CN108379556A - 骨形成蛋白-4在治疗角膜病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及骨形成蛋白‑4在治疗角膜病的药物中的用途，BMP4对角膜上皮和基质有轻度的促进生长作用，治疗由上皮破损而导致的CNV，BMP4可作为修复上皮破损药物，BMP4用于抑制角膜炎性反应，在角膜损伤修复过程中发挥重要作用，其给药方式便捷无创伤，易于推广。

Description

骨形成蛋白-4在治疗角膜病的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及骨形成蛋白-4在治疗角膜病的药物中的用途。

背景技术

角膜病是临床上的常见疾病，也是世界最重要的致盲性眼病之一。角膜正常情况下，是无血管，透明的结缔组织，是眼表的第一道屏障，是屈光系统的重要组成部分。角膜暴露于外界，易受微生物、外伤、化学及物理因素刺激影响，受损害的机会较多，且角膜没有血管组织，营养供应受到一定限制，因此一旦有微生物侵入，易发生感染。其中，角膜上皮位于角膜的最外层，更容易受到病原微生物等的攻击。

角膜正常情况下，是无血管、透明的结缔组织，眼表的第一道屏障，是眼前节屈光系统的重要组成部分。角膜新生血管(Corneal Neovascularization,CNV)在病理情况下会出现，新生的血管从角膜周边血管丛的毛细血管和小静脉发出分支，可以阻挡进入眼内光线，影响视觉敏感度。CNV疾病致盲率非常高，在美国，眼科就诊病人中的致盲率高达4.14％，我国每年有大量的患者因此失明。

角膜新生血管是多种眼部疾病的常见并发症，CNV在临床上可分为3类，深层型新生血管侵及后弹力层，基质型新生血管，血管翳型新生血管。CNV可继发于化学烧伤、缺血、感染、外伤和炎症等疾病。导致角膜炎症反应进一步加重，角膜水肿和角膜瘢痕形成。其他原因导致的CNV包括角膜接触镜，角膜缘干细胞缺失，角膜结膜退行性病变，比如翼状胬肉和角膜边缘变性。CNV也是角膜移植排斥反应发生的一个主要原因，严重影响穿透性角膜移植手术预后。目前CNV治疗包括滴用皮质类固醇眼药水，非甾体抗炎药，光动力治疗，激光光凝术，细针导热疗法，结膜，角膜缘干细胞及羊膜移植治疗，抗新生血管药物治疗。但是上述这些方法在临床治疗上，均存在一定的局限性，可导致相关的副作用。特别是长期使用激素后引起高眼压，白内障等并发症。由于目前对于角膜新生血管的发病机制尚未完全清楚，因此并无非常有效的治疗方法。如何有效地抑制CNV的发生和发展，至今已成为角膜病研究中的热点。

现有的研究表明抗新生血管治疗并不能完全消退新生血管，原因之一是细胞因子/生长因子不止VEGF能够导致CNV，比如PDGF，MMPs，血管抑素，内皮抑制素，色素上皮衍生因子，血小板反应素，胰岛素样生长因子等均有参与作用。

目前没有CNV形成的确切机制，CNV是多种因素共同参与作用的结果，各种因素之间又有着错综复杂的联系。VEGF是目前CNV关注的重点因子，当前研究治疗CNV最常用的为VEGF抑制剂，有些药物已应用于临床治疗，这些研究结果将为抗CNV治疗提供重要的理论依据。VEGF-A是VEGF家族中促成病理性新生血管形成最重要的成员。研究表明滴用，结膜下和眼内注射VEGF-A抗体可以部分抑制CNV，在角膜碱烧伤后通过加速基底膜的重建改善角膜透明性。但它仅能针对CNV的早期，当VEGF表达量下调，对于慢性CNV即具有周细胞和平滑肌细胞的成熟新生血管，该药物则作用无效。而且该抗体只在CNV早期抑制巨噬细胞浸润，在晚期亦无明显疗效，对浅表的血管效果效果比深层的血管好。

通过抗VEGF抗体来治疗CNV存在一定的局限性，只是针对症状治疗，不能对因治疗。在一些病例中一段时间内需要重复治疗。新生血管产生的机制复杂，各个致病因素之间相互作用，这就为药物抑制CNV的形成提供了许多作用位点和契机。

角膜组织表达多种细胞因子和受体，如胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子等构成角膜细胞因子网络，调节角膜细胞的代谢，维持角膜生理的动态平衡，参与角膜的免疫调节，角膜上皮损伤的修复过程也是由多种细胞和众多细胞因子在时间和空间上高度协调而完成的。近年来通过免疫组化、原位杂交等方法发现，BMPs在鼠类动物的眼组织中广泛表达，其中包括:角膜上皮、结膜上皮、角膜内皮、视网膜色素上皮、睫状体、虹膜和神经节细胞等。BMPs可协同其他细胞因子一起构成角膜的细胞因子网络。这些细胞因子通过自分泌、旁分泌和远端分泌等方式引起靶细胞的生物学变化，产生特定的生物学作用，从而为维持角膜组织的正常功能或在其损伤后发挥作用。在角膜病的发生、发展、转归过程中有众多的细胞因子参与其中，研究这些细胞因子的作用可为日后角膜疾病的临床治疗奠定基础。临床应用表皮生长因子等药物促进角膜上皮损伤修复，均取得一定的疗效，但是具有新生血管化，引起CNV等风险。但有趣的是，目前公认的最有效的对抗CNV的治疗方法是滴用贝伐单抗，但其副作用是加剧角膜上皮缺损，这表示贝伐单抗并不适合用于同角膜上皮缺损并发的CNV。因此，寻找促进角膜上皮损伤修复的最佳药物，减少副作用是十分必要的。

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是细胞外蛋白，通过结合细胞表面的蛋白受体发挥作用。BMP4可以抑制肿瘤细胞生长，在肺干细胞分化中起重要作用，调控肺中假复层纤毛柱状上皮的增殖和脱落。BMP4可以介导血管内皮细胞凋亡，抑制血管新生。目前研究表明，BMP4在正常成人角膜各层均有表达，提示骨形成蛋白家族成员可参与维持人角膜的生理功能及代谢平衡。而且BMP4在大泡性角膜病变及圆锥角膜上皮细胞的表达较正常角膜明显升高。损伤后的上皮细胞在迁移、增生时，会合成MMP-9，当用相应抗体中和MMP-9后，上皮迁移明显加快，暗示MMP-9与上皮迁移前缘后方的基底膜及基质的降解重构有关。MMP-9的表达伴随上皮细胞的大量增长而增加，当基底膜完全合成，MMP-9的水平则明显下调。

发明内容

本发明的目的是提供BMP4在抑制角膜新生血管的药物中的用途，其具有抑制角膜新生血管和对角膜上皮和基质有轻度的促进生长方面的作用。

本发明的另一个目的是提供一种以BMP4为活性成分的滴眼剂。

更优的技术方案：所述的滴眼剂活性成分BMP4的浓度为1ug/ml-50ug/ml。

更优的技术方案：所述的滴眼剂活性成分BMP4的浓度为20ug/ml

本发明通过研究发现BMP4和BMP受体-II结合后，与BMP受体-I磷酸化后形成复合物，激活下游受体Smad家族，并与Smad1和(或)Smad5磷酸化形成R-Smads，Smad4与R-Smads一起组成激活的Smad复合物进入细胞核。经过系列反应后参与调控VEGF，TNFa和MMP9的表达。泛素连接酶(Smad ubiquitination regulatory factor，Smurf)1是常见的Smad拮抗剂，能够阻断BMP4与Smad的结合，从而中断后续反应的发生。BMP4对CNV具有显著的抑制作用，BMP4对角膜上皮和基质有轻度的促进生长作用，治疗由上皮破损而导致的CNV，BMP4可作为修复上皮破损药物，BMP4用于抑制角膜炎性反应，在角膜损伤修复过程中发挥重要作用，其给药方式便捷无创伤，易于推广。

附图说明

图1为缝线诱导大鼠角膜新生血管墨汁灌注铺片；

图2为BMP-4抑制缝线诱导的大鼠CNV墨汁灌注铺片，图2中：A未处理组，B对照组，C药物处理组，D和E分别从CNV的长度和密度来说明BMP4抑制CNV的效果，测量应用

图3为BMP-4有效抑制角膜血管生成因子ELISA结果；

图4为MTT实验检测三种细胞增殖促进率与BMP4浓度关系折线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1：制作缝线诱导大鼠CNV模型，并观察CNV的变化规律。

动物手术前麻醉用8％水合氯醛腹腔注射。托吡卡胺眼药水在局部应用(桑滕，大阪，日本)，应用10-0角膜缝线(Johnson&Johnson Medical Ltd.,St Stevens-Woluwe,Belgium)距离角巩膜缘1.5mm处，通过上皮和基质层，但未穿透内皮层，分别缝线两针。两针之间的距离是1毫米。术后应用0.3％氧氟沙星眼膏预防感染。随着时间的推移，如果缝合被移除，自然存在的自然血管消退，因此，缝线一直保持到治疗结束。

如图1所示，在缝线诱导后第7天，CNV生长最为活跃，形成粗大，密集的毛细血管网。图1中：A正常角膜，B缝线诱导后第1天，缝线附近角膜水肿，角膜缘血管扩张，C缝线诱导后第3天，缝线附近角膜缘血管向缝线方向伸展，D缝线诱导后第5天，缝线附近角膜缘血管向缝线方向明显生长，E缝线诱导后第7天，由附近角膜缘向缝线方向生长出粗大茂密的新生血管网，F缝线诱导后第14天，围绕缝线方向生长出粗大茂密的新生血管网，血管较之前有消退。

实施例2：以BMP4为活性成分的滴眼液的配置及其应用。

取4mM HCL溶解BMP4制得20ug/ml的BMP4溶液，选择此时间点给实施例1中制得的缝线诱导大鼠CNV模型外眼滴用20ug/ml的BMP4溶液，1滴/次，3次/天，连续7天(此过程中角膜缝线保留)，以4mMHCL溶液为对照组。如图2所示，发现滴用7天后滴药组CNV的面积明显小于对照组。如图3所示，应用了ELISA试剂盒检测角膜中VEGF，TNFa，MMP-9的蛋白水平，A示角膜VEGF与BMP4的ELISA结果，发现用药组VEGF蛋白含量显著下降，而BMP4在用药过程中组别间未见差异。B示角膜MMP-9和TNF-α的ELISA结果，发现两者在用药组均有明显下降。实验组较对照组明显降低，具有统计学意义(*P<0.01)。

因角膜上皮细胞只有4-6层细胞，非常薄，刀片刮除法更容易控制损伤的的范围和深度，同时也是研究角膜上皮损伤后修复的理想模型。选用此模型研究药物的对比效果。大鼠经腹腔麻醉及眼表麻醉后，在手术显微镜下术者用角膜环钻在角膜中央轻轻刻画直径为6mm的上皮圆形区域，无菌棉签蘸取20％浓度酒精，在刻环中央放置30秒钟之后用大量无菌水冲洗，然后用角膜上皮刀将印刻区域内的上皮细胞层全部刮除。双眼均建立模型，并随机分为BMP4组和VEGF抗体组，每组7只大鼠。BMP4组用药方法：模型建立当天，左眼滴加20ug/ml BMP4蛋白，1滴/次，3次/天，持续2天。右眼滴加相应溶剂，方法同前。VEGF抗体组用药方法：模型建立当天，左眼滴加5ug/ml VEGF抗体，1滴/次，3次/天，持续2天。右眼滴加相应溶剂，方法同前。应用荧光素钠染色检测大鼠角膜上皮损伤的情况，随后对石蜡切片进行HE染色和TUNEL染色观察角膜上皮细胞的变化情况，发现滴用7天后滴药组CNV的面积明显小于对照组。

实施例3：研究角膜损伤后修复过程中BMP4，VEGF和MMP-9之间的作用关系。

对大鼠角膜上皮细胞、角膜基质细胞和脐带静脉内皮细胞进行了MTT细胞活性测定实验，设计了一系列浓度梯度的BMP4分别作用于三种细胞，最后通过溶解细胞琥珀酸脱氢酶还原MTT生成的甲臜结晶，在酶标仪下测定吸光度，获得实验数据。建立角膜上皮损伤模型采用上皮刮除法，其步骤如下：将以wistar大鼠作为实验动物，将实验分为正常组织检测部分及上皮损伤组织检测部分，做石蜡切片并进行TUNEL和HE染色。培养角膜上皮细胞，向培养基中分别添加BMP4蛋白，VEGF抗体并设置溶剂对照和空白对照，培养一天后，检测各分组表达的BMP4，VEGF，MMP-9和Capase-3的表达量和上皮细胞活性，并进行TUNEL染色。如图4所示，当BMP4溶液的质量浓度在1ug/ml-20ug/ml时，最适BMP4浓度为20ug/ml，对角膜上皮细胞和角膜基质细胞有轻度的促进作用，而对脐带静脉内皮细胞具有显著的抑制作用，。根据上述实验数据，为使BMP4浓度对脐带静脉内皮细胞起到明显抑制作用，而对角膜基质细胞和角膜上皮细胞不抑制。BMP4能够明显抑制CNV并且提高角膜上皮细胞活性，进一步研究揭示BMP4，VEGF和MMP-9在角膜上皮修复的形成与生长过程中的作用机制，并用检测Capase-3蛋白的表达和进行TUNEL染色两种方式来评估上皮细胞凋亡状况，通过对比分析来阐明治疗上皮损伤更有效的治疗方法，为将来可应用于临床的治疗奠定理论基础。通过以上实验结果阐明角膜损伤后修复过程中BMP4，VEGF和MMP-9之间的作用关系，比较三者在角膜上皮修复过程中发挥的不同作用，细胞实验表明BMP4可以提高上皮细胞活性。在滴用不同的试剂后，对角膜上皮中各种蛋白有否影响，进一步证实BMP4，VEGF和MMP-9在角膜修复过程中的相调控关系，为应用于临床的治疗奠定理论基础。

由以上实施例可以看出：在大鼠缝线诱导CNV模型中，造模当天与造模7天后滴用BMP4均能够有效抑制CNV，具有统计学意义。造模7天后滴用以BMP4为活性成分的滴眼液，和对照组相比，可以明显降低VEGF，TNF-a和MMP 9的蛋白水平，具有统计学意义。CNV造模当天滴用BMP4组与滴用地塞米松滴眼液组比较，疗效在统计学上无明显差异。本发明以缝线诱导大鼠CNV为模型揭示BMP4-Smad信号通路抑制CNV的作用及可能的作用机制，提供BMP4为活性成分的滴眼液了作为治疗角膜新生血管疾病的药物。

Claims (4)

1.骨形成蛋白-4作为治疗角膜病药物的用途。

2.根据权利要求1所述的骨形成蛋白-4作为治疗角膜病药物的用途，其特征在于：所述的药物为一种以骨形成蛋白-4为活性成分的滴眼剂。

3.根据权利要求2所述的一种以骨形成蛋白-4为活性成分的滴眼剂，其特征在于：所述的骨形成蛋白-4的浓度为1ug/ml-50ug/ml。

4.根据权利要求2所述的一种以骨形成蛋白-4为活性成分的滴眼剂，其特征在于：所述的骨形成蛋白-4的浓度为20ug/ml。