WO2004005497A1 - インスリン抵抗性改善薬スクリーニング方法 - Google Patents

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WO2004005497A1
WO2004005497A1 PCT/JP2003/008367 JP0308367W WO2004005497A1 WO 2004005497 A1 WO2004005497 A1 WO 2004005497A1 JP 0308367 W JP0308367 W JP 0308367W WO 2004005497 A1 WO2004005497 A1 WO 2004005497A1
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ppar
transcription
screening
test substance
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PCT/JP2003/008367
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Makoto Ogino
Hideki Endoh
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a substance that promotes the PPARr transcription-inducing activity, and a method for screening a drug for improving insulin resistance or insulin resistance.
  • thiazolidine derivatives which have already been shown to be effective as insulin sensitizers, act as agonists of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARr) (Lehmann et al. J. Biol. Chem., 270, 12953-12956, 1995).
  • PPARr peroxisome proliferator-activated receptor gamma
  • PPARr belongs to the nuclear receptor superfamily and is known to bind to a response element upstream of the target gene and induce its transcription as a transcription promoter activated by ligand binding (Mangelsdorf et al., Gel. Vol. 83, pp. 835-839,
  • PPARragonists stop cell proliferation and promote cell differentiation (Kitamura et al., Jpn. J. Cancer Res., Vol. 90, Para. 75, 1999). PPAR r is particularly expressed in adipose tissue (Tontonoz et al., Genes and Development, Vol. 8, pp. 1224-1234, Collinsi, Tontonoz et al., Gel, Vol. 79, pp. 1147-1156, 1994)
  • induction of adipocyte differentiation does not occur in homo-deficient mice.
  • thiazolidine derivative acting as an agonist of PPARr causes a decrease in large fat cells and an increase in small fat cells (Kubota et al., Mol. Gel, Vol. 4, pp. 597-609, 1999).
  • the mechanism by which thiazolidine derivatives improve insulin resistance is that PPARr agonists rapidly promote adipocyte differentiation, resulting in suppression of the production of TNF, which is a substance that induces insulin resistance, as well as in peripheral tissues. It is thought that glucose transporter expression is promoted and free fatty acid production is suppressed, resulting in increased glucose uptake into cells and improvement of hyperglycemia (Lehmann et al., J. Biol. Chem., Eds.
  • nuclear receptors have two-position transcription promoting regions in their structure.
  • the N-terminal one is called the AF-1 region
  • the G-terminal one is called the AF-2 region. Since the AF-2 region has been implicated in ligand-dependent transcriptional promotion (Mangelsdorf et al., Cell. 83, 841-850, 1995), Research has been carried out, and it has been used for searching for arguists. On the other hand, there is not much knowledge other than that it is involved in ligand-independent transcription promotion in the AF-1 region.
  • the transcription-inducing activity of PPARr requires interaction with a group of transcription-coupling factors, and attempts have been made to identify factors that interact with PPARr.
  • the binding of existing nuclear receptor interacting factors to PPAR r has been investigated, and SRC-1 (Zhu et al. Gene Expr. 6, 185-195, 1996), GBP / p300 (Gel man. J. Biol. Chem., Vol. 274, pp. 7681-7688, 1999). It has been reported to interact.
  • conjugation factors are thought to bind mainly to the AF-2 region, and only a small number of those known as conjugation factors that bind to the AF-1 region are currently PGC-2 (Cast illo et al., EMB0 ⁇ 18, 3676-3687 (1999)).
  • Patent Literature 1 The base sequence and amino acid sequence of the p68 RNA helicase are registered in the database (genpept X52104, genpept X15729, ge-pept BG016027, genpept AF015812), and the upstream base sequence is described in Non-Patent Document 5.
  • Patent Literature 1 Patent Literature 2, Patent Literature 3, and Patent Literature 4 describe molecules highly homologous to p68 RNA and recase, and describe that they are involved in wound healing and are useful as tumor markers. I have.
  • it has been clarified to be a transcription-inducing coupling factor that binds to the AF-1 region of estrogen receptor, one of nuclear receptors (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 6 Non-Patent Document 6
  • the detailed molecular mechanism is still unknown.
  • Patent Document 3 Patent Document 3
  • Patent Document 4 Patent Document 4
  • Non-Patent Document 4 (Non-Patent Document 4)
  • Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 5)
  • Non-Patent Document 6 (Non-Patent Document 6)
  • Non-Patent Document 7 (Non-Patent Document 7)
  • Non-Patent Document 8 (Non-Patent Document 8)
  • the present inventors identified p68 RNA helicase as a protein that binds to the AF-1 region of PPARr, and found that ⁇ 68 RNA helicase was expressed in human adipose tissue. Expression of PPARr promotes the transcription-inducing activity of PPARr. Next, it was found that pioglitazone, which is an insulin sensitizer, induces expression of p68 RNA helicase, and that enhanced expression of the protein improves diabetes. Analysis of the upstream region of the p68 RNA helicase revealed a region that regulates transcriptional repression.
  • the present invention provides a method for screening a new type of insulin sensitizer different from the conventional PPAR agonist by promoting the transcription-inducing activity of PPAR r and a method for producing a pharmaceutical composition for improving insulin resistance. The invention has been completed.
  • 1 to 10 amino acids include a deleted, substituted, or Z- or inserted amino acid sequence, and further encode a polypeptide that interacts with PPARr.
  • [4] i) a step of bringing a test substance into contact with the cells according to [1] to [3], and ii) a change in a test substance-dependent interaction or a test substance dependence using the reporter gene expression as an index.
  • Analyzing the change in the PPARr transcription-inducing activity by a method comprising: detecting whether a test substance promotes the PPARr transcription-inducing activity;
  • [5] i) a step of bringing a test substance into contact with the cells according to [1] to [3]; ii) a change in a test substance-dependent interaction or a test substance-dependent PPARr Analyzing a change in transcription-inducing activity, andiii) screening a substance that promotes the transcription-inducing activity of PPARr, which comprises a step of selecting a test substance that enhances reporter activity.
  • a method of screening for an insulin sensitizer comprising:
  • a method for screening for an insulin sensitizer comprising the step of analyzing a change in a test substance-dependent transcription induction activity using the expression of
  • Patent Document 1 describes a molecule highly homologous to the P68 RNA helicase, Although many disease names have been implicated, the relationship between p68 RNA helicase and insulin resistance and the relationship between p68 RNA helicase and PPAR r are not described.
  • a molecule highly homologous to the p68 RNA helicase described in Patent Document 2 is considered to be involved in wound healing.
  • a molecule having high homology to p68 RNA helicase described in Patent Document 3 or Patent Document 4 is useful as a tumor marker and is involved in various cancers. None of the patent documents describes the relationship between p68 RNA helicase or a molecule highly homologous thereto and its relationship with insulin resistance and its relationship with PPARy.
  • the fact that the p68 RNA helicase binds to the AF-1 region of PPAR r and functions as a transcription induction coupling factor is a novel finding discovered by the present inventors, and the interaction between PPAR r and the p68 RNA helicase.
  • FIG. 1 is a diagram showing luciferase activity performed in Example 2.
  • the vertical axis of the graph indicates luciferase activity, and the horizontal axis indicates the amount of p68 RNA helicase expression vector.
  • FIG. 2 is a diagram showing luciferase activity performed in (3) of Example 5.
  • the vertical axis of daraf indicates luciferase activity, and the horizontal axis indicates cotransfected plasmid.
  • the shaded bar shows the result of no drug addition, and the black bar shows the result of drug addition.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a known human-derived natural p68 RNA helicase. From the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Is a known human-derived natural PPARr.
  • Polypeptides that interact with PPARr for preparing the cells of the present invention for PPARr transcription activity test include:
  • polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • a polypeptide (hereinafter, referred to as a protein) consisting of an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and interacting with the AF-1 region of PPARr A homologous polypeptide);
  • Functional equivalent variants include “a polypeptide that contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that interacts with the AF-1 region of PPARr”, “an amino acid represented by SEQ ID NO: 2” In the sequence, 1 to 10, preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5 amino acids comprise an amino acid sequence in which deletion, substitution, and / or insertion has been performed, and the AF-1 region of PPARr And polypeptides that interact with the protein.
  • the homologous polypeptide is composed of an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is particularly a protein that interacts with the AF-1 region of PPARr.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 preferably comprises an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more homology.
  • a protein that interacts with the AF-1 region of PPARr preferably a protein that interacts with the AF-1 region of PPARr.
  • the term "homology j" used herein refers to a Glustal program (1 ⁇ 883 and 3113 ⁇ , Gene, 73, 237-244, 1998; Thompson et al., Ucleic Acid Res., 22 Vol., Pp. 4673-4680, 1994) means the value Identities obtained by default using the parameters prepared by the search.The above parameters are as follows.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a functionally equivalent variant and a homologous polypeptide are collectively referred to as “PPAR-interacting P68 RNA helicase”.
  • the gene encoding the PPAR r protein fusion for preparing the cells of the present invention for the PPAR r transcription induction test is at least the AF-1 region of the PPAR r protein represented by SEQ ID NO: 4 and the DNA of the transcription factor.
  • AF-1 region of the coupling region and may be a gene encoding a fusion protein consisting of c PPAR is expressed by the 1st to 5th 0 4 th nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 area It is.
  • the DNA binding region may be a DNA binding region of any transcription factor.
  • the “DNA binding region” is a region that functions to bind to DNA, and has a DNA binding ability to a response sequence, but does not independently have a transcription inducing ability.
  • the “transcription factor” used for detecting the transcription-inducing ability of PPARr is not limited as long as it is a eukaryotic transcription factor having a region that binds to a specific DMA sequence in the cell nucleus. Further, the DNA binding region of the transcription factor may have a DMA binding ability to a response element, but may have no ability to induce transcription by itself.
  • transcription factors include, for example, the yeast GAL4 protein (Keegan et al., Science, Vol. 231, pp. 699-704, 1986, Ma et al., Gel 48: 847-853). 1987).
  • the DNA-binding region and the transcription-inducing region of the GAL4 transcription factor are located on the N-terminal side (the region including the first to 147th amino acids).
  • the “response element” a DNA sequence to which the DMA binding region of the transcription factor can bind is used.
  • the region may be cut out from the upstream region of the gene and used, or the sequence may be chemically synthesized and used.
  • a more detailed definition and an example of “response sequence” are described in “Molecular Cell Biology 4th Edition” (translated by Maruyama et al., Tokyo Chemical Dojinsha, 2001).
  • the “reporter gene” located downstream of the response element is not particularly limited as long as it is a commonly used one, but is preferably an enzyme gene or the like that is easily quantitatively measured. Examples include a chloramphenicol acetyltransferase gene (GAT) derived from a bacterial transposon, a luciferase gene (LUG) derived from a firefly, and a green fluorescent protein gene (GFP) derived from a jellyfish.
  • GAT chloramphenicol acetyltransferase gene
  • LEG luciferase gene
  • GFP green fluorescent protein gene
  • Polynucleotides encoding PPARr, the DNA binding region of transcription factors, and PPAR-interacting p68 RNA helicases are synthesized using primers and probes designed and synthesized based on known amino acid sequence and base sequence information, and PGR ( It can be isolated from the cDNA library by screening using the Polymerase Chain Reaction method or hybridization.
  • PPAR-interacting p68 RNA helicases are identified as the same molecular species and can be any type that interacts with PPARr and affects the ability of the receptor to induce transcription in the presence of ligand. Species may be derived, for example, human (GenBank accession numbers X15729, X52104 and AF015812), mouse
  • PPARy is identified as the same molecular species and may be derived from any species as long as it functions in vivo as a nuclear receptor. For example, human (GenBank accession number U79012 ), A mouse (GenBank accession number U09138), a rat (GenBank accession number AB019561), and the like.
  • PPARr has two isoforms, PPARrl and PPARr2.
  • PPARrl lacks the N-terminal 30 amino acids compared to PPARy2, but the other amino acid sequences are exactly the same. Both are known to be expressed in adipose tissue.
  • a polynucleotide encoding PPAR ⁇ , a DNA binding region of a transcription factor, or a PPAR-interacting p68 RNA helicase can be obtained, for example, as follows, but is not limited to this method and is a known procedure. , J et al., Cold Spring
  • Nucleotides can be produced.
  • human cells or tissues capable of producing the protein of the present invention include, for example, human adipose tissue. Extract mRNA from human adipose tissue. Next, the mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of a random primer or an oligo dT primer to synthesize a first-strand cDNA.
  • the polynucleotide of the present invention or a part thereof is obtained. More specifically, the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the method described in Example 1.
  • the PPAR of the present specification can be obtained by the procedure described in the above-mentioned Patent Document “Embodiment of the Invention” 1)
  • the method for producing a protein gene b)
  • the second production method r a polynucleotide can be produced that encodes a recombination into the DNA binding region of a transcription factor or PPAR-interacting p68 RNA.
  • the DNAs encoding each of these regions may be used alone or ligated by the method described in rWo l ecu l ar G l on ngj [Satnbrook, J et al., Go Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989].
  • an expression system of PPAR r and PPAR interacting p68 RNA helicase in test cells can be constructed.
  • the polynucleotide obtained as described above may be incorporated into an appropriate vector plasmid and introduced into a host cell in the form of a plasmid. These may be configured so that both are contained on one plasmid, or may be configured so that each is contained on a separate plasmid. Alternatively, cells in which such a configuration has been integrated into chromosomal DMA May be obtained and used.
  • the reporter gene linked to the response element was also constructed using general gene recombination techniques, this construct was incorporated into a vector plasmid, and the resulting recombinant plasmid was introduced into host cells. Is used. Alternatively, cells having such a configuration incorporated into chromosome DNA may be obtained and used.
  • PPAR ⁇ may be introduced from the outside, but when a cell rich in endogenous PPAR ⁇ , such as an adipose-derived cell, is used as a host cell, any of the above-mentioned configurations may be used.
  • PPAR r may be omitted and only a configuration consisting of a reporter linked to a response element and a PPAR-interacting p68 RNA helicase may be introduced.
  • fragments containing the isolated polynucleotides can be transformed into eukaryotic and prokaryotic host cells by reintegration into an appropriate vector plasmid. Furthermore, by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors, the gene can be expressed in each host cell. Methods for transforming host cells and expressing genes are described in, for example, “Embodiments of the Invention” in the above-mentioned patent document. 2) The vector of the present invention, the host cell of the present invention, and the method for producing the recombinant protein of the present invention. It can be carried out by the method described in (1).
  • the expression vector is not particularly limited as long as it contains the desired polynucleotide.
  • the expression vector can be obtained by introducing the desired polynucleotide into a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used. Can be listed.
  • the cell of the present invention can be obtained, for example, by transfection of a desired host cell with the expression vector. More specifically, for example, as described in Example 2, a desired polynucleotide expression vector can be obtained by incorporating a desired polynucleotide into an expression vector for mammalian cells-PCDNA3.1. Then, the transformed vector of the present invention can be produced by incorporating the expression vector into G0S-1 cells using a commercially available transfection reagent, Ribofectamine 2000.
  • the desired transformed cells obtained above can be cultured according to a conventional method, and the desired protein is produced by the culture.
  • the medium used for the culture Various commonly used cells can be selected depending on the host cell used.For example, in the case of the above COS-1 cells, Dulbecco's Modified Eagle Minimum Essential Medium (DIEM) supplemented with serum components such as fetal bovine serum (FBS) A medium obtained by adding G418 to such a medium can be used.
  • DIEM Dulbecco's Modified Eagle Minimum Essential Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • test cells Culturing the cells of the present invention (hereinafter referred to as test cells) in the presence of a test substance
  • test substance when the test substance promotes the expression of PPAR-interacting p68 RNA helicase or suppresses the degradation, an increase in the expressed reporter activity is observed.
  • a substance is identified as a PPAR r transcription inducing activity promoter.
  • Each of these has a different structure from the conventional PPAR agonist, and is expected to have a stronger main effect and act as an insulin sensitizer that is separated from side effects.
  • One embodiment of the present invention comprises: (1) i) a polynucleotide encoding a PPAR-interacting p68 RNA-request, ii) at least an AF-1 region of a PPAR r protein and a DNA binding region of a transcription factor.
  • a method for selecting and screening for a substance that promotes the PPAR r transcription-inducing activity and a substance that improves insulin resistance which consists of detecting and measuring changes in the PPAR r transcription activation activity by test substances in No.
  • the one-hybrid system is a method for detecting a protein-protein interaction using a reporter gene expression as a marker.
  • a transcription factor has two regions with different functions, a DNA binding region and a transcription activation region, but in the hybrid system, in order to examine the interaction between two types of proteins X and Y, 1) the transcription factor of
  • a fusion protein consisting of a DNA binding region and X and 2) Y are simultaneously expressed in cultured cells.
  • proteins X and Y interact, they form a transcription complex.
  • This binds to the transcription factor response element (specifically binding DMA site) in the cell nucleus and is located downstream of it.
  • DMA site transcription factor response element
  • the interaction between the two proteins can be detected by replacing the expression of the reporter gene. More specifically, it can be carried out by the method of Cast i l l o
  • test substance on the interaction of p68 RNA helicase for PPAR r and PPAR interaction can be detected by replacing the expression of the reporter gene, promote interaction between PPAR interaction P 68 RNA helicase and PPAR
  • a substance that is, a substance that promotes the transcription-inducing activity of PPARr
  • a substance that improves insulin resistance can be detected and Z- or screened.
  • the PPAR r is a full-length protein, it is preferably an Atsuyi system. It is advisable to add a PPAR r ligand to the mixture.
  • the nuclear receptor changes its tertiary structure due to the binding of the ligand to the AF-2 region, resulting in the recruitment of transcription coupling factors to the AF-1 and AF-2 regions. It has been reported that transcriptional activation has occurred. More specifically, the screening can be performed by the method described in Example 2.
  • PPAR y ligand to be added when using the PPAR r full-length region is not particularly limited as long as it can induce the transcription-inducing ability of PPAR ⁇ ⁇ ⁇ , for example, 1 to 1000 nM, preferably. Are those capable of inducing the ability of PPARy to induce transcription at a final concentration of 1 to 100 nM, more preferably 1 to 30 nM.
  • PPAR ligands include thiazolidine derivatives such as pioglitazone (Lehmann et al., J. Biol. Ghem., Vol. 270, No. 12953-12956, 1995).
  • Another embodiment of the method characterized by measuring the effect of a test substance on the interaction between PPAR r and PPAR interaction p68 RNA helicase is, for example, a method for biochemical detection.
  • PPAR-interacting p68 RNA helicase labeled with RI or the like and an appropriate tag protein such as glutathione-S-transferase (GST), protein jS-galactosidase, maltose-binding protein (MBP), etc.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • It can be carried out by directly detecting the binding between the protein and the fusion protein consisting of the AF-1 region of PPAR r in the presence of the test substance. More specifically, it can be implemented by the method described in the first embodiment.
  • Another embodiment is an immunochemical method (ELISA method).
  • ELISA method for example, in order to examine the interaction between two types of proteins X and Y, X is fixed in advance, and after mixing Y and the test substance, nonspecific binding is performed. Wash by an appropriate method to remove, and then add an antibody that specifically reacts with Y with antigen and antibody. The amount of Y bound to the immobilized X can be detected by replacing the amount of the antibody specifically reacting with Y.
  • a substance that promotes the interaction between the PPAR-interacting p68 RNA helices and PPARr and a substance that improves insulin resistance can be detected and screened or screened.
  • Methods for detecting and / or screening for a substance that promotes the PPAR r transcription-inducing activity and a substance that improves insulin resistance include the methods described above, and the PPAR used in the above embodiment is 1) AF-1 Region 2) Preferably, it may be any of the PPAR full-length regions together with the addition of the ligand.
  • Methods for screening for an insulin sensitizer that includes a step of analyzing changes in the expression level of PPAR-interacting p68 RNA helicase>
  • Insulin resistance ameliorating drugs can be screened by the method characterized by the following.
  • the “cell” may be any cell that expresses a PPAR-interacting p68 RNA helicase, and may be a cell obtained by transforming a PPAR-interacting p68 RNA helicase expression vector as described above.
  • the culture cell 3T3L1 described in Example 4 is used.
  • Whether the rppAR-interacting cell expressing the p68 RNA helicase is expressing the p68 RNA helicase is determined by Northern blotting using a gene having a base sequence encoding the p68 RNA helicase or a part thereof. Method, Western blotting using an antibody specific to the p68 RNA helicase, and the like.
  • the test substance-dependent change in the amount of PPAR-interacted p68 RNA helicase expressed in the test substance-dependent p68 RNA helicase is determined by adding or not adding a test substance to cells expressing the PPAR-interacting p68 RNA helicase, and then collecting the cells. It can be measured as a change in the amount of mRNA that is a gene transcription product or a protein encoded by the mRNA.Comparing the change in the expression level between when no test substance is added and when a test substance is added By doing so, it is possible to analyze changes in the expression level of the test substance-dependent PPAR interaction p68 RNA helicase. RNA or a cell extract can be obtained from the collected cells.
  • the amount of PPAR-interacting p68 RNA helicase mRNA in the recovered RNA can be detected, for example, by the real-time PGR method. More specifically, the screening can be performed by the method described in Example 4.
  • the protein content of PPAR-interacting p68 RNA helicase in the recovered cell extract can be detected by, for example, an immunochemical method (eg, Western blotting method). In this way, it is possible to carry out the subscription-learning of Li insulin sensitizer by the analyzing the expression amount of change of PPAR interaction P 68 RNA helicase,
  • An insulin resistance ameliorating agent can be screened by including a step of analyzing a test substance-dependent change in transcription induction activity as an indicator.
  • Reporter gene atssii is a method for detecting gene expression regulation using the reporter gene expression as a marker.
  • the regulation of gene expression is controlled by a part called the promoter region existing in the 5 'upstream region, and the gene expression level at the transcription stage can be estimated by measuring the activity of this promoter.
  • the test substance activates the promoter, it activates the transcription of a reporter gene located downstream of the promoter region.
  • the promoter activating effect that is, the expression enhancing effect can be detected by replacing the expression of the reporter gene.
  • the effect of the test substance on the regulation of the expression of the PPAR-interacting p68 RNA helicase can be detected by replacing the expression of the reporter gene with the reporter gene assay using the promoter region of the PPAR-interacting p68 RNA helicase.
  • the ⁇ reporter gene '' fused to the promoter region of the p68 RNA helicase consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is not particularly limited as long as it is a commonly used one, but is preferably an enzyme gene or the like which is easily quantitatively measured. .
  • bacterial transposon-derived clonal ramphenicol acetyltransferase gene CAT
  • firefly-derived luciferase gene Luc
  • jellyfish-derived green fluorescent protein gene GFP
  • the reporter gene may be functionally fused to the p68 RNA helicase promoter region consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • Test substance-dependent induction of transcription by comparing the expression level of the reporter gene with and without contacting the cells transformed with the reporter gene fused to the promoter region of the p68 RNA helicase Changes in activity can be analyzed.
  • test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include commercially available compounds (including peptides) and various known compounds (including peptides) registered in a chemical file.
  • Combinatorial 'chemistry technology Teerrett et al., J. Steel e. Tetrahedron, Vol. 51, pp. 8135—8173,
  • the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition for improving insulin resistance, which comprises a step of screening using the screening method of the present invention, and a step of formulating a substance using the substance obtained by the screening.
  • a method is included.
  • Preparations comprising a substance obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient may be prepared using carriers, excipients, and other additives commonly used for the preparation of the active ingredient, depending on the type of the active ingredient. Can be prepared.
  • administration examples include oral administration such as tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous injection, intramuscular injection, or joint injection, and suppositories.
  • Parenteral administration such as an agent, a transdermal agent, or a transmucosal agent.
  • parenteral administration such as intravenous injection is preferred for peptides digested in the stomach.
  • compositions for oral administration one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone, or magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition contains additives other than an inert diluent, such as a lubricant, a disintegrant, It may contain a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent.
  • Tablets or pills can be coated with a sugar coating or a film such as a gastric or enteric substance, if necessary.
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections can include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the water-soluble solution or suspension may contain, as a diluent, for example, distilled water for injection or physiological saline.
  • examples of the diluent for the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ethanol), and polysorbate 80. it can.
  • the composition may further include a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, a preservative, and the like.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a fungicide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the active ingredient, that is, the intensity of the activity of the substance obtained by the screening method of the present invention, the symptoms, the age or sex of the administration subject, and the like.
  • the dose is usually about 0 ⁇ ⁇ / day for an adult (assuming a body weight of 60 kg)! ⁇ 100mg, preferably 0. ⁇ ! ⁇ 50 mg.
  • the dosage is 0.01 to 50 mg, preferably 0.01 to 10 mg per day in the form of injection.
  • the GDNA encoding the entire length of human PPARr2 was introduced into the animal cell expression vector PGDNA3.1 / V5-His-T0P0 vector (Invitrogen) by the in vitro recombination T0P0 cloning method (Invitrogen). Plasmid pcDNA-PPARr for animal cell expression was prepared.
  • the pcDNA-PPARr prepared in (1) of Example 1 was used as a type III protein by the PGR method (DNA polymerase (Taq DNA polymerase; Sigma)). After repeating 5 cycles of 94 ° C (30 seconds), 55 ° C (30 seconds), and 72 ° C (30 seconds) 25 times, heating at 72 ° C for 7 minutes) An approximately 600 bp GDNA fragment encoding a region including the AF-1 region of PPARr was obtained.
  • a thiazolidine derivative, pioglitazone (piogl itazone. (+)-5- [4- [2- (5-ethyl-2-pyridinyl) ethoxy] benzyl] benzyl), which has been reported to act as a ligand for PPAR r 4-Thiazolidinedione; Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., patent 1853588) was synthesized according to the method described in the patent specification.
  • the PPARragonist pioglitazone was added to the transfected cells to a final concentration of 30 nM and cultured for 24 hours. Then, the medium was removed, and the cells were washed with a phosphate buffer (PBS). The cells were lysed by adding 80 jul of a cell lysate (100 mM potassium phosphate (pH 7.8), 0.2% Triton X-100) per well. A luciferase substrate solution (100 uI, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the cell lysate (20 I), and the amount of luminescence was measured using a chemiluminescence measuring device (ML3000; Dynatec Laboratories).
  • ML3000 chemiluminescence measuring device
  • -galactosidase activity of the cell lysate was measured using a -galactosidase activity detection kit (Galcto-Light Plus TM system; TR0PIX) and quantified. The above luciferase activity was corrected for each well as the transfusion efficiency of the transgene.
  • a human cDNA library (Clontech) at 94 ° C (5 minutes) was prepared using the PGR method (DNA polymerase (Taq DNA polymerase; Sigma)). After that, a cycle of 94 ° C (30 seconds), 55 ° C (30 seconds), and 72 ° C (30 seconds) is repeated 35 times and heated at 72 ° C for 7 minutes. The amplification of the 800 bp GDNA fragment was detected by agarose gel electrophoresis. As a result, the p68 RNA helicase was found to be expressed in adipose tissue and muscle, which are known to have the action of PPAR r. This also confirmed that the p68 RNA helicase is a transcriptional coactivator of PPAR ⁇ from the expression site.
  • Cultured cells 3T3L1 cells are grown to confluence by adding 2 ml of the minimum essential medium DIEM (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Sigma) to a culture plate (diameter 60; Asahi Techno Glass). did. Then, add insulin (final concentration 10 / g / ml; Sigma), dexamethasone (final concentration 250 Sigma) and 3-isobutyl-1-methoxyxanthine to differentiation medium (minimum essential medium DMEM (Gibco)). (Final concentration of 500 juM; Sigma) was added to the mixture, and pioglitazone (final concentration of 1 ⁇ ), which was an insulin sensitizer, was added and p68 was not added.
  • RNA extraction reagent IS0GEN; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • reverse transcription reaction kit Thermoscript RT-PCR
  • pioglitazone which is an insulin sensitizer, has the effect of increasing the expression level of p68 RNA helicase, and thus, it is supported that the increased expression of p68 RNA helicase improves insulin resistance.
  • PGL3-p68-899 bp, pGL3-p68-1 184 bp constructed in Example 5, (1), or pGL3-Basic (100 ng / well) as a negative control was used as the j8-galactosidase expression vector (pGMV-).
  • the cells were transiently cotransfected into G0S-1 cells together with ⁇ -galactosidase control vector (Roche Diagnostics) (10 ng Nowell). Cotransfect was performed in the same manner as in (2) of Example 2. After culturing for 48 hours, the amount of luciferase luminescence was measured in the same manner as in Example 2.
  • the ⁇ -galactosidase activity was measured in the same manner as in Example 2, and the above-mentioned luciferase activity was corrected for each gel as the transfection efficiency of the transgene.
  • the promoter activity of the p68 RNA helicase gene was much stronger than that of the negative control pGL3-Bas iG (pGL3-p68-1 at 184 bp had a promoter activity of pGL3-Basic). 202 times, at pGL3-p68-899 bp about 94 times that of pGL3-Basic).
  • Example 2 After adding piodaritazone, one of the insulin sensitizers, to the cells transfected in (5) of Example 5 to a final concentration of 10 M and culturing for 24 hours, the same procedure as in Example 2 was performed. Luciferase activity was measured. Further, the S-galactosidase activity was measured in the same manner as in Example 2, and the luciferase activity was corrected for each cell as the transgene efficiency of the transgene.
  • promoter activity of the p68 RNA helicase gene was enhanced in an insulin sensitizer-dependent manner (Fig. 2). This fact revealed that transcription of the p68 RNA helices gene was enhanced by pioglitazone, one of the insulin sensitizers, and that the mechanism of insulin resistance improvement was clarified by the p68 RNA helicopter. It has been shown to be transcriptional activation of the base gene.
  • pioglitazone one of the insulin sensitizers, enhances the promoter activity of the p68 RNA to recase gene, and was similarly observed in both pGL3-p68-899bp and pGL3-p68-1184bp, indicating that pioglitazone It is considered that the site of action of transcriptional activation by I was located 3 'downstream of -899 bp, and it was revealed that the region from -1184 bp to -899 bp did not release transcriptional repression regulation.
  • screening for a substance that has the effect of releasing the inhibitory regulation of this p68 RNA helicase gene more specifically, screening for a substance that further enhances the reporter activity of pGL3-p68-1 184 bp, and screening for a substance that enhances the conventional insulin resistance It has become possible to detect and screen or screen for substances that enhance the expression level of recase to p68 RNA different from the sex improver and substances that improve insulin resistance.
  • PPAR r a PPAR interacts screening system using the interaction of p68 RNA helicase, and scan chestnut-learning system using the enhanced expression of PPAR interaction
  • P 68 RNA helicase is conventional insulin It can be used to screen for new types of drugs that are different from the drug PPAR r synthetic ligand.
  • the cells of the present invention can be used for constructing the screening system.
  • a pharmaceutical composition for improving insulin resistance is produced by formulating a substance obtainable by the screening method of the present invention as an active ingredient and using a carrier, excipient, and / or other additive. can do.
  • Sequence Listing Free Text The description of "Ar" UfiGial Sequencej is described in the numbers 223> in the following sequence table. Specifically, each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 6 to 8, 10, 14, and 15 in the sequence listing is a primer sequence artificially synthesized.

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Abstract

PPARγとp68 RNA ヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、p68 RNAヘリケースの発現を亢進することによりPPARγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法を開示する。当該方法は、PPARγの転写誘導活性を促進することによる従来のPPARアゴニストとは異なる新しいタイプのインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法である。さらに、前記スクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を開示する。

Description

明 細 書 ィンスリン抵抗性改善薬スクリ一二ング方法 技術分野
本発明は、 PPARrの転写誘導活性を促進する物質、 及びノ又はインスリン抵抗 性改善薬をスクリーニングする方法に関する。 背景技術
インスリン抵抗性改善薬としてすでに効果が認められているチアゾリジン誘導 体はペルォキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ （peroxisome prol iterator activated receptor gamma： PPARr) のァゴニストとして作用することが示さ れている （Lehmannら、 J. Biol. Chem. , 第 270巻、 第 12953— 12956頁、 1995年) 。
PPARrは核内受容体スーパーファミリーに属し、 リガンドの結合によって活性化 される転写促進因子として標的遺伝子上流にある応答配列に結合し、 その転写を 誘導することが知られている （Mangelsdorfら、 Gelし 第 83巻、 第 835-839頁、
1995年） 。PPARrァゴニストは細胞の増殖を停止し、 細胞分化を促進することが 報告されている （Kitamuraら、 Jpn. J. Cancer Res.、 第 90巻、 第 75項、 1999 年） 。 PPAR rは特に脂肪組織で発現が認められ （Tontonozら、 Genes and Development, 第 8巻、 第 1224-1234頁、 蘭年、 Tontonozら、 Gelし 第 79巻、 第 1147- 1156頁、 1994年）、 ホモ欠損型マウスでは脂肪細胞の分化誘導が起こらない。 また PPARrのァゴニストとして作用するチアゾリジン誘導体の投与は大型脂肪細 胞の減少と小型脂肪細胞の増加を引き起こす （Kubotaら、 Mol.Gelし 第 4巻、 第 597- 609頁、 1999年） 。以上の知見から、 チアゾリジン誘導体がインスリン抵抗性 を改善する機構は PPARrァゴニス卜が急速に脂肪細胞の分化を促進する結果、 ィ ンスリン抵抗性誘発原因物質である TNFひの産生抑制、 末梢組織でのグルコース トランスポーター発現の促進、 遊離脂肪酸産生の抑制が起こり、 結果、 細胞内へ の糖取り込みが亢進して高血糖が改善されると考えられている （Lehmannら、 J.Biol. Chem. , 第 270巻、 第 12953— 12956頁、 1995年) 。 チアゾリジン誘導体の PPAR rとの親和性は生体内の血糖降下作用と相関することから、 該化合物群のィ ンスリン抵抗性改善作用は PPAR rの活性化を介した作用であると考えられている (W i l l sonら、 J. Med, Chem.、 第 39巻、 第 665-668頁、 1996年） 。 このようなこと から PPAR γの転写誘導活性を促進することはィンスリン抵抗性を改善すると考え られ、 そのため、 PPAR rのァゴニストの検出方法はインスリン抵抗性糖尿病治療 薬をスクリーニングする有効な手法であると考えられてきた。
しかしながら近年チアゾリジン誘導体を用いた臨床での知見から、 PPAR丫のァ ゴニスト作用を持つ従来の合成リガンドは、 ィンスリン抵抗性改善作用のみでな くいずれも肝臓機能障害を引き起こし、 また生体内の循環血漿量を増大させて浮 腫を惹起することが報告された （非特許文献 1、 非特許文献 2、 非特許文献 3参 照） 。この PPAR rの合成ァゴニス卜による肝臓機能障害は重篤な副作用であり、 浮腫の惹起も心肥大等をもたらす重篤な副作用であることからインスリン抵抗性 改善という主作用との乖離が強く望まれている。し力、し、 これまでにチアゾリジ ン誘導体がこのような副作用をもたらす分子メカニズムは解明されていない。 一般に核内受容体はその構造中に二力所の転写促進領域を持っており、 N末端 側のものは AF- 1領域、 G末端側のものは AF - 2領域と呼ばれている。 AF-2領域はリ ガンドに依存した転写促進に関与しているとされることから （Mange l sdorfら、 Ce l l . 第 83巻、 第 841- 850頁、 1995年） 、 これまでに多くの研究がなされ、 ァゴ 二ストの探索等にも利用されてきた。 一方、 AF-1領域に関してはリガンドに非依 存的な転写促進に関与しているという他に多くの知見はない。 ところが近年、 PPAR rの AF-1領域に点変異を持つヒトのなかに特徴的な表現型を示すものの存在 が報告され、 特に第 1 2番目のプロリンがァラニンに変異しているヒトは、 野生 型に比べて肥満に抵抗性であり良好なィンスリン感受性を示すことが報告された (非特許文献 4参照） 。
PPAR rの転写誘導活性には他の核内受容体同様に転写共役因子群との相互作用 が必要であり、 PPARrと相互作用する因子を同定しょうとする試みがなされて来 た。 実際に、 既存の核内受容体相互作用因子と PPAR rとの結合が調べられており, SRC-1 (Zhuら Gene Expr. 第 6巻、 第 185-195頁、 1996年） 、 GBP/p300 (Ge l man . J. B i o l . Chem. , 第 274巻、 第 7681 - 7688頁、 1999年) など複数の分子が PPAR rと相 互作用することが報告されている。 しかしながら、 これらの共役因子群は主に AF - 2領域に結合するものと考えられており、 AF - 1領域に結合する共役因子として 知られているものは現在のところわずかに PGC - 2 (Cast i l l oら、 EMB0丄第 18巻、 第 3676- 3687頁 1999年) が挙げられるに留まっている。
p68 RNA ヘリケースは、 その塩基配列及びアミノ酸配列がデータベースに登録 さ れて お り （ genpept X52104, genpept X15729, ge叩 ept BG016027, genpept AF015812) 、 上流塩基配列が非特許文献 5に記載されている。 また、 p68 RNA へ リケースと相同性の高い分子が特許文献 1、 特許文献 2、 特許文献 3、 特許文献 4に記載され、 創傷治癒に関与することや腫瘍マーカーとして有用であることが 記載されている。 一方、 核内受容体の一つであるエストロゲンレセプター の AF-1 領域に結合する転写誘導共役因子であることが明らかになつている （非特許 文献 6参照） 。 さらに近年、 p68 RNA ヘリケースが脂肪細胞分化に関与している 可能性が示唆されてきた（非特許文献 7、 非特許文献 8参照）。 しかし、 その詳細 な分子メカニズムについては依然不明である。
(特許文献 1 )
国際公開第 02/28999号パンフレツ 卜
(特許文献 2 )
カナダ第 2325226号明細書
(特許文献 3 )
国際公開第 01 /60860号パンフレツ 卜
(特許文献 4 )
国際公開第 01 /64707号パンフレツ ト
(非特許文献 1 )
「ザ 'ランセット （The Lancet) 」 、 （米国） 、 2000年、 第 355巻、 ρ· 1008— 1010
(非特許文献 2 )
「ダイアビーテイーズ 'フロンティア （D i abetes Front i er) 」 、 1999年、 第 10 巻、 p. 81 1 -818 (非特許文献 3)
「ダイアビー亍イーズ ' フロンティア （Diabetes Frontier) 」 、 1999年、 第 10 巻、 p.819-824
(非特許文献 4)
「ネイチヤー .ジエネテイクス （Nature Genetics) 」 、 （米国） 、 1998年、 第 20巻、 p.284-287、
(非特許文献 5)
Γヌクレイック ■ァシッド■ リサーチ （Nucleic Acids Research) 」 、 （英国） 2000年、 第 28巻、 p.932-939
(非特許文献 6)
「モレキュラー■アンド■セルラー■バイオロジー （Molecular and Cel lular Biology) j 、 （米国）、 1999年、 第 19巻、 p.5363-5372
(非特許文献 7)
「バイオケミカル 'アンド 'バイオフィジカル■ リサーチ■コミュニケーショ ンズ (Biochemical and Biophysic l Research Communications; J 、 (米国） ， 2001年、 第 287巻、 p.435-439
(非特許文献 8)
「アニマル.ジエネ亍イクス （Animal Genetics) 」 、 （英国） 、 2000年、 第 31巻、 ρ· 166-170
発明の開示
本発明者らは、 PPARrの AF- 1領域に結合する蛋白質として p68 RNAヘリケース を同定し、 ヒ卜脂肪組織中で Ρ68 RNAヘリケースが発現していることを見出した, さらに、 p68 RNAヘリケースが過剰に発現すると PPARrの転写誘導活性が促進す ることを見出した。次いで、 ィンスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンが p68 RNA ヘリケースの発現を誘導することを見出し、 該蛋白質の発現亢進が糖尿病態 改善となることを見出した。 また、 p68 RNAヘリケース上流領域の解析により、 転写抑制性調節をする領域を見出した。 さらに、 ピオグリタゾンによる PPARr転 写活性化の作用点は転写抑制性調節の解除ではないことを見出し、 この P68 RNA ヘリケース遺伝子の抑制性調節を解除する作用を持つ物質のスクリーニングによ リ従来のインスリン抵抗性改善薬とは異なる p68 RNA ヘリケースの発現量を亢進 する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及びノ又はスクリーニン グすることができることを見出した。
これらの知見をもとにして、 PPAR rと P68 RNA ヘリケースとの相互作用を促進 する、 及び Zまたは、 p68 RNA ヘリケースの発現を亢進することにより PPAR rの 転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法および スクリーニング方法を構築した。 PPAR rの転写誘導活性を促進することによる従 来の PPARァゴニストとは異なる新しいタィプのィンスリン抵抗性改善薬のスクリ 一二ング方法及びインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を提供し、 本発 明を完成した。
すなわち本発明は、
[ 1 ] ί ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸 が欠失、 置換、 及び または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相 互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 i i ) 配列番号 4で表 される PPAR γ蛋白質の少なくとも AF-1領域と転写因子の DNA結合領域とからなる 融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 及び、 i ί i ) 前記転写因子の DNA 結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポータ一遺伝子によリ形質転換さ れた細胞、
あるいは、
i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び Zまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相互作用す るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 及び i ί ) 配列番号 4で表され る PPARr蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質 転換され、 a ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、 1 ~10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相互作用するポリペプチド、 及び、 b ) 配列番号 4で表される PP AR y蛋白質を発現している細胞、 [2] 転写因子が酵母の GAL4蛋白質である [1 ] 記載の細胞、
[3] レポーター遺伝子がルシフヱラーゼ遺伝子である [1] 記載の細胞、
[4] i ) [1 ] 乃至 [3] に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、 及び、 i i ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化ま たは試験物質依存的な PPARrの転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを 特徴とする、 試験物質が PPARrの転写誘導活性を促進するか否かを検出する方法、
[5] i ) [1 ] 乃至 [3] に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、 i i ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または 試験物質依存的な PPARrの転写誘導活性の変化を分析する工程、 及び i i i ) レ ポーター活性を亢進する試験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、 PPAR rの転写誘導活性を促進する物質をスクリーニングする方法、
[ 6 ] PPAR γの転写誘導活性を促進する物質がィンスリン抵抗性改善薬である [5] 記載のスクリーニング方法、
[7] i ) PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現している細胞に試験物質を 接触させる工程、 及び、 i ί ) 試験物質依存的な PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケー ス発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善 薬をスクリーニングする方法、
[8] i ) 配列番号 5で表される塩基配列からなる p68 RNA ヘリケースのプロ モーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物 質を接触させる工程、 及び、 i i ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物 質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、 インス リン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
[9] 請求の範囲 5乃至請求の範囲 8に記載のスクリーニングする方法を用い てスクリーニングする工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法 に関する。 特許文献 1に P68 RNA ヘリケースと相同性の高い分子が記載され、 当該分子が 関与するとして多数の疾患名が挙げられているが、 p68 RNA ヘリケースとインス リン抵抗性との関係及び p68 RNAヘリケースと PPAR rとの関係については記載 されていない。 特許文献 2に記載されている p68 RNAヘリケースと相同性の高い 分子は、 創傷治癒に関与するとされている。 また、 特許文献 3又は特許文献 4に 記載されている p68 RNAヘリケースと相同性の高い分子は、 腫瘍マ一カーとして 有用であることや種々の癌に関与すると記載されている。 何れの特許文献にも p68 RNA ヘリケース又はそれと相同性の高い分子について、 インスリン抵抗性と の関係及び PPAR yとの関係については記載されていない。
従って、 p68 RNAヘリケースが PPAR rの AF-1領域に結合し、 その転写誘導共役 因子として機能することは本発明者らが見出した新規の知見であり、 PPAR rと p68 RNAヘリケースとの相互作用を促進する、 及び または、 p68 RNAヘリケー スの発現を亢進することにより PPAR γの転写誘導活性を促進しィンスリン抵抗性 を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法、 インスリン抵抗性 改善用医薬組成物の製造方法は本発明者らが初めて行った発明である。
図面の簡単な説明
図 1 は、 実施例 2で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。 グラフの縦軸 はルシフェラーゼ活性を、 横軸は p68 RNAヘリケース発現ベクター量を示す。 図 2は、 実施例 5の （3 ) で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。 ダラ フの縦軸はルシフェラーゼ活性を、 横軸はコトランスフエク卜したプラスミドを 示す。 斜線バーは薬剤非添加、 黒色バーは薬剤添加の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
[ 1 ] 本発明の細胞
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 公知のヒ卜由来 の天然型 p68 RNAヘリケースである。 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からな るポリべプチドは、 公知のヒ卜由来の天然型 PPARrである。
PPARr転写活性試験のための本発明の細胞作成用の、 PPARrと相互作用するポリ ペプチドには、
( 1 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチド；
(2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 〜 10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPARrの AF-1領域と 相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド （以下、 機能的等価改 変体と称する） ；
( 3 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸 配列からなり、 しかも、 PPARrの AF-1領域と相互作用する蛋白質であるポリぺプ チド （以下、 相同ポリペプチドと称する） ；
が含まれる。
機能的等価改変体としては、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 し かも PPARrの AF-1領域と相互作用する蛋白質であるポリべプチド」 、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個、 好ましくは 1〜7個、 更に好まし くは 1〜5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を含み, しかも、 PPARrの AF - 1領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド」 が含まれ る。
相同ポリべプチドは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以 上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 PPARrの AF - 1領域と相互作用する蛋白 質である限り、 特に限定されるものではないが、 配列番号 2で表されるアミノ酸 配列に関して、 好ましくは 90%以上、 より好ましくは 95%以上、 更に好ましくは 9 8%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、 好ましくは PPARrの AF-1領域と相互作用する蛋白質である。 なお、 本明細書における前記 「相同性 j とは、 Glustal program (1^88 3と3113卬、 Gene、 第 73巻、 第 237 - 244頁、 1998 年； Thompsonら、 ucleic Acid Res.、 第 22巻、 第 4673- 4680頁、 1994年） 検索 によりデフオル卜で用意されているパラメータを用いて得られた値 Identitiesを 意味する。 前記のパラメータは以下のとおりである。
Pai r ise A I iment Parametersとして K tup l e
Gap Pena l ty 3
W i ndow 5
D i agona l s Saved 5
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド、 機能的等価改変体, 相同ポリペプチドを総称して 「PPAR相互作用 P68RNAヘリケース」 と称する。
PPAR r転写誘導試験のための本発明の細胞作成用の、 PPAR r蛋白質融合体をコ ードする遺伝子は、 配列番号 4で表される PPAR r蛋白質の少なくとも AF- 1領域と 転写因子の DNA結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子であればよい c PPAR の AF-1領域は配列番号 3で表される塩基配列の第 1番目〜第 5 0 4番目の 塩基配列により表される領域である。 また、 上記 DNA結合領域は、 いずれの転写 因子の DNA結合領域を用いてもよい。 「DNA結合領域」 は、 DNAに結合するために 機能する領域であり、 応答配列に対する DNA結合能を有するが、 単独で転写誘導 能を有しないものを示す。
上記の実施態様において、 PPAR rの転写誘導能を検出するために用いられる 「転写因子」 は、 細胞核内で特定の DMA配列に結合する領域を有する真核生物の 転写因子であれば限定されない。 また転写因子の DNA結合領域は、 応答配列に対 する DMA結合能は有するが、 単独で転写誘導能を有しないものであればよい。 こ のような転写因子としては、 例えば、 酵母の GAL4蛋白質 （Keeganら、 Sc i ence、 第 231巻、 第 699-704頁、 1986年、 Maら、 Ge lし 第 48巻、 第 847- 853頁、 1987年） が挙げられる。 GAL4転写因子の DNA結合領域および転写誘導領域は、 例えば GAL4 の場合、 N末端側 （およそ第 1番目から 147番目までのアミノ酸を含む領域） に存 在する。
「応答配列」 は、 転写因子の DMA結合領域が結合し得る DNA配列を用いる。 遺伝 子の上流域からその領域を切り出して用いる、 あるいはその配列を化学的に合成 して用いてもよい。 「応答配列」 のより詳しい定義と実例については 「分子細胞 生物学第 4版」 （丸山ら訳、 東京化学同人社、 2001年） に記載されている。
応答配列の下流に配置される 「レポーター遺伝子」 は、 一般に用いられるもの であれば特に限定されないが、 定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。 例えば、 バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフエニコールァセチル卜ラン スフエラーゼ遺伝子 （GAT) 、 ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子 （LUG) 、 クラ ゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子 （GFP) 等があげられる。 レポーター遺伝子は、 応答配列の下流に機能的に連結される、 あるいはプロモーターに応答配列を挿入 されているものが用いられる。
PPARr、 転写因子の DNA結合領域、 PPAR相互作用 p68 RNAヘリケースをコー ドするポリヌクレオチドは、 既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに 設計し合成したプライマーやプローブを用いて、 PGR (Polymerase Chain Reaction) 法やハイブリダィゼ一シヨンによるスクリーニングにより、 cDNAライ ブラリーから単離できる。 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースは、 同じ分子種と して同定されるもので、 PPAR rに相互作用して該受容体のリガンド存在下での転 写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、 例 えばヒト （GenBank accession番号 X15729、X52104 および AF015812) 、 マウス
( GenBank accession 番号 X65627 ) 、 ャマネコ （GenBank accession 番号 AF110009) などの哺乳動物由来のものが挙げられる。 PPARyは、 同じ分子種とし て同定されるもので、 核内受容体としての生体内での機能を果たすものであれば いずれの種由来のものであってもよく、 例えばヒト （GenBank accession 番号 U79012) 、 マウス （GenBank accession 番号 U09138) 、 ラッ 卜 （GenBank accession 番号 AB019561) などの哺乳動物由来のものなどが挙げられる。 また, PPARrには、 PPARrl 及び PPARr2の二種のアイソフオームが存在し、 PPARrl は PPARy2と比較すると N末端側の 30アミノ酸が欠失しているが、 その他のァ ミノ酸配列は全く同じであり、 いずれも脂肪組織に発現していることが知られて いる。
PPAR γ , 転写因子の DNA結合領域、 または PPAR相互作用 p68 RNAヘリケースをコ ードするポリヌクレオチドは、 例えば次のように得ることができるが、 この方法 に限らず公知の操作 r olecular Gloningj [Sambrook, Jら、 Cold Spring
Harbor Laboratory Press. 1989年] でも得ることができる。
例えば、 （1 ) PGR を用いた方法、 （2) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち cDNAラィブラリ一で形質転換した形質転換株から所望のァミノ酸を含む形質転換 株を選択する方法） を用いる方法、 又は （3 ) 化学合成法などを挙げることがで きる。 各製造方法については、 W001/34785に記載されていると同様に実施できる。
PCR を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 1 ) 蛋 白質遺伝子の製造方法 a)第 1製造法に記載された手順によリ、 本明細書記載のポ リヌクレオチドを製造することができる。 該記載において、 「本発明の蛋白質を 産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」 とは、 例えば、 ヒ卜脂肪組織を挙 げることができる。 ヒト脂肪組織から mRNAを抽出する。 次いで、 この mRNAをラ ンダムプライマーまたはオリゴ dT プライマーの存在下で、 逆転写酵素反応を行 し、、 第一鎖 cDNAを合成することが出来る。 得られた第一鎖 cDNAを用い、 目的遺 伝子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PGR) に供し、 本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる より具体的には、 例えば実施例 1に記載の方法により本発明のポリヌクレオチド を製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の 実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 b)第 2製造法に記載された手順により、 本明細書の PPAR r、 転写因子の DNA結合領域、 または PPAR相互作用 p68 RNA へ リケースをコ一ドするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態 j 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 c)第 3製造法、 d)第 4製造法に記載された方法によ つて、 本明細書の PPAR r、 転写因子の DNA結合領域、 または PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
rWo l ecu l ar G l on i ngj [Satnbrook, Jら、 Go I d Spr i ng Harbor Laboratory Press, 1989年] に記載の方法により、 これら各領域をコードする DNAを単独、 あるいは 連結し、 適当なプロモータ一の下流に連結することで PPAR r及び PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの試験細胞内での発現系が構築できる。 具体的には上述のよ うに得られたポリヌクレオチドは、 適当なベクタープラスミドに組み込み、 ブラ スミドの形で宿主細胞に導入すればよい。 これらは、 両者が一つのプラスミ ド上 に含まれるよう構成してもよく、 あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよ う構成してもよい。 あるいは、 このような構成が染色体 DMAに組み込まれた細胞 を取得してこれを用いてもよい。
応答配列に連結されたレポーター遺伝子も、 一般的な遺伝子組換え技術を用い て構築し、 この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、 得られた組換えブラ スミドを宿主細胞中に導入したものを用いる。 あるいは、 このような構成が染色 体 DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
PPAR γは外部から導入しても良いが、 内在性の PPAR γが豊富に存在する細胞、 例えば脂肪由来細胞などを宿主細胞として用いる場合は、 上述の構成のうち、
PPAR rを省いて、 応答配列に連結されたレポーターと PPAR相互作用 p68 RNAヘリ ケースからなる構成のみを導入してもよい。
より具体的には、 単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、 適当なベクター プラスミドに再び組込むことにより、 真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転 換させることができる。 さらに、 これらのベクターに適当なプロモーターおよび 形質発現にかかわる配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞において遺 伝子を発現させることが可能である。 宿主細胞を形質転換し、 遺伝子を発現させ る方法は、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 2 ) 本発明のベクター, 本発明の宿主細胞、 本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法によリ実施 できる。 発現ベクターは、 所望のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定される ものではなく、 例えば、 用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現べクタ 一に、 所望のポリヌクレオチドを揷入することにより得られる発現べクタ一を挙 げることができる。
本発明の細胞は、 例えば、 前記発現ベクターにより、 所望の宿主細胞をトラン スフエクシヨンすることにより得ることができる。 より具体的には、 例えば、 実 施例 2に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現べクタ -PCDNA3. 1に組み込むことにより、 所望の蛋白質の発現ベクターを得ることがで き、 該発現ベクターを市販のトランスフヱクシヨン試薬リボフヱク卜ァミン 2000 を用いて G0S-1細胞に取リ込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができ る。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、 常法に従い培養することができ、 該培 養により所望の蛋白質が生産される。 該培養に用いられる培地としては、 採用し た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、 例えば上記 COS - 1細 胞であれば牛胎児血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最 小必須培地 (DIEM)等の培地に G418を加えたものを使用できる。
[ 2 ] 本発明の検出及びスクリーニング方法
本発明の、 PPAR rと PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースとの相互作用を促進する. あるいは、 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの発現を亢進することにより PPAR r の転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定おょぴス クリーニング方法を以下に記載する。
本発明の細胞 （以下、 試験用細胞と称する） を試験物質の存在下で培養し、
PPAR rの転写誘導能に対する PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの促進作用が試験 物質によリ促進されることをレポータ一遺伝子の発現によリ検出し測定すること ができる。
また、 例えば試験物質が PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの発現を促進したり 分解を抑制するとき、 発現するレポーター活性の増大が観察される。 このような 物質は PPAR r転写誘導活性促進剤として同定される。
これらはいずれも従来の PPARァゴニストとは異なる構造を有し、 より強い主作 用を持ち副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待さ れる。
<PPAR rの転写誘導活性を促進する物質並びにィンスリン抵抗性を改善する物質 を検出及びノ又はスクリーニングする方法 >
本発明の一つの実施態様としては、 （ 1 ) i ) PPAR相互作用 p68 RNA へリケー スをコードするポリヌクレオチド、 i i ) PPAR r蛋白質の少なくとも AF-1領域と 転写因子の DNA結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 及び、 i ί i ) 前記転写因子の DNA結合領域が結合し得る応答配列に融合された レポーター遺伝子によリ形質転換された細胞、
あるいは、 ( 2 ) i ) PPAR相互作用 p68 RNAへリケースをコードするポリヌクレオチド、 及 ぴ ί i ) PPAR r蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子によ リ形質転換され、
a ) PPAR相互作用 p68 RNAヘリケース、 及び、 b ) PPAR r蛋白質を発現している 細胞 （試験用細胞） を用い、 これに試験物質を接触させ、 レポーター遺伝子の発 現を指標として、 試験用細胞における試験物質による PPAR rの転写活性化能促進 作用の変化を検出し、 測定することからなる PPAR rの転写誘導活性を促進する物 質及びインスリン抵抗性を改善する物質を選択、 スクリーニングする方法が挙げ られる。
ワンハイブリツドシステムは、 レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋 白-蛋白質間相互作用を検出する方法である。 一般に転写因子は DNA結合領域と転 写活性化領域という機能の異なる 2つの領域を有するが、ヮンハイプリッドシス テムでは、 2種類の蛋白質 Xと Yの相互作用を調べるために、 1 ) 転写因子の
DNA結合領域と Xからなる融合蛋白質と、 2 ) Yの 2種類を同時に培養細胞内で 発現させる。 蛋白質 Xと Yが相互作用するとこれらが 1つの転写複合体を形成し. これが細胞の核内において前記転写因子の応答配列 （特異的に結合する DMAの部 位） と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。 こ のように 2つの蛋白質の相互作用をレポータ一遺伝子の発現に置き換えて検出す ることができる。 より具体的には Cast i l l oらの方法で実施することが出来る
(EMB0 第 18卷、 第 3676 - 3687頁 1999年） 。 したがって、 PPAR rと PPAR相互作 用 p68 RNAヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の 発現に置き換えて検出することができ、 PPAR相互作用 P68 RNAヘリケースと PPAR との相互作用を促進する物質 （即ち PPAR rの転写誘導活性を促進する物質） 並 びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び Z又はスクリーニングを実施で きる。 PPAR rの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する 物質を検出及び Z又はスクリーニングする方法において用いる細胞に発現する PPAR r力 PPAR r全長蛋白質である場合には、 好ましくは、 アツセィ系に PPAR r リガンドを添加するとよい。 核内受容体は一般に AF-2領域にリガンドが結合して 立体構造が変化した結果、 AF-1領域および AF- 2領域に転写共役因子がリクルート されてきて転写の活性化がおこることが報告されているからである。 より具体的 には、 実施例 2に記載の方法で前記スクリーニングを実施できる。
PPAR r全長領域を用いる際に好ましい添加する PPAR yリガンドとしては、 PPAR Ύの転写誘導能を惹起することができるものであればいずれのものであってもよ く、 例えば 1 ~1000 nM、 好ましくは 1〜100 nM、 より好ましくは 1〜30 nMの最終 濃度で PPAR yの転写誘導能を惹起することができるものが挙げられる。 PPAR リ ガンドとしては、 例えば、 ピオグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体 （Lehmann ら、 J. B i o l . Ghem.、 第 270巻、 第 12953-12956項、 1995年） が挙げられる。
PPAR rと PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用 を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、 例えば、 生化学的に 検出する方法がある。 このような方法では、 例えば R Iなどで標識した PPAR相互作 用 p68 RNAヘリケースとグルタチオン- S-トランスフェラーゼ （GST) 、 プロティ ン jS -ガラクトシダ一ゼ、 マルトース一バインディングプロテイン （MBP) な ど適当なタグ蛋白質と PPAR rの AF-1領域からなる融合タンパク質との結合を試験 物質の存在下で直接的に検出することで実施できる。 より具体的には実施例 1に 記載の手法によリ実施できる。
また、 別の実施態様としては免疫化学的な方法 （EL I SA法） がある。 このよう な方法では、 例えば、 2種類の蛋白質 Xと Yの相互作用を調べるために、 Xをあ らかじめ固定しておき、 これに Yと試験物質を混ぜた後非特異的な結合を除くた めに適当な方法で洗浄し、 さらに Yと特異的に抗原抗体反応をする抗体を添加す る。 固定された Xに結合した Yの量は、 Yに特異的に反応した抗体量と置き換え て検出することができる。 これを利用することで、 PPAR相互作用 p68 RNAヘリケ ースと PPAR rとの相互作用を促進する物質並びにィンスリン抵抗性を改善する物 質の検出及びノ又はスクリーニングを実施できる。
PPAR rの転写誘導活性を促進する物質並びにィンスリン抵抗性を改善する物質 を検出及び 又はスクリーニングする方法としては、 上記記載の方法が挙げられ るが、 上記態様において用いる PPARは、 1 ) AF- 1領域、 2 ) 好ましくはリガンド 添加と共に PPAR全長領域のいずれでもよい。 <PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの発現量の変化を分析する工程を含むインス リン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法 >
i ) PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触さ せる工程、 及び、 ί i ) 試験物質依存的な PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース発現 量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする方法で、 ィンスリン抵抗性改善 薬をスクリーニングすることが出来る。
「細胞」 としては、 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現している細胞なら ば何れの細胞でもよく、 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース発現ベクターを上記の ように形質転換して得られた細胞でも良い。 好ましくは実施例 4に記載の培養細 胞 3T3L1が挙げられる。 rppAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現している細 胞」 が p68 RNA ヘリケースを発現しているか否かは、 p68 RNA ヘリケースをコー ドする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッテイン グ法、 p68 RNA ヘリケースに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッテイング法 などにより特定することができる。 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現して いる細胞に試験物質を添加又は非添加して一定時間培養させた後細胞を回収する, 試験物質依存的な PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース発現量の変化は、 遺伝子の転 写産物である mRNA、 又は、 該 mRNAによりコードされる蛋白質の量の変化として測 定することができ、 試験物質非添加の場合と試験物質添加の場合の前記発現量の 変化を比較することにより、 試験物質依存的な PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース 発現量の変化を分析することが出来る。 前記の回収した細胞から RNAまたは細胞 抽出液を得ることが出来る。 回収した RNA中の PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース の mRNA量は、 例えば、 リアルタイム PGR法などにより検出する事が出来る。 より 具体的には、 実施例 4に記載の方法により、 前記スクリーニングを実施できる。 また、 回収した細胞抽出液中の PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの蛋白質量は、 例えば、 免疫化学的な方法 （ウェスタンブロッテイング法など） により検出する ことが出来る。 このようにして、 PPAR相互作用 P68 RNA ヘリケースの発現量の変 化を分析することによリインスリン抵抗性改善薬のスクリ一二ングを実施できる,
<PPAR相互作用 P68 RNA ヘリケースプロモーターを利用しインスリン抵抗性改善 薬をスクリーニングする方法 >
i ) 配列番号 5で表される塩基配列からなる p68 RNAヘリケースのプロモータ 一領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接 触させる工程、 及び、 i i ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存 的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴として、 ィンスリン抵 抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
レポーター遺伝子アツセィ （田村ら、 転写因子研究法、 羊土社、 1993年） は、 レポーター遺伝子の発現をマ一カーとして遺伝子の発現調節を検出する方法であ る。 一般に遺伝子の発現調節はその 5' 上流域に存在するプロモーター領域と呼 ばれる部分で制御されておリ、 転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの 活性を測定することで推測することができる。 試験物質がプロモーターを活性化 すれば、 プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化 する。 このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺 伝子の発現に置き換えて検出することができる。 したがって、 PPAR相互作用 p68 RNA へリケースのプロモータ一領域を用いたレポーター遺伝子ァッセィにより、 PPAR相互作用 p68 RNAヘリケースの発現調節に対する試験物質の作用はレポータ 一遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。 配列番号 5で表される塩基 配列からなる p68 RNAヘリケースのプロモーター領域と融合された 「レポーター 遺伝子」 は、 一般に用いられるものであれば特に限定されないが、 定量的測定が 容易な酵素遺伝子などが好ましい。 例えば、 バクテリアトランスポゾン由来のク 口ラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 （CAT) 、 ホタル由来の ルシフェラーゼ遺伝子 （Luc) 、 クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子 （GFP) 等が あげられる。 レポーター遺伝子は、 配列番号 5で表される塩基配列からなる p68 RNA ヘリケースのプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。 p68 RNA ヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換さ れた細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の 発現量を比較することにより試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析するこ とができる。 上記工程を実施することにより、 PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース の発現を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質のスクリーニング を実施できる。 具体的には、 実施例 5に記載の方法により、 前記スクリーニング を実施できる。 本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、 特に限定されるもの ではないが、 例えば、 市販の化合物 （ペプチドを含む） 、 ケミカルファイルに登 録されている種々の公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル 'ケミス トリー技術 （Terrettら、 J. Stee l e. Tetrahedron, 第 51巻、 第 8135—8173頁、
1995年） によって得られた化合物群、 微生物の培養上清、 植物や海洋生物由来の 天然成分、 動物組織抽出物、 あるいは、 本発明のスクリーニング法により選択さ れた化合物 （ペプチドを含む） を化学的又は生物学的に修飾した化合物 （ぺプチ ドを含む） を挙げることができる。
[ 3 ] インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
本発明には、 本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、 及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むこと を特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。 本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、 前 記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤、 及びノ又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注、 筋注、 若しくは関節注など の注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げる ことができる。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与が 好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン, 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成 物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィル厶で被覆す ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤, 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として, 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油（例えば、 ォリーブ油）、 アルコール類 (例えば、 エタノー ル）、 又はポリソルベート 80等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿潤剤, 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを含むこ とができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾過、 殺 菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固体組成 物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、 使用 することもできる。
投与量は、 有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質 の活性の強さ、 症状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮して、 適宜決定するこ とができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 (体重 60kgとして）におい て、 1日につき約 0·■！〜 100mg、 好ましくは 0. ·！〜 50mgである。 非経口投与の場合、 注射剤の形では、 1日につき 0. 01〜50mg、 好ましくは 0. 01〜10mgである。 実施例
以下、 実施例によって本発明を詳述するが、 本発明は該実施例によって限定さ れるものではない。 なお、 特に断りがない場合は、 公知の方法 （「Mo l ecu l ar CloningjSambrook, Jら、 Go Id Spring Harbor Laboratory Press'、 1989年、 等) に従って実施可能である。 また、 市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の 指示書に従つて実施可能である。
(実施例 1 ) PPARyAF-1領域結合蛋白質の同定
(1 ) PPARr遺伝子の単離と動物細胞発現用プラスミド pcDNA— PPARrの作製 配列番号 6及び 7に示したプライマーを用いて、 ヒト脂肪組織 GDNAライブラリ 一 （クロンテック社） から PGR法 （DNAポリメラーゼ （LA Taq DNA polymerase； 宝酒造社） を用い、 94 °C (5分） の後、 94 °C (30秒） 、 55 。C (30秒） 、 72 °C (90秒） のサイクルを 35回繰り返した後 72 °Cで 7分加温）により PPARr2の全長域 をコードする 1518bp (ベ一スペア） を含む GDNA断片を取得した。ヒト PPARr2の全 長をコードする GDNAを動物細胞発現ベクター PGDNA3.1/V5-His-T0P0ベクター （ィ ンビトロジェン社） に in vitro組換えによる T0P0クローニング法 （インビトロ ジェン社） によリ揷入して動物細胞発現用プラスミ ド pcDNA— PPARrを作製した。
(2) グルタチオン S-トランスフェラーゼ （GST) 融合タンパク質発現用ブラ スミド pGEX-PPAR r -AF-1の作製と GST- PPAR γ -AF-1融合蛋白質の発現
配列番号 6及び 8に示したプライマーを用いて、 実施例 1の （1 ) で作製した pcDNA- PPARrを錶型として PGR法 （DNAポリメラ一ゼ (Taq DNA polymerase； シグ マ社） を用い、 94 °C (5分） の後、 94 °C (30秒） 、 55 °C (30秒） 、 72 °C (30 秒） のサイクルを 25回繰り返した後 72 °Cで 7分加温） により PPARrの AF-1領域を 含む領域をコードする約 600bpの GDNA断片を取得した。これを制限酵素 （EGORIお よび Notl ； 宝酒造社） 処理し、 同様に制限酵素処理した pGEX- 6P- 1 (アマシャム バイオサイエンス社) プラスミドに揷入して GST融合タンパク質発現用プラスミ ド pGEX - PPARr - AF - 1を作製した。このプラスミ ドで形質転換した大腸菌を 37 °Cで 3時間培養した後、 イソプロピル-； S-D -チォガラクトビラノシド （IPTG ;ナカラ ィテスク社） を最終濃度 2.5 mMで添加して融合蛋白質の発現を誘導し、 さらに 27 °Cで 6時間培養した。 その後この大腸菌を回収し、 超音波発生装置 （201M ; ク ボタ社） により細胞を破砕して GST— PPARr—AF-1融合蛋白質を調製した。
(3) GSTプルダウンアツセィ 実施例 1の （2) で調製した GST - PPARr— AF - 1融合蛋白質をゲル （ダルタチ オンセファロ一ス 4B； アマシャムフアルマシア社） に結合させた後、 このゲルを 適当な緩衝液で洗浄して非特異的な蛋白質の結合を除いた。 p68 RNAヘリケース 発現べクタ一、 pSG5-p68 (Endohら、 Mol.Cel l.BioU 第 19巻、 第 5363 - 5372頁、 1999年） を錶型として、 キット添付のプロトコールに従い試験管内発現系
(ΤΝΓΤ7 Quick Coupled Transcription/ Translation System； プロメガ社） と 放射ラベルメチォニン (EASYTAG™EXPRESS PROTEI LABELI G MIX [35S] - ; NENラ ィフサイエンス社） で放射ラベルした全長 p68 RNA ヘリケース蛋白質を前記の GST- PPARr - AF-1融合蛋白質を結合したゲルに混ぜて 4 °Cで 1時間結合反応をさせ た後洗浄した。 これをドデシル硫酸ナトリウム変性ポリアクリルアミドゲルを用 いて分離し （SDS - PAGE) 、 イメージングアナライザー （Typhoon 8600； フアルマ シァバイオサイエンス社） により解析した。 その結果、 PPARrの AF - 1領域と p68 RNAヘリケースとの結合が確認された。 これにより p68 RNAヘリケースが PPARr の AF - 1領域に結合する因子であることが明らかとなつた。
(実施例 2) PPARrのリガンド存在下での転写誘導能に対する p68 RNAヘリケー スの調節作用の検出
上述の結果から、 p68 RNAヘリケースは PPARrの AF-1領域と相互作用すること が示された。そこで p68 RNAヘリケースが PPARrの有する転写誘導活性にどのよ うな影響を及ぼすか、 培養細胞 G0S-1を用いたレポーターアツセィで調査した。
PPAR rのリガンドとして作用することが報告されているチアゾリジン誘導体、 ピ ォグリタゾン (piogl itazone. (+)-5- [4- [2- (5-ェチル- 2-ピリジニル）エトキシ] ベンジル] -2, 4-チアゾリジンジオン；武田薬品工業， 特許 1853588号） は特許明 細書の方法に従って合成した。
(1 ) PPARrの転写誘導能に対する P68 RNAヘリケースの調節作用の検出 培養細胞 C0S-1細胞は 96ゥエル培養プレート（旭テクノグラス社）で 90%コンフル ェントの状態になるまで各ゥエル 10%牛胎児血清 （シグマ社） を含む 100 1の最 少必須培地 DNIEM (ギブコ社） 中で培養した。 この細胞にリボフ Iクシヨン試薬
(リポフエク卜ァミン 2000 ;インビトロジェン社） を用いて、 リポフエクシヨン 試薬添付のプロトコールに従い、 以下 （A) 、 (B) 、 (C) 、 及び （D) を一 過性にコ トランスフヱク卜した。
(A) 実施例 1の （1 ) により作製した pcDNA - PPARr (30 ng ウエル）
(B) PPAR結合配列をルシフヱラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターコン ストラク ト （Kl iewerら、 Nature、 第 358巻、 第 771-774頁、 1992年） （100 ng ウ エル）
(C) p68 RNA ヘリケース発現ベクター、 pSG5-p68 (Endohら、 Mol. Cel I. Biol . 第 19巻、 第 5363- 5372頁、 1999年) (0-10 ngZゥエル）
(D) β - ラウ トシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミド pGMV- -ガラクトシダ ーゼコントロールベクタ一 （ロッシュ 'ダイァグノスティック社） 10 ngノウェ ル
PPARrァゴニストであるピオグリタゾンを最終濃度 30 nMとなるように前記コト ランスフエク卜した細胞に添加して 24時間培養した後、 培地を除去し、 細胞をリ ン酸緩衝液 （PBS) で洗浄した。 1ゥエルあたり 80 ju lの細胞溶解液 （100 mM リ ン酸カリウム (pH7.8) 、 0.2 %トリ トン X-100) を添加して細胞を溶解した。 こ の細胞溶解液 20 Iにルシフェラーゼ基質溶液 100 u I (和光純薬工業社） を添 加し、 化学発光測定装置 （ML3000型； ダイナテツクラポラトリーズ社） を用いて 発光量を測定した。また、 別途、 前記細胞溶解液の -ガラクトシダーゼ活性を -ガラク トシダーゼ活性検出キッ卜 (Gal cto-Light Plus™ system； TR0PIX 社） を用いて測定し数値化した。 これを導入遺伝子のトランスフエクシヨン効率 として上述のルシフェラーゼ活性を各ゥエル毎に補正した。
上記実験の結果、 PPARrのァゴニスト依存的な転写誘導活性は、 P68 RNA ヘリ ケースを共発現することにより、 P68RNAへリケース量依存的に促進されることが わかった （図 1 ) 。 この事実は、 P68RNAヘリケースが PPARrの転写誘導共役因子 の一つであることを明らかにしている。 これを利用して、 p68RNAヘリケースの量 を増やせば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが 可能である。 すなわち、 p68RNAヘリケースの量が増えることで PPARrの転写誘導 能がより亢進する結果、 PPARrァゴニスト同様の作用、 つまりインスリン抵抗性 改善作用を期待することが出来る。 本実験系で、 PPARrの転写誘導活性を促進す る物質並びにィンスリン抵抗性を改善する物質の検出及び 又はスクリ一二ング が可能となった。
(実施例 3 ) ヒト組織における p68 RNA ヘリケースの発現確認
配列番号 9及び 1 0に示したプライマーを用いて、 ヒト cDNAライブラリー （ク ロンテック社） から PGR法 （DNAポリメラーゼ （Taq DNA po l ymerase； シグマ社） を用い、 94 °C (5分） の後、 94 °C (30秒）、 55°C (30秒）、 72°C (30秒） のサイク ルを 35回繰り返し、 72 °Cで 7分加温） により p68 RNA ヘリケースをコードする 約 800bpの GDNA断片の増幅をァガロースゲル電気泳動法により検出した。その結果, p68 RNA ヘリケースは、 PPAR rの作用があることが知られている脂肪組織及び筋 肉で発現していることを見出した。これにより発現部位からも p68 RNA ヘリケー スが PPAR γの転写共役因子であることが裏付けられた。
(実施例 4 ) 3T3L1細胞の脂肪細胞への分化過程における p68 RNAヘリケース m RNA発現量の比較
培養細胞 3T3L1細胞は培養プレート （直径 60剛;旭テクノグラス社） に 10 %牛 胎児血清 （シグマ社） を含む最少必須培地 DIEM (ギブコ社) 2 m lを加えてコンフル ェントの状態になるまで培養した。 その後、 分化用培地 （最少必須培地 DMEM (ギ ブコ社） にインスリン （最終濃度 10 / g/m l ； シグマ社） 、 デキサメサゾン （最 終濃度 250 シグマ社） および 3-イソブチル -1-メ トキシルキサンチン （最終 濃度 500 ju M ;シグマ社) を加えたもの） に交換し、 これにインスリン抵抗性改 善薬であるピオグリタゾン （最終濃度 1 μ Μ) を添加したものと添加しなかった ものとで p68 RNAヘリケースの発現量に変化が生じるか否かを調査した。 ピオグ リタゾンを添加して 24時間後に細胞を回収し、 RNA抽出試薬 （I S0GEN ;和光純薬 工業社） を用いて RNAを抽出して逆転写反応キット （Thermoscr i pt RT-PCR
System；インビトロジヱン社） を使って逆転写反応を行ったものを錶型として、 配列番号 1 1及び 1 2 (p68 RNA へリケース） 、 もしくは配列番号 1 3及び 1 4
(G3PDH) に示したプライマーセッ卜と検出試薬 （2x SYBR Green Master M i x； アプライドバイオシステム社） を用いてリアルタイム PGR法 （プリズム 7700シ一 クエンスディテクシヨンシステム；アプライドバイオシステム社） により p68 RNA ヘリケース及び G3PDHの発現量の変化を調べた。 p68 RNA ヘリケース遺伝子 の発現量は、 下記式に基づいて G3PDH遺伝子の発現量で補正した。
[p68 RNA ヘリケース補正発現量 ] = [p68 RNA ヘリケースの発現量 （生デ一 タ） ] [G3PDH遺伝子の発現量 （生データ） ]
その結果、 ピオグリタゾンを添加したものは非添加のものに比較して p68 RNA へリケースの発現量が約 1 · 7倍となっていることが明らかとなった。 これにより インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンは、 p68 RNAヘリケースの発現量 を亢進させる作用を有しており、 したがって、 p68 RNA ヘリケースの発現亢進が、 ィンスリン抵抗性を改善することが裏付けられた。
(実施例 5 ) p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
( 1 ) p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター領域の単離とレポ一ターべクタ 一の作製
先に報告されている p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーターの塩基配列
(ROss l erら、 Nuc l e i c Ac i ds Res.、 第 28巻、 第 932-939頁、 2000年） およびヒ卜 ゲノム DNA配列 （GenBank access i on番号 AG009994) を基に設計した配列番号 1 4及び 1 5のプライマーを用いてヒトゲノム DNA (クロンテック社） を錶型とし て、 PGR法 （DMAポリメラーゼ （LA Taq DNA po l ymerase；宝酒造社） を用い、
98 °C (5分） の後、 96 °C (30秒） 、 55 °C (30秒） 、 72 °C (90秒） のサイクル を 35回繰り返した後 72 °Cで 7分加温） により p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモ 一ター領域を含む配列番号 5で示される DNA断片を収得した。 この DNA断片を制限 酵素 （Kpn lおよび Xho l ；宝酒造社） で処理し、 同様に制限酵素処理したルシフエ ラーゼレポーターベクター （pGL3-Bas i cベクター； プロメガ社） に連結して p68 RNA ヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター （pGL3-p68- 1 184bp) を構築した。 さらに、 この pGL3-p68-1 184bpを制限酵素 （Nhe lおよび
Xho l ；宝酒造社） で処理して得られた p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター 領域を- 899bpまで含んだ DNA断片を、 同様に制限酵素処理した pGL3- Bas i cべクタ 一に連結し、 p68 RNA ヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター (pGL3-p68-899bp) を構築した。
( 2 ) p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
実施例 5の （1 ) で構築した pGL3- p68-899bp、pGL3-p68-1 184bp、 又は陰性対照 として pGL3-Bas i c (100 ng/ゥエル） をそれぞれ j8 -ガラクトシダーゼ発現べク ター （pGMV - ) δ -ガラクトシダーゼコントロールベクタ一； ロッシュ■ダイァグノ スティック社社） （10 ngノウエル） と共に G0S-1細胞に一過性にコトランスフエ クトした。 コトランスフエクトは実施例 2の （1 ) と同様の方法で行った。 48時 間培養した後、 実施例 2と同様にルシフヱラーゼ発光量を測定した。 また、 実施 例 2と同様に β -ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランス フエクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ゥェル毎に補正した。 上記実験の結果、 p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター活性は陰性対照で ある pGL3-Bas i Gに比して非常に強いことが明らかとなつた （pGL3- p68-1 184bpの 時 pGL3- Bas i cの約 202倍、 pGL3-p68- 899bpの時 pGL3-Bas i cの約 94倍） 。 また pGL3- p68 - 899bpに比して pGL3-p68 - 1 184bpで得られた活性が約半分であったことか ら、 - 1 184bpから- 899bpまでの領域が転写抑制性調節に関与していることが明ら かとなつた。 この抑制性調節を解除する作用をもつ物質は、 結果として p68 RNA へリケース遺伝子の転写を亢進する作用があると期待され、 pGL3-p68-1 184bpを 用いた本発明によりこのような物質をスクリーニングすることが可能となった。
( 3 ) p68 RNA ヘリケース遺伝子のプロモーター活性に対するインスリン抵抗性 改善薬の調節作用の検出
ィンスリン抵抗性改善薬の一つであるピオダリタゾンを最終濃度 10 Mとなる ように実施例 5の （2 ) でコ 卜ランスフエクトした細胞に添加して 24時間培養し た後、 実施例 2と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。 また、 実施例 2と同様 にS -ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランスフエクショ ン効率として上述のルシフヱラーゼ活性を各ゥヱル毎に補正した。
上記実験の結果、 インスリン抵抗性改善薬依存的に p68 RNA ヘリケース遺伝子 のプロモーター活性の亢進が認められた （図 2 ) 。 この事実は、 p68 RNA ヘリケ ース遺伝子の転写がィンスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによつ て亢進されることを明らかにし、 インスリン抵抗性改善の機構が p68 RNA ヘリケ ース遺伝子の転写活性化であることを明らかにしている。
また、 インスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによる p68 RNA へ リケース遺伝子のプロモータ一活性の亢進は pGL3- p68- 899bpおよび pGL3-p68 - 1 184bpの両方で同様に認められたことから、 ピオグリタゾンによる転写活性化の 作用点は- 899bpより 3' 下流側に存在すると考えられ、 -1 184bpから- 899bpまでの 領域による転写抑制性調節の解除ではないことが明らかとなった。 したがって、 この p68 RNA ヘリケース遺伝子の抑制性調節を解除する作用を持つ物質のスクリ 一二ング、 より具体的には pGL3- p68 - 1 184bpのレポーター活性をより亢進させる 物質のスクリーニングにより従来のインスリン抵抗性改善薬とは異なる p68 RNA へリケースの発現量を亢進する物質並びにィンスリン抵抗性を改善する物質を検 出及びノ又はスクリーニングすることが可能になった。
これらのことより、 p68 RNA ヘリケースの発現亢進がインスリン抵抗性を改善 する可能性が裏付けられた。 これを利用して、 p68 RNA ヘリケースの発現量を亢 進させれば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが 可能である。 本実験系でィンスリン抵抗性を改善する物質の検出及び 又はスク リーニングが可能となった。 産業上の利用可能性
本発明の、 PPAR rと PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースの相互作用を利用したス クリーニング系、 及び PPAR相互作用 P68 RNA ヘリケースの発現亢進を利用したス クリ一ニング系は、 従来のインスリン抵抗性改善薬である PPAR r合成リガンドと は異なる新しいタイプの薬剤のスクリーニングに利用できる。 本発明の細胞は、 前記スクリ一ニング系の構築に利用できる。
また、 本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分と し、 担体、 賦形剤、 及び 又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、 インスリン抵抗性改善用医薬組成物を製造することができる。 配列表フリーテキス卜 以下の配列表の数字見出しく 223>には、 「Ar"UfiGial Sequencejの説明を記載す る。具体的には、 配列表の配列番号 6〜8、 10、 14、 及び 15の配列で表される各塩 基配列は、 人工的に合成したプライマ一配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ί ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 〜 10個のアミノ酸が欠 失、 置換、 及び/または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相互作 用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 i ί ) 配列番号 4で表され る PPAR r蛋白質の少なくとも AF - 1領域と転写因子の DNA結合領域とからなる融合 蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 及び、 ί i i ) 前記転写因子の DNA結合 領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子によリ形質転換された 細胞、
あるいは、
i ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1 ~10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相互作用す るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 及び i ί ) 配列番号 4で表され る PPAR r蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子によリ形質 転換され、 a ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、 1 ~10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び/または挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも PPAR rと相互作用するポリペプチド、 及び、 b ) 配列番号 4で表される PP AR r蛋白質を発現している細胞。
2. 転写因子が酵母の GAL4蛋白質である請求の範囲 1記載の細胞。
3. レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求の範囲 1記載の細胞。
4. i ) 請求の範囲 1乃至請求の範囲 3に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、 及び、 ί ί ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の 変化または試験物質依存的な PPAR rの転写誘導活性の変化を分析する工程を含む ことを特徴とする、 試験物質が PPAR rの転写誘導活性を促進するか否かを検出す る方法。
5. i ) 請求の範囲 1乃至請求の範囲 3に記載の細胞に試験物質を接触させる工程, i i ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化ま たは試験物質依存的な PPAR rの転写誘導活性の変化を分析する工程、 及び ί i i ) レポーター活性を亢進する試験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、 PPAR rの転写誘導活性を促進する物質をスクリーニングする方法。
6. PPAR rの転写誘導活性を促進する物質がィンスリン抵抗性改善薬である請求の 範囲 5記載のスクリーニング方法。
7. i ) PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触 させる工程、 及び、 ί ί ) 試験物質依存的な PPAR相互作用 p68 RNA ヘリケース発 現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善薬を スクリーニングする方法。
8. i ) 配列番号 5で表される塩基配列からなる P68 RNA ヘリケースのプロモー ター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を 接触させる工程、 及び、 i ί ) レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依 存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、 インスリン 抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
9. 請求の範囲 5乃至請求の範囲 8に記載のスクリーニングする方法を用いてス クリーニングする工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法。
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