JP2009508492A - インスリンプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

組成物及び方法はインスリンプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニングのために提供される。ヒトインスリンプロモーターの制御下でグリーン蛍光タンパク質を発現するベクターは、インスリンプロモーターがグルコース応答様式で発現されるマウス及びヒト細胞に導入される。上記細胞はその後インスリンプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングするために使用される。

Description

発明の分野
本発明は薬物スクリーニング、特に、インスリン生成を調節する物質のスクリーニングの分野に関する。
関連出願へのクロスリファレンス
この出願は、本明細書中に援用する、２００５年９月１５日出願の米国仮特許出願番号６０／７１７，６４７号からの優先権を主張する。
政府権利の申告
本発明は、少なくとも部分的に、米国政府からの交付金により支持された（ＮＩＨからの交付金番号Ｒ０１ ＤＫ６８７５４）。米国政府は本発明に対してある権利を有しうる。

発明の背景
体内のどの他の細胞によっても共有されない、膵臓ベータ細胞の基本的な特性はインスリン遺伝子の高レベルの発現である。インスリンプロモーター活性に影響するシス及びトランスエレメントは何年間も研究されているが、私たちの理解が限られていることは明らかである。特に、インスリン発現のベータ細胞特異性を決定するプロモーターエレメントは十分に理解されているが、一部にはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルがないために、インスリンプロモーターへ伝達する経路は広範囲には調べられていない。インスリン生成を調節する、すなわち、インスリン生成を増大させる又は減少させる物質、例えば、化学化合物を同定するために有効なスクリーニング方法について要求がある。

発明の要約
本発明は哺乳類細胞においてインスリン発現を調節する化合物のスクリーニングのための組成物及び方法を提供する。
本発明の１の態様にしたがって、グリーン蛍光タンパク質ポリヌクレオチド配列の如き、マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供され、ここで、不安定化強化グリーン蛍光タンパク質はＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞及びヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞から成る群から選ばれる細胞への上記ベクターの導入に際して発現される。上記ベクターは、例えば、非限定的に、ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥの如きレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターでありうる、及びここで、不安定化強化グリーン蛍光タンパク質は、実施例１中に詳細に示されるように、ヒトインスリンプロモーターの制御下で発現される。

上記ベクターを含む細胞（すなわち、上記ベクターが感染又は他の標準の方法により導入される細胞）もまた提供される。上記細胞は膵臓ベータ細胞を含む。本発明に係るベクターを含む代表的な細胞は、非限定的に、ＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞の如きマウス細胞、及びＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞の如きヒト細胞を含む。

インスリン遺伝子発現を調節する化合物を同定する方法もまた提供される。上記方法は：（ａ）例えば、強化グリーン蛍光タンパク質ポリヌクレオチドの如き、マーカーポリペプチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を提供することであって、上記マーカーポリペプチドは上記細胞内で基準値で発現されること；（ｂ）上記細胞を候補化合物と接触させること；及び（ｃ）上記細胞を上記候補化合物と接触させた結果としての、基準値に比較した細胞内のマーカーポリペプチドの発現における調節を検出することを含む。上記スクリーニング方法はさらに、例えば、上記候補化合物による強化グリーン蛍光タンパク質の発現の調節が用量応答性であるかどうかを決定すること；上記候補化合物は哺乳類インスリン生成細胞によるインスリン発現を調節するかどうかを決定すること；及び／又はＲＴ−ＰＣＲにより上記候補化合物は哺乳類インスリン生成細胞によるインスリン発現を調節するかどうかを決定することを含みうる。上記方法において使用されるベクター及び細胞は上記に示されるものと同様である。

本発明の上記及び他の局面は以下の詳細な説明、添付図面、及び請求項からより明らかになるであろう。

別段の定めなき限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は本発明が関係する分野における当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に示されるものと同様の又は等価な方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用されうるが、好適な方法及び材料は以下に示される。

発明の詳細な説明
定義及び方法
以下の定義及び方法は本発明をよりよく定義するために及び本発明の実施において当業者を導くために提供される。別段の定めなき限り、用語は関連分野における当業者による慣用の使用にしたがって理解されるべきである。分子生物学における通常の用語の定義はまたＲｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；及びＬｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４中に見られうる。

「ポリヌクレオチド」。 用語「ポリヌクレオチド」は、非限定的に、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含むヌクレオチド単量体の重合体をいう。ポリヌクレオチドは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プライマー、プローブ、ベクター等を含むＤＮＡ及びＲＮＡ分子を含み、それらの一重及び二重鎖形を含む。本発明にしたがうポリヌクレオチドは標識化、固体支持へのカップリング等による周知の方法により化学的に改変されうる。

「細胞」。 本明細書中で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物」は相互変換可能に使用され、及び全ての上記名称は後代を含む。したがって、用語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は初代被験細胞及び移転の回数に関わらず、それに由来する培養物を含む。全ての後代は意図的な又は偶然の変異のために、ＤＮＡ内容量において正確に同一である必要はないこともまた理解される。もともと形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体後代は含まれる。

「哺乳類」。 本明細書中で使用されるとき、用語「哺乳類」は、非限定的に、マウス（例えば、マウス又はラット）、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ等を含む、いかなる哺乳類の種をも含む。

「単離された」。 「単離された」ポリヌクレオチド（単数又は複数）によりその天然環境から除去されたポリヌクレオチド（すなわち、核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は異種のホスト細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は本発明に係るＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写物を含む。本発明にしたがう単離された核酸分子は合成的に生成された分子をさらに含む。

「使用可能につなげられる（作用可能な状態で連結された）」。 核酸は、それがもう一つの核酸配列と機能的な関係に置かれたとき「使用可能につなげられる」。例えば、前配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、上記ポリペプチドについてのＤＮＡに使用可能につなげられる；プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合、上記コード配列に使用可能につなげられる；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置される場合、コード配列に使用可能につなげられる。一般的に、「使用可能につなげられる」はつなげられるＤＮＡ配列は連続している、及び分泌リーダーの場合には、連続している及びリーディング相内であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。結合は便利な制限酵素部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが慣例の実施にしたがって使用される。

「組換え」。 組換え核酸は、例えば、化学合成により又は遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作により、組換えられなければ２の分離したセグメントである配列の人工的な組み合わせにより作出される。

「調節する」。 本明細書中で使用されるとき、用語「調節する」は、非限定的に、発現の値を増大させる又は減少させること、発現のタイミング、発現の細胞、組織、器官又は他の特異性又は遺伝子発現の他の局面を含む、いかなる検出可能な様式でも発現可能なポリヌクレオチド配列の発現を検出可能に変えることを意味する。遺伝子発現の調節は、非限定的に、ｍＲＮＡ転写の、そのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の、コードされるタンパク質に対応する酵素活性等の値における変化を検出することを含む、いかなる既知の手段によっても検出されうる。

組換え体又はポリヌクレオチドの調製：ベクター、形質転換、ホスト細胞。 本発明にしたがう天然又は合成核酸は、ホスト細胞に導入可能な及び複製可能な、組換えポリヌクレオチド構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組み込まれうる。例えば、そのような構築物は複製システム及びあるホスト細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳をすることができる配列を含むベクターでありうる。
本発明の実施のために、ベクター及びホスト細胞を調製する及び使用するための慣用の組成物及び方法が使用される。

組換えベクターの如き外来性ポリヌクレオチドが導入された細胞、組織、器官又は生物は「形質転換された」、「トランスフェクトされた」又は「トランスジェニックである」と考えられる。「トランスジェニック」又は「形質転換された」細胞又は生物はまた上記細胞又は生物の後代（子孫）をも含む。

非限定的に、マウス及びヒト細胞を含む、哺乳類又は他の真核及び原核細胞での使用のために好適なベクターの数は熟練した実施者に周知である。典型的に、哺乳類発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下の１以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列及びドミナント選択可能マーカーを含む。上記哺乳類発現ベクターはまたプロモーター調節領域（例えば、誘発可能か又は構成的か、環境的に又は発達的に調節されるか又は細胞又は組織特異的発現かを制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写停止部位、及び／又はポリアデニレーションシグナルをも含みうる。上記ベクターは使用に因り、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクターでありうる、及び複製可能又は複製不能でありうる。ウイルスベクターが複製不能である場合、ウイルス増殖は一般的に補完的なホスト細胞においてのみ起こるであろう。

組換え構築物は感染、導入、トランスフェクション、トランスヴェクション、エレクトロポーレーション及び形質転換の如き周知の技術を用いてホスト細胞に組み込まれうる。発現ベクターは染色体、エピソーム及びウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、レンチウイルス、バキュロウイルス、パポヴァウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルス及びレトロウイルスの如きウイルスに由来するベクター、及びコスミド及びファージミドの如きそれらの組み合わせに由来するベクターを含む。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド挿入物は適切なプロモーターに使用可能につなげられる。上記発現構築物は転写開始、停止のための部位及び、転写される領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含むであろう。上記構築物により発現される成熟転写産物のコード部位ははじめに翻訳開始ＡＵＧ及び翻訳されるべきポリペプチドの終わりに適切に位置される停止コドンを含むであろう。

発現ベクターは少なくとも１の選択可能マーカーを含みうる。上記マーカーは真核細胞培養物のためのヂヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性及びＥ． ｃｏｌｉ及び他の細菌における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切なホストの代表的な例は大腸菌、ストレプトミセス及びネズミチフス菌細胞の如き細菌細胞；酵母細胞の如き真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞の如き昆虫細胞；マウスインスリノーマ（ＭＩＮ６）、ヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞の如き動物細胞；及び植物細胞を含む。上記に示されるホスト細胞のために適切な培養液及び条件は本分野において知られる。

本発明の実施のために有用なベクターは実施例中に示される。さらに、細菌における使用のためのベクターはＱｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。真核細胞ベクターは、非限定的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；及びＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを含む。他の好適なベクターは当業者に容易に明らかであろう。

実施例は本発明の実施におけるヒトインスリンプロモーターの使用を示す。さらに、さまざまな目的のための使用に好適な細菌プロモーターはＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ及びＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを含む。真核細胞プロモーターはＣＭＶｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙプロモーター、ＨＳＶチミヂンキナーゼプロモーター、ｅａｒｌｙ及びｌａｔｅＳＶ４０プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターの如きレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターの如きメタロチオネインプロモーターを含む。

高等真核生物による転写は上記ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大されうる。エンハンサーはあるホスト細胞型でプロモーターの転写活性を増大させるようはたらく通常約１０〜３００塩基対の、ＤＮＡのシス活性エレメントである。エンハンサーの例は、非限定的に、複製起点ａｔｂｐ１００〜２７０のｌａｔｅ側上に位置されるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスｅａｒｌｙプロモーターエンハンサー、複製起点のｌａｔｅ側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。

小胞体のｌｕｍｅｎへの、ペリプラズム空間への又は細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが発現されたポリペプチドに組み込まれうる。上記シグナルは上記ポリペプチドに対して内因性でありうる又はそれらは異種のシグナルでありうる。

本発明を一般的に示したが、同様のことは以下の実施例の引用により、より容易に理解されるであろう、及び実施例は例示のために提供され、及び限定として意図されない。それゆえ、付属の請求項の範囲内で、本発明は本明細書中で特に記載されているよりも別なように実施されうることが理解されるべきである。

実施例１：ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーからの化合物の予備スクリーニングは、インスリンプロモーター活性における増大について計算された０．７４のｚ’値及びインスリンプロモーター活性の阻害についての０．４３のｚ’値を有する、正に及び負にインスリンプロモーターを調節する候補化合物を産出した。
体内のどの他の細胞によっても共有されない、膵臓ベータ細胞の基本的な特性はインスリン遺伝子の高レベルの発現である。インスリンプロモーター活性に影響するシス及びトランスエレメントは何年間も研究されているが、私たちの理解が限られていることは明らかである。特に、インスリン発現のベータ細胞特異性を決定するプロモーターエレメントは十分に理解されているが、一部にはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルがないために、インスリンプロモーターへ伝達する経路は広範囲には調べられていない。

私たちはインスリンプロモーター活性を調節する小分子化合物についてのスクリーニングを開発した。これらの化合物及び最後にはそれらの標的を同定することはインスリン発現を制御する伝達経路への洞察を提供するはずである。分析は通常インスリンｍＲＮＡを発現するマウスインスリノーマ、ＭＩＮ６に基づいた。この細胞はインスリンプロモーター活性及びハウスキーピング遺伝子活性をモニターするための蛍光レポータータンパク質を使用する２のカセットを安定的に含むよう遺伝子操作された。第一分析はハウスキーピング遺伝子、熱ショックタンパク質６８のそれに比較して、マウスインスリノーマ（ＭＩＮ６）細胞においてインスリンプロモーター−不安定化ｅＧＦＰレポーターカセットの発現を変える化合物を検出することであり、熱ショックタンパク質６８のプロモーターは不安定化ｄｓＲＥＤ２の発現を指揮するよう第二のカセットにおいて使用される。第二の分析はヒットを確認するために使用されうる、及びＲＴ−ＰＣＲによりコントロールｍＲＮＡに比較した内因性インスリンｍＲＮＡ発現の調節をさらに実証するであろう。全ての培養されたインスリン生成細胞のように、ＭＩＮ６細胞は無傷の膵臓において正常なベータ細胞が生成するほどインスリンｍＲＮＡ及びタンパク質を実質的にあまり生成しない。したがって、これはインスリン生成を刺激する及び抑制する両方の化合物の同定を許容する。インスリンｍＲＮＡ合成の小分子調節剤はインスリン分泌を制御する調節経路をプローブするための有用な道具である。経路の知識及びそれらを調節する手段はＩ及びＩＩ型糖尿病の治療に適用されるであろう知識の基礎を導くことが期待される。予備研究は、インスリンプロモーター−ｅＧＦＰレポータートランスジーンは内因性インスリン遺伝子の活性をまねることを示す。分析パラメーターは最適化され、標準の操作手順に統合され、及びＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの８，０００化合物サブセットのパイロットスクリーニングを行うために使用されている。インスリン遺伝子発現を増大させる及び減少させるヒットは同定され及び確認された。これらのヒットはｅＧＦＰにおける増大について０．７４及び減少について０．４３のｚ’値を計算するために使用された。

材料及び方法
スクリーニングに好適なベータ細胞モデル。 膵臓ベータ細胞はインスリン遺伝子を発現する唯一の細胞型である。それゆえ、インスリンプロモーター活性に方向付けられたスクリーニングはベータ細胞又はベータ細胞モデルを用いて所望のようになされる。初代ベータ細胞は供給が少なく、及び操作されるときアポトーシスを経験する強い傾向を有して、そのためそれらを単層培養物に維持することが困難であり、扱いが困難である。それゆえ、スクリーニングはベータ細胞モデルを利用しなければならない。げっ歯類インスリノーマ細胞系は何年間も研究されている。ＭＩＮシリーズの細胞系は１８６７ｂｐヒトインスリンプロモーター断片からＳＶ４０ Ｔ抗原遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから開発された（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：１２６−１３２，１９９０）。ＭＩＮ６は、特に初期の代において、生理学的グルコース濃度でグルコース応答インスリン分泌を示す。後期の代はこの特性を失いやすいが、Ｍｉｎ６細胞は無期限にインスリン遺伝子発現の実質的なレベルを安定に保持する。
ＭＩＮ６の如きインスリノーマ細胞は大量のインスリンｍＲＮＡ及びタンパク質を発現するが、レベルは無傷の膵臓における健康なベータ細胞でのレベルよりまだ少ない。したがって、このスクリーニングは発現を増大させる及び減少させるであろう小分子プローブを検出するために設計される。

この分析はヒト膵臓内分泌先祖系においてインスリンプロモーター活性に影響する化合物についてのスクリーニングに比較して独特の局面を有する。ヒト内分泌細胞系は比較的より未成熟の状態にある。さらに、ヒト及びげっ歯類ベータ細胞は、インスリン遺伝子の数及びどのようにしてインスリン遺伝子が調節されるかといういくつかの特徴を含む、多くの特性において異なる（Ｏｈｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １１：２２７−２３３， ２０００）。一つはヒト細胞での及び一つはマウス細胞での、２のインスリンプロモータースクリーニングからの結果を互いに比較することは同定された化合物の標的を決定するための及びまたより詳細に研究され及び実質的な化学的リソースを含む構造−活性及びリード最適化研究に進められるであろう化合物に優先順位をつけるための機械論的研究に助力する。

イメージに基づいたハイスループットスクリーニングのためのＭＩＮ６のエンジニアリング。 レンチウイルスベクターｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ｅＧＦＰ不安定化．ＷＰＲＥ（図１中に示される）は以下のようにヒトインスリン遺伝子（ｈＩＮＳ）プロモーターにより駆動される強化グリーン蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子の不安定化ヴァージョン（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３４９７０−３４９７５，１９９８）を発現するよう操作された：Ｍ． Ｇｅｒｍａｎにより私たちに好意的に提供されたプラスミドｐＦＯＸＣＡＴ−１．４ｈＩｎｓ１１からの１．４ｋｂ ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｈＩｎｓプロモーター配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩで切断し、及びｈＰＧＫプロモーター配列と置換するようｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ ２中のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩにライゲーションした。ベクター上清を以前に示されるように（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３，１９９５）、２９３Ｔ細胞の一過性カルシウムリン酸仲介共トランスフェクションにより調製した。ＤＭＥＭ１０培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中の１５ｃｍプレート当たり２×１０⁷細胞の２９３Ｔ細胞を３５マイクログラムのトランスファーベクタープラスミド：２５μｇのｐＣＭＶΔＲ８．９１パッケージングプラスミド４、及び１０．５μｇのｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）エンベローププラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション１２〜１５時間後、培地を、血清を含まないＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ， Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， ＮＪ， ＵＳＡ）で置き換えた。２４〜７２時間でハーヴェストされるウイルス上清を０．４５μｍのフィルターにかけ、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−８０ ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて限外ろ過により１００〜２００倍に濃縮し、ｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＰＧＫ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥウイルス上清の連続希釈での２９３Ｔ細胞の形質導入及びＥＧＦＰ発現細胞の割合を決定するためのＦＡＣＳ分析により決定される、ミリリットル５当たり約１０⁹形質導入単位（ＴＵ）のタイターを産出した。同様のベクターをいたるところに発現されるｈｓｐ６８プロモーターの制御下でｄｓＲＥＤ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の不安定化ヴァージョンを発現するよう構築した。これらのタンパク質の両方は２〜４時間の次数の半減期が報告されている。ベクター上清を以前に示されるように（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３， １９９５）、２９３Ｔ細胞の一過性カルシウムリン酸仲介共トランスフェクションにより調製した。ＤＭＥＭ１０培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中の１５ｃｍプレート当たり２×１０⁷細胞の２９３Ｔ細胞を３５マイクログラムのトランスファーベクタープラスミド：２５μｇのｐＣＭＶΔＲ８．９１パッケージングプラスミド４、及び１０．５μｇのｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）エンベローププラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション１２〜１５時間後、培地を、血清を含まないＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ， Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， ＮＪ， ＵＳＡ）で置き換えた。２４〜７２時間でハーヴェストされるウイルス上清を０．４５μｍのフィルターにかけ、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−８０ ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて限外ろ過により１００〜２００倍に濃縮し、いたるところにあるプロモーター（例えば、ｈｓｐ６８）を含むウイルス上清の連続希釈での２９３Ｔ細胞の感染及び蛍光タンパク質発現細胞の割合を決定するための蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により決定される、ミリリットル５当たり約１０⁹形質導入単位（ＴＵ）のタイターを産出した。

ｈＩＮＳプロモーターの特異性を示すために、ｈＩＮＳ−ｅＧＦＰウイルスをマウスインスリノーマ細胞系Ｍｉｎ６及び頸部癌腫細胞系ＨｅＬａに感染させるために使用した。それらの細胞系における内因性インスリンプロモーター活性と一致して、高レベルのＧＦＰ発現はＭＩＮ６において観察されたが、ＨｅＬａにおいては観察されなかった。同様の結果は初代ベータ細胞及び線維芽細胞で観察された。

安定なＭＩＮ６系をｈＩＮＳ−不安定化ｅＧＦＰ及びｈｓｐ６８−不安定化ｄｓＲＥＤ２遺伝子カセットを導入するためにレンチウイルスを用いて作出した。安定な細胞系をサブクローニングした。中レベルのｄｓＲＥＤ２及びｅＧＦＰ蛍光を有するクローンをさらなる研究のために保持した。パイロットスクリーニングを１のクローンで行ったが、パイロットスクリーニングからのヒットの生理活性は忠実度の表示として第二のクローンで確認した（以下を参照のこと）。

図２は、コントロールにおける及び正及び負のコントロール化合物に応答したｅＧＦＰの蛍光が決定されたことを示す。試験分析をそれぞれ３８４ウェルプレート中の８ウェルの複製で行った。正のコントロールのために、細胞をプロテオソーム機能をブロックし、及び蛍光タンパク質を安定化し、及びそれにより蛍光を増大させるはずであるＭＧ１３２、及びタンパク質合成をブロックし、及び蛍光を減少させるはずであるシクロヘキサミドに暴露した。私たちは、上記細胞を化合物添加後４８時間で評価したとき、それぞれ、蛍光における用量依存的増大及び減少を観察した。私たちは、この分析における蛍光タンパク質の強度における減少は出版されたデータに基づく予想と一致し、及びこの分析のために計画される４８時間の時間枠後のインスリン又はｈｓｐ６８発現における変化を明らかにするために好適であると結論付けた。私たちは次に上記スクリーニングを自動化するための分析プロトコルを開発した。

分析プロトコル。 以下は第一分析、すなわち、スクリーニングモードにおいて生物学的に活性な化学物質を同定するための試験スキームで行われる第一の分析についての詳細な分析プロトコルである：

細胞生育、維持及びスケールアップ
・約９０％相対的湿度で１０％ＣＯ₂及び３７℃での生育。
・生育表面は工場で処理された組織培養プラスティックである。
・培地調合：ＤＭＥＭ ｗ／グルコース、ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１０％血清。

細胞シーディング
・細胞を通常の生育培地中に理想的には５０〜７５％コンフルエンシーでまく。
・化合物添加前のまき時間は８〜２４時間である。

化合物調製
・化合物を２０％ ＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍＬ（〜１ｍＭ）に希釈する。
・化合物を細胞適用前に約１０μＭで、ある培地調合物中に配列する。
・化合物配列は変動し、及び分析のフォーマットに依存する。化合物を添加した培地配列フォーマットを細胞培養プレートフォーマットに合わせることが所望される。
・フォーマット転換は留意されなければならない、及び追跡はウェル−化合物関係を再構築するために実行されなければならない。

まかれた細胞への化合物添加
・当量の体積の１０μＭ培地を細胞シーディングの時間に適用された処理されていない培地に添加する。
・細胞培養条件下での最終的な名目上の化合物濃度は予想されるμＭ範囲である。
・コントロールウェルはＤＭＳＯ媒体負コントロール及び正コントロール（増大についてＭＧ１３２；負についてシクロヘキサミド）を含む。１の態様において、それぞれの３８４ウェルプレートは負及び正のコントロールの間で分けられた３２コントロールウェルを含むであろう。

インキュベーション
・細胞を中断なしに示される生育条件下で２日間生育する。
停止−全ての試薬及びプロセスは室温で実行される
温度
・培地を細胞から除去し、及び４％パラフォルムアルデヒドを最低４０分間添加する。
・パラフォルムアルデヒドを少なくとも１最大ウェル体積のＰＢＳでウェルから洗浄する。
・核対比染色を最低４０分間添加する（１μｇ／ｍＬの濃度のＤＡＰＩ）。
・対比染色を少なくとも１最大ウェル体積のＰＢＳで細胞から洗浄する。
・ｄｄＨ２Ｏ中の５０％グリセロールを０．５×最大ウェル体積で添加する。

イメージ回収
・１０×対物レンズを用いて回収される１２ビットイメージ、ＤＡＰＩ、ｅＧＦＰ、及びｄｓＲＥＤ２イメージについての４フィールドの視野。
・回収され及び全てのイメージに適用される較正イメージを用いるフラットフィールドコレクション。
・パイロットスクリーニングにおいて、数字で表されたアウトプットデータを化合物ｉｄ、用量、プレート及びウェル位置及びエラーフラッグの記述を提供するメタ−データを伴うＥｘｃｅｌスプレッドシート中で分析した。
・イメージバックグラウンドにおけるプレート対プレート変動の正規化は計算されたバックグラウンド値を用いてなされ及びバックグラウンドコントロールウェルの分布をチェックすることにより裏付けられた。
・大きさ及び強度限界により行われる目的物抽出はそれぞれの目的物が少なくとも１の細胞核を有したことを必要とし、及びこの値はＤＡＰＩ及びｅＧＦＰカラーチャネル中のそれぞれのウェルについての統合されたピクセル強度値として示される（本文を参照のこと）。

データ分析
・いくつかの基準は上記イメージデータを評価するために使用されうる。パイロットスクリーニングのために、ヒットリストはｅＧＦＰ蛍光について最低及び最高で０．１パーセンタイルであった及び対応するｄｓＲＥＤ２及びＤＡＰＩ値は中心〜１０−〜９０％分位であったウェルから従われた。これらのウェルのサムネイルイメージをスプレッドシートにロードし、分析数字データにリンクさせ、及びさらなる研究のためのヒットを選択するために視覚的に評価した。ｅＧＦＰ、ｄｓＲＥＤ２及びＤＡＰＩ値についての正確な分位カットオフを、バックグラウンドウェルが除外されたが、正のコントロール及び実験ウェルは存在する分位に基づいて経験的に決定した。この分析は細胞数における激しい減少又は増大を引き起こすことなくインスリンプロモーターｅＧＦＰを調節し、及びｄｓＲＥＤ２を維持したヒットを同定することにおいて成功した（本文を参照のこと）。ｄｓＲＥＤ２は所望の場合さらにヒットを分類するために分析されうる。サムネイルイメージの視覚的洞察はウェル中で蛍光結晶又は沈殿を引き起こす化合物を取り除くために重要である。

パイロットスクリーニングのための装置／ソフトウェア
・全てのシステム及び方法はスクリーニング前に較正され及び試験される。
・流体の取り扱い−Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ；Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＸ／ＯＲＣＡ／ＳＡＭＩ Ｓｃｈｅｄｕｌｅｒ。
・プレートインデックス−Ｋｅｎｄｒｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｔｏｍａｔ ６００１及びＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｈｏｔｅｌ。
・イメージング−ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩＮＣｅｌｌ １０００。
・イメージングプレートフィーダー−Ｔｈｅｒｍｏ／ＣＲＳ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｏｂｏｔ Ａｒｍ。
・イメージ計測−ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ。
・流体取り扱いチップ−ＭＢＰ／Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｈａｍｉｌｔｏｎ（１０μＬ−３００μＬ）。
・マイクロタイタープレート−（Ｇｒｅｉｎｅｒ）９６ｐｐ ｖ−ｂｔｔｍ；３８４ｐｐ ｖ−ｂｔｔｍ；３８４ Ｂｌａｃｋ ｕＣｌｅａｒ ＴＣ；１５３６ Ｂｌａｃｋ ｕＣｌｅａｒ Ｌｏ ＴＣ。

結果
３８４ウェルプレートにまかれた細胞を１ウェル当たり１化合物で添加された（化合物当たり５μＭ濃度；プロトコルを参照のこと）ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーの８，０００化合物をスクリーニングするために使用した。２日後、上記プレートをパラフォルムアルデヒド中で固定し、及びハイスループット顕微鏡によりイメージ化した。８，０００のスクリーニングされた化合物のそれぞれを含む１ウェル当たりのｅＧＦＰ、ｄｓＲＥＤ２及びＤＡＰＩ蛍光データについての統合ピクセル強度をプロトコルにおけるように計測した。プレート間での正規化後、上記データ点は全ての３のチャネルにおいて通常の分布を示す（図３Ａ−Ｃ）。図３中に示されるように、ＤＡＰＩチャネルにおける実際の分布は狭く、細胞周期におけるさまざまな点での細胞のＤＮＡ量を反映する。したがって、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーからの８，０００化合物の予備スクリーニングは正に及び負にインスリンプロモーターを調節する候補化合物を産出した。０．７４のｚ’値をインスリンプロモーター活性における増大について、及び０．４３のｚ’値をインスリンプロモーター活性の阻害について計算した。

予備確認分析のために、用量応答曲線を２０倍用量範囲にわたりそれぞれの用量を８の複製で成して、行った。８，０００化合物第一パイロットスクリーニングから、私たちは追跡する１６化合物を選択した：８は増大した及び８は減少したｅＧＦＰ蛍光を有した；全ての１６化合物は、インスリンプロモーターに選択的である化合物についての予備フィルターとしてはたらく、中心分位におけるｄｓＲＥＤ２蛍光を有した。私たちは複数で及び用量範囲をとおして化合物を試験した第一スクリーニングの繰り返しにおいて蛍光を減少させた及び増大させた化合物の単離を確認した。ｅＧＦＰ蛍光を増大させた及び減少させた化合物が観察された。第一分析における化合物についてのおよそのＥＣ５０値は低いマイクロモーラー範囲であった。

ｚ’計算をインスリンプロモーター−ｅＧＦＰ応答において増大を刺激した第一スクリーニングからの正のヒットの１を用いて行った。ｚ’を培地添加のみ又はＤＭＳＯ媒体コントロールウェルのいずれかを処理されていないサンプルとして用いて０．７４であると計算した。負のコントロールシクロヘキサミドを用いて、私たちはまた処理されていないウェルに比較してインスリンプロモーター活性を阻害する化合物を検出するための分析についてのｚ’も計算した。阻害についてのこのｚ’値は０．４３であった。増大されたインスリン活性について観察されたｚ’値ほど強くないが、４８時間の実験中に毒性を引き起こさない濃度のシクロヘキサミドが使用されたことが留意されるべきである。私たちは、選択的、非毒性化合物はよりよいｚ’を産出しうることを予想する。

第一確認分析を通過する化合物を第二確認分析において試験する。第二分析は、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことにより、内因性インスリンｍＲＮＡに対する化合物の効果を計測することであろう。ｅＧＦＰ及び内因性インスリンｍＲＮＡの両方は、化合物が１．４ｋｂインスリンプロモータートランスジーンに影響しうるが、より複雑な制御下にありうる内因性インスリンプロモーターには影響しない可能性のために試験されるであろう。次のＲＮＡ及びタンパク質分析は、以下のフォロースルー実験についての節において示されるように、（ａ）化合物がベータ細胞又は他の内分泌細胞機能のために重要な遺伝子に影響する又は調節するかどうかを決定するために、及び（ｂ）上記化合物により調節されるシグナル伝達経路を同定するために行われる。

追加の態様
一旦、１セットの化合物が第二分析により定義される真の陽性を含むと同定されたら、バイオインフォーマティクスアプローチは全体として上記化合物セットにより影響される伝達の多様性を示すために及び個々の分子により調節される経路についての仮説を発展させるために使用される。これらの仮説は伝統的なウェットラボアプローチにより経験的に試験される。インフォーマティクスは外部刺激により調節される細胞内伝達経路の同定を助けるために行われる。

私たちはベータ細胞の伝達能力及び複雑さをサンプリングする２の情報に富む分析を使用する。マイクロアレイデータを用いるｍＲＮＡプロファイルにおける変化は８の時点にわたり個々の化合物で処理された細胞から得られる。第二に、リン酸化タンパク質における変化は、特にＡｋｔ、ＥＲＫ−１及び−２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫイソ型、ＰＫＣイソ型、及びＪａｋ−Ｓｔａｔを含む１パネルの細胞内伝達物質に対して方向付けられたリン特異的抗体を用いて、また時間過程にわたる、免疫ブロッティングにより得られる。遺伝子配列及びリンタンパク質スキャンデータは伝達経路を割り当てるために有用であり、及び現在はラージスケールのシグナル伝達ネットワークプロジェクトのデータセットを含む（例えば、Ｂ細胞及びマクロファージ系における細胞外リガンドにより調節される伝達ネットワークの定義へのそれらの適用の例のために、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｇａｔｅｗａｙ．ｏｒｇを参照のこと）。精巧な統計的フレームワークにおける最近の発展はトランスクリプトーム及びプロテオーム分析の感度を大いに改善し、及び結果として伝達経路に遺伝子及びタンパク質を順序付けるそれらの能力を高める。進歩した統計的ツールは通常インスリン感度を増大させるために使用されるチアゾリヂンヂオン（ＴＺＤ）処理により標的化される遺伝子の同定に適用されており（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６２７−６３２， ２００５；Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０： ３１０８−３１２７， ２００４）、及び１パネルの細胞外リガンドで処理されるＲＡＷ ２６４．７マクロファージのリンタンパク質スキャンはサイトカイン放出を調節する経路を予想するために使用されている（Ｐｒａｄｅｒｖａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ１１， ２００６）。

単一のリガンド遺伝子配列及びリンタンパク質データを回収する及び分析することに加えて、明らかな経路をとおしてはたらくことがわかっている化合物の対は同様にここで分析される。このようにして、最も強い生物学的応答を与えるために合同する化合物の間の相互作用は伝達ネットワークにおけるピンポイントの重要な交点を助けるので、これらの相互作用が調べられる。

実験手順
トランスクリプトーム計測。 インスリノーマ細胞を化合物単独で及び、付加的よりも強く機能すると同定される選択サブセットについては対様式で、最適化条件下で処理する。全部で２４配列／化合物試験について８の時点を生物学的に三連で得る。上記化合物への即時応答を同定する目的に一致して、時点は典型的に、上記化合物の即時伝達応答は起こったはずであるが、少なくともいくつかの場合には、ベータ細胞分化の明白なサインに先行する１日（例えば、０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間）にわたる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ８．１ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙマイクロアレイをこれらの分析のために使用する。

リンタンパク質免疫ブロッティング。 細胞内伝達タンパク質におけるリン酸化残基に特異的な１パネルの抗体を８の時点にわたり処理されたＥＳＣｓについてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）免疫ブロッティングにより試験する。それらの標的タンパク質は広い範囲の細胞伝達を仲介するので、抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ及びＳｉｇｍａ）を選択した。上記パネルはｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ６（Ｔｙｒ６４１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ９０ＲＳＫ（Ｓｅｒ３８１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣ−ｐａｎイソ型（γ Ｔｈｒ５１４）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣδ（Ｔｙｒ３１１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣμ（Ｓｅｒ９１６）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、リン酸化ｐ４４／４２（ＥＲＫ−１／ＥＲＫ−２；ＥＲＫ−２についてＴｈｒ１８３、Ｔｙｒ１８５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ４４５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ２９９）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ（Ｓｅｒ５３６）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８（Ｓｍａｄ１ Ｓｅｒ４６３／４６５）及びｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）、ｐｈｏｓｐｈｏ−β−カテニン（Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５及びＳｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３β（Ｓｅｒ９）を含む。上記のそれぞれをヒト胎児膵臓組織、成人のランゲルハンス島、及び細胞系コントロールサンプルに対する感度及び標的選択性についてスクリーニングする。処置のための時間過程は遺伝子配列のための時間過程より短く、及び初期研究は応答の検出を確実にするために０、１、２、５、１０、２０、６０、及び１２０分を試験し、及び上記時間過程は必要に応じて改変されるであろう。強いヒットを単独で評価し、及び付加的より強く機能する対（Ａｉｍ３において決定される）を二重化合物スキャンにおいて評価する。

トランスクリプトーム分析：それぞれの遺伝子の特徴についての平均差スコアをＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｉｍａｇｅ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ５．０ソフトウェアを用いて決定する。顕著な特徴の決定を三重データセットから高い感度を達成する、ＶＡＭＰＩＲＥマイクロアレイスーツ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６２７−６３２，２００５； Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：３１０８−３１２７，２００４）を用いて行う。簡単に述べると、感度は遺伝子発現における顕著な変化を評価するための通常の使用におけるいくらか任意の倍変化カットオフを上記チップ上の全体的な遺伝子セットに由来する統計的に正確な変化見積もりで置き換えることにより高められる。一旦、遺伝子リストが完了したら、特異に調節される遺伝子は遺伝子名、説明、及びホモロジーンＩＤで全ての特異に発現される特徴に注釈をつけること、及び特異に調節される遺伝子の中で統計的に豊富である注釈群を同定することにより機能に関連付けられる。これはＶＡＭＰＩＲＥのＧＯｂｙインターフェースをとおしてなされ、及び報告はＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）、ＫＥＧＧ、ＴＲＡＮＳＦＡＣ、Ｂｉｏｃａｒｔａ及びＳｕｐｅｒａｒｒａｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍにおいて自動的に作成される。

Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ研究室は伝達経路の再構築及び分析を促進するＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを開発している。上記Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈはプロテオームの（私たちの場合にはリンタンパク質データ）及びトランスクリプトームの（ＫＥＧＧ、ＢｉｏＣａｒｔａ及び他の遺産経路に関連して）及び文献に由来する他のデータの統合から経路を築き上げるためのツールを有するであろう。この分析により識別される経路はさらなる実験計画のための仮説の基礎としてはたらくであろう。

リンタンパク質分析： 単一のリガンドにより調節されるリンタンパク質の全体的な応答パターンはそれらの最大（又は最小）応答の時点での約２０の細胞内リンタンパク質の平均値のツーウェイヒエラルキークラスタリングを用いて視覚化されるであろう。伝達経路応答及びベータ細胞分化の間のリンクをさらに調べるために、単一の及び二重の化合物処理の両方について、特定のリンタンパク質及び分化応答の大きさの関係についての相関係数が計算されるであろう。強い正及び負の相関は、それらが化合物、伝達物質、及び分化の間の直接的なつながりを示唆するように追跡されるであろう。

第一成分回帰は分化応答及び上記の分析において同定されるリンタンパク質又は遺伝子の間の伝達関係のモデルを開発するために使用される。第一成分回帰はタンパク質の機械論的な知識を必要としないが、基礎にあるパターン及び関係を検出することが証明された帰納的なインフォーマティクスアプローチであり、及び伝達物質を分化に複合するであろう直線的モデル（Ｊａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １１：５４４−５６１，２００４）を定義する。上記分析におけるこの点で、第一成分回帰係数及び化合物依存的分化経路に重大に関連するそれぞれのリンタンパク質についての相関係数の間で強い相関が予想される。

モデル試験及び解説
トランスクリプトーム及びフォスフォトーム分析に由来する経路モデルを、用量範囲をとおして化合物により刺激される細胞内で直接的に、関連するｍＲＮＡ及びタンパク質を相互作用させることを調べることにより確認する。第二に、経路においてはたらくことが知られる他のタンパク質及び遺伝子を評価する。例えば、ＥＲＫ１／２タンパク質が特定の化合物に応答して強くリン酸化される場合、私たちはＭＥＫタンパク質及び可能性のある下流の標的を評価する。仮説考案及び試験の繰返しは活性化合物の伝達経路及び下流の遺伝子標的を明らかにするために使用される。

化合物の対により付加的より強く刺激される遺伝子及びリンタンパク質の評価は、それらは経路間の可能性のある交点であるので、かなり有益であろう。これらの可能性のある交点のリン酸化又は遺伝子発現変化は分化の程度に相関するであろうことが予想される。これらのタンパク質は機能獲得及び喪失策（例えば、過剰発現、ｓｉＲＮＡ、阻害剤等）を用いて次の研究のために付箋を貼られるであろう。

標的タンパク質のさらなる分析は上記化合物のアフィニティバージョンを作出することにより達成される。アフィニティ樹脂を作出するために上記化合物をつなぎとめることは成功しているシンプルバージョンである（例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００：７６３２−７６３７，２００３）。マススペクトロスコピー標的同定のためのタンパク質の共有結合標識化用アナログはこの目的のために合成される。

実施例２：ＴＲＭ−６細胞においてインスリンプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング
インスリン発現のベータ細胞特異性を決定するプロモーターエレメントは十分に理解されているが、一部にはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルがないために、インスリンプロモーターへ伝達する経路は広範囲には調べられていない。その欠損はヒトベータ細胞モデルについて特に深刻である。私たちはインスリンプロモーター活性に影響する小分子を分析するためにインスリンを発現するヒト膵臓内分泌細胞系を利用した。これらの化合物及び最後にはそれらの標的を同定することはインスリン発現を制御する伝達経路への洞察を提供するはずである。

第一分析はヒト内分泌細胞においてインスリンプロモーター−ｅＧＦＰレポーターカセットの発現を変える化合物を検出するために使用される。生理活性分子の第二分析はＲＴ−ＰＣＲにより内因性インスリンｍＲＮＡの調節を裏付けるために使用されうる。第一分析又はスクリーニングは＞０．６のｚ’を有し、及び３８４ウェルプレートフォーマットでパイロットスクリーニングにおいて試験された。パイロットスクリーニングは、最も活性な化合物の５０％が確認された活性を示すことを示し、インスリン遺伝子活性を調節する分子をもたらした。

スクリーニングに好適なベータ細胞モデル。 ベータ細胞はインスリン遺伝子を発現する唯一の細胞型である。それゆえ、インスリンプロモーター活性に方向付けられるどんなスクリーニングもベータ細胞又はベータ細胞モデルを用いて最もよく行われる。初代ベータ細胞は供給が少なく、及び操作されるときアポトーシスを経験する強い傾向を有して、そのためそれらを単層培養物に維持することが困難であり、扱いが困難であり、それゆえ、スクリーニングはベータ細胞モデルを利用しなければならない。げっ歯類インスリノーマ細胞系は何年間も研究されている。本発明において、化合物はマウスベータ細胞系Ｍｉｎ６におけるインスリンプロモーター活性に対する効果についてスクリーニングされる。しかしながら、ヒト細胞も扱うことにより得られる実質的な利点がある。ヒト及びげっ歯類ベータ細胞は、インスリン遺伝子の数及びどのようにしてインスリン遺伝子が調節されるかといういくつかの特徴を含む、多くの特性において異なる（Ｏｄａｇｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９０９−１９１５，１９９６）。一つはヒト細胞での及び一つはマウス細胞での、２のインスリンプロモータースクリーニングからの結果を比較することは化合物の標的を機械論的に決定すること及びまたより詳細に研究され及び実質的な化学的リソースを含む構造−活性及びリード最適化研究に進められるであろう化合物に優先順位を付けることに助力する。

ヒト膵臓内分泌細胞系ＴＲＭ−６の特徴
ヒト内分泌膵臓からの細胞系は開発され及び何年間も研究されている（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：２１７−２２２，２０００；Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６２８−６３３，１９９５； Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：８７１−８７５，１９９７； Ｒｅｉｓｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：９１０−９１３，２０００； Ｏｈｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ， Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １１：２２７−２３３，２０００；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３４９７０−３４９７５，１９９８）。これらのヒト内分泌膵臓細胞系は成長刺激遺伝子ＳＶ４０ Ｔ抗原及びＨ−ｒａｓ^val12を用いてヒト内分泌膵臓から開発された（Ｒｅｉｓｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：９１０−９１３，２０００； Ｏｈｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １１：２２７−２３３，２０００； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３−３４９７０−３４９７５，１９９８； Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６２７−６３２，２００５）。細胞系は不死であり、及び培養物中で速く増殖するが、それらは分化された機能、特にそれらの細胞における成長及び分化の間の関係が理解される必要がある理由であるホルモン遺伝子発現を失うことにより増殖するよう誘発される大多数の細胞と同様に応答する。本発明において、内分泌分化は細胞系において誘発される。本発明のいくつかの局面は初期の継代でインスリンを発現するヒト胎児ランゲルハンス島に由来する細胞系であるＴＲＭ−６に焦点を合わせる（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：２１７−２２２，２０００； Ｒｅｉｓｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：９１０−９１３，２０００； Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：３１０８−３１２７，２００４）。後の継代はレトロウイルスベクターに仲介されるＰＤＸ−１の発現に応答して実質的な値のソマトスタチンを発現し、及び細胞−細胞接触を促進するために細胞クラスターに凝集する（Ｒｅｉｓｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：９１０−９１３，２０００）。ＮｅｕｒｏＤ１はソマトスタチン発現を抑制し、及び低い値のインスリン発現を引き起こした（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：２１７−２２２，２０００）。

インスリン発現の値を増大させるために、ＰＤＸ−１及びＮｅｕｒｏＤ１を発現するＴＲＭ−６細胞（Ｔ６ＰＮ細胞）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２５：２１７−２２２，２０００）にＥ４７^MERレトロウイルスベクターを感染させ、及びＦＡＣＳにより選択した。Ｅ４７^MERはタモキシフェンの存在下でのみそれを機能的にさせる突然変異されたエストロゲンリセプターに融合された強いインスリントランスアクチベーターであるクラスＩ ｂＨＬＨファクターＥ４７から成る。Ｔ６ＰＮ細胞におけるＥ４７活性の誘発はかなり高い値のインスリン遺伝子発現の誘発をもたらす（１００倍）（図４）。Ｅ４７の効果はインスリン発現に限定されているか又はベータ細胞分化に対してより一般的な効果を有するかどうかを決定するために、１パネルの他のベータ細胞遺伝子を調べた。Ｅ４７はＳＵＲ−１、グルコキナーゼ、及びＭａｆＡを誘発することがわかった。したがって、Ｔ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞は実質的な数の重要なベータ細胞遺伝子を発現し、そのためそれらは本明細書中に示されるインスリンプロモータースクリーニングのための適切な標的である。

分析プロトコル。 以下は第一分析、すなわち、スクリーニングモードで生物学的に活性な化学物質を同定するための試験スキームで行われる第一の分析のための詳細な分析プロトコルである：

細胞生育、維持及びスケールアップ
・約９０％相対的湿度で１０％ＣＯ₂及び３７℃での生育。
・生育表面は工場で処理された組織培養プラスティックである。
・培地調合 ＤＭＥＭ ｗ／グルコース、ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１０％血清。
・細胞シーディング
・細胞を０．５マイクロモーラータモキシフェンを含む培地中に理想的には５０〜７５％コンフルエンスでまく。
・化合物添加前のまき時間は８〜２４時間である。

化合物調製
・化合物を２０％ ＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍＬ（〜１ｍＭ）に希釈する。
・化合物を細胞適用前に約１０μＭで、ある培地調合物中に配列する。
・化合物配列は変動し、及び分析のフォーマットに依存する。化合物を添加した培地配列フォーマットを細胞培養プレートフォーマットに合わせることが所望される。多くの場合、これはオペレーターに定義される方向をもたらす化合物配列フォーマット転換を含むであろう。
・フォーマット転換は留意されなければならない、及び追跡はウェル−化合物関係を再構築するために実行されなければならない。
・まかれた細胞への化合物添加
・当量の体積の１０μＭ培地を細胞シーディングの時間に適用された処理されていない培地に添加する。
・細胞培養条件下での最終的な化合物濃度は〜５μＭである。
・コントロールウェルはＤＭＳＯ媒体負コントロール及び４μＭタモキシフェン正コントロールを含む（図２中のように）。パイロットスクリーニングのために、それぞれの３８４ウェルプレートは負及び正のコントロールの間で分けられた３２コントロールウェルを含んだ。

インキュベーション
・細胞を中断なしに示される生育条件下で２日間生育する。
・停止−全ての試薬及びプロセスを室温で実行する。
・培地を細胞から除去し、及び４％パラフォルムアルデヒドを最低４０分間添加する。
・パラフォルムアルデヒドを少なくとも１最大ウェル体積のＰＢＳでウェルから洗浄する。
・核対比染色を最低４０分間添加する（ほとんどの場合、１μｇ／ｍＬの濃度のＤＡＰＩ）。
・対比染色を少なくとも１最大ウェル体積のＰＢＳで細胞から洗浄する。
・ｄｄＨ₂Ｏ中の５０％グリセロールを０．５最大ウェル体積で添加する。

イメージ回収及び分析
・５×又は１０×対物レンズを用いて回収されるイメージ、ＤＡＰＩ及びｅＧＦＰイメージについて、それぞれ、１又は４フィールドの視野。
・パイロットスクリーニングにおいて、数字で表されたアウトプットデータを化合物ｉｄ、用量、プレート及びウェル位置及びエラーフラッグの記述を提供するメタ−データを伴うＥｘｃｅｌスプレッドシート中で分析した。
・イメージバックグラウンドにおけるプレート対プレート変動の正規化を計算されたバックグラウンド値を用いて行い、及びバックグラウンドコントロールウェルの分布をチェックすることにより裏付けた。
・目的物抽出は大きさ及び強度限界により行われ、及びこの値はＤＡＰＩ及びｅＧＦＰカラーチャネル中のそれぞれのウェルについての統合されたピクセル強度値として示される（本文を参照のこと）。
・いくつかの基準は上記イメージデータを評価するために使用されうる。パイロットスクリーニングのために、中心１０〜９０％分位のｅＧＦＰ及びＤＡＰＩにおける最低及び最高０．１パーセンタイルのウェルからのサムネイルイメージをスプレッドシートに整理し、分析数字データにリンクさせ、及びさらなる研究のためのヒットを選択するために視覚的に評価した。これは細胞数における激しい減少又は増大を引き起こすことなくインスリンプロモーターｅＧＦＰを調節したヒットを産出した（本文を参照のこと）。

パイロットスクリーニングのための装置／ソフトウェア
・全てのシステム及び方法はスクリーニング前に較正され及び試験される。
・流体の取り扱い−Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ；Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＸ／ＯＲＣＡ／ＳＡＭＩ Ｓｃｈｅｄｕｌｅｒ。
・プレートインデックス−Ｋｅｎｄｒｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｔｏｍａｔ ６００１及びＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｈｏｔｅｌ。
・イメージング−ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩＮＣｅｌｌ １０００。
・イメージングプレートフィーダー−Ｔｈｅｒｍｏ／ＣＲＳ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｏｂｏｔ Ａｒｍ。
・イメージ計測−ＧＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ。
・流体取り扱いチップ−ＭＢＰ／Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｈａｍｉｌｔｏｎ（１０μＬ−３００μＬ）。
・マイクロタイタープレート−（Ｇｒｅｉｎｅｒ）９６ｐｐ ｖ−ｂｔｔｍ；３８４ｐｐ ｖ−ｂｔｔｍ；３８４ Ｂｌａｃｋ ｕＣｌｅａｒ ＴＣ；１５３６ Ｂｌａｃｋ ｕＣｌｅａｒ Ｌｏ ＴＣ。

ヒトインスリンプロモーター−ＧＦＰトランスジーンはレンチウイルスベクター仲介遺伝子転移により挿入されるとき忠実に発現される。 ヒトインスリン遺伝子（ｈＩｎｓ）プロモーターにより駆動される強化グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスベクターｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥは実施例１中に示される。ＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥウイルスをマウスインスリノーマ細胞系Ｍｉｎ６及び頸部癌腫細胞系ＨｅＬａに感染させるために使用した。それらの細胞系における内因性インスリンプロモーター活性と一致して、高レベルのＧＦＰ発現がＭｉｎ６において観察されたが、ＨｅＬａにおいては観察されなかった。

ｅＧＦＰはタモキシフェンによりＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞において高く誘発される。 一旦、インスリンプロモーター−ｅＧＦＰレンチウイルスベクターが十分に機能することが明らかになったら、Ｔ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞にそれを感染させ、及びＥ４７核移行及びインスリンプロモーター活性を誘発するタモキシフェンによるｅＧＦＰの誘発について試験した。高い値のｅＧＦＰがタモキシフェン投与に応答して観察された。この結果はこのシステムのハイスループット分析への発展のための起動力を提供した。

細胞プレーティング密度及びタモキシフェン濃度の最適化は０．６のｚ’値をもたらす。 インスリンプロモーター−ｅＧＦＰウイルスに感染したＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞を異なる細胞プレーティング密度及びタモキシフェン濃度で試験し、及びハイスループット分析のための条件を最適化するために（細胞数についてのコントロールに対して）ＤＡＰＩについて正規化されるｅＧＦＰ蛍光の値について分析した。結果は図５中に示される。０．５マイクロモーラータモキシフェンのベースラインがウェルに添加され、及び２，０００細胞が３８４ウェルプレートのそれぞれのウェルにまかれた最適条件下で、計算されたｚ’は０．６であった。
上記分析を最適化し、及び高いｚ’値でそれを確認して、私たちはＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーからの１サブセットの化合物のスモールスケールスクリーニングに進んだ。

ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーからの８，０００化合物の予備スクリーニングは正に及び負にインスリンプロモーターを調節する候補化合物を産出する。 細胞を３８４ウェルプレートにまいた後、最高値未満の用量のタモキシフェンを中間値のＧＦＰ蛍光を誘発するために添加し、及びＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーの８，０００化合物を１ウェル当たり１化合物で添加した（１化合物当たり５μＭ濃度；プロトコルを参照のこと）。２日後、上記プレートをパラフォルムアルデヒド中に固定し、及びＧＦＰ蛍光をハイスループット顕微鏡により計測した。８，０００のスクリーニングされた化合物のそれぞれを含むウェル当たりの統合されたｅＧＦＰ及びＤＡＰＩ蛍光データを計測した。統合蛍光強度を計算するために、目的物をバックグラウンドを除外するために強度−及び大きさ−閾値イメージマスクを用いてイメージから抽出し、及びこの値をはじめのヒットを選択するために使用した（プロトコルを参照のこと）。インスリンプロモーター−ＧＦＰ蛍光に対する小分子化合物の効果を示す４ウェルは図８中に示される。左から右へ、中間値のＧＦＰ蛍光を示す化合物なしのコントロールウェル、インスリンプロモーター活性を変えなかった化合物を含むウェル、インスリンプロモーター活性をアップレギュレートした化合物を含むウェル、及びインスリンプロモーター活性を除去した化合物を含むウェルがある。ＤＡＰＩ蛍光は、上記化合物が上記細胞に毒性でなかったことを示すために、対応する下のパネル中に示される。

用量応答を伴う第一確認分析は約５０％の予備的な真の陽性率を産出する。 第一確認分析のために、用量応答曲線を、それぞれの用量を三重で行って、実行した（図６）。ＧＦＰ蛍光を抑制した４化合物のうちの３及びＧＦＰ蛍光を増大させた７化合物のうちの３は確認分析で陽性であり、はじめのヒットの約５０％の真の陽性率であった。上記化合物についてのおよそのＥＣ５０値は、スクリーニングで使用された濃度（５マイクロモーラー）から予想されるように、低いマイクロモーラー範囲であった。

第二確認分析。 第一確認分析を通過した化合物を第二確認分析におけるさらなる試験に進めた。これはＧＦＰ及び内因性インスリンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲから成る（図７）。化合物が１．４ｋｂインスリンプロモータートランスジーンには影響しうるが、より複雑な制御下にありうる内因性インスリンプロモーターに影響しない可能性のために、ＧＦＰ及び内因性インスリンＲＴ−ＰＣＲ分析の両方を行う。図７中に示されるように、化合物１、２、及び３はＧＦＰ及び内因性インスリンｍＲＮＡの両方に対して強い抑制効果を有した。化合物１０はコントロールと同じ値のＧＦＰ ｍＲＮＡを有するように見えるが、活性化化合物（７、１０、１１）もまたどんな他の化合物も含まない０．５マイクロモーラータモキシフェンを含むコントロールに比較して増大されたインスリンｍＲＮＡを示した。

追加の態様。 １セットの化合物が第二分析により定義されるように真の陽性であることが同定されたら、バイオインフォーマティクスアプローチは全体として上記化合物セットにより影響される伝達の多様性を示すために及び個々の分子により調節される経路についての仮説を発展するために使用されうる。これらの仮説は伝統的なウェットラボアプローチにより経験的に試験されるであろう。インフォーマティクスは外部刺激により調節される細胞内伝達経路の同定において助力するよう行われるであろう。
伝達能力及びＥＳＣｓの複雑さをサンプリングする２の情報が豊富な分析を使用する。マイクロアレイデータを用いたｍＲＮＡプロファイルにおける変化を８の時点にわたり個々の化合物で処理された細胞から得る。第二に、リン酸化タンパク質における変化を、特にＡｋｔ、ＥＲＫ−１及び−２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫイソ型、ＰＫＣイソ型、及びＳｔａｔ−３を含む１パネルの細胞内伝達物質に対して方向付けられたリン特異的抗体を用いて、また時間過程にわたる、免疫ブロッティングにより得る。遺伝子配列及びリンタンパク質スキャンデータは伝達経路を割り当てるために有用であり、及び現在はラージスケールのシグナル伝達ネットワークプロジェクトのデータセットを含む（例えば、Ｂ−細胞及びマクロファージ系における細胞外リガンドにより調節される伝達ネットワークの定義へのそれらの適用の例のためにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−ｇａｔｅｗａｙ．ｏｒｇを参照のこと）。精巧な統計的フレームワークにおける最近の発展はトランスクリプトーム及びプロテオーム分析の感度を大いに改善し、及び結果として伝達経路に遺伝子及びタンパク質を順序付けるそれらの能力を高める。Ｄｒ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍにより開発された進歩した統計的ツールは通常インスリン感度を増大させるために使用されるチアゾリヂンヂオン（ＴＺＤ）処理により標的化される遺伝子の同定に適用されており（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：Ｗ６２７−６３２， ２００５； Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０： ３１０８−３１２７， ２００４）、及びサイトカイン放出を調節する経路を予想するために１パネルの細胞外リガンドで処理されるＲＡＷ ２６４．７マクロファージのリンタンパク質スキャンを使用する（Ｐｒａｄｅｒｖａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ７：Ｒ１１， ２００６）。

単一のリガンド遺伝子配列及びリンタンパク質データを回収する及び分析することに加えて、明らかな経路をとおしてはたらくことがわかっている化合物の対は同様にここで分析されるであろう。最も強い生物学的応答を与えるために合同する化合物の間の相互作用は伝達ネットワークにおけるピンポイントの重要な交点を助けるので、これらの相互作用の定義は重要な目的である。

実験手順
トランスクリプトーム計測。 インスリノーマ細胞を化合物単独で及び、付加的より強く機能すると同定される選択サブセットについては対様式で、最適化条件下で処理する。全部で２４配列／化合物試験について、８の時点を生物学的に三重で得る。上記化合物への即時応答を同定する目的に一致して、時点は典型的に、上記化合物の即時伝達応答は起こったはずであるが、少なくともいくつかの場合には、ベータ細胞分化の明白なサインに先行する１日（例えば、０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間）にわたる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ８．１ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙマイクロアレイをこれらの分析のために使用する。

リンタンパク質免疫ブロッティング。 細胞内伝達タンパク質中のリン酸化残基に特異的な１パネルの抗体を８の時点にわたり処理されたＥＳＣｓについてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）免疫ブロッティングにより試験する。それらの標的タンパク質は広い範囲の細胞伝達を仲介するので、抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ及びＳｉｇｍａ）を選択した。上記パネルはｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ６（Ｔｙｒ６４１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ９０ＲＳＫ（Ｓｅｒ３８１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣ−ｐａｎイソ型（γ Ｔｈｒ５１４）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣδ（Ｔｙｒ３１１）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＫＣ （Ｓｅｒ９１６）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、リン酸化ｐ４４／４２（ＥＲＫ−１／ＥＲＫ−２；ＥＲＫ−２についてＴｈｒ１８３、Ｔｙｒ１８５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ４４５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ２９９）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ（Ｓｅｒ５３６）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８（Ｓｍａｄ１ Ｓｅｒ４６３／４６５）及びｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）、ｐｈｏｓｐｈｏ−β−カテニン（Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５及びＳｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３β（Ｓｅｒ９）を含む。上記のそれぞれをヒト胎児膵臓組織、成人のランゲルハンス島、及び細胞系コントロールサンプルに対する感度及び標的選択性についてスクリーニングする。処置のための時間過程は遺伝子配列のための時間過程より短く、及び初期研究はその応答の検出を確実にするために０、１、２、５、１０、２０、６０、及び１２０分を試験し、及び上記時間過程は必要に応じて改変されるであろう。強いヒットを単独で評価し、及び付加的よりも強く機能する対を二重化合物スキャンにおいて評価する。

トランスクリプトーム分析。 それぞれの遺伝子の特徴についての平均差スコアはＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｉｍａｇｅ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＭＡＳ ５．０ソフトウェアを用いて決定されるであろう。顕著な特徴の決定を三重データセットから高い感度を達成する、ＶＡＭＰＩＲＥマイクロアレイスーツ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：Ｗ６２７−５３２，２００５； Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：３１０８−３１２７，２００４）を用いて行う。簡単に述べると、感度は遺伝子発現における顕著な変化を評価するための通常の使用におけるいくらか任意の倍変化カットオフを上記チップ上の全体的な遺伝子セットに由来する統計的に正確な変化見積もりで置き換えることにより高められる。一旦、遺伝子リストが完成したら、特異に調節される遺伝子は遺伝子名、説明、及びホモロジーンＩＤで全ての特異に発現される特徴に注釈をつけること、及び特異に調節される遺伝子の中で統計的に豊富である注釈群を同定することにより機能に関連付けられるであろう。これはＶＡＭＰＩＲＥのＧＯｂｙインターフェースをとおしてなされ、及び報告はＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）、ＫＥＧＧ、ＴＲＡＮＳＦＡＣ、Ｂｉｏｃａｒｔａ及びＳｕｐｅｒａｒｒａｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍにおいて自動的に作成される。
Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ研究室は伝達経路の再構築及び分析を促進するＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを開発している。上記Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈはプロテオームの（私たちの場合にはリンタンパク質データ）及びトランスクリプトームの（ＫＥＧＧ、ＢｉｏＣａｒｔａ及び他の遺産経路に関連して）及び文献に由来する他のデータの統合から経路を築き上げるためのツールを有するであろう。この分析により識別される経路はさらなる実験計画のための仮説の基礎としてはたらく。

リンタンパク質分析： 単一のリガンドにより調節されるリンタンパク質の全体的な応答パターンをそれらの最大（又は最小）応答の時点での約２０の細胞内リンタンパク質の平均値のツーウェイヒエラルキークラスタリングを用いて視覚化する。伝達経路応答及びベータ細胞分化の間のリンクをさらに調べるために、単一の及び二重の化合物処理の両方について、特定のリンタンパク質及び分化応答の大きさの関係について相関係数を計算する。強い正及び負の相関を、それらが化合物、伝達物質、及び分化の間の直接的なつながりを示唆するように追跡する。

第一成分回帰を分化応答及び上記の分析において同定されるリンタンパク質又は遺伝子の間の伝達関係のモデルを開発するために使用する。第一成分回帰はタンパク質の機械論的な知識を必要としないが、基礎にあるパターン及び関係を検出することが証明された帰納的なインフォーマティクスアプローチであり、及び化合物を伝達物質に分化につなげるであろう直線的モデル（Ｊａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ． １１：５４４−５６１，２００４）を定義する。上記分析におけるこの点で、私たちは、第一成分回帰係数及び化合物依存的分化経路に重大に関連するそれぞれのリンタンパク質についての相関係数の間の強い相関を見出すことを予想する。

モデル試験及び解説。 トランスクリプトーム及びフォスフォトーム分析に由来する経路モデルを、用量範囲をとおして化合物により刺激される細胞内で直接的に、関連するｍＲＮＡ及びタンパク質を相互作用させることにより確認する。第二に、上記経路においてはたらくことが知られる他のタンパク質及び遺伝子を評価する。例えば、ＥＲＫ１／２タンパク質が特定の化合物に応答して強くリン酸化される場合、私たちはＭＥＫタンパク質及び可能性のある下流の標的を評価するであろう。仮説考案及び試験の繰返しは活性化合物の伝達経路及び下流の遺伝子標的を明らかにする。

化合物の対により付加的よりも強く刺激される遺伝子及びリンタンパク質の評価は、それらは経路間の可能性のある交点であるので、かなり有益である。これらの可能性のある交点のリン酸化又は遺伝子発現変化は分化の程度に相関するであろうことが予想される。これらのタンパク質は機能獲得及び喪失策（例えば、過剰発現、ｓｉＲＮＡ、阻害剤）を用いて次の研究のために付箋を貼られるであろう。

標的タンパク質のさらなる分析は上記化合物のアフィニティバージョンを作出することによりなされる。アフィニティ樹脂を作出するよう上記化合物をつなぎとめることは成功しているシンプルバージョンである（例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００：７６３２−７６３７，２００３）。マススペクトロスコピー標的同定のためのタンパク質の共有結合的標識化用アナログは合成されている。

全ての出版物、特許及び特許出願を本明細書中に援用する。
上記明細書中に、本発明はそのある好ましい態様に関連して示されており、及び多くの詳細は例示の目的のために示されているが、本発明は追加の態様が可能であること、及び本明細書中の詳細のいくつかは本発明の基本的な原理から離れることなくかなり変化されうることが当業者に明らかであろう。

図１はヒトインスリンプロモーターから不安定化強化グリーン蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターの構造を示す。このベクターｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥはヒトインスリン遺伝子（ｈＩｎｓ）プロモーターにより駆動される不安定化強化グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現する。 図２は操作されたＭＩＮ６細胞におけるｅＧＦＰ蛍光の用量応答性を示す。化合物を３倍滴定シリーズ（ｎＭでの濃度）にわたり添加した。（Ａ）プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２への暴露は、不安定化蛍光タンパク質の分解をブロックすることにより予想されるであろうように、ｅＧＦＰ蛍光における用量依存的増大を刺激した。 （Ｂ）逆に、タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミドは、新規タンパク質合成に対するブロックを反映する、蛍光強度における減少を引き起こした。データは３８４ウェルプレートにおいて行われ及び化合物添加後４８時間映された分析からの複数ウェルの平均である。 図３はＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリーからの８，０００化合物のスモールスケールスクリーニングを示す。それぞれのチャネルにおけるウェルデータの要約統計は通常の分布を示す。Ｘ軸値は分位であり、及びしたがって予想されるように、ＤＡＰＩ分布の実際の蛍光強度がｅＧＦＰ又はｄｓＲＥＤ２強度の分布に比較して非常に狭かったことを現わさない。 図４は、Ｅ４７はＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞においてインスリン遺伝子発現を誘発することを示す。（Ａ）インスリンｍＲＮＡはＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞の２の生物学的複製物においてタモキシフェンの不在下では非定量的ＲＴ−ＰＣＲによりほとんど検出できない。タモキシフェンで、インスリンｍＲＮＡは強く誘発される。（Ｂ）Ｔ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞の異なるセットの２の生物学的複製物は定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析され、再び、Ｅ４７活性がタモキシフェンにより誘発されるときインスリンｍＲＮＡの劇的なアップレギュレーションを示した。心臓特異的であり、及びそのプロモーター中のＥ−ｂｏｘｅｓにより高く誘発されるミオシン重鎖遺伝子はタモキシフェンにより誘発されなかった（図４中に示されていない）。 図５は、最も高いｚ’をもたらすシーディング密度及びタモキシフェン濃度を決定するための分析最適化を示す。細胞を異なるシーディング密度でさまざまなタモキシフェン濃度で処理し、及び（細胞数についてのコントロールに対して）ＤＡＰＩについて正規化されたｅＧＦＰ蛍光の値について分析した。 図６は８，０００化合物Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＤｉｖｅｒＳｅｔライブラリー スクリーニングからの選択された化合物の第一確認を示す。（Ａ）インスリンプロモーター活性を阻害した２９化合物からランダムに選択された４化合物をＧＦＰ蛍光に対する効果について異なる用量で三重でスクリーニングした。４化合物のうちの２がＧＦＰ蛍光を阻害することを確認した。（Ｂ）第一スクリーニングにおいてＧＦＰ蛍光に対して最も大きな正の効果を有した７化合物を異なる用量で三重で試験した。上記化合物のうちの３がＧＦＰ蛍光を増大させることを確認した。 図７はインスリン及びＧＦＰ ｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲによる第二スクリーニングの結果を示す。ＧＦＰ蛍光を抑制した３化合物（１，２，３）及びＧＦＰ蛍光を増大させた３化合物（７，１０，１１）をＧＦＰ及びインスリンｍＲＮＡに対する効果について試験した。細胞を５マイクロモーラー化合物に暴露し、及びまた０．５マイクロモーラータモキシフェンを与えた。両方のコントロールは０．５マイクロモーラータモキシフェンを有し、及びＤＭＳＯコントロールは化合物で処理されたサンプル中に存在するのと同じ量のＤＭＳＯを有した。４マイクロモーラータモキシフェンコントロールはインスリンｍＲＮＡの最大誘発を示す。両方のＧＦＰ及びインスリンｍＲＮＡ値を、転写に対する化合物の非特異的効果を除外するためにＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡについて正規化する。

Claims (45)

1. 不安定化強化グリーン蛍光タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、不安定化強化グリーン蛍光タンパク質はＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞及びヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞から成る群から選ばれる細胞への上記ベクターの導入に際して発現される前記ベクター。
2. 請求項１に記載のウイルスベクター。
3. 請求項１に記載のレンチウイルスベクター。
4. 請求項１に記載のベクターを含む細胞。
5. 請求項１に記載のベクターを含む膵臓ベータ細胞。
6. 請求項１に記載のベクターを含むマウス細胞。
7. 請求項１に記載のベクターを含むＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞。
8. 請求項１に記載のベクターを含むヒト細胞。
9. 請求項１に記載のベクターを含むヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞。
10. レンチウイルスベクターｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ。
11. 請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
12. 請求項１０に記載のベクターを含む膵臓ベータ細胞。
13. 請求項１０に記載のベクターを含むマウス細胞。
14. 請求項１０に記載のベクターを含むＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞。
15. 請求項１０に記載のベクターを含むヒト細胞。
16. 請求項１０に記載のベクターを含むヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞。
17. Ｅ４７を発現するポリヌクレオチド配列を含むヒトＴ６ＰＮ細胞。
18. マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチド配列を含むベクターを含み、ここで上記マーカーポリペプチドは上記細胞内で発現される、請求項１７に記載の細胞。
19. 上記マーカーポリペプチドはグリーン蛍光タンパク質である、請求項１８に記載の細胞。
20. 上記グリーン蛍光タンパク質は強化グリーン蛍光タンパク質である、請求項１９に記載の細胞。
21. 上記強化グリーン蛍光タンパク質は不安定化グリーン蛍光タンパク質である、請求項２０に記載の細胞。
22. 上記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２０に記載の細胞。
23. 上記レンチウイルスベクターはｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥである、請求項２２に記載の細胞。
24. ヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７ＭＥＲ細胞。
25. マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチド配列を含むベクターを含み、ここで、上記マーカーポリペプチドは上記細胞内で発現される、請求項２４に記載の細胞。
26. 上記マーカーポリペプチドはグリーン蛍光タンパク質である、請求項１８に記載の細胞。
27. 上記グリーン蛍光タンパク質は強化グリーン蛍光タンパク質である、請求項１９に記載の細胞。
28. 上記強化グリーン蛍光タンパク質は不安定化グリーン蛍光タンパク質である、請求項２０に記載の細胞。
29. 上記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２０に記載の細胞。
30. インスリン遺伝子発現を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）強化グリーン蛍光タンパク質ポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を提供することであって、強化グリーン蛍光タンパク質は上記細胞内で基準値で発現されること；（ｂ）上記細胞を候補化合物と接触させること；及び（ｃ）上記細胞を上記候補化合物と接触させた結果としての、基準値に比較した上記細胞内での強化グリーン蛍光タンパク質の発現における調節を検出することを含む前記方法。
31. 上記候補化合物による強化グリーン蛍光タンパク質の発現の調節は用量応答性であるかどうかを決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 上記候補化合物は哺乳類インスリン生成細胞によるインスリン発現を調節するかどうかを決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
33. ＲＴ−ＰＣＲにより、上記候補化合物は哺乳類インスリン生成細胞によるインスリン発現を調節するかどうかを決定することを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 上記強化グリーン蛍光タンパク質は不安定化グリーン蛍光タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
35. 上記ベクターはウイルスベクターである、請求項３０に記載の方法。
36. 上記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項３５に記載の方法。
37. 上記ベクターはｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥである、請求項３６に記載の方法。
38. 上記細胞は膵臓ベータ細胞である、請求項３０に記載の方法。
39. 上記細胞はマウス細胞である、請求項３０に記載の方法。
40. 上記細胞はＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞である、請求項３９に記載の方法。
41. 上記細胞はヒト細胞である、請求項３０に記載の方法。
42. 上記細胞はヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞である、請求項４１に記載の方法。
43. 候補化合物のハイスループットスクリーニングのために自動化される、請求項３０に記載の方法。
44. インスリン遺伝子発現を調節する化合物の同定方法であって、（ａ）ＭＩＮ６マウスインスリノーマ細胞及びヒトＴ６ＰＮ／Ｅ４７^MER細胞から成る群から選ばれる細胞を提供することであって、上記細胞は強化グリーン蛍光タンパク質ポリヌクレオチドに使用可能につなげられたヒトインスリン遺伝子プロモーターポリヌクレオチドを含むベクターを含み、強化グリーン蛍光タンパク質は上記細胞内で基準値で発現されること；（ｂ）上記細胞を候補化合物と接触させること；及び（ｃ）上記細胞を上記候補化合物と接触させた結果としての、基準値に比較した上記細胞内での強化グリーン蛍光タンパク質の発現における調節を検出することを含む前記方法。
45. 上記ベクターはｐＲＲＬ．ＳＩＮ−１８．ｃＰＰＴ．ｈＩＮＳ−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥである、請求項４４に記載の方法。

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