WO2004002511A1

WO2004002511A1 - 抗ｈｉｖ剤

Info

Publication number: WO2004002511A1
Application number: PCT/JP2003/008259
Authority: WO
Inventors: Nobutaka Wakamiya; Katsuki Ohtani; Takashi Sakamoto; Hiroyuki Keshi; Yuichiro Kishi
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2004-01-08
Also published as: US20090048165A1; JPWO2004002511A1; CA2472438A1; CN1620307A; EP1518557A1; EP1518557A4; AU2003246119B2; US20050123899A1; CN1876833B; US20070184477A1; US20070190652A1; AU2003246119A1; US20070191265A1; CN1876833A

Abstract

マンノース結合タンパク質(MBP)を有効成分として含み、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)感染者の治療および病態進行を効果的に抑制する抗HIV剤が開示されている。　また、HIV感染細胞をMBPの存在下で培養する工程を含む、MBPが奏する抗HIV活性の評価方法も開示されている。

Description

明細書抗 H I V剤技術分野

本発明は、マンノース結合タンパク質（MANNOSE BINDING PROTE IN, 以下、単に「MBP」と称する）の新規用途、特に、ヒト免疫不全ウィルス（HUMAN IMMUNODEF I CIENCY VIRUS, 以下、単に「HIV」と称する）を原因とする感染症の治療の際に用いる抗 HIV剤での MBPの利用に関する。背景技術

MBPは、マンナン結合タンパク質、マンナン結合レクチン、マンノース結合レクチンなどと称されている物質であって、その分子内部にコラーゲン様構造およびカルシウム要求性の糖認識領域を有する C型レクチン、すなわち、コレクチンに属する物質である [Kozu t sumi , Y. e t a!. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 95, pp. 658-664 (1980) ]。

図 4を参照すれば、 MBPは、一般に、その N末端側から C末端側（図 4の左端から右端）に向けて、 N末端領域（システィンリッチ領域）、コラーゲン様領域、ネック領域、および糖認識領域（CRD)の 4つの領域から構成されている。そして、ネック領域およびコラーゲン様領域でのヘリックス構造によって、 1本当たり約 30kDa〜約 33kDaの 3つのポリぺプチドが分子間結合して、約 90kDa〜約 99kDaの 1つのサブユニット構造（3量体）が形成されている。そして、このサブユニット構造の 2〜6個が、さらにブーケ様に結合してホモオリゴマー構造を形成している。

MBPに関するこれまでの基礎研究から、生体内に進入してきた微生物に対して、 MBPは、当該微生物表面の糖鎖に結合して、補体系を活性化させて、微生物感染の初期防御に関与していることが示唆されている [Ho lmskov, U. e t aし, Immunol. Today, 15, pp. 67-74 (1994) および Turner, M. W. et aし, Immunol. Today, Π, pp. 532-540 (1996) ]。それに加えて、 MBPの欠損者では、感染症が起こりやすいこと [Su匪 er f i el d, J. A. et aし, Lancet, 345, pp. 886-889 (1995) ]、動脈硬化性ァテローム患者に MBP欠損者が多いこと [Madsen, H. 0. et al. , Lancet, 352, pp. 959-960 (1998) ]、 MBP遺伝子変異によって重症マラリアになりやすいこと [Luty, A. J. et al. , J. Infect. Dis.， Π8, pp. 1221-1224 (1998) ]、それに、 MBP遺伝子変異により嚢胞性線維症において肺での感染症を重症化させること [Garred, P. et al. , J. Cl in. Invest. , 里, p. 431-437 (1999) ]、などがこれまでに報告されている。

さらに、 MBPの治療薬用途に向けた検討として、 MBP欠損患者に MBPを投与することで、補体依存性のォプソニン活性の正常化が起こり、易感染性が改善されることが報告されている [Vald imarsson, H. et al. , Scand. J. Immunol. , 48, pp. 116-123 (1998) ]。また、嚢胞性繊維症の患者に MBPを投与したところ、患者の臨床症状は安定化したことも報告されている

[Garred, P. et al. , Pediatr. Pulmonol. , 33 (3) , pp. 201-207 (2002) ]。ところで、 HIVの感染者数は世界規模で年々増加し続けており、その多くは、発展途上国で発生しており、これらの国々では、後天性免疫不全症候群 (AIDS)患者の急増という事態を招いている。特に、タイ国のクレイド E型と呼ばれるウィルス（サブタイプ E型ウィルス）は、極めて感染力が高く、世界保健機構 (WHO)では、サブタイプ E型ウィルスによる感染者が、今後、世界で最も多くなると予測している。

日本では、欧米と同様に、サブタイプ B型ウィルスによる感染者が多かつたが、最近になって、サブタイプ E型ウィルスによる感染者も増加する傾向にある。 '

HIV感染症に効果的に対応するには、新規の感染者数の発生を予防すること、すなわち、ワクチンの開発が緊急の課題とされている。とりわけ、米国やフランスなどでは、ワクチンの研究が積極的に進められているが、現在研究中のワクチンは、サブタイプ B型ウィルスに対処するものであって、サブタイプ E型ウィルスに対するワクチンの研究は、未だにほとんどなされていないのが現状である。さらに、サブタイプ D型ウィルスとしては、アジァゃ中央アフリカに主に分布している、劇症型を示す N D K株が知られている。

前述したように、サブタイプ B型ウィルスは、広く世界に分布している実情があるにもかかわらず、未だにそのワクチンは研究中であり、その実用化がほど遠いのが現状である。また、サブタイプ E型ウィルス、 CRF0し AEは、感染力が強く今後その感染範囲の拡大が予測されており、そして、サブタイプ D型ウィルスには、劇症型を示すものがある。従って、このようなサブタイプに属するウィルスに対して効果的な薬剤の開発も待望されているのが実情である。

また、エイズ (AIDS)ワクチンには、エイズウイルスのウィルス粒子をそのまま使う生ワクチン、ウィルス粒子の一部分を用いるコンポーネントヮクチン、ウィルス遺伝子の組換えを行って得たリコンビナントワクチン、ウィルスを死滅させてその蛋白構造のみを保った死菌ワクチンなどが研究されている。しかしながら、それらの実用性を考慮すると、 HIV感染の防御効果、すなわち、有効性（免疫能の誘導）のみならず、その安全性も考慮する必要がある。

現在のところ、エイズの治療においては、多剤併用療法（HAART) がよく使われている。 HAART療法が提唱された当時は、画期的な化学療法と言われたが、現在では、薬剤耐性ウィルスの出現、 HIVの高度ゲノム変異、長期および大量服用による副作用などの問題が認知されたこともあって、使用する薬剤の選択および使用方法が極めて複雑になってきている。

HIVは、高度のゲノム多様性を有するウィルスであり、その原因は、主として 2つあると考えられている。

まず第一に、 HIVゲノムの複製エラーによる多様性の増大が挙げられる。通常、ゲノム RNAから逆転写酵素によって DNAが作られ、その後、宿主細胞ゲノムに組み込まれるという複製過程をとつている。逆転写酵素は、 3 '→ 5 'ェキソヌクレア一ゼ活性を欠いているため、複製された塩基配列に対する校正機能を有していない。また、逆転写酵素の基質特異性が低いので、逆転写反応の際に塩基の置換、欠失、挿入、重複などの変異が、極めて高頻度に発生する [Mansky, L. M.， J. Gen. Virol., 79, pp.1337- 1345 (1998)]。しかも、 HIVは、生体内で 10^{9 1G}/日の割合で増殖し [Perelson, A. S. et aし, Science, m, pp.1582-1586 (1996)]、年間 300サイクルの複製が繰り返されていると考えられている。従って、 HIVに感染すると同時に変異の蓄積がはじまり、さらなるゲノムの多様性が生じることとなる。

次に、異系統のウィルス間の遺伝子組換えによる多様性の増大が挙げられる。 HIVが属するレトロウイルスの遺伝学的組換えは、通常、ウィルス粒子内への相同性のある 2つの RNAゲノムの取り込みと、逆転写酵素による铸型乗り換え（te即 late switch) 機能によって奏する強制コピー選択（forced copy choice) [Coffin, J. M. , J. Gen. Virol., 42, pp.1-26 (1979)] と称するメカニズムとによって、高頻度に生じることが知られている [Jetzt, A. E. et a!., J. Virol., 74, pp.1234-1240 (2000)]。従って、このような高度のゲノム多様性を獲得することで、 HIVの準種性、サブタイプの分化、組換えウィルスの出現、薬剤耐性変異、 CTLエスケープ変異などを引き起こすものと考えられている。

HIVは、遺伝学的系統によって、 HIVタイプ 1 (HIV-1) と HIVタイプ 2 (HIV-2) の 2種に大別され、 HIV-1は、さらにグループ M、グループ 0およびグループ Nに分類される。

グループ Mは、 HIV-1の中で最も主要なグループであり、サブタイプ A〜 D、 F〜H、 Jおよび Kの 9種に分類されている。サブタイプ Αおよび F は、それぞれ、サブ-サブタイプ A、 A2および Fl、 F2にさらに分類されている。

なお、サブタイプ Eは、現在のところ、 CRF0し AEとして分類されつつあるので、本明細書では、サブタイプ Eを、「CRF0し AE」（前出）とする。

HIV- 2は、サブタイプ A〜Gに分類されている [Charneau, P. et al., Virology, 205, pp.247-253 (1994) ； Gurtler, L. G. et al.， J. Virol., 68, pp.1581-1585 (1994) ； Simon, F. et ah, Nat. Med., 4, pp.1032- 1037 (1998) ； Triques, K. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, j_6, pp.139-151 (2000) ； Robertoson, D. L. et aし, Science, 288, pp.55-56 (2000) ； Triques, K. et al., Virology, 259, pp.99-109 (1999)]。

また、 HIVの組換えウィルスの分類として、組換え型流行株（CRFs： CRF01 〜CRF12)、孤立型組換えウィルス（URFs： URFsA/C、 URFsA/D、 URFsB/E、 URFsB/C), 帰属不明の組換えウィルス（MAL株）、グループ M/0間組換えウイルスなどが報告されている [Carr, J. K. et al., Virology, 247, pp.22- 31 (1998) ； Motomura, K. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, l^, pp. 1831-1843 (2000) ； Peeters, M. et al., J. Virol., 73, pp.7368-7375 (1999) ； Takehisa, J. et al., J. Virol., 73, pp.6810-6820 (1999) ；武部豊、日本ウィルス学会雑誌， 50(2), pp.123-138 (2001)]。

HIVの糖蛋白質として、エンベロープ糖蛋白質である gpl20と、膜貫通糖蛋白質である gp41とがある。これら糖蛋白質は、ウィルスゲノム状の「env」と称する遺伝子でコードされた gpl60が、宿主のプロテア一ゼで切断されて生じる [Hallenberger, S. et al., Nature, 360, pp.358-361 (1992)]。

gpl20には、 N -結合型糖鎖結合部位が 24箇所存在し [Leonard, C. K. et al., J. Biol. Chem. , 265, pp.10373-10382 (1990)]、糖鎖は gpl20分子の約半分を占めている [Allans, J. S. et al., Science, 228, pp.1091-1094 (1985)] ので、 HIVは糖鎖で覆われたウィルスであるといえる。 HIVの標的細胞への感染には、 gpl20の糖鎖が必要であることが種々の実験により証明されている [Fennie, C. et al., J. Virol., 63- PP.639- 646 (1989) ； Matthews, T. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp.5424-5428 (1987) ； Montef iori, D. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.9248-9252 (1988) ； Pal, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, pp.3384-3388 (1989)]。

ところで、 HIV- 1粒子が細胞に感染する際の作用機構として、まず、細胞膜上の CD4に gpl20が結合し、次いで、コレセプター（ケモカインレセプ夕一）に gpl20の V3ループが結合し、次いで、 gp41が細胞膜に侵入して膜融合を引き起こす、との一連の作用が考えられていいる。これまでに多様なケモカインレセプターが報告されており、例えば、 CCR5 (マクロファージ指向性ウィルスのコレセプター）、 CXCR4 (T細胞指向性ウィルスのコレセプ夕一）、 CCR1、 CCR2b、 CCR3、 CCR4、 CCR8、 CCR9、 CXCR2、 CXCR5、 CXCR 6 /STRL33および CX3CR1などが報告されている。 HI Vの分類方法として、前述した遺伝学的系統による方法の他に、これらケモカインレセプターに基づいて分類する方法もある。例えば、コレセプ夕一として CCR 5を介するウィルスは CCR5 (単に R 5とも称する）指向性ウィルス、コレセプ夕一として CXCR4を介するウィルスは CXCR4 (単に X 4とも称する）指向性ウィルス、同様にして、 CCR1指向性ウィルス、 CCR2b指向性ウィルスなどに分類される。これらの中でも、特に、 R 5指向性ウィルスは、マクロファージ指向性のウィルスであり、また、 X 4指向性ウィルスは、 T細胞指向性ウィルスに分類される。また、 R5X4指向性ウィルスは、マクロマージおよび T細胞の双方に対して指向性を示すウィルスに分類される。

MBPと HIVとの関係に関して、 MBPのホモ遺伝子変異を有するヒ卜において HIVの感染のリスクが高く、また、 AIDS診断後の生存期間が短いことが報告されている [Garred, P. et al., Lancet, 349- ΡΡ· 236-240 (1997)]。しかし、その後、逆に遺伝子変異のあるグループの方が AIDSに移行しにくいという報告 [Mass, J. et al., Aids, 12, pp.2275-2280 (1998) ]がされたり、遺伝子変異と AIDSの予後とは関係ないという報告 [McBride, M. 0. et al., Int. J. STD. AIDS., 9, pp.683-688 (1998)]もされている。さらに、 MBP が、 gpl20と結合することが報告されている [Larkin, M. et al., AIDS, 3， pp.793-798 (1989) ； Mizuochi, T. et al., J. Biol. Chem. , 264, pp. 13834-13839 (1989) ； Saifuddin, M. et aし, L Gen. Virol., 81, pp.949 -955 (2000)]。

しかしながら、 MBPによる抗 HIV作用の有無、それに、 MBPによる HIV増殖抑制作用の有無については全く不明であった。これらは、 MBPを抗 HIV剤として利用する上での有用性を判定する際の最も重要な要素であるにもかかわらず、これまで、一切証明がなされていなかつたことを指し示すものである。また、 MBPの抗 HIV作用を評価できる評価系も存在していなかつたので、 MBPを利用した抗 HIV剤の開発が進展していない状況にあった。

また、 HIVを薬剤治療するにあたって懸念される薬剤耐性ウィルスの出現、 HIVの高度ゲノム変異、長期および大量服用による副作用などの問題が未解決のままである。さらに、ワクチンの開発も困難を極め、特に、サブタイプ Eの研究は全く進んでいないのが実情である。

ところで、 R 5指向性ウィルスは中和抗体によって中和されにくく、病態進行に深く関わっていることが判明している。とりわけ、感染初期における R 5指向性ウィルスに対する治療方法が、患者の予後に重大な影響を及ぼすものと考えられているため、初期感染時での R 5指向性ウィルスへの的確な対処が要求される。また、感染伝播する HIVのほとんどが CCR 5指向性ゥィルスであることから、 CCR 5が、予防治療や感染 ·伝播抑制の標的としても注目を浴びている。一方で、臨床経過が進行して病態が後期段階に近づくにつれて、 CCR 5指向性ウィルスから CXCR 4指向性ウィルスへの移行が進み、後期段階に至ると、 CXCR 4指向性ウィルスの存在が顕著となることが知られている。

このようなケモカインレセプターの存在が判明したのはごく最近であり、これらケモカインレセプ夕一を標的とする治療薬の開発は、未だ基礎研究段階でしかない。これらケモカインレセプ夕一の阻害剤についての開発も行われているが、 CCR 5阻害薬を投与した場合には、 CXCR 4指向性ウィルスの出現を速め、病態進行の助長に至ることが危惧されているなど、懸念すべき重大な問題が未解決のままとなっている。

それゆえ、臨床医からは上記した一連の問題を回避でき、しかも、安全でかつ HIVウィルスのサブタイプ、ケモカインレセプターに対する指向性、それにマクロファージゃ T細胞への指向性などの諸要素に関係なく抗 H I V作用を示す薬剤の開発が切望されているのである。

とりわけ、サブタイプ B型ウィルス、 CRF01— AE、サブタイプ D型ウィルスに対して抗ウィルス作用を示す薬剤の開発、それに、 CCR 5指向性ウィルス、 CXCR 4指向性ウイルス、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウイルスに抗 HI V作用を示す薬剤の開発が望まれているのである。そして、同様に、マクロファージ指向性ウィルス、 T細胞指向性ウィルス、マクロファージ T細胞指向性ウィルスに対して抗 HIV作用を示す薬剤の開発も待望されているのである。発明の開示

本発明は、上記従来技術で指摘されていた問題点に鑑みて発明されたものであり、とりわけ、本発明者らは、 MBPの抗 HIV作用を定量可能な評価系を初めて確立したのである。また、その評価系を利用することで、 MBPによる抗 HIV作用、つまり、 HIV増殖抑制作用を初めて証明して、抗 HIV剤としての MBPの用途を切り開いたのである。そして、本発明者らは、 MBPが、サブ夕イブ E型 HIVは勿論、その他のクレイド（サブタイプ）に属する HIVに対しても抗 HIV作用を示すことを証明したのである。

すなわち、本発明の要旨とするところは、 MBPを有効成分とする抗 HIV剤にある。 MBPを有効成分とする本発明の抗 HIV剤によれば、 MBPの標的が糖鎖であるため、 HIVゲノム変異による MBP耐性株の出現による影響を受けにくい点で有利である。また、 MBPは、生体に常在する物質であるため、従来の化学療法に使用される化合物で認められる副作用が生じないという利点がある。

そして、本発明の他の態様によれば、抗 HIV作用の評価方法、すなわち、 ( 1 ) 標的細胞と HIVとを共存せしめて得られた感染細胞を培養し、 ( 2 ) 培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、

( 3 ) 清浄細胞を MBPの存在下で培養し、および

( 4 ) 培養上清中の HIV由来の p 24蛋白を測定する、

工程を含んだ、 MBPが奏する抗 HIV作用の評価方法も提供される。また、本発明の別の態様によると、抗 HIV作用の他の評価方法、すなわち、

( a ) HIVと MBPとが共存する第一混合系を培養し、

( b ) 標的細胞と MBPとが共存する第二混合系を、好ましくは、第一混合系と並行して培養し、

( c ) 第一混合系と第二混合系とを合一して感染細胞を得、

( d ) 得られた感染細胞を培養し、

( e ) 培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、

( f ) 清浄細胞を、好ましくは、 MBPの存在下で培養し、および

( g ) 培養上清中の HIV由来の p 24蛋白を測定する、

工程を含んだ、 MBPが奏する抗 HIV作用の評価方法も提供される。

これら評価方法によって、 MBPが潜在的に保有している抗 HIV作用が、客観的に容易に確認および検証することが可能となる。図面の簡単な説明

第 1図は、 HIV感染細胞 NDK/M8166における組換え型マンノース結合タンパク質（rMBP)と HIV活性との相関を示すグラフである。

第 2図は、 HIV感染細胞 LP65/M8166における組換え型マンノース結合タンパク質（rMBP)と HI V活性との相関を示すグラフである。

第 3図は、 HIV感染細胞 NDK/M8166における天然型マンノース結合タンパク質（nMBP)と H I V活性との相関を示すグラフである。

第 4図は、マンノース結合タンパク質の構造を示す概略図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の抗 HIV剤は、有効成分として用いた MBPが奏する HIV増殖抑制作用、例えば、 HIV中和作用や HIV発芽抑制作用などを利用するものであるため、ェィズ患者および HIV感染者の治療および病態進行の抑制に有用である。

また、本発明の抗 HIV剤での有効成分である MBPは、天然物および合成物（組換体を含む）の別を問わず、所定の HIV増殖抑制作用を奏するものであればいずれでも可能である。とりわけ、 MBPとして、ヒト血清から単離および精製された MBPや、動物細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣 (CH0)細胞（以下、単に、「(； H0細胞」と称する）から遺伝子工学的に分泌された MBPが、本発明において好適に利用可能である。

本発明で適用可能な MBPの一つである組換え型ヒトマンナン結合タンパク質（以下、単に「rhMBP」と称する）は、例えば、国際公開公報第 W0 99/ 37676 号を参照すれば、以下の工程、すなわち、（i) 天然型ヒトマンナン結合タンパク質（以下、単に「nhMBP」と称する）の cDNAの塩基配列（配列番号： 1) の 66bp〜812bpに対応する 747個の連続するポリヌクレオチド（配列番号： 2) をプラスミド pNOWlに揷入して、発現ベクター pNOWl-hMBPを構築し、（ii) 発現べクタ一 pNOWl-hMBPを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（dhfr) の CH0細胞に導入して形質転換体を得、（iii) 得られた形質転換体をネオマイシンを含んだ培養培地にて培養して、ネオマイシン耐性細胞を取得し、 (iv) 選択したネオマイシン耐性細胞をメトトレキセート（MTX)を含んだ培養培地にて培養して、メトトレキセート耐性の細胞を取得し、および）選択したメトトレキセ一ト耐性細胞から rhMBPを回収する、との一連の工程を経ることによつて製造可能である。

前述した製造方法の詳細は、以下のように説明される。

まず、発現べクタ一 pNOWl- hMBPの構築を行う。 nhMBPを構成するァミノ酸は、 Hermanらによって、すでに解析および報告されている [Sastry et al., The human mannose - binding protein gene. Exonstructure reveals its evolutionary relationship to a human pulmonary surfactant gene and localization to chromosome 10" , J. Exp. Med. 170(4), pp.1175-1189 (1989)]。 nhMBPを構成するアミノ酸配列を、配列番号： 3に示した。

これら配列情報を踏まえて、ヒト肝臓 cDNAライブラリー（クローンラック社製）から、 nhMBPの開始コドンからストップコドンまでを増幅させ、得られた nhMBPの cDNAを制限酵素で消化して、 nhMBPの cDNAの 66〜812bpに対応する 747個の連続するポリヌクレオチド（配列番号： 2) を取得し、これを挿入体とする。次に、発現ベクター PN0W1を、制限酵素で消化して、 pCMVと BGPポリ Aの間に、前述の挿入体を DNAライゲーシヨンキット（宝酒造製）を用いて挿入する。このようにして得られた発現ベクターを、プラスミ pNOW 1-hMBPと命名する。

次に、発現クローンの選択を行う。ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（dhfr) の CH0細胞への発現ベクター pNOW 1 - hMBPの導入は、以下のようにして行う。ゥシ胎児血清添加 IMDM培地（GIBC0社）を調製し、これに（dhfr—) DG44 CH0 細胞株を混合し、 37 で、 5%炭酸ガスの条件下で、 24時間培養する。培養上清を廃棄して、その代わりに、発現ベクター pNOWl- hMBPをリボフェクチン溶液に混合して、これに予め調製しておいた溶液を含む FCS添加 IMDMを加え、さらにヒポキサンチン（GIBC0社製）とチミジン（GIBC0社製）を加えた後に培養を行って、 dhfr—の宿主 CH0細胞への発現ベクター pNOW 1- hMBPの導入を行う。その後、培養上清を廃棄し、 FCS、ヒポキサンチン、チミジン添加 IMDMを加え、さらに培養を行う。

ネオマイシン（G418) 耐性 CH0細胞を取得するために、発現べクタ一 pNOW 1-hMBPが導入された細胞を培養した後、これをトリプシン処理し、ネオマイシン（G418) を含む FCS添加 IMDMで細胞を懸濁する。この懸濁物を、その後、マイクロプレートに播種し、 37°C、 5 %炭酸ガス（CO2)の条件下で、 2週間培養することで、ネオマイシン耐性の細胞（クローン）が出現する。 rhMBPの産生が確認されたクローンの中からいくつかを選択し、各クローンの培養を行う。各培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成の FCS添加 IMDMを加え、 4日間培養し、その培養上清を回収する。回収した培養上清中の rhMBPの産生量を測定する。なお、 rhMBPの産生量は、対照としての nhMBP, コレクチンの糖認識領域（CRD)とネック領域に対する（大腸菌で発現させた）抗ゥサギポリクローナル抗体および nhMBP (定量対象）を用いて、鈴木らの方法 [Y. Suzuki, et al. , 'Characterization of Recombinant Bovine Conglut inin Expressedin a Mammalian Cell", Biochem. Biophys. Res. Coimun. , 238, pp.856-863 (1997)] に準じて定量することができる。メトトレキセート耐性の CH0細胞の取得には、 rhMBP産生クローンをさらに継代培養して安定化させた後、低濃度のメトトレキセートを培地に加えて遺伝子増幅を行う。まず、メトトレキセート、ネオマイシン（G418) を加えた 10%透析済 FCS (IRHバイオサイエンス社製）添加 IMDMに、選択した各細胞クローンを混合し、播種した。 37 、 5 %炭酸ガス（C02) の条件下で、 2週間培養を行うことにより、メトトレキセート耐性の細胞（クローン）が現れる。これらメトトレキセ一ト耐性のクローンの rhMBP産生性を確認すると、高水準の産生レベルが確認される。

これらクローンから任意のクローンを選択し、それぞれを播種し、 2週間培養する。培養上清を廃棄し、前出のものと同じ組成の FCS添加 IMDM (メトトレキセ一ト、ネオマイシン（G418) を加えたもの）を加え、 4日間培養し、その培養上清を回収し、 rhMBPの産生レベルを確認する。

rhMBPを精製するために、得られたクローンの中で最も産生効率の高いクローンを、播種し、培養する。そして、培養上清を廃棄し、メトトレキセート、ネオマイシン（G418) を含む CHO- S- SFM I I培地（ビタミン Cを添加する場合は終濃度が l OOmMになるようにビタミン Cを添加）を加え、 4日間培養する。その培養上清を回収し、 TBS (TBS powder (宝酒造社製）より調製）に対して透析を行い、次いで、 TBSC ( 5 mM CaC h、 TBS) に対して透析を行う。その後、マンナン—ァガロース（S IGMA社製）により精製を行う。すなわち、マンナン—ァガロースをカラム（Co lumn PD-10、 Empty, フアルマシァ社製）に詰め、そこに透析済の培養液を通し、 TBSCで洗浄後、 TBSE (10 m EDTA, TBS) で溶出する。溶出後、終濃度が 15mMになるように 1M CaCh を加える。そして、再度、マンナン—ァガロースに適用し、 TBSCで洗浄後、 l OOmMのマンノースを含む TBSで溶出する。その後に、改めて、 TBSCに対して透析を行って、 rhMBPの精製品を得る。

このようにして得られた精製 rhMBPは、ゲル濾過クロマトグラフィ一で処理した際の 280nmでの吸光度が、 1， 000〜1， 300kDaの分子量、特に l，150kDaの分子量にて特異的なピークを示す。また、 200〜400kDaの分子量、特に 300 kDaの分子量にて特異的なピークを示す。なお、 rhMBPのゲル濾過クロマトグラフィ一分析は、 20mM Tr i s-HC l (pH 8. 0)、 0. 15mM NaCK 5 mM EDTAを用レ^ 流速 0. 5ml /分で、スーパーロース 6 HR10/30 ( φ l OmmX長さ 300誦；フアルマシア社製）の条件で実施する。そして、 40 ^ gの rhMBPを、このカラムに流し、 280nmの吸光度で測定する。

なお、国際公開公報第 W0 99/37676 号に記載の方法に従って合成された rhMBPを、本発明の抗 HIV剤の有効成分として使用する場合には、前出の精製 rhMBPを用いるのが好ましい。この精製 rhMBPを、さらにゲル濾過クロマトグラフィ一に適用した際に得られる、 280nmでの吸光度測定によって、 1 , 000 〜l , 300kDaの分子量に現れる分画物、 200〜400kDaの分子量に現れる分画物、またはこれら分画物の双方を含む精製 rhMBPを用いることもできる。

そして、本発明の抗 HIV剤は、いずれのタイプの HIV株に対しても有効に作用するものであるが、後述の実施例の記載からも明らかなように、 HIV- 1のグループ Mのサブタイプ Bに属する HIVの他、 HIV- 1のグループ Mのサブ夕イブ Dに属する HIVや、組換え型流行株、特に、 CRF01— AE株に対して顕著な抗 HIV作用を奏する。

また、本発明の抗 HIV剤は、 CCR 5指向性ウィルス、 CXCR 4指向性ウィルス、および CCR 5 /CXCR 4指向性ウィルスに対しても顕著な抗 HIV作用を奏する。さらに、本発明の抗 HIV剤は、マクロファージ指向性ウィルス、 T細胞指向性ウィルス、およびマクロファージ/ T細胞指向性ウィルスに対しても、同様に顕著な抗 HIV作用を呈する。

本発明の抗 HIV剤を、エイズ治療剤または HIV感染の病態進行抑制剤として用いる場合、生体へのタンパク質の取り込みに好都合な剤型および投与経路 (静脈内投与など）を選択するのが好ましい。例えば、本発明の医薬組成物の投与方法として、静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与、経口投与などが適宜選択でき、その投与方法に応じて、種々の形態の製剤として用いることができる。以下に、静脈投与製剤について記載するが、本発明において用いられる剤型は、これらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種製剤を利用することができる。

日本人（479例）における MBPの遺伝子変異および ώ中 MBP濃度を検討したところ、 ΜΒΡの遺伝子変異は、コドン 54 (GGC→GAC) にのみ認められ、各ジエノタイプの比率は、 Wild/Wildで 70.8%、 Wi ld/mutantで 22.5%、 mutant/ mutantで 6.7%であることが報告されている。また、血中 MBP濃度は、 Wild /Wildで 0.18〜4.35^g/ml (平均 1.26 g/ml)、 Wi ld/mutantで 0.00〜0.80 zg /ml (平均 0.23/ g/ml)、 nmtant/mutanatで 0.00〜0· 20 g/ml (平均 0.04 g/ ml) であることも報告されている [芥子宏行ら、医学のあゆみ， 194(12), pp.957-958 (2000)]。

本発明の抗 HIV剤を、エイズ治療剤または HIV感染後の病態進行抑制剤として用いる場合、本発明の抗 HIV剤の静脈内投与量は、健常人の血中 MBP濃度が約 1 g/ml〜約 1.5 g/mlであるので、血中 MBP濃度を ELISAなどの手法により測定した後、 C型肝炎などの肝障害により MBPの産生量が低下したり、あるいは遺伝子変異によって血中濃度が低い場合には、まずは、血中 MBP濃度を約 1 g/ml〜約 1.5 g/mlとなるように投与量を決定してもよい。そして、 HIV-RNA量および CD4陽性細胞数を定期的にモニタリングし、モニタリングの結果と MBP投与量との関係を把握した上で、有効血中 MBP濃度値を決定する必要がある。血中 MBP濃度が正常値であれば、徐々に血中濃度を高くして（例えば、約 1.5/ g/nil〜約 5.0 g/ml)、 HIV- RNA量および CD 4陽性細胞数を定期的にモニタリグし、モニタリングの結果と MBP投与量との関係を把握した上で、有効血中 MBP濃度値を決定すればよい。

MBPの有効血中濃度は、個人が生来有する血中 MBP濃度に左右されるため一定するものではないが、好ましくは、約 1.0 g/ml〜約 50 g/ml、より好ましくは、約 1.5 ig/ml〜約 10/xg/mlに設定するのが好ましく、投与直前または投与直後の血中濃度は、これらの範囲外であってもよい。さらに、遺伝子変異によっても、血中 MBP濃度の低下が認められることから、 MBPの投与量は、遺伝子変異も考慮して決定すべきである。また、その剤型（経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤型）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を、製剤原料として加えることができる。

このような添加剤の具体例を、以下に例示するが、これらに限定されるものではない。

溶剤：精製水、注射用水、生理食塩水、ラッカセィ油、エタノール、グリセリン。

賦形剤：デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール。

コーティング剤：白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロース、および上 ' 掲の高分子賦形剤。

基剤：ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤。

結合剤：デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビエルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ。

滑沢剤：ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、コムギデンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール。

崩壊剤：デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルポキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース。

保緩等溶無解補助剤シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコ痛張ール、ポリエチレングリコール。

¾存

懸濁化匕匕剤アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、斉斉斉モノステアリン酸アルミニウム、クェン酸、各種界面活性剤。

粘稠剤カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、ァルギン酸ナトリウム。

乳化剤アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン。

安定剤亜硫酸水素ナトリウム、ァスコルビン酸、トコフエ口ール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質。

リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸。塩化ナトリウム、ブドウ糖。

塩酸プロ力イン、リドカイン、ベンジルアルコール。安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブ夕ノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フエノール、チロメサール。

味剤白糖、サッカリン、カンゾゥエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン。

芳香剤トウヒチンキ、ローズ油。

着色剤水溶性食用色素、レーキ色素。

本発明の抗 HIV剤は、上掲した成分に加えて、製薬上許容される塩を含有することも可能である。製薬上許容される塩 (類）としては、例えば、無機塩基、有機塩基等の塩基との塩、無機酸、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸などの酸付加塩等が挙げられる。このような塩 (類）の具体例を、以下に例示するが、これらに限定されるものではない。

無機塩基：ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム、ァンモニゥム等。

有機塩基エタノールアミン等の第一級ァミン、ジェチルァミン、ジエタノールァミン、ジシクロへキシルァミン、 Ν，Ν' - ジベンジルエチレンジァミン等の第二級ァミン、トリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールァミン等の第三級ァミン。

塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸。

有ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルォロ酢酸、フマール酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、 Ρ-トルエンスルホン酸。塩基性アミノ酸アルギニン、リジン、オル二チン。

酸性アミノ酸ァスパラギン酸、グルタミン酸。実施例

以下に、本発明を実施例に沿って具体的に説明するが、これら実施例の開示によって本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

ところで、以下の実施例において実証された抗 HIV作用の語は、 HIVに対する中和作用のみならず、 H I Vに対する発芽抑制作用をも包含するものであるが、便宜上、単に「中和作用」と記載する。

また、実施例 1および 2で用いた HIV株の詳細を、表 1にまとめた。ウィルス株指向性ケモカインレセ： r夕- サブタイプ

9 2 Th 0 1 4 マクロファージ CCR5 B

J RC S F マクロファージ CCR5 B

LP 6 5 マクロファ-シ 'ZT細胞 CCR5 CXCR4 E

NDK マクロファ - ZT細胞 CCR5/CXCR4 D 実施例 1

本実施例では、 MBPによる抗 HIV活性を検討した。

まず、 HIV株として、 HIV-NDK実験株（サブタイプ D ；以下、単に「NDK」と称する）と、組換え型流行株 CRF0し AE (臨床分離株；以下、単に「LP65」と称する）とを準備した。

次に、これら HIV株で、フィトへマグルチニン (phytohemagglutinin(PHA)) でブラスト化したヒト末梢血単核球（ヒト PBMC ;以下、単に「PBM (；」と称する）と T細胞系の株化細胞 M8166 (以下、単に「M8166」と称する）を、それぞれ感染させた。

なお、 NDKと M8166の双方は、米国国立衛生研究所（NIH)の AIDS Research and Reference Regent Programより入手可能な株である。

ところで、 MBPとしては、ヒト血液より精製した nhMBPと、国際公開公報第 W0 99/37676 号に記載の方法により合成された rhMBPを用いた。

劇症型ウィルスである NDKを、 PBMCおよび M8166にそれぞれ添加し、これらを、 37°Cで、 1時間培養して感染させて得られた感染株を、それぞれ NDK/ PBMCおよび NDK/M8166と称する。また、 LP65を、 PBMCおよび M8166にそれぞれ添加し、これらを 37 で、 1時間培養することによって HIV感染させた。なお、 NDKおよび LP65の双方共に、 100 TCID₅。のウィルスに相当する量を、 5 X10⁶個/ mlの細胞に対して添加した。得られた感染細胞を、それぞれ「LP 65/PBMCj および「LP65/M8166」と命名した。その後、感染細胞を、 PBSで 2回洗浄した。次に、 4種のウィルス感染細胞 (NDK/PBMC, 醒細 66、 LP65/PBM LP65/M8166) に、 nhMBPまたは rhMBPを、 l〜100 g/mlの濃度（図 1 ) または 1〜30 g/mlの濃度（図 2〜図 3 ) で添加した。この時の細胞の濃度は、 200 1当たり 1 X 10⁶個/ mlの濃度（すなわち、 2 X 10⁵個/ 200 1 ) である。つまり、 1/5規模の 200 1 の系内に、 MBP 1〜100 g/ l X 10⁶個/ mlまたは MBP 1〜30 g/ 1 X 個/ ml の濃度の細胞を置き、これをヒト血清添加培地で、 37で、 5 %炭酸ガス存在下、 1週間培養した。培養後のウィルス量の変化の指標として、培養上清中の HIV由来の p 24抗原量を全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルス f ：富士レビォ社製）を用いて EL I SA測定し、 MBP非添加群と比較した。その結果、図 3に記載のグラフにあるように、 nhMBP添加群にて HIV量の抑制（HIV増殖抑制）が認められた。また、図 1に記載のグラフから見てとれる通り、 NDK/M8166については、 rhMBP濃度が 10 g/ml〜30 g/mlの場合、培養上清中の p 24抗原量が、培養後速やかに rhMBP非添加群の約 50 %にまで抑制されていたことが確認された。さらに、図 2に記載のグラフから明らかなように、臨床分離株 LP65 (HIV- 1の組換え型流行株 CRF0し AE) についても、 rhMBPは、 LP65を濃度依存的に中和する I C50が、約 10 g/mlの濃度で抗 HIV効果（HIV増殖抑制効果）が認められ、つまり、その抗 HIV作用（中和作用）はサブタイプに関係なく認められた。

また、使用した MBP濃度範囲においては、 nhMBPおよび rhMBPのいずれでも、細胞に対する顕著な増殖抑制や細胞毒性は認められなかった。加えて、本実験系においては、 HIVの発芽抑制作用、つまり、感染細胞からの HIVの放出抑制作用も示唆されていた。

以上のことから、本発明の抗 HIV剤が、サブタイプ E型 HIVおよびサブタイプ D型 HIVの双方に対して抗 HIV作用を示すことが明らかとなった。同様に、本発明の抗 HIV剤が、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウィルス、それに、マクロファージ/ T細胞指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を示すことも明らかとなつたのである。実施例 2

HIV株として、 92Th014実験株（サブタイプ B ) と JRCSF実験株（サブタイプ B ) を準備した。なお、これら実験株は、そのいずれもが、米国国立衛生研究所の AIDS Research and Re f erence Regen t Programより入手可肯である。また、 PBM nhMBPおよび rhMBPは、実施例 1に記載のものを用いた。まず、 100 TCID₅。の力価に相当するウィルス溶液 50 ^ 1と、その終濃度を 2、 6、 20、 60 g/mlの濃度とした nhMBPまたは rhMBPの溶液 50 1とを混合した。次いで、この混合溶液を、 37T：、 5 %炭酸ガス存在下で、 1時間培養して、 nhMBPまたは rhMBPの終濃度が 1、 3、 10、 30 Ai g/mlに調整された第一混合系を調製した。

これと並行して、 PBMCを 2 X 10⁵個/ 50 ^ 1の濃度に調整し、これに、その終濃度を 2、 6、 20、 60 g/mlの濃度とした nhMBPまたは rhMBPの溶液 50 1 とを混合した。次いで、この混合溶液を、 37°C、 5 %炭酸ガス存在下で、 1時間培養して、 nhMBPまたは rhMBPの終濃度が 1、 3、 10、 30 g/mlに調整された第二混合系を調製した。

次に、双方の MBP濃度（終濃度）が共に 1、 3、 10、 30 g/mlのいずれかに調整された第一混合系と第二混合系液とを合わせて、 37°Cで一昼夜培養した後、未反応の MBPとウィルスを洗浄除去した。洗浄後、洗浄前の MBP終濃度と同じになるように、新鮮な nhMBPまたは rhMBPを添加し、 10%FCS含有 RPMI 培地（インタ一ロイキン— 2を 20単位 /ml、ペニシリンを 50単位 /ml、ストレプトマイシンを 50単位/ ml含有）で 7日間培養した。培養後のウィルス量変化の指標として、培養上清中の HIV由来の p 24抗原量を、全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルス f ：富士レビォ社製）を用いて EU SA測定し、 MBP非添加群と比較した。

その結果、野生株ウィルスである JRCSFおよび 92Th014のいずれのウィルスに対しても有意な抗 HIV活性（HIV増殖抑制活性）が認められた。 p 24抗原量を半減させるのに必要な MBPの量（50 %抑制濃度）は、〗RCSFの場合、 nhMBPで 0. 19 g、 rhMBPで 2. 74 / g以下であった。同様に、 92Th0 の場合、 nhMBPで 7 g、 rhMBPで 1. 57 /i g以下であった。これらのことから、 MBPは、野生型サブタイプ Bのウィルス株に対しても優れた抗 HIV活性（中和活性）を示すことが明らかとなった。

また、本実施例での結果から、本発明の抗 HIV剤は、 CCR 5指向性ウィルス、それに、マクロファージ指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を示すことが明らかとなった。さらに、本実施例にあっては、 MBPが CCR 5指向性ウィルスに対して抗 HIV用を示すことを直接的に証明していることから、 MBPを HIV 感染初期の治療のみならず、予防治療や感染 ·伝播抑制に対しても効果的に使用できることが判明したのである。さらに、本実施例では、本発明の抗 HIV剤が、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を呈することを直接的に証明できたことから、 HIV感染の感染初期のみならず、臨床経過が進行した病態においてもなお（つまり、 HIV感染者のみならず HIV患者にも）効果的であることが明らかになつたのである。

実施例 1および実施例 2で得られた結果から、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウイルスに対して抗 HIV作用を示した MBPは、 CCR 5指向性ウィルスに対しても同様の抗 HI V作用を示したことから、 MBPは CXCR 4指向性ゥィルスに対しても抗 HIV作用を示すものと考えられる。同じく、マクロファージ T細胞指向性ウィルスに対して抗 HIV作用を示した MBPは、マクロファージ指向性ウィルスに対しても同様の抗 HIV作用を示したことから、 MBPは T細胞指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を示すものと考えられる。

実施例 1および実施例 2での実験結果から、本発明の抗 HIV剤が、 CCR 5指向性ウィルス、 CXCR 4指向性ウィルス、それに、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を示すことが明らかになつたのである。加えて、本発明の抗 HIV剤は、マクロファージ指向性ウィルス、 T細胞指向性ウィルス、そして、マクロファージノ T細胞指向性ウィルスに対して抗 HIV作用を示すことも判明したのである。産業上の利用可能性

MBPを有効成分とする本発明の抗 HIV剤は、活性の中和が最も困難とされている組換え型流行株 CRF0し AEウィルスを含む多様な HIV株に対して中和活性を示す。つまり、本発明の抗 HIV剤は、ウィルスのサブタイプ、ケモカインレセプ夕一指向性、マクロファージ ZT細胞指向性の種類 ·程度に関係なく、とりわけ、現在のところ最も懸案となっている、サブタイプ B型 HIV、サブタイプ D型 HIV、それに、 CRF01— AEに対して所定の抗 HIV作用を呈する。また、本発明の抗 HIV剤は、 CCR 5指向性ウィルス、 CXCR4指向性ウィルス、それに、 CCR 5 /CXCR 4指向性ウィルスに対しても抗 HIV作用を示す。さらに、本発明の抗 HIV剤は、マクロファージ指向性ウィルス、 T細胞指向性ゥィルス、そして、マクロファージ細胞指向性ウィルスに対しても抗 HIV 作用を示す。

また、本発明の抗 HIV剤は、糖鎖を標的にしているため、 HIVゲノム変異による MBP耐性株の出現の可能性が小さい。それに加えて、 MBP自体が生体内に常在するため、従来の HIV治療で利用されていた化合物に認められた副作用もない。

このように、本発明の抗 HIV剤は、 HIVを原因とする感染症に多様に対応可能であり、その治療において極めて有用なものである。

Claims

請求の範囲

1. マンノース結合タンパク質（MBP) を有効成分とする抗 H I V剤。

2. 前記 MB Pが、 H I V増殖抑制作用を有する請求項 1に記載の抗 H I V 剤。

3. 前記増殖抑制作用が、 H I V中和作用である請求項 2に記載の抗 H I V 剤。

4. 前記増殖抑制作用が、 H I V発芽抑制作用である請求項 2に記載の抗 H I V剤。

5. 前記 MB Pが、ヒト血清から単離および精製される請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

6. 前記 MBPが、動物細胞から遺伝子工学的に分泌される請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

7. 前記動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項 6に記載の抗 H I V剤。

8. 前記 H I Vが、 H I Vタイプ 1のグループ Mのサブタイプ Bに属する H I V株である請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

9. 前記 H I Vが、 H I Vタイプ 1のグループ Mのサブタイプ Dに属する H I V株である請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

10. 前記 H I Vが、組換え型流行株である請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

11. 前記組換え型流行株が、 CRF0し AEである請求項 10に記載の抗 H I V剤。

12. 前記 H I Vが、 CCR 5に対して指向性を有するウィルスである請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

13. 前記 H I Vが、 CXCR 4に対して指向性を有するウィルスである請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

14. 前記 H I Vが、 CCR 5および CXCR 4の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

15. 前記 H I Vが、マクロファージに対して指向性を有するウィルスである請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

16. 前記 H I Vが、 T細胞に対して指向性を有するウィルスである請求項 1 または 2に記載の抗 H I V剤。

17. 前記 H I Vが、マクロファージおよび T細胞の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項 1または 2に記載の抗 H I V剤。

18. MB Pの抗 H I V作用の評価方法であって、以下の工程、すなわち、 (1) 標的細胞と H I Vとを共存せしめて得られた感染細胞を培養し、

(2) 培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、

(3) 清净細胞を MB Pの存在下で培養し、および

(4) 培養上清中の H I V由来の p24蛋白を測定する、工程を含む、ことを特徴とする MB Pの抗 H I V作用の評価方法。

19. MB Pの抗 H I V作用の評価方法であって、以下の工程、すなわち； (a) H I Vと MB Pとが共存する第一混合系を培養し、

(b) 標的細胞と MB Pとが共存する第二混合系を培養し、

(c) 第一混合系と第二混合系とを合一して感染細胞を得、

(d) 得られた感染細胞を培養し、

(e) 培養した感染細胞を洗浄して清浄細胞を得、

(f ) 清浄細胞を培養し、および

(g) 培養上清中の H I V由来の p24蛋白を測定する、

工程を含む、ことを特徴とする MB Pの抗 H I V作用の評価方法。

20. 前記工程（a)および（b)が、並行して実施される請求項 19に記載の評価方法。

21. 前記工程（f)が、清浄細胞を MB Pの存在下で培養する請求項 19または 20に記載の評価方法。

22. 前記抗 H I V作用が、 H I V増殖抑制作用である請求項 18または 19に記載の評価方法。

23.前記増殖抑制作用が、 H I V中和作用である請求項 22に記載の評価方法。

24. 前記増殖抑制作用が、 H I V発芽抑制作用である請求項 22に記載の評価方法。

25. 前記 MBPが、ヒト血清から単離および精製される請求項 18または 19に記載の評価方法。

26. 前記 MB Pが、動物細胞から遺伝子工学的に分泌される請求項 18または 19に記載の評価方法。

27. 前記動物細胞が、チャイニーズ八ムスター卵巣細胞である請求項 26に記載の評価方法。

28. 前記 H I Vが、 H I Vタイプ 1のグループ Mのサブタイプ Bに属する H I V株である請求項 18または 19に記載の評価方法。

29. 前記 H I Vが、 H I Vタイプ 1のグループ Mのサブタイプ Dに属する H I V株である請求項 18または 19に記載の評価方法。

30. 前記 H I Vが、組換え型流行株である請求項 18または 19に記載の評価方法。

31. 前記組換え型流行株が、 CRF0し AEである請求項 30に記載の評価方法。

32. 前記 H I Vが、 CCR 5に対して指向性を有するウィルスである請求項 18または 19に記載の評価方法。

33. 前記 H I Vが、 CXCR 4に対して指向性を有するウィルスである請求項 18または 19に記載の評価方法。

34. 前記 H I Vが、 CCR 5および CXCR4の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項 18または 19に記載の評価方法。

35. 前記 H I Vが、マクロファージに対して指向性を有するウィルスである請求項 18または 19に記載の評価方法。

36. 前記 H I Vが、 T細胞に対して指向性を有するウィルスである請求項 18 または 19に記載の評価方法。

37. 前記 H I Vが、マクロファージおよび T細胞の双方に対して指向性を有するウィルスである請求項 18または 19に記載の評価方法。

38. 請求項 18または 19に記載の評価方法によって決定された抗 H I V作用を有する MBP。

39. MBPを有効成分とする抗 H I V剤の H I V感染者への使用。

40. 前記 H I V感染者が、 CCR 5に対して指向性を有するウィルスによる罹患者である請求項 39に記載の抗 H I V剤の使用。