WO2005052150A1 - インスリン遺伝子の転写調節方法 - Google Patents

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WO2005052150A1
WO2005052150A1 PCT/JP2004/018068 JP2004018068W WO2005052150A1 WO 2005052150 A1 WO2005052150 A1 WO 2005052150A1 JP 2004018068 W JP2004018068 W JP 2004018068W WO 2005052150 A1 WO2005052150 A1 WO 2005052150A1
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WO
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ipf1
protein
binding
seq
dlx4
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PCT/JP2004/018068
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English (en)
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Hirofumi Doi
Kensaku Imai
Naoya Wada
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Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Celestar Lexico-Sciences, Inc.
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating transcription of an insulin gene. More specifically, the present invention relates to a protein that binds to IPF 1 (Insul in promoter factor-1; hereinafter, abbreviated as “IPF 1” in the present specification). It relates transcriptional regulation method the insulin gene comprising the step of inhibiting the binding of quality, Oh Q bACKGROUND
  • IPF1 is a transcription factor expressed in] 3 cells of the knee, and is a factor that promotes the expression of genes important for glucose metabolism, such as insulin, glucokinase, and GLUT2 (reviewed by Diabetologia 44, 1203). -1214, 2001; Eur. J. Endocrinol. 146, 129-141, 2002; Diabetologia 45, 309-326, 2002) 0
  • Defective function of IPF 1 causes abnormalities in glucose metabolism and hereditary type 2 diabetes M0DY4 (Maturity -onset diabetes of the young) (J. Clin. Invest. 104, R41-R48, 1999)
  • IPF1 is an important factor in maintaining the function of glucose metabolism such as insulin secretion and viscera. It is believed that
  • IPF1 is phosphorylated via the signal transduction system of phosphatidylinositol 3-kizase and stress-activated protein kinase by anti-glucose stimulation and translocates into the nucleus.
  • IPF1-dependent insulin gene promoter activity is suppressed by hepatocytes, two-utalia, and one-factor- alpha (HNF-1a).
  • HNF-1a one-factor- alpha
  • HNF 3 G Hepatocyte nuclear factor 3-gamma
  • DLX 4 (sometimes called Distal-less, homeobox 4, or BP1) is a homeodomain-containing transcription factor that is known to suppress the transcription of the ⁇ -globin gene (Mol. Cell. Biol. 22 , 2505-2514, 2002).
  • TCF 4 Transcription factor 4 is a transcription factor having a helix-loop-helix structure, and is known to bind to the initiator element of the somatostatin receptor II gene and the enhancer element of the immunoglobulin gene to activate transcription. (EMB0 J. 15, 6680-6690; Science 247, 467-470).
  • PHF1 PHD finger protein 1
  • PHD finger domain is a protein having a PHD finger domain and is thought to be a transcriptional regulator, but its function is unknown (Genomics 48, 381-383, 1998). However, it has never been known that these transcription factors are regulators of insulin gene transcription.
  • TMPO Thimopoietin
  • IPF 1 is an important transcription factor in the transcription of insulin gene
  • identifying a protein that binds to IPF 1 is necessary to provide a means for preventing and / or treating diabetes. Very important.
  • IPF 1 and By inhibiting the binding to the protein it is possible to provide a means for regulating the transcription of the insulin gene. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a protein that binds to IPF1, and to provide a means for regulating insulin gene transcription by inhibiting the binding of IPF1 to the protein.
  • the present inventors have modified the amino acid sequence of IPF 1 to a certain length according to the prediction method described in International Publication No. WO001 / 67299.
  • the protein is decomposed into peptides, and the amino acid sequence of each oligopeptide or a protein having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence is searched in a database, and a local alignment is performed with the selected protein to perform local alignment. Proteins with high scores were predicted to be proteins that could bind to IPF1. As a result, several types of proteins having oligopeptides having homology to the oligopeptide consisting of the amino acid sequence derived from IPF1 were found.
  • the present inventors have found that these proteins bind to IPF1, and found a method for regulating transcription of an insulin gene based on the binding. Further, they have found that these proteins have an activity of suppressing the activity of an insulin promoter.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for promoting transcription of an insulin gene comprising a step of inhibiting the binding of IPF1 to any one of the following groups:
  • HN F 3 G hepatocyte nuclear factor 3-gamma
  • a method for screening a substance that inhibits the binding between IPF1 and any one of the following proteins wherein the test is performed under conditions that allow the binding of IPF1 and the protein.
  • the substance is brought into contact with IPF 1 and Z or the protein, and then the signal and / or marker generated by the binding of IPF 1 and the protein are Determining whether the test substance inhibits the binding of IPF1 to the protein by detecting the presence or absence or change of the signal and Z or the marker in a system capable of detecting car Screening methods including:
  • a method for screening a substance that promotes transcription of an insulin gene comprises the step of: binding a test substance under conditions that allow binding of IPF1 and any one protein selected from the following group: And IPF1 and / or the protein, and then, in a system capable of detecting a signal and / or a marker generated by binding of the IPF1 and the protein, the presence or absence of the signal and / or the marker; or A screening method comprising a step of determining whether the test substance inhibits the binding between IPF1 and the protein by detecting the change:
  • a method for screening a substance that promotes transcription of an insulin gene comprising the steps of: testing a substance under conditions that allow binding of IPF1 and one of the following proteins selected from the group consisting of:
  • a screening method comprising a step of determining whether or not contacting a substance with IPF1 and / or the protein promotes transcription of the insulin gene: (i) HNF 3G,
  • the present invention provides a substance screened by any of the above screening methods.
  • a medicament for preventing and / or treating a disease caused by a decrease in the amount of an insulin gene product wherein IPF1 binds to any one protein selected from the following group: Drugs that inhibit
  • a medicament for preventing and treating diabetes or treating diabetes which inhibits the binding of IPF1 to one of the following proteins:
  • medicaments containing a substance screened by any of the above-mentioned screening methods as an active ingredient.
  • a method for preventing and / or treating a disease caused by a decrease in the amount of a gene product of an insulin gene comprising a step of inhibiting the binding of IPF1 to one of the following groups:
  • a method for preventing and / or treating diabetes comprising a step of inhibiting the binding of IPF1 to one of the following proteins:
  • a method comprising a step of administering a substance screened by any of the above screening methods.
  • the present invention provides a reagent kit used for the above-mentioned screening method
  • FIG. 1 shows the results of oral alignments with the oligopeptides PPGLSASPQPS, EGAEPGV, and PFPGALGA composed of amino acid residues derived from IPF1 and the homologous oligonucleotides PGGLPASPLPS, EGGEPGV, and PYPGGLPA in HNF3G. Is shown.
  • FIG. 2 shows the results of low-power alignment of oligopeptides PPDISPYE and GEELL consisting of amino acid residues derived from IPF1 and homologous oligopeptides PPDRSPLE and GEELL in PHF1.
  • FIG. 3 shows the results of oral alignments with the oligonucleotides IKIWFQNRRMKWKK, SPQPS, and RRPQEP, which are homologous in DLX4, and VKIWFQNKRSKYKK, SPEPS, and RRPQAP, which are composed of IPF1-derived amino acid residues. Show.
  • Fig. 4 shows the oligopeptides HHHLPAQ, PPGLSAS consisting of amino acid residues derived from IPF1, and the homologous oligopeptide HSLLPNC in TCF4 with GPAPEFSA! , PPGLPSS, and GSPPSLSA show the results of local alignment.
  • FIG. 5 shows the results of oral alignment of the oligopeptide FQRGPAPEFSASPP consisting of amino acid residues derived from IPF1 and the homologous oligonucleotide FQGISFPEISTRPP in TMP0.
  • FIG. 6 shows the results of a binding test between IPF1 and HNF3G, PHF1, DLX4, TCF4, or TMPO.
  • FIG. 7 shows the results of detection of IPF1-dependent human insulin promoter activity in a HeLa cell line.
  • FIG. 8 shows the effect of HNF3G, PHF1, and DLX4 overexpression on the IPF1-dependent human insulin promoter activity in a HeLa cell line.
  • FIG. 9 shows the effect of HNF3G, PHF1, and DLX4 overexpression on human insulin promoter activity in the MIN6 cell line.
  • FIG. 10 shows the results (RT-PCR) of confirming the expression of human HNF3G, human PHF1, and human DLX4 in the human knee.
  • Fig. 11 shows mouse HF3G, mouse PHF1, and mouse DLX4 in MIN6 cells. Shows the results (RT-PCR method) for confirming the expression of.
  • the proteins (i) to (V) (sometimes called wild-type interacting proteins) used in the present invention are represented by SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10 and 12 in the sequence listing, respectively. It is a protein represented by the described amino acid sequence.
  • IPF1 used in the present invention (this may be called wild-type IPF1) is a protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Therefore, those skilled in the art can easily obtain the wild-type interacting protein and the wild-type 1PF1 from these descriptions.
  • a purification method known per se affinity chromatography using a monoclonal antibody having each protein as an antigen
  • a sample in which production of these proteins is observed for example, cells derived from human knee
  • the proteins (i) to (V) include amino acids in which one or several amino acids have been substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence of the above-mentioned wild-type interacting protein.
  • IPF1 includes an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence of the above-mentioned wild-type IPF1, A protein having substantially the same insulin promoter activating action as the wild-type IPF1 or a protein having substantially the same insulin gene transcription promoting action as the wild-type IPF1 (these proteins may be referred to as mutant IPF1). ) Is also included.
  • the mutant interacting protein has a certain degree of amino acid sequence (e.g., 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably the amino acid sequence of the wild-type interacting protein). Is 90% or more, particularly preferably 95% or more) It is preferable to have an amino acid sequence having Similarly, the mutant IPF1 has a certain amino acid sequence (eg, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 90% or more) with the amino acid sequence of the wild-type IPF1. (95% or more).
  • Methods for obtaining genes encoding these mutant proteins are known, and include, for example, Molecular Cloning: AL aboratory Manu al '(ed. By Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring (Harbour, New York, 1989) and the like, or a method analogous thereto, and the desired mutant protein can be easily obtained. Whether the obtained mutant protein has substantially the same insulin gene transcription regulation activity as the wild-type interacting protein is determined by the insulin promoter activity specifically shown in Example 3 of the present specification. Those skilled in the art can easily confirm by using the method for detecting the inhibitory effect of the above. Further, whether or not the obtained mutant protein has the same insulin promoter activating action as that of wild-type IPF1 was determined by using the insulin promoter activity measurement method specifically shown in Example 3 of the present specification. It can be easily confirmed by those skilled in the art.
  • the method for promoting transcription of an insulin gene comprises a step of inhibiting the binding of IPF1 to any one of the above proteins (i), (ii) and (iii). It is characterized by including.
  • the above-mentioned (i), (ii), or (iii) protein that binds to IPF1 generally has the insulin promoter activity of IPF1. Is expected to be suppressed. Therefore, a substance that inhibits this binding can activate the insulin promoter and promote the transcription of the insulin gene by inhibiting the inhibitory action of the protein on the insulin promoter activity.
  • the type of the substance that inhibits the above-mentioned binding is not particularly limited.
  • proteins such as antibodies, nucleic acids such as antisense nucleic acids, and many others.
  • High molecular compounds such as sugars and lipids may be used. Also, whether it is a natural substance or a non-natural substance May be.
  • the bond between I1 and a certain protein is defined as IPF1 and non-covalent bonds such as a hydrophobic bond and an electrostatic interaction, so that IPF1 and the protein form a complex. 1 and the protein interact.
  • binding herein means that IPF1 and the protein as a whole bind.
  • amino acids that do not participate in the binding between IPF1 and the protein may be included in the amino acids constituting IPF1 or the protein.
  • the binding between IPF1 and the protein is determined by co-precipitation by immunoprecipitation, two-hybrid method, Burdun method, Western plot method, fluorescence resonance energy transfer method or other known methods or a combination of these methods. Can be detected.
  • the substance having the above-mentioned inhibitory action can be screened, for example, by the following method provided by the present invention.
  • the method is a method for screening a substance that inhibits the binding between IPF1 and any one protein selected from the group consisting of the above (i) and (V).
  • a test substance is brought into contact with IPF 1 and / or the protein under conditions that allow binding, and then the signal is detected in a system that can detect signole and Z or a marker generated by the binding of IPF 1 and the protein. And / or detecting the presence or absence or change of a marker to determine whether the test substance inhibits the binding between IPF1 and the protein.
  • a substance that inhibits binding to any one protein selected from the group consisting of (i), (ii), and (iii) can be screened.
  • the conditions that allow the binding of IPF1 and a certain protein include, for example, conditions under which IPF1 and the protein are co-expressed in a cell.
  • the conditions can be satisfied by transfecting a suitable vector into which IPF1 and a polynucleotide encoding the protein have been incorporated into cells by a conventional genetic engineering technique.
  • the signal generated by the binding of IPF 1 and the protein Null means that which is generated by binding of IPF 1 and the protein and can itself be directly detected by its physical or chemical properties, and a marker which is generated by binding of IPF 1 and the protein.
  • the signal include luciferase and a radioisotope
  • the marker include a reporter gene such as a chloramphenicol acetyltransferase gene and the like, and a detection epitope tag such as a 6XHis-tag.
  • the IPF 1 and the test substance coexist when compared to the case where the test substance is not coexistent. It can be determined that the test substance inhibits the binding of IPF1 to the protein when the signal and no or marker generated by the binding of 1 to the protein are reduced or eliminated.
  • the type of the test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and any compound can be used as the test substance.
  • the test substance may be a low molecular compound such as an organic compound, an inorganic compound, a saccharide compound, or a high molecular compound such as a protein, a nucleic acid, a polysaccharide, or a lipid. It may be a natural substance or a non-natural substance.
  • Examples of the library subjected to the screening include, but are not limited to, a small molecule compound library, a phage display library, a combinatorial library, and the like.
  • the step of detecting the presence or absence or change of the signal and / or the marker in a system capable of detecting the signal and / or Z generated by the binding of IPF1 and the protein or the marker is performed by the insulin gene.
  • the step may be performed as a step of determining whether or not transcription of the insulin gene is promoted.
  • a substance that promotes the transcription of the insulin gene can be screened according to the above method.
  • the present invention provides a kit for performing the above-mentioned screening.
  • the kit comprises (a) IPF1 and / or DNA encoding IPF1, and (b) a protein and Z or It is characterized by containing DNA encoding the protein.
  • the components of the kit may be provided as a protein, or may be provided in the form of a gene capable of expressing the protein, preferably a recombinant vector containing the gene.
  • a medicament containing a substance screened by the method of the present invention as an active ingredient can be used as a medicament for preventing and / or treating a disease caused by a decrease in the amount of an insulin gene product in mammals including humans. Can be administered. Diseases caused by a decrease in the amount of the insulin gene gene include, for example, diabetes (including complications of diabetes).
  • the administration form of the medicament of the present invention is not particularly limited, and it can be administered orally or parenterally.
  • a substance as an active ingredient may be used as it is, but a pharmaceutical composition containing a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive for a pharmaceutical preparation is prepared together with the substance as an active ingredient. It is desirable to administer it.
  • the medicament of the present invention containing a protein as an active ingredient can be formulated according to a conventional method for preparing a protein preparation, and the medicament of the present invention containing a nucleic acid as an active ingredient can also be prepared by means available in the art. It can be formulated and used.
  • nucleic acid includes DNA or RNA.
  • the medicament of the present invention containing a nucleic acid can be used, for example, in the form of a recombinant vector containing a nucleic acid as an active ingredient.
  • the nucleic acid may be either DNA or RA, and the total length is not particularly limited.
  • the antisense nucleic acid may be, for example, an oligonucleotide having 10 bases or more, preferably 15 bases or more so as to enable complementary binding.
  • an antibody capable of binding to the above protein as an active ingredient of the medicament of the present invention preferably when a monoclonal antibody is used, the antibody can be produced by an ordinary method, and a monoclonal antibody capable of specifically binding to the above protein can also be produced by a method commonly used by those skilled in the art.
  • Pharmaceutically and pharmaceutically acceptable pharmaceutical additives include, for example, excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coatings, pigments, diluents, bases, A solubilizer or a solubilizing agent, a tonicity agent, a pH adjuster, a stabilizer, a propellant, a sticking agent, and the like can be used.
  • examples of the pharmaceutical composition suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, syrups, and the like.
  • compositions suitable for parenteral administration include, for example, injections, drops, suppositories, inhalants, transdermal absorbers, eye drops, ear drops, ointments, creams, patches, etc. be able to.
  • the dose of the medicament of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dose is selected according to various conditions such as the kind of the substance as the active ingredient, the purpose of treatment or prevention, the age and symptoms of the patient, and the administration route. In general, the dose can be selected from the range of about 0.001 mg to 1000 mg per adult per day.
  • the present invention also provides a method for preventing and / or treating a disease caused by a decrease in the gene product of the insulin gene.
  • the method is characterized by inhibiting the binding of IPF1 to a protein (preferably, HNF3G, PHF1 or DLX4) that binds to IPF1.
  • a protein preferably, HNF3G, PHF1 or DLX4
  • the disease caused by a decrease in the gene product of the insulin gene includes, for example, diabetes.
  • the method can be carried out using the above-mentioned medicine.
  • a protein interacting with IPF1 was identified by the prediction method described in WO 01/67299. Predicted according to the method. The amino acid sequence of IPF1 is decomposed into oligopeptides of an appropriate length, and the amino acid sequence of each oligopeptide or a protein having an amino acid sequence homologous to the amino acid sequence is searched in a database. Perform local alignment with IPF1 and select the one with the highest local alignment score.
  • the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 53 consisting of amino acid residues derived from IPF1 and the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 55 having homology to the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 54
  • SEQ ID NO: 56 Is present in the amino acid sequence of PHF1 (FIG. 2), and is composed of amino acid residues derived from IPF1 and is described in SEQ ID NO: 57
  • the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 58 is particularly preferred embodiments the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 53 consisting of amino acid residues derived from IPF1 and the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 55 having homology to the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 54
  • SEQ ID NO: 56 Is present in the amino acid sequence of PHF1 (FIG. 2), and is composed of amino acid residues derived from IPF1
  • oligopeptide of SEQ ID NO: 60, the oligopeptide of SEQ ID NO: 61, and the oligopeptide of SEQ ID NO: 62 which are homologous to the oligonucleotide of SEQ ID NO: 59. (Fig. 3), comprising the amino acid residue of IPF1 and the oligopeptide of SEQ ID NO: 63, the oligopeptide of SEQ ID NO: 64, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65.
  • Oligo described The oligopeptide described in SEQ ID NO: 66, the oligopeptide described in SEQ ID NO: 67, and the oligopeptide described in SEQ ID NO: 68, which are homologous to the peptide, are present in the amino acid sequence of TCF4. Fig. 4), it was found that the oligopeptide described in SEQ ID NO: 70, which is homologous to the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 69, consisting of amino acid residues derived from IPF1, was present in the amino acid sequence of TMP0 ( ( Figure 5).
  • Example 2 Binding test with human IPF 1 Whether human IPF1, human HF3G, human PHF1, human DLX4, human TCF4, and X bind to human TMPO was examined by the GST-pull down method.
  • Human IPF1 cDNA is derived from human liver cDNA (Clontech)
  • human HNF3G cDNA is derived from human liver cDNA (Clontech)
  • human PHF1 cDNA is derived from human liver cDNA (Clontech)
  • human TCF4 cDNA is derived from human brain.
  • human DLX4 cDNA was cloned from the human placenta-derived cDNA (Clontech) by PCR.
  • the human IPF1 cDNA was inserted into pGEX-4T (Amersham biosciences), which is a GST fusion protein expression vector, to construct an N-terminal GST fusion IPF1 expression plasmid, pGEX-4T / IPF1.
  • pGEX-4T is a GST fusion protein expression vector
  • cDNAs of human HNF3G, human PHF1, human DLX4, human TCF4 and human TMP0 were incorporated into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), an expression vector for in vitro protein synthesis and animal cells, and each expression was performed.
  • Plasmids were constructed (pcDNA HA-HNF3G, pcDNA-HA-PHF1, pcDNA-HA-DLX4, pcDNA-HA-TCF4 and pcDNA-HA-TMP0). At this time, an HA tag coding sequence was inserted into the 5 'end of each cDNA so that each protein was expressed as an N-terminal HA-tagged protein.
  • pCruzHA-LacZ N-terminal HA-tagged LacZ expression plasmid
  • GST-IPF1 was induced and expressed in E. coli harboring pGEX-4T / IPF1, and then produced using Glutathione sepharose 4B (Amersham biosciences).
  • Human HNF3G, human PHF1, human DLX4, human TCF4, human TMP0 and LacZ were labeled with 35 S-methionine in vitro using TNT quick coupled transcription / translation systems (Promega soil) 3 ⁇ 4r. Synthesized as a protein. 20 mu synthesis reaction solution of ⁇ and 5 mu beta GST-IPF1 or GST, 500 At 1 Binding buffer (40 mM HEPES, pH 7.5 / 50 mM KC1 / 5 mM MgCl 2 /0.2 mM EDTA / 1 mM DTT / 0.5% NP-40) It was left on ice for 1 hour.
  • Binding buffer 40 mM HEPES, pH 7.5 / 50 mM KC1 / 5 mM MgCl 2 /0.2 mM EDTA / 1 mM DTT / 0.5% NP-40
  • FIG. 6 Binding of IPF1 to HF3G, PHF1, DLX4, TCF4, and TMP0 was observed (FIG. 6). Since no binding between LacZ and IPF1 was observed, it can be said that the detected binding between IPF1 and each protein is not nonspecific (Fig. 6).
  • Example 3 Inhibition of human insulin gene promoter activity by human HNF3G, human PHF1, and human DLX4
  • human HNF3G human PHF1, human DLX4, human TCF4, and human TMP0 that showed binding to IPF1
  • human insulin gene promoter activity using human HF3G, human PHF1, and human DLX4 was investigated using a reporter atsey system.
  • Human insulin gene promoter region (-392 / + 237, transcription start point is +1) was cloned from Human genomic DNA (Clontech) by PCR. The cloned promoter region is incorporated into pGL3-Basic, a luciferase reporter vector (Promega), to construct pInsPro (-392 / + 237)-GL3, a reporter plasmid for measuring human insulin gene promoter activity. did.
  • Human IPF1 cDNA was incorporated into P cDNA3.1 (+) (Invitrogen) to construct an IPF1 expression plasmid (pcDNA-FLAG-IPF1). At that time, a FLAG tag coding sequence was inserted into the fifth and the end of the IPF1 cDNA so as to be expressed as an N-terminal FLAG-tagged protein.
  • expression plasmids for human HNF3G, human PHF1, and human DLX4 As expression plasmids for human HNF3G, human PHF1, and human DLX4, pcDNA-HA-HNF3G, pcDNA-HA-PHF1, and pcDNA-HA-DLX4 were used, respectively.
  • Plasmids were 200 ng of pInsPro (-392 ⁇ 237)-GL3, 400 ng of pcDNA-FLAG-IPF1 and l ⁇ g of each expression plasmid (pcDNA-HA-HNF3G, pcDNA-HA-PHF1, and pcDNA-HA- DLX4) and 0.5 ng of pRL-SV40 (Promega) were used as internal controls, respectively.
  • the total amount of DNA was adjusted to 1.6 g with pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
  • luciferase activity was measured using the Dual—: Luciferase Reporter Assay System (Promega). The measured values were measured by Renilla luciferase activity.
  • MIN6 cells derived from mouse insulinoma / 3 cells
  • FIG. 8 the vertical axis represents the relative luciferase activity when the luciferase activity when only pcDNA-FLAG-IPF1 was introduced was defined as 100. -Indicates that the expression plasmid was not introduced, and + indicates that the expression plasmid was introduced. Furthermore, to indicate that HNF3G N PHF1, and DLX4 introduced the corresponding expression plasmid. It was.
  • HNF3G, PHF1, and DLX4 were examined by a reporter assay using MIN6 cells, a three-cell line derived from mouse insulinoma that expresses IPF1 endogenously.
  • a reporter assay using MIN6 cells, a three-cell line derived from mouse insulinoma that expresses IPF1 endogenously.
  • Fig. 9 the vertical axis represents the relative luciferase activity when the luciferase activity when each expression plasmid was not introduced was taken as 100. — indicates that expression plasmid was not introduced, HNF3G, PHF1, and DLX4 correspond to each.
  • CDNAs derived from human kidney, human brain and human placenta were each purchased from Invitrogen.
  • mouse MIN6 cells total RNA was prepared using the RNeasy Mini Kit (Qiagen), and cDNA derived from MIN6 cells was synthesized using the RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2.1 (Takara).
  • AMV RNA PCR Kit
  • PCR was carried out using KOD Plus DNA polymerase (Toyobo) and each gene-specific primer.
  • the reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel, and the desired PCR product was detected by ethidium bromide staining.
  • As a primer As a primer,
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35, and
  • Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37, and
  • Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, and
  • Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41, and
  • Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45, and
  • Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46
  • Figure 10 shows the human kidney (Pancreas lane), human brain (Brain lane) or human placenta.
  • Each cDNA derived from (Placenta lane) was type III, and the results of PCR using each gene-specific primer are shown (HNF3G, PHF1 and DLX4 panels, respectively).
  • the desired PCR product was detected by ethidium umide staining.
  • the numbers on the left indicate the size marker values (bp), and the arrowheads indicate the positions of the amplification products derived from each mRNA. Brain, Pancreas, and Placenta indicate that cDNA derived from each organ was type II.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of performing PCR using mouse-derived MIN6 cell-derived cDNA as type III and using gene-specific primers (lanes for HNF3G, PHF1 and DLX4, respectively).
  • the reaction solution was separated by 2% agarose gel electrophoresis, and the desired PCR product was detected by ethidium-mouth staining.
  • the number on the left indicates the size marker value (bp), and the arrowhead indicates the position of the amplification product derived from each mRNA. Since the primers for detecting each gene are designed so as to sandwich an intron, the amplified PCR product is not derived from genomic DNA. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 13 Partial oligonucleotide of IPF1 which showed a high score in the local alignment of IPF1 and HNF3G.
  • SEQ ID NO: 14 Partial IPF1 oligopeptide that showed a high score in the local alignment of IPF1 and HNF3G
  • SEQ ID NO: 15 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and HNF3G.
  • SEQ ID NO: 16 Partial HNF 3 G oligonucleotide showing a high score in the local alignment between IPF1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 17 HNF 3 G partial oligopeptide which showed a high score in the local alignment between IPF 1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 18 Partial HNF 3 G oligonucleotide showing a high score in the local alignment of IPF1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 19 partial oligonucleotide of IPF1 which showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1.
  • SEQ ID NO: 20 Partial oligonucleotide of IPF1 which showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1
  • SEQ ID NO: 21 Partial oligopeptide of PHF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1.
  • SEQ ID NO: 22 Partial oligopeptide of PHF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1.
  • SEQ ID NO: 23 Partial IPF1 oligopeptide which showed a high score in the local alignment between IPF1 and DLX4
  • SEQ ID NO: 24 Partial IPF1 oligopeptide which showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4
  • SEQ ID NO: 25 Partial oligopeptide of DLX4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4.
  • SEQ ID NO: 26 Partial oligopeptide of DLX4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4.
  • SEQ ID NO: 27 Partial IPF1 oligonucleotide which showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 28 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 29 Partial oligonucleotide of IPF1 which showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 30 Partial oligonucleotide of TCF4 showing high score in local alignment between IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 31 Partial oligopeptide of TCF4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4.
  • SEQ ID NO: 32 Partial TCF4 oligopeptide which gave a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 33 Partial IPF1 oligonucleotide which showed a high score in the local alignment between IPF1 and TMPO
  • SEQ ID NO: 34 Partial TMPO oligonucleotide which showed a high score in the local alignment between IPF1 and TMPO.
  • SEQ ID NO: 35 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 36 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 37 oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 38 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 39 Primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 Rigo nucleotides.
  • SEQ ID NO: 40 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 41 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of mouse HNF3G gene
  • SEQ ID NO: 42 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of mouse HNF3G gene
  • SEQ ID NO: 43 Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of mouse PHF1 gene.
  • SEQ ID NO: 44 Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of mouse PHF1 gene.
  • SEQ ID NO: 45 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of mouse DLX4 gene
  • SEQ ID NO: 46 Oligonucleotide for primer designed based on the nucleotide sequence of mouse DLX4 gene
  • SEQ ID NO: 47 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and HNF3G
  • SEQ ID NO: 48 Partial oligonucleotide of IPF1 showing high score in local alignment between IPF1 and HNF3G
  • SEQ ID NO: 49 Partial IPF1 oligopeptide which showed a high score in the local alignment between IPF1 and HNF3G
  • SEQ ID NO: 50 Partial HNF 3 G oligopeptide which showed a high score in the local alignment between IPF 1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 51 Partial HNF 3 G oligonucleotide showing a high score in the local alignment of IPF1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 52 Partial HNF 3 G oligonucleotide which showed a high score in the local alignment between IPF 1 and HNF 3 G
  • SEQ ID NO: 53 Partial IPF 1 oligonucleotide which showed a high score in the local alignment of IPF 1 and PHF 1
  • SEQ ID NO: 54 Partial IPF1 oligopeptide which showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1
  • SEQ ID NO: 55 Partial oligopeptide of PHF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1
  • SEQ ID NO: 56 Partial oligopeptide of PHF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and PHF1
  • SEQ ID NO: 57 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4.
  • SEQ ID NO: 58 Partial IPF1 oligopeptide which showed a high score in the local alignment between IPF1 and DLX4
  • SEQ ID NO: 59 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4.
  • SEQ ID NO: 60 Partial DLX4 oligopeptide which gave a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4
  • SEQ ID NO: 61 Partial oligopeptide of DLX4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4.
  • SEQ ID NO: 62 Partial DLX4 oligopeptide which gave a high score in the local alignment of IPF1 and DLX4
  • SEQ ID NO: 63 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 64 Partial oligonucleotide of IPF1 showing high score in local alignment between IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 65 Partial oligonucleotide of IPF1 showing high score in local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 66 High score in local alignment of IPF 1 and TCF 4 Partial oligopeptide of TCF 4 showing
  • SEQ ID NO: 67 Partial oligopeptide of TCF4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 68 Partial oligopeptide of TCF4 that showed a high score in the local alignment of IPF1 and TCF4
  • SEQ ID NO: 69 Partial oligopeptide of IPF1 that showed a high score in the local alignment between IPF1 and TMPO.
  • SEQ ID NO: 70 Partial TMPO oligopeptide which gave a high score in the local alignment between IPF1 and TMPO Industrial applicability
  • proteins (i) to (V) that bind to IPF1 are provided, and a means for regulating insulin gene transcription by inhibiting the binding of IPF1 to the protein is provided.
  • a means for regulating insulin gene transcription by inhibiting the binding of IPF1 to the protein is provided.
  • a substance that promotes insulin gene transcription can be easily screened. It can be used as an active ingredient.

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Abstract

ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合阻害工程を含むインスリン遺伝子の転写促進方法：(i)ＨＮＦ３Ｇ、(ii)ＰＨＦ１、及び(iii)ＤＬＸ４、並びにインスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：(i)ＨＮＦ３Ｇ、(ii)ＰＨＦ１、及び(iii)ＤＬＸ４。

Description

明 細書 インスリン遺伝子の転写調節方法 技術分野
本発明は、 インスリン遺伝子の転写調節方法に関する。 より具体的には、 本発 明は、 I P F 1 (インスリン 'プロモーター 'ファクター 1 ： Insul in promoter factor- 1、 以下、 本明細書で 「 I P F 1」 と略す。 ）と該 I P F 1と結合する蛋白 質との結合を阻害する工程を含むインスリン遺伝子の転写調節方法に関するもの 、あ Q 背景技術
I P F 1 は、膝臓の ]3細胞で発現している転写因子であり、インスリン、 ダル コキナーゼ（Glucokinase)、 GLUT2など糖代謝に重要な遺伝子群の発現促進因子で ある（総説： Diabetologia 44, 1203-1214, 2001； Eur. J. Endocrinol. 146, 129-141, 2002； Diabetologia 45, 309-326， 2002) 0 I P F 1の機能欠損は糖代謝の異常を 招き、 遺伝性 2型糖尿病 M0DY4 (Maturity-onset diabetes of the young) を発 症させることから （J. Clin. Invest. 104, R41-R48, 1999)、 I P F 1はインス リン分泌等の糖代謝系や勝臓の機能維持において重要な因子であると考えられて いる。
I P F 1は、抗グルコース刺激によりフォスファチジルイノシトール 3 -キづ "一 ゼ及びストレス-ァクティべ一テツドプロティンキナーゼのシグナル伝達系を介 してリン酸化を受けて核内へ移行し、 インスリン遺伝子のプロモーター活性を促 進することが報告されているが (J. Biol. Chem. 272, 20936-20944, 1997； J. Biol. Chem. 274, 1011-1016， 1999)、 これまで I P F 1をリン酸化する酵素は同定され ていない。 また、 I P F 1依存的なインスリン遺伝子プロモーター活性がへパト サイト ·二ユタリア一 ·ファクタ一一 1 α (H N F - 1 a ) により抑制されるこ とが報告されており （Endocr. Res. 27, 63-74， 2001)、 インスリン遺伝子プロモ 一ター領域への I P F 1の結合を HN F— 1 αが競合的に阻害するためであると 考えられているが、 I P F 1と H N F— 1 αが直接結合するかどうかについては 従来知られていない。
一方、 遺伝子の転写を制御する因子がいくつか知られている。 例えば、 H N F 3 G (Hepatocyte nuclear factor 3 - gamma) は Forkhead box ¾有する早写因ナ であり、肝臓特異的な遺伝子の転写制御因子であると考えられている （Genomics 20, 377-385, 1994； Genomics 39, 417-419, 1997； Mol. Cell. Biol. 18， 4245-4251: 1998)。 D L X 4 (Distal - less、homeobox 4、 BP1と呼ばれる場合もある） はホメ ォドメィンを有する転写因子であり、 β -globin遺伝子の転写を抑制することが 知られている （Mol. Cell. Biol. 22, 2505-2514, 2002)。 T C F 4 (Transcription factor 4) は helix- loop- helix構造を有する転写因子であり、 somatostatin receptor II遺伝子のイニシエータ一エレメントや、 immunoglobulin遺伝子のェ ンハンサ一エレメントに結合し、転写を活性化することが知られている （EMB0 J. 15， 6680- 6690; Science 247, 467 - 470)。 また、 P H F 1 (PHD finger protein 1) は PHD finger domainを有する蛋白質であり、転写調節因子ではないかと考えられ ているが、その機能は不明である (Genomics 48, 381-383, 1998)。 しかしながら、 これらの転写因子がィンスリン遺 子転写の調節因子であることは従来全く知ら れていない。 さらに、 TM P O (Thymopoietin) は核蛋白質であり、 核構造の維 持や細胞周期に関与している可能性が考えられているが、 その機能の詳細は不明 であり （Genomics 28， 198-205， 1995； Genome Res. 6, 361 - 370， 1996)、 この蛋 白質がインスリン遺伝子転写に関与しているとの報告はない。 発明の開示
上記のように、 I P F 1はィンスリン遺伝子転写における重要な転写促進因子 であることから、 I P F 1と結合する蛋白質を同定することは糖尿病の予防及ぴ Z又は治療のための手段を提供するために極めて重要である。 また、 I P F 1と 該蛋白質との結合を阻害することによりインスリン遺伝子の ^写を調節する手段 を提供できる可能性がある。 従って、 本発明の課題は、 I P F 1と結合する蛋白 質を提供し、 έらに I P F 1と該蛋白質との結合を阻害することによりインスリ ン遺伝子転写を調節する手段を提供することにある。
本発明者らは I P F 1と結合する蛋白質を同定してその機能を明らかにすべく、 国際公開第 W001/67299号公報に記載の予測方法に従って、 I P F 1のアミノ酸配 列をある長さのオリゴペプチドに分解し、 各オリゴペプチドのアミノ酸配列ある いはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で 検索し、選抜された蛋白質と との間でローカルァライメントを行いローカル ァライメントのスコアの高い蛋白質を I P F 1と結合可能な蛋白質であると予測 した。 その結果、 I P F 1由来のアミノ酸配列からなるオリゴぺプチドと相同性 のあるオリゴペプチドを有する数種の蛋白質が見出された。 そして、 本発明者ら は、 これらの蛋白質が I P F 1と結合すること、 及びその結合に基づいてインス リン遺伝子の転写を調節する方法を見出した。 さらに、 これらの蛋白質がインス リンプロモーターの活性抑制作用を有することを見出した。 本発明は上記の知見 を基にして完成されたものである。
すなわち、 本発明により、 I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋 白質との結合阻害工程を含むィンスリン遺伝子の転写促進方法：
) HN F 3 G (hepatocyte nuclear factor 3 - gamma)、
(ii) P H F 1 (PHD finger protein 1)
及ぴ
(iii) D L X 4 (distal-less homeobox4)
が提供される。
また、 本発明により、 I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質 との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、 I P F 1及び該蛋白質 の結合を可能にする条件下で、 被験物質と I P F 1及び Z又は該蛋白質を接触さ せ、 次いで、 I P F 1及ぴ該蛋白質の結合により生じるシグナル及び/又はマー カーを検出可能な系において、 該シグナル及び Z又はマーカーの存在若しくは不 存在又は変化を検出することにより、 該被験物質が I PF 1と該蛋白質との結合 を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
(i) HNF 3G、
(ii) PHF.l、
(iii) DLX4、
(iv) T C F 4 (transcription factor4)
及ぴ
(v) TMPO (thymopoietin)
も提供される。
さらに、 本発明により、 インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリー二 ング方法であって、 I PF 1及び以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質の 結合を可能にする条件下で、被験物質と I PF 1及び/又は該蛋白質を接触させ、 次いで、 I PF 1及ぴ該蛋白質の結合により生じるシグナル及び/又はマーカー を検出可能な系において、 該シグナル及び/又はマーカーの存在若しくは不存在 又は変化を検出することにより、 該被験物質が I PF 1と該蛋白質との結合を阻 害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
(i) HNF 3G、
(ii) PHF 1
及び
(iii) DLX4
も提供される。
また、 本発明により、 インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニン グ方法であって、 I PF 1及び以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質の結 合を可能にする条件下で、 被験物質と I PF 1及び/又は該蛋白質を接触させる ことによりインスリン遺伝子の転写が促進するか否かを決定する工程を含むスク リーニング方法： (i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1
及び
(iii) DLX4
も提供される。
別の観点からは、 本発明により、 上記のいずれかのスクリーニング方法により スクリーニングされた物質が提供される。
また、 本発明により、 インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患 の予防及ぴ Z又は治療のための医薬であって、 I P F 1と以下の群より選ばれる いずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1
及び
(iii) D LX4 ；並びに
糖尿病の予防及び Z又は治療のための医薬であって、 I P F 1と以下の群より選 ばれるいずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1
及ぴ
(iii) D LX4
が提供される。 これらの医薬の好ましい態様によれば、 上記のいずれかのスクリ 一ユング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含有する医薬が 提供される。
さらに、 インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び Z 又は治療方法であって、 I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質 との結合を阻害する工程を含む方法：
(i)HNF 3 G、 (ii) PHF 1
及び
(iii) DLX4 ；並びに
糖尿病の予防及ぴ Z又は治療方法であって、 I PF 1と以下の群より選ばれるい ずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
(i) HNF 3G、
(ii) PHF 1
及ぴ
(iii) DLX4
が提供される。 これらの方法の好ましい態様によれば、 上記のいずれかのスクリ 一ニング方法によりスクリーニングされた物質を投与する工程を含む方法が提供 される。
さらに別の観点からは、 上記のスクリーユング方法に用いる試薬キットであつ て、
(a) I P F 1及ぴ Z又は I PF 1をコードする DNA、 並びに
(b) I P F 1と結合する蛋白質及び/又は該蛋白質をコードする DN A
を含有する試薬キット
が本発明により提供される。 この発明の好ましい態様によれば、
(a) I P F 1及ぴ 又は I P F 1をコードする DNA、 並びに
(b)下記の群より選ばれる 1又は 2以上の蛋白質及ぴ Z又は該蛋白質をコードす る DNA：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及ぴ
(iii) DLX4
を含有する試薬キットが提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 IPF1 由来のァミノ酸残基からなるオリゴぺプチド PPGLSASPQPS、 EGAEPGV、及ぴ PFPGALGAと HNF3G中の相同性のあるオリゴぺプチド PGGLPASPLPS、 EGGEPGV, 及ぴ PYPGGLPAとの口一力ルァライメントの結果を示す。
第 2図は、 IPF1 由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド PPDISPYE 及び GEELLと PHF1中の相同性のあるオリゴぺプチド PPDRSPLE及び GEELLとのロー力 ルァライメントの結果を示す。
第 3図は、 IPF1由来のァミノ酸残基からなるオリゴぺプチド IKIWFQNRRMKWKK、 SPQPS、 及び RRPQEPと DLX4中の相同性のあるオリゴぺプチド VKIWFQNKRSKYKK、 SPEPS、 及ぴ RRPQAPとの口一力ルァライメントの結果を示す。
第 4図は、 IPF1由来のアミノ酸残基からなるオリゴぺプチド HHHLPAQ、PPGLSAS、 及ぴ GPAPEFSAと TCF4中の相同性のあるオリゴぺプチド HSLLPNC！、 PPGLPSS、 及ぴ GSPPSLSAとのローカルァライメントの結果を示す。
第 5図は、 IPF1 由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド FQRGPAPEFSASPP と TMP0中の相同性のあるオリゴぺプチド FQGISFPEISTRPPとの口一力ルァライメ ントの結果を示す。
第 6図は、 IPF1と HNF3G、 PHF1、 DLX4、 TCF4、 又は TMPOとの結合試験の結果を 示す。
第 7図は、 HeLa細胞系での IPF1依存的ヒ トインスリンプロモーター活性の検 出結果を示す。
第 8図は、 HeLa細胞系での HNF3G、 PHF1、 及ぴ DLX4過剰発現の IPF1依存的ヒ トインスリンプロモーター活性への影響を示す。
第 9図は、 MIN6細胞系での HNF3G、 PHF1、及ぴ DLX4過剰発現のヒ トインスリン プロモータ一活性への影響を示す。
第 1 0図は、 ヒ ト膝臓におけるヒト HNF3G、 ヒ ト PHF1、及ぴヒ ト DLX4の発現を 確認した結果 （RT- PCR法） を示す。
第 1 1図は、 MIN6細胞におけるマウス H F3G、 マウス PHF1、 及ぴマウス DLX4 の発現を確認した結果 （RT- PCR法） を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる （i) ないし （V) の蛋白質 （これらを野生型の相互作用蛋 白質と呼ぶ場合がある） は、 それぞれ配列表の配列番号 4、 6、 8、 1 0および 1 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。 本発明に用いられる IPF1 (これを野生型の IPF1と呼ぶ場合がある）は、配列表の配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列で表される蛋白質である。 よって、 当業者はこれらの記載から、 野生型 の相互作用蛋白質及ぴ野生型の 1PF1を容易に入手可能である。例えば、これらの 蛋白質の産生が認められる試料 （例えばヒト膝臓由来の細胞） から、 自体公知の 精製方法 （それぞれの蛋白質を抗原とするモノクローナル抗体を用いたァフィニ ティクロマトグラフィー法） を用いて、 回収し精製すればよい。
また、 本明細書において、 （i) ないし （V) の蛋白質には、 上記の野生型の相互 作用蛋白質のァミノ酸配列において 1個ないし数個のァミノ酸が置換、 挿入また は欠失したアミノ酸配列を含み、 ヒトを含む哺乳動物生体において上記の野生型 の相互作用蛋白質と実質的に同一のインスリン遺伝子転写調節作用を有する蛋白 質、 または実質的に同一のィンスリンプロモーター活性抑制作用を有する蛋白質 (これらの蛋白質を変異型の相互作用蛋白質と呼ぶ場合がある） も含まれる。 さらに、 本明細書において、 IPF1には、 上記の野生型の IPF1のアミノ酸配列 において 1個ないし数個のァミノ酸が置換、 挿入または欠失したアミノ酸配列を 含み、ヒトを含む哺乳動物生体において上記の野生型の IPF1と実質的に同一のィ ンスリンプロモーター活性化作用を有する蛋白質、 または実質的に同一のィンス リン遺伝子転写促進作用を有する蛋白質（これらの蛋白質を変異型の IPF1と呼ぶ 場合がある） も含まれる。
一般的には、 変異型の相互作用蛋白質は、 野生型の相互作用蛋白質のアミノ酸 配列と一定上 （例えば、 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 8 5 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上） の相同性 を有するアミノ酸配列を有していることが好ましい。 同様に、 変異型の IPF1は、 野生型の IPF1のァミノ酸配列と一定上（例えば、 70 %以上、好ましくは 80 % 以上、 より好ましくは 85%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましく は 95%以上） の相同性を有するアミノ酸配列を有していることが好ましい。 これらの変異蛋白質をコードする遺伝子の取得方法は公知であり、 例えば Mo l e c u l a r C l o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l' (S a mb r o o kら編、 コールドスプリング ·ハーバー · ラボラ トリー .プレス、 コールド ·スプリング ·ハーバー、 ニューヨーク、 1989年） 等に記載された 方法またはそれに準じる方法に り適宜入手することができ、 所望の変異蛋白質 を容易に入手することができる。 得られた変異蛋白質が、 野生型の相互作用蛋白 質と実質的に同一のインスリン遺伝子転写調節作用を有するか否かは、 本明細書 の実施例 3に具体的に示されたィンスリンプロモーター活性の抑制作用検出方法 を用いて、 当業者が容易に確認できる。 また、 得られた変異蛋白質が、 野生型の IPF1同一のインスリンプロモーター活性化作用を有するか否かは、本明細書の実 施例 3に具体的に示されたインスリンプロモーター活性測定方法を用いて、 当業 者が容易に確認できる。
本発明により提供されるインスリン遺伝子の転写促進方法は、 I PF 1と上記 の蛋白質（i)、 （ii)、 及び（iii)からなる群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質と の結合阻害工程を含むことを特徴としている。 いかなる特定の理論に拘泥するわ けではないが、 I PF 1と結合する上記の（i)、 （ii)、 又は（iii)の蛋白寶は、一 般的には I PF 1のインスリンプロモーター活性を抑制することが期待される。 従って、 この結合を阻害する物質は該蛋白質のインスリンプロモーター活性抑制 作用を阻害することにより、 インスリンプロモーターを活性化し、 インスリン遺 伝子の転写を促進することができる。 上記の結合を阻害する物質の種類は特に限 定されず、 例えば、 有機化合物、 無機化合物、 糖化合物などの低分子化合物のほ か、 抗体などの蛋白質類、 アンチセンス核酸などの核酸類、 多糖類、 脂質類など の高分子化合物であってもよい。 また、 天然物質又は非天然物質のいずれであつ てもよい。
本明細書において、 I 1とある蛋白質の結合とは I P F 1と該蛋白質が複 合体を形成する'ように、 水素結合、 疎水結合およぴ静電的相互作用などの非共有 結合により、 I P F 1と該蛋白質が相互作用することを意味する。 ここでの結合 とは、 I P F 1と該蛋白質が全体として結合すれば足りる。 例えば、 I P F 1ま たは該蛋白質を構成するアミノ酸の中に、 I P F 1と該蛋白質の結合に関与しな いアミノ酸が含まれていてもよい。
I P F 1と該蛋白質の結合は、 免疫沈降法による共沈物の確認、 ツーハイプリ ッド法、 ブルダゥン法、 ウェスタンプロット法およぴ蛍光共鳴エネルギー転移法 などの自体公知の方法またはこれらの方法を組合せることにより検出され得る。 上記の阻害作用を有する物質は、 例えば、 本発明により提供される以下の方法 によってスクリーユングすることができる。該方法は、 I P F 1と上記の（i)ない し（V)からなる群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する物質を スクリーニングするための方法であり、 I P F 1及び該蛋白質の結合を可能にす る条件下で、 被験物質と I P F 1及び/又は該蛋白質を接触させ、 次いで、 I P F 1及ぴ該蛋白質の結合により生じるシグナノレ及び Z又はマーカーを検出可能な 系において、 該シグナル及び/又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検 出することにより、 該被験物質が I P F 1と該蛋白質との結合を阻害するか否か を決定する工程を含むことを特徴としている。この方法の好ましい態様によれば、 上記の（i)、 （i i)、 及び（i i i)からなる群から選ばれるいずれか 1つの蛋白質との 結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
上記の工程において、 I P F 1及びある蛋白質の結合を可能にする条件とは、 例えば、 I P F 1及ぴ該蛋白質を細胞内において共発現させた条件である。 I P F 1及ぴ該蛋白質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを組み込んだ適当なベ クタ一を慣用の遺伝子工学的手法により、 細胞にトランスフエクションすること により、 該条件を満たすことが可能である。
さらに、 上記の工程において、 I P F 1及び該蛋白質の結合により生じるシグ ナルとは I P F 1及ぴ該蛋白質の結合により生じるものであってそのもの自体が その物理的または化学的性質により直接検出され得るものを意味し、 I P F 1及 ぴ該蛋白質の結合により生じるマーカーとは I P F 1及ぴ該蛋白質の結合により 生じるものであってそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に 検出され得るものを意味する。 シグナルとしては、 ルシフェラーゼ、 放射性同位 体等、 マーカーとしては、 レポーター遺伝子、 例えばクロラムフエニコールァセ チルトランスフェラーゼ遺伝子等、 または検出のェピトープタグ、 例えば 6 X H i s - t a g等が例示される。 これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業 者に周知のものである。 、
また、 上記の工程において I P F 1と該蛋白質の結合を可能にする条件下にお いて、 それらと該披験物質を共存させた場合に、 該披験物質を共存させない場合 と比較して、 I P F 1と該蛋白質の結合により生じるシグナル及びノまたはマー カーが低減または消失した場合に、 該披験物質が I P F 1と該蛋白質との結合を 阻害すると決定することができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質の種類は特に限定されず、 任 意の化合物を被験物質として使用することができる。 被験物質は有機化合物、 無 機化合物、 糖化合物などの低分子化合物のほか、 蛋白質、 核酸、 多糖類、 脂質類 などの高分子化合物であってもよい。 また、 天然物質又は非天然物質のいずれで あってもよい。 スクリーニングに供されるライブラリ一としては、 例えば、 低分 子化合物ライブラリー、 ファージディスプレーライブラリー、 コンビナトリアル ライブラリーなどを挙げることができるが、 これらに限定されることはない。 また、 上記の方法において、 I P F 1及び該蛋白質の結合により生じるシグナ ル及ぴ Z又はマーカーを検出可能な系において該シグナル及ぴノ又はマーカーの 存在若しくは不存在又は変化を検出する工程はィンスリン遺伝子の転写が促進す るか否かを決定する工程として行われるものでもよく、 その結果、 上記の方法に 従ってインスリン遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができ る。 また、本発明により上記のスクリーニングを行うためのキットが提供される力 該キットは（a) I P F 1及ぴ 又は I P F 1をコードする D N A、 並びに（b) I P F 1と相互作用する蛋白質及び Z又は該蛋白質をコードする D NAを含有するこ とを特徴としている。 キットの要素は、 蛋白質として提供されてもよく、 あるい は該蛋白質を発現可能な遺伝子、 好ましくは該遺伝子を含む組換えベクターなど の形態で提供されてもよい。
本発明の方法によりスクリ一二ングされた物質を有効成分として含む医薬は、 インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び/又は治療の ための医薬として、 ヒトを含む哺乳類動物に投与することができる。 インスリン 遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患としては、 例えば、 糖尿病 （糖尿病 の合併症を含む） を挙げることができる。 本発明の医薬の投与形態は特に制限さ れず、 経口的又は非経口的に投与することができる。 本発明の医薬としては、 有 効成分である物質をそのまま用いてもよいが、 有効成分である物質とともに薬理 学的及び製剤学的に許容される製剤用添加物とを含む医薬組成物を調製して投与 することが望ましい。
例えば、 蛋白質を有効成分として含む本発明の医薬は、 通常の蛋白質製剤の調 製方法に従って製剤化することができ、 核酸を有効成分として含む本発明の医薬 も、 当業界で利用可能な手段で製剤化して用いることができる。 本明細書におい て 「核酸」 の用語は DNA又は RNAを包含する。 核酸を含む本発明の医薬は、 例え ば有効成分である核酸を含む組換えベクターの形態で用いることができる。 上記 の組換えベクターには、 有効成分である該核酸から生体内で効率的に遺伝子産物 を発現されるように、 遺伝子発現のために必要な、 あるいは遺伝子発現を促進す る各種の配列を適宜の順番で組み込んでおいてもよい。 本発明の医薬がアンチセ ンス核酸を含む場合、 該核酸は DNA又は R Aのいずれでもよく、 全長も特に制限 されることはない。 アンチセンス核酸は、 例えば、 相補的結合が可能になるよう に 10塩基以上、 好ましくは 15塩基以上のオリゴヌクレオチドであってもよい。 また、 本発明の医薬の有効成分として上記の蛋白質に結合可能な抗体、 好ましく はモノクローナル抗体を用いる場合には、 抗体は通常の方法で製造することがで き、 上記の蛋白質に特異的に結合可能なモノクローナル抗体も当業者に汎用の方 法で製造することができる。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物としては、 例えば、 賦形剤、 崩壊剤ないし崩壌補助剤、 結合剤、 滑沢剤、 コーティング剤、 色素、 希釈剤、 基 剤、 溶解剤ないし溶解補助剤、 等張化剤、 pH調節剤、 安定化剤、 噴射剤、 及び粘 着剤等を用いることができる。 経口投与に適する医薬組成物の例としては、 例え ば、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 細粒剤、 顆粒剤、 液剤、 又はシロップ剤等を挙げ ることができる。 非経口投与に適する医薬組成物としては、 例えば、 注射剤、 点 滴剤、 坐剤、 吸入剤、 経皮吸収剤、 点眼剤、 点耳剤、 軟膏剤、 クリーム剤、 又は 貼付剤等を挙げることができる。 本発明の医薬の投与量は特に限定されず、 有効 成分である物質の種類、 治療又は予防の目的、 患者の年齢や症状、 投与経路など の種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能であるが、一般的には、 成人 1日あたり 0. 00 1mg〜1000 m g程度の投与量範囲から選択するこ とができる。
また、 本発明は、 インスリン遺伝子の遺伝子産物の低減に起因する疾患の予防 及び/又は治療方法を提供する。 該方法は、 I PF 1と該 I PF 1と結合する蛋 白質 （好ましくは、 HNF 3 G、 PHF 1または DLX4) との結合を阻害する ことを特徴とする。 インスリン遺伝子の遺伝子産物の低減に起因する疾患とは、 例えば、 糖尿病を挙げることができる。 上記の医薬を用いて、 該方法を実施する ことが可能である。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはなレ、。
例 1 ： I PF 1と相互作用する蛋白質の抽出
IPF1 と相互作用する蛋白質を、 国際公開第 W0 1/67299号公報に記載の予測方 法に従って予測した。 IPF1のァミノ酸配列を適宜の長さのオリゴぺプチドに分解 し、 各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ 酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質と IPF1との間 でローカルァライメントを行い、 ローカルァライメントのスコアの高いものを
IPF1 と相互作用すると予測した。 ローカルァライメントのスコアは国際公開第 W001/67299号公報に記載の方法と同様に 25. 0以上とした。
予測の結果、 IPF1由来のァミノ酸残基からなる配列番号 47に記載のオリゴぺ プチド、 配列番号 48に記載のオリゴぺプチド、 及ぴ配列番号 49に記載のォリゴ ぺプチドと相同性のある配列番号 50に記載のォリゴぺプチド、 配列番号 51に記 載のォリゴぺプチド、及ぴ配列番号 52に記載のォリゴぺプチドが HNF3Gのァミノ 酸配列中に存在することが分かった。第 1図に IPF1と HNF3Gとのローカルァライ メントの結果を示す。 また、 IPF1由来のアミノ酸残基からなる配列番号 53に記 載のオリゴぺプチド及ぴ配列番号 54 に記載のオリゴぺプチドと相同性のある配 列番号 55に記載のオリゴぺプチド、配列番号 56に記載のオリゴぺプチドが PHF1 のアミノ酸配列中に存在しており （第 2図）、 IPF1 由来のアミノ酸残基からなる 配列番号 57に記載のォリゴぺプチド、 配列番号 58に記载のォリゴぺプチド、 及 ぴ配列番号 59に記載のオリゴぺプチドと相同性のある配列番号 60に記載のオリ ゴぺプチド、 配列番号 61に記載のオリゴぺプチド、 及び配列番号 62に記載のォ リゴペプチドが DLX4のアミノ酸配列中に存在しており （第 3図）、 IPF1由来のァ ミノ酸残基からなる配列番号 63に記載のォリゴぺプチド、 配列番号 64に記載の オリゴぺプチド、及び配列番号 65に記載のオリゴぺプチドと相同性のある配列番 号 66に記載のオリゴぺプチド、 配列番号 67に記載のオリゴぺプチド、 及び配列 番号 68に記載のオリゴぺプチドが TCF4のアミノ酸配列中に存在しており （第 4 図）、 IPF1由来のアミノ酸残基からなる配列番号 69に記載のオリゴぺプチドと相 同性のある配列番号 70に記載のォリゴぺプチドが TMP0のァミノ酸配列中に存在 することが分かった （第 5図）。
例 2 : ヒ ト I P F 1との結合試験 ヒ ト IPF1 とヒ ト H F3G、 ヒ ト PHF1、 ヒ ト DLX4、 ヒ ト TCF4、 Xはヒ ト TMPOと結 合するか否かを GST - pull down法により検討した。
<材料 >
(1)各 cDNAのクローニング
ヒ ト IPF1 cDNAはヒ ト肝臓由来 cDNA (Clontech社） から、 ヒ ト HNF3G cDNAはヒ ト肝臓由来 cDNA (Clontech社） から、 ヒ ト PHF1 cDNA、 ヒ ト TCF4 cDNA及ぴヒ ト TMPO cDNAはヒト脳由来 cDNA (Clontech社） から、 ヒ ト DLX4 cDNAはヒト胎盤由 来 cDNA (Clontech社） からそれぞれ PCRによりクローユングした。
(2)各種発現プラスミド 、
ヒ ト IPF1 cDNA を GST 融合蛋白質発現用ベクターである pGEX - 4T (Amersham biosciences社） に組み込み、 N末 GST融合 IPF1発現プラスミド、 pGEX- 4T/IPF1 を構築した。 また、 ヒト HNF3G、 ヒト PHF1、 ヒト DLX4、 ヒト TCF4及ぴヒ ト TMP0 の各 cDNAを in vitro蛋白質合成及び動物細胞用発現べクターである pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） に組み込み、 各発現プラスミドを構築した （pcDNA HA- HNF3G、 pcDNA- HA- PHF1、 pcDNA- HA- DLX4、 pcDNA- HA- TCF4及び pcDNA- HA- TMP0)。 なお、 そ の際、 各蛋白質が N末 HAタグ付加型蛋白質として発現されるよう、 HAタグコー ド配列を各 cDNAの 5'末に挿入した。陰性コントロールとして用いる LacZの発現 プラスミドは、 pCruzHA - LacZ (N末 HAタグ付加型 LacZ発現プラスミド） (Santa cruz 社） を用いた。
(3) N末 GST融合 IPF1 (GST-IPF1) の精製
GST-IPF1 は、 pGEX- 4T/IPF1 を保持する大腸菌にて誘導発現後、 Glutathione sepharose 4B (Amersham biosciences社) を用レヽて 製した。
ぐ方法 >
(1) GST-pull down法による結合試験
ヒ ト HNF3G、 ヒ ト PHF1、 ヒ ト DLX4、 ヒ ト TCF4、 ヒ ト TMP0及ぴ LacZは、 TNT quick coupled transcription/ translation systems (Promega个土) ¾r使用して in vitro にて35 S-メチォニン標識した蛋白質として合成した。 20 μ ΐの合成反応液と 5 μ β の GST- IPF1又は GSTを、 500 At 1の Binding buffer (40 mM HEPES, pH7. 5/ 50 mM KC1/ 5 mM MgCl2/ 0. 2 mM EDTA/ 1 mM DTT/ 0. 5% NP-40) 中にて、氷上、 1 時間静 置した。 その後、 20 μ 1 (bed volume) の Glutathione sepharose 4Bを添カ卩し、 4° C にてー晚、 転倒混和した後、遠心によりビーズを回収した。 ビーズを 500 ju l の Binding bufferで 4回洗浄した後、 20 μ 1の 2 X SDS sample buffer (125mM Tris-HCl, pH6. 8/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0. 01% Bromophenol blue)を加え、 3分間煮沸後、 上清を 5- 20% SDS- PAGEにより分離した。 その後、 BAS2000 (Fuji film社） によ り結合した蛋白質を検出した。
<結果 > 、
IPF1と H F3G、 PHF1、 DLX4、 TCF4、及ぴ TMP0との結合が認められた（第 6図）。 なお、 LacZと IPF1との結合は認められなかったことから、検出された IPF1 と各 蛋白質との結合は非特異的なものではないと言える（第 6図）。第 6図中、 GST (GST のレーン） あるいは GST- IPF1 (GST- IPF1のレーン） と in vitro転写 Z翻訳系に て 3¾ -メチォニン標識蛋白質として合成した各蛋白質（HNF3G、 PHF1、 DLX4、 TCF4、 TMP0及び LacZ) (inputのレーン） を混合後、 グルタチオンセファロースにより GSTあるいは GST- IPF1を回収し、 SDS- PAGEにより分離した。 その後、結合蛋白質 をオートラジオグラフィ一により検出した。 矢頭は、 in vitro系にて合成した各 蛋白質 （HNF3G、 PHF1、 DLX4、 TCF4、' TMP0及ぴ LacZ) の位置を示す。
例 3 ： ヒ ト HNF3G、 ヒト PHF1、 ヒト DLX4によるヒトインスリン遺伝子プロモータ 一活性の抑制
IPF1との結合が認められたヒト HNF3G、 ヒト PHF1、 ヒト DLX4、 ヒト TCF4、 及 ぴヒ ト TMP0のうち、 ヒ ト H F3G、 ヒ ト PHF1、 ヒ ト DLX4を用いてヒ トインスリン 遺伝子プロモータ一活性の抑制作用をレポーターアツセィ系を用いて検討した。
<材料 >
(1)ヒトインスリン遺伝子プロモーター領域のクローユング及ぴルシフェラーゼ レポータープラスミ ドの構築
ヒ トインスリン遺伝子プロモーター領域 （- 392/+237、 転写開始点を +1 とする） は、 Human genomic DNA (Clontech社） から PCRによりクローニングした。 クロ 一ユングしたプロモーター領域を/レシフェラーゼレポーターべクターである pGL3 - Basic (Promega 社） に組み込み、 ヒ トインスリン遺伝子プロモーター活性 測定用レポータープラスミ ドである pInsPro (- 392/+237) - GL3を構築した。
(2)各種発現プラスミ ド
ヒ ト IPF1の cDNAを PcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） に組み込み IPF1発現プラス ミ ドを構築した （pcDNA- FLAG- IPF1)。 その際、 N末 FLAGタグ付加型蛋白質として 発現されるよう、 FLAGタグコード配列を IPF1 cDNAの 5，末に揷入した。ヒ ト HNF3G、 ヒト PHF1、及ぴヒ ト DLX4の各発現プラスミ ドは、 pcDNA- HA - HNF3G、pcDNA- HA - PHF1、 及ぴ pcDNA-HA-DLX4をそれぞれ使用した。
ぐ方法 >
(1)トランスフエクション及びレポーターアツセィ
前日に 2xl05個の HeLa細胞を 6 well plate に散種し、 ー晚培養後、 FuGENE6 (Roche Diagnostics社）を用いてトランスフエクションを行った。プラスミ ドは、 200 ngの pInsPro (- 392Λ237) - GL3、 400 ngの pcDNA- FLAG- IPF1、 l ^ gの各発現 プラスミ ド（pcDNA- HA- HNF3G、 pcDNA- HA- PHF1、及び pcDNA- HA- DLX4)及び internal control として 0. 5 ngの pRL- SV40 (Promega社） をそれぞれ用いた。 また、 DNA の総量は 1. 6 gとなるように pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） にて調整した。 48時 間：! ¾·¾後、 Dual—: Luciferase Reporter Assay System (Promega社) を用レヽて/レシ フェラーゼ活性を測定した。なお、 測定値は、 Renilla ルシフェラーゼ活性により 捕正した。マウスインスリノーマ由来 /3細胞株である MIN6細胞を用レヽる場合は、 前日に、 5χ105個の MIN6細胞を 6 well plateに散種し、ー晚培養後、FuGENE6 (Roche Diagnostics 社） を用いてトランスフエクシヨンを行った。プラスミ ドは、 200 ng の pInsPro (- 392/+237)- GL3、 1 μ g の各発現プラスミ ド （ pcDNA- HA- HNF3G、 pcDNA - HA- PHF1、 及び pcDNA - HA- DLX4) 及ぴ internal control として 5 ng の pRL- SV40をそれぞれ用いた。また、 DNAの総量は 1. 2 μ gとなるように pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社）にて調整した。 48時間培養後、上記と同様の方法にてルシフエラ ーゼ活性を測定した。 '
<結果 >
まず、 IPF1を発現していない HeLa細胞でのルシフェラーゼレポーター系を用 いた IPF1依存的なヒトインスリンプロモーター活性検出系の構築を行った。その 結果、第 7図に示すように、 IPF1発現プラスミド量依存的なヒトインスリンプロ モーター活性の増大が認められた。 第 7図中、 縦軸は pcDNA- FLAG- IPF1未導入の 時のルシフェラーゼ活性を 1とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を、 横軸は 導入した pcDNA- FLAG- IPF1量を表す。 そこで、 この系を用いて各蛋白質の影響に ついて検討した。 その結果、 HNF3G、 PHF1及び DLX4の過剰発現により IPF1依存 的なヒトインスリンプロモーター活性がそれぞれ約 45°ん約 25° /。及び約 60%抑制さ れることが明らかとなった（第 8図）。第 8図中、縦軸は pcDNA- FLAG - IPF1のみ導 入時のルシフェラーゼ活性を 100とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を表す。 —は発現プラスミド未導入、 +は発現プラスミドを導入したことを示す。 また、 HNF3GN PHF1、 及び DLX4はそれぞれ対応する発現プラスミ ドを導入し.たことを示 す。
次に、 IPF1を内在的に発現しているマウスインスリノーマ由来 ;3細胞株である MIN6細胞を用いて、 HNF3G、 PHF1、 及び DLX4のヒトインスリンプロモーター活性 への影響をレポーターァッセィにより検討した。その結果、 H F3G、 PHF1及び DLX4 の過剰発現によりヒ トインスリンプロモーター活 1"生が約 60%、約 30%及ぴ約 45%抑 制されることが明らかとなった （第 9図）。第 9図中、縦軸は各発現プラスミド未 導入時のルシフェラーゼ活性を 100とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を表 す。 —は発現プラスミ ド未導入、 HNF3G、 PHF1、 及ぴ DLX4はそれぞれ対応する発 現プラスミドを導入したことを示す。 以上の結果より、 HNF3G、 PHF1、 及ぴ DLX4 1S HeLa細胞系での IPF1依存的なヒトインスリン遺伝子プロモーター活性及ぴ MIN6細胞系でのヒ トインスリンプロモーター活性の両活性を抑制することが明 らかとなつた。
例 4 ： HNF3G, PHF1、 及ぴ DLX4のヒト脖臓及ぴ MIN6細胞での発現確認 (RT-PCR 法）
インスリン分泌組織であるヒト脖臓及びマウスィンスリノーマ由来 ]3細胞株で ある MIN6細胞において HNF3G、 PHF1、 及び DLX4が発現しているか否かについて を RT- PCR法により検討した。
ぐ方法 >
(1) RT-PCR法による各 mR Aの確認
ヒト脖臓、 ヒト脳及ぴヒト胎盤由来 cDNAはそれぞれ Invitrogen社から購入し た。 マウス MIN6細胞の場合は、 RNeasy Mini Kit (Qiagen社） を用いて total RNA を調製後、 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2. 1 (Takara社） を用いて MIN6細胞由来 cDNA を合成した。 各 cDNAを铸型として、 KOD Plus DNA polymerase (Toyobo社） 及ぴ 各遺伝子特異的プライマーを用いて PCRを実施した。反応液を 2%ァガロースゲル で電気泳動し、 ェチジゥムプロマイド染色により目的の PCR産物を検出した。 プライマーとしては、
ヒ ト H F3Gの場合は、
配列番号 35に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 及ぴ
配列番号 36に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
ヒ ト PHF1の場合は
配列番号 37に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 及ぴ
配列番号 38に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
ヒト DLX4の場合は
配列番号 39に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 及び
配列番号 40に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ使用した。
また、 マウス HNF3Gの場合には
配列番号 41に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 及ぴ
配列番号 2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
マウス PHF1の場合には 配列番号 43に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 友ぴ 配列番号 44に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
マウス DLX4の場合には
配列番号 45に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、 及ぴ
配列番号 46に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ使用した。
ぐ結果 >
HNF3G, PHF1、 及び DLX4のインスリン分泌組織であるヒト脖臓における発現を RT-PCR法により検討した結果、 各遺伝子の mRNAの存在が確認された。 第 1 0図 は、 ヒト陴臓 （Pancreas のレーン）、 ヒ ト脳 （Brain のレーン） 又はヒト胎盤
(Placentaのレーン） 由来の各 cDNAを铸型とし、 各遺伝子特異的プライマーを 用いて PCRを実施した結果を示しており （それぞれ HNF3G、 PHF1及び DLX4のパネ ル)。 反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動により分離後、 ェチジゥムブ口マイド 染色により目的の PCR産物を検出した。左の数字はサイズマーカーの値（bp)を、 矢頭は各 mRNA由来の増幅産物の位置を表す。また、 Brain、Pancreas及ぴ Placenta はそれぞれ各臓器由来の cDNAを鎳型としたことを示す。
また、 インスリンは脖臓に存在する β細胞により分泌されることから、 マウス インスリノーマ由来の β細胞株である ΜΙΝ6 細胞での各マウス遺伝子の発現を RT-PCRにより検討した結果、 各マウス遺伝子の mRNAの存在が確認された。 第 1 1図は、 マウス MIN6細胞由来 cDNAを铸型とし、 各遺伝子特異的プライマー （そ れぞれ HNF3G、 PHF1及び DLX4のレーン）を用いて PCRを実施した結果を示した図 である。 反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動により分離後、 ェチジゥムブ口マイ ド染色により目的の PCR産物を検出した。 左の数字はサイズマーカーの値 （bp) を、矢頭は各 mRNA由来の増幅産物の位置を表す。 なお、各遺伝子検出用のプライ マーは、 イントロンをはさむように設計してあるため、 増幅された PCR産物はゲ ノミック DNA由来のものではない。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 3 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 14 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 1 5 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 16 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴぺプチド。
配列番号 1 7 ： I P F 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴペプチド。
配列番号 1 8 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴぺプチド。
配列番号 1 9 ： I PF 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて.高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 20 ： I PF 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 21 ： I P F 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した P H F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 22 ： I PF 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した P H F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 23 ： I PF 1と DLX4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 24 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 25 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した D L X 4の部分ォリゴぺプチド。 配列番号 26 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメント おいて高いスコア を示した D L X 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 27 ： I P F 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 28 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 29 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 30 ： I P F 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した TCF 4の部分オリゴぺプチド。
配列番号 31 ： I PF 1と TCF4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した T C F 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 32 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した TCF 4の部分オリゴペプチド。
配列番号 33 ： I PF 1と TMPOのローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 34 ： I PF 1と TMPOのローカルァライメントにおいて高いスコア を示した TMPOの部分オリゴぺプチド。
配列番号 35 ：配列番号 3に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 36 ：配列番号 3に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 37 ：配列番号 5に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 38 ：配列番号 5に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 39 ：配列番号 7に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 40 ：配列番号 7に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用ォ リゴヌクレオチド。
配列番号 41 ：マウス HNF 3 G遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマ 一用オリゴヌクレオチド。
配列番号 42 ：マウス HNF 3 G遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマ 一用オリゴヌクレオチド。
配列番号 43 ：マウス PHF 1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー 用オリゴヌクレオチド。 、
配列番号 44 ：マウス PHF 1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー 用オリゴヌクレオチド。
配列番号 45 ：マウス DLX 4遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー 用オリゴヌクレオチド。
配列番号 46 ：マウス DLX 4遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー 用オリゴヌクレオチド。
配列番号 47 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 48 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 49 ： I P F 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 50 ： I P F 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴペプチド。
配列番号 51 ： I PF 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴぺプチド。
配列番号 52 ： I P F 1と HNF 3 Gのローカルァライメントにおいて高いスコ ァを示した HNF 3 Gの部分オリゴぺプチド。 配列番号 53 ： I P F 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 54 ： I P F 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 55 ： I P F 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した P H F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 56 ： I PF 1と PHF 1のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した P H F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 57 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 58 ： I PF 1と DLX4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 59 ： I P F 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 60 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した DLX 4の部分オリゴペプチド。
配列番号 6 1 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した D L X 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 62 ： I PF 1と DLX 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した DLX 4の部分オリゴペプチド。
配列番号 63 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 64 ： I P F 1と TCF4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 65 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分オリゴぺプチド。
配列番号 66 ： I P F 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した T C F 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 67 ： I PF 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した T C F 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 68 ： I P F 1と TCF 4のローカルァライメントにおいて高いスコア を示した T C F 4の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 69 ： I PF 1と TMPOのローカルァライメントにおいて高いスコア を示した I P F 1の部分ォリゴぺプチド。
配列番号 70 ： I PF 1と TMPOのローカルァライメントにおいて高いスコア を示した TMPOの部分オリゴペプチド。 産業上の利用可能性
本発明により、 I PF 1と結合する蛋白質（i)ないし (V)が提供され、 I PF 1 と該蛋白質との結合を阻害することによりインスリン遺伝子転写を調節する手段 が提供された。 この手段を用いた本発明のスクリーニング方法により.、 例えば、 インスリン遺伝子転写を促進する物質を容易にスクリーニングすることができ、 該物質は、 糖尿病などの疾患の予防及び Z又は治療のための医薬の有効成分とし て用いることできる。

Claims

請求 の 範 囲
1. I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質との結合阻害工程を 含むィンスリン遺伝子の転写促進方法：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及ぴ
(iii) D LX4。
2. I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する 物質のスクリーユング方法であって、 I P F 1及ぴ該蛋白質の結合を可能にする 条件下で、 被験物質と I P F 1及び Z又は該蛋白質を接触させ、 次いで、 I P F 1及ぴ該蛋白質の結合により生じるシグナル及び/又はマーカーを検出可能な系 において、 該シグナル及び/又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出 することにより、 該被験物質が I P F 1と該蛋白質との結合を阻害するか否かを 決定する工程を含むスクリーニング方法：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
(iii) D LX4、
(iv) T C F 4、
及び
(v) TMPO。
3. インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、 I P F 1及ぴ以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質の結合を可能にする条件 下で、 被験物質と I P F 1及び/又は該蛋白質を接触させ、 次いで、 I P F 1及 ぴ該蛋白質の結合により生じるシグナル及び/又はマーカーを検出可能な系にお いて、 該シグナル及び/又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出する ことにより、 該被験物質が I P F 1と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定 する工程を含むスクリーニング方法：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及ぴ
(iii) DLX4。
4. インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、 I P F 1及び以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質の結合を可能にする条件 下で、 被験物質と I卩 F 1及ぴ Z又は該蛋白質を接触させることによりインスリ ン遺伝子の転写が促進するか否かを決定する工程を含む方法：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及ぴ
(iii) D LX4。
5. 請求の範囲第 2項ないし第 4項のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法 によりスクリーニングされた物質。
6. インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び Z又は治 療のための医薬であって、 I P F 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白 質との結合を阻害する医薬：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及び
(iii) D LX4。
7. 糖尿病の予防及び/又は治療のための医薬であって、 I P F 1と以下の群よ り選ばれるいずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及ぴ (iii)DLX4。
8. 請求の範囲第 5項に記載の物質を有効成分として含有する請求の範囲第 6項 又は第 7項に記載の医薬。
9. インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び/又は治 療方法であって、 I PF 1と以下の群より選ばれるいずれか 1つの蛋白質との結 合を阻害する工程を含む方法：
(i) HNF 3 G、
(ii) PHF 1、
及び
(iii) DLX4。
10. 糖尿病の予防及び/又は治療方法であって、 I PF 1と以下の群より選ば れるいずれか 1つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
(i) HNF 3G、
(ii) PHF 1 ,
及ぴ
(iii) DLX4。
1 1. 請求の範囲第 5項に記載の物質の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与す る工程を含む請求の範囲第 9項または第 10項に記載の方法。
12. 請求の範囲第 1項ないし第 4項に記載のスクリーニング方法に用いる試薬 キットであって、
(a) I P F 1及び/又は I P F 1をコードする DNA、 並びに
(b)下記の群より選ばれる 1又は 2以上の蛋白質及び Z又は該蛋白質をコードす る DNA：
(i) HNF 3G、
(ii) PHF 1、
及ぴ
(iii) DLX4 を含有する試薬キット
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