WO2004005503A1 - 細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用いたチーズの製造 - Google Patents

細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用いたチーズの製造 Download PDF

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Daisuke Yasokawa
Hitoshi Sawada
Ryoji Nakagawa
Makoto Kawakami
Koji Nagashima
Shuhei Miyashita
Hiroko Miyashita
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Mahoroba Co., Ltd.
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a bacterial-derived milk-clotting enzyme and a method for producing cheese using the enzyme. More specifically, the present invention relates to a milk-clotting enzyme produced by a bacterium of the genus Benibacillus, and a cheese and cheese-like food using the enzyme. It concerns the manufacturing method. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful as a new type of cheese and cheese-like food characterized by high-quality aroma, taste, and texture by using a novel bacterial curd enzyme, and a method for producing the same. Background art
  • an object of the present invention is to provide a method for producing cheese and cheese-like foods using a curdling enzyme produced by a bacterium belonging to the genus Benibacillus.
  • Another object of the present invention is to provide a novel milk-clotting enzyme derived from bacteria used for the production of the food.
  • the present invention for solving the above problems is constituted by the following technical means.
  • action has a curdling action to form curd by coagulating milk
  • substrate specificity specifically cleaves Thr94-Met95 in the presence of calcium using ⁇ casein as a substrate
  • C optimal pH: 6.0-7.0
  • molecular weight the molecular weight measured by SDS-PAGE is 35, 000-37, 0000 Da
  • a curdling enzyme comprising:
  • cheese is formed by using the curdling enzyme according to any one of (1) to (4) to form curd, separating the whey, and then ripening the cheese. Manufacturing method.
  • the present invention provides a method of culturing a specific bacterium capable of producing a milk-clotting enzyme, and collecting the milk-clotting enzyme of the present invention from the obtained culture. Also, using the milk-clotting enzyme of the present invention, cheese and cheese It is characterized by producing and providing similar foods.
  • strains producing the above-mentioned milk-clotting enzyme are classified into the genus Paenibaci 11us from the comparison of their physiological properties and the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene. This strain has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Patent Organism Depositary under the Accession No. FE RM P _ 188 138, the microorganism designation Paeni.
  • a method for obtaining a milk-clotting enzyme from a culture of the bacterium belonging to the genus Bacillus for example, when solid culture is performed using the above strain, an extraction treatment is performed by adding an equal amount of water or a buffer to the culture. Then, a crude enzyme solution of the milk-clotting enzyme is obtained, and the method may be suitably used, in which the crude enzyme solution is concentrated and dried to obtain a crude enzyme powder of the milk-clotting enzyme.
  • the cells are removed by centrifugation, and ammonium sulphate or sodium sulfate is added to the culture supernatant, or an organic solvent such as acetone or alcohol is added. Addition Then, the curd enzyme is precipitated, and the precipitate is separated, collected, and dried to obtain a crude enzyme powder of the curd enzyme.
  • the present invention is not limited to these methods, and an appropriate method can be used.
  • a commonly used method for purifying an enzyme can be used.
  • a method of purifying a crude enzyme solution obtained from a culture supernatant of a liquid culture of a bacterium of the genus Benibacillus using a hydrophobic column chromatography and a cation exchange column chromatography can be used. It is not limited to.
  • a standard agar medium 0.25% yeast extract, 0.5% (Peptone, 0.1% glucose, 1.5% agar), overnight culture at 35, and then cultivation at room temperature.
  • liquid culture for example, 0.5% corn starch is used.
  • 0.5% soluble starch used after 0. 5% N a H 2 PO 4 (p H 7. 0) a variety of liquid medium basic composition (basic broth) modified 3 Examples include a method of culturing with rotation and shaking at 180 rpm at 7 t, but the method is not limited thereto, and an appropriate method can be used.
  • the milk-clotting enzyme of the present invention is obtained by extracting a crude enzyme solution from a culture, and pulverizing the crude enzyme solution with ammonium sulfate solution preferably in a 50 to 80% saturated ammonium sulfate solution, followed by cation exchange chromatography.
  • the purified enzyme preparation can be obtained by purification by chromatography and hydrophobic chromatography.
  • curd enzymes for example, after 8 hours of culture the strain under basic liquid medium and harvested, resuspended in 0.5% Denpun 5 mM C a C 1 2 one After culturing overnight and removing cells by centrifugation, ammonium sulfate was dissolved in the supernatant to 50% saturation, and the polysaccharide containing starch was removed by ultracentrifugation. Add and dissolve ammonium sulfate to achieve 80% saturation , 4: The mixture was left standing, and the precipitate was collected by centrifugation.
  • the method of fractionating and purifying the milk-clotting enzyme is not limited to the above method, and appropriate methods and conditions can be set according to the above method.
  • the optimal pH and pH stability of the milk-clotting enzyme of the present invention were examined.
  • Optimum p H information the 1 0 0 mM buffer adjusted to predetermined p H of, l O WZv scan Kimumiruku - 1 0mM C a C 1 2 and so as to, plus skim milk and calcium chloride It was measured using The pH stability was maintained at 35 for 10 minutes in a buffer adjusted to a predetermined pH of 50 mM, and the residual activities were compared.
  • the milk-clotting activity had a maximum value at pH 6.0 to 7.0, and was approximately 64% of the activity at pH 8.0 at pH 8.0.
  • the milk-clotting activity was almost stable at pH 6.0 to 8.0, but almost inactivated at pH 4.0.
  • the optimal action temperature and heat stability of the curdling enzyme of the present invention were examined.
  • the curdling activity at a predetermined temperature was measured.
  • thermal stability 20 mM MESEPESZ sodium acetate MC a C 1 kept for 10 minutes a predetermined temperature in 2, was compared the residual activity.
  • the enzyme was stable from 40 to 50 ° C, and the milk-clotting activity increased with increasing temperature, but started to deactivate around 50 ° C and almost lost at 70 ° C. I was active.
  • the curdling activity of the curdling enzyme of the present invention was examined using an inhibitor. Curing activity was inhibited by EDTA, and Ca ions were essential for maintaining and expressing the activity.
  • the molecular weight of the milk-clotting enzyme according to the invention is approximately 35,000-37, OOODa.
  • the curdling activity of the curdling enzyme of the present invention was measured according to the method of Arima et al. That is, an enzyme solution containing 10% reduced skim milk dissolved in 0.01 M calcium chloride was used as a substrate, and the concentration of the enzyme solution was adjusted with respect to 5 ml of the substrate so that curd fragment was formed in 5 to 10 minutes. 5 ml was added and kept at 35. Stir occasionally and observe the formation of curd fragments. The time until the formation of the card fragment was measured, and the amount of the enzyme that started curd per minute was determined to be 400 units.
  • the enzyme of the present invention has a curdling action of coagulating milk to form curd.
  • Thr94-Met95 is specifically cleaved in the presence of calcium using ⁇ casein as a substrate.
  • curd is formed using the above-mentioned curdling enzyme, whey is separated, and then ripened, so that cheese and cheese-like food can be produced.
  • a specific process for producing the above cheese and cheese-like food can be a normal cheese production method as appropriate, except for using the above curdling enzyme.
  • the mixture After heat sterilization at 65 ° C, the mixture is rapidly cooled to 30 t :, and the curdling enzyme of the present invention, a lactic acid bacterium starter and calcium chloride are added according to a standard method. After stirring, take the curd on gauze, remove whey, press, immerse in 20% salt water, dry, vacuum pack, store in a 15 ° C aging cabinet, and ripen. You.
  • these processes and conditions are not limited to the above-described method, and can be arbitrarily set according to the type of the product.
  • the cheese and cheese-like food produced by the method of the present invention were examined for shear stress at the Piano wire, texture, observation of the cross section of the cheese with an electron microscope, and composition of free amino acid, using ordinary calf rennet. That the cheese of the present invention surpassed rennet cheese in terms of cohesion, shear stress, and the content of umami amino acids dartamic acid and isoleucine in hydrophobic amino acids as compared to cheese products manufactured under the same conditions. The feeling was almost the same except that the cheese of the present invention was slightly tattered and crumbled.The cheese and cheese-like food of the present invention It was found to be of the same quality as rennet cheese products. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the pH stability of the milk-clotting enzymes of the present invention.
  • FIG. 2 shows the temperature stability of the curdling enzyme of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of 10% polyacrylamide electrophoresis of the purified curdling enzyme of the present invention.
  • Ammonium sulfate was added to this active fraction to a concentration of 1 M, and 15 mM Tris'hydroxymethylaminomethane containing 1 M ammonium sulfate and 5 mM calcium chloride 15 mM Bis-tris-propane (pH) 7.5) Load on a P or 0 s HP 220 micron column (4.6 mm in diameter x 100 mm in height) equilibrated with buffer (B buffer), 1 M to 200 m The active fraction was collected by linear gradient elution with a B buffer containing M ammonium sulfate.
  • the bacteria of the genus Benibacillus were smeared, and the milk-clotting enzyme was extracted with water from 100 agar plates of 9 cm diameter grown at 37 t, and the cells and agar fragments were removed by centrifugation. After filtration, the milk was suspended in 0.5% (w / v) and freeze-dried to give a milk-clotting enzyme preparation.
  • the milk was pasteurized by heating at 65 ° C for 30 minutes, cooled to 30, then inoculated with 1% of lactic acid bacteria overnight, and the milk-clotting enzyme preparation was dissolved in a small amount of water and added. Thereafter, cutting, whey-off, squeezing, and salting were carried out according to a standard method, and aged for 6 months to produce Gouda cheese.
  • the free amino acids of the obtained cheese are shown for the case where the milk-clotting enzyme of the present invention is used as the rennet (Example of the present invention) and the case where the calf rennet is used (Control example). Shown in 1.
  • the shear stress of the present invention example and the control example when a piano wire was used in the rheometer was 21.8 ⁇ 19.8 gf for the present example, and 207.8 for the control example. It was 1 gf.
  • the bacteria of the genus Benibacillus were applied to 100 pieces of standard agar medium supplemented with 1% skim milk, cultured at 35 T: overnight, and then cultured at room temperature for one day. Extract the enzyme from the agar with 1.6 liters of water, remove cells and agar fragments by centrifugation, and filter. After adding skim milk to 0.5% (wZv) for 3 liters, it was freeze-dried. Approximately 10 liters of raw milk was heat-sterilized at 65 for 30 minutes, rapidly cooled to 30 ° C, and the whole amount of the freeze-dried enzyme extract, lactic acid bacteria star, and calcium chloride were added according to a standard method. Commercial calf and rennet were used as targets.
  • the generated curd was cut and stirred for 30 minutes.
  • the curd was taken out with a gauze, the whale was removed, pressed, immersed in 20% salt water, dried, vacuum-packaged, and stored in an aging oven at 15 ° C.
  • the cheese weight using the curd enzyme of the present invention was 1333.3 g, and that using calf 'rennet was 122.lg. Further, the texture was such that the cheese using the curdling enzyme of the present invention was slightly shabby. When the cross section of the cheese was observed with an electron microscope, no apparent difference was observed.
  • the free amino acid composition was compared for cheeses aged 6 months.
  • the content of glutamic acid, a delicious amino acid tended to be slightly higher in cheese using the curdling enzyme of the present invention.
  • the hydrophobic amino acids parin, leucine and isoleucine
  • the cheese using the clotting enzyme of the present invention contained isoleucine almost twice, the total of these three amino acids was almost the same. there were.
  • the present invention relates to a bacterial-derived milk-clotting enzyme and the production of cheese using the enzyme, and the present invention has the following effects.
  • New milk-clotting enzyme can be provided.
  • the milk-clotting enzyme of the present invention is a cheese or cheese It can be used for the production of foods like tomatoes.

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Abstract

本発明は、細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用いたチーズの製造を提供するものであり、ペニバチルス属細菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ. ）により生産される、凝乳活性を有する酵素であって、以下の酵素学的性質；（１）作用：乳を凝固させてカードを形成する凝乳作用を有する、（２）基質特異性：κカゼインを基質としてカルシウム存在下でＴｈｒ９４−Ｍｅｔ９５を特異的に切断する、（３）至適ｐＨ：６．０～７．０、（４）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は３５，０００～３７，０００Ｄａ、を有することを特徴とする凝乳酵素、その製法、チーズの製造方法、及びチーズ様食品に関する。

Description

明細: 細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用いたチーズの製造 技術分野
本発明は、 細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用いたチーズの製造方法 に関するものであり、 更に詳しくは、 ベニバチルス属細菌が生産する凝 乳酵素、 及び当該酵素を用いたチーズ及びチーズ様食品の製造方法に関 するものである。 本発明は、 細菌由来の新規凝乳酵素を用いて、 良質な 芳香、 味、 食感を特徴とする新しいタイプのチーズ及びチーズ様食品及 びその製造方法を提供するものとして有用である。 背景技術
従来より、 チーズを製造するに際しては、 原料乳を凝固させるために 凝乳酵素が必要とされ、 離乳前の子牛第 4胃から抽出、 調製されるキモ シンが凝乳酵素として伝統的に用いられている。 しかし、 このキモシン の原料となる子牛の慢性的な供給不足から、 1 9 7 0年代初め頃より、 多くの研究者が精力的にキモシンに代わる凝乳酵素の研究、 開発を行つ てきた。
そして、 これまでに、 動物、 植物及び微生物起源のキモシンに代わる 多数の凝乳酵素が見いだされ、 チーズ製造への利用の試みがなされてい る。 しかし、 キモシンに代わる凝乳酵素として実用化されているものは 、 動物起源のペプシンやエン ドシァ · パラシチカ ( E n d 0 t h i a p a r a s i t i c a )、 ムコーリレ . フシリレス ( Mu c o r p u s i 1 1 u s ) 及びムコール ' ミィヘイ (Mu c o r m i e h e i ) の糸 状菌 3種が産生する微生物起源の微生物レンネッ トのみである。 発明の開示
このような状況の中で、 本発明者らは、 良質な芳香、 味、 食感を特徴 とする新しいタイプのチーズを開発するのに有用な新たな微生物起源の 凝乳酵素を見いだすべく、 鋭意検討を行ったところ、 分離した細菌の培 養上清が強い凝乳活性を有することを見いだし、 更に研究を重ねて本発 明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、 ベニバチルス属細菌が産生する凝乳酵素を用いたチ —ズ及びチーズ様食品の製造方法を提供することを目的とするものであ る。
また、 本発明は、 上記食品の製造に使用する細菌由来の新規凝乳酵素 を提供することを目的とするものである。
上記課題を解決するための本発明は、 以下の技術的手段から構成され る。
( 1 ) ぺニバチルス属細菌 (P a e n i b a c i l l u s s p. ) に より生産される、 凝乳活性を有する酵素であって、 以下の酵素学的性質
( a) 作用 ： 乳を凝固させてカードを形成する凝乳作用を有する、 （b ) 基質特異性 ： κカゼィンを基質としてカルシウム存在下で T h r 94 -M e t 9 5を特異的に切断する、 （ c ) 至適 p H ： 6. 0〜 7. 0、 ( d ) 分子量 ： S D S— P AGEにより測定した分子量は 3 5 , 0 0 0〜 3 7， 0 0 0 D a、
を有することを特徴とする凝乳酵素。
( 2 ) 5 0〜 8 0 %飽和の硫酸アンモニゥム溶液で塩析される、 前記 （ 1 ) に記載の酵素。
( 3 ) 5 0〜 8 0 %飽和の硫酸アンモニゥム溶液で塩祈される、 安定な p H領域が 6. 0〜 8. 0、 安定な温度域が 4 0〜 5 0 °Cであることを 特徴とする前記 （ 2 ) に記載の酵素。
(4) ベニバチルス属細菌が、 受託番号 F E RM P— 1 8 1 3 8であ る、 前記 （ 1 ) に記載の酵素。
( 5) 乳を原料としてチーズを製造するに当たり、 前記 （ 1 ) から （4 ) のいずれかに記載の凝乳酵素を用いてカードを形成させ、 ホエー分離 後、 熟成させることを特徴とするチーズの製造方法。
( 6) 前記 （ 5) に記載の方法により製造される、 乳を原料として細菌 由来凝乳酵素を用いて製造したことを特徴とするチーズ様食品。 次に、 本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、 凝乳酵素の産生能を有する特定の細菌を培養し、 得られる 培養物から本発明の凝乳酵素を採取すること、 また、 本発明の凝乳酵素 を用いて、 チーズ及びチーズ様食品を製造し、 提供すること、 を特徴と するものである。 本発明において、 上記凝乳酵素を産生する菌株は、 そ の生理学的性状及び 1 6 Sリボゾーム RN A遺伝子の塩基配列の比較か ら、 P a e n i b a c i 1 1 u s属に分類される。 この菌株は、 独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、 受託番号 F E RM P _ 1 8 1 3 8、 微生物の表示 P a e n i、 として寄託されている。 このべ二バチルス属細菌の培養物から凝乳酵素を取得する方法として は、 例えば、 上記菌株を用いて、 固体培養を行った場合、 培養物と等量 の水あるいは緩衝液を加えて抽出処理し、 凝乳酵素の粗酵素液を得、 適 宜、 その粗酵素液を濃縮、 乾燥して凝乳酵素の粗酵素粉末を得る方法を 用いることができる。 また、 上記菌株を用いて、 液体培養を行った場合 、 遠心分離を行って菌体を除去し、 その培養上清に硫安や硫酸ナトリウ ムなどを加えるか、 あるいはアセトンやアルコールなどの有機溶媒を加 えて、 凝乳酵素を沈殿させ、 その沈殿を分離、 回収し、 乾燥して凝乳酵 素の粗酵素粉末を得ることができる。 しかし、 本発明は、 これらの方法 に制限されるものではなく、 適宜の方法を用いることができる。
次に、 本発明の凝乳酵素の精製方法としては、 通常行われる酵素の精 製方法を用いることができる。 好適には、 例えば、 ベニバチルス属細菌 の液体培養の培養上清から得られた粗酵素液を、 疎水カラムクロマトグ ラフィ一及び陽イオン交換カラムク口マトグラフィ一で精製する方法を 用いることができるが、 これらに制限されるものではない。 本発明で用 いるべ二バチルス属細菌の培養方法については、 固体培養では、 例えば 、 スキムミルクを 1 wZ V %となるように加えた標準寒天培地 （ 0. 2 5 %酵母エキス、 0. 5 %ペプトン、 0. 1 %グルコース、 1. 5 %寒 天） を用い、 3 5 で一晩培養後、 室温で培養する方法が例示され、 ま た、 液体培養では、 例えば、 0. 5 %コーンスティ一プリカ一、 0. 5 %可溶性デンプン、 0. 5 % N a H2 P O4 ( p H 7. 0 ) を基本組成 とした液体培地 （基本液体培地） を様々に改変したものを用い、 3 7 t で 1 8 0 r p mの回転振盪培養する方法が例示されるが、 これらに制限 されるものではなく、 適宜の方法を利用することができる。
本発明の凝乳酵素は、 培養物から粗酵素液を抽出し、 この粗酵素液を 、 好適には、 5 0〜 8 0 %飽和の硫酸アンモニゥム溶液で硫安塩祈した 後、 陽イオン交換クロマ トグラフィ一及び疎水クロマトグラフィーで精 製して精製酵素標品を得ることができる。
即ち、 凝乳酵素の分画 · 精製方法については、 例えば、 基本液体培地 で上記菌株を 8時間培養後、 集菌し、 0. 5 %デンプンー 5 mM C a C 12 に再懸濁して一晩培養し、 遠心にて菌体等を除いた後、 上清に 5 0 %飽和となるように硫安を溶解し、 超遠心にてデンプンを含む多糖類 を除去し、 得られた上清に 8 0 %飽和となるように硫安を追加、 溶解し 、 4 :でー晚放置し、 沈澱を遠心にて回収し、 3. 3 mM ME SZ 3 . 3mM ME P E S/ 3. 3mM 酢酸 N a— 5 mM C a C 12 ( p H 5. 5 ) の緩衝液に溶解後、 ポアサイズ 0. 8 ^mのフイタ一を通 し、 同一緩衝液に対して一晩透析し、 得られた酵素標品を、 陽イオン交 換カラムクロマトグラフィーに供し、 活性画分を分取し、 これに硫安濃 度を最終濃度 1 Mとなるように硫安を添加して、 疎水クロマトグラフィ 一を行い活性画分を分取する方法が例示される。 上記方法により得られ た活性画分は、 1 0 % S D S _ PAGEで、 ほぼ一本の単一バンドとし て検出される。 本発明においては、 凝乳酵素の分画、 精製方法は、 上記 方法に制限されるものではなく、 上記方法に準じて、 適宜の方法及び条 件を設定することができる。
次に、 本発明の凝乳酵素の酵素学的性質を示す。
( 1 ) 至適作用 PH及び安定 p H
本発明の凝乳酵素の至適 p H及び p H安定性を調べた。 至適 p Hにつ いては、 1 0 0 mMの所定 p Hに調整した緩衝液に、 l O WZv ス キムミルク— 1 0mM C a C 12 となるように、 スキムミルク及び塩 化カルシウムを加えたものを用いて測定した。 また、 p H安定性につい ては、 5 0 mMの所定 p Hに調整した緩衝液中で 1 0分間 3 5 に保ち 、 残存活性を比較した。 その結果、 凝乳活性は p H 6. 0〜7. 0に極 大値を持ち、 pH 8. 0では pH 7. 0での活性の 6 4 %程度であった 。 また、 凝乳活性は p H 6. 0〜8. 0でほぼ安定であつたが、 p H 4 . 0ではほぼ失活した。
( 2 ) 至適作用温度及び熱安定性
次に、 本発明の凝乳酵素の至適作用温度及び熱安定性を調べた。 至適 作用温度については、 所定温度での凝乳活性を測定した。 また、 熱安定 性については、 2 0 mM M E S E P E S Z酢酸ナトリウム一 5 m M C a C 1 2 中で 1 0分間所定温度に保ち、 残存活性を比較した。 そ の結果、 この酵素は 4 0〜 5 0 °Cまで安定で、 凝乳活性は温度が高くな るにつれて増大したが、 5 0 °C付近で失活が始まり、 7 0 °Cで殆ど失活 した。
( 3 ) 阻害剤
本発明の凝乳酵素の凝乳活性を阻害剤を用いて調べた。 E D T Aで凝 乳活性は阻害され、 C aイオンが活性の維持及び発現に必須であった。
( 4 ) 分子量
S D S — P A G Eにより測定した本発明の凝乳酵素の分子量は約 3 5 、 0 0 0〜 3 7、 O O O D aである。
( 5 ) 活性測定法
本発明の凝乳酵素の凝乳活性は A r i m aらの方法に準じて測定した 。 即ち、 0. 0 1 M塩化カルシウムに溶解した 1 0 %還元脱脂乳を基質 として用い、 この基質 5 m l に対して 5〜 1 0分間でカードフラグメン 卜が生成するように濃度調整した酵素液 0. 5 m l を加え、 3 5 に保 持した。 時々攪拌し、 カードフラグメントの生成を観察した。 カードフ ラグメン卜が生成するまでの時間を測定し、 1分間に凝乳を開始する酵 素量を 4 0 0ュニッ トとした。
( 6 ) 作用
本発明の酵素は、 乳を凝固させてカードを形成する凝乳作用を有する
( 7 ) 基質特異性 ： κカゼインを 1 0 m g / 1 の濃度で 2 0 mM M O S O ( p H 6. 5 ) — l O mM C a C 1 2 に溶解し、 凝乳溶液を 1 / 2 0容で加えて、 3 7 ：で 1 5分間インキュベートし、 その消化産物 を T r i s ZT r i c i n e系 S D S — P A G Eにより分離し、 P V D F膜に転写して N末端アミノ酸配列分析を行った。 アミノ酸配列分析に ついては、 凝乳酵素を 0 . 1 % T F Aで溶解後、 同溶液で平衡化した P h e n y l 5 P W R Pカラムに添加し、 ァセトニトリルの濃度勾配 で溶出した。 メインピークの N末端アミノ酸配列をプロティンシークェ ンサーを用いて分析した。 その結果、 κカゼインを基質として、 カルシ ゥム存在下で、 T h r 9 4— M e t 9 5を特異的に切断する。 本発明では、 乳を原料としてチーズを製造するに当たり、 上記凝乳酵 素を用いてカードを形成させ、 ホエー分離後、 熟成させることにより、 チーズ及びチーズ様食品を製造することができる。 本発明において、 上 記チーズ及びチーズ様食品を製造する具体的なプロセスは、 上記凝乳酵 素を使用する他は、 通常のチーズの製造方法を適宜採用することが可能 であり、 例えば、 生乳を、 6 5 °Cで加熱殺菌後、 3 0 t:に急冷し、 本発 明の凝乳酵素と、 乳酸菌スターター及び塩化カルシウムを定法に従って 添加し、 そのまま保温後、 形成されたカードをカッ トし、 攪拌した後、 カードをガーゼに取ってホエーを抜き、 プレス後 2 0 %塩水浸漬し、 乾 燥後、 真空包装し、 1 5 °Cの熟成庫に保存し、 熟成する方法が例示され る。 しかし、 これらのプロセス及び条件は、 上記方法に限定されるもの ではなく、 その製品の種類に応じて任意に設定することができる。
本発明の方法により製造したチーズ及びチーズ様食品について、 ピア ノ線でのせん断応力、 食感、 電子顕微鏡でのチーズ断面観察、 遊離アミ ノ酸組成を調べて、 通常のカーフ · レンネッ トを用いて同様の条件で製 造したチーズ製品と比較した結學、 せん断応力、 うまみアミノ酸である ダルタミン酸及び疎水性アミノ酸のイソロイシン含量の点で、 本発明の チーズが、 レンネッ トチーズを上回ったこと、 食感は、 本発明のチーズ の方が若干ぼろぼろと崩れるような感じであったこと、 の他は、 ほぼ同 等であり、 本発明のチーズ及びチーズ様食品は、 製品の品質についても 、 レンネッ トチーズ製品の品質と同等のものであることが分かった。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の凝乳酵素の p H安定性を示す。
図 2は、 本発明の凝乳酵素の温度安定性を示す。
図 3は、 本発明の精製凝乳酵素の、 1 0 %ポリアクリルアミ ド電気泳 動の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、 本発明は以下 の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例 1
ぺニバチルス属細菌の菌株 （F E RM P— 1 8 1 3 8) を、 3 7 で対数増殖期終期まで培養した培養液 1. 2 リッ トルを、 遠心分離にて 集菌した。 0. 5 %可溶性デンプンを含む 5 mM塩化カルシウム水 6 0 0m l に再懸濁後、 一晩培養した。 培養後、 この培養液を 4t:で遠心分 離して粗酵素液とした。 この粗酵素液に 5 0 %飽和となるように硫安を 加え、 沈殿を遠心分離で除き、 上清に 8 0 %飽和となるように硫安を追 加した。 沈殿を遠心分離で回収し、 3. 3 mM M E S Z 3. 3 mM H E P E S / 3. 3 mM酢酸ナトリウム— 5 mM塩化カルシウム （ p H 5. 5 ) に対して一夜透析した。 その結果、 B S A換算で約 2. 4mg の酵素標品を得、 この凝乳活性は約 1、 1 0 0、 0 0 0ユニッ トであつ た。 実施例 2
上記実施例 1で得た酵素標品を 5 mM塩化カルシウムを含む 3. 3 m M M E S Z 3. 3 mMH E P E S / 3. 3 mM酢酸ナトリウム （p H 5. 5 ) 緩衝液 （Α緩衝液） で平衡化した P o r o s H S 2 0ミクロ ンカラム（ 直径 4. 6 mm x高さ 1 0 0 mm) に負荷し、 0〜0. 2 M 食塩を含む A緩衝液でリニアーグラジェント溶出を行って活性画分を回 収した。 この活性画分に 1 Mとなるように硫安を加え、 1 M硫安及び 5 mM塩化カルシウムを含む 1 5 mMトリス ' ヒ ドロキシメチルアミノメ 夕ン 1 5 m Mビス一トリス · プロパン （ p H 7. 5 ) 緩衝液 （ B緩衝 液） で平衡化した P o r 0 s H P 2 2 0ミクロンカラム（ 直径 4. 6 mm x高さ 1 0 0 mm) に負荷し、 1 M〜 2 0 0 m M硫安を含む B緩衝 液でリニアーグラジェント溶出を行って活性画分を回収した。 この活性 画分を 5 mM塩化カルシウムを含む 5 mMトリス · ヒ ドロキシメチルァ ミノメタンノ 5 m Mビス一トリス · プロパン （ p H 7. 0 ) 緩衝液に対 して透析し、 B S A換算で約 2 5 0 gの精製酵素標品を得た。 本酵素 は、 この二段階のカラムクロマトグラフィーによって 1 . 3 1倍まで精 製され、 収率は 1 3. 6 %であった。 実施例 3
( 1 ) チーズの製造
ベニバチルス属細菌を塗抹し、 3 7 t にて増殖させた 9 c m径シヤー レ 1 0 0枚の寒天から水にて凝乳酵素を抽出し、 遠心分離によって菌体 及び寒天片を除去した。 ろ過後、 0. 5 % (w/ v ) となるようにスキ ムミルクを懸濁して凍結乾燥を行い、 凝乳酵素標品とした。 牛乳を 6 5 °Cで 3 0分間加熱殺菌し、 3 0 に冷却後、 乳酸菌ス夕一夕一 1 %を接 種し、 本凝乳酵素標品を少量の水に溶解後、 添加した。 以後、 定法によ り、 カッティ ング、 ホエーオフ、 圧搾、 加塩を行い、 6ヶ月熟成させて ゴーダチーズを製造した。 ( 2 ) 結果
上記製造法において、 レンネッ トとして、 本発明の凝乳酵素を用いた 場合 （本発明例）、 及び子牛レンネッ トを用いた場合 （対照例） につい て、 得られたチーズの遊離アミノ酸を表 1に示す。 また、 レオメーター でピアノ線を用いた場合の本発明例と対照例のせん断応力は、 本発明例 が 2 3 1 . 8 ± 1 9 . 8 g f 、 対照例が 2 0 7 . 8 土 2 8 . 1 g f であ つた。
表 1 遊離アミノ酸含有量 (mgZg)
Figure imgf000012_0001
実施例 4
(チーズの製造）
ベニバチルス属細菌を 1 %スキムミルク加標準寒天培地 1 0 0枚に塗 付し、 3 5 T:で一晩培養後、 室温で一日培養した。 1 . 6 リ ッ トルの水 で寒天から酵素を抽出し、 遠心分離で菌体及び寒天片を除き、 ろ過後 1 . 3リッ トルについて 0. 5 % (wZv) となるようにスキムミルクを 添加後凍結乾燥した。 生乳約 1 0リ ッ トルを 65 で 3 0分間加熱殺菌 後、 30°Cに急冷し、 凍結乾燥後の酵素抽出液全量と、 乳酸菌スター夕 一、 塩化カルシウムを定法に従って添加した。 対象として、 市販カーフ · レンネッ トを用いた。 そのまま 1時間保温後、 生成したカードをカツ トし、 30分間攪拌した。 カードをガーゼに取ってホェ一を抜き、 プレ ス後、 20 %塩水浸漬、 乾燥後、 真空包装し、 1 5°Cの熟成庫に保存し た。
その際のチーズ重量は、 本発明の凝乳酵素を用いたものは 1 333. 3 g、 カーフ ' レンネッ トを用いたものは 1 226. l gであった。 ま た、 食感は、 本発明の凝乳酵素を用いたチーズの方が若干ぼろぼろと崩 れるような感じであった。 電子顕微鏡でチーズ断面の様子を観察したと ころ、 見かけ上大きな差異は認められなかった。
6ヶ月熟成したチーズについて、 遊離アミノ酸組成を比較した。 その 結果、 うまみアミノ酸であるグルタミン酸含量は、 本発明の凝乳酵素を 用いたチーズの方が若干多い傾向があった。 疎水性アミノ酸 （パリン、 ロイシン、 イソロイシン） に関しては、 本発明の凝乳酵素を用いたチー ズの方が 2倍近くイソロイシンを含有していたものの、 これらの 3つの アミノ酸含量の合計はほぼ同じであった。 産業上の利用可能性
以上詳述したように、 本発明は、 細菌由来凝乳酵素及び当該酵素を用 いたチーズの製造に係るものであり、 本発明により、 以下のような効果 が奏される。
( 1) 新しい凝乳酵素を提供することができる。
(2) 本発明の凝乳酵素は、 キモシン代替酵素として、 チーズ及びチー ズ様食品の製造に用いることができる。
( 3 ) 上記凝乳酵素を用いた新しいチーズ及びチーズ様食品の製造方法 を提供することができる。
(4) 上記方法により、 レンネッ トチーズと同等の品質を有するチーズ 及びチーズ様食品を提供することができる。 微生物の寄託についての言及
寄託機関の名称 ： 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕 あて名 ： 〒 3 0 5— 8 5 6 6 日本国茨城県つくば市東 1 _ 1 一 1 中央第 6
寄託した日付 ： 2 0 0 0年 1 2月 8日
受託番号 ： F E RM P - 1 8 1 3 8
微生物の表示 ： P a e n i

Claims

請求の範囲
1. ぺニバチルス属細菌 ( P a e n i b a c i 1 1 u s s p . ) により生産される、 凝乳活性を有する酵素であって、 以下の酵素学 的性質 ；
( 1 ) 作用 ： 乳を凝固させてカードを形成する凝乳作用を有する、 （ 2 ) 基質特異性 ： κカゼィンを基質としてカルシウム存在下で T h r 9 4 一 M e t 9 5を特異的に切断する、 （ 3 ) 至適 p H ： 6. 0〜 7. 0、 ( 4 ) 分子量 ： S D S— P AG Eにより測定した分子量は 3 5， 0 0 0〜 3 7， 0 0 0 D a、
を有することを特徴とする凝乳酵素。
2. 5 0〜 8 0 %飽和の硫酸アンモニゥム溶液で塩析される、 請求項 1に記載の酵素。
3. 5 0〜 8 0 %飽和の硫酸アンモニゥム溶液で塩祈される、 安定な p H領域が 6. 0〜 8. 0、 安定な温度域が 4 0〜 5 0 °Cである ことを特徴とする請求項 2に記載の酵素。
4. ベニバチルス属細菌が、 受託番号 F E R M P - 1 8 1 3
8である、 請求項 1に記載の酵素。
5. 乳を原料としてチーズを製造するに当たり、 請求項 1から 4のいずれかに記載の凝乳酵素を用いて力一ドを形成させ、 ホエー分離 後、 熟成させることを特徴とするチーズの製造方法。
6 . 請求項 5に記載の方法により製造される、 乳を原料とし て細菌由来凝乳酵素を用いて製造したことを特徴とするチーズ様食品。
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