CN100413538C - 角膜疾病治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新类型的药剂，它恢复角膜外科手术后的角膜敏感性或者改善干眼病症。促生长素抑制素受体激动剂的应用期望提供对以下改善的效果：白内障外科手术或LASIK外科手术后降低的角膜敏感性，与角膜神经变性如神经性麻痹角膜病、角膜溃疡、糖尿病性角膜病等有关的降低的角膜敏感性和干眼。

Description

角膜疾病治疗剂

技术领域

本发明涉及包含促生长素抑制素(somatostatin)受体拮抗剂的角膜神经轴突延伸促进剂，和一种基于角膜神经轴突的延伸、用于恢复或改善角膜敏感性或治疗干眼或角膜上皮缺陷的药剂。

背景技术

由于角膜神经被角膜外科手术如激光光折射角膜切开术(PRK)、激光辅助原位角膜磨削术(LASIK)、角膜移植术等切断，角膜敏感性据说通常降低约3周至1年。作为角膜敏感性功能降低的结果，在角膜外科手术后的患者眨眼次数较少，成问题地是显示干眼症状。在干眼患者中，泪腺功能减退产生角膜低敏感性，其在与另外的泪腺功能减退结合后，可能加重角膜表面病症。然而目前角膜外科手术后的角膜敏感性的恢复被留待自发恢复，在干眼的治疗中，未提供积极治疗以恢复角膜敏感性。

促生长素抑制素是在1973年从下丘脑中分离的肽，为一种促生长素释放抑制因子(SRIF)，至今已经发现五种亚类的促生长素抑制素受体，它们各自称为SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4和SSTR5。促生长素抑制素作为促生长素释放抑制因子在神经组织中广泛分布，对于虹膜、睫状体和视网膜已经证实促生长素抑制素受体在眼组织中的存在(Mori，M.等，Neuroscience Letters，1997，vol.223，No.3，pp.1 85-188)。

另外，促生长素抑制素在生物机体的内分泌系统、外分泌系统、神经系统等中具有极其多样的功能，并且已经报导参与例如神经传递、神经细胞生长调节等，对于PC12细胞中的神经轴突延伸具有促进作用(Ferriero，M.D.et.，Developmental Brain Research，vol.80，p.13-18(1994))。

作为涉及促生长素抑制素的眼病，已知青光眼、角膜基质炎、虹膜炎、视网膜炎、白内障、结膜炎等(JP-A-2002-515912，对应于WO98/58646，EP1019050)。

另外，已经尝试将促生长素抑制素本身或其衍生物开发成药物，例如作为促生长素抑制素受体激动剂的奥曲肽，作为用于胃肠道激素产生肿瘤和肢端肥大症·垂体性巨人症的治疗药物可以商购获得。另外，例如已知下列各项：兰瑞肽(JP-A-2-289599，对应于EP389180)，AN-238(JP-A-2000-502055，对应于WO97/19954，US5843903)，PTR-3173(JP-A-2002-518339，对应于US6051554，US6355613)，对SSTR2或SSTR3具有亲和力的胺衍生物(JP-A-2000-226373，对应于US6329389)，具有促生长素抑制素受体功能调节作用和用于预防或治疗糖尿病、肥胖症、糖尿病并发症等的芳族胺衍生物(JP-A-2000-191615，对应于EP1123918)，具有促生长素抑制素受体功能调节作用和用于预防或治疗糖尿病等的稠环化合物(JP-A-11-209356，对应于US6352982)，

例如具有类促生长素抑制素活性的肽，其由式I表示

X¹-X²-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-X³-Ser-X⁴

其中X¹是Asp-Arg-Met-Pro-Cys，Arg-Met-Pro-Cys，Met-Pro-Cys，Pro-Cys或Cys，X²是Arg或Lys，X³是Ser或Thr，和X⁴是Cys-Lys或Cys(JP-A-10-174587)，

例如，由式II表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2001-518895，对应于WO98/45285，EP977751)，

例如由式III表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2001-519811，对应于WO98/44921，US6063796)，

例如，由式IV表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2001-519812，对应于WO98/44922，US6063796)，

由式V表示的促生长素抑制素激动剂

其中R¹¹是选自卤原子、氰基、羧基、(C₁-C₆)烷基和(C₁-C₆)烷氧基的基团；X是-CH₂-基团，-SO₂-基团，-CO-基团或直键；Y是CH基团或氮原子等(JP-A-2001-114761，对应于EP1086947A1)，

例如，由式VI表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2002-3498，对应于US2001/047030)，例如，作用于SSTR2的促生长素抑制素激动剂，如5-胍基-2((2-(甲苯-4-磺酰基)-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羰基)-氨基)-戊酸甲酯等(US2002/91125A1)，

例如，由式VII表示的促生长素抑制素激动剂

等(US2002/91090A1)，

由式VIII表示的促生长素抑制素类似物

(WO2002/10192)，

诱导来自一种或多种亚类的促生长素抑制素受体的激动剂效应的咪唑基衍生物(WO99/64401)，对促生长素抑制素受体具有亲和力的乙内酰脲衍生物(WO2001/85718)，用作促生长素抑制素受体配体的4-氨基哌啶衍生物(WO2001/44191)，

例如，由式IX表示的促生长素抑制素激动剂

等(US6387932)，

例如由Phe-cyclo(Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH₂表示的SSTR1激动剂(WO2000/75186)，

由式X表示的化合物

等，其具有选择性的SSTR4结合作用并且预计具有青光眼治疗作用(US6127343)，

由式XI表示的促生长素抑制素类似物

其中R₁是C₁-C₄烷基，金刚烷基(adamantyl)等(WO2000/10589)，

例如，由式XII表示的促生长素抑制素激动剂

等(WO99/22735，对应于US6117880)，

例如由式XIII表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2001-502712，对应于US6020349，US6083960)，

例如由式XIV表示的促生长素抑制素激动剂

等(JP-A-2001-525793(对应于WO97/43278，EP912551)，例如，由环[Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe(4-(3-甲氧基苯基)咪唑)-Gly]表示的环状促生长素抑制素类似物等(JP-A-2002-518409(对应于WO99/65942，EP1086131)，麦角灵衍生物，它是用于治疗焦虑、抑郁等的SSTR1选择性激动剂(JP-A-2001-527580(对应于WO98/54183，US6221870)，作为促生长素抑制素受体功能调节剂的联苯化合物(JP-A-2002-80439，对应于WO2002/000606)，与促生长素抑制素受体结合以阻断Na通道的β-咔啉衍生物(JP-A-2002-517500，对应于WO99/64420，EP1086101)，伐普肽(SharonGazal等，Journal of Medicinal Chemistry，vol.45，p.1665-1671(2002))，作为具有促生长素抑制素受体结合抑制作用和具有特定化学结构的化合物的胺衍生物，该化学结构其特征在于用氮原子取代下列基团的2-位：

(JP-A-2002-348287)，对促生长素抑制素受体具有亲和力和选择性的吡啶并噻吩并二氮杂草(JP-A-2002-541260，对应于WO2000/61587)等。

相反，没有关于在角膜内存在促生长素抑制素受体的报导。此外，关于角膜神经，已经证明大多数来源于从三叉神经神经节分开的第一分支(眼分支)的神经分布在角膜中，并且密切涉及角膜外科手术后的敏感性恢复，角膜上皮的再生等(Ke-Ping Xu等Cornea，vol.15，pp.235-239(1996))。

然而，没有发现教导在三叉神经(角膜神经)中存在促生长素抑制素受体或通过促生长素抑制素促进三叉神经(角膜神经)的神经轴突延伸的报导。

发明内容

本发明提供一种药剂，其在具有角膜敏感性功能降低的患者，角膜外科手术如激光光折射角膜切开术(PRK)、激光辅助原位角膜磨削术(LASIK)、角膜移植术等之后的患者和干眼患者等中显示角膜敏感性功能恢复，并且治疗与这些角膜敏感性功能降低相关的角膜上皮疾病。

本发明人已经研究以便提供一种新类型的恢复角膜外科手术后的角膜敏感性或改善干眼症状的药剂，并且首次发现促生长素抑制素对三叉神经(以下有时称为角膜神经)具有轴突延伸促进作用，和促生长素抑制素受体存在于三叉神经中。基于这些发现他们另外研究并且完成了本发明，将促生长素抑制素受体激动剂用作恢复角膜敏感性等的药物。

因此，本发明涉及

(1)一种角膜神经轴突延伸促进剂，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(2)一种用于恢复角膜敏感性的药剂，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(3)一种干眼治疗剂，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(4)一种角膜上皮缺陷的治疗剂，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(5)一种用于促进角膜神经轴突延伸的药物组合物，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(6)一种用于恢复角膜敏感性的药物组合物，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(7)一种用于治疗干眼的药物组合物，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(8)一种用于治疗角膜上皮缺陷的药物组合物，其包含促生长素抑制素受体激动剂，

(9)促生长素抑制素受体激动剂在制备用于促进角膜神经轴突延伸的药物组合物中的应用，

(10)促生长素抑制素受体激动剂在制备用于恢复角膜敏感性的药物组合物中的应用，

(11)促生长素抑制素受体激动剂在制备用于治疗干眼的药物组合物中的应用，

(12)促生长素抑制素受体激动剂在制备用于治疗角膜上皮缺陷的药物组合物中的应用，

(13)一种促进角膜神经轴突延伸的方法，其包含向需要促进角膜神经轴突延伸的患者(case)施用有效量的促生长素抑制素受体激动剂，

(14)一种恢复角膜敏感性的方法，其包含向需要恢复角膜敏感性的患者施用有效量的促生长素抑制素受体激动剂，

(15)一种治疗干眼的方法，其包含向受干眼影响的患者施用有效量的促生长素抑制素受体激动剂，

(16)一种治疗角膜上皮缺陷的方法，其包含向具有角膜上皮缺陷的患者施用有效量的促生长素抑制素受体激动剂。

如上所述，促生长素抑制素受体激动剂是指促生长素抑制素本身以及作用于促生长素抑制素受体并且显示类似于促生长素抑制素的作用的那些，包含称为促生长素抑制素激动剂、促生长素抑制素类似形式、促生长素抑制素类似物等的那些。

作为促生长素抑制素受体激动剂，可以有利地使用促生长素抑制素本身以及任何化合物，只要它作用于促生长素抑制素受体并且显示类似于促生长素抑制素的作用。作为这种化合物，例如，可以提及作为促生长素抑制素受体激动剂的奥曲肽，在JP-A-2-289599(对应于EP389180)中描述的兰瑞肽，八肽如伐普肽等，在JP-A-2000-502055(对应于WO97/19954，US5843903)中描述的类促生长素抑制素环肽，如AN-238等，在JP-A-2002-518339(对应于US6051554，US6355613)中描述的主链环化促生长素抑制素类似物如PTR-3173等，在JP-A-226373(对应于US6329389)和JP-A-2002-348287中公开的胺衍生物，在JP-A-2000-191615(对应于EP1123918)中描述的芳族胺衍生物，在JP-A-11-209356(对应于US6352982)中描述的稠环化合物，在JP-A-10-174587中描述的肽，在JP-A-2001-518895(对应于WO98/45285，EP977751)，JP-A-2001-519811(对应于WO98/44921，US6063796)和JP-A-2001-519812(对应于WO98/44922，US6063796)中描述的促生长素抑制素激动剂，在JP-A-2001-114761(对应于EP1086947A1)，JP-A-2002-3498 (对应于US 2001/047030)，US 2002/91125A1，US2002/91090 A1，US6387932，WO99/22735(对应于US6117880)和JP-A-2001-502712(对应于US6020349，US6083960)中描述的促生长素抑制素激动剂，在WO2002/10192和WO2000/10589中描述的促生长素抑制素类似物，在WO99/64401中描述的咪唑基衍生物，在WO2001/85718中描述的乙内酰脲衍生物，在WO2001/44191中描述的4-氨基哌啶衍生物，在WO2000/75186中描述的SSTR1激动剂，在US6127343中描述的化合物，其具有选择性SSTR4结合作用和青光眼治疗作用，在JP-A-2001-525793(对应于WO 97/43278，EP912551)中描述的促生长素抑制素激动剂，在JP-A-2002-518409(对应于WO99/65942，EP1086131)中描述的环状促生长素抑制素类似物，在JP-A-2001-527580(对应于WO98/54183，US6221870)中描述的麦角灵衍生物，在JP-A-2002-80439(对应于WO2002/000606)中描述的联苯化合物，在JP-A-2002-517500(对应于WO99/64420，EP1086101)中描述的β-咔啉(carbolyl)衍生物，在JP-A-2002-541260(对应于WO2000/61587)中描述的吡啶并噻吩并二氮杂(pyridothienodiazepin)等。

含有本发明的促生长素抑制素受体激动剂的药剂用于从哺乳动物(例如人，大鼠，小鼠，兔，牛，猪，狗，猫等)角膜的角膜敏感性功能降低中恢复，其中角膜神经被损伤或切断或者角膜上皮有缺陷。例如，它用作外科手术如PRK，LASIK，角膜移植术等之后恢复被降低的角膜敏感性的治疗药物，或者用作具有降低的角膜敏感性的干眼患者的治疗药物，和另外用作与角膜敏感性的功能退化有关的角膜上皮疾病的治疗药物。作为促生长素抑制素受体激动剂，更优选特异性作用于SSTR2和/或SSTR4的激动剂，SSTR2和/或SSTR4是促生长素抑制素受体亚型。

本发明的药剂系统或局部给药。对于系统给药，将其口服和肠胃外施用，作为静脉内注射剂、皮下注射剂、肌内注射剂等施用。对于局部给药，将其施用于眼。

作为本发明药剂的剂型，可以提及固体药剂如散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，栓剂等；液体如糖浆，注射剂，滴眼剂等；等等。为了生产胶囊和片剂，可以通过使用例如赋形剂(乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，微晶纤维素等)、润滑剂(硬脂酸镁，滑石，硬脂酸，硬脂酸钙等)、崩解剂(淀粉，羧甲纤维素钠，碳酸钙等)、粘合剂(淀粉浆溶液，羟丙基纤维素钠，羧甲纤维素溶液，阿拉伯树胶溶液，明胶溶液，海藻酸钠溶液等)等生产任何剂型。对于颗粒剂和片剂，可以使用适当包衣剂(明胶，蔗糖，阿拉伯树胶，巴西棕榈蜡等)、肠溶衣(例如醋酞纤维素，甲基丙烯酸共聚物，羟丙基纤维素酞酸酯，羧甲基乙基纤维素等)等形成包衣薄膜。

为了生产胶囊，将适当加入的用于改善流动性和滑动性的适当赋形剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、轻质硅酸酐和用于加压下的流动性的微晶纤维素、乳糖等以及上述崩解剂等的混合物均匀混合或成粒，用适当包衣剂包衣以形成薄膜和包装到胶囊中，或者用具有增加的塑性的胶囊基质包封模制，其含有适当的胶囊基质(明胶等)，甘油或山梨糖醇等。根据需要这些胶囊可以含有着色剂，防腐剂[二氧化硫，对羟基苯甲酸酯类(对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯)]等。胶囊可以是常规胶囊，肠溶包衣的胶囊，胃溶包衣的胶囊或缓释胶囊。当生产肠溶胶囊时，将用肠溶包衣剂包衣化合物，或将上述适当赋形剂加入化合物中，并包装在常规胶囊中或者胶囊本身可以用肠溶包衣剂包衣，或者肠溶聚合物可以用作塑模的基质。

为了生产栓剂，可以适当选择和使用栓剂基质(例如可可脂，聚乙二醇等)。

为了生产糖浆，例如，可以适当选择和使用稳定剂(乙二胺四乙酸钠等)，混悬剂(阿拉伯树胶，羧甲纤维素等)，矫味剂(单糖浆，葡萄糖等)，芳香剂等。

为了生产本发明的药剂，作为注射剂或滴眼剂，它可以通过将激动剂溶解或分散在溶液中来生产，所述溶液适当地含有药用添加剂如等渗剂(氯化钠，氯化钾，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，缓冲液(磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸盐缓冲液，ε-氨基己酸盐缓冲液等)，防腐剂(对氧基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠，乙二胺四乙酸钠，硼酸，硼砂等)，增稠剂(羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，稳定剂(亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸钠，二丁基羟基甲苯等)，pH调节剂(盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等)，等等。

尽管用于上述糖浆、注射剂和滴眼剂的添加剂的量根据所用添加剂的种类、应用等而变化，它们可以以能够实现添加剂的目的的浓度加入，等渗剂通常以约0.5至约5.0w/v％加入以使得渗透压为约229-约343mOsm。另外，缓冲液以约0.01-约2.0w/v％加入，增稠剂以约0.01-约1.0w/v％加入，稳定剂以约0.001-约1.0w/v％加入。pH调节剂适当地加入以通常获得约3至约9、优选约4至约8的pH。

对于特别用作滴眼剂，将促生长素抑制素受体激动剂的浓度下限调整为通常约0.0005w/v％，约0.001w/v％或约0.005w/v％，上限通常调节为约1.0w/v％，约0.5w/v％，约0.1w/v％，约0.05w/v％或约0.01w/v％。

尽管本发明的促生长素抑制素受体激动剂的剂量根据目标疾病、症状、施用患者、给药方法等而变化，当例如将它典型地施用于PRK外科手术后的成人的眼睛作为恢复角膜敏感性的药剂时，例如，将含有约0.01w/v％促生长素抑制素的液体滴眼剂优选滴入眼睛，1天数次，每剂量约20至约50μL。

当碱基、氨基酸等用缩写在本说明书和附图中表示时，它们是基于按照IUPAC-IUB委员会关于本领域常规使用的生化命名或缩写的缩写。其实例在下列各项中表示。当氨基酸具有光学异构体时，除非另外指出它是L-异构体。

DNA：脱氧核糖核苷酸

cDNA：互补脱氧核糖核苷酸

DNase：脱氧核糖核酸酶

SSTR：促生长素抑制素受体

GAPDH：甘油醛-3-磷酸-脱氢酶

NGF：神经生长因子

A：腺嘌呤

T：胸腺嘧啶

G：鸟嘌呤

C：胞嘧啶

RNA：核糖核酸

mRNA：信使RNA

Gly：甘氨酸

Ala：丙氨酸

Val：缬氨酸

Ser：丝氨酸

Thr：苏氨酸

Cys：半胱氨酸

Met：甲硫氨酸

Asp：天冬氨酸

Lys：赖氨酸

Arg：精氨酸

Phe：苯丙氨酸

Tyr：酪氨酸

Trp：色氨酸

Pro：脯氨酸

Asn：天冬酰胺

Me：甲基

附图简述

图1显示兔的三叉神经和视网膜中促生长素抑制素受体亚类(SSTR2和SSTR4)的表达。

图2显示培养的兔三叉神经细胞和从细胞的轴突延伸的相差显微图像，其中A显示未添加组的细胞，B显示1μM促生长素抑制素添加组的细胞，C显示10μM促生长素抑制素添加组的细胞，D显示NGF添加组的细胞，E显示促生长素抑制素+NGF添加组的细胞。

图3是显示在切断兔角膜神经后角膜敏感性的变化的图表，其中*意味着与载体给药组的显著差异(n＝6-12，平均值±标准误差，p＜0.05)。

图4显示荧光显微镜图像，该图像显示培养的兔三叉神经细胞和从细胞的轴突延伸，其中A显示对照组的细胞，B显示10μM octoreotide添加组的细胞。

图5是显示在与图4相同的试验中神经生成细胞与总细胞数的比率(％)的图表，其中*表示与对照的显著差异(n＝3，平均值±标准误差，p＜0.05)。

图6显示培养的兔三叉神经细胞和从细胞的轴突延伸的荧光显微镜图像，其中A表示未添加组的细胞，B显示1μM化合物1添加组的细胞，C显示0.1μM化合物2添加组的细胞。

图7是显示在与图6相同的试验中的吸光度的图表，该吸光度显示培养的细胞的神经丝的量(n＝3，平均值±标准误差)。

实施本发明的最佳方式

通过参考下列实验例和实施例更详细地解释本发明，这些实验例和实施例不应理解为是限制性的。

实验例1  兔三叉神经中促生长素抑制素受体的表达

1)所用动物

使用日本白兔(体重2.0kg)，购自Fukusaki Rabbit Warren。

2)试验方法

将Celactal(赛拉嗪)∶氯胺酮针剂(氯胺酮盐酸盐)＝0.5∶1肌内注射(0.9mL/kg)于日本白兔以全身麻醉。在用盐水心脏灌注后，分别获得视网膜和三叉神经。通过AGPC方法，使用TRIzol试剂(由GIBCO BRL制造)，从每个组织中提取RNA，通过DNA酶处理去除基因组DNA，使用SuperScripit II(由GIBCO BRL制造)进行反转录反应。使用Platinum TaqDNA聚合酶(GIBCO BRL)在表1所述反应条件下扩增cDNA。作为引物，使用表1所示的兔促生长素抑制素受体SSTR2基因特异性引物(稍后称为SEQ ID NO：1)和SSTR4基因特异性引物(稍后称为SEQ ID NO：2)。将视网膜和GAPDH用作表达的阳性对照。

表1

3)试验结果

结果在图1中表示。通过RT-PCR分析在兔视网膜(R)和三叉神经(T)中促生长素抑制素受体亚类SSTR2和SSTR4。结果，在两种组织中都发现了SSTR2和SSTR4的表达。

实验例2

在培养的兔三叉神经细胞中神经轴突延伸促进作用(体外实验)

1)所用动物

使用日本白兔(2-3天大)，购自Fukusaki Rabbit Warren。

2)试验物质

作为试验物质，使用促生长素抑制素(由CALBIOCHEM制造，LotB33795)and NGF(NGF-7S，由Sigma制造)。将试验物质溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中至100μM促生长素抑制素，20μg/mL NGF-7S。将制备的试剂保存在-80℃，并且在使用前溶解。

3)试验方法

按照Chan等(Kuan Y. Chan和Richard H.Haschke.Exp.Eye Res.41：687-699，1985)的报导分离三叉神经细胞。更具体地，在乙醚麻醉下，在用盐水将兔心脏灌注后，摘除三叉神经节，使用神经分散液(SUMITOMOBAKELITE Co.，Ltd.)分散三叉神经节，将细胞平板接种在包被有聚赖氨酸/层粘连蛋白的24-孔板(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)中。细胞的数量约3000个细胞/孔，培养条件为5％CO₂，95％空气，37℃。将细胞接种在Dulbecco’s改进的Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM/F-12)培养基中，培养基中添加有5％胎牛血清(FCS)，培养24小时，将培养基换成无FCS的DMEM/F-12培养基。

之后，将细胞分成下列5组：

I未添加组

II添加促生长素抑制素至终浓度为1μM的组

III添加促生长素抑制素至终浓度为10μM的组

IV添加NGF至终浓度为1μg/mL的组和

V同时添加促生长素抑制素和NGF至终浓度分别为1μM和1μg/mL的组，并培养48小时。

通过使用相差显微镜观察在形态上观察促生长素抑制素和NGF对神经突的形成和从三叉神经细胞的轴突延伸的影响。

4)试验结果

图2显示培养的兔三叉神经细胞的相差显微镜图像，其中分别地(A)显示组I的细胞，(B)显示组II的细胞，(C)显示组III的细胞，(D)显示组IV的细胞，和(E)显示组V的细胞。

在未添加组的细胞(A)中稍微观察到神经突的形成。与(A)相比，1μM促生长素抑制素添加组的细胞(B)显示明显促进轴突延伸，在10μM促生长素抑制素添加组的细胞(C)中，也观察到许多显示长轴突延伸的细胞。在NGF添加组的细胞(D)和NGF、促生长素抑制素同时添加组的细胞(E)中，与未添加组(A)相比，也观察到明显的神经细胞轴突延伸促进作用。

实验例3

兔角膜神经切割后角膜敏感性的功能变化(体外试验)

1)所用动物

使用雄性日本白兔(体重1.5kg-2.0kg)，购自Fukusaki Rabbit Warren。

2)试验物质

作为试验物质，使用促生长素抑制素(由CALBIOCHEM制造，LotB33795)and NGF(NGF-7S，由Sigma制造)。将试验物质溶解在下示载体中并用于试验。

载体配方

氯化钠                0.9g

磷酸二氢钠二水合物    0.1g

氢氧化钠              适量

                      (pH 7.0)

注射用蒸馏水          适量

                                      

总量                  100mL

3)试验方法

将Celactal(赛拉嗪)∶氯胺酮针剂(氯胺酮盐酸盐)＝0.5∶1肌内注射(0.9mL/kg)于兔子以全身麻醉。用直径为6mm的环钻标记角膜，在环中其上侧切开180度，同时用8.0尼龙缝合线缝合。将载体(载体给药组，n＝10)，促生长素抑制素溶液(100μM，促生长素抑制素给药组，n＝12)或NGF溶液(20μg/mL，NGF给药组，n＝6)滴入眼睛，50μL，4次/日，连续4周，从手术后立即开始。对于手术后1周，将泰利必妥滴眼液(Santen)与试验物质的滴入同时滴注，1天4次。将动物喂养在设定为室温23±3℃、湿度55±10％的饲养室中，12小时照明(8:00开灯，20:00关灯)，每只笼子关1只动物。在手术第3天和1，2，3，4和6周使用Cochet-Bonnet角膜敏感计(由LUNEAU制造)测量角膜敏感性。基于将每一个体手术前的敏感性作为100％计算角膜敏感性(％)。

4)试验结果

图3显示在角膜神经切割后随时间流逝角膜敏感性的变化。在所有组中从角膜切开术以后第3天至1周角膜敏感性迅速降低，但在2周后发现角膜敏感性的轻微恢复。3或4周以后，与载体给药组相比，促生长素抑制素给药组显示显著的角膜敏感性恢复作用(p＜0.05，Dunnett’s检验)。

实验例4

奥曲肽对培养的兔三叉神经细胞的轴突延伸的影响(体外试验)

1)所用动物

使用日本白兔(2-3天大)，购自Fukusaki Rabbit Warren。

2)试验物质

使用奥曲肽(SMS 201-995，American Peptide Company，Inc.)。

3)试验方法

细胞培养：通过参考Chan等(Kuan Y. Chan和Richard H.Haschke.Exp.Eye Res.41：687-699，1985)的报导分离三叉神经细胞。更具体地，在乙醚麻醉下，在用盐水将兔心脏灌注后，摘除三叉神经节，分散在神经分散液(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)中。将细胞计数并接种在包被聚赖氨酸的8孔培养板(BECTON DICKINSON)上。细胞数约为3×10³个细胞/孔，培养条件为5％CO₂，95％空气，37℃。对于细胞培养，使用加入B27添加物(GIBGO；0.02 mL/mL培养液)的Neurobasal培养基(GIBGO)，在细胞接种后立即向培养基中加入奥曲肽(10μM终浓度)，培养细胞24小时。免疫染色：在培养24小时时，用4％低聚甲醛在室温下将细胞固定2小时，用特异性识别构成神经细胞和神经突的神经丝的抗-神经丝200抗体(NF，Anti-Neurofilament 200，Sigma)荧光染色轴突和树突。将染色细胞的图像从荧光显微镜输入计算机，使用图像分析软件(MacSCOP，MITANI CO.)评估奥曲肽对神经突形成和轴突延伸的作用。更具体地，使用图像分析软件测量轴突延伸的长度和细胞的直径，将包括长度不小于细胞直径两倍的轴突的细胞作为神经生成(neuritogenetic)细胞，计算其与总细胞数的百分比(％)。

4)试验结果

图4显示奥曲肽对培养的兔三叉神经细胞中神经突和轴突延伸的作用，其中(A)显示培养在不含奥曲肽的培养基中24小时的对照兔三叉神经细胞，和(B)显示在含有浓度为10μM的奥曲肽的培养基中培养24小时的细胞。证实与对照细胞组相比，在奥曲肽添加组中神经生成细胞增加。

图5显示神经生成细胞对总细胞数的比例(％)。神经生成细胞的比例在对照组中为总细胞的约21％，在奥曲肽添加组中为总细胞的约43％，观察到由于奥曲肽的添加导致的神经生成细胞显著增加(n＝3，平均值±标准误差，t-检验，p＜0.05％)。

从以上发现作为促生长素抑制素类似物的奥曲肽促进三叉神经细胞的轴突延伸。

实验例5  促生长素抑制素受体激动剂对培养的兔三叉神经细胞的轴突延伸的影响(体外试验)

1)所用动物

使用日本白兔(2-3天大)，购自KITAYAMA LABES Co.，Ltd.。

2)试验物质

作为促生长素抑制素受体激动剂使用试验物质，6-氨基-2-(3-(1H-吲哚-3-基)-2-((4-(2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-基)哌啶-1-羰基)氨基)丙酰基氨基)己酸叔丁酯，其为SSTR2特异激动剂(以下称为化合物1)，和1-(3-(N-(5-溴代吡啶-2-基)-N-(3，4-二氯苄基)氨基)丙基)-3-(3-(1H-咪唑-4-基)丙基)硫脲(以下称为化合物2)，其为SSTR4特异激动剂。化合物1是实施例4的化合物，并且按照JP-A-2001-519812(WO98/44922)的实施例2的方法合成。按照JP-A-2001-525793(WO97/43278)的实施例15合成化合物2。

3)试验方法

细胞培养：

通过参考Chan等(Kuan Y. Chan和Richard H.Haschke.Exp.Eye Res.41：687-699，1985)的报导分离三叉神经细胞。更具体地，在乙醚麻醉下，进行用盐水灌注心脏，摘除三叉神经节。使用神经分散液(SUMITOMOBAKELITE Co.，Ltd.)中，分散三叉神经节以制备三叉神经细胞。对于细胞培养，使用加入B27添加物(GIBCO；终浓度2％v/v)和L-谷氨酰胺(GIBCO；终浓度1mM)的Neurobasal培养基(GIBCO)，培养条件为5％CO₂，95％空气，100％湿度，37℃，48小时。将细胞以约3×10³个细胞/孔接种在包被聚赖氨酸的8孔培养板(BECTON DICKINSON)上，或者以3×10³个细胞/孔接种在包被聚赖氨酸的96孔板上，试验组的培养基含有化合物1(终浓度1μM)或化合物2(终浓度0.1μM)。

细胞染色：在48小时培养完成后，用4％低聚甲醛固定接种在96孔平板上的细胞，用特异性识别构成神经细胞体和神经突的神经丝的抗-神经丝200抗体(Sigma)和HR偶联山羊抗-小鼠IgG抗体(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)标记细胞的神经丝。向标记的细胞上加入含有50μL 0.02％H₂O₂(Nacalai Tesque)和0.2％邻苯二胺(Sigma)的柠檬酸盐缓冲液，允许显色30分钟。然后，加入50μL 4.5 MH₂SO₄(Nacalai Tesque)淬灭反应。在完成着色后，测量492nm处的吸光度，将测量值当作染色的神经丝的量并用作neuritogenesis的指标(Taniwaki T.，等Dev.Brain Res.(1995)88，109-166)。用4％低聚甲醛固定涂布在8孔培养板上的细胞，将用抗-神经丝200抗体(Sigma)固定的样品染色，用Alexa Fluor 568偶联的第二抗体(Molecular probes)标记荧光。在荧光显微镜下观察荧光标记的细胞，将细胞图像输入计算机。

4)试验结果

图6显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微镜图像，其中(A)表示在不含促生长素抑制素受体激动剂的培养基中培养的对照组的细胞，(B)显示添加终浓度为1μM的化合物1的组的细胞，和(C)显示添加终浓度为0.1μM的化合物2的组的细胞。与对照组的细胞相比，证实添加化合物1或化合物2的组的细胞显示神经生成细胞增加。图7是显示吸光度的图表，该吸光度显示每个添加组细胞的神经丝的量，其中对照组的吸光度为0.798，化合物1添加组和化合物2添加组的吸光度分别为0.876和0.850。即，根据促生长素抑制素受体激动剂的加入，神经丝的量增加，认为这反映神经生成细胞的增加。

从以上发现促生长素抑制素受体激动剂化合物1和化合物2具有促进三叉神经细胞轴突延伸的作用。

以下显示制剂实施例。

实施例1：片剂

促生长素抑制素    50mg

乳糖              80mg

淀粉              17mg

硬脂酸镁          3mg

微晶纤维素        10mg

使用以上组分作为一种片剂的材料，按照常规方法模制压片。根据需要可以用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素酞酸酯等)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纤维素)包衣片剂。

实施例2：胶囊

促生长素抑制素    75mg

甘露糖醇          75mg

淀粉              17mg

硬脂酸钙          3mg

使用以上组分作为一种胶囊的材料，将它们均匀混合，按照常规方法成粒，并包装在硬胶囊中。在包装前，根据需要用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)，或糖包衣或薄膜包衣颗粒。

实施例3：注射剂

化合物1           750mg

羧甲基纤维素钠    500mg

注射用水          适量

总量              100mL

按照常规方法将以上组分无菌混合以提供注射剂。

实施例4：滴眼剂

化合物2           50mg

硼酸              700mg

硼砂              适量(pH 7.0)

氯化钠            500mg

羟甲基纤维素      0.5g

乙二胺四乙酸钠    0.05mg

苯扎氯铵          0.005mg

无菌纯化水        适量

总量              100mL

将无菌纯化水(80 mL)加热至约80℃，加入羟甲基纤维素，搅拌混合物直至液体温度达到室温。将化合物2，氯化钠，硼酸，乙二胺四乙酸钠和苯扎氯铵加入该溶液以使溶解。加入适量硼砂调节pH至7。加入无菌纯化水以达到100mL。

实施例5：滴眼剂

乙酸octoreotide    112mg

D-甘露糖醇         4.5g

磷酸二氢钠         0.1g

氢氧化钠           适量(pH 7.0)

无菌纯化水         适量

总量               100mL

将乙酸octoreotide，D-甘露糖醇和磷酸二氢钠加入无菌纯化水(80mL)以使溶解。加入适量氢氧化钠来调节pH至5.0。加入无菌纯化水以达到100mL。用膜滤器将制备的滴眼剂无菌过滤并装入一次性(单位剂量)容器和密封。

工业适用性

由于本发明的药剂含有促生长素抑制素受体激动剂，具有三叉神经细胞轴突延伸促进作用和功能性恢复降低的角膜敏感性的作用，它用于改善与角膜神经损伤等有关的角膜敏感性的功能降低，和与角膜敏感性功能降低有关的干眼症状。具体地，促生长素抑制素受体激动剂的应用期望提供对以下改善的效果：白内障外科手术或LASIK外科手术后降低的角膜敏感性，与角膜神经变性如神经性麻痹角膜病、角膜溃疡、糖尿病性角膜病等有关的降低的角膜敏感性和干眼。

尽管以上已经详细描述了本发明的一些实施方案，然而，对于本领域的普通技术人员明显的是可以在实质上不背离本发明新的教导和优势的情形下对所示特定实施方案进行各种改进和变化。这些改进和变化包含在后附权利要求中阐明的本发明的精神和范围内。

本申请是基于在日本提出的专利申请号318881/2002和040250/2003，其内容由此结合作为参考。

序列表

<110>千寿制药株式会社

<120>角膜疾病药物

<130>226-PCT

<160>2

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>TGGCCGTCTT CATTTTCTGC TCGCCGCTCA CTTTGACCAA G 41

<210>2

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>GTGGGCAAGA TGCGCGCTGT GAATGGGGTT GGCGCAGCTG TT  42

Claims (5)

1. 促生长素抑制素受体激动剂在制备用于促进角膜神经轴突延伸的药物组合物中的应用。

2. 促生长素抑制素受体激动剂在制备用于恢复角膜敏感性的药物组合物中的应用。

3. 促生长素抑制素受体激动剂在制备用于治疗干眼的药物组合物中的应用。

4. 促生长素抑制素受体激动剂在制备用于治疗与角膜敏感性的功能退化有关的角膜上皮疾病的药物组合物中的应用。

5. 权利要求1至4中任何一项的应用，其中所述促生长素抑制素受体激动剂是选自下列各项中的至少一种：促生长素抑制素，奥曲肽，6-氨基-2-(3-(1H-吲哚-3-基)-2-((4-(2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-基)哌啶-1-羰基)氨基)丙酰基氨基)己酸叔丁酯和1-(3-(N-(5-溴代吡啶-2-基)-N-(3，4-二氯苄基)氨基)丙基)-3-(3-(1H-咪唑-4-基)丙基)硫脲。

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