WO2004039403A1

WO2004039403A1 - 角膜障害治療剤

Info

Publication number: WO2004039403A1
Application number: PCT/JP2003/013503
Authority: WO
Inventors: Yoshiko Takayama; Yoshikuni Nakamura; Jun Inoue; Mitsuyoshi Azuma
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2004-05-13
Also published as: JP4603976B2; KR20050059319A; EP1566184A4; AU2003275597A1; EP1566184A1; JPWO2004039403A1; US20060234922A1

Abstract

本発明は、角膜の術後の角膜知覚回復やドライアイの症状を改善する新しいタイプの医薬を提供する。ソマトスタチン受容体作動薬の適用は、白内障手術後、ＬＡＳＩＫ手術後、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、ドライアイ症状の改善に有用である。

Description

明細書

角膜障害治療剤技術分野

本発明はソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤、および角膜神経軸索伸展による角膜知覚の回復、改善、並びにドライアイ及ぴ角膜上皮欠損の治療剤に関する。背景技術

レーザー屈折矯正角膜切除術（PRK) 、レーザー角膜切削形成術（レーシック； LAS I K) 、角膜移植などの角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、通常約 3週間から 1年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわれている。そしてこの角膜知覚機能の低下から角膜手術後の患者では瞬目回数が減少しドライアイの症状が認められることが問題となっている。また、ドライアイ患者では、涙液機能の低下から角膜知覚の低下をもたらし、さらにこの角膜知覚の低下がさらなる涙液機能の低下と循環し、角膜表面の症状がさらに悪化することが問題となっている。しかし、現在角膜手術後の角膜知覚の回復は自然回復に委ねられ、またドライアイの治療においても角膜知覚を回復させるための積極的治療は施されていないのが現状である。

一方、ソマトスタチン（somatostatin)は、成長ホルモン放出抑制因子 (somatotropin release inhibiting factor； SRIF) として、 1 9 7 3年に視床下部から単離されたペプチドで、現在までに、 5個のサブタイプのソマトスタチン受容体が見出されており、それぞれ S STR 1、 S STR 2、 S STR 3、 S S TR4および S S TR 5と命名されている。ソマトスタチンは成長ホルモン放出抑制因子として神経組織に広く分布し、眼組織においても虹彩、毛様体、網膜にソマトスタチン受容体が存在することが確認されている（Mori, M.、 et al. , Neuroscience Letters, 1 99 7年， 223卷， 3 号， p. 1 85— 1 88)。また、ソマトスタチンは生体内において、内分泌系、外分泌系、神経系などにおいて多彩な機能を有し、例えば、神経伝達や神経細胞成長調節などに関与すること、また、 PC 1 2細胞において神経軸索伸展を促進させる作用力 Sあると報告されてレヽる (Ferriero, M. D. et. , Developmental Brain Research, 1 9 94年， 80卷， p. 1 3— 1 8)。

ソマトスタチンが関与する眼疾患としては、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、網膜炎、白内障、結膜炎などが知られている（特表 2002— 5 1 5 91 2、対応： WO 98/58646、 EP 1 0 1 9050) 。

ソマトスタチンそのもの、またはその類縁体を医薬品として開発する試みもなされており、例えば，ソマトスタチン受容体作動薬として知られているォクトレオチド（octreotide)は消化管ホルモン産生腫瘍おょぴ末端肥大症 · 下垂体性巨人症の治療薬として市販されている。その他、例えば；ランレオタイド（lanreotide) (特開平 2— 28 9 5 9 9、対応： EP 389 1 80) 、 AN- 238 (特表 2000— 50205 5、対応： WO 97/1 9 954、 US 5843903) 、 PTR— 3 1 7 3 (特表 200 2— 5 1 8 3 39、対応： US 60 5 1 5 54、 US 6 3 5 56 1 3) 、 S STR 2, S STR 3に親和性を有するァミン誘導体（特開 2000— 226 3 73、対応： U S 6 32 9 38 9) 、ソマトスタチン受容体機能調節作用を有し、糖尿病、肥満糖尿病合併症などの予防または治療に有用な芳香族ァミン誘導体（特開 2000— 1 9 1 6 1 5、対応： EP 1 1 23 9 1 8) 、ソマトスタチン受容体作動作用を有し、糖尿病などの予防または治療に有用な縮合環化合物（特開平 1 1— 209356、対応： US 6 3 52982)、

例えば、式 I

X^X^Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-X^Ser-X⁴

1は Asp - Arg_Met - Pro - Cys, Arg- Met- Pro - Cys， Met- Pro- Cys, Pro- Cysまたは Cysを、 X²は Argまたは Lysを、 X ³は Serまたは Thrを、 X ⁴力 SCys— Lysまたは Cysを示す。〕で示されるソマトスタチン様活性を有するペプチド（特開平 1 0- 1 74587) 、例えば、式 Π

などで表されるソマトスタチン作動薬（特表 200 1— 5 1 8895、対応 WO 98/45285、 EP 97775 1) 、

例えば、式 Π

などで表されるソマトスタチン作動薬（特表 200 1— 5 1 98 1 1、対応 WO 98/4492 1、 US 606 3796) 、

例えば、式 IV

などで表されるソマトスタチン作動薬（特表 200 1 - 5 1 98 1 2、対応 WO 98/44922、 US 606 3796) 、

式 V

〔式中、 R¹¹は、ハロゲン原子、シァノ基、カルボキシ基、 (C_rC₆) アルキル基、及び（C厂 C₆) アルコキシ基から選択した基であり； Xは、 _CH₂_ 基、 — S0₂—基、一 CO—基、又は直接結合であり；そして Yは、 CH基又は窒素原子である〕などで表されるソマトスタチンァゴ-スト（特開 200 1 — 1 1476 1、対応： EP 1086947A1) 、

例えば、式 VI

などで表されるソマトスタチンァゴニスト（特開 2 00 2— 3 4 9 8、対応： U S 2 0 0 1 /04 7 0 3 0) 、

例えば、 5ーグァニジノ一 2 ( (2 - (トルエン一 4—スルフォニル）一 1， 2, 3， 4—テトラヒドロ一イソキノリン _ 3—カルボエル) —アミノ〕 —ぺンタン酸メチルエステルなどの S S TR 2に作用するソマトスタチンァゴニスト (US 2 0 0 2/9 1 1 2 5 A 1 ) 、

例えば、式 \¾

な

0 2/9 1 0 9 0 A 1 ) 式

で示されるソマトスタチンアナログ (WO 2002/10 1 9 2) 、ソマトスタチンの 1以上のサブタイプの受容体からァゴニスト効果を引き起こすィミダゾリル誘導体（WO 99 b 440 1) 、ソマトスタチン受容体と親和性を持つヒダントイン誘導体（WO 200 1/85 7 1 8) 、ソマトスタチン受容体のリガンドとして有用な 4 _アミノビペリジン誘導体（WO 200 1 Z44 1 9 1) 、

例えば、式 IX

などで表されるソマトスタチンァゴニスト（US 6387932) 、例えば、 P h eーシク口 (C y s— D_T r p - L y s - C y s ) — Th r NH₂で示される S S TR 1ァゴニスト (WO 2000/75 1 86) 、選択的 S S TR 4結合作用を有し、緑内障治療作用が期待されるとして、式 X

などで表される化合物（US 6 2 7 34 3)

式 X I

0 OH

H₂C ~ ¹ ~ CH₂-NH— Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-D-Tyr一 H₂

〔式中、は Ci一 C₄アルキル、ァダマンチルなどを示す〕で示されるソマトスタチンアナログ (WO 2 00 0/1 0 5 8 9) 、

例えば、式 ΧΠ

などで示されるソマトスタチンァゴニスト (WO 9 9 2 2 7 3 5、対応： U S 6 1 1 7 8 8 0) 、

例えば、式 ΧΠ

などで示されるソマトスタチンァゴニスト（特表 2 0 0 1 5 0 2 7 1 2、対応： U S 6 0 2 0 34 9、 U S 6 0 8 3 9 6 0) 、例えば、式 XIV

などで示されるソマトスタチンの作動因子（特表 200 1— 525793 (対応： WO 97/43278, EP 9 1 255 1) 、例えば、シクロ〔T y r— D— T r p— Ly s— Va l— P h e (4— (3—メトキシフエニル）イミダゾール) — G 1 y〕などで示されるサイクリックソマトスタチン類似体 (特表 2002- 5 1 8409 (対応： WO 99/65942、 EP 1 086 1 3 1) 、不安、欝などの処置に有用な S S TR 1選択的ァゴエストであるエルゴリン誘導体（特表 2001— 527 580 (対応： WO 98/54 1 83、 US 6 22 1 8 70) 、ソマトスタチン受容体機能調節剤としてのビフエ二ル化合物（特開 2002— 80439、対応： WO 2002/000606) 、ソマトスタチン受容体に結合して、 N aチャンネルを遮断する ) 3—カルボリン誘導体（特表 2002— 5 1 7500、対応： WO 99/64420、 EP 1086 1 0 1) 、ノヽプレオテド ^vapreotide, Sharon Gazal et al. , journal of Medicinal Chemistry, 2002年， 45卷， p. 1 665— 1 6 71) 、ソマトスタチン受容体結合阻害作用を有する化合物で、基：

の 2位に窒素原子が置換していることに特徴がある特異な化学構造を有するァミン誘導体（特開 2002 _ 34828 7) 、およびソマトスタチンレセプタ一に対して親和性および選択性を有するピリドチエノジァゼピン（特表 200 2— 54 1 260、対応： WO 2000/6 1 587) などが知られている。その一方、角膜においては、ソマトスタチン受容体が存在することは未だ報告されていない。また、角膜の神経に関して、三叉神経節で分岐する第一枝 (ophthalmic branch)由来の神経のほとんどが角膜に分布し、角膜の術後知覚回復、角膜上皮の修復などに深く関わっていることが報告されている（Ke- PingXu et al. Cornea, 1 996年， 1 5卷， p. 23 5— 239) 。

しかし、三叉神経（角膜神経）にソマトスタチン受容体が存在することや、三叉神経（角膜神経）の神経軸索伸展をソマトスタチンが促進させるという報告は認められない。発明の開示

本発明は、レーザー屈折矯正角膜切除術（PRK) 、レーザー角膜切削形成術（レーシック； LAS I K) 、および、角膜移植などの角膜手術後やドライアイ患者などで角膜知覚機能の低下した患者の角膜知覚機能を回復させ、さらに、これら角膜知覚機能の低下に伴う角膜上皮の障害を治療する医薬を提供する。

本発明者らは、角膜の術後の角膜知覚回復やドライアイの症状を改善する新しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったところ、ソマトスタチンが三叉神経（以後、角膜神経ということもある。）の軸索伸展促進効果があること、また三叉神経にソマトスタチン受容体が存在することを初めて見出し、これらの知見に基づいてさらに研究をすすめ、ソマトスタチン受容体作動薬を角膜知覚回復などの医薬として利用する本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

(1) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤、 (2) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復剤、

(3) ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療剤、

(4) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療剤、

(5) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進用医薬組、

成物、

( 6 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復用医薬組成物、

( 7 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療用医薬組成物、

( 8 ) ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療用医薬組成物、

( 9 ) 角膜神経軸索伸展促進用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用、

(10)角膜知覚回復用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用、

(11) ドライアイ治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用、

(12) 角膜上皮欠損治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用、

(13) 角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展促進方法、

(14) 角膜知覚の回復が必要される疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによる角膜知覚回復方法、

(15) ドライアイに罹患した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによるドライアイの治療方法、

(16) 角膜上皮が欠損した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによる角膜上皮欠損の治療方法、

に関するものである。

ここで、ソマトスタチン受容体作動薬とは、ソマトスタチンそのものの他、ソマトスタチン受容体に作用し、ソマトスタチンと同様の作用を示すものをいい、ソマトスタチンァゴニスト、ソマトスタチン類似体、ソマトスタチンアナログなどといわれているものを包含する。

ソマトスタチン受容体作動薬としては、ソマトスタチンそのものの他、ソマトスタチン受容体に作用しソマトスタチンと同様の作用を示すものであれば、いずれの化合物であっても有利に使用できる。そのような化合物としては、例えば，ソマトスタチン受容体作動薬として知られているオタトレオチド

(octreotide)、特開平 2— 289599 (対応： EP 3891 80) に記載のランレオタイド（lanreotide) 、パプレオチド (vapreotide) などのォクタべプチド、特表 2000— 502055 (対応： WO 9 7/1 9954, US 5

843903) に記載の例えば AN— 238などのソマトスタチン類似環状べプチド、特表 2002— 5 1 8339 (対応： US 605 1 554、 US 6 3

556 1 3) に記載の例えば PTR— 3 1 73などの主鎖環化ソマトスタチン類似体、特開 226 3 73 (対応： US 6 329389)ゃ特開 2002— 34 8287に開示のァミン誘導体、特開 2000— 1 9 1 6 1 5 (対応： E P 1 1 239 1 8)に記載の芳香族ァミン誘導体、特開平 1 1— 209356 (対応： US 6 3 52982)に記載の縮合環化合物、特開平 1 0— 1 7458 7 に記載のぺプチド類、特表 200 1— 5 1 88 95 (対応： WO 98/45 2 85、 E P 97775 1) 、特表 200 1— 5 1 98 1 1 (対応： WO 98/ 4492 1、 US 6063 796) およぴ特表 2001— 5 1 98 1 2 (対応： WO 98ノ44922、 US 606 3 796) に記載のソマトスタチン作動薬、特開 200 1— 1 1476 1 (対応： EP 1 086 947A1) 、特開 2002- 3498 (対応： US 200 1/047030)、 U S 2002/ 9 1 1 25 A 1、 US 2002/9 10 90A 1 , US 6 38 7932、 WO 99/22735 (対応： US 6 1 1 7880), 特表 200 1— 5027 1 2 (対応： U S 6020349、 US 6083 960) に記載のソマトスタチンァゴエスト、 WO 2002/10 1 92および WO 2000/1 058 9に記載のソマトスタチンアナログ、 WO 99/6440 1に記載のィミダゾリル誘導体、 WO 200 1/85 7 1 8に記載のヒダントイン誘導体、 WO 200 1 /441 9 1に記載の 4—アミノピペリジン誘導体、 WO 2000/75 1 8 6に記載の S STR 1ァゴュスト、 US 6 1 2 7343に記載の選択的 S ST R 4結合作用を有し、緑内障治療作用を示す化合物、特表 200 1— 525 7

93 (対応： WO 9 7/432 78、 E P 9 1 255 1 )に記載のソマトスタチ i ンの作動因子、特表 2002— 5 18409 (対応： WO 99/6 5942、 EP 1 086 1 3 1)に記載のサイクリックソマトスタチン類似体、特表 20 0 1 - 527580 (対応： WO 98/54 1 83、 US 6221 870)記載のエルゴリン誘導体、特開 2002— 80439 (対応： WO 2002/00 0606)に記載のビフヱ-ル化合物、特表 2002- 5 1 7500 (対応： W 099/64420、 EP 1 08 6 1 O 1 )に記載の ]3—カルボリル餺導体、およぴ特表 2002— 54 1 260 (対応： WO 2000/6 1 587)に記載のピリドチエノジァゼピンなどが挙げられる。

本発明のソマトスタチン受容体作動薬を含有する医薬は、哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、ゥサギ、ゥシ、プタ、ィヌ、ネコなど）の角膜神経が障害、切断または角膜上皮が欠損した角膜において、低下した角膜知覚機能の回復に有用である。例えば、 PRKや LAS I K、角膜移植などの手術後の低下した角膜知覚回復のための治療薬として、あるいは角膜知覚の低下したドラィアイ患者の治療薬として、さらに、角膜知覚機能の低下に伴う角膜上皮障害の治療薬として有用である。また、ソマトスタチン受容体作動薬としては、ソマトスタチン受容体サブタイプである S S TR 2または/およぴ S S TR 4 に特異的に作用するァゴニスト（作動薬）がより好ましい。

本発明の医薬は全身的または局所的に投与される。全身的には経口投与の他、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など非経口的にも投与される。局所的には、眼に投与される。

本発明の医薬の製剤形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤、およびシロップ剤、注射剤、点眼剤などの液剤などが挙げられる。顆粒および錠剤として製造する場合には、例えば賦形剤（乳糖、白糖、プドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壌剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤おょぴ錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナパロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルェチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。

カプセル剤として製造する場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケィ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壌剤などを適宜添加したものを均等に混和または粒状もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなどを加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤 [二酸化イオウ、パラベン類（パラォキシ安息香酸メチル、ェチル、プロピルエステル） ] などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶性コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物または化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。

坐剤として製造する場合には坐剤基剤（例えばカカオ脂、マク口ゴールなど）を適宜選択して使用することができる。

シロップ剤として製造する場合、例えば安定剤（ェデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜選択して使用することができる。

本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、医薬上許容される添加物、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マン二トール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液など）、保存剤（パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノ一ル、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ-ゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など）、増粘剤 (ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリエチレングリコールなど）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、 pH調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。

上記シロップ剤、注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよく、等張化剤は、通常、浸透圧が約 229〜約 343 mO s mとなるよう、約 0. 5〜約 5. OwZv%を添加する。また、緩衝剤は約 0. 0 1〜約 2. 0 / %程度、增粘剤は約0. 0 1〜約1. Ow/v%程度、安定化剤は約 0. 001〜約1. 0 w/v%程度になるように添加する。 pH調整剤は、適宜添加し、通常 pH約 3〜約 9、好ましくは約 4〜約 8になるように添加する。

特に点眼剤として使用する場合、ソマトスタチン受容体作動薬の濃度は、通常下限は約 0. 000 5 wZv%、約 0. 00 1 w/v%、約 0. 005 w/ v%であり、上限は約 1. 0 %、約0. 5w/v%、約 0. l wZv%、約 0. 05w/v%、約 0. 0 1 w/v%に調製される。

本発明におけるソマトスタチン受容体作動薬の投与量は対象となる疾患、症状、投与対象、投与方法などにより異なるが、例えば PRK手術後の角膜知覚回復剤として成人の眼に局所的に使用する場合には、例えばソマトスタチン約 0. 0 1 w/v%含有する点眼液を、 1回約 20〜約 50 し、 1 日数回点眼するのがよい。本明細書おょぴ図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、

I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。

DNA ：デォキシリボ核酸

c DNA ：相捕的デォキシリボ核酸

DN a s e ：デォキシリボヌクレアーゼ

S S TR ：ソマトスタチン受容体

GAPDH：グリセルアルデヒド- 3-ホスフェート -デヒドロゲナーゼ NGF ：神経成長因子

A ：アデニン

T ：チミン

G ：グァニン

C ：シトシン

RNA ：リボ核酸

mRNA ：メッセンジャー RNA

G 1 y ：グリシン

A 1 a ：ァラニン

V a 1 ：バリン

S e r ：セリン

T h r ：スレ才ニン

C y s

M e t ：メチォニン

A s P ：ァスパラギン酸

Ly s . リジン

A r g ：アルギニン

P h e ：フエ二ルァラニン T y r ：チロシン

T r p ：トリブトファン

P r o ：プロリン

A s n ：ァスパラギン

M e ：メチル基図面の簡単な説明

図 1はゥサギ三叉神経と網膜でのソマトスタチン受容体サブタイプ（S S TR 2及び S S TR 4)の発現を示す図である。

図 2は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す位相差顕微鏡像である。 Aは無添加群、 Bは 1 ΑίΜソマトスタチン添加群、 Cは 1 0 Μソマトスタチン添加群、 Dは NGF添加群、 Εはソマトスタチン +NG F添加群の各細胞を示す。

図 3はゥサギの角膜神経を切断した後の角膜知覚の推移を示すグラフである。

*は基剤投与群に対する有意差を示す（η = 6〜1 2、平均値土標準誤差、 ρ < 0. 05) 。

図 4は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す蛍光顕微鏡像である。 Αはコントロール群、 Bは 1 0 μΜオタトレォチド添加群の各細胞を示す。

図 5は図 4と同じ試験において、全細胞数に対する神経突起形成細胞の比率

(%) 示すグラフである。 *はコントロールに対する有意差 (η= 3、平均値士標準誤差、 ρ < 0. 05) を示す。

図 6は培養ゥサギ三叉神経細胞とその細胞からの軸索伸展を示す蛍光顕微鏡像である。 Αは無添加群、 Bは 1 μΜ化合物 1添加群、 Cは 0. Ι μΜ化合物 2添加群の各細胞を示す。

図 7は図 6と同じ試験において、培養細胞のニューロフィランメント量を表す吸光度を示すグラフである（η = 3、平均値土標準誤差）。発明の実施のするための最良の形態

本発明を以下の試験例及び実施例に従いさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

試験例 1. ゥサギ三叉神経におけるソマトスタチン受容体の発現

1) 使用動物

福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ（体重 2. 0 kg) を使用した。 2) 試験方法

日本白色種ゥサギにセラクタール（xylazine) ：ケタラール（塩酸ケタミン） = 0. 5 ： 1の混合液を筋肉内注射（0. 9mLZk g) し、全身麻酔を実施した。生理食塩水で心臓灌流後、網膜と三叉神経節をそれぞれ採取した。 TRIzol Reagent (GIBCO BRL社製）を用いた AGPC法により、組織から R N Aを抽出し、 DNa s e処理によりゲノム DNAを除去した後、 SuperScripit II (GIBCO BRL社製）を用いて逆転写反応を行なった。 c D N Aを、 Platinum Taq DNA polymerase (GIBCO BRL社）を用いて表 1に記す反応条件で增幅させた。なお、プライマーは表 1記載のゥサギのソマトスタチン受容体 S STR 2遺伝子特異的プライマー（後記配列表：配列番号 1) と S STR 4遺伝子特異的プライマ一（後記配列表：配列番号 2) を使用した。網膜および GAPDHは発現の陽性コントロールとして用いた。

(表 1)

3) 試験結果

結果を図 1に示した。ゥサギ網膜（R)と三叉神経（T)におけるソマトスタチ 1$ ン受容体、 S STR 2および S S TR 4サブタイプを RT— P CR法により解祈した結果、両組織において S STR 2および S STR4とも発現が認められた。

試験例 2.培養ゥサギ三叉神経細胞における神経軸索伸展促進作用（In vitro 実験） '

1) 使用動物

福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ（生後 2〜3日目）を使用した。

2 ) 被験物質

被験物質として、ソマトスタチン（CALBI0CHEM社製， Lot B33795)および NG F (NGF- 7 S, Sigma社製）を使用した。被験物質はリン酸緩衝液（ P B S ) に Ι Ο Ο μΜ ソマトスタチン、 20 /z g/mL NGF— 7 Sになるよう溶解した。調製した試薬は一 80°Cに保存し、使用前に溶解して使用した。

3) 試験方法

三叉神経細胞の単離は Chanらの報告 (Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687 - 699， 1985) を参考にして行った。すなわち、エーテル麻酔下、ゥサギを生理食塩水で心臓灌流後、三叉神経節を切り出し、神経分散液 (住友べ一クライト) を用いて、三叉神経節を分散させ、ポリリジン/ラミニンでコートした 24ゥエルプレート（住友べ一クライト）に細胞を播種した。細胞数は 1ゥエルあたり約 3000細胞とし、培養条件は 5 % C O ₂、 95 % 空気環境下、 3 7でとした。細胞は 5%牛血清（Fetal calf serum； F C S) 添加ダブノレべッコの修正ィーグノレ培地 ZF— 1 2 (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium/Nutrient Mixture F-12： DMEM/F - 1 2 ) 培養液中に播種して 24時間培養後、培養液を F C S無添加の DMEM/F— 1 2培養液に交換した。

その後、以下の 5群：

I 無添加群

Π 最終濃度 1 Mとなるようソマトスタチンを添加した群

ΙΠ 最終濃度 10 となるようソマトスタチンを添加した群 W 最終濃度 1μ g/mLとなるよう NGF添加した群

V ソマトスタチンおょぴ NGFをそれぞれ最終濃度 ΙμΜおよび 1μ g/m Lとなるよう同時に添加した群

に分け、さらに 48時間培養した。

ソマトスタチンおょぴ NGFによる三叉神経細胞の突起形成と軸索伸展に対する効果は位相差顕微鏡を用いた観察によって形態的に評価した。

4) 試験結果

図 2は培養ゥサギ三叉神経細胞の位相差顕微鏡像を示す。（A) は第 I群の細胞を、（B) は第 Π群の細胞を、（C) は第 ΠΙ群の細胞を、（D) は第 IV群の細胞を、（E) は第 V群の細胞をそれぞれ示している。

無添加群の細胞ではわずかな神経突起の形成が認められた（A) 。 l Mソマトスタチン添加群の細胞（B)は (A)に比較して明らかに軸索伸展が促進され、 10 /iMソマトスタチン添加群の細胞（C)でも長い軸索伸展を示す細胞が多く観察された。 NGF添加群の細胞（D) および NGFとソマトスタチンを同時に添加した群の細胞（E) においても、無添加群（A) に比較して明らかに神経細胞の神経軸索伸展促進作用が認められた。

試験例 3. ゥサギ角膜神経切断後の角膜知覚機能変化（In vivo試験）

1) 使用動物

福崎養兎組合より購入した体重 1. 5 k g〜2. O k gの雄性日本白色種ゥサギを使用した。

2) 被験物質

被験物質としてソマトスタチン（CALBI0CHEM社製， Lot B33795) と NGF (N GF- 7 S, Sigma社製）を使用した。被験物質は、以下に示す基剤に溶解し、試験に用いた。

基剤処方：

塩化ナトリウム 0. 9 g

リン酸 2水素ナトリウム · 2水和物 0. 1 g

水酸化ナトリウム適量（ p H 7. 0 ) 注射用蒸留水適量

全量 100 m L

3 ) 試験方法

ゥサギにセラクタール（xylazine) ：ケタラール（塩酸ケタミン） = 0. 5 ： 1 混合液を筋肉内注射（0. 9mL/k g) し、全身麻酔を実施した。角膜を直径 6 mmのトレパンで標識し、その上位 1 80度の角膜を円形切開しながら 8. 0ナイロン縫合糸で縫合した。縫合の直後から、基剤（基剤投与群、 n = 1 0)、ソマトスタチン溶液（ 1 00 μΜ、ソマトスタチン投与群、 η = 1 2) あるいは NGF溶液（20 Ai g/mL、 NGF投与群、 n = 6) を 50 μ Ι^ずつ、 4 回 /1日、 4週間連続点眼投与した。手術後一週間は 1日 4回の被験物質点眼の際に、同時にタリビット点眼液 (Tarivid ophthamic solution, Santen) を点眼投与した。動物は室温 23 ± 3 °C、湿度 55 ± 10 %、 1 2時間照明（ 8 ： 00点灯、 20 ： 00消灯）に設定された飼育室内で 1ケージあたり 1匹収容し、飼育した。角膜知覚は Cochet- Bonnet角膜知覚計（LUNEAU社製）を用いて、手術 3日目と 1、 2、 3、 4、 6週目に測定した。角膜知覚（％)は、各個体の手術前の知覚を 1 00 %とし算出した。

4) 試験結果

図 3は角膜神経を切断後の角膜知覚の推移を経時的に示している。角膜知覚は角膜切開手術 3日後から 1週後にかけて、すべての群で急激に低下したが、 2遍目以降、緩やかな角膜知覚の回復が認められた。 3週、 4週間後にソマトスタチン投与群において、基剤投与群と比較して有意な角膜知覚回復効果が認められた（ρ < 0. 05、 Du n n e t t検定）。

試験例 4. 培養ゥサギ三叉神経細胞の軸索伸展に対するォクトレォチドの効果（In vitro試験）

1) 使用動物

福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ（生後 2〜3日目）を使用した。 2) 被験物質

ォク卜レオチド（Octreotide； SMS 201 - 995， American Peptide ComDanv, Inc. 2l| を使用した。

3 ) 試験方法

細胞培養：三叉神経細胞の単離は Chanらの報告（Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687-699， 1985) を参考にして行った。すなわち、エーテル麻酔下、生理食塩水で心臓灌流後、三叉神経節を切り出し、神経分散液（住友ベークライト）を用いて、三叉神経節を分散させた後、細胞数を計測して、ポリリシンでコートした 8ゥエルカルチャースライド（BECT0N DICKINSON) に細胞を播種した。細胞数は 1ゥエルあたり約 3 X 1 0 ³細胞とし、培養条件は 5 % C 0 ₂、 9 5 %空気下、 3 7 とした。細胞培養には-ユー口べーサル培養液（GIBG0) に B 2 7サプリメント（GIBG0； 0 . 0 2 m L /m L培養液）を添加した培養液を用い、細胞播種直後にオタトレォチド（1 0 μ Μ最終濃度）を培養液中に添加して 2 4時間培養した。

免疫染色：培養 2 4時間後に、細胞を 4 %パラホルムアルデヒトで室温で 2 時^固定し、神経細胞体おょぴ神経突起を構成するニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント 2 0 0抗体（NF, Anti- Neurofi lament 200, Sigma) を用いて神経細胞、軸索および突起を蛍光染色した。染色細胞は蛍光顕微鏡からコンピュータに画像として取り込み、画像解析ソフト（MacSCOP, MITANI CO. ) を用いてオタトレォチドによる突起形成と軸索伸展に対する効果を評価した。すなわち、細胞の軸索伸展長および細胞体直径を画像解析ソフトを用いて測定し、細胞体の直径の 2倍以上長さの軸索を持つ細胞を神経突起形成細胞として全細胞数に対する比率（％) を計算した。

4 ) 試験結果

図 4は培養ゥサギ三叉神経細胞におけるオタトレォチドの神経突起、軸索伸展効果を示している。 ( A )はォクトレォチド無添加培養液で 2 4時間培養したコントロールのゥサギ三叉神経細胞を、（B )はオタトレォチドを最終濃度 1 0 μ Μ 添加した培養液で 2 4時間培養した細胞を示す。コント口ールの細胞群に比較し、オタトレォチド添加群では神経突起形成細胞が増加することが確認された。図 5は神経突起形成細胞の全細胞数に対する比率（％) を示している。神経突起形成細胞の比率はコントロール群では全細胞の約 2 1 %、オタトレオチド添加群では全細胞の約 4 3 %であり、ォクトレオチド添加による神経突起形成細胞の有意な増加が認められた（n = 3、平均値土標準誤差、 t検定、 p < 0. 0 5 %)o

以上のことから、ソマトスタチンのアナ口グであるオタトレオチドは三叉神経細胞の軸索伸展を促進することが分った。

試験例 5. 培養ゥサギ三叉神経細胞の軸索伸展に及ぼすソマトスタチン受容体ァゴニストの効果（In Vitro実験）

1 ) 使用動物

北山ラベスより購入した日本白色種ゥサギ（生後 2〜3日）を使用した。 2) 被験物質

被験物質であるソマトスタチン受容体ァゴエストとして、 S S TR 2特異的ァゴニストである、 6—アミノー 2— ( 3 - ( 1 H—インドール一 3—ィル） - 2 - ( (4 - ( 2—ォキソ一 2、 3—ジヒドロべンゾイミダゾール一 1—ィノレ）ピぺリジン一 1一カルボニル）ァミノ）プロピオニルァミノ）へキサン酸 t _プチルエステル（以下、化合物 1と称する。）、および、 S S TR 4特異的ァゴニストである、 1― ( 3 - (N— ( 5—プロモピリジン一 2—ィル) — N 一（3 , 4—ジクロ口ベンジル）ァミノ）プロピル）一 3 _ ( 3— ( 1 H—ィミダゾルー 4 _ィル) プロピル) チォゥレア（以下、化合物 2と称する。 )を使用した。化合物 1は特表 2 0 0 1 - 5 1 9 8 1 2 (WO 9 8 /4 4 9 2 2)、実施例 4の化合物で、実施例 2の方法に従って合成した。化合物 2は特表 2 0 0 1 - 5 2 5 7 9 3 (WO 9 7/4 3 2 7 8)実施例 1 5の記載に従い合成した。

3) 試験方法

細胞培養：ゥサギ三叉神経細胞の単離は Chanらの報告（Kuan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41： 687 - 699， 1985) を参考にして行った。すなわち、エーテル麻酔下、生理食塩水で心臓灌流を施した後、三叉神経節を取り出し、神経分散液（住友べ一クライト）を用いて三叉神経節を分散させ、三叉神経細胞を調製した。細胞培養には Neurobasal medium (GIBC0) に B27 Supplement (GIBC0 ;最終濃度. 2 % v/v) および L- Glutamin (GIBCO ;最終濃度. I mM) を添加した培養液を用い、培養条件は、 5 % C02, 95 % air, 100 % humidity, 37 °C, 4 8時間とした。細胞はポリリジンでコートした 8ゥヱルカルチャースライド（BECT0N DICKINSON) に約 3 X 10³細胞 Zゥエル、あるいはポリリジンでコートした 96ゥエルプレートに 3 X 10³細胞/ゥエルとなるよう播種し、被験物質群の培養液中には化合物 1 (最終濃度 1 μ Μ)または化合物 2 (最終濃度 0. 1 μ Μ) を添加した。

細胞染色： 4 8時間培養終了後、 9 6ゥエルプレートに播種した細胞を 4 °/₀ パラホルムアルデヒドにて固定し、神経細胞体および神経突起を構成するニュ一口フィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント 200抗体（Sigma) および H R P結合ャギ抗マウス IgG抗体（和光純薬）を用いて細胞のニューロフイラメントを標識した。標識した細胞上に 50 の 0. 02% H₂0₂ (Nacalai Tesque) および 0. 2°/。 o-phenylenediamine (Sigma) を含むクェン酸緩衝液を添加して 30 分間発色させた後、 50 の 4. 5 M H₂S0₄ (Nacalai Tesque) を添加して反応を停止した。発色終了後、これの 492 nmの吸光度を測定し、この測定値を染色された-ユーロフイラメント量として、神経突起形成の指標とした（Taniwaki T. , et al. Dev. Brain Res. (1995) 88, 109 - 166)。 8ゥエルカルチャースライドに播種した細胞は、 4 %パラホルムアルデヒドを用いて固定し、杭-ユーロフイラメント 200抗体（Sigma) を用いて固定した標本を染色し、 Alexa Fluor 568結合二次抗体（Molecular probes) を用いて蛍光標識した。蛍光標識された細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、細胞像をコンピュータに画像として取り込んだ。

4 ) 実験結果

図 6は培養ゥサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示している。（A)はソマトスタチン受容体ァゴニスト無添加培養液で培養したコントロール群の細胞を、 ( B )は化合物 1を最終濃度 1 μΜ添加した群の細胞を、（C )は化合物 2を最終濃度 0. 1 μΜ添加した群の細胞を示している。コントロール群の細胞に比較し、化合物 1または化合物 2を添加した群の細胞では神経突起形成細胞が增加することが確認された。図 7は各添加群の細胞のニューロフイラメント量を表す吸光度を示すグラフである。コントロール群の吸光度は 0 . 7 9 8、化合物 1添加群おょぴ化合物 2添加群ではそれぞれ 0 . 8 7 6および 0 . 8 5 0であった。すなわち、ソマトスタチン受容体ァゴニスト添加によってニューロフィラメント量が増加しており、神経突起形成細胞の增加を反映していると考えられた。以上のことから、ソマトスタチン受容体ァゴニストである化合物 1と化合物 2は三叉神経細胞の軸索伸展を促進する作用のあることがわかった。

以下に製剤実施例を示す。

実施例 1 錠剤

ソマトスクチン 5 0 m g

乳糖 8 0 m g

デンプン 1 7 m g

ステアリン酸マグネシウム 3 m g

結晶セルロース 1 0 m g

以上の成分を 1錠分の材料として、常法により錠剤を成形する。錠剤は必要に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプ口ピルメチルセルロースなど）、糖衣おょぴフィルム（例えばェチルセルロース）を適用してもよレ、。

実施例 2 カプセル剤 '

ソマトスタチン 7 5 m g

マンニトール 7 5 m g

デンプン 1 7 m g

ステアリン酸カルシウム 3 m g

以上の成分を 1カプセル剤の材料として均一に混合し、常法により顆粒状とし、硬カプセルに充填する。この充填する前に必要に応じて顆粒は通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセル口ース）、糖衣またはフィルム（例えばェチルセルロース）を適用してもよい。実施例 3 注射剤化合物 1 750 m g

カノレボキシメチノレセノレロースナトリウム 500 m g

注射用水

全量 1 00 mL 以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。

実施例 4 点眼剤

化合物 2 50 m g

ホウ酸 700 m g

ホウ砂適量（pH7. 0) 塩化ナトリウム 500 m g

ヒドロキシメチノレセノレロース 0. 5 g

ェデト酸ナトリゥム 0. 05 m g 塩化ベンザルコニゥム 0. 005 m g 滅菌精製水

100 mL 滅菌精製水 8 OmLを約 80°Cまで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液に化合物 2、塩化ナトリウム、ホウ酸、ェデト酸ナトリゥムおよび塩化ベンザルコニゥムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えて p Hを 7に調整する。滅菌精製水を加えて 1 0 OmLまでメスアップする。

実施例 5 点眼剤

酢酸ォクトレオチド 1 1 2 m g

D—マンニトール 4. 5 g

リン酸ニ水素ナトリウム 0. 1 g

水酸化ナトリウム適量（pH 7. 0) 滅菌精製水

1 00 mL

滅菌精製水 8 OmLに酢酸ォクトレオチド、 D—マンニトール、リン酸二水素ナトリゥムを加えて溶解する。水酸化ナトリゥムを適量加えて p Hを 5 .

0に調整する。滅菌精製水を加えて 1 0 O m Lまでメスアップする。調製した点眼剤をメンブランフィルターで滅菌ろ過後、デイスポーザブル（ュュットドース）容器に充填、密封する。産業上の利用可能性

本発明のソマトスタチン受容体作動薬を含有する医薬は、三叉神経細胞軸索伸展促進作用および角膜知覚機能回復作用を有することから、角膜神経の損傷などに伴う角膜知覚機能低下の改善および角膜知覚機能低下に伴うドライアイ症状の改善に有用である。具体的には、ソマトスタチン受容体作動薬を適用することにより、白内障手術後や L A S I K手術後の角膜知覚の低下、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、ドライアイ症状の改善効果が期待できる。以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の新規な教示と利点から実質的に逸脱しない範囲でいろいろな修正と変更をなすことは可能であるので、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。

本出願は、日本で出願された特願 2 0 0 2— 3 1 8 8 8 1および特願 2 0 0 3 - 0 4 0 2 5 0を基礎としており、それらの内容は本出願にすべて包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進剤。

2 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復剤。

3 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療剤。

4 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療剤。

5 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜神経軸索伸展促進用医薬組成物。

6 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜知覚回復用医薬組成物。

7 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有するドライアイ治療用医薬組成物。

8 . ソマトスタチン受容体作動薬を含有する角膜上皮欠損治療用医薬組成物。

9 . 角膜神経軸索伸展促進用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用。

10. 角膜知覚回復用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作働薬の使用。

11、ドライアイ治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容

体作動薬の使用。

12. 角膜上皮欠損治療用医薬組成物を製造するためのソマトスタチン受容体作動薬の使用。

13. 角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展促進方法。

14. 角膜知覚の回復が必要される疾患対象にソマトスタチン受容体作動

薬の有効量を投与することによる角膜知覚回復方法。

15. ドライアイに罹患した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによるドライアイの治療方法。

16. 角膜上皮が欠損した疾患対象にソマトスタチン受容体作動薬の有効量を投与することによる角膜上皮欠損の治療方法。