(3 Suppl)：S357-60)建立直径为8.5mm的角膜瓣。在显微镜下将角膜瓣精确返回到最初的位置，使动物从麻醉中苏醒，同时观察动物，使得角膜瓣不移动。
(3)施用
通过从建立角膜瓣当日起的8周中滴眼而施用含测试物质的滴眼液或施用载体溶液。用微移液管，以每次50μL的量，以2小时的间隔每日4次给手术后的眼施用滴眼液或载体溶液。在手术后1周的时间，通过每日滴眼4次施用0.3％氧氟沙星滴眼液(Tarivid滴眼液，Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.)，同时施用测试滴眼液。
(4)测量角膜敏感性
从手术后第1周到手术后第8周，用Cochet-Bonnet触觉计每周一次测量角膜敏感性。测量是盲法试验，因此检查者不知道测量的兔属于哪一组。
(5)统计学分析
为进行统计学分析，使用了两组t检验(SAS临床前软件包；5.0版，SAS Institute Japan)，确定显著性水平是小于5％。
4.测试结果
图3显示了角膜敏感性的时间依赖性改变。角膜敏感性由连接Cochet-Bonnet触觉计的尼龙丝(直径：0.12mm)的尖端接触角膜中心时诱导眨眼反应的尼龙丝的最长长度表示，最长长度示于图3的纵轴。手术后第1周，在载体溶液施用组和PACAP27施用组发现角膜敏感性的急剧下降。此后，在载体溶液施用组和PACAP27施用组发现角膜敏感性的缓慢恢复。在每个测量点将PACAP27施用组的角膜敏感性与载体溶液施用组的角膜敏感性相比时，PACAP27施用组的角膜敏感性在开始施用后3、4、5和8周显著高(n＝6-7，平均值±标准差，＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，t检验)。
激光辅助的原位角膜磨镶术(LASIK)中，用微型角膜刀建立角膜瓣(角膜片)被折叠起来，暴露角膜基质，用受激准分子激光器辐射磨损角膜基质，以校正折射误差。然后，将角膜瓣返回到最初位置。在该测试实施例中，用微型角膜刀检验了本发明的药物组合物对角膜敏感性降低的兔模型的作用。从上文描述的结果可以看出，PACAP27可以促进角膜敏感性降低的恢复。
测试实施例3
对切除的泪腺分泌蛋白的促进作用(1)
从兔切除泪腺，然后用PACAP27或17号肽处理。检验了PACAP27和17号肽对蛋白分泌量增加的药理学作用。
1.测试物质溶液的制备
(a)将纯净水加入氯化钠(137.92g)、氯化钾(7.01g)、二水合氯化钙(3.53g)和六水合氯化镁(1.2g)，使总体积为1000mL(溶液1)。将纯净水加入磷酸二氢钾(8.17g)，使总体积为500mL(溶液2)。将溶液1(50mL)和溶液2(10mL)加入900mL纯净水，在得到的溶液中溶解葡萄糖(2.07g)和碳酸氢钠(2.1g)。将得到的溶液的总体积调节到1000mL(pH大约7.4)，将其用作培养溶液。使95％氧气和5％二氧化碳的混合气体通过培养溶液。
(b)将PACAP27或17号肽溶解于培养溶液，达到10-7M的浓度，将其用作测试物质溶液。将具有毒蕈碱激动剂活性的Carbachol(Nacalai Tesque，Inc.)溶解于培养溶液，达到10-4M的浓度，将其用作药物的对照(carbachol添加组)。将没有加入药物的培养溶液作为对照组。
2.制备泪腺分泌切除样品
对雄性日本白兔进行普通麻醉，通过腹主动脉用灌注溶液(含有116mM氯化钠和5.4mM氯化钾)进行灌注。从兔切除主泪腺组织。从切除的主泪腺组织除去脂肪结缔组织后，将主泪腺组织分成两个相等的切片(每个切片大约40mg)。将泪腺切片转移到添加了0.5mL/孔培养溶液的24孔板，然后在37℃下温育。每20分钟用新鲜的培养溶液更换培养溶液，共3次。温育总共进行60分钟，以获得稳定状态的泪腺切片样品。
3.实验方法
(a)37℃下在0.5mL新鲜的培养溶液中将稳定状态的切片样品温育20分钟。然后收集培养溶液。采用蛋白染色试剂(DC蛋白测定试剂，Bio Rad)确定培养溶液中的蛋白量，转化为每1mg湿样品的蛋白分泌量。假定由此获得的蛋白分泌量是100％的蛋白分泌率，认为这是处理前的分泌率。
(b)用0.5mL测试物质溶液更换(a)的温育后的切片样品的培养溶液。用新鲜的测试物质溶液更换测试物质溶液，然后每20分钟收集5次。采用蛋白染色试剂确定收集的溶液中的蛋白量。以相同的方式，作为对照组，在培养溶液中温育切片样品，用新鲜的培养溶液更换该培养溶液，确定培养溶液中的蛋白量。
4.结果
实验结果示于图4。纵轴表示当假定处理前的分泌率是100％时，兔的切除的泪腺的分泌率(n＝6，平均值±标准差)。水平轴表示时间。在carbachol添加组中，显示了蛋白分泌率的显著增加，峰值在0-20分钟的时间。在用10-7M PACAP27或17号肽处理的组中，蛋白分泌率在开始处理后20分钟及此后显著增加，然后在开始治疗后40-60分钟达到最大值(＊；p＜0.05，Dunnett’s多重比较分析)。与carbachol添加组相比，PACAP27或17号肽添加组中药物作用持续时间更长。在对照组中，没有观察到蛋白分泌率的所述增加。
从上述结果可以看出，PACAP27和17号肽对切除的泪腺中的蛋白分泌具有显著的促进作用。也就是说，PACAP27和17号肽对泪液分泌具有促进作用，因此可以用于治疗干眼症状。
测试实施例4
对培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成的促进作用(2)
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd.购买的日本白兔(2-3日龄)。
2.测试物质
PACAP27和24号肽
3.测试方法
(1)细胞培养
根据Chan等(Kwan Y.Chan and Richard H.Haschke，Exp.EyeRes.41：687-699，1985)报道的方法分离兔三叉神经细胞。在乙醚麻醉下用生理盐水对兔进行心脏灌注。从兔切下三叉神经节，然后分散在神经分散液(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)中以制备三叉神经细胞。在5％ CO2和95％空气中，100％湿度和37℃的温度下，在补加了B27补充物(Invitrogen Corp；终浓度：2％v/v)和L-谷氨酰胺(Invitrogen Corp；终浓度：1mM)的Neurobasal培养基(InvitrogenCorp)中培养三叉神经细胞。以大约3×103个细胞/孔，将细胞接种在24孔板中的聚赖氨酸/昆布氨酸包被的盖玻片(Sumitomo BakeliteCo.，Ltd.)上。将PACAP27(终浓度：0.1μM，1μM)或24号肽(终浓度：0.1μM，1μM)加入培养基，并且将没有加入这两种物质的培养基作为对照(未添加组)。
(2)染色
培养48小时后，用4％的低聚甲醛在室温下将兔三叉神经细胞固定2小时。用特异性识别构成神经细胞体和神经突的神经丝的抗神经丝200抗体(Sigma)和与抗神经丝200抗体反应的荧光第二抗体(Molecular Probes，Inc.)用于对固定的样品进行荧光染色。用荧光显微镜观察染色的细胞，将细胞图像扫描到计算机。
(3)图像分析
为了评估培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成，用图像分析软件(Image-Pro Plus ver.4.0，Planetron，Inc.)测量扫描到计算机中的染色的细胞图像中最长的神经突和细胞体主轴的长度。测量了每个组中3个孔的细胞。神经突长度比细胞体主轴长度长2或3倍的细胞定义为神经突形成细胞。计算总细胞数目中神经突形成细胞的比例(％)(Otori，Y.，Wei，J.Y.，Barnstable，C.J.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sic.，(1998)39，972-981)。
(4)统计学分析
为进行统计学分析，使用了Dunnett’s多重比较分析法(SAS临床前软件包；5.4版，SAS Institute Japan)，确定显著性水平是小于5％。
4.测试结果
图5显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像。示出了(A)未添加组，(B)PACAP27添加组和(C)24号肽添加组。在未添加组中，具有伸长的神经突的神经突形成细胞的数目很少。在PACAP27添加组和24号肽添加组中，观察到了许多神经突形成细胞。
图6显示每个添加组中神经突细胞在总细胞数目中的比例(％)。对照组中神经突形成细胞的比例(％)是20.7％，0.1μM和1μMPACAP27添加组分别是37.6％和51.1％，0.1μM和1μM 24号肽添加组分别是42.5％和51.4％。作为统计学分析的结果，与未添加组相比，PACAP27添加组和24号肽添加组显示了神经突形成细胞显著增加。
如上述结果可见，PACAP27和24号肽对培养的兔三叉神经细胞中的神经突形成具有促进作用。
测试实施例5
对切除的泪腺分泌蛋白的促进作用(2)
从兔切除泪腺，在含有PACAP27或24号肽的溶液中温育，分泌的蛋白量的改变检验为泪腺刺激活性。
1.使用的动物
使用了从Fukusaki Rabbit养兔场购买的体重为1.5-2.0kg的日本白兔。将每只动物放在室内分开的笼子中，其中保持23±3℃的温度和55±10％的湿度，每天光照12小时(8:00光照开始，20:00光照结束)，在到达后进行饲养，直到测试的最后一天。每天给予动物100g固体饲料(Labo R Stock，Nosan Corporation)，可以自由引用自来水。
2.测试物质
将PACAP27和24号肽用作测试物质。如下制备物质溶液。
(a)将纯净水加入氯化钠(137.92g)、氯化钾(7.01g)、二水合氯化钙(3.53g)和六水合氯化镁(1.2g)，使总体积为1000mL(溶液1)。将纯净水加入磷酸二氢钾(8.24g)，使总体积为500mL(溶液2)。将溶液1(50mL)和溶液2(10mL)加入900mL纯净水，在得到的溶液中溶解葡萄糖(2.07g)和碳酸氢钠(2.1g)。将得到的溶液的总体积调节到1000mL(pH大约7.4)，将其用作温育溶液。
(b)将PACAP27或24号肽溶解于温育溶液，达到10-7M的浓度，将其用作测试物质溶液。将具有毒蕈碱激动剂活性的Carbachol(Nacalai Tesque，Inc.)溶解于温育溶液，达到10-4M的浓度，将其用作药物的对照。将没有加入药物的温育溶液作为对照组。在实验前使95％氧气和5％二氧化碳的混合气体通过每个温育溶液。
3.测试方法
(1)制备泪腺分泌切除样品
对动物进行普通麻醉，通过腹主动脉用灌注溶液(含有116mM氯化钠和5.4mM氯化钾)进行灌注。从兔切除主泪腺组织。从切除的主泪腺组织除去脂肪结缔组织后，将主泪腺组织分成两个相同的切片(每个切片大约40mg)。将泪腺切片转移到添加了0.5mL/孔温育溶液的24孔板，然后在37℃下95％氧气和5％二氧化碳的混合气体中温育。每20分钟用新鲜的温育溶液更换温育溶液，共3次。温育总共进行60分钟，以获得稳定状态的泪腺切片样品。
(2)分泌的蛋白的定量
37℃下在95％氧气和5％二氧化碳的混合气体中在0.5mL新鲜的培养溶液中将稳定状态的切片样品温育20分钟。完成温育后，收集温育溶液，采用蛋白染色试剂(DC蛋白测定试剂，Bio Rad)确定溶液中的蛋白量。认为由此获得的蛋白量是测试开始前从切除的泪腺样品分泌的蛋白量。随后，用0.5mL含有测试物质的温育溶液更换温育溶液，37℃下在95％氧气和5％二氧化碳的混合气体中将切片样品温育60分钟。收集温育溶液，确定温育溶液中的蛋白量。对于对照组和carbachol组，按照上文所述的相同方式，用各自的温育溶液更换温育溶液，37℃下在95％氧气和5％二氧化碳的混合气体中将切片样品温育60分钟，确定温育溶液中的蛋白量。将温育溶液中的蛋白量转化为每1mg泪腺切片样品湿重量的蛋白量。假定测试开始前的蛋白分泌率是100％。计算在含有测试物质的温育溶液中温育后的蛋白分泌率，检验测试物质对蛋白分泌的促进作用。
(3)统计学分析
为进行统计学分析，使用了Dunnett’s多重比较分析法(SAS临床前软件包；5.4版，SAS Institute Japan)，确定显著性水平是小于5％。
4.测试结果
测试结果示于图7。纵轴显示当处理前的分泌率假定为100％时切除的兔泪腺的蛋白分泌率。在carbachol组、PACAP27组和24号肽组中，发现了与不含药物的对照组相比蛋白分泌率的显著增加(＊p＜0.05)。
从上述结果可以看出，PACAP27和24号肽对切除的泪腺中的蛋白分泌具有显著的促进作用。
测试实施例6
对兔泪液分泌的促进作用
检验了当给兔眼施用PACAP27和24号肽时泪液量的改变。
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd购买的体重为1.5-2.0kg的日本白兔。将每只动物放在室内分开的笼子中，其中保持23±3℃的温度和55±10％的湿度，每天光照12小时(8:00光照开始，20:00光照结束)，在到达后进行饲养，直到测试的最后一天。每天给予动物100g固体饲料(Labo R Stock，Nosan Corporation)，可以自由引用自来水。
2.测试物质
将PACAP27和24号肽用作测试物质。将测试物质以0.1％的浓度溶解于以下载体溶液，以制备滴眼液。作为对照，使用了以下载体溶液。
载体溶液的配方：
二水合磷酸二氢钠    0.1g
氯化钠              0.9g
氢氧化钠            适量
纯净水              适量
100mL(pH 7.0)
3.测试方法
当给兔的一只眼施用50μL含有测试物质的滴眼液或载体溶液时，通过测量分泌的泪液而检验测试物质或载体溶液对泪液分泌的效果。在施用前8.5分钟和施用后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟和120分钟，通过Schirmer法测量分泌的泪液量。通过在测量泪液量前7.5分钟给眼施用10μL 0.4％的盐酸丁氧普鲁卡因(Benoxil滴眼液，Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.)对兔进行局部麻醉。用滤纸拭去下睑结膜囊中的泪液后，用Schirmer′s测试条(Showa YakuhinKako Co.)测量1分钟内分泌的泪液量。施用滴眼液后每个时间点的泪液分泌量与施用滴眼液前的泪液分泌量的差异计算为由测试物质导致的泪液量的改变。
4.统计学分析
使用了Dunnett’s多重比较分析法(SAS临床前软件包；5.4版，SAS Institute Japan)比较了载体溶液施用组和药物施用组之间泪液量的改变，确定显著性水平是小于5％。
5.测试结果
图8显示了给兔眼施用滴眼液时分泌的泪液量的改变。在载体溶液施用组中，从刚施用后到施用后120分钟都没有观察到显著改变。在PACAP27施用组中，施用后30分钟和120分钟观察到了与对照组相比的泪液分泌量的显著增加，在24号肽施用组中，从施用后20分钟到120分钟观察到了照组相比的泪液分泌量的显著增加。
从上述结果可以看出，PACAP27和24号肽对泪液分泌具有促进作用，并且可以用于改善泪液缺陷型干眼症状。
测试实施例7
对微型角膜刀导致的兔角膜敏感性降低的改进作用(2)
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd购买的体重为1.5-2.0kg的雄性日本白兔。将每只动物放在室内分开的笼子中，其中保持23±3℃的温度和55±10％的湿度，每天光照12小时(8:00光照开始，20:00光照结束)，在到达后进行饲养，直到测试的最后一天。每天给予动物100g固体饲料(Labo R Stock，Nosan Corporation)，可以自由引用自来水。
2.测试物质
将24号肽用作测试物质。将测试物质以0.01％的浓度溶解于以下载体溶液，以制备滴眼液。作为对照，使用了以下不含测试物质的载体溶液。
载体溶液的配方：
二水合磷酸二氢钠    0.1g
氯化钠              0.9g
氢氧化钠            适量
纯净水              适量
总体积              100mL(pH 7.0)
3.测试方法
(1)建立角膜瓣
通过肌内注射(0.9mL/kg)比例为0.5∶1的Ceractal(2％甲苄噻嗪)和Ketaral(5％氯胺酮)的混合物对动物进行全身麻醉。充分暴露眼球后，用微型角膜刀(Nidek Co.，Ltd.)建立直径为8.5mm的角膜瓣。对于该手术，使用了兔的适配器和厚度为130μm的刀刃。
(3)施用
通过从建立角膜瓣当日起的8周中滴眼而施用含测试物质的滴眼液或施用载体溶液。用微移液管，以每次50μL的量，以2小时的间隔每日4次施用滴眼液或载体溶液。从建立角膜瓣当日开始的1周时间，在每日的第一次和第三次施用测试物质或载体溶液的同时施用一滴作为抗炎剂的尼呋喃滴眼液(Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.)，在每日的第二次和第四次施用测试物质或载体溶液的同时施用一滴0.3％的加替沙星滴眼液(Gatiflo滴眼液，Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.)。
(3)测量角膜敏感性
在手术前和从手术后第1周到手术后第8周，用Cochet-Bonnet触觉计每周一次测量角膜敏感性。测量是盲法试验，因此检查者不知道测量的兔属于哪一组。
角膜敏感性由连接Cochet-Bonnet触觉计的尼龙丝接触动物角膜中心时诱导的眨眼反应的频率确定。当接触触觉计10次中证实有5次或更多次眨眼反应时，判断动物具有角膜敏感性。当接触触觉计10次中有5次以下眨眼反应时，判断动物不具有角膜敏感性。重复该测定三次。当两次或两次以上判断动物具有角膜敏感性时，将最大值(触觉计的尼龙丝的最长长度)记录为测量时间点时个体的角膜敏感性。测量是盲法试验，因此检查者不知道测量的兔属于哪一组。
4.统计学分析
通过t检验(SAS临床前软件包；5.0版，SAS Institute Japan)比较了载体溶液施用组和测试物质施用组之间每个测量时间点的角膜敏感性，确定显著性水平是小于5％。
5.测试结果
图9显示了由切断角膜神经导致的角膜敏感性降低和此后的角膜敏感性改变。在建立角膜瓣后1周，观察到对照组和24号肽施用组角膜敏感性急剧下降。此后，在对照组几乎没有观察到角膜敏感性的恢复，而24号肽施用组发现角膜敏感性的缓慢恢复。在建立角膜瓣后7和8周，在24号肽施用组观察到相对于对照组的对角膜敏感性的统计学显著的改进作用。上述结果表明24号肽对角膜敏感性具有改进作用。
测试实施例8
对培养的角膜上皮增殖的促进作用
1.使用的细胞
使用了人正常角膜上皮细胞(Kurabo Industries Ltd.，细胞株No.4C0466)。
2.测试物质和制备方法
将24号肽和PACAP27用作测试物质。以终浓度(10-5M)的1000倍的浓度将测试物质溶解于蒸馏水，然后用人角膜上皮细胞的无血清增殖培养基(EpiLife(-)，Kurabo Industries Ltd.)将浓度调节为终浓度的两倍。
3.测试方法
(1)培养和添加测试物质
在使冷冻保存的人正常角膜上皮细胞融化后，根据常规方法接种细胞，并且在5％ CO2中37℃下培养7天。培养后，通过常规方法收获细胞，以1.0×104个细胞/mL的浓度悬浮于EpiLife(-)中。以0.5mL/孔的量将上述测试物质溶液分散到24孔板中。将细胞悬浮液(0.5mL)接种在24孔板的每个孔(5.0×103个细胞/孔)中，培养8天。每48小时更换培养基。作为对照，使用没有加入测试物质的EpiLife(-)。
(2)细胞计数
完成培养后，除去24孔板中的上清液，用1.0mL EpiLife(-)将板洗涤3次。根据细胞计数试剂盒-8(Dojindo Laboratories)的方案，基于还原MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑鎓)的能力对细胞的数目进行计数。以400μL/孔的量将EpiLife(-)分散到24孔微量滴定板的每个孔中，然后在每个孔中加入40μL细胞计数试剂盒-8溶液。将板在5％ CO2中37℃下温育2小时，然后，用微量滴定板读数器在450nm测量吸光度。
4.统计学分析
计算对照组和每个测试物质添加组中吸光度的平均值，通过Dunnett’s多重比较检验(单尾)比较对照组和每个测试物质添加组的值。显著性水平确定为5％。
5.测试结果
图10显示了细胞计数的结果(MTT还原能力)。纵轴显示测试物质添加组的细胞数目相对于对照组的细胞数目的比例(％)。培养8天后，24号肽添加组和PACAP27添加组中的细胞数目与对照组相比有增加，并且对照组和测试物质添加组之间有显著差异(p＜0.05)。由上述结果可见，PACAP和PACAP衍生物(24号肽)影响角膜上皮细胞，从而对增殖具有促进作用。
实施例9
对兔角膜上皮损伤的治疗的促进作用
1.使用的动物
使用了从Kitayama Labes Co.，Ltd购买的体重为2.0-2.5kg的雄性日本白兔。将每只动物放在室内分开的笼子中，其中保持23±3℃的温度和55±10％的湿度，每天光照12小时(8:00光照开始，20:00光照结束)，在到达后进行饲养，直到测试的最后一天。每天给予动物100g固体饲料(Labo R Stock，Nosan Corporation)，可以自由引用自来水。
2.测试物质
将PACAP27用作测试物质。将测试物质以10μM或100μM的浓度溶解于以下载体溶液，以制备滴眼液。作为对照，使用了以下不含测试物质的载体溶液。
载体溶液的配方：
二水合磷酸二氢钠    0.1g
氯化钠              0.9g
氢氧化钠            适量
纯净水              适量
总体积              100mL(pH 7.0)
3.测试方法
(1)建立角膜瓣
通过肌内注射(0.9mL/kg)比例为0.5∶1的Ceractal(2％甲苄噻嗪)和Ketaral(5％氯胺酮)的混合物对动物进行全身麻醉。充分暴露眼球后，用微型角膜刀(Nidek Co.，Ltd.)建立直径为8.5mm的角膜瓣。对于该手术，使用了兔的适配器和厚度为130μm的刀刃。
(2)建立角膜上皮缺损
建立角膜瓣后，在立体显微镜下将角膜瓣精确返回到最初位置。手术后1周，对兔进行普通麻醉。将直径为6mm的滤纸充分浸入正庚醇，然后从滤纸除去过量的正庚醇。用滤纸接触角膜中心60秒，以磨损角膜上皮。
(3)通过滴眼而施用
通过从建立角膜瓣当日到完全治愈角膜上皮损伤当日的时间中滴眼而连续施用含测试物质的滴眼液或施用载体溶液。将动物分成载体溶液施用(对照)组、10μM PACAP27施用组和100μM PACAP27施用组。以每次50μL的量，以2小时的间隔每日4次施用滴眼液或载体溶液。为了预防感染，在角膜瓣建立手术后1周的时间，在施用测试物质或载体溶液的同时通过滴眼施用一滴0.3％洛美沙星滴眼液(Lomeflon，Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.)。
(4)图像分析
在刚刚磨损角膜上皮后和磨损角膜上皮后18、24、42和48小时给眼施用0.1％的荧光素，从而对角膜上皮的缺损部位进行染色。用裂隙灯对染色的缺损部位进行拍照，所述裂隙灯的闪烁部分安装了钴滤光器。将照片储存在计算机中作为数字图像，用图像分析软件(Image-Pro Plus，Ver.4.0，由Planetron Inc.生产)测量染色的角膜上皮缺损部位。
4.统计学分析
用Dunnett’s多重比较分析(SAS临床前软件包，5.0版，SASInstitute Japan)比较对照组和测试物质施用组的每个测量时间点的角膜上皮缺损面积与刚刚建立角膜上皮缺损后的角膜上皮缺损面积的比例(％)。显著性水平确定为小于5％。
5.测试结果
图11显示了给眼施用PACAP27导致的角膜上皮创伤愈合的时程。将每个测量时间点的剩余角膜上皮缺损面积(％)用作角膜上皮创伤愈合的指标，假定角膜上皮缺损的最初面积是100％。尽管每个组中剩余的角膜上皮缺损的面积都随时间逐渐减少，但PACAP27施用组中比对照组减少更迅速。在磨损角膜上皮后24小时、42小时和48小时，发现10μM PACAP27施用组和对照组之间剩余的角膜上皮缺损面积的比例有显著差异。在磨损角膜上皮后24小时，发现100μMPACAP27施用组和对照组之间剩余的角膜上皮缺损面积的比例有显著差异。上述结果表明，给眼施用PACAP27，给角膜上皮的创伤愈合带来了促进作用。
实施例2
下文描述了药物制剂的实例。
制剂实施例1：片剂
17号肽        10mg
乳糖          80mg
淀粉          17mg
硬脂酸镁      3mg
晶体纤维素    10mg
通过常规方法，使用上述一个药品的成分制备片剂。如果必要，可以用常规使用的肠衣剂(如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)、糖衣剂或膜(如乙基纤维素)包被片剂。
制剂实施例2：胶囊
PACAP27     50mg
甘露醇      75mg
淀粉        17mg
硬脂酸钙    3mg
将上述用于一个胶囊的成分均匀混合，通过常规方法粒化，然后填充到硬胶囊中。在填充到胶囊前，如果必要，可以用常规使用的肠衣剂(如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)、糖衣剂或膜(如乙基纤维素)包被颗粒。
制剂实施例3：注射液
PACAP38           750mg
羧甲基纤维素钠    500mg
注射用水          补足到100mL
将上述成分无菌混合，以制备注射液。
制剂实施例4：滴眼液
17号肽            5mg
硼酸              700mg
硼砂              适量(pH 7.0)
氯化钠            500mg
羟甲基纤维素      0.5g
乙二胺四乙酸钠    0.05
苯扎氯铵          0.005g
无菌纯净水        补足到100mL
将无菌纯净水(80mL)加热到大约80℃，在其中加入羟甲基纤维素。搅拌混合物，然后冷却到室温。在混合物中加入17号肽、氯化钠、硼酸、乙二胺四乙酸钠和苯扎氯铵并且溶解。通过加入适量的硼砂将溶液调节到pH 7.0。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL。
制剂实施例5：滴眼液
PACAP27       10mg
D-甘露醇      4.5g
磷酸二氢钠    0.1g
氢氧化钠      适量(pH 7.0)
无菌纯净水    补足到100mL
将PACAP27、D-甘露醇和磷酸二氢钠溶解于80mL无菌纯净水。通过加入适量的氢氧化钠将溶液调节到pH 7.0。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL。用滤膜过滤由此获得的滴眼液，然后填充到一次性(单位剂量)容器中，封闭容器。
制剂实施例6：滴眼液
24号肽    5mg
硼酸      700mg
硼砂      适量(pH 7.0)
氯化钠    500mg
羟乙基纤维素      0.2g
乙二胺四乙酸钠    0.05g
葡糖酸氯己定      0.005g
无菌纯净水        补足到100mL
将羟甲基纤维素加入80mL无菌纯净水，加热到大约80℃，搅拌，然后冷却到室温。将24号肽、氯化钠、硼酸、乙二胺四乙酸钠和葡糖酸氯己定溶解于溶液中。通过加入硼砂将溶液调节到pH 7。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL。
制剂实施例7：滴眼液
24号肽              0.01g
二水合磷酸二氢钠    0.1g
氯化钠              0.9g
氢氧化钠            适量
苯扎氯铵            0.005g
纯净水              补足到100mL
将二水合磷酸二氢钠、氯化钠和苯扎氯铵依次溶解于大约90mL纯净水中。将24号肽溶解于溶液中。在搅拌下通过加入氢氧化钠将溶液调节到pH 8.0。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL，然后通过过滤灭菌。
制剂实施例8：滴眼液
24号肽          0.01g
三水合乙酸钠    0.1g
氯化钠          0.9g
盐酸            适量
苯扎氯铵        0.005g
纯净水          补足到100mL
将三水合乙酸钠、氯化钠和苯扎氯铵依次溶解于大约90mL纯净水中。将24号肽溶解于溶液中。在搅拌下通过加入盐酸将溶液调节到pH 5.0。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL，然后通过过滤灭菌。
制剂实施例9：滴眼液
24号肽      0.01g
HEPES       0.1g
氯化钠      0.9g
氢氧化钠    适量
苯扎氯铵    0.005g
纯净水      补足到100mL
将HEPES、氯化钠和苯扎氯铵依次溶解于大约90mL纯净水中。将24号肽溶解于溶液中。在搅拌下通过加入氢氧化钠将溶液调节到pH7.0。采用有刻度的量筒，用无菌纯净水将溶液调节到100mL，然后通过过滤灭菌。
序列表文字
SEQ ID No.1；Xaa是Val或Ile(位置：5)
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SEQ ID No.14；Xaa是Arg-NH2或Arg-OH(位置：38)
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SEQ ID No.20；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
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SEQ ID No.23；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.24；Xaa是Gly-NH2(位置：28)
SEQ ID No.25；Xaa是Lys-NH2(位置：29)
SEQ ID No.26；Xaa是Arg-NH2(位置：29)
SEQ ID No.27；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.28；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.29；Xaa是Leu-NH2(位置：23)
SEQ ID No.30；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.31；Xaa是Leu-NH2(位置：23)
SEQ ID No.32；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.33；Xaa是Arg-OH(位置：30)
SEQ ID No.34；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.35；Xaa是乙酰-His(位置：1)
SEQ ID No.35；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
SEQ ID No.36；Xaa是Arg-NH2(位置：38)
SEQ ID No.37；Xaa是Arg-NH2(位置：38)
SEQ ID No.38；Xaa是Leu-NH2(位置：23)
SEQ ID No.39；Xaa是乙酰-His(位置：1)
SEQ ID No.39；Xaa是Leu-NH2(位置：23)
SEQ ID No.40；Xaa是Arg-NH2(位置：30)
Figure IYZ000001719655600011
Figure IYZ000001719655600021
Figure IYZ000001719655600061
Figure IYZ000001719655600071
Figure IYZ000001719655600091
Figure IYZ000001719655600111
Figure IYZ000001719655600121
Figure IYZ000001719655600141
Figure IYZ000001719655600151
Figure IYZ000001719655600161
Figure IYZ000001719655600171
Figure IYZ000001719655600191
Figure IYZ000001719655600201
Figure IYZ000001719655600251
Figure IYZ000001719655600271
Figure IYZ000001719655600381

Claims (8)

1.促进角膜神经突形成的试剂，包括PACAP衍生物或其药学可接受的盐，其中所述PACAP衍生物是下面式(I)所示的肽：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12(I)
其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，X11是Leu-Gly-Arg-Arg，X12修饰C-末端氨基酸的α-羧基，并且代表-NH2或-OH。
2.改进角膜敏感性的试剂，包括PACAP衍生物或其药学可接受的盐，其中所述PACAP衍生物是下面式(I)所示的肽：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12(I)
其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，X11是Leu-Gly-Arg-Arg，X12修饰C-末端氨基酸的α-羧基，并且代表-NH2或-OH。
3.干眼症的治疗剂，包括PACAP衍生物或其药学可接受的盐，其中所述PACAP衍生物是下面式(I)所示的肽：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12(I)
其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，X11是Leu-Gly-Arg-Arg，X12修饰C-末端氨基酸的α-羧基，并且代表-NH2或-OH。
4.角膜上皮损伤的治疗剂，包括PACAP衍生物或其药学可接受的盐，其中所述PACAP衍生物是下面式(I)所示的肽：
His-Ser-Asp-Ala-X1-Phe-Thr-X2-X3-Tyr-X4-Arg-X5-Arg-X6-Gln-X7-Ala-Val-X8-X9-Tyr-Leu-Ala-Ala-X10-X11-X12(I)
其中X1是Ile，X2是Asp，X3是Ser，X4是Ser，X5是Tyr，X6、X8和X9是Arg，X7是Leu，X10是Val，X11是Leu-Gly-Arg-Arg，X12修饰C-末端氨基酸的α-羧基，并且代表-NH2或-OH。
5.PACAP27、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备用于促进角膜神经突形成的试剂中的用途，其中所述PACAP衍生物是如SEQID NO：33所示的17号肽或如SEQ ID NO：40所示的24号肽，所述PACAP27的序列如SEQ ID NO：15所示。
6.PACAP27、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备用于改进角膜敏感性的试剂中的用途，其中所述PACAP衍生物是如SEQ IDNO：33所示的17号肽或如SEQ ID NO：40所示的24号肽，所述PACAP27的序列如SEQ ID NO：15所示。
7.PACAP27、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备干眼症的治疗剂中的用途，其中所述PACAP衍生物是如SEQ ID NO：33所示的17号肽或如SEQ ID NO：40所示的24号肽，所述PACAP27的序列如SEQ ID NO：15所示。
8.PACAP27、PACAP衍生物或其药学可接受的盐在制备角膜上皮损伤的治疗剂中的用途，其中所述PACAP衍生物是如SEQ ID NO：33所示的17号肽或如SEQ ID NO：40所示的24号肽，所述PACAP27的序列如SEQ ID NO：15所示。
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