ITMI20110583A1 - Preparazioni oftalmiche a base di pacap (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide) al fine di ripristinare la normale funzione visiva nel glaucoma in fase precoce - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“PREPARAZIONI OFTALMICHE A BASE DI PACAP (PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING POLYPEPTIDE) AL FINE DI RIPRISTINARE LA NORMALE FUNZIONE VISIVA NEL GLAUCOMA IN FASE PRECOCE”

Campo tecnico dell’invenzione

La presente invenzione riguarda preparazioni oftalmiche in forma di collirio comprendenti un peptide espresso in numerose aree del Sistema Nervoso Centrale, compresa la retina, ovvero il PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polipeptide).

Tali preparazioni sono utili per ripristinare una normale funzione visiva in distrofie retiniche/retinopatie ed otticopatie, come il glaucoma (Glaucoma Congenito, Glaucoma Infantile, Glaucoma Giovanile, Glaucoma dell’Adulto, Glaucoma Cronico Primario ad angolo aperto, Glaucoma Cronico Primario ad angolo chiuso, Glaucoma Secondario tra cui il Glaucoma Pigmentario, Glaucoma Iatrogeno, Glaucoma Acuto). In particolare, questa invenzione si propone di recuperare la normale funzione visiva nello stadio precoce della malattia glaucomatosa, in cui la sequenza di eventi che porta alla perdita delle cellule ganglionari retiniche è ancora reversibile.

Stato della tecnica

Il PACAP, un peptide che appartiene alla famiglia del peptide VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide)/glucagone/secretine, è considerato uno dei più interessanti peptidi per le sue azioni biologiche. La struttura e le proprietà funzionali così conservate nella scala dei vertebrati suggeriscono che il PACAP sia coinvolto in varie funzioni vitali; infatti l’evidenza sperimentale ha dimostrato un suo coinvolgimento nello sviluppo di vari organi, nelle funzioni del sistema endocrino, cardiovascolare, respiratorio, riproduttivo, nervoso, nelle risposte immunitarie e nei ritmi circadiani. E sintetizzato in differenti aree del SNC, inclusa la retina, con un ruolo pleiotropico agendo come neurotrasmettitore, neuromodulatore o fattore neurotrofico. Il PACAP è espresso in due forme, un peptide lungo 38 aminoacidi (PACAP 38) ed uno più corto lungo 27 aminoacidi (PACAP 27), di cui la forma più lunga è quella più espressa nel sistema nervoso. I recettori in grado di legare sia il PACAP 27 che 38 sono fondamentalmente di due tipi: il recettore di classe 1 (PAC 1, dotato di alta affinità) ed il recettore di classe 2 (dotato di uguale affinità per PACAP e VIP; si distinguono due tipi di recettore di classe 2, il VPAC 1 e 2). Il PACAP dopo essersi legato a PACI induce l’attivazione di una adenilato ciclasi e della fosfolipasi C con conseguente aumento dei livelli di AMP ciclico (AMPc). Il PACAP può essere considerato anche un ligando dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) una famiglia di recettori in grado di attivare le tirosine kinasi A e B (TrkA e TrkB, rispettivamente) in assenza dei loro ligandi specifici, rispettivamente il NGF ed il BDNF, con conseguente fosforilazione di molteplici bersagli intracellulari (Lee and Chao, 2002; Rajagopal et al., 2004).

La distribuzione delle cellule retiniche in grado di sintetizzare e liberare il PACAP appare limitata alle cellule ganglionari, un sottogruppo di cellule amacrine e cellule orizzontali (Seki et al. 2000; Hannibal and Fahrenkrug 2004); la distribuzione del recettore specifico PACI include oltre alle cellule ganglionari, anche alcuni tipi di cellule amacrine e le cellule del Muller (Seki et al. 1997; 2000; D’Agata and Cavallaro 1998; Kubrusly et al.

2005).

E stato quindi proposto di considerare il PACAP come un agente in grado di legarsi a due tipi di recettori presenti a livello della retina, il PACI e PAC2 che esercitano un effetto neuroprotettivo sulle cellule retiniche che li esprimono, tra cui, soprattutto, le cellule ganglionari, ed anche le cellule amacrine e le cellule del Muller; per effetto neuroprotettivo si intende, in questo caso specifico, la capacità da parte di molecole farmacologicamente attive di opporsi alla morte cellulare che caratterizza numerose patologie retiniche. Ad esempio il PACAP, sia il PACAP 38 che 27, si è dimostrato in grado di agire come un neuroprotettore prevenendo la sofferenza delle cellule retiniche in varie affezioni vascolari quali la retinopatia ischemica ed opponendosi alla morte delle cellule ganglionari che segue ad una lesione del nervo ottico; il PACAP è, inoltre, in grado di opporsi alla morte delle cellule retiniche causata da trattamenti con eccito-tossine, quali l’acido glutammico e l’acido kainico, o quella causata da irradiazioni con raggi UV (Silveira et al., 2002; Seki et al. 2006; Atlasz et al. 2007; Atlasz et al, 2010).

Da questi studi emerge che il PACAP è stato utilizzato nell’ ambito della neuroprotezione e più specificamente per prevenire la morte delle cellule retiniche in vari modelli animali di retinopatia. Non è per altro mai stata descritta un’azione diretta del PACAP sulle cellule retiniche affette ripristinandone la normale funzionalità, soprattutto durante una fase neurodegenerativa precoce che precede la morte cellulare.

E noto che sia in pazienti affetti da glaucoma che in modelli sperimentali di glaucoma la degenerazione/morte di cellule ganglionari con conseguente riduzione della loro densità retinica rappresenta una fase avanzata del glaucoma (Quigley et al. 1989; Buckingham et al. 2008; Boland e Quigley 2011). In una fase precoce del glaucoma, invece, le cellule ganglionari non sono ancora così compromesse da essere indirizzate verso la loro morte, ma iniziano a funzionare in modo anomalo con conseguente riduzione delle capacità visive; tali alterazioni funzionali sono rilevabili mediante registrazione delEelettroretinogramma evocato da stimoli visivi strutturati (ERG da pattern, P-ERG) la cui sorgente si trova nella retina interna a livello delle cellule ganglionari (Maffei e Fiorentini, 1982; Maffei e Fiorentini, 1985). Il P-ERG si è dimostrato utile a rilevare danni precoci della retina interna sia nei modelli sperimentali animali che nel paziente con ipertensione endoculare o affetto da glaucoma (Domenici et al., 1991; Ventura e Porciatti 2006; Parisi et al. 2006; Falsini et al, 2008).

Per quanto concerne i metodi di somministrazione del PACAP, dati recenti indicano che PACAP 38 e 27 sono in grado di passare la barriera emato-encefalica aprendo il campo alla loro possibile applicazione farmacologica mediante un trattamento per via sistemica (Nonaka et al., 2002; Dogrukol-Ak et al, 2009). L’uso sistemico (per iniezione endovenosa, o intramuscolare, o intraperitoneale) del PACAP è però da evitare in quanto può indurre effetti collaterali, come effetti sulla regolazione dei ritmi circadiani (Kawaguchi et al., 2010); topi knock-out per il recettore PACI, presentano infatti dei cambiamenti nei ritmi circadiani (Hannibal et al. 2008). Inoltre, trattamenti sistemici con PACAP non sono in grado di prevenire completamente la degenerazione di cellule retiniche in modelli animali, al contrario di quanto dimostrato mediante iniezioni intravitreali di PACAP che permettono di liberare la molecola direttamente a livello retinico (Babai et al.

2006; Kiss et al. 2006). Ad oggi, quindi, sussiste la necessità di individuare nuove preparazioni di PACAP somministrabili con tecniche non-invasive per veicolare il PACAP alla retina, in modo tale da evitare tecniche di somministrazione come ad esempio le iniezioni intraoculari, sub-retiniche o retrobulbari, ovvero metodi altamente invasivi, che non risultano adatti ad un trattamento cronico prolungato a causa del rischio associato di provocare, ad esempio, la perforazione del bulbo oculare, infezioni o emorragie.

US 2008/0300182 descrive preparazioni oftalmiche contenenti PACAP, PACAP 27 e 38, utili per prevenire la morte delle cellule retiniche in vari modelli di patologia retinica. L’attività neuroprotettiva del PACAP è stata verificata in vivo mediante iniezione intravitreale in un modello sperimentale in cui si induce farmacologicamente la morte delle cellule retiniche; non è riportata la somministrazione topica sotto forma di collirio né l’utilizzo di modelli in vivo di glaucoma. La prevenzione della morte delle cellule retiniche è attribuita alla liberazione di interleuchina-6 (IL-6), una citochina infiammatoria, da parte delle cellule retiniche del Muller che esprimono il recettore PACI. Il recettore PACI è però maggiormente concentrato a livello della retina interna, ovvero delle cellule ganglionari, come riportato in letteratura. Inoltre, l’aumento nella retina di IL-6, così come di altre citochine coinvolte nei processi infiammatori, provoca un’alterazione della risposta retinica alla luce misurabile con l’elettroretinogramma da flash (ERG da flash; Ozawa et al., 2008); un aumento di IL-6 potrebbe pertanto indurre un ulteriore deficit visivo invece di curarlo.

Inoltre, l’instaurarsi della morte cellulare nel glaucoma rappresenta una fase tardiva di compromissione delle cellule ganglionari e del nervo ottico, quando ormai la funzione visiva è fortemente alterata e difficilmente recuperabile.

US 62242563 propone peptidi analoghi del PACAP per la prevenzione della morte cellulare nei mammiferi e per il trattamento di vari tipi di patologie (malattie neurodegenerative come la malattia di Parkinson e di Alzheimer, patologie cardiovascolari, diabete, malattie della retina e del rene). La prevenzione della morte cellulare è invocata come responsabile dell’attività terapeutica per le patologie citate, tra le quali quelle della retina sono citate solo genericamente Valgono pertanto le considerazioni sopra riportate per US 2008/0300182.

JP 10-505863 descrive l’uso del PACAP per prevenire la morte neuronaie in vari tipi di patologie cerebrali. Anche in questo caso l’obiettivo è quello di prevenire la morte neuronaie e quindi valgono le considerazioni riportate per US 2008/0300182.

EP 1752158 descrive l’uso di PACAP o analoghi per promuovere la genesi di cellule corneali al fine di aumentare la sensibilità corneale, per trattare soggetti affetti dall’“occhio secco” e da lesioni traumatiche dell’epitelio corneale.

WO 200823717 descrive preparazioni oftalmiche contenenti PACAP per promuovere la secrezione delle lacrime agendo sul recettore PACI e non si riferisce, quindi, a patologie retiniche.

EP 1546198 descrive l’uso di PACAP per aumentare le capacità proliferative e differenziative delle cellule staminali del prosencefalo basale al fine di usare queste cellule per il trattamento delle malattie neurodegenerative. EP 1507551 descrive l’uso di PACAP per potenziare le capacità proliferati ve/differenziati ve di progenitori neuronali presenti nel cervello di un adulto per il trattamento di varie alterazioni del sistema nervoso.

US 20020182729 descrive un metodo basato sull’uso di PACAP per regolare il ciclo cellulare in neuroni in via di sviluppo ed ancora in fase moltiplicativa al fine di trattare varie patologie che affliggono il sistema nervoso.

Nonostante siano stati suggeriti effetti del PACAP nella riduzione e/o prevenzione della morte cellulare in alcune patologie retiniche e/o in malattie neuro degenerative che affliggono altre aree del SNC, non è stato descritto ne è desumibile dallo stato della tecnica l’uso terapeutico del PACAP o di suoi analoghi per ripristinare una normale visione nel glaucoma.

Il glaucoma è inquadrabile in una serie di patologie progressive che interessano l’occhio e che portano, se non adeguatamente curate, alla cecità a causa della perdita delle cellule ganglionari e dell’atrofia progressiva delle fibre del nervo ottico. Il glaucoma, in particolare la forma di glaucoma più frequente denominata glaucoma primario ad angolo aperto (POAG; 70-80% dei casi di glaucoma), e' caratterizzato nella maggior parte dei pazienti da aumento della pressione endooculare (IOP) con un restringimento progressivo delle vie di deflusso dell'umor acqueo; questa patologia cronica se non prontamente diagnosticata e curata può comportare in una fase avanzata la morte delle cellule ganglionari ed un danno al nervo ottico, alterazioni praticamente irreversibili. E inoltre da sottolineare che il glaucoma in una fase progressiva può arrivare ad interessare, oltre alla retina, anche i centri visivi, quali il corpo genicolato laterale, fino a coinvolgere la stessa corteccia visiva rendendo inutili eventuali trattamenti terapeutici in questa fase. Negli ultimi anni la terapia farmacologica ha mirato a ridurre la IOP sebbene un consistente numero di pazienti resista alla terapia farmacologica in uso e vada incontro ad una perdita progressiva ed irreversibile della funzione visiva.

Il trattamento farmacologico del glaucoma, come riportato sopra, non può prescindere da un metodo di somministrazione topica oculare che eviti il manifestarsi di effetti collaterali (somministrazioni sistemiche) od il rischio di provocare la perforazione del bulbo oculare, infezioni o emorragie (somministrazioni intravitreali e subretiniche).

La retina rappresenta una parte del sistema nervoso centrale parzialmente separata; infatti esistono vari tipi di barriere tra cui quella emato-retinica, che impedisce la diffusione aspecifica di composti, ad esempio molecole di grandi dimensioni, alla retina. La penetrazione intraoculare di composti farmacologicamente attivi applicati per via topica è, infatti, regolata da barriere localizzate nella cornea e nella congiuntiva, sclera, coroide ed i vasi coroidei, oltre che dall’ assorbimento sistemico e dalla degradazione metabolica ad opera di enzimi presenti in questi tessuti. Una volta instillati, i composti farmacologicamente attivi devono quindi attraversare un complesso sistema di barriere, tra cui la barriera ematoretinica, per penetrare nei tessuti sottostanti fino alla retina.

Inoltre, la retina, tramite le cellule ganglionari, dalle quali si originano le fibre del nervo ottico, è collegata mediante il nervo ottico stesso ai centri visivi come il Corpo Genicolato Laterale parte dorsale (dLGN).

Si rende quindi necessario di provvedere all’individuazione di molecole, come il PACAP, applicabili per uso topico in modo da evitare i rischi connessi all’uso di metodiche invasive, in grado di raggiungere la retina in concentrazioni efficaci atte non solo a bloccare la progressione della patologia indotta dal glaucoma a livello delle cellule ganglionari e del nervo ottico prima che vadano incontro a morte, ma anche e soprattutto di recuperare alla normalità funzionalità le alterazioni visive prima che diventino irreversibili.

Descrizione dell’invenzione

Si è ora trovato che il PACAP (o suoi analoghi) somministrato per via topica oculare è in grado di ripristinare nel glaucoma, la normale funzionalità delle cellule retiniche, in particolare delle cellule ganglionari. Il PACAP è pertanto in grado di contrastare i deficit visivi che caratterizzano uno stadio precoce del glaucoma, prima dell’ instaurarsi della morte delle cellule ganglionari stesse.

La presente invenzione si basa sulla dimostrazione che il trattamento con PACAP in un modello murino spontaneo di glaucoma è in grado di ripristinare una normale funzionalità a livello della retina interna (cellule ganglionari) con conseguente recupero delle capacità visive valutate mediante registrazione del P-ERG; questo recupero avviene in una fase di progressione della malattia che precede quella caratterizzata dall’ instaurarsi della morte delle cellule ganglionari valutata mediante analisi della loro densità retinica.

La presente invenzione ha pertanto per oggetto formulazioni oftalmiche contenenti PACAP per ripristinare le normali capacità visive nel glaucoma.

La formulazione oftalmica dell’invenzione è preferibilmente un collirio comprendente PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polipeptide, PACAP 27 o PACAP 38).

Inoltre l’invenzione riguarda l’uso di PACAP (27 e 38) per la preparazione di un medicamento in forma di collirio per il trattamento di malattie neuro degenerative della retina, del nervo ottico e del corpo genicolato laterale ai fini del ripristino di una normale visione in una fase precoce.

Elenco delle figure

Figura 1 - Determinazione dei livelli di AMPc nella retina in seguito ad applicazione topica di PACAP 38.

Figura 2 - Misurazione dei livelli di pressione endooculare (IOP) a varie età in un modello sperimentale di glaucoma spontaneo (topo DBA/2J).

Figura 3 - Densità delle cellule ganglionari nel glaucoma misurata a differenti età associate ad un aumento della IOP; indagine condotta in un modello sperimentale di glaucoma spontaneo (topo DB A/2 J).

Figura 4 - Registrazione dell’elettroretinogramma da pattern (P-ERG) nel modello murino di glaucoma (topo DBA/2J) a differenti età.

Figura 5 - L’applicazione topica di PACAP 38 riduce significativamente l’alterazione della risposta retinica derivante dalle cellule ganglionari nella retina interna durante una fase del glaucoma che precede la riduzione di densità delle cellule ganglionari; indagine condotta in un modello sperimentale di glaucoma spontaneo (topo DBA/2J).

Figura 6 - ERG da flash registrato nel modello sperimentale di glaucoma spontaneo (topo DBA/2J) dopo trattamento topico con PACAP al fine di dimostrare la totale assenza di alterazioni funzionali a livello dei fotorecettori e della retina esterna.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Le composizioni dell’ invenzione sono preferibilmente in forma di soluzioni, sospensioni, gel o unguenti contenenti PACAP in concentrazioni comprese tra 0.2 e 50 pg/μΐ (preferibilmente 1-10 pg/μΐ). Le dosi terapeutiche giornaliere sono indicativamente comprese tra 4 e 10000 pg (preferibilmente 20-2000 pg) e possono essere eventualmente raggiunte in due o più somministrazioni al giorno di una soluzione oftalmica di 10-100 pi instillata topicamente a livello della congiuntiva.

Il PACAP (27 e 38) può essere somministrato da solo o in combinazione con altri principi attivi, quali ad esempio β-bloccanti, prostaglandine e inibitori delLanidrasi carbonica.

La preparazione conterrà un adatto veicolo farmaceuticamente accettabile e compatibile con il principio attivo stesso e tollerato a livello oculare.

Esempi di tali veicoli comprendono una soluzione fisiologica, preferibilmente contenente 0,9% di cloruro di sodio e/o soluzioni contenenti agenti viscosizzanti quali Carbossi-metilcellulosa, Carbopol, Idrossipropilcellulosa, polisaccaridi, glicosamminoglicani e loro miscele e derivati (ad esempio, sali).

L’uso di agenti viscosizzanti può migliorare la biodisponibilità garantendo un più lento e graduale passaggio di PACAP rispetto alla somministrazione in soluzione fisiologica che viene più rapidamente lavata via dalla congiuntiva.

Preferibilmente, l’agente viscosizzante è il Tamarind seed polysaccharide o TSP, un polisaccaride estratto dai semi della pianta di tamarindo ( Tamarindus indica ) descritto in EP 0 892 636.

Il contenuto di TSP può variare preferibilmente da 0.05 a 2% (peso/volume - w/v), preferibilmente da 0,25 a 0,5% (w/v).

Il TPS in soluzione si presenta trasparente. Le soluzioni sono viscoelastiche, sterili e sono utilizzate per la protezione corneale e congiuntivaie. Inoltre, il TSP forma sulla superficie oculare un film che persiste a lungo, in grado di lubrificare ed umidificare la cornea e la congiuntiva.

Secondo un altro aspetto preferito, la soluzione viscosizzata comprende Carbossi-metilcellulosa sodica in percentuali variabili da 0,01 a 2% (w/v), preferibilmente da 0,2 a 0,4% (w/v). La Carbossi-metilcellulosa sodica è atossica, inerte e caratterizzata da un pH stabile in soluzione. Inoltre, a una concentrazione pari circa all’ 1% ha un indice di rifrazione simile a quello del liquido lacrimale.

Un ulteriore aspetto preferito, è che la soluzione viscosizzata comprenda acido Ialuronico, più preferibilmente acido Ialuronico in combinazione con TSP.

Il contenuto di acido Ialuronico può variare da 0.05% a 0.8% (w/v), preferibilmente da 0.2 a 0.4% (w/v).

Secondo una realizzazione preferita, la preparazione comprende PACAP in concentrazione pari a 2 mg/mL in soluzione fisiologica contenente NaCl 0,9%.

Secondo un’altra realizzazione preferita, la preparazione comprende PACAP in concentrazione pari a 2 mg/mL in soluzione fisiologica con Carbossi-metilcellulosa sodica allo 0,2%.

Secondo un’ulteriore realizzazione preferita, la preparazione comprende PACAP in concentrazione pari a 1 mg/mL in soluzione fisiologica con TSP allo 0,25%.

La preparazione in collirio può essere somministrata topicamente direttamente sulla superficie oculare intatta, ovvero in modo non invasivo tale da evitare l’utilizzo di metodiche invasive, quali ad esempio le iniezioni intraoculari, subretiniche e retrobulbari. In particolare, la somministrazione può essere effettuata a livello del fornice congiuntivaie. Inoltre la preparazione può essere formulata come patch oculare o in lenti a contatto.

Come dimostrato nella parte sperimentale, il PACAP somministrato topicamente, secondo l’invenzione, è in grado di essere veicolato fino a raggiungere la retina inducendo un aumento della concentrazione retinica del secondo messaggero AMPc nelle cellule retiniche, uno dei bersagli intracellulari dell’attivazione dei recettori del PACAP, come riportato nell’introduzione sullo stato della tecnica. Questi risultati indicano che il PACAP non solo è in grado di passare attraverso le varie barriere tessutali dopo trattamento topico e diffondere fino alla retina, ma anche di conservare una conformazione che gli permette di legarsi ed attivare i suoi recettori specifici espressi in varie cellule retiniche, tra cui le cellule ganglionari.

Le formulazioni dell’invenzione possono essere utilizzate per la prevenzione e/o il trattamento di malattie neurodegenerative della retina, del nervo ottico e del corpo genicolato laterale, in particolare il Glaucoma nelle sue varie forme (Glaucoma Congenito, Glaucoma Infantile, Glaucoma Giovanile, Glaucoma dell’Adulto, Glaucoma Cronico Primario ad angolo aperto, Glaucoma Cronico Primario ad angolo chiuso, Glaucoma Secondario tra cui il Glaucoma Pigmentario, Glaucoma Iatrogeno, Glaucoma Acuto). Gli esempi di seguito riportati illustrano ulteriormente l’invenzione. Esempio 1 - Determinazione dei livelli di AMPc nella retina e dopo 6 ore dal trattamento topico dell’occhio con preparazioni a base di PACAP

<■>E stata utilizzata la preparazione a base di soluzione fisiologica 10,9% NaCl) contenente PACAP 38

Il test è stato condotto su topi (C57BL-6J, Harlan, Italia) ed il PACAP 38 è stato applicato topicamente, instillato nel fornice congiuntivaie di un occhio, mentre l’altro occhio utilizzato come controllo è stato trattato con la sola soluzione (“placebo”) fisiologica.

<■>Determinazione dei livelli di AMPc nella retina

Gli animali sono stati sacrificati a 6 ore dall’applicazione topica dopo induzione di un’anestesia profonda mediante iniezione intraperitoneale con uretano (20%). Successivamente, l’occhio è stato estratto e l’AMPc misurato nell’omogenato di retina sia dell’occhio trattato con PACAP che dell’altro occhio trattato con la sola soluzione fisiologica (occhio di controllo). Le misurazioni sono state fatte mediante dosaggio dell’AMP ciclico utilizzando il Cyclic AMP EIA KIT (Cayman Chemicon Company). I risultati riportati nel grafico in Fig. 1 sono stati ottenuti con una applicazione topica di PACAP (50 μΜ; 0.226 pg/μΐ) in soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) e acido acetico (5%) e sono espressi in valori relativi (%) rispetto all’occhio di controllo. La statistica è stata effettuata mediante t-test di Student confrontando l’occhio tratto con PACAP con quello di controllo: in tutti casi AMPc è risultato significativamente aumentato nell’occhio trattato rispetto a quello di controllo (*, p<0,05).

Questi risultati indicano che il PACAP è in grado di passare le varie barriere e di raggiungere la retina dopo applicazione topica a livello del fornice congiuntivaie; il PACAP appare inoltre in grado di attivare i suoi recettori cellulari che determinano un aumento di AMPc.

Esempio 2 - Effetti esplicati dall’applicazione topica ripetuta di PACAP a varie età in un modello murino di glaucoma

E noto che il recettore del PACAP, chiamato PACI, è espresso a livello delle cellule ganglionari (Seki et al. 1997; 2000; D’Agata and Cavallaro 1998; Hannibal and Fahrenkrug 2004; Kubrusly et al. 2005). L’attività del PACAP è stata verificata nel modello sperimentale più utilizzato di glaucoma spontaneo, ovvero un topo doppio mutante chiamato DBA/2J (John et al., 1998; Chang et al., 1999). Il topo DB A/2 J presenta mutazioni omozigoti di due geni separati; il primo è la tyrosine related protein ( Tyrpl -/-) che codifica una proteina dei melanosomi e il secondo è una glicoproteina di membrana ( Gpnmb -/-); si assiste ad un accumulo di granuli di pigmento nel trabecolato, simile alla forma di Glaucoma Pigmentario, con conseguente degenerazione delle lamelle trabecolari, atrofia dell’iride e progressivo impedimento del deflusso di umore acqueo che induce un innalzamento della IOP.

Questo topo si caratterizza per una aumento progressivo della IOP con progressiva perdita della risposta retinica a stimoli visivi strutturati (possono essere reticoli formati da strisce chiare che si alternano con strisce scure, o scacchi, di differente contrasto e grandezza) che dipende dalla retina intema/cellule ganglionari; nell’uomo e nel modello animale questa risposta retinica va sotto il nome di elettroretinogramma da pattern (P-ERG; Domenici et al., 1991; Ventura e Porciatti, 2006; Falsini et al., 2008). Alla disfunzione delle cellule ganglionari segue in epoca tardiva una degenerazione delle cellule ganglionari con riduzione della loro densità e progressiva atrofia delle fibre del nervo ottico (Ventura et al., 2006; Buckingham et al., 2008). Nella Fig. 2 si riporta che in questo modello murino di glaucoma (DBA/2J) la IOP inizia ad aumentare tra i 5 e 6 mesi di vita postnatale: a 6 mesi e mezzo la IOP nel topo DBA/2J appare già significativamente più elevata (ί-test; * p<0,05) di quella misurata nel topo normale (C57bl/6J) e nel topo DB A/2 J a 5 mesi di età, ovvero prima delFinizio della patologia. All’età di 11 mesi la IOP subisce un’ulteriore innalzamento da cui si deduce una progressione della patologia simile a quella che si instaura nel paziente umano.

Si è valutato se ad un aumento della IOP corrisponda un aumento della morte cellulare con conseguente perdita delle cellule ganglionari che si riducono in densità. Nel grafico di Fig. 3 è riportata la densità delle cellule ganglionari misurata mediante analisi al microscopio confocale della distribuzione delle cellule ganglionari marcate con un anticorpo fluorescente in grado di riconoscere la γ-Sinucleina (Surgucheva et al., 2008); dal grafico si rileva che solo all’età avanzata di 11 mesi si inizia ad osservare una lieve riduzione della densità delle cellule ganglionari a partire dalla retina periferica. Da questi risultati emerge che la morte delle cellule ganglionari inizia a manifestarsi all’età avanzata di 11 mesi nel modello murino di glaucoma, il topo DBA/2J, ovvero dopo circa 5 mesi dall’iniziale aumento della IOP; Buckingham e Collaboratori (2008) hanno proposto che il massimo livello di morte cellulare si verifichi dopo i 16 mesi nel topo DB A/2 J. Gli studi condotti in precedenza sul paziente affetto da glaucoma sono in linea quanto riportato nel modello murino suggerendo che i deficit visivi inizino a manifestarsi precocemente, prima che le cellule ganglionari si riducano di densità e le fibre del nervo ottico vadano in atrofia (Quigley, 1989; Harwerth, Quigley, 2006).

I deficit visivi precoci causati da un funzionamento anomalo delle cellule ganglionari della retina, in particolare delle loro sinapsi, sono facilmente misurabili nel paziente e nei modelli animali mediante registrazione deirelettroretinogramma di pattern (P-ERG) che rappresenta una metodica non-invasiva in grado di rilevare alterazioni funzionali, anche in fase iniziale, della retina interna ed, in particolare, delle cellule ganglionari (Ventura et al. 2006; Falsini et al., 2008; 2009). Nella Fig. 4 è riportato il P-ERG evocato da stimoli visivi strutturati (i reticoli visivi usati come stimolo erano dei reticoli orizzontali il cui profilo di luminanza era caratterizzato da frequenze spaziali di 0,05, 0,1 e 0,2 cicli/grado, contrasto del 90% che si invertivano alla frequenza temporale di 2 Hz) registrato mediante elettrodi corneali collegati ad amplificatore e connessi ad un computer per l’analisi online. Come appare nella Fig. 4 all’età di 7 mesi nel topo DBA/2J il P-ERG è già alterato (riduzione significative delle ampiezze del P-ERG evocato da stimoli visivi di frequenza spaziale 0.05 e 0,2 c/grado; t-test di Student, * p<0,05) in corrispondenza dell’aumento della IOP (Fig. 2). All’età di 8 mesi, ovvero quando la IOP si manifesta stabilmente aumentata (Fig. 2), ma non era presente riduzione di densità delle cellule ganglionari (Fig. 3), è stato effettuato un trattamento della durata di due settimane mediante applicazioni topiche ripetute di PACAP in soluzione fisiologica (un trattamento/48 ore) in un occhio e di veicolo (soluzione fisiologica) nell’altro occhio (occhio di controllo). Sono state usate tre differenti concentrazioni di PACAP (N=3 topi DBA/2J per ciascun gruppo): 500 nM (0,0022 pg/μΐ), 1 μΜ (0,0045 pg/μΐ), 50 μΜ (0,226 pg/μΐ); solo la più alta concentrazione (50 μΜ, 0,226 pg/μΐ) si è rivelata efficace. DaH’istogramma riportato in Fig. 5 risulta che il trattamento topico con PACAP alla concentrazione di 50 μΜ (0,226 pg/μΐ) effettuato per 2 settimane tra 8 e 8,5 mesi (un’applicazione ogni 48 ore) era in grado di prevenire l’alterazione del P-ERG nel topo DBA/2J arrestando la progressione della patologia (confrontare i dati dell’occhio trattato con l’occhio di controllo; t-test di Student, * p<0,05) e recuperando la risposta visiva delle cellule ganglionari della retina interna verso la normalità.

L’altro tipo di elettroretinogramma, ovvero ERG da flash, che misura la risposta dei fotorecettori e della retina esterna alla luce, appare del tutto indenne nel glaucoma a supporto ulteriore che questo è un tipo di patologia a carico della retina interna, ovvero delle cellule ganglionari, almeno in una fase precoce. Nella Fig. 6, riportiamo le ampiezze delle risposta della retina esterna (fotorecettori e cellule post-recettoriali) alla luce (ERG da flash) da cui si evidenzia che nel topo DBA/2J non trattato la risposta della retina esterna alla luce è presente e del tutto normale. Di particolare rilevanza appare un secondo risultato riportato nella Fig. 6: l’occhio del topo DBA/2J trattato con PACAP (50 μΜ) in soluzione fisiologica per via topica (due settimane, un trattamento ogni 48h) presenta un ERG da flash normale. Questo secondo risultato suggerisce che il PACAP non sia in grado di modificare il fotopigmento contenuto nel segmento esterno dei fotorecettori e quindi di alterare la risposta dei fotorecettori alla luce (ERG da flash), come sarebbe da attendersi nel caso che questo tipo di trattamento inducesse un aumento di IL-6 a livello retinico (Ozawa et al. 2008), in base a quanto proposto in US 2008/0300182.

I dati riportati permettono di concludere che il trattamento topico ripetuto con PACAP a concentrazioni efficaci previene l’alterazione funzionale delle cellule ganglionari e permette di ripristinare le capacità visive retiniche durante una fase precoce in un modello sperimentale di glaucoma. La concentrazione efficace minima del PACAP in grado di esercitare effetti protettivi sulla funzione delle cellule ganglionari è risultata Bibliografìa

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Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Formulazioni oftalmiche topiche contenenti un veicolo e un PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polipeptide) per il trattamento di deficit visivi connessi al glaucoma.
2. 2. Formulazioni secondo la rivendicazione 1, in cui il PACAP è PACAP 27 o PACAP 38.
3. 3. Formulazioni secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui i deficit visivi sono correlati a uno stadio precoce del glaucoma, prima dell’ instaurarsi della morte delle cellule ganglionari stesse.
4. 4. Formulazioni seconda una o più delle rivendicazioni da 1 a 3, in forma di soluzioni, sospensioni, gel o unguenti contenenti PACAP in concentrazioni comprese tra 0.2 e 50 pg/μΐ.
5. 5. Formulazioni seconda una o più delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui il veicolo è soluzione fisiologica eventualmente contenente agenti viscosizzanti scelti fra Carbossi-metilcellulosa, Carbopol, Idrossipropilcellulosa, polisaccaridi, glicosamminoglicani e loro miscele e derivati.
6. 6. Formulazioni secondo la rivendicazione 5 in cui l’agente viscosizzante è il Tamarind seed polysaccharide (TSP).
7. 7. Formulazioni secondo la rivendicazione 6 in cui il TSP è presente in concentrazioni da 0.05 a 2% (peso/volume - w/v).
8. 8. Formulazioni secondo la rivendicazione 5 in cui l’agente viscosizzante è Carbossi-metilcellulosa sodica in percentuali variabili da 0,01 a 2% (w/v).
9. 9. Formulazioni secondo la rivendicazione 5 in cui l’agente viscosizzante è acido Ialuronico in concentrazioni da 0.05% a 0.8% (w/v), eventualmente in miscela con TSP.
10. 10. Uso di PACAP per la preparazione di un medicamento in forma di collirio per il trattamento di malattie neurodegenerative della retina, del nervo ottico e del corpo genicolato laterale ai fini del ripristino di una normale visione in una fase precoce della malattia. Milano, 8 aprile 2011