JPWO2004005497A1 - インスリン抵抗性改善薬スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
ＰＰＡＲγとｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法を開示する。当該方法は、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進することによる従来のＰＰＡＲアゴニストとは異なる新しいタイプのインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法である。さらに、前記スクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を開示する。
Description
本発明は、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法に関する。
インスリン抵抗性改善薬としてすでに効果が認められているチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１２９５３−１２９５６頁、１９９５年）。ＰＰＡＲγは核内受容体スーパーファミリーに属し、リガンドの結合によって活性化される転写促進因子として標的遺伝子上流にある応答配列に結合し、その転写を誘導することが知られている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ、第８３巻、第８３５−８３９頁、１９９５年）。ＰＰＡＲγアゴニストは細胞の増殖を停止し、細胞分化を促進することが報告されている（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第９０巻、第７５項、１９９９年）。ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現が認められ（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第８巻、第１２２４−１２３４頁、１９９４年、Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｃｅｌｌ、第７９巻、第１１４７−１１５６頁、１９９４年）、ホモ欠損型マウスでは脂肪細胞の分化誘導が起こらない。またＰＰＡＲγのアゴニストとして作用するチアゾリジン誘導体の投与は大型脂肪細胞の減少と小型脂肪細胞の増加を引き起こす（Ｋｕｂｏｔａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、第４巻、第５９７−６０９頁、１９９９年）。以上の知見から、チアゾリジン誘導体がインスリン抵抗性を改善する機構はＰＰＡＲγアゴニストが急速に脂肪細胞の分化を促進する結果、インスリン抵抗性誘発原因物質であるＴＮＦαの産生抑制、末梢組織でのグルコーストランスポーター発現の促進、遊離脂肪酸産生の抑制が起こり、結果、細胞内への糖取り込みが亢進して高血糖が改善されると考えられている（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１２９５３−１２９５６頁、１９９５年）。チアゾリジン誘導体のＰＰＡＲγとの親和性は生体内の血糖降下作用と相関することから、該化合物群のインスリン抵抗性改善作用はＰＰＡＲγの活性化を介した作用であると考えられている（Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３９巻、第６６５−６６８頁、１９９６年）。このようなことからＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進することはインスリン抵抗性を改善すると考えられ、そのため、ＰＰＡＲγのアゴニストの検出方法はインスリン抵抗性糖尿病治療薬をスクリーニングする有効な手法であると考えられてきた。
しかしながら近年チアゾリジン誘導体を用いた臨床での知見から、ＰＰＡＲγのアゴニスト作用を持つ従来の合成リガンドは、インスリン抵抗性改善作用のみでなくいずれも肝臓機能障害を引き起こし、また生体内の循環血漿量を増大させて浮腫を惹起することが報告された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。このＰＰＡＲγの合成アゴニストによる肝臓機能障害は重篤な副作用であり、浮腫の惹起も心肥大等をもたらす重篤な副作用であることからインスリン抵抗性改善という主作用との乖離が強く望まれている。しかし、これまでにチアゾリジン誘導体がこのような副作用をもたらす分子メカニズムは解明されていない。
一般に核内受容体はその構造中に二カ所の転写促進領域を持っており、Ｎ末端側のものはＡＦ−１領域、Ｃ末端側のものはＡＦ−２領域と呼ばれている。ＡＦ−２領域はリガンドに依存した転写促進に関与しているとされることから（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ、第８３巻、第８４１−８５０頁、１９９５年）、これまでに多くの研究がなされ、アゴニストの探索等にも利用されてきた。一方、ＡＦ−１領域に関してはリガンドに非依存的な転写促進に関与しているという他に多くの知見はない。ところが近年、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に点変異を持つヒトのなかに特徴的な表現型を示すものの存在が報告され、特に第１２番目のプロリンがアラニンに変異しているヒトは、野生型に比べて肥満に抵抗性であり良好なインスリン感受性を示すことが報告された（非特許文献４参照）。
ＰＰＡＲγの転写誘導活性には他の核内受容体同様に転写共役因子群との相互作用が必要であり、ＰＰＡＲγと相互作用する因子を同定しようとする試みがなされて来た。実際に、既存の核内受容体相互作用因子とＰＰＡＲγとの結合が調べられており、ＳＲＣ−１（ＺｈｕらＧｅｎｅ Ｅｘｐｒ．第６巻、第１８５−１９５頁、１９９６年）、ＣＢＰ／ｐ３００（Ｇｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７４巻、第７６８１−７６８８頁、１９９９年）など複数の分子がＰＰＡＲγと相互作用することが報告されている。しかしながら、これらの共役因子群は主にＡＦ−２領域に結合するものと考えられており、ＡＦ−１領域に結合する共役因子として知られているものは現在のところわずかにＰＧＣ−２（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．第１８巻、第３６７６−３６８７頁 １９９９年）が挙げられるに留まっている。
ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、その塩基配列及びアミノ酸配列がデータベースに登録されており（ｇｅｎｐｅｐｔ Ｘ５２１０４，ｇｅｎｐｅｐｔ Ｘ１５７２９，ｇｅｎｐｅｐｔ ＢＣ０１６０２７，ｇｅｎｐｅｐｔ ＡＦ０１５８１２）、上流塩基配列が非特許文献５に記載されている。また、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子が特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４に記載され、創傷治癒に関与することや腫瘍マーカーとして有用であることが記載されている。一方、核内受容体の一つであるエストロゲンレセプターαのＡＦ−１領域に結合する転写誘導共役因子であることが明らかになっている（非特許文献６参照）。さらに近年、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースが脂肪細胞分化に関与している可能性が示唆されてきた（非特許文献７、非特許文献８参照）。しかし、その詳細な分子メカニズムについては依然不明である。
国際公開第０２／２８９９９号パンフレット カナダ第２３２５２２６号明細書 国際公開第０１／６０８６０号パンフレット 国際公開第０１／６４７０７号パンフレット 「ザ・ランセット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ）」、（米国）、２０００年、第３５５巻、ｐ．１００８−１０１０ 「ダイアビーティーズ・フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１１−８１８ 「ダイアビーティーズ・フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１９−８２４ 「ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（米国）、１９９８年、第２０巻、ｐ．２８４−２８７、 「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（英国）２０００年、第２８巻、ｐ．９３２−９３９ 「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９９年、第１９巻、ｐ．５３６３−５３７２ 「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、（米国）、２００１年、第２８７巻、ｐ．４３５−４３９ 「アニマル・ジェネティクス（Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（英国）、２０００年、第３１巻、ｐ．１６６−１７０
しかしながら近年チアゾリジン誘導体を用いた臨床での知見から、ＰＰＡＲγのアゴニスト作用を持つ従来の合成リガンドは、インスリン抵抗性改善作用のみでなくいずれも肝臓機能障害を引き起こし、また生体内の循環血漿量を増大させて浮腫を惹起することが報告された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。このＰＰＡＲγの合成アゴニストによる肝臓機能障害は重篤な副作用であり、浮腫の惹起も心肥大等をもたらす重篤な副作用であることからインスリン抵抗性改善という主作用との乖離が強く望まれている。しかし、これまでにチアゾリジン誘導体がこのような副作用をもたらす分子メカニズムは解明されていない。
一般に核内受容体はその構造中に二カ所の転写促進領域を持っており、Ｎ末端側のものはＡＦ−１領域、Ｃ末端側のものはＡＦ−２領域と呼ばれている。ＡＦ−２領域はリガンドに依存した転写促進に関与しているとされることから（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｃｅｌｌ、第８３巻、第８４１−８５０頁、１９９５年）、これまでに多くの研究がなされ、アゴニストの探索等にも利用されてきた。一方、ＡＦ−１領域に関してはリガンドに非依存的な転写促進に関与しているという他に多くの知見はない。ところが近年、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に点変異を持つヒトのなかに特徴的な表現型を示すものの存在が報告され、特に第１２番目のプロリンがアラニンに変異しているヒトは、野生型に比べて肥満に抵抗性であり良好なインスリン感受性を示すことが報告された（非特許文献４参照）。
ＰＰＡＲγの転写誘導活性には他の核内受容体同様に転写共役因子群との相互作用が必要であり、ＰＰＡＲγと相互作用する因子を同定しようとする試みがなされて来た。実際に、既存の核内受容体相互作用因子とＰＰＡＲγとの結合が調べられており、ＳＲＣ−１（ＺｈｕらＧｅｎｅ Ｅｘｐｒ．第６巻、第１８５−１９５頁、１９９６年）、ＣＢＰ／ｐ３００（Ｇｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７４巻、第７６８１−７６８８頁、１９９９年）など複数の分子がＰＰＡＲγと相互作用することが報告されている。しかしながら、これらの共役因子群は主にＡＦ−２領域に結合するものと考えられており、ＡＦ−１領域に結合する共役因子として知られているものは現在のところわずかにＰＧＣ−２（Ｃａｓｔｉｌｌｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．第１８巻、第３６７６−３６８７頁 １９９９年）が挙げられるに留まっている。
ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、その塩基配列及びアミノ酸配列がデータベースに登録されており（ｇｅｎｐｅｐｔ Ｘ５２１０４，ｇｅｎｐｅｐｔ Ｘ１５７２９，ｇｅｎｐｅｐｔ ＢＣ０１６０２７，ｇｅｎｐｅｐｔ ＡＦ０１５８１２）、上流塩基配列が非特許文献５に記載されている。また、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子が特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４に記載され、創傷治癒に関与することや腫瘍マーカーとして有用であることが記載されている。一方、核内受容体の一つであるエストロゲンレセプターαのＡＦ−１領域に結合する転写誘導共役因子であることが明らかになっている（非特許文献６参照）。さらに近年、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースが脂肪細胞分化に関与している可能性が示唆されてきた（非特許文献７、非特許文献８参照）。しかし、その詳細な分子メカニズムについては依然不明である。
本発明者らは、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に結合する蛋白質としてｐ６８ ＲＮＡヘリケースを同定し、ヒト脂肪組織中でｐ６８ ＲＮＡヘリケースが発現していることを見出した。さらに、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースが過剰に発現するとＰＰＡＲγの転写誘導活性が促進することを見出した。次いで、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンがｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を誘導することを見出し、該蛋白質の発現亢進が糖尿病態改善となることを見出した。また、ｐ６８ ＲＮＡヘリケース上流領域の解析により、転写抑制性調節をする領域を見出した。さらに、ピオグリタゾンによるＰＰＡＲγ転写活性化の作用点は転写抑制性調節の解除ではないことを見出し、このｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の抑制性調節を解除する作用を持つ物質のスクリーニングにより従来のインスリン抵抗性改善薬とは異なるｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングすることができることを見出した。
これらの知見をもとにして、ＰＰＡＲγとｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法を構築した。ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進することによる従来のＰＰＡＲアゴニストとは異なる新しいタイプのインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法及びインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］ ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質を発現している細胞、
［２］ 転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である［１］記載の細胞、
［３］ レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である［１］記載の細胞、
［４］ ｉ）［１］乃至［３］に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験物質がＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進するか否かを検出する方法、
［５］ ｉ）［１］乃至［３］に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程、及びｉｉｉ）レポーター活性を亢進する試験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質をスクリーニングする方法、
［６］ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質がインスリン抵抗性改善薬である［５］記載のスクリーニング方法、
［７］ ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
［８］ ｉ）配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
［９］ 請求の範囲５乃至請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
特許文献１にｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子が記載され、当該分子が関与するとして多数の疾患名が挙げられているが、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとインスリン抵抗性との関係及びｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの関係については記載されていない。特許文献２に記載されているｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子は、創傷治癒に関与するとされている。また、特許文献３又は特許文献４に記載されているｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子は、腫瘍マーカーとして有用であることや種々の癌に関与すると記載されている。何れの特許文献にもｐ６８ ＲＮＡヘリケース又はそれと相同性の高い分子について、インスリン抵抗性との関係及びＰＰＡＲγとの関係については記載されていない。
従って、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に結合し、その転写誘導共役因子として機能することは本発明者らが見出した新規の知見であり、ＰＰＡＲγとｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法は本発明者らが初めて行った発明である。
これらの知見をもとにして、ＰＰＡＲγとｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法を構築した。ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進することによる従来のＰＰＡＲアゴニストとは異なる新しいタイプのインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング方法及びインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］ ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質を発現している細胞、
［２］ 転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である［１］記載の細胞、
［３］ レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である［１］記載の細胞、
［４］ ｉ）［１］乃至［３］に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験物質がＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進するか否かを検出する方法、
［５］ ｉ）［１］乃至［３］に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程、及びｉｉｉ）レポーター活性を亢進する試験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質をスクリーニングする方法、
［６］ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質がインスリン抵抗性改善薬である［５］記載のスクリーニング方法、
［７］ ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
［８］ ｉ）配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
［９］ 請求の範囲５乃至請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
特許文献１にｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子が記載され、当該分子が関与するとして多数の疾患名が挙げられているが、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとインスリン抵抗性との関係及びｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの関係については記載されていない。特許文献２に記載されているｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子は、創傷治癒に関与するとされている。また、特許文献３又は特許文献４に記載されているｐ６８ ＲＮＡヘリケースと相同性の高い分子は、腫瘍マーカーとして有用であることや種々の癌に関与すると記載されている。何れの特許文献にもｐ６８ ＲＮＡヘリケース又はそれと相同性の高い分子について、インスリン抵抗性との関係及びＰＰＡＲγとの関係については記載されていない。
従って、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に結合し、その転写誘導共役因子として機能することは本発明者らが見出した新規の知見であり、ＰＰＡＲγとｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、及び／または、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定方法およびスクリーニング方法、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法は本発明者らが初めて行った発明である。
図１は、実施例２で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性を、横軸はｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクター量を示す。
図２は、実施例５の（３）で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性を、横軸はコトランスフェクトしたプラスミドを示す。斜線バーは薬剤非添加、黒色バーは薬剤添加の結果を示す。
図２は、実施例５の（３）で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性を、横軸はコトランスフェクトしたプラスミドを示す。斜線バーは薬剤非添加、黒色バーは薬剤添加の結果を示す。
以下に本発明を詳細に説明する。
［１］本発明の細胞
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型ｐ６８ ＲＮＡヘリケースである。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型ＰＰＡＲγである。
ＰＰＡＲγ転写活性試験のための本発明の細胞作成用の、ＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、機能的等価改変体と称する）；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
機能的等価改変体としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド」が含まれる。
相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質である限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、好ましくはＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質である。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、第７３巻、第２３７−２４４頁、１９９８年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第２２巻、第４６７３−４６８０頁、１９９４年）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ ｔｕｐｌｅ １
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ３
Ｗｉｎｄｏｗ ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ ５
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、機能的等価改変体、相同ポリペプチドを総称して「ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ＲＮＡヘリケース」と称する。
ＰＰＡＲγ転写誘導試験のための本発明の細胞作成用の、ＰＰＡＲγ蛋白質融合体をコードする遺伝子は、配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子であればよい。ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域は配列番号３で表される塩基配列の第１番目〜第５０４番目の塩基配列により表される領域である。また、上記ＤＮＡ結合領域は、いずれの転写因子のＤＮＡ結合領域を用いてもよい。「ＤＮＡ結合領域」は、ＤＮＡに結合するために機能する領域であり、応答配列に対するＤＮＡ結合能を有するが、単独で転写誘導能を有しないものを示す。
上記の実施態様において、ＰＰＡＲγの転写誘導能を検出するために用いられる「転写因子」は、細胞核内で特定のＤＮＡ配列に結合する領域を有する真核生物の転写因子であれば限定されない。また転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写誘導能を有しないものであればよい。このような転写因子としては、例えば、酵母のＧＡＬ４蛋白質（Ｋｅｅｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、第６９９−７０４頁、１９８６年、Ｍａら、Ｃｅｌｌ、第４８巻、第８４７−８５３頁、１９８７年）が挙げられる。ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合領域および転写誘導領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）に存在する。
「応答配列」は、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列を用いる。遺伝子の上流域からその領域を切り出して用いる、あるいはその配列を化学的に合成して用いてもよい。「応答配列」のより詳しい定義と実例については「分子細胞生物学第４版」（丸山ら訳、東京化学同人社、２００１年）に記載されている。
応答配列の下流に配置される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結される、あるいはプロモーターに応答配列を挿入されているものが用いられる。
ＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、ｃＤＮＡライブラリーから単離できる。ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、同じ分子種として同定されるもので、ＰＰＡＲγに相互作用して該受容体のリガンド存在下での転写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ１５５７２９、Ｘ５２１０４およびＡＦ０１５８１２）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ６５６２７）、ヤマネコ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１１０００９）などの哺乳動物由来のものが挙げられる。ＰＰＡＲγは、同じ分子種として同定されるもので、核内受容体としての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ７９０１２）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ０９１３８）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＢ０１９５６１）などの哺乳動物由来のものなどが挙げられる。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォームが存在し、ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。
ＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト脂肪組織を挙げることができる。ヒト脂肪組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本明細書のＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本明細書のＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］に記載の方法により、これら各領域をコードするＤＮＡを単独、あるいは連結し、適当なプロモーターの下流に連結することでＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの試験細胞内での発現系が構築できる。具体的には上述のように得られたポリヌクレオチドは、適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すればよい。これらは、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成してもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよう構成してもよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
応答配列に連結されたレポーター遺伝子も、一般的な遺伝子組換え技術を用いて構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入したものを用いる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
ＰＰＡＲγは外部から導入しても良いが、内在性のＰＰＡＲγが豊富に存在する細胞、例えば脂肪由来細胞などを宿主細胞として用いる場合は、上述の構成のうち、ＰＰＡＲγを省いて、応答配列に連結されたレポーターとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースからなる構成のみを導入してもよい。
より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。宿主細胞を形質転換し、遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフェクション試薬リポフェクトアミン２０００を用いてＣＯＳ−１細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ−１細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
［２］本発明の検出及びスクリーニング方法
本発明の、ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、あるいは、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定およびスクリーニング方法を以下に記載する。
本発明の細胞（以下、試験用細胞と称する）を試験物質の存在下で培養し、ＰＰＡＲγの転写誘導能に対するＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの促進作用が試験物質により促進されることをレポーター遺伝子の発現により検出し測定することができる。
また、例えば試験物質がＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を促進したり分解を抑制するとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような物質はＰＰＡＲγ転写誘導活性促進剤として同定される。
これらはいずれも従来のＰＰＡＲアゴニストとは異なる構造を有し、より強い主作用を持ち副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待される。
＜ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法＞
本発明の一つの実施態様としては、（１）ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）ＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
（２）ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）ＰＰＡＲγ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、
ａ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース、及び、ｂ）ＰＰＡＲγ蛋白質を発現している細胞（試験用細胞）を用い、これに試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、試験用細胞における試験物質によるＰＰＡＲγの転写活性化能促進作用の変化を検出し、測定することからなるＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質及びインスリン抵抗性を改善する物質を選択、スクリーニングする方法が挙げられる。
ワンハイブリッドシステムは、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白−蛋白質間相互作用を検出する方法である。一般に転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領域という機能の異なる２つの領域を有するが、ワンハイブリッドシステムでは、２種類の蛋白質ＸとＹの相互作用を調べるために、１）転写因子のＤＮＡ結合領域とＸからなる融合蛋白質と、２）Ｙの２種類を同時に培養細胞内で発現させる。蛋白質ＸとＹが相互作用するとこれらが１つの転写複合体を形成し、これが細胞の核内において前記転写因子の応答配列（特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。より具体的にはＣａｓｔｉｌｌｏらの方法で実施することが出来る（ＥＭＢＯ Ｊ．第１８巻、第３６７６−３６８７頁 １９９９年）。したがって、ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができ、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの相互作用を促進する物質（即ちＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質）並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングを実施できる。ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法において用いる細胞に発現するＰＰＡＲγが、ＰＰＡＲγ全長蛋白質である場合には、好ましくは、アッセイ系にＰＰＡＲγリガンドを添加するとよい。核内受容体は一般にＡＦ−２領域にリガンドが結合して立体構造が変化した結果、ＡＦ−１領域およびＡＦ−２領域に転写共役因子がリクルートされてきて転写の活性化がおこることが報告されているからである。より具体的には、実施例２に記載の方法で前記スクリーニングを実施できる。
ＰＰＡＲγ全長領域を用いる際に好ましい添加するＰＰＡＲγリガンドとしては、ＰＰＡＲγの転写誘導能を惹起することができるものであればいずれのものであってもよく、例えば１〜１０００ｎＭ、好ましくは１〜１００ｎＭ、より好ましくは１〜３０ｎＭの最終濃度でＰＰＡＲγの転写誘導能を惹起することができるものが挙げられる。ＰＰＡＲγリガンドとしては、例えば、ピオグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１２９５３−１２９５６項、１９９５年）が挙げられる。
ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、例えば、生化学的に検出する方法がある。このような方法では、例えばＲＩなどで標識したＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲγのＡＦ−１領域からなる融合タンパク質との結合を試験物質の存在下で直接的に検出することで実施できる。より具体的には実施例１に記載の手法により実施できる。
また、別の実施態様としては免疫化学的な方法（ＥＬＩＳＡ法）がある。このような方法では、例えば、２種類の蛋白質ＸとＹの相互作用を調べるために、Ｘをあらかじめ固定しておき、これにＹと試験物質を混ぜた後非特異的な結合を除くために適当な方法で洗浄し、さらにＹと特異的に抗原抗体反応をする抗体を添加する。固定されたＸに結合したＹの量は、Ｙに特異的に反応した抗体量と置き換えて検出することができる。これを利用することで、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの相互作用を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングを実施できる。
ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法としては、上記記載の方法が挙げられるが、上記態様において用いるＰＰＡＲは、１）ＡＦ−１領域、２）好ましくはリガンド添加と共にＰＰＡＲ全長領域のいずれでもよい。
＜ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量の変化を分析する工程を含むインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法＞
ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする方法で、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることが出来る。
「細胞」としては、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞ならば何れの細胞でもよく、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクターを上記のように形質転換して得られた細胞でも良い。好ましくは実施例４に記載の培養細胞３Ｔ３Ｌ１が挙げられる。「ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞」がｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現しているか否かは、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を添加又は非添加して一定時間培養させた後細胞を回収する。試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、又は、該ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の量の変化として測定することができ、試験物質非添加の場合と試験物質添加の場合の前記発現量の変化を比較することにより、試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析することが出来る。前記の回収した細胞からＲＮＡまたは細胞抽出液を得ることが出来る。回収したＲＮＡ中のＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのｍＲＮＡ量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法などにより検出する事が出来る。より具体的には、実施例４に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。また、回収した細胞抽出液中のＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの蛋白質量は、例えば、免疫化学的な方法（ウエスタンブロッティング法など）により検出することが出来る。このようにして、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量の変化を分析することによりインスリン抵抗性改善薬のスクリーニングを実施できる。
＜ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースプロモーターを利用しインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法＞
ｉ）配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴として、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例５に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔら、Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第５１巻、第８１３５−８１７３頁、１９９５年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
［３］インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
［１］本発明の細胞
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型ｐ６８ ＲＮＡヘリケースである。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のヒト由来の天然型ＰＰＡＲγである。
ＰＰＡＲγ転写活性試験のための本発明の細胞作成用の、ＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、機能的等価改変体と称する）；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
機能的等価改変体としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド」、「配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質であるポリペプチド」が含まれる。
相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質である限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができ、好ましくはＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用する蛋白質である。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、第７３巻、第２３７−２４４頁、１９９８年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第２２巻、第４６７３−４６８０頁、１９９４年）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ ｔｕｐｌｅ １
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ３
Ｗｉｎｄｏｗ ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ ５
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、機能的等価改変体、相同ポリペプチドを総称して「ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ＲＮＡヘリケース」と称する。
ＰＰＡＲγ転写誘導試験のための本発明の細胞作成用の、ＰＰＡＲγ蛋白質融合体をコードする遺伝子は、配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードする遺伝子であればよい。ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域は配列番号３で表される塩基配列の第１番目〜第５０４番目の塩基配列により表される領域である。また、上記ＤＮＡ結合領域は、いずれの転写因子のＤＮＡ結合領域を用いてもよい。「ＤＮＡ結合領域」は、ＤＮＡに結合するために機能する領域であり、応答配列に対するＤＮＡ結合能を有するが、単独で転写誘導能を有しないものを示す。
上記の実施態様において、ＰＰＡＲγの転写誘導能を検出するために用いられる「転写因子」は、細胞核内で特定のＤＮＡ配列に結合する領域を有する真核生物の転写因子であれば限定されない。また転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に対するＤＮＡ結合能は有するが、単独で転写誘導能を有しないものであればよい。このような転写因子としては、例えば、酵母のＧＡＬ４蛋白質（Ｋｅｅｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、第６９９−７０４頁、１９８６年、Ｍａら、Ｃｅｌｌ、第４８巻、第８４７−８５３頁、１９８７年）が挙げられる。ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合領域および転写誘導領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）に存在する。
「応答配列」は、転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列を用いる。遺伝子の上流域からその領域を切り出して用いる、あるいはその配列を化学的に合成して用いてもよい。「応答配列」のより詳しい定義と実例については「分子細胞生物学第４版」（丸山ら訳、東京化学同人社、２００１年）に記載されている。
応答配列の下流に配置される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結される、あるいはプロモーターに応答配列を挿入されているものが用いられる。
ＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、ｃＤＮＡライブラリーから単離できる。ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、同じ分子種として同定されるもので、ＰＰＡＲγに相互作用して該受容体のリガンド存在下での転写誘導能に影響を与えるものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ１５５７２９、Ｘ５２１０４およびＡＦ０１５８１２）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ６５６２７）、ヤマネコ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１１０００９）などの哺乳動物由来のものが挙げられる。ＰＰＡＲγは、同じ分子種として同定されるもので、核内受容体としての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ７９０１２）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ０９１３８）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＢ０１９５６１）などの哺乳動物由来のものなどが挙げられる。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の二種のアイソフォームが存在し、ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同じであり、いずれも脂肪組織に発現していることが知られている。
ＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されていると同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト脂肪組織を挙げることができる。ヒト脂肪組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本明細書のＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本明細書のＰＰＡＲγ、転写因子のＤＮＡ結合領域、またはＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］に記載の方法により、これら各領域をコードするＤＮＡを単独、あるいは連結し、適当なプロモーターの下流に連結することでＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの試験細胞内での発現系が構築できる。具体的には上述のように得られたポリヌクレオチドは、適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すればよい。これらは、両者が一つのプラスミド上に含まれるよう構成してもよく、あるいは各々別々のプラスミド上に含まれるよう構成してもよい。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
応答配列に連結されたレポーター遺伝子も、一般的な遺伝子組換え技術を用いて構築し、この構成をベクタープラスミド中に組込んだ上、得られた組換えプラスミドを宿主細胞中に導入したものを用いる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。
ＰＰＡＲγは外部から導入しても良いが、内在性のＰＰＡＲγが豊富に存在する細胞、例えば脂肪由来細胞などを宿主細胞として用いる場合は、上述の構成のうち、ＰＰＡＲγを省いて、応答配列に連結されたレポーターとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースからなる構成のみを導入してもよい。
より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。宿主細胞を形質転換し、遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターを市販のトランスフェクション試薬リポフェクトアミン２０００を用いてＣＯＳ−１細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ−１細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
［２］本発明の検出及びスクリーニング方法
本発明の、ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの相互作用を促進する、あるいは、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進することによりＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進しインスリン抵抗性を改善する新しい物質の同定およびスクリーニング方法を以下に記載する。
本発明の細胞（以下、試験用細胞と称する）を試験物質の存在下で培養し、ＰＰＡＲγの転写誘導能に対するＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの促進作用が試験物質により促進されることをレポーター遺伝子の発現により検出し測定することができる。
また、例えば試験物質がＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を促進したり分解を抑制するとき、発現するレポーター活性の増大が観察される。このような物質はＰＰＡＲγ転写誘導活性促進剤として同定される。
これらはいずれも従来のＰＰＡＲアゴニストとは異なる構造を有し、より強い主作用を持ち副作用と乖離したインスリン抵抗性改善薬として作用することが期待される。
＜ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法＞
本発明の一つの実施態様としては、（１）ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）ＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
（２）ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）ＰＰＡＲγ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、
ａ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース、及び、ｂ）ＰＰＡＲγ蛋白質を発現している細胞（試験用細胞）を用い、これに試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、試験用細胞における試験物質によるＰＰＡＲγの転写活性化能促進作用の変化を検出し、測定することからなるＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質及びインスリン抵抗性を改善する物質を選択、スクリーニングする方法が挙げられる。
ワンハイブリッドシステムは、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白−蛋白質間相互作用を検出する方法である。一般に転写因子はＤＮＡ結合領域と転写活性化領域という機能の異なる２つの領域を有するが、ワンハイブリッドシステムでは、２種類の蛋白質ＸとＹの相互作用を調べるために、１）転写因子のＤＮＡ結合領域とＸからなる融合蛋白質と、２）Ｙの２種類を同時に培養細胞内で発現させる。蛋白質ＸとＹが相互作用するとこれらが１つの転写複合体を形成し、これが細胞の核内において前記転写因子の応答配列（特異的に結合するＤＮＡの部位）と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。より具体的にはＣａｓｔｉｌｌｏらの方法で実施することが出来る（ＥＭＢＯ Ｊ．第１８巻、第３６７６−３６８７頁 １９９９年）。したがって、ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができ、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの相互作用を促進する物質（即ちＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質）並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングを実施できる。ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法において用いる細胞に発現するＰＰＡＲγが、ＰＰＡＲγ全長蛋白質である場合には、好ましくは、アッセイ系にＰＰＡＲγリガンドを添加するとよい。核内受容体は一般にＡＦ−２領域にリガンドが結合して立体構造が変化した結果、ＡＦ−１領域およびＡＦ−２領域に転写共役因子がリクルートされてきて転写の活性化がおこることが報告されているからである。より具体的には、実施例２に記載の方法で前記スクリーニングを実施できる。
ＰＰＡＲγ全長領域を用いる際に好ましい添加するＰＰＡＲγリガンドとしては、ＰＰＡＲγの転写誘導能を惹起することができるものであればいずれのものであってもよく、例えば１〜１０００ｎＭ、好ましくは１〜１００ｎＭ、より好ましくは１〜３０ｎＭの最終濃度でＰＰＡＲγの転写誘導能を惹起することができるものが挙げられる。ＰＰＡＲγリガンドとしては、例えば、ピオグリタゾンなどのチアゾリジン誘導体（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第１２９５３−１２９５６項、１９９５年）が挙げられる。
ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの相互作用に対する試験物質の作用を測定することを特徴とする方法の別の実施態様としては、例えば、生化学的に検出する方法がある。このような方法では、例えばＲＩなどで標識したＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質とＰＰＡＲγのＡＦ−１領域からなる融合タンパク質との結合を試験物質の存在下で直接的に検出することで実施できる。より具体的には実施例１に記載の手法により実施できる。
また、別の実施態様としては免疫化学的な方法（ＥＬＩＳＡ法）がある。このような方法では、例えば、２種類の蛋白質ＸとＹの相互作用を調べるために、Ｘをあらかじめ固定しておき、これにＹと試験物質を混ぜた後非特異的な結合を除くために適当な方法で洗浄し、さらにＹと特異的に抗原抗体反応をする抗体を添加する。固定されたＸに結合したＹの量は、Ｙに特異的に反応した抗体量と置き換えて検出することができる。これを利用することで、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースとＰＰＡＲγとの相互作用を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングを実施できる。
ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングする方法としては、上記記載の方法が挙げられるが、上記態様において用いるＰＰＡＲは、１）ＡＦ−１領域、２）好ましくはリガンド添加と共にＰＰＡＲ全長領域のいずれでもよい。
＜ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量の変化を分析する工程を含むインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法＞
ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする方法で、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることが出来る。
「細胞」としては、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞ならば何れの細胞でもよく、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクターを上記のように形質転換して得られた細胞でも良い。好ましくは実施例４に記載の培養細胞３Ｔ３Ｌ１が挙げられる。「ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞」がｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現しているか否かは、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を添加又は非添加して一定時間培養させた後細胞を回収する。試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、又は、該ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の量の変化として測定することができ、試験物質非添加の場合と試験物質添加の場合の前記発現量の変化を比較することにより、試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析することが出来る。前記の回収した細胞からＲＮＡまたは細胞抽出液を得ることが出来る。回収したＲＮＡ中のＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのｍＲＮＡ量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法などにより検出する事が出来る。より具体的には、実施例４に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。また、回収した細胞抽出液中のＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの蛋白質量は、例えば、免疫化学的な方法（ウエスタンブロッティング法など）により検出することが出来る。このようにして、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量の変化を分析することによりインスリン抵抗性改善薬のスクリーニングを実施できる。
＜ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースプロモーターを利用しインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法＞
ｉ）配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴として、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と機能的に融合されていればよい。ｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例５に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔら、Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第５１巻、第８１３５−８１７３頁、１９９５年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
［３］インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＰＰＡＲγＡＦ−１領域結合蛋白質の同定
（１）ＰＰＡＲγ遺伝子の単離と動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγの作製
配列番号６及び７に示したプライマーを用いて、ヒト脂肪組織ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ化（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（９０秒）のサイクルを３５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりＰＰＡＲγ２の全長域をコードする１５１８ｂｐ（ベースペア）を含むｃＤＮＡ断片を取得した。ヒトＰＰＡＲγ２の全長をコードするｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰ０ベクター（インビトロジェン社）にｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えによるＴＯＰ０クローニング法（インビトロジェン社）により挿入して動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγを作製した。
（２）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現用プラスミドｐＧＥＸ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１の作製とＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質の発現
配列番号６及び８に示したプライマーを用いて、実施例１の（１）で作製したｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγを鋳型としてＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；シグマ社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）のサイクルを２５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりＰＰＡＲγのＡＦ−１領域を含む領域をコードする約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を取得した。これを制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ；宝酒造社）処理し、同様に制限酵素処理したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス社）プラスミドに挿入してＧＳＴ融合タンパク質発現用プラスミドｐＧＥＸ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１を作製した。このプラスミドで形質転換した大腸菌を３７℃で３時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ナカライテスク社）を最終濃度２．５ｍＭで添加して融合蛋白質の発現を誘導し、さらに２７℃で６時間培養した。その後この大腸菌を回収し、超音波発生装置（２０１Ｍ；クボタ社）により細胞を破砕してＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質を調製した。
（３）ＧＳＴプルダウンアッセイ
実施例１の（２）で調製したＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質をゲル（グルタチオンセファロース４Ｂ；アマシャムファルマシア社）に結合させた後、このゲルを適当な緩衝液で洗浄して非特異的な蛋白質の結合を除いた。ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクター、ｐＳＧ５−ｐ６８（Ｅｎｄｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、第１９巻、第５３６３−５３７２頁、１９９９年）を鋳型として、キット添付のプロトコールに従い試験管内発現系（ＴＮＴ登録商標Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社）と放射ラベルメチオニン（ＥＡＳＹＴＡＧＴＭＥＸＰＲＥＳＳ ＰＲＯＴＥＩＮ ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＭＩＸ［３５Ｓ］−；ＮＥＮライフサイエンス社）で放射ラベルした全長ｐ６８ ＲＮＡヘリケース蛋白質を前記のＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質を結合したゲルに混ぜて４℃で１時間結合反応をさせた後洗浄した。これをドデシル硫酸ナトリウム変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イメージングアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００；ファルマシアバイオサイエンス社）により解析した。その結果、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域とｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの結合が確認された。これによりｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に結合する因子であることが明らかとなった。
（実施例２）ＰＰＡＲγのリガンド存在下での転写誘導能に対するｐ６８ ＲＮＡヘリケースの調節作用の検出
上述の結果から、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースはＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用することが示された。そこでＰ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの有する転写誘導活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＣＯＳ−１を用いたレポーターアッセイで調査した。ＰＰＡＲγのリガンドとして作用することが報告されているチアゾリジン誘導体、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、（＋）−５−［４−［２−（５−エチル−２−ピリジニル）エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン；武田薬品工業，特許１８５３５８８号）は特許明細書の方法に従って合成した。
（１）ＰＰＡＲγの転写誘導能に対するｐ６８ ＲＮＡヘリケースの調節作用の検出
培養細胞ＣＯＳ−１細胞は９６ウェル培養プレート（旭テクノグラス社）で９０％コンフルエントの状態になるまで各ウェル１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む１００μｌの最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）中で培養した。この細胞にリポフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００；インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション試薬添付のプロトコールに従い、以下（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｄ）を一過性にコトランスフェクトした。
（Ａ）実施例１の（１）により作製したｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγ（３０ｎｇ／ウェル）
（Ｂ）ＰＰＡＲ結合配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターコンストラクト（Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第３５８巻、第７７１−７７４頁、１９９２年）（１００ｎｇ／ウェル）
（Ｃ）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクター、ｐＳＧ５−ｐ６８（Ｅｎｄｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、第１９巻、第５３６３−５３７２頁、１９９９年）（０−１０ｎｇ／ウェル）
（Ｄ）β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミドｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼコントロールベクター（ロッシュ・ダイアグノスティック社）１０ｎｇ／ウェル
ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンを最終濃度３０ｎＭとなるように前記コトランスフェクトした細胞に添加して２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。１ウェルあたり８０μｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。この細胞溶解液２０μｌにルシフェラーゼ基質溶液１００μｌ（和光純薬工業社）を添加し、化学発光測定装置（ＭＬ３０００型；ダイナテックラボラトリーズ社）を用いて発光量を測定した。また、別途、前記細胞溶解液のβ−ガラクトシダーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性検出キット（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ ＰｌｕｓＴＭ ｓｙｓｔｅｍ；ＴＲＯＰＩＸ社）を用いて測定し数値化した。これを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、ＰＰＡＲγのアゴニスト依存的な転写誘導活性は、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを共発現することにより、ｐ６８ＲＮＡヘリケース量依存的に促進されることがわかった（図１）。この事実は、ｐ６８ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの転写誘導共役因子の一つであることを明らかにしている。これを利用して、ｐ６８ＲＮＡヘリケースの量を増やせば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが可能である。すなわち、ｐ６８ＲＮＡヘリケースの量が増えることでＰＰＡＲγの転写誘導能がより亢進する結果、ＰＰＡＲγアゴニスト同様の作用、つまりインスリン抵抗性改善作用を期待することが出来る。本実験系で、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングが可能となった。
（実施例３）ヒト組織におけるｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現確認
配列番号９及び１０に示したプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；シグマ社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）のサイクルを３５回繰り返し、７２℃で７分加温）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードする約８００ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅をアガロースゲル電気泳動法により検出した。その結果、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、ＰＰＡＲγの作用があることが知られている脂肪組織及び筋肉で発現していることを見出した。これにより発現部位からもｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの転写共役因子であることが裏付けられた。
（実施例４）３Ｔ３Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化過程におけるｐ６８ ＲＮＡヘリケースｍＲＮＡ発現量の比較
培養細胞３Ｔ３Ｌ１細胞は培養プレート（直径６０ｍｍ；旭テクノグラス社）に１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）２ｍｌを加えてコンフルエントの状態になるまで培養した。その後、分化用培地（最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）にインスリン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ；シグマ社）、デキサメサゾン（最終濃度２５０μＭ；シグマ社）および３−イソブチル−１−メトキシルキサンチン（最終濃度５００μＭ；シグマ社）を加えたもの）に交換し、これにインスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾン（最終濃度１μＭ）を添加したものと添加しなかったものとでｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量に変化が生じるか否かを調査した。ピオグリタゾンを添加して２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ；和光純薬工業社）を用いてＲＮＡを抽出して逆転写反応キット（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；インビトロジェン社）を使って逆転写反応を行ったものを鋳型として、配列番号１１及び１２（ｐ６８ ＲＮＡヘリケース）、もしくは配列番号１３及び１４（Ｇ３ＰＤＨ）に示したプライマーセットと検出試薬（２ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；アプライドバイオシステム社）を用いてリアルタイムＰＣＲ法（プリズム７７００シークエンスディテクションシステム；アプライドバイオシステム社）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケース及びＧ３ＰＤＨの発現量の変化を調べた。ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ｐ６８ ＲＮＡヘリケース補正発現量］＝［ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
その結果、ピオグリタゾンを添加したものは非添加のものに比較してｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量が約１．７倍となっていることが明らかとなった。これによりインスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンは、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進させる作用を有しており、したがって、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現亢進が、インスリン抵抗性を改善することが裏付けられた。
（実施例５）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
（１）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域の単離とレポーターベクターの作製
先に報告されているｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーターの塩基配列（Ｒ▲ｏ▼ｓｓｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、第９３２−９３９頁、２０００年）およびヒトゲノムＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＣ００９９９４）を基に設計した配列番号１４及び１５のプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（５分）の後、９６℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（９０秒）のサイクルを３５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号５で示されるＤＮＡ断片を収得した。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＫｐｎｌおよびＸｈｏｌ；宝酒造社）で処理し、同様に制限酵素処理したルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター；プロメガ社）に連結してｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター（ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐ）を構築した。さらに、このｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐを制限酵素（ＮｈｅｌおよびＸｈｏｌ；宝酒造社）で処理して得られたｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域を−８９９ｂｐまで含んだＤＮＡ断片を、同様に制限酵素処理したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに連結し、ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター（ｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐ）を構築した。
（２）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
実施例５の（１）で構築したｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐ、ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐ、又は陰性対照としてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１００ｎｇ／ウェル）をそれぞれβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼコントロールベクター；ロッシュ・ダイアグノスティック社社）（１０ｎｇ／ウェル）と共にＣＯＳ−１細胞に一過性にコトランスフェクトした。コトランスフェクトは実施例２の（１）と同様の方法で行った。４８時間培養した後、実施例２と同様にルシフェラーゼ発光量を測定した。また、実施例２と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、Ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性は陰性対照であるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃに比して非常に強いことが明らかとなった（ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐの時ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約２０２倍、ｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐの時ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約９４倍）。またｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐに比してｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐで得られた活性が約半分であったことから、−１１８４ｂｐから−８９９ｂｐまでの領域が転写抑制性調節に関与していることが明らかとなった。この抑制性調節を解除する作用をもつ物質は、結果としてｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写を亢進する作用があると期待され、ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐを用いた本発明によりこのような物質をスクリーニングすることが可能となった。
（３）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性に対するインスリン抵抗性改善薬の調節作用の検出
インスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンを最終濃度１０μＭとなるように実施例５の（２）でコトランスフェクトした細胞に添加して２４時間培養した後、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。また、実施例２と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、インスリン抵抗性改善薬依存的にｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の亢進が認められた（図２）。この事実は、ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写がインスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによって亢進されることを明らかにし、インスリン抵抗性改善の機構がｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写活性化であることを明らかにしている。
また、インスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによるｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の亢進はｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐおよびｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐの両方で同様に認められたことから、ピオグリタゾンによる転写活性化の作用点は−８９９ｂｐより３’下流側に存在すると考えられ、−１１８４ｂｐから−８９９ｂｐまでの領域による転写抑制性調節の解除ではないことが明らかとなった。したがって、このｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の抑制性調節を解除する作用を持つ物質のスクリーニング、より具体的にはｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐのレポーター活性をより亢進させる物質のスクリーニングにより従来のインスリン抵抗性改善薬とは異なるｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングすることが可能になった。
これらのことより、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現亢進がインスリン抵抗性を改善する可能性が裏付けられた。これを利用して、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進させれば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが可能である。本実験系でインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングが可能となった。
（実施例１）ＰＰＡＲγＡＦ−１領域結合蛋白質の同定
（１）ＰＰＡＲγ遺伝子の単離と動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγの作製
配列番号６及び７に示したプライマーを用いて、ヒト脂肪組織ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ化（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（９０秒）のサイクルを３５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりＰＰＡＲγ２の全長域をコードする１５１８ｂｐ（ベースペア）を含むｃＤＮＡ断片を取得した。ヒトＰＰＡＲγ２の全長をコードするｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰ０ベクター（インビトロジェン社）にｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えによるＴＯＰ０クローニング法（インビトロジェン社）により挿入して動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγを作製した。
（２）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現用プラスミドｐＧＥＸ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１の作製とＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質の発現
配列番号６及び８に示したプライマーを用いて、実施例１の（１）で作製したｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγを鋳型としてＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；シグマ社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）のサイクルを２５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりＰＰＡＲγのＡＦ−１領域を含む領域をコードする約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を取得した。これを制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ；宝酒造社）処理し、同様に制限酵素処理したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス社）プラスミドに挿入してＧＳＴ融合タンパク質発現用プラスミドｐＧＥＸ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１を作製した。このプラスミドで形質転換した大腸菌を３７℃で３時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ナカライテスク社）を最終濃度２．５ｍＭで添加して融合蛋白質の発現を誘導し、さらに２７℃で６時間培養した。その後この大腸菌を回収し、超音波発生装置（２０１Ｍ；クボタ社）により細胞を破砕してＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質を調製した。
（３）ＧＳＴプルダウンアッセイ
実施例１の（２）で調製したＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質をゲル（グルタチオンセファロース４Ｂ；アマシャムファルマシア社）に結合させた後、このゲルを適当な緩衝液で洗浄して非特異的な蛋白質の結合を除いた。ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクター、ｐＳＧ５−ｐ６８（Ｅｎｄｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、第１９巻、第５３６３−５３７２頁、１９９９年）を鋳型として、キット添付のプロトコールに従い試験管内発現系（ＴＮＴ登録商標Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社）と放射ラベルメチオニン（ＥＡＳＹＴＡＧＴＭＥＸＰＲＥＳＳ ＰＲＯＴＥＩＮ ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＭＩＸ［３５Ｓ］−；ＮＥＮライフサイエンス社）で放射ラベルした全長ｐ６８ ＲＮＡヘリケース蛋白質を前記のＧＳＴ−ＰＰＡＲγ−ＡＦ−１融合蛋白質を結合したゲルに混ぜて４℃で１時間結合反応をさせた後洗浄した。これをドデシル硫酸ナトリウム変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イメージングアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００；ファルマシアバイオサイエンス社）により解析した。その結果、ＰＰＡＲγのＡＦ−１領域とｐ６８ ＲＮＡヘリケースとの結合が確認された。これによりｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγのＡＦ−１領域に結合する因子であることが明らかとなった。
（実施例２）ＰＰＡＲγのリガンド存在下での転写誘導能に対するｐ６８ ＲＮＡヘリケースの調節作用の検出
上述の結果から、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースはＰＰＡＲγのＡＦ−１領域と相互作用することが示された。そこでＰ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの有する転写誘導活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＣＯＳ−１を用いたレポーターアッセイで調査した。ＰＰＡＲγのリガンドとして作用することが報告されているチアゾリジン誘導体、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、（＋）−５−［４−［２−（５−エチル−２−ピリジニル）エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン；武田薬品工業，特許１８５３５８８号）は特許明細書の方法に従って合成した。
（１）ＰＰＡＲγの転写誘導能に対するｐ６８ ＲＮＡヘリケースの調節作用の検出
培養細胞ＣＯＳ−１細胞は９６ウェル培養プレート（旭テクノグラス社）で９０％コンフルエントの状態になるまで各ウェル１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む１００μｌの最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）中で培養した。この細胞にリポフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００；インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション試薬添付のプロトコールに従い、以下（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｄ）を一過性にコトランスフェクトした。
（Ａ）実施例１の（１）により作製したｐｃＤＮＡ−ＰＰＡＲγ（３０ｎｇ／ウェル）
（Ｂ）ＰＰＡＲ結合配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターコンストラクト（Ｋｌｉｅｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第３５８巻、第７７１−７７４頁、１９９２年）（１００ｎｇ／ウェル）
（Ｃ）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現ベクター、ｐＳＧ５−ｐ６８（Ｅｎｄｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、第１９巻、第５３６３−５３７２頁、１９９９年）（０−１０ｎｇ／ウェル）
（Ｄ）β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子をもつプラスミドｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼコントロールベクター（ロッシュ・ダイアグノスティック社）１０ｎｇ／ウェル
ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンを最終濃度３０ｎＭとなるように前記コトランスフェクトした細胞に添加して２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。１ウェルあたり８０μｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。この細胞溶解液２０μｌにルシフェラーゼ基質溶液１００μｌ（和光純薬工業社）を添加し、化学発光測定装置（ＭＬ３０００型；ダイナテックラボラトリーズ社）を用いて発光量を測定した。また、別途、前記細胞溶解液のβ−ガラクトシダーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性検出キット（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ ＰｌｕｓＴＭ ｓｙｓｔｅｍ；ＴＲＯＰＩＸ社）を用いて測定し数値化した。これを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、ＰＰＡＲγのアゴニスト依存的な転写誘導活性は、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを共発現することにより、ｐ６８ＲＮＡヘリケース量依存的に促進されることがわかった（図１）。この事実は、ｐ６８ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの転写誘導共役因子の一つであることを明らかにしている。これを利用して、ｐ６８ＲＮＡヘリケースの量を増やせば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが可能である。すなわち、ｐ６８ＲＮＡヘリケースの量が増えることでＰＰＡＲγの転写誘導能がより亢進する結果、ＰＰＡＲγアゴニスト同様の作用、つまりインスリン抵抗性改善作用を期待することが出来る。本実験系で、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングが可能となった。
（実施例３）ヒト組織におけるｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現確認
配列番号９及び１０に示したプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）からＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；シグマ社）を用い、９４℃（５分）の後、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）のサイクルを３５回繰り返し、７２℃で７分加温）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケースをコードする約８００ｂｐのｃＤＮＡ断片の増幅をアガロースゲル電気泳動法により検出した。その結果、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースは、ＰＰＡＲγの作用があることが知られている脂肪組織及び筋肉で発現していることを見出した。これにより発現部位からもｐ６８ ＲＮＡヘリケースがＰＰＡＲγの転写共役因子であることが裏付けられた。
（実施例４）３Ｔ３Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化過程におけるｐ６８ ＲＮＡヘリケースｍＲＮＡ発現量の比較
培養細胞３Ｔ３Ｌ１細胞は培養プレート（直径６０ｍｍ；旭テクノグラス社）に１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）２ｍｌを加えてコンフルエントの状態になるまで培養した。その後、分化用培地（最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）にインスリン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ；シグマ社）、デキサメサゾン（最終濃度２５０μＭ；シグマ社）および３−イソブチル−１−メトキシルキサンチン（最終濃度５００μＭ；シグマ社）を加えたもの）に交換し、これにインスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾン（最終濃度１μＭ）を添加したものと添加しなかったものとでｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量に変化が生じるか否かを調査した。ピオグリタゾンを添加して２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ；和光純薬工業社）を用いてＲＮＡを抽出して逆転写反応キット（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；インビトロジェン社）を使って逆転写反応を行ったものを鋳型として、配列番号１１及び１２（ｐ６８ ＲＮＡヘリケース）、もしくは配列番号１３及び１４（Ｇ３ＰＤＨ）に示したプライマーセットと検出試薬（２ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；アプライドバイオシステム社）を用いてリアルタイムＰＣＲ法（プリズム７７００シークエンスディテクションシステム；アプライドバイオシステム社）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケース及びＧ３ＰＤＨの発現量の変化を調べた。ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ｐ６８ ＲＮＡヘリケース補正発現量］＝［ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
その結果、ピオグリタゾンを添加したものは非添加のものに比較してｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量が約１．７倍となっていることが明らかとなった。これによりインスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンは、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進させる作用を有しており、したがって、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現亢進が、インスリン抵抗性を改善することが裏付けられた。
（実施例５）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
（１）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域の単離とレポーターベクターの作製
先に報告されているｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーターの塩基配列（Ｒ▲ｏ▼ｓｓｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２８巻、第９３２−９３９頁、２０００年）およびヒトゲノムＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＣ００９９９４）を基に設計した配列番号１４及び１５のプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（５分）の後、９６℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（９０秒）のサイクルを３５回繰り返した後７２℃で７分加温）によりｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域を含む配列番号５で示されるＤＮＡ断片を収得した。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＫｐｎｌおよびＸｈｏｌ；宝酒造社）で処理し、同様に制限酵素処理したルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター；プロメガ社）に連結してｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター（ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐ）を構築した。さらに、このｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐを制限酵素（ＮｈｅｌおよびＸｈｏｌ；宝酒造社）で処理して得られたｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター領域を−８９９ｂｐまで含んだＤＮＡ断片を、同様に制限酵素処理したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに連結し、ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子プロモーター連結レポーターベクター（ｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐ）を構築した。
（２）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の検出
実施例５の（１）で構築したｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐ、ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐ、又は陰性対照としてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１００ｎｇ／ウェル）をそれぞれβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼコントロールベクター；ロッシュ・ダイアグノスティック社社）（１０ｎｇ／ウェル）と共にＣＯＳ−１細胞に一過性にコトランスフェクトした。コトランスフェクトは実施例２の（１）と同様の方法で行った。４８時間培養した後、実施例２と同様にルシフェラーゼ発光量を測定した。また、実施例２と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、Ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性は陰性対照であるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃに比して非常に強いことが明らかとなった（ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐの時ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約２０２倍、ｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐの時ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約９４倍）。またｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐに比してｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐで得られた活性が約半分であったことから、−１１８４ｂｐから−８９９ｂｐまでの領域が転写抑制性調節に関与していることが明らかとなった。この抑制性調節を解除する作用をもつ物質は、結果としてｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写を亢進する作用があると期待され、ｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐを用いた本発明によりこのような物質をスクリーニングすることが可能となった。
（３）ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性に対するインスリン抵抗性改善薬の調節作用の検出
インスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンを最終濃度１０μＭとなるように実施例５の（２）でコトランスフェクトした細胞に添加して２４時間培養した後、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。また、実施例２と同様にβ−ガラクトシダーゼ活性を測定してこれを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、インスリン抵抗性改善薬依存的にｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の亢進が認められた（図２）。この事実は、ｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写がインスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによって亢進されることを明らかにし、インスリン抵抗性改善の機構がｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の転写活性化であることを明らかにしている。
また、インスリン抵抗性改善薬の一つであるピオグリタゾンによるｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子のプロモーター活性の亢進はｐＧＬ３−ｐ６８−８９９ｂｐおよびｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐの両方で同様に認められたことから、ピオグリタゾンによる転写活性化の作用点は−８９９ｂｐより３’下流側に存在すると考えられ、−１１８４ｂｐから−８９９ｂｐまでの領域による転写抑制性調節の解除ではないことが明らかとなった。したがって、このｐ６８ ＲＮＡヘリケース遺伝子の抑制性調節を解除する作用を持つ物質のスクリーニング、より具体的にはｐＧＬ３−ｐ６８−１１８４ｂｐのレポーター活性をより亢進させる物質のスクリーニングにより従来のインスリン抵抗性改善薬とは異なるｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進する物質並びにインスリン抵抗性を改善する物質を検出及び／又はスクリーニングすることが可能になった。
これらのことより、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現亢進がインスリン抵抗性を改善する可能性が裏付けられた。これを利用して、ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現量を亢進させれば、生体のエネルギー源を糖代謝へ向かわせ血糖値を降下させることが可能である。本実験系でインスリン抵抗性を改善する物質の検出及び／又はスクリーニングが可能となった。
本発明の、ＰＰＡＲγとＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの相互作用を利用したスクリーニング系、及びＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースの発現亢進を利用したスクリーニング系は、従来のインスリン抵抗性改善薬であるＰＰＡＲγ合成リガンドとは異なる新しいタイプの薬剤のスクリーニングに利用できる。本発明の細胞は、前記スクリーニング系の構築に利用できる。
また、本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、インスリン抵抗性改善用医薬組成物を製造することができる。
また、本発明のスクリーニング方法により得ることができる物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、インスリン抵抗性改善用医薬組成物を製造することができる。
以下の配列表の数字見出し〈２２３〉には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号６〜８、１０、１４、及び１５の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
Claims (9)
- ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質の少なくともＡＦ−１領域と転写因子のＤＮＡ結合領域とからなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、及び、ｉｉｉ）前記転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
あるいは、
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｉｉ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質が結合し得る応答配列に融合されたレポーター遺伝子により形質転換され、ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／または挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＰＰＡＲγと相互作用するポリペプチド、及び、ｂ）配列番号４で表されるＰＰＡＲγ蛋白質を発現している細胞。 - 転写因子が酵母のＧＡＬ４蛋白質である請求の範囲１記載の細胞。
- レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求の範囲１記載の細胞。
- ｉ）請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、試験物質がＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進するか否かを検出する方法。
- ｉ）請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な相互作用の変化または試験物質依存的なＰＰＡＲγの転写誘導活性の変化を分析する工程、及びｉｉｉ）レポーター活性を亢進する試験物質を選択する工程を含むことを特徴とする、ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質をスクリーニングする方法。
- ＰＰＡＲγの転写誘導活性を促進する物質がインスリン抵抗性改善薬である請求の範囲５記載のスクリーニング方法。
- ｉ）ＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケースを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）試験物質依存的なＰＰＡＲ相互作用ｐ６８ ＲＮＡヘリケース発現量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
- ｉ）配列番号５で表される塩基配列からなるｐ６８ ＲＮＡヘリケースのプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
- 請求の範囲５乃至請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法。
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|---|---|---|---|---|
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