WO2003093476A9 - Vecteur avec tropisme dependant de la protease modifie - Google Patents

Vecteur avec tropisme dependant de la protease modifie

Info

Publication number
WO2003093476A9
WO2003093476A9 PCT/JP2003/005528 JP0305528W WO03093476A9 WO 2003093476 A9 WO2003093476 A9 WO 2003093476A9 JP 0305528 W JP0305528 W JP 0305528W WO 03093476 A9 WO03093476 A9 WO 03093476A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
virus
cells
protease
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/005528
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003093476A1 (fr
Inventor
Hiroaki Kinoh
Makoto Inoue
Yasuji Ueda
Akihiro Iida
Mamoru Hasegawa
Masanori Kobayashi
Original Assignee
Dnavec Research Inc
Hiroaki Kinoh
Makoto Inoue
Yasuji Ueda
Akihiro Iida
Mamoru Hasegawa
Masanori Kobayashi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP03728016.1A priority Critical patent/EP1505154B1/en
Priority to CN038155745A priority patent/CN1665932B/zh
Priority to CA2484538A priority patent/CA2484538C/en
Priority to KR1020047017455A priority patent/KR101058294B1/ko
Priority to US10/513,094 priority patent/US7402427B2/en
Priority to AU2003234775A priority patent/AU2003234775A1/en
Application filed by Dnavec Research Inc, Hiroaki Kinoh, Makoto Inoue, Yasuji Ueda, Akihiro Iida, Mamoru Hasegawa, Masanori Kobayashi filed Critical Dnavec Research Inc
Priority to JP2004501612A priority patent/JP4448440B2/ja
Publication of WO2003093476A1 publication Critical patent/WO2003093476A1/ja
Publication of WO2003093476A9 publication Critical patent/WO2003093476A9/ja
Priority to HK06102193.5A priority patent/HK1081996A1/xx
Priority to US12/140,715 priority patent/US7709621B2/en
Priority to US12/712,905 priority patent/US20100297732A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18822—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a cell fusion type vector in which protease-dependent topology is modified and a method for producing the same.
  • the vector of the present invention is useful as a gene therapy vector that specifically infects cancer.
  • SeV Sendai virus
  • Paramyxovirus vectors are vectors that enable a high introduction rate and high expression of foreign genes, and are also expected as cancer gene therapy vectors.
  • Many attempts have been made to treat cancer with paramissovirus. For example, infection of BHK21 cells with Mumps virus has been reported to show anticancer effects in tumor-bearing nude mice (Minato, N. et al. (1979) J. Exp. Med. 149, 1117-1133) .
  • metastasized cancer may be matrix metabolite protease (MMP) and / or plasminogen activator.
  • MMP matrix metabolite protease
  • UPA tPA
  • tPA plasminogen activator
  • the present invention provides a novel cell fusion vector in which protease-dependent tropism is modified and infiltrates surrounding cells only in the presence of a specific protease, and a method for producing the same.
  • Paramyxoviridae viruses including Sendai virus, have two proteins in their envelopes.
  • the F (fusion) protein causes membrane fusion between the virus and its host cell and releases the nucleoside psid into the cytoplasm.
  • HN (hemagglutini n-neuraminidase) protein has a neuraminase activity with hemagglutination ability and plays a role in binding to host receptors.
  • the F and ⁇ proteins are also called spike proteins and are exposed on the surface of the viral envelope.
  • the M (matrix) protein also lines the envelope and adds strength to the virus particle. The feature of this vector is that it can efficiently transfect a wide range of cells and animal tissues. Compared to one, it has achieved a higher amount of effort. '
  • the F protein (F0) does not show cell fusion activity as it is, but only shows its fusion activity when cleaved by a host-derived protease and decomposed into F1 and F2.
  • the growth of viruses with wild-type F protein is restricted to tissues such as airway mucosal epithelium that express a trypsin-like protease that can cleave this protein.
  • various studies have been conducted on the modification of the fuzzy or fusing ability of F.
  • mutants with F that cleave only with ⁇ -chymotrypsin lose trypsin sensitivity, and its tropism has been shown to be specific to the cleavage sequence of F (Tashiro, M.
  • the vector 1 can be infected and propagated in a specific tissue or the like that expresses a certain protease.
  • one of the problems with paramyxovirus vectors is the secondary release of virus from cells that occurs after the vector has been introduced into the target cell. In cells infected with replicating viruses, virions are formed and daughter viruses are released, so that virus particles spread beyond the target tissue.
  • virus particles with wild-type F protein are not infectious in the absence of trypsin-like enzyme, but the virus particles themselves are released from the cells. In vivo administration, there is a concern that the virus that has spread in the blood will reach the whole body.
  • F gene deficient SeV Li,
  • VLP Virus-like particles
  • the present inventors have found that, among virus envelope genes, paramyxovirus lacking the M gene does not cause particle formation but forms a synthium by the fusion of infected cells and cells in contact therewith, and cell fusion type Has been found to be infected (TOOO / 09700). These M-deficient viruses are replicated in the introduced cells and transmitted to neighboring cells in the presence of trypsin.
  • M-deficient viruses are deficient in the M gene required for particle formation, virus particles usually do not release! / Or is extremely suppressed.
  • RNPs Reconstituted in the M gene required for particle formation
  • infectious virus particles cannot be produced (W000 / 09700).
  • an M-deleted virus could be prepared as an infectious virus particle. Accordingly, the present inventors have developed a new production method for preparing M-deleted virus as virus particles.
  • the inventors first considered the use of a temperature-sensitive mutation of the viral gene as a solution to construct a vector with suppressed VLP release. It grows at low temperatures but cannot grow at high temperatures! / Several mutant viruses have been reported.
  • the present inventors have mutated a mutated protein that suppresses virion formation, particularly at a high temperature, particularly the M protein. If it is used, VLP formation can be suppressed by producing virus at a low temperature (eg, 32 ° C) and at a higher temperature (eg, 37 ° C) during gene therapy. Possible 1 ⁇ I thought there was life.
  • the present inventors have reported the recombination of the F gene-deficient type encoding the M and ⁇ ⁇ ⁇ proteins, which have been reported for the M protein and HN protein, respectively, with a total of 6 temperature-sensitive mutations.
  • a Sendai virus vector was constructed. When the VLP release of this virus was examined, it was found to be about 1/10 or less compared to the wild type virus.
  • anti-M antibody was used to localize M protein in cells transfected with Sendai virus vector with suppressed VLP release. As a result of analysis by immunostaining, cell surface observed in cells transfected with wild-type virus was found.
  • M protein Aggregation of M protein was significantly reduced in the case of the VLP release-inhibiting virus, and the concentration of M protein was extremely reduced, especially at high temperatures (38 ° C).
  • Intracellular localization of M and HN proteins in cells infected with this SeV containing the temperature-sensitive mutant M gene was examined in detail by confocal laser microscopy, and even at low temperatures (32 ° C), M protein localization was significantly reduced and was observed in a form close to that of microtubules. Furthermore, at high temperatures (37 ° C), M protein is near the microtubule centrosome.
  • the present inventors can obtain a recombinant virus vector having a reduced or eliminated particle-forming ability by preparing a viral vector having a mutation that causes a defect in the localization of M protein. I found it.
  • the present inventors also attempted to construct a virus that completely lacked cell surface aggregation of M protein in cells into which the virus had been introduced by deleting the M gene from the virus.
  • the present inventors constructed a helper cell that can inducibly express a wild-type M protein that can be used for production of an M gene-deficient virus.
  • the method of the present invention makes it possible to produce virus particles at a concentration of IX 10 8 PFU / ml or higher, and to provide for the first time a recombinant virus that can withstand practical use, including clinical practice.
  • the virus production system of the present invention enables the production of highly safe, high-titer gene therapy vectors that can rule out contamination with other viruses.
  • the F-modified M-deficient paramyxovirus suitable for practical use was provided in the M-deficient SeV production system of the present invention, which supplies M protein to trans using M-expressing cells.
  • the present inventors verified the actual antitumor effect in vivo using the infectious virus particles constructed as described above.
  • mice with transplanted cancer cells were administered M-deletion virus activated by matrix meta-oral protease (MMP), which is highly active in this cancer, they were introduced into the cancer tissue through cell fusion infection. It was confirmed that the virus spread.
  • MMP matrix meta-oral protease
  • the virus was limited to the injection site even after several days, whereas the vector of the present invention showed a strong penetrating power against cancer tissues, and the spread of the vector was observed throughout the cancer. It was.
  • the inhibitory effect on the growth of the cancer was obvious compared to the control without the virus or the wild type virus.
  • the present inventors succeeded in preparing a virus particle (F non-cleavable virus) in which the F protein on the virus surface is not cleaved by controlling the addition of protease during virus particle production.
  • This virus is not infectious as it is, but it exhibits specific infectivity when treated with a protease that cleaves the F protein on the surface of the virus or added to cells in the presence of the protease. I was able to.
  • Such a latent infectious viral vector has made it possible to specifically infect cancer cells that produce a specific protease, and the present inventors have also developed a vector having a modified F gene.
  • viral amplification can be performed using an enzyme that cleaves wild-type F protein such as trypsin using helper cells that express wild-type F protein.
  • the resulting virus particle contains a cleaved wild-type F protein in the envelope and is infectious.
  • the viral genome encodes a modified F gene in which the cleavage site of the F protein is modified. Can't spread power infection.
  • the method of preparing a virus using wild-type F protein is advantageous because it can produce virus particles independently of the modified F gene incorporated into the vector genome. '
  • the present invention provides a vector that spreads infection only in the presence of a protease expressed in a specific tissue such as cancer.
  • the vectors of the present invention do not significantly produce virus-like particles and transfer the vector to adjacent surrounding cells by cell fusion.
  • the vector of the present invention which acquires infectivity with a protease whose activity is enhanced at the same time, has a strong inhibitory effect on tumor growth, and gene therapy for cancer using this vector is considered to be extremely effective.
  • the present invention relates to a cell fusion vector having a modified protease-dependent topism, a method for producing the same, and more specifically,
  • [1] Paramyxovirus genomic RNA wherein (a) the nuclear acid encoding the M protein is mutated or deleted, and (b) is a modified F protein, which is the cleavage site of the protein.
  • a complex comprising a genomic RNA encoding a protein whose sequence is replaced by a sequence that is cleaved by a protease that does not cleave the wild-type F protein, and having the following properties:
  • the modified F protein lacks a part of the cytoplasmic domain of the wild type F protein.
  • the complex according to any one of [1] to [7],
  • a method for producing a viral particle having the ability to introduce the genomic RA comprising:
  • a method for producing viral particles having the ability to introduce the genomic RNA into cells that come into contact with cells into which (i) a step of amplifying an RNP containing the N, P, Opi L protein, and the genomic RNA of the paramycovirus in a cell under the permissive conditions of the M mutant protein
  • step (i) is carried out at 35 ° C. or lower
  • step (i) is carried out at 35 ° C. or lower
  • step (ii) is carried out at 35 ° C. or lower
  • steps (i) to (ii) The production method according to (1 0) or (1 1), which comprises a force for allowing a protease to cleave the modified F protein, or a step of treating the virus particles recovered in step (ii) with the protease,
  • Paramyxovirus wild-type F protein is expressed in the cell in step (i), and the wild-type F protein is cleaved at at least one of steps (i) to (ii) A production method according to [1 0] or [1 1], which comprises a step of causing a protease to exist or treating the virus particles recovered in step (ii) with the protease,
  • a therapeutic composition for cancer comprising the complex according to [5] and a pharmaceutically acceptable carrier,
  • a modified protein of paramyxovirus F protein, Pro cleavage site -! Leu- Gly include Pro-Gln-Gly s or Va l-Gly- Arg, matrix meth port protease or plasminogen Recombinant protein showing cell fusion ability in the presence of an activator,
  • a virus particle comprising the protein according to [16] or a nucleic acid encoding the protein '
  • [2 3] A virus particle comprising the protein according to [19] or a nucleic acid encoding the protein.
  • paramyxovirus refers to a virus belonging to Paramyxovirid ae) or a derivative thereof.
  • Paramyxoviruses are a group of viruses that have non-segmented negative-strand RNA in their genomes.
  • Paramyxovirinae (Paramyxovirinae) (also called respirovirus), Rubravirus, and Mo Including Pirivirus) and Pneumovirinae (including Pneumovirus and Metapneumovirus).
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza virus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • DMV Dolphin moloillivirus
  • PDPR measles virus
  • rinderpest virus RSV
  • He ndra virus Hendra
  • Hendra He ndra virus
  • Nipah virus Nipah
  • human parainfluenza vi s- 2 HP IV-2
  • simian parainfluenza virus 5 SV5
  • human parainfluenza vims-4a HPIV— 4 &
  • human parainfluenza virus-4b HPIV— 4b
  • mumps virus Mumps
  • NDV Newcastle disease virus
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza vi rus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CD V
  • dolphin raolbillivirus DMV
  • PDPR ruminants virus
  • MV measles virus
  • RPV rinderpest virus
  • Hendra virus Hendra
  • Nipah virus Nipah virus
  • the virus of the present invention is preferably a virus belonging to the Paramyxovirus subfamily (including the genera Respirovirus, Rubravirus, and Mobilivirus), or a derivative thereof, more preferably the Respirovirus genus. (Respirovirus) (also called Paramyxovirus) or a derivative thereof.
  • respirovirus viruses to which the present invention can be applied include human parainfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and ushiparainfluenza virus type 3 (BPIV-3). ), Sendai virus (also referred to as mouse parainfluenza virus type 1), and Opi monkey parainfluenza virus type 10 (SPIV-10).
  • the paramyxovirus is most preferably Sendai virus. These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, and artificially constructed strains.
  • Recombinant protein and recombinant virus refer to protein opiviruses produced via recombinant polynucleotides, respectively.
  • Recombinant polynucleotide refers to a polynucleotide that is not bound in the same manner as in its natural state.
  • the recombinant polynucleotide includes a polynucleotide in which polynucleotide strands are changed by a human hand, or a synthesized polynucleotide.
  • the recombinant polynucleotide can be produced by a known genetic recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • a recombinant protein expresses a recombinant polynucleotide encoding the protein.
  • a recombinant virus can be produced by expressing a polynucleotide encoding a viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus.
  • a gene refers to genetic material, and includes nucleic acids such as RNA and DNA.
  • a nucleic acid encoding a protein is called a gene of the protein.
  • the gene may not encode a protein.
  • the gene may encode a functional RNA such as a ribozyme or antisense RNA.
  • Genes can be naturally occurring or artificially designed sequences.
  • “DNA” includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • encoding a protein means that sense or antisense includes 0RF encoding the amino acid sequence of the protein so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • the present invention provides a cell fusion-type vector having replication ability modified with protease-dependent topology.
  • This vector does not release virus-like particles significantly after introduction into cells in the host environment, and infiltrates surrounding cells only in the presence of specific proteases.
  • the vector of the present invention specifically refers to the following complex.
  • Paramyxovirus genomic RNA wherein (a) the nucleic acid encoding the M protein is mutated or deleted, and (b) is a 5 female F protein, the sequence of the cleavage site of which is A complex comprising a genomic RNA encoding a protein that has been replaced with a sequence that is cleaved by a protease that does not cleave the wild-type F protein, and having the following properties:
  • a vector refers to a carrier for introducing a nucleic acid into a cell.
  • the complex is a complex including the genomic RNA of the paramyxovirus and a viral protein that binds to the genomic RNA.
  • the complex of the present invention may be, for example, a complex composed of paramyxovirus genomic RNA and a viral protein, ie, ribonucleoprotein (RNP).
  • RNP can be introduced into cells, for example, in combination with a desired transfection reagent.
  • Such concealment is specifically a complex containing paramyxovirus genomic RNA, N protein, P protein, and L protein.
  • viral proteins act to transcribe viral proteins from cistrons that encode viral proteins, and the genome itself is replicated to form daughter RNPs. Replication of genomic RNA can be confirmed by detecting an increase in the copy number of RA by RT-PCR or Northern hybridization.
  • the complex is more preferably a paramyxovirus virus particle.
  • Viral particles are microparticles containing nucleic acids that are released from cells by the action of viral proteins.
  • the shape of the virus particle may vary depending on the type of virus, such as a sphere or a rod, but is sufficiently smaller than a cell, and its size is usually about 10 nm to 800 nm.
  • Paramyxovirus virus particles have a structure in which the RNP containing genomic RNA and viral proteins is contained in a lipid membrane (called an envelope) derived from the cell membrane.
  • Viral particles may or may not be infectious (see below). For example, it may be a virus particle that does not show infectivity as it is, but has potentially infectivity that can acquire infectivity by a specific treatment.
  • Paramyxovirus genome RA is an RNA that has the function of forming RP together with paramyxovirus virus protein, the gene in the genome is expressed by the protein, and the nucleic acid is replicated to form a daughter secret.
  • Paramyxovirus is a virus that has a single-stranded negative strand RA in its genome. Code as anti-sense.
  • the genome of a paramyxovirus is composed of a viral gene arranged as an antisense between 3, leader region and 5, trailer region. Between the 0RF of each gene, there is a transcription termination sequence (E sequence)-an intervening sequence (I sequence)-a transcription initiation sequence (S sequence). Transcribed as cistron.
  • Genomic RNA contained in the vector of the present invention contains N (nucleocapsid) and P (phosphonate), which are viral proteins necessary for the autonomous replication of RNA itself. ) And L (Large) are encoded as antisense.
  • the RNA also encodes an F (fusion) protein, which is a protein that causes cell membrane fusion necessary for propagation of the RA to adjacent cells.
  • the genomic RNA further encodes an H (hemagglutenin-neuraminidase) (or H) protein in an antisense manner.
  • HN protein is not required for infection (Markwell, MA et al., Proc. Natil. Acad. Sci.
  • the vector of the present invention can be constructed using genomic RNA that does not encode the HN gene.
  • each gene in each virus belonging to the Paramyxovirus subfamily is generally expressed as follows.
  • the N gene is sometimes referred to as “NP ⁇ ”.
  • accession number of the nucleotide sequence database of each Sendai virus gene classified as Respirovirus in the Parawxoviridae family is 29343, M30202, M30203, M30204, M51331 for the NP gene.
  • M55565, M69046, X17218 P gene is M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M gene is D11446, K02742 , M30202, M30203, M30204, 69046, U31956, X00584, X53056, F gene is D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, ⁇ 02131, ⁇ gene is D26475, M12397, M30202, M30203 , M30204, M690 46, X00586, X02808, X56131, for L gene, see D00053, M30202, M30203, M30 204, M69040, X00587, X58886.
  • viral genes encoded by other viruses include the N gene: CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-2, D10025; Mapuera, X85128; Mumps ,
  • NDV AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; and SV5, M32248; for F gene CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1. M223 47; HPIV-2, M60182; HPIV-3.
  • the closest 0RF in genomic RNA requires only the S sequence between the 3 'leader region and the 0RF, and does not require the E and I sequences.
  • the 0RF closest to 5, in genomic RNA requires only the E sequence between the 5, trailer region and the 0RF, and does not require the I and S sequences.
  • the two 0RFs can be transcribed as the same cistron using, for example, a sequence such as IRES. In such cases, the E-1-S sequence is not required between these two 0RFs.
  • the typical RNA genome is 3, followed by a leader region, followed by six 0RFs that encode N, P, M, F, H, and L proteins in antisense order.
  • the arrangement of the viral gene is not limited to this, but preferably, like the wild-type virus, 3, following the leader region, N, P, (M,)
  • ORFs encoding F, HN, and L proteins are arranged in sequence, followed by a 5 'trailer region.
  • the number of viral genes is not six, but even in such a case, the virus genes should be arranged in the same way as in the wild type as described above, or changed appropriately. Can do.
  • this 0RF does not exist or encodes a mutant M protein.
  • the cleavage site of the F protein encoded by the genome is modified to a sequence that is cleaved by a protease that does not cleave the wild type F protein (described later).
  • the genomic RNA of the present invention can encode one or more foreign genes. As the foreign gene, a desired gene to be expressed in a target cell can be used.
  • the introduction position of the foreign gene can be inserted, for example, at a desired site in the non-coding region of the genome, for example, between the 3 'leader region and the viral protein 0RF closest to 3, and each viral protein 0RF And / or 5 and the closest viral protein between 0RF and the 5 'trailer region.
  • a deletion region can be inserted.
  • An EIS sequence should be constructed between the inserted foreign gene and the viral ORF.
  • foreign genes may be inserted through IRES.
  • the expression level of a foreign gene can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (3 'side of the negative strand) (TO01 / 18223). It can also be controlled by the insertion position of the foreign gene on the genome, and the higher the expression level is, the lower the expression level is, the closer to 3 ′ of the negative strand, the lower the expression level. Become. Thus, the insertion position of the foreign gene can be appropriately adjusted so as to obtain the desired expression level of the gene and so that the combination with the genes encoding the preceding and subsequent viral proteins is optimal.
  • the foreign gene is preferably linked to a highly efficient transcription initiation sequence and inserted near the 3 ′ end of the negative strand genome. Specifically, it is inserted between the leader region and the viral protein 0RF closest to 3 '. Alternatively, it may be inserted between 0RF of the viral gene closest to 3 'and the second gene.
  • the insertion position of the inserted gene in the vector should be set to the 5 'side of the negative strand genome, or the transcription start sequence should be less efficient. For example, it is possible to obtain an appropriate effect by suppressing the expression level from the virus vector to a low level.
  • an arbitrary viral gene contained in the vector is modified from a wild type gene.
  • at least one of the N, P, and L genes that are replication factors is modified to enhance the function of transcription or replication.
  • HN protein one of the structural proteins, is hemagglutinin, a hemagglutinin.
  • HN protein one of the structural proteins, is hemagglutinin, a hemagglutinin.
  • membrane fusion ability and / or particle formation ability can be regulated by modifying the F protein and domains other than the cleavage site.
  • F protein and HN protein that can be antigen molecules on the cell surface
  • viral vectors with reduced antigen-presenting ability for these proteins can be produced.
  • the vector of the present invention may be one lacking an accessory gene.
  • knocking out the V gene, one of the SeV accessory genes does not impair gene expression or replication in cultured cells' and significantly reduces the pathogenicity of SeV against hosts such as mice ( Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Curran, J. et al., W001 / 04272 , EP1067179).
  • Such an attenuated vector is useful as a viral vector for non-toxic gene transfer in vivo or ex vivo.
  • the complex of the present invention is a substantially uniform complex.
  • Substantially homogeneous complex means that the complex is separated from paramyxovirus RNPs or virus particles that are not the complex of the present invention. That is, the substantially uniform complex of the present invention does not contain other paramyxovirus RNPs having the ability to form particles nor virus particles of the virus.
  • the particle-forming ability means that infectious virus particles and / or non-infectious virus particles (this is called virus-like particles) are released in cells infected with virus vectors (this is secondary release) Says the ability of the vector.
  • a viral RNP containing in the genome a gene encoding a wild type F protein or an F protein having a fusion activity equivalent thereto is also included in the genome. Does not contain virus particles Absent.
  • the sequence of the cleavage site of the protein is replaced with a sequence that is cleaved by another protease.
  • Paramyxovirus F protein (F0) does not show cell membrane fusion activity as it is, but it shows its fusion activity by cleaving the extracellular domain (or virion domain) of the F0 fragment.
  • the two F protein fragments generated by cleavage are called F2 on the N-terminal side and F1 on the C-terminal side, and both are linked by disulfide bonds.
  • Cleavage of the F protein means that the F protein on the membrane is cleaved at a domain outside the membrane in this way to generate a fragment that acquires cell fusion ability.
  • the cleavage site sequence refers to the amino acid sequence necessary for cleavage by a protease or an essential residue therein.
  • the cleavage sites of the paramyxovirus F protein are known and they are cleaved by trypsin-like proteases such as furin in the cell.
  • Furin is ubiquitous in the Golgi apparatus of most cells.
  • the furin recognition motivation is Arg ⁇ X- Lys / Arg ⁇ Arg (RXK / RR) (2 amino acids separated by 7 ⁇ are either).
  • Human PIV3 RTKR
  • SV5 SV5
  • Mumps virus RHKR
  • NDV virulent strain
  • RQR / KR Measles viru s
  • RKRR RS virus It has the sequence of these motifs at the cleavage site.
  • the virulent strain, F is sensitive to proteases present in all cells, and multi-stage growth with F cleavage in any organ makes the infection fatal.
  • this motif does not apply to Sendai virus (PQSR), Human PIV1 (PQSR), and NDV (avirulen t strain) attenuated strains (K / RQG / SR), which is low in pathogenicity, and only the serine protease recognition sequence Arg. have.
  • the sequence of the F protein cleavage site of paramyxovirus has been well analyzed and can be found by those skilled in the art by referring to the literature as appropriate (eg, virology, edited by Shoichi Hatanaka, Tokyo, Asakura Shoten, 1997, pp. 247-248).
  • the cleavage site is the F protein of a virus grown in a cell, tissue, or individual capable of propagating the paramyxovirus, or the cleavage site of the F protein expressed and recovered in the cell or individual. It can be confirmed by identification.
  • F protein expressed on the cell surface can be artificially cleaved and identified by treating with a protease such as trypsin that cleaves the cleavage site of this protein.
  • the F protein has a sequence in which the amino acid sequence at the F protein cleavage site is modified and cleaved by another protease.
  • the native cleavage sequence of the F protein is modified by substitution, deletion, and / or insertion of one or more amino acids and reconstructed into a sequence that can be cleaved by other proteases.
  • the amino acid sequence can be modified by a known site-directed mutagenesis method.
  • the modified F protein may retain the property of being cleaved by a protease (such as trypsin) that cleaves the wild-type F protein (see Examples).
  • a vector encoding such a modified F protein has an expanded protease-dependent individual growth mechanism compared to the wild-type F protein.
  • the sequence cleaved by another protease may be a sequence cleaved by a desired protease.
  • a sequence cleaved by a protease expressed in a desired tissue or cell to be targeted for vector introduction is used.
  • a vector that specifically retains only in the tissue can be constructed.
  • a protease cleavage sequence that is specifically expressed or activated in a certain state eg, a disease
  • a vector that specifically infiltrates only in that state eg, only within a specific disease region
  • Proteases can be intracellular or extracellular
  • protease secreted outside the cell, membrane-type protease expressed on the membrane surface, and the like are suitable. Further, it may be a desired protease present on the transport pathway until the F protein is translated in the cell and secreted on the cell surface.
  • the number of diseases caused by abnormal expression of the protease gene is enormous, including metabolic diseases, circulatory disorders, inflammation * immune diseases, infectious diseases, malignant tumors, and other diseases that belong to all categories in the pathology review.
  • Contains for example, calpain in muscular dystrophy, ubiquitin-proteasome system rupture in autoimmune and neurological diseases, decreased expression of neprilysin in Alzheimer's disease, increased expression of MMP in cancer invasion and metastasis, pathogen-derived protease by pathogenic microorganisms, These include serine proteases in the hemostatic mechanism and aminopeptidases in the placenta.
  • Calpain a calcium-dependent cysteine protease, has been studied as an enzyme involved in muscle protein degradation in muscular dystrophy.
  • Calpain has a specific activation mechanism that is activated by binding to calcium, and it degrades proteins such as lactinin, troponin, and connectin, which are important for maintaining the structure of skeletal muscle, in the cell. It is thought to trigger proteolysis.
  • As the calpain cleavage sequence (Kar lsson, J. 0. et al. (2000) Cell Biol. Int. 24, 235-243), for example, Leu-Leu-Val-Tyr is used as a degradation substrate.
  • the ubiquitin-proteasome system is a selective and active proteolytic mechanism in cells, and is an important cell function control system such as signal transduction and cell cycle.
  • the ubiquitin consisting of 76 amino acids is covalently bound to the protein by the continuous catalytic action of the ubiquitin-active enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3). It is decomposed by. 'Hundred types of E3 enzymes are broadly classified into HECT and RING fin types, and abnormalities in these enzyme activities are involved in numerous diseases. For example, Leu-Leu-Val-Tyr is used as a degradation substrate for 26S proteasome (Reinheckel, T. et al.
  • Rheumatoid arthritis and other joint diseases are disorders that cause movement disorders due to tissue destruction of articular cartilage.
  • the ability to regenerate articular cartilage is extremely weak, and the collapse of the higher-order structure of cartilage due to extracellular matrix degradation leads to progressive joint destruction.
  • ADAM TS ADAM with thrombospondin motif
  • aglycan cartilage proteoglycan
  • a particularly preferred protease cleavage sequence in the present invention is a cleavage sequence of a protease that has enhanced activity in cancer.
  • a protease whose activity is enhanced in cancer refers to a protease whose activity is enhanced in a certain cancer tissue or cancer cell compared to normal thread or tissue corresponding to the cancer or normal cell.
  • the increased activity may be an increase in the expression level of the protease and / or an increase in the activity itself.
  • the protease expression level was determined by using Northern hybridization using the protease gene fragment as a probe, RT-PCR using a primer that specifically amplifies the protease gene, or an antibody against the protease. It can be measured by Western plot, ELISA, or immunoprecipitation. Further, the activity of the protease can be known from the degradation assay using the substrate of the protease. Many in vivo proteases are known whose activities are regulated by various inhibitors. Protease activity levels can also be measured by measuring the expression levels of these inhibitors. For example, the activity of the extracellular matrix (ECM) degrading enzyme is enhanced particularly in metastatic cancer (Nakajima, M. and Chop, AM, Semin. Cancer Biol.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM invasion by ECM-degrading enzymes is deeply involved in cancer metastasis, and in fact, many inhibitions of metastasis or basement membrane invasion by inhibitors of ECM-degrading enzymes have been reported.
  • a vector that encodes a modified F protein having a recognition sequence for cleavage by an enzyme at the cleavage site it is possible to construct a cancer-specific infection and invasion vector.
  • Live serine proteases include cathebsin G, elastase, plasmin, plasminogen activator, tumor trypsin, chymotrypsin-like Sex proteinase, thrombin and the like. Plasmin is produced by limited degradation of plasminogen that exists in an inactive state in the body. This limited degradation is controlled by plasminogen activator (PA) and its inhibitor, plasminogen activator inhibitor (PAI).
  • PA plasminogen activator
  • PAI plasminogen activator inhibitor
  • PA plasminogen activator inhibitor
  • tPA tissue type PA
  • uPA urokinase type PA
  • uPA can act while bound to the uPA receptor (uPAR) on the cell surface.
  • uPAR uPA receptor
  • Plasmin separates fibronectin, tenascin, laminin, etc., but collagen cannot be directly degraded. However, it cleaves a part of the precursor of collagen degrading enzyme and activates it, thereby indirectly degrading collagen. These are often highly active in cancer cells and correlate well with metastatic potential (Tanaka, N.
  • Butenas provides a highly specific sequence for tPA using 54 different fluorescent substrates. (Butenas, S. et al. (1997) Biochemistry 36, 2123-2131) showed high FPR and VPR degradation activity against tPA. Therefore, these sequences are particularly preferably used.
  • ECM-degrading enzymes classified as cysteine proteases or aspartic proteases, which are also involved in cancer metastasis and invasion.
  • cathebsin B (Sloane, BF, Semin. Cancer Biol. 1: 137-152, 1990) using laminin, proteoglycan, fipronectin, collagen, procollagenase (activated by degradation), etc. as a substrate.
  • cathebcin Kerman, SE and Gottesraan,. M., Semin. Cancer Biol.
  • Cathebsins B and L are especially found in breast cancer tissue (Sp yratos, F. et al., Lancet ii: 1115-1118, 1989; Lah, TT et al., Int. J. Cancer 50: 36-44, 1992), colon fistula Carcinoma (Shuja, S. et al., Int. J.
  • Metaloproteinase is a metalloenzyme containing metal elements such as Zn, and caspase, aminopeptidase, angiotensin I converting enzyme, collagen i "Izee, etc. have been reported. More than 16 types of matrix metaloproteinases (MMPs) have been reported: Representative MMPs include collagenase-1, 2, 3 (MMP-1, 8, 13), gelatinase A, B (Above -2, 9), Stromelysin 1, 2, 3 (MMP-3, 10, 11), Matrilysin (MMP-7), Membrane-type meta-oral protease (MT1-MMP, MT2-MMP) And so on.
  • MMPs matrix metaloproteinases
  • concealment has Zn 2+ at the active center and requires Ca 2+ for enzyme activity. It is secreted as a latent enzyme (latent MMP or ProMMP) and activated outside the cell to degrade various ECMs present in the living body. In addition, MMP is inhibited by the common inhibitor tissue inhibitor of mettaloproteinases (TIMP).
  • latent MMP latent MMP
  • ProMMP ProMMP
  • TMP tissue inhibitor of mettaloproteinases
  • ECM-degrading meta-proteases include aminopeptidases, such as aminopeptidase N / CD13 and aminopeptidase ⁇ that degrade ECM constituent proteins. Experiments using inhibitors have reported that all of these proteases are deeply involved in cancer.
  • collagenase cleaves type I, II, and III collagen molecules, which are fibrous collagens, at specific sites.
  • gelatinase A gelatinase A
  • MMP-9 gelatinase B
  • Gelati ⁇ "Ize is also called type IV collagenase, the ability to degrade type IV collagen, which is the main component of the basement membrane. It also degrades type V collagen and elastin.
  • MMP-9 does not degrade laminin and fibronectin, but MMP-2 degrades them.
  • Stromelysin (MMP-3, 10) is a broad substrate.
  • MMP-7 Matrilysin
  • MMP-7 is a molecule that does not have hemopexin domain
  • Substrate specificity is the same as that of MMP-3, especially high degradation activity against proteodalycan and elastin
  • Membrane-type MMP (MT-MMP) (MT1, 2, 3, 4, 5, 6 -MMP) is transmembrane MT-Haku has an insertion sequence (approximately 10 amino acids) between the propeptide domain and the active site, which contains Arg- Xaa- Lys- Arg (Xaa is any amino acid).
  • HT1-MMP degrades type I, II, and III collagen, and MT3-conceals type III collagen.
  • MMP overexpression has been found to occur extensively in cancer cells. They can be divided into expression by cancer itself and cancer stromal cells.
  • collagenase that degrades interstitial collagen MMP is involved in the invasion of cancer cells, and its activity level is correlated with metastatic potential in colorectal cancer etc. (Wooley, DE, Cancer Metastasis Rev. 3: 361) Tarin, D. et al., Br. J. Cancer 46: 266-278, 1982) and type IV collagenases (MMP-2, MMP-9) are found in various epithelial cancers.
  • There is a high correlation between activity and metastatic potential Liotta, LA and Stetler-Stevenson, WG, Semin. Cancer Biol.
  • PLGLW AR Bosset, DM et al. (1993) Anal. Biochem. 212, 58—64
  • GPLGMRGL Deng, SJ et al. (2000) J. Biol. Chem. 275) , 31422-31427)
  • PQGLEAK Beekman, B. et al. (1996) FEBS Lett. 390, 221-225
  • RPKPVEWREAK Beekman, B. et al. (1997) FEBS Lett. 418, 305-309
  • PLALWAR Jacobsen, EJ et al. (1 999) J. Med. Chem. 42, 1525-1536).
  • PLGMWS as degradation substrate for MMP-2 and 9
  • phage-displayed peptide library screening was performed by MMP9 (Kridel, SJ et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578), MMP2 (Chen, EI et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 4485-4491), MT1-MMP (Kridel, SJ et al • (2002) J. Biol. Chem. In JBC Papers in Press, April 16, 2002, Manusscript M111574200).
  • Group IV is a sequence that specifically degrades to MT1-MMP.
  • VFSIPL and IKYHS sequences cannot be degraded by MMP9 and MMP2, but can only be degraded by MT-MMP.
  • the cleavage sequence of MMP9 includes Pro-X-X-Hy (X is an arbitrary residue, Hy represents a hydrophobic residue), and Pro-X-X-Hy- (Ser / Thr) is particularly preferable. More specifically, Pro-Arg- (Ser / Thr) -Hy- (Ser / Thr) can be exemplified (cutting occurs between X-Hy).
  • hydrophobic residues examples include, but are not limited to, Leu, Val, Tyr, lie, Phe, Trp, and Met. Alternatively, other cleavage sequences have been identified
  • M P2 may be Pro-X-X-Hy described above, and (Ile / Leu) -XX-Hy, Hy-Ser-X-Leu, His-XX-Hy, etc. can be exemplified.
  • Group I, II, III, IV in the following literature; Chen, EI et al. (2002) J. Biol. Chem.
  • MMP-7 concealment-1
  • MMP -2 hidden-9
  • Hiring P-3 Marleukin-1
  • MMP-14 Marleukin-1
  • MMP-14 Marleukin-1
  • MMP-14 Marleukin-1
  • MMP-14 Marleukin-1
  • H. Matrix metalloproteinases and TIMPs (Oxford Iniversity Press, Oxford, UK, 2000); Fernandez-Patron, C. et al., Circ. Res. 85: 906-911, 1999; Nakamura, H. et al., J. Biol. Chem. '275: 38885-38890, 2000
  • Mc Quibban G et al., Science 289: 1202-1206, 2000
  • Sasaki T. et al., J.
  • MMP-1 is VPMS-MRGG
  • MMP-3 includes RPFS-MIMG
  • MMP-7 includes VPLS-LTMG
  • MTl-MMP includes, but is not limited to, IPES-LRAG.
  • PLAY AR Nezel-Amett, S. et al., Anal. Biochem. 195: 86, 1991
  • MMP-8 Various synthetic substrates for MMP are available and their sequences can be compared (see, for example, the MMP Substrate in the Calbiochem catalog, Merk).
  • MMP activity in tissues is regulated during the production of latent enzymes, activation of latent enzymes, and inhibition by inhibitors of active enzymes. Developmental ovulation, fertilization, endometrium It is involved in various physiological phenomena such as implantation into the wound and wound healing.
  • MMP-2 gelatinase
  • MT1-MMP gelatinase
  • MMP-9 plasmin made from plasminogen by uPA, the ProMMP- 3 active I arsenide, a ctive MMP-3 is present the route to activate the P roMMP-9, This pathway is involved in cancer metastasis.
  • the vector of the present invention is particularly useful to introduce a sequence cleaved by a protease involved in cancer metastasis into the cleavage site of F protein.
  • proteases include MMP-2, MMP-9, uPA, MMP-3, and MT1-MMP, and particularly include MMP-2, MMP-9, and uPA.
  • a modified F protein is a protein that is cleaved by a target protease when expressed in a cell and maintains the F membrane fusion action.
  • the N-terminus after cleavage is labeled with within 5 amino acids, preferably within 4 amino acids, and more preferably within 3 amino acids (eg 1, 2, or 3 amino acids) compared to wild-type F1.
  • addition of Met-Thr-Ser (SEQ ID NO: 1) to the N-terminus of the F1 fragment of the modified F protein does not impair the cell membrane fusion reaction after cleavage by MMP There was found. Therefore, it is preferable to design the cleavage sequence so that Met-Thr-Ser or a conservative substitution sequence thereof, or an amino acid consisting of a partial sequence thereof is added to the N-terminus of F1 after cleavage.
  • a conservative substitution refers to a substitution between amino acids whose side chain chemical properties are similar. Specifically, Met is substituted with lie or Val, Thr is substituted with Ser or Ala, and Ser is substituted with Ala, Asn, or Thr. The amino acid substitution at each position may be performed independently.
  • the sequence corresponding to one or several amino acids at the C terminus of the F2 fragment of the original F protein is appropriately deleted, and Pro-Leu / Gin-Gly is inserted (ie, replaced).
  • the amino acids to be deleted can be selected, for example, within the range of 0 to 10 amino acids, with the same number of amino acids inserted (for example, 3 amino acids).
  • Protea The F protein can be prepared so that the N-terminus of F1 is directly ligated downstream of Pro-Leu / Gln-Gly, as long as the cleavage and membrane fusion processes are not hindered.
  • the cleavage sequence and the F1 fragment are preferably ligated via an appropriate spacer.
  • the cleavage sequence containing such a spacer is particularly preferably Pro-Leu / Gln-Gly-Met-Thr-Ser (SEQ ID NO: 3) or Pro-Leu / Gln-Gly-Mly-Met-Thr. And a sequence containing (SEQ ID NO: 4). Met, Thr, and Ser may be conservatively substituted with other amino acids.
  • 1 to 10 residues for example 1, 2, 3, 4, 5, or 6 residues, that are consecutive in the N-terminal direction from the C-terminal amino acid in F2 after cleavage are Pro- Leu
  • a modified F protein substituted with a sequence such as / Gln-Gly-Met-Thr-Ser or Pro-Leu / Gln-Gly-Met-Thr can be mentioned as a preferred protein.
  • the wild-type F protein has a sequence corresponding to the C-terminal 4 amino acids of the F2 fragment (typically 113 Pro-Gln-Ser-Arg 116 1 depending on the strain) ( An F protein in which SEQ ID NO: 5) is replaced with Pro-Leu / Gln_Gly-Met-Thr-Ser can be exemplified.
  • the sequence exemplified above (Pro-Leu / Gln-Gly_Met-Thr-Ser or Pro-Leu / Gln-Gly-Met-Thr) is supported as a preferred example.
  • the F protein cleavage site is preferably Pro-XX-Hy-Thr / Ser, more preferably a sequence containing Pro-XX-Hy-Thr / Ser-Thr / Ser ("Thr / Ser" is either Thr or Ser) Represents).
  • Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala and Pro-Gin-Gly-Leu-Tyr-Ala which are not applicable to Pro-XX-Hy-Thr / Ser, are not preferred (FIG. 44). If a peptide matching the Pro-X-X-Hy-Thr / Ser sequence is incorporated into the F protein cleavage site, a vector exhibiting high invasive potential in the presence of MMP can be produced.
  • cleavage sequences include sequences cleaved by a plasminogen activator.
  • examples include a sequence containing Va 1-Gly-Arg as a cleavage sequence of uPA and tPA.
  • the F protein is designed so that this sequence is at the C-terminus of the F2 fragment after cleavage of the modified F protein.
  • the sequence containing the C-terminal amino acid of the F2 fragment after cleavage of the wild-type F protein may be replaced with a sequence containing Val-Gly-Arg (SEQ ID NO: 6).
  • 1 to 10 residues for example 1, 2, 3, 4, 5, or 6 residues from the C-terminal amino acid of F2 after cleavage to the N-terminal direction are Va ⁇ Gly-Arg or A modified F protein substituted with a sequence containing this can be mentioned as a preferred protein.
  • Sendai virus F protein as an example, the sequence corresponding to the C-terminal 3 amino acids of the F2 fragment in the wild-type F protein (typically 11 4 Gln-Ser-Arg 116 1 depending on the strain) (SEQ ID NO: An F protein in which 7) is substituted with Val-Gly-Arg can be exemplified.
  • an assembly system using a plasmid vector can be used (Example 31). That is, a plasmid vector expressing the modified F protein is tranfected into cells and cultured in the presence of protease to detect syncytium formation. The modified F protein encoded by the plasmid that forms syncytium is judged to be cleaved by the protease and exhibit fusion ability.
  • HT1080 cells that express MMP can be used to assess F protein that is cleaved by MMP.
  • MMP may be added to the culture system. This Atsy system developed in the present invention is used. If so, it is possible to easily obtain a modified F protein having fusion ability.
  • the modified F protein provided by the present invention has the ability to show cell fusion ability depending on a specific protease.
  • this protein it is possible to create viral vectors that cause cell fusion or specifically infect only in the presence of the protease, or drug / gene delivery vectors such as liposomes.
  • the F gene of the adenovirus vector (Galanis, E. et al., Hum. Gene Ther. 12, 811-821 (2001)) carrying the F, HN gene is modified to be cleaved by a protease expressed in cancer.
  • By loading the protein gene it is possible to develop a vector that causes cell fusion in the presence of a specific protease.
  • the present invention also provides a paramyxovirus vector comprising a modified F protein having enhanced cell fusion ability due to deletion of a cytoplasmic domain.
  • This modified F protein has 0 to 28, more preferably 1 to 27, more preferably 4 to 27 amino acids in the cytoplasmic domain. It is an F protein from which some amino acids of the cytoplasmic domain have been deleted.
  • the cytoplasmic domain is the domain on the cytoplasm side of the membrane protein, and in the F protein, it is the C-terminal region of the transmembrane (TM) region (see Fig. 42).
  • TM transmembrane
  • an F protein having 6 to 20, more preferably 10 to 16, more preferably 13 to 15 amino acids as a cytoplasmic domain has a significantly higher cell fusion ability than a wild type F protein.
  • Paramyxovirus vectors containing genes encoding these cytoplasmic domain-deficient F proteins in the genome have higher cell fusion ability than normal vectors, and thus can more strongly invade surrounding cells. If the cleavage site of this F protein is modified as described in the present specification, a vector exhibiting a high invasive force can be obtained only in the presence of a specific protease.
  • this book is related to a fusion protein of two spike proteins of paramyxovirus.
  • Paramyxoviruses have proteins that are thought to function in cell fusion (called F proteins) and proteins that are thought to function in adhesion to cells (called HN or H).
  • F proteins proteins that are thought to function in cell fusion
  • HN or H proteins that are thought to function in adhesion to cells
  • F protein proteins that are thought to function in adhesion to cells
  • HN or H proteins that are thought to function in adhesion to cells
  • a protein in which part or all of the cytoplasmic domain of the F protein has been deleted may be fused to the H (or H) protein.
  • the length from the downstream of the TM region of the F protein to the HN (or H) protein is 5 residues or more, more preferably 10 residues or more, more preferably 14 residues or more, more preferably 20 residues. That's it.
  • an appropriate length linker peptide is added to the C-terminal of the F protein part to adjust the length. Is preferred.
  • a protein fused with HN or H) protein via an arbitrary linker peptide to a cytoplasmic domain deletion type F protein having a cytoplasmic domain of 14-residue F protein is preferably used. It can.
  • the length of the linker peptide can be, for example, about 50 residues.
  • the amino acid sequence of the linker peptide is not particularly limited, but a polypeptide having no significant physiological activity is preferable. For example, a polypeptide as exemplified in FIG. 43 (SEQ ID NO: 80) can be used.
  • recombinant viral vectors can be prepared according to methods well known to those skilled in the art. For example, most commonly producing adenovirus base Kuta one utilized such as gene therapy, Saito et al. Methods Contact Yopi other (Miyake et al., 1 9 96, Proc. Natl . Acad. S ci. USA, 93 vol. Kanegae et al., 1996, Acta Paediatr. Jpn N 38, 182-1 88; Kanegae et al., Biomanual Series 4-gene transfer and expression and analysis method, 1994, 43-58, sheep Company: Kanegae et al., 1994, Cell Engineering, Vol. 13, No. 8, pp. 757-763).
  • retrovirus vectors Wang et al., 1995, protein nucleic acid enzyme, 40, 2508-2513
  • adeno-associated virus vectors Temayori et al., 1995, protein nucleic acid enzyme, 40 ⁇ , 2532-2538
  • JP-B 6-34727 and JP-B 6-505626 are known as methods for producing recombinant papillomavirus.
  • JP-A-5-308975 is known as a method for producing a recombinant adeno-associated virus.
  • JP-T 6-508039 is known.
  • the gene (M gene) encoding the M (matrix) protein is mutated or deleted.
  • the virus protein is released by modifying the cleavage site of the F protein poor to a sequence that can be cleaved by other proteases, and further mutating or deleting the M gene to suppress the ability to form particles.
  • a completely new and unique vector has been developed that infiltrates the vector in a cell population expressing a specific protease.
  • M gene These mutations eliminate or significantly reduce the particle-forming activity in the host environment. Such mutations can be identified in cells expressing this M protein by a decrease in cell surface aggregation of the protein (see Examples).
  • the deletion of the M protein is most effective when modifying the secondary release particles, that is, for the purpose of suppressing VLP release.
  • Sendai virus Sendai virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • VLP virus like p article
  • VLP is produced by strong expression of only M protein (Coronel, EC et al., J. Virol. 73; 7035-7038).
  • the specific role of the M protein for virion formation can be summarized as follows.
  • the field of virion formation is a field called Lipid rafts on the cell membrane (Simons, K. and Ikonen, E. Nature 387; 569-572 (19 97)), originally It was identified as a lipid fraction insoluble in nonionic surfactants such as Triton X-100 (Brown, DA and Rose, JK Cell 68; 533-544 (1992)).
  • Influenza virus Ali, A. et al., J. Virol. 74; 8709-8719 (2000)
  • Measles virus Measles virus (MeV: Manie, SN et al., J. Virol.
  • the M protein binds to the cytoplasmic tail of the spike protein, which is known to affect influenza virus (Zhang, J. et al., J. Virol. 74; 4634-4644 (2000)) and SeV (Sanderson, C M. et al., J. Virol. 67; 651-663 (1993)), etc., and binding to RNP is also possible with influenza virus (Ruigrok, RW et ah, Virology 173; 311-316 (1989). )), Nora influenza virus and SeV (Coronel, EC et al., J. Virol. 75; 1117-1123 (2001)).
  • VLP formation is reduced to 1/30 in the G protein deletion type (Mebatsion, T. et al., Cell 84; 941-951 (1996)), M protein deletion It was reported that the mold decreased to 1 / 500,000 or less (Mebatsion, T. et al., J. Virol. 73; 242-250 (1999)).
  • measles virus measles virus
  • cell-to-cell fusion is enhanced in the M protein deletion type (Cathomen, T.
  • SeV F and HN are in the secretory pathway (ie, present in the Golgi apparatus, etc.), it is shown that the Cytoplasmic tail of each (F and ⁇ ) is bound to the M protein. (Sanderson, C M. et al., J. Virol. 67; 651-663 (1993), Sanderson, C M. et al., J. Virol. 68; 69-76 (1994)).
  • M protein in order for M protein to be efficiently transported to lipid rafts on the cell membrane where virions are formed, binding to the F and the Cytoplasmic tail of ⁇ is important. It is expected that it is transported to the cell membrane in the form of riding on the F and HN secretion pathway. Thus, the M protein plays an essential role in the formation of viral particles.
  • a mutant M protein gene that loses aggregation of the M protein on the cell membrane, a betater that does not have the ability to form particles. Can be created.
  • Detection of M protein localization in cells can be carried out by a method using cell fractionation, a method in which the localization of M protein is directly detected by immunostaining, and the like.
  • immunostaining for example, M protein can be stained using a fluorescently labeled antibody and observed under a confocal laser microscope.
  • a cell fraction is obtained by a known cell fractionation method, and the fraction containing M protein is identified by immunoprecipitation using an antibody against M protein or Western plotting. Can be examined.
  • the field of virion formation is called lipid rafts on the cell membrane, which is a lipid fraction insoluble in nonionic surfactants such as Triton X-100.
  • a virus vector having a mutated M gene preferably has a particle-forming ability in the host environment of 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, more preferably 1/30 or less, more preferably 1/50 or less, More preferably, it is 1/100 or less, more preferably 1/300 or less, more preferably 1/500 or less.
  • the vector of the present invention substantially loses the ability to produce virus particles in the host environment.
  • Substantial loss means that no production of viral particles in the host environment is detected.
  • the virus particle is 10 3 / ml or less, preferably 10 2 / ml or less, more preferably lOVml or less.
  • virus particles can be confirmed directly with an electron microscope. Alternatively, it can be detected and quantified using a nucleic acid or protein contained in the virus as an indicator. For example, a general nucleic acid test such as PCR is performed on genomic nucleic acid contained in a virus particle. Detection and quantification may be performed by an extraction method. Alternatively, a viral particle having a foreign gene can be quantified by infecting the cell with a cell and detecting the expression of the gene. Non-infectious virus particles can be quantified by introducing them into cells in combination with a transfection reagent and detecting gene expression. In the present invention, virus particles include particles that do not have infectivity, and include, for example, VLP.
  • virus titer is determined by, for example, CIU (Cell-Infected Unit) measurement or hemagglutination activity (HA) measurement.
  • CIU Cell-Infected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the host environment is the wild type of paramyxovirus from which the target vector is derived. Refers to the environment in the host where it normally grows in nature or an environment that produces viral propagation equivalent to it.
  • the host environment can be, for example, optimal growth conditions for the virus. If it is a paramyxovirus hosted by a mammal animal, it refers to the mammal's living body or equivalent environment.
  • the temperature is about 37-38 ° C. (eg 37 ° C.) corresponding to the body of a mammal.
  • vitro, normal cell culture conditions, in particular serum-containing or a free medium (pH 6. 5 ⁇ 7. 5) is 37 ° C, 5% C0 2 , under humidity environment culture environment Can be mentioned.
  • conditional mutation refers to a mutation that is loss of function in the host environment but is active in a certain environment.
  • a gene encoding a temperature-sensitive mutant M protein that loses little or no function at 37 ° C but recovers its function under low-temperature conditions can be preferably used.
  • a temperature-sensitive mutation is a mutation whose activity is significantly reduced at high temperatures (eg, 37 ° C) compared to low temperatures (eg, 32 ° C).
  • the present inventors succeeded in producing virus particles having a dramatically reduced particle-forming ability at 37 ° C. corresponding to the host environment, using a temperature-sensitive mutant of M protein.
  • This mutant M protein shows aggregation on the cell surface under low temperature conditions (for example, 32 ° C) and forms virus particles. However, at the normal temperature in the host body (37 ° C), the agglutination is lost and virus particles are lost. Cannot be formed.
  • a vector having in its genome a nucleic acid encoding such a temperature-sensitive mutant M protein is suitable as the vector of the present invention.
  • Conditional mutation In a viral vector encoding an M protein, the M protein functions to form virus particles by allowing the vector to replicate under conditions that allow the M protein to function, that is, permissive conditions. When virus particles produced in this way are infected under normal circumstances, the M protein cannot function and does not form particles.
  • the temperature-sensitive mutation of the M gene is not particularly limited.
  • a small number selected from the group consisting of Sendai virus M protein G69, T116, and A183. Includes mutations in at least one, preferably two, and more preferably all three amino acid sites, or other homologous sites in other (-) RNA viruses M proteins A thing can be used suitably.
  • G69 is the 69th amino acid Gly of the M protein
  • T116 is the 116th amino acid Thr of the M protein
  • A183 is the 183rd amino acid Ala of the M protein.
  • the gene that encodes the M protein is widely conserved in the (-) thigh virus, and is known to have a function of interacting with both the nucleopower pseudoid and the envelope of the virus ( Garoff, H. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 117-190 (1998)).
  • 104-119 (104-KACTDLRITVRRTVRA-119 SEQ ID NO: 45), which is predicted to be amphiphilic ⁇ -helix in the SeV M protein, has been identified as an important region for particle formation (Genevieve Mottet et al., J. Gen. Virol.
  • the amino acid sequence of the M protein is similar to that of the (-)-strand RNA virus.
  • the known M protein in the Paramyxovirus subfamily is a basic protein consisting of approximately 330 to 380 amino acids in total length. Similarity across regions, but particularly high in the C-terminal half (Gould, AR Virus Res. 43: 17-31 (1996), Harcourt, BH et al., Virology 271: 334-349 ( 2000)).
  • amino acids homologous to G69, T116, and A183 of SeV M protein can be easily identified.
  • the amino acid of the homologous site of the other (one) thigh virus ⁇ protein corresponding to SeV M protein G69, ⁇ 16, and A183 can be obtained by a person skilled in the art using, for example, a homology search program for amino acid sequences such as BLAST (alignment). It can be identified by aligning with the amino acid of SeVM protein using alignment creation program such as CLUSTAL W.
  • a homology search program for amino acid sequences such as BLAST (alignment). It can be identified by aligning with the amino acid of SeVM protein using alignment creation program such as CLUSTAL W.
  • the homologous site of each M protein corresponding to G69 of SeV M protein is G69 for human parainfluenza virus-1 (HPIV-1) (the parentheses are abbreviations) and human parainfluenza virus-3 (HPIV-3).
  • homologous sites of each M protein corresponding to T116 of SeV M protein are T116 for human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), T120 for human parainfluenza virus-3 (HPIV-3), pho T104 for cine distemper virus (PDV) and canine distemper virus (CDV), T105 for dolphin molbillivirus (DMV), peste-des-petits- ruminants vir us (PDPR), measles virus (MV) and rinderpest T104 for virus (RPV), T120 for Hendra virus (Hendra) and ⁇ Nipah virus (Nipah), human parainflu enza virus-2 (HPIV-2) and simian parainfluenza virus 5 (SV5) T117 if human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a) and human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b), Tl19 if mumps virus (Mumps), Newcastle disea se virus (NDV) If so, S120 is mentioned.
  • the homologous site of each M protein corresponding to A183 of SeV M protein is A183 for human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), F187, phocine distemper, which is not human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) Y171 for vir us (PDV) and canine distemper virus (CDV), Y172 for dolphin molbilliv irus (DMV), peste-des-petits-ruminants virus (PDPR), measles virus (MV) and rinderpest virus YRP for (RPV), Y187 for Hendra virus (Hendra) and O ⁇ Nipah virus (Nipah), Y18'4 for human parainfluenza virus-2 (HPIV-2), simian parainfluenza virus 5 (SV5 ) F184, human par ainfluenza virus-4a (HPIV-4a) and human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b) F188, mumps virus (Mumps) F186, Newcastle disease virus
  • white matter has any one of the above-mentioned three sites, preferably a combination of any two sites, and more preferably all three sites have amino acids substituted with other amino acids.
  • amino acids include basic amino acids (eg lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non- Polar amino acids (eg, alanine, parin, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan),] 3 branched amino acids (eg, threonine, parin, isoleucine), and aromatic amino acids (eg, tyrosine, phenol) Can be classified into groups such as Ruarayun, Tryptophan, Histidine), etc., for example, replacing an amino acid with an amino acid other than the amino acid of the group to which
  • substitution with acidic or neutral amino acids for basic amino acids substitution with nonpolar amino acids for polar amino acids, molecular weights greater than the average molecular weight of 20 natural amino acids.
  • substitution with an amino acid smaller than the average molecular weight is possible if it has an amino acid
  • substitution with an amino acid larger than that is possible if the amino acid is smaller than the average molecular weight For example, a mutation selected from the group consisting of G69E, T116A, and A183S in Sendai virus M protein, or another paramyxovirus M protein containing a mutation at a position homologous thereto can be used.
  • G69E is a mutation in which the 69th amino acid Gly of the M protein is substituted with Glu
  • ⁇ 16 ⁇ is a mutation in which the 116th amino acid Thr force la of the M protein is substituted
  • A183S is;
  • This is the mutation that is replaced by the second amino acid Ala force er. That is, the homologous sites of Sendai virus M protein G69, T116, and A183 or other viral sputum proteins can be substituted with Glu (E), Ala (A), and Ser (S), respectively.
  • These mutations It is preferable to have a combination, and it is particularly preferable to retain all three mutations.
  • Mutation can be introduced into the M gene according to a known mutation introduction method. For example, as described in the Examples, it can be introduced using an oligonucleotide having the desired mutation.
  • P253-505 (Morikawa, Y. et al., Kitasa to Arch. Exp. Med., 64; 15; 30 (1991)) may be used. It is also possible to replace the 104th Thr of the measles virus M protein corresponding to the 116th Thr of the SeV M protein or the 119th Thr of the Mumps virus M protein with another amino acid (for example, Ala). Good.
  • the vector of the present invention is deficient in the M gene.
  • M gene deficiency means that the function of the M3 ⁇ 4 gene is lost, and includes the case of having an M gene having a loss-of-function type mutation and the case of deleting the M gene.
  • a function-deficient mutation of the M gene can be produced, for example, by deleting the protein coding sequence of the M gene or inserting another sequence. For example, a stop codon can be designed in the middle of the M protein coding sequence (TO00 / 09700). Most preferably, the vector of this effort is completely deleted of the coding sequence of the M protein.
  • a vector lacking the 0RF of the M protein loses the ability to form viral particles under any conditions, unlike a vector encoding a conditional mutation M protein.
  • a cDNA encoding paramyxovirus genomic RNA in the presence of viral proteins necessary for reconstitution of RP containing paramyxovirus genomic RNA, ie, N, P, and L proteins. Is transferred. Transcription can generate a negative-strand genome (ie, the same antisense strand as the viral genome), or a positive strand (sense strand encoding a viral protein) can reconstitute a viral RNP. it can. In order to increase the efficiency of vector reconstitution, positive strands are preferably generated. RNA ends are the natural viral genome and Similarly, it is preferable to accurately reflect the ends of the 3 ′ leader sequence and the 5 ′ trailer sequence.
  • a T7 RA polymerase recognition sequence may be used as a transcription initiation site and the RA polymerase may be expressed in the cell.
  • the 3' end of the transcript can be encoded with a self-cleaving ribozyme so that the 3 'can be accurately cut out (Hasan, MK et al., J. Gen. Virol. 78: 2813—2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466).
  • a cloning site can be designed to insert foreign genes into cDNA encoding genomic RNA.
  • the site may be, for example, a desired position in a protein non-coding region of the genome, specifically 3, between the leader region and the viral protein 0RF closest to 3 ′, between each viral protein 0RF, And / or can be inserted between the 5 'nearest viral protein 0RF and the 5' trailer region.
  • a cloning site can be designed in the deleted region.
  • the cloning site can be, for example, a restriction enzyme recognition sequence.
  • the cloning site may be a so-called multi-cloning site having a plurality of restriction enzyme recognition sequences. Cloning sites may exist in multiple locations in the genome, so that multiple foreign genes can be inserted at different locations in the genome.
  • a DNA sample containing the cDNA sequence of the target foreign gene When integrating a foreign gene, first prepare a DNA sample containing the cDNA sequence of the target foreign gene. It is preferable that the DNA sample can be confirmed as a single plasmid by electrophoresis at a concentration of 25 ng // _ il or more.
  • viral genomic RNA is obtained using the Notl site.
  • An example will be described where a foreign gene is inserted into the encoded DNA. If the target cDNA base sequence contains a Notl recognition site, use a site-specific mutagenesis method, etc. to modify the base sequence so that the encoded amino acid sequence is not changed, and remove the Notl site in advance. It is preferable to keep it.
  • the gene fragment of interest is amplified from this sample by PCR and recovered.
  • both ends of the amplified fragment are used as Notl sites. Include the EIS sequence or its part in the primer so that the E-1-S sequence is placed between the 0RF of the foreign gene after insertion into the viral genome and the 0RF of the viral gene on both sides of the viral gene. To do.
  • the synthetic DNA sequence on the forward side may have any 2 or more nucleotides on the 5 ′ side to ensure cleavage by Notl (preferably 4 bases that do not contain sequences derived from Notl recognition sites such as GCG and GCC, (Preferably ACTT) is selected, a Notl recognition site gcggccgc is added to the 3 'side, and any 9 bases or a multiple of 6 to 9 is added as a spacer sequence to the 3' side.
  • the synthetic DNA sequence on the reverse side select any 2 or more nucleotides from the 5 'side (preferably 4 bases not including sequences derived from Notl recognition sites such as GC G and GCC, more preferably A CTT). Add the Notl recognition site gcggccgc on the 'side, and add the oligo DNA of the inserted fragment to adjust the length on the 3' side.
  • the length of this oligo T) NA is designed so that the chain length of the Notl fragment of the final PCR amplification product containing the E-IS sequence is a multiple of 6 (so-called “rule of 6 (rule of six) J; Kolakofski, D. et al., J. Virol.
  • PCR For PCR, a conventional method using Taq polymerase or other DNA polymerase can be used.
  • the amplified fragment of interest is digested with Notl and inserted into the NotI site of the plasmid vector — pBluescript. Confirm the base sequence of the obtained PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence.
  • the insert is excised from this plasmid with Notl and cloned into the Notl site of the plasmid containing the genomic cDNA. It is also possible to obtain a recombinant Sendai virus cDNA by directly inserting into the Notl site without using a plasmid vector.
  • recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to literature methods (Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Ha san, MK et al. , J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997).
  • an 18 bp spacer sequence (5 '-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3') (SEQ ID NO: 10) with a Notl restriction site was added to the cloned Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)).
  • a plasmid pSeVl 8 + b (+) containing a self-cleaving liposomal site derived from the antigenomic strand of hepatitis delta virus is obtained by inserting between the leader sequence and 0RF of the N protein (Hasan, MK et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820).
  • the cDNA encoding the genomic RNA is digested with restriction enzymes, and the fragment containing the M gene is recovered and cloned into an appropriate plasmid.
  • M gene mutations or M gene deletion sites are constructed on this plasmid.
  • the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) is used for mutation introduction.
  • a PCR-ligation method may be used in combination, and all or part of the 0RF of the M gene may be deleted and linked with an appropriate spacer sequence.
  • a virus genomic cDNA carrying a mutation in the M gene is prepared by collecting the fragment containing this and replacing it with the M gene of the original full-length genomic cDNA. Can do.
  • mutations can be introduced into, for example, the F and / or H genes.
  • the vector of the present invention can be reconstructed by transcribing the DNA encoding the genomic RNA in a cell in the presence of the above-mentioned viral protein.
  • the present invention provides a dish encoding the viral genomic RNA of the vector of the present invention for the production of the vector of the present invention!).
  • the present invention also relates to the use of DNA encoding the genomic RNA of the vector for application to the production of the vector of the present invention. Reconstitution of the virus from the genomic cDNA of the minus-strand RNA virus can be performed using known methods (W 097/16539; TO97 / 16538; Durbin, AP et al., 1997, Virology 235: 323-332). ;
  • RNA virus or a RP that constitutes a virus component, such as Paline fluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda-pest virus, Sendai virus, etc.
  • the vector of the present invention can be reconfigured according to these methods.
  • the specific procedure is as follows: (a) Paramyxovirus genomic RNA (negative strand RNA) ) Or a cDNA encoding the phase-trapping agent (positive strand) in a cell expressing N, P, and L proteins, (b) a complex containing the genomic RNA from the cell or its culture supernatant
  • the process of recovering the body can be used for manufacturing.
  • the transcribed genomic RNA is replicated in the presence of N, L, and P proteins to form an RNP complex.
  • the vector of the present invention can be produced in the form of RNP even in the absence of a functional M protein.
  • Enzymes such as T7 RNA polymerase that are required for transcription of the initial genomic RNA from DNA can be carried out by introducing a plasmid vector that expresses it, or, for example, by placing this gene in the chromosome of a cell. It can also be supplied by inducing expression and inducing expression during virus reconstitution. Genomic RNA and viral proteins necessary for vector reconstruction are supplied, for example, by introducing plasmids that express them. In the supply of these viral proteins, it is possible to use a helper virus such as a wild type or some mutant paramyxovirus, but this is not preferable because it causes the contamination of these viruses.
  • Examples of methods for introducing genomic RNA-expressing DNA into cells include the following: (1) a method for preparing a DNA precipitate that can be taken up by the target cell; (2) suitable for uptake by the target cell; A method of creating a complex containing positively charged DNA with low cytotoxicity, 3 A method of instantaneously opening a hole in the target cell membrane enough to allow DNA molecules to pass through, etc. is there.
  • transfection reagents can be used.
  • D0TMA Roche
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • D0TAP D0TAP
  • DOPE DOSPER
  • the transfection method used was used, and the DNA that entered the cells by this method was taken up by phagocytic vesicles.
  • a sufficient amount of DNA enters the nucleus (Graham, F. and an d Van. Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein , S.,
  • Method (3) is called electroporation and is more versatile than methods (1) and (2) in that it has no cell selectivity. Efficiency is the duration of the pulse current. It is considered to be optimal under the optimal conditions of the shape of the pulse, the strength of the electric field (gap between electrodes, voltage), the conductivity of the buffer, the DNA concentration and the cell density.
  • the method (2) among the three categories is easy to operate and can examine a large number of specimens using a large number of cells. Therefore, for introducing DNA into cells for vector reconstitution, Transfusion reagents are suitable.
  • Transfusion reagents are suitable.
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfecti on Reagent Roche, Cat No. 1811169
  • virus vector reconstitution from cDNA is not limited to these. Specifically, for example, it can be performed as follows. ''
  • N, P, and the quantity ratio of the expression vector encoding the L 2: 1: is preferably 2, amount of the plasmid, for example, the 1 ⁇ 4 ⁇ ⁇ pGEM - N, of 0. 5 ⁇ 2 ⁇ g pGEM- Adjust appropriately with P and about 1 to 4 ⁇ g of pGEM-L.
  • Transfected cells may contain 100 ⁇ g / ml rifampicin if desired.
  • cytosine arabinoside (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably g / ml cytosine arabinoside (AraC) (Sigma) containing only clotting-free MEM to minimize cytotoxicity of vaccinia virus Retain the optimal drug concentration to maximize virus recovery (Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). After culturing for 48 to 72 hours after transfection, collect the cells, crush the cells by repeating freeze-thaw three times, and then cultivate the rupture containing RNP again in LLC-MK2 cells. Transfusion can be introduced into cells in the form of a complex with, for example, lipophthalamine or polycationic liposome.
  • transfection reagents can be used. Examples include DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), D0TAP, DOPE, D0SPER (Roche # 1811169). To prevent degradation in endosomes, Kurochin can also be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 80: 3015).
  • DOTMA Roche
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • DOPE DOPE
  • D0SPER Roche # 1811169
  • Kurochin can also be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 80: 3015).
  • Vaccinia virus vT T-3 can be completely removed by diluting the resulting cell lysate and repeating reamplification. Re-amplification is repeated 3 times, for example.
  • the obtained RNP can be stored at -80 ° C.
  • the host cell used for reconstitution is not particularly limited.
  • cultured cells such as monkey kidney-derived LLC MK2 cells and CV-1 cells, hamster kidney-derived BHK cells, human-derived cells, and the like can be used.
  • infectious virus particles containing the protein in the envelope can be obtained.
  • the present invention provides a method for producing the vectors of the present invention as viral particles. Viral particles are more stable in solution than RNPs, and because they are infectious, they can be introduced into target cells simply by contacting the cells without the need for transfection reagents. It is particularly excellent for industrial use.
  • One of the methods for producing the vector of the present invention as a virus particle is a method of reconstituting a virus under a permissive condition # using a virus genome having an M gene having a conditional mutation. That is, when culturing cells into which the above-mentioned step (a), or the complex obtained by the above-mentioned steps (a) and (b) has been introduced, the M protein is allowed to function and function by performing the treatment under permissive conditions. Can be formed.
  • a method for producing a viral particle containing genomic RNA encoding an M mutant protein comprises: (i) a paramyxovirus N, P, and L protein in a cell under the permissive conditions of the M mutant protein, and A method of amplifying RP containing said genomic RA, and (ii) recovering virus particles released into the culture supernatant of said cells. For example, if it is a temperature-sensitive M mutant protein, culture it at an acceptable temperature.
  • Another method for producing the vector of the present invention as a virus particle is a method using a helper cell expressing M protein.
  • M helper cells By using M helper cells, the present inventors have modified the cleavage site of F protein into a sequence that can be cleaved by other proteases, and further produced a vector that mutates or deletes the M gene as a viral particle. It was. Since the method of the present invention does not require a helper virus such as a wild-type paramyxovirus, a virus capable of forming particles containing the M gene is not mixed, and the vector of the present invention can be prepared purely. Is possible.
  • the present invention comprises (i) a paramyxovirus genome thigh, (a) a nucleic acid encoding an M protein has been mutated or deleted, and (b) a modified F protein, wherein the protein is cleaved.
  • a viral particle having the ability to introduce the genomic RNA into a cell that comes into contact with the cell into which the particle has been introduced.
  • the viral particle does not produce viral particles.
  • Wild-type M protein may be derived from a paramyxovirus different from genomic RNA as long as it has the activity of forming virus particles.
  • a tag peptide or the like may be added, and when expressed from an appropriate expression vector, a beta-derived linker peptide may be added.
  • Viral particles produced from M-expressing cells contain the M protein expressed in this cell in the envelope, but do not contain the gene encoding this protein. Therefore, cells infected with this virus no longer express wild MM protein and can no longer form virus particles.
  • a helper cell expressing M protein can be prepared as follows.
  • an inducible promoter or a recombinant expression control system such as Cre / loxP is used.
  • Cre / loxP-inducible expression plasmid for example, the plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, plll5) designed to induce the gene product by Cre DNA recombinase. -1121) etc. can be used.
  • a helper cell line in which the M gene is integrated into the chromosome and the M protein can be continuously expressed by induction.
  • a helper cell line in which the M gene is integrated into the chromosome and the M protein can be continuously expressed by induction.
  • monkey kidney-derived cell line LLC-MK2 cells can be used. LLC-MK2 cells are cultured at 37 ° C, 5% C0 in MEM supplemented with 10% heat-treated immobilized rabbit fetal serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 / g / ml. Incubate in 2 .
  • FBS immobilized rabbit fetal serum
  • penicillin G sodium 50 units / ml penicillin G sodium 50 units / ml
  • streptomycin 50 / g / ml streptomycin 50 / g / ml. Incubate in 2 .
  • the above plasmid which is designed to induce and express the M gene product by Cre DNA recombinase, is introduced into LLC-MK2 cells according to a well-known protocol using the cannula phosphate method (mammalian transfection kit (Stratagene)). . '
  • a 10cm plate after introducing 10 M expression plasmid in LLOMK2 cells grown to 40% Konfuruento, in at MEM medium containing 10% FBS in 10 ml, 5% C0 2 incubator one among 37 ° C 24 Incubate for hours. Remove cells after 24 hours After suspension in the ground, use 5 pieces of 10 cm petri dishes, spread 5 ml 1 piece, 2 ml 2 pieces, 0.2 ml 2 pieces, G4 18 (GIBC0-BRL) 10ml 10 ° / containing 1200 ⁇ g / ml. Incubate in MEM medium containing FBS, and culture for 14 days while changing the medium every 2 days. Cells that are resistant to G418 grown in the medium are collected using claw ring. Continue to expand each recovered clone until confluent on a 10cm plate.
  • High expression of M protein in helper cells is important for recovering high-titer viruses.
  • an M expression plasmid having a certain drug resistance marker gene is tranfected, and a cell that retains the M3 ⁇ 4 gene is selected using the drug, and then an M expression plasmid having another drug resistance marker gene is again used.
  • By transfecting cells and selecting cells with this other drug resistance marker it is possible to select cells that can express M protein even higher than the cells selected in the first transfection. Is possible. In this manner, M helper cells constructed through two transfections can be suitably used.
  • An M helper cell can produce infectious virus particles that are deficient in both F and M genes by simultaneously expressing the F gene (W003 / 025570).
  • the F gene expression plasmid is also tranfected twice or more to further increase the F protein expression induction level.
  • the F gene a modified F protein gene as described in the present specification can be used.
  • the RNP of the present invention stagnated in these cells. May be introduced and cultured.
  • RNP can be introduced, for example, by transfecting cell lysate containing RNP into M helper cells, or by co-culturing RNP-producing cells and M helper cells.
  • RNP can be introduced into M helper cells by fusion.
  • genomic RNA may be transcribed in M helper cells to form new RNPs in the presence of N, P, and L proteins.
  • step (i) step of amplifying RNP with M helper cells
  • step (i) step of amplifying RNP with M helper cells
  • the temperature-sensitive mutant M protein it is necessary to perform the viral particle production process below the permissible temperature in the production of the vector.
  • the virus particle It has been found that efficient particle formation can be achieved by performing the process of forming particles at a low temperature.
  • the low temperature is 35 ° C or lower, more preferably 34 ° C or lower, more preferably 33 ° C or lower, and most preferably 32 ° C or lower.
  • viral particles of the present ⁇ for example 1 X 10 5 CIU / mL or more, preferably 1 X 10 6 CIU / raL or more, more preferably 5 X 10 6 CIU / mL or more, more preferred properly is 1 X 10 7 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 7 CIU / mL or more, more preferably 1 X 10 8 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 8 CIU / raL more titer Can be released into the extracellular fluid of virus-producing cells. Viral titers can be measured by methods described elsewhere herein (Kiyotani, K. et al., Virology 177 (1), 65-74 (1990); W000 / 70070) .
  • DNA encoding genomic RNA which can be positive or negative
  • virus 3 ⁇ 4 white matter group ie NP, P, L, M, F, and H proteins
  • B co-culturing the cell and a cell expressing an M gene integrated into the chromosome
  • M helper cell co-culturing the cell and a cell expressing an M gene integrated into the chromosome
  • M helper cell co-culturing the cell and a cell expressing an M gene integrated into the chromosome
  • D integrating the extract into the chromosome
  • a step of transfecting and culturing the expressed M gene-expressing cells M helper cells
  • the step (d) is preferably performed under the low temperature conditions described above.
  • the obtained virus particles can be amplified again (preferably at a low temperature) by infecting M helper cells again.
  • the virus can be reconstituted according to the description in the Examples.
  • the recovered virus particles can be amplified by infecting M helper cells again after dilution. This amplification process can be performed, for example, 2 or 3 times or more.
  • the resulting virus stock can be stored at -80 ° C.
  • Virus titer can be determined by measuring hemagglutination activity (HA). HA can be determined by the “endo-point dilution method”.
  • LLC-MK2 cells are first seeded in a 100 mm petri dish at 5 ⁇ 10 6 cells / dish.
  • genomic RNA is transcribed with T7 RNA polymerase, recombinant vaccinia virus (PLWUV-) expressing T7 polymerase treated with psoralen and long-wave ultraviolet light (365 nm) for 20 minutes after 24 hours of cell culture.
  • PLWUV- recombinant vaccinia virus
  • VacT7 Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)
  • MOI 2 room temperature for 1 hour.
  • plasmid that expresses genomic RNA
  • an expression plasmid that expresses paramyxovirus N, P, L, F, and ⁇ proteins, respectively. Transfect the lever cells.
  • the quantity ratio of plasmid can be, for example, 6: 2: 1: 2: 2: 2 in this order, but is not limited thereto.
  • wash twice with MEM without serum 40 g / mL Cytosine j3 -D-arabinofuranoside (AraC: Sigma, St.
  • the virus particle of the present invention is an infectious particle obtained by cleaving the modified F protein possessed by the virus particle, or infectious by treatment with a protease that cleaves the modified F protein. It may be a virus particle having a potential infectivity.
  • the envelope of the virus particle contains a modified F protein encoded by the genome, but if the protein is not cleaved, it is not infectious as it is.
  • Such a virus is treated with a protease capable of cleaving the cleavage sequence of the modified F protein, or is contacted with a cell or tissue in the presence of the protease, whereby the F protein is cleaved to acquire infectivity.
  • an envelope protein that is not encoded by the virus genome can be expressed in cells, and virus particles containing this protein in the envelope can be produced.
  • envelope proteins include An example is wild type F protein.
  • the virus particles produced in this way encode a modified F protein in the genomic RNA, but also have a wild type F protein in addition to this protein in the envelope.
  • wild-type F protein of the virus particle can be cleaved to gain infectivity.
  • infectious virus particles can be prepared at a high titer without using a protease that cleaves the 5 female F protein.
  • the virus particle of the present invention may be a virus particle containing a paramyxovirus wild-type F protein.
  • the wild type F protein may be an envelope protein of other paramyxoviruses even if it is not derived from the same species as the viral genome.
  • a virus particle having a desired virus envelope protein in its envelope may be prepared even if it is not a wild type F protein.
  • a virus vector having this envelope protein can be produced by expressing the desired envelope protein in cells during virus reconstitution.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the viral particles of the present invention include pseudo-liver vectors containing envelope proteins derived from viruses other than viruses derived from genomic RNA, such as VSV-G protein.
  • the envelope protein is not encoded in the viral genomic RNA. Therefore, after the virus particles have infected the cells, this protein is not expressed from the viral vector. Absent.
  • virus particles of the present invention have, for example, proteins such as adhesion factors, Gand, and receptors that can adhere to specific cells on the envelope surface, antibodies or fragments thereof, or these proteins in the extracellular region. It may also contain a chimeric protein having a viral envelope-derived polypeptide in the intracellular region. This also makes it possible to create vectors that target specific yarns and weaves. These can be supplied to the virus by expressing them in the cells at the time of reconstitution of the viral vector. Specifically, for example, a fragment containing a receptor binding domain of a soluble factor such as cyto force-in or an antibody fragment against a cell surface protein (W001 / 20989).
  • proteins such as adhesion factors, Gand, and receptors that can adhere to specific cells on the envelope surface, antibodies or fragments thereof, or these proteins in the extracellular region. It may also contain a chimeric protein having a viral envelope-derived polypeptide in the intracellular region. This also makes it possible to create vectors that target specific yarns and weaves.
  • a viral gene-deficient vector for example, if two or more vectors with different viral genes on the viral genome contained in the vector are introduced into the same cell, they will be defective in each. Since viral proteins are supplied by expression from other vectors, viral particles that are complementary to each other and form infectious virus particles are formed, and the replication cycle is repeated to amplify the viral vector. That is, when two or more vectors of the present invention are inoculated in a combination that complements viral proteins, a mixture of each virus gene-deficient virus vector can be produced in large quantities and at low cost. Since these viruses are deficient in viral genes, the genome size is smaller than viruses that do not lack viral genes, and large foreign genes can be retained. In addition, these viruses, which are not proliferative due to viral gene defects, are diluted outside the cell and difficult to maintain co-infection.
  • the virus vector obtained by the above-mentioned method can be infected with a developing chicken egg to amplify the vector.
  • a developing chicken egg For example, use a chicken to make a transgene body of the M gene, inoculate this egg with a vector and amplify it.
  • the basic method for the production of viral vectors using eggs has already been developed (Nakanishi et al., (1993), "Advanced Technology Protocol III for Neuroscience Research, Molecular Neuronal Physiology", Koseisha, Osaka , Pp. 153-172). Specifically, for example, fertilized eggs are placed in an incubator and cultured at 37-38 ° C for 9-12 days to grow embryos.
  • Viral vectors are inoculated into the allantoic cavity and eggs are cultured for several days to proliferate the virus vector. Conditions such as the culture period vary depending on the recombinant virus to be amplified. It can be broken. Then collect the urine containing the virus. Separation and purification of virus vectors from urine can be carried out according to conventional methods (Tatsuto Tashiro, “Virus Experiment Protocol”, supervised by Nagai and Ishihama, Medical View, pp. 68-73 (1995)).
  • the recovered viral vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method or a combination thereof including filtration (filtration), centrifugation, column purification, and the like.
  • “Substantially pure J means that the viral vector is a major component of the sample in which it is present. Typically, a substantially pure viral vector is included in the sample.
  • the proportion of protein derived from the virus vector is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, More preferably, it can be confirmed by occupying 80% or more, and more preferably 90% or more
  • a specific purification method of paramyxovirus for example, a method using cellulose sulfate ester or crosslinked polysaccharide sulfate ester (special No. 62-30752, No. 62-33879, No. 62-30753), and sulfated fucose-containing polysaccharides And / or a method of adsorbing it on its decomposition products (W097 / 32010), etc.
  • the vector of the present invention is useful for gene therapy targeting a tissue expressing a certain protease.
  • genes can be introduced into the surface of the target tissue, but it is difficult to penetrate the vector into the tissue.
  • the vector of the present invention has the ability to deeply infiltrate the vector into the tissue where the target protease activity is enhanced.
  • the vector of the present invention even for cancer cells that have infiltrated to the deep part of a normal tissue, by infecting a part of the surface of the cancer cell that can be vector-infected with the vector, Ma It is possible to transmit the vector with
  • joint diseases such as cancer, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis (M).
  • joint diseases such as RA
  • RA joint diseases
  • the collapse of the cartilage higher-order structure by the extracellular matrix ⁇ progresses and the joint is destroyed. It is expected that joint destruction will be reduced by removing cells whose ECM-degrading enzyme activity is enhanced by the betater of the present invention.
  • arteriosclerosis the aggregation of macrophage-derived foam cells proceeds. Foam cells secrete large amounts of metalloprotease, resulting in destruction of fibrous thickening and plaque failure. It is considered possible to treat such arteriosclerosis by killing macrophages expressing MMP using the vector of the present invention.
  • various proteases are activated in cancer.
  • the vector of the present invention is useful as a therapeutic vector that infects and infiltrates specifically for cancer.
  • the dose of the vector varies depending on the disease, patient weight, age, sex, symptom, purpose of administration, form of administration composition, administration method, transgene, etc., but can be determined as appropriate by those skilled in the art. is there.
  • the amount of vector administered is preferably from about 10 5 CIU / ml to about 10 11 CIU / ml, more preferably about 10 7 CIU / ml to about 10 9 CIU / ml, most preferably about 1 X 10 8 CIU / ml to about 5 X 10 8 CIU / ml It is preferred to administer in an acceptable carrier.
  • Administer to cancer tissue! ⁇ Vector can be administered to multiple sites so that it reaches the target site evenly.
  • the dose per dose is preferably 2 x 10 5 CIU to 2 x 10 10 CIU, and the dose can be given once or multiple times within the range of clinically acceptable side effects. The same applies to the number of times.
  • an amount converted from the above dose can be administered based on the body weight ratio between the target animal and human or the volume ratio (for example, average value) of the administration target site.
  • the administration target of the composition containing the vector of the present invention includes all mammals such as human, monkey, mouse, rat, rabbit, hidge, ushi, and nu.
  • the vector of the present invention is useful for the treatment of cancer.
  • the vector of the present invention can be used for the treatment of cancer in which the activity of a specific protease is enhanced.
  • the present invention provides a therapeutic composition for cancer comprising the vector of the present invention encoding an F protein that is cleaved by a protease whose activity is enhanced in cancer, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to the use of the vector in the manufacture of a cancer therapeutic composition.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising the step of administering the vector to cancer.
  • ECM-degrading enzyme Since the activity of ECM-degrading enzyme is enhanced in malignant cancers that infiltrate and metastasize, using a vector with an F protein gene that is cleaved by ECM-degrading enzyme causes the malignant cancer to be specifically infected with the vector.
  • the tissue can be killed.
  • the vector can carry a foreign gene.
  • the foreign gene may be a marker gene for monitoring vector infections, or a cancer therapeutic gene.
  • therapeutic genes include cell-inducible genes such as apoptosis, genes encoding proteins with cytotoxicity, cytokines, hormones, and the like.
  • the vector of the present invention is administered directly to cancer (in vivo).
  • the vector of the present invention can be introduced into a patient-derived cell or other cells, and the cell can be administered to cancer by indirect (ex vivo) administration in which the cell is injected into the cancer.
  • Fig. 1 is a diagram showing the construction scheme of F-deleted SeV genomic cDNA in which a temperature-sensitive mutation is introduced into the M gene.
  • Figure 2 shows the structure of the viral gene constructed for the purpose of controlling the secondary release particles by the introduction of temperature-sensitive mutagenesis into the M gene and the virus gene constructed or used to compare the effects of the mutagenesis.
  • Figure 3 shows SeV18 + / ⁇ F-GFP or SeV18 + / MtsHNts ⁇ F-GFP infecting cells that continuously express the F protein (LLC-MK2 / F7 / A), 32 ° C and 37 ° C, respectively. It is a photograph which shows the microscope image which shows GFP expression after culture
  • FIG. 4 shows that cells that continuously express SeV-F protein (LLC-MK2 / F7 / A) were cultured in trypsin and serum-free MEM at 32 ° C or 37 ° C, and the F protein increased over time. It is a photograph which shows the result of having observed the expression level semi-quantitatively by Western blotting.
  • Figure 5 shows that LLC-MK2 cells were infected with SeV18 + GFP, SeV18 + / ⁇ F-GFP or SeV18 + / MtsHNts ⁇ FG FP at moi 3 and cultured at 32 ° C, 37 ° C or 38 ° C for 3 days.
  • 2 is a photograph showing a microscopic image showing expression.
  • FIG. 6 shows LLC-M 2 cells with SeV18 + GFP, SeV18 + / ⁇ F-GFP It is a figure which shows hemagglutination activity (HA activity) of the culture supernatant which infected FP at moi 3 and cultured at 32 ° C, 37 ° C or 38 ° C, and sampled with time (changed to a new medium at the same time)
  • Figure 7 shows that LLC-MK2 cells were infected with SeV18 + GFP, SeV18 + / AF-GFP or SeV18 + / MtsHNts AF-GFP at m.o3, and the culture supernatant and cells after 2 days of culture at 37 ° C M protein between intracellular and virus-like particles (VLP) obtained by Wester ⁇ -blotting using anti-M antibody, using 1/10 equivalent of lwell of 6-well plate culture per lane. It is a photograph showing the abundance ratio.
  • VLP virus-like particles
  • Figure 8 shows that LLC-MK2 cells were infected with SeV18 + SEAP / ⁇ F-GFP or! /, Or SeV18 + SEAP / MtsHNts ⁇ F-GFP at moi 3, and after 12, 18, 24, 50, 120 hours of culture. It is a figure which shows the SEAP activity measured using the sampled culture supernatant.
  • Figure 9 shows LLC-MK2 cells infected with SeV18 + SEAP / ⁇ F-GFP or! / Or SeV18 + SEAP / MtsHNts ⁇ F-GFP at moi 3 and sampled after 24, 50, 120 hours of culture. It is a diagram showing Kiyo's HA activity.
  • Figure 10 shows that LLC-MK2 cells were infected with SeV18 + SEAP / ⁇ F-GFP or SeV18 + SEAP / MtsHNts ⁇ F-GFP at moi 3, and the culture supernatant sampled after 5 days of culture was centrifuged. This is a photograph showing the amount of virus-like particles determined by Western blotting using anti-M antibody, using virus collected and 1/10 equivalent of 6-well plate culture lwell per lane.
  • Figure 11 shows that LLC-MK2, BEAS-2B or CV-1 cells were treated with SeV18 + / ⁇ F-GFP or SeV18 + / MtsHNts AF-GFP moi 0, 01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 , 3, 10 and cultured in medium without serum or with 10% FBS, medium without serum 3 days after infection, medium with 10% FBS 6 days after infection It is a figure which shows the cytotoxicity estimated from the amount of LDH released to ⁇ . The cells with the same number of cells were expressed as relative values with the value when 100% lysis was performed using a cytopathic agent (Triton).
  • Triton Triton
  • Fig. 12 shows LLC-MK2 Itoda vesicles with SeV18 + GFP, SeV18 + / AF-GFP Infection with F-GFP at moi 1, 32 ° C, 37. C or 38. It is a photograph showing the intracellular localization of M protein obtained by culturing in C and immunostaining using an anti-M antibody 2 days after culturing.
  • Figure 13 shows A-10 cells infected with SeV18 + SEAP / AF-GFP or SeV18 + SEAP / MtsHNts AF-GFP at m. O. I. 1 and cultured at 32 ° C or 37 ° C, 10 ° /. 1 day after culture in serum-containing medium Immunostaining with anti-M antibody and anti-HN antibody! /, Subcellular localization of M and HN proteins observed using confocal laser microscope It is a photograph which shows. This is shown as a stereo stereoscopic image.
  • Figure 14 shows A-10 cells infected with SeV18 + SEAP / AF-GFP or SeV18 + SEAP / MtsHNts AF-GFP at moi 1, cultured at 32 ° C or 37 ° C, and medium containing 10% serum.
  • 2 is a photograph showing the intracellular localization of M protein and HN protein observed with a confocal laser microscope after immunostaining using anti-M antibody and anti-HN antibody after 2 days in culture. This is shown as a stereo stereoscopic image.
  • Fig. 15 is a photograph showing the effect of a microtubule depolymerization reagent on the intracellular localization of M and HN proteins.
  • FIG. 18 is a diagram showing a construction scheme of both F and M deletion type SeV genomic cDNA.
  • FIG. 19 shows the structure of the constructed F and / or M-deleted SeV gene.
  • FIG. 20 is a view showing a construction scheme of an M gene expression plasmid having a hygromycin resistance gene.
  • Figure 21 shows the inducible expression of the cloned M (and T) protein. After infection with a recombinant adenovirus (AcCANCre) expressing Cre DNA recombination ⁇ M and F by W estern-blotting It is a photograph which shows the semiquantitative expression comparison of protein.
  • AcCANCre recombinant adenovirus
  • Figure 22 is a photograph showing virus reconstitution of M-deleted SeV (SeV18 + / AM-GFP) using helper cells (LLC-MK2 / F7 / M) clones # 18 and # 62.
  • Figure 23 shows the virus productivity of SeV18 + / AM-GFP (time course of CIU and HAU).
  • Fig. 24 is a photograph and figure showing the results of RT-PCR for confirming the gene structure in the virion of SeV18 + / ⁇ M-GFP.
  • Figure 25 shows Western blotting of viral proteins in cells and culture supernatants after infection of LLC-MK2 cells to confirm the viral structure of SeV18 + / AM-GFP from the protein perspective! It is a photograph which shows the comparison result with / ⁇ , SeV18 + GFP and SeV18 + / ⁇ F-GFP.
  • Figure 26 shows quantitative comparison of virus-derived proteins in the culture supernatant of LLC-MK2 cells infected with SeV18V ⁇ M-GFP and SeV18 + / ⁇ F-GFP (Western blotting by preparing a dilution series). It is a photograph. Anti-SeV antibody (DN-1) was used.
  • Fig. 27 is a diagram showing the HA activity in the culture supernatant collected over time after infection with SeV18 + / ⁇ M-GFP or! /, Or SeV18 + / ⁇ F-GFP in LLC-MK2 at moi 3 .
  • FIG. 28 is a photograph showing a fluorescence microscopic image 5 days after infection when SeV18 + / ⁇ -GFP or SeV18 + / ⁇ F-GFP was infected with LLC-MK2 at moi 3.
  • Figure 29 shows the culture supernatant collected after 5 days of infection with SeV18 + / ⁇ -GFP or SeV18 + / ⁇ F-GFP in LLC-MK2 at moi 3, using cationic ribosome (Dosper). Take a photo showing a fluorescence microscope image two days after transfection into LLC-M2.
  • FIG. 30 shows the design of the amino acid sequence at the cleavage site of F1 / F2 (activation site of F protein).
  • the recognition sequence of protease (MMP or uPA) highly expressed in cancer cells was designed based on the sequence of the synthetic substrate.
  • FIG. 31 shows a cDNA construction scheme of an M-deleted SeV vector in which the F activation site is converted.
  • Fig. 32 is a photograph showing protease-dependent cell fusion type infection with F-modified M-deficient Sendai virus vector.
  • SeV / ⁇ - GFP A, B, C, J, K, L
  • SeV / F MMP # 2
  • M— GFP D, E, F, M, N, 0
  • SeV / F uPA
  • Cell fusion type infection is observed and synthiti um3 ⁇ 4r is a multinucleated cell 7 (E, F, M) o
  • uPA urokinase—type plasminogen activator
  • tPA tissue-type PA
  • HT1080 (A, D, G), a cancer cell line expressing secret expression, MKN28 (B, E, H), a cell line expressing tPA, and SW620 (C, F, I), which does not express either protease, are used.
  • MMP # 2 SeV / F
  • ⁇ -GFP is 10 times more infected (D)
  • uPA SeV / F
  • SW620 which does not express either protease
  • Fig. 34 is a photograph showing concealment induction by Phorbol Ester and induction of cell fusion type infection of F-modified M-deficient Sendai virus vector.
  • MMP2 The expression of MMP2, 9 was confirmed by the gelatin zymography method in which the portion with gelatin degradation activity was whitened (A). Lane C is the control and T is the supernatant induced by 20 nM PMA. MMP9 panda is confirmed in HT1080 and Pane I, indicating that MMP 9 is induced. Concealment 2 shows that latent MMP2 was detected in Pane I before induction, but it is a latent type, so it is almost active. As shown by B, SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP was shown to show cell fusion type infection by MP9 induction.
  • Fig. 35 is a photograph showing cell fusion type infection of F-modified M-deficient Sendai virus vector in vivo.
  • HT1080 tumor bearing nude mice were prepared. Individuals with a major axis exceeding 3 mm after 7-9 days after subcutaneous injection were horned. 50 SeVs were injected only once. Two days later, it was observed with a fluorescence microscope. A, D, G, and J are bright fields, B, E, H, and K are GFP fluorescence images, and C, F, I, and L are magnified images. SeV-GFP and SeV / ⁇ -GFP are confirmed to be fluorescent only around the injection (Panels E and H). On the other hand, it was observed that SeV / F (Ken # 2) ⁇ -GFP spreads to the whole cancer (Panel K). In the enlarged version, SeV-GF P, SeV / ⁇ M-GFP shows fluorescence for each cell, whereas SeV / F ( ⁇ # 2) ⁇ M-GFP has no cell shape and cell fusion. It was suggested that
  • FIG. 36 is a diagram showing cell fusion type infection of F-modified M-deficient Sendai virus vector in vivo.
  • the ratio of GFP to the whole cancer in the photographic image in Fig. 35 was measured from the area by NIH image.
  • SeV-GFP has 10% and SeV / ⁇ M-GFP power 3 ⁇ 40%, while SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP has 90 ° /.
  • MMP # 2 SeV / F
  • FIG. 37 shows the antitumor effect of the F5 female altered M-deficient SeV vector in tumor-bearing nude mice.
  • the size of the tumor volume in Fig. 5 was measured.
  • Four groups of SeV were injected into cancers that had developed more than 3 cm. Two days later, it was injected again and the size of the cancer was measured.
  • PBS, SeV-GFP, and SeV / ⁇ -GFP rapidly grew in size, whereas SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP, which had spread throughout the entire cancer, as shown in Figure 36, The injected cancer clearly did not grow and remained small.
  • Figure 3-8 shows the expression of protease in cancer cells of the F non-cleavable F-modified M-deficient SeV vector. It is a photograph which shows selective infection.
  • SeV / F (MMP # 2) ⁇ M-GFP is infected with MMP-expressing strain HT1080, but tPA-expressing strain MKN28 is not infected.
  • SeV / F (uPA) ⁇ -GFP is infected in the tPA-expressing strain MKN28 but not in the MMP-expressing strain HT1080.
  • Fig. 39 is a photograph showing the acquisition of infection by induction of MMP3, 7 by fibroblast of F non-cleavable F-modified M-deleted SeV vector. '
  • FIG. 40 is a photograph showing MMP selective infection of F-modified M-deficient SeV vector to human aortic smooth muscle cells.
  • SeV / F secret # 2
  • SeV / F secret # 2
  • FIG. 41 is a photograph showing protease-dependent F cleavage of F-modified M-deficient SeV vector.
  • Lanes 1, 4, 7, and 10 M-deleted SeV vector with unmodified force Lanes 2, 5, 8, and 11 are M-deleted SeV vectors with MMP # 2 sequence inserted in F
  • Lanes 3, 6, 9, 12 are M-deleted SeV vectors in which uPA sequence is inserted into F.
  • the above protease untreated, lanes 1, 2, 3; 0.1 ng / ml MMP9, lanes 4, 5, 6 0.1 ng / ml uPA, lanes 7, 8, 9; 7.5 / g / ml trypsin, lanes 10, 11, 12) 37. C, treated for 30 minutes.
  • FIG. 42 shows the comparison of the fusion ability by the construction of F cytoplasmic domain deletion mutant and co-expression with HN.
  • A Construction diagram of Sendai virus F protein cytoplasmic domain deletion mutant. Number from top to bottom: 7 6-7 9
  • FIG. 43 shows that the F / HN chimeric protein dramatically increases the fusion ability.
  • A F / HN chimeric protein structure diagram.
  • the linker sequence in the figure is SEQ ID NO: 80.
  • B Fusion ability of F / HN chimeric protein is increased by insertion of Linker.
  • Each Sendai virus F / HN chimeric protein and HN were co-expressed in LLCMK2 cells supplemented with 5 ig / ml trypsin.
  • Fig. 44 is a photograph showing the outline of insertion of the MMP substrate sequence into the F cleavage site of the F / HN chimeric protein.
  • A Construction diagram of F-modified F / HN chimeric protein with MMP substrate sequence inserted. Sequence number: 8 1-8 9 in order from the top.
  • Fig. 45 shows the effect on F peptide (Fusion peptide) modification and concentration-dependent syncytium formation.
  • A Fusion peptide modification construction diagram. SEQ ID NOs: 90 to 93 from the top.
  • Fig. 46 shows the genome structure of the modified F-modified M-deficient Sendai virus.
  • Fig. 47 shows the spread of the modified F-modified M-deleted type in cancers with low MMP expression. It is. Shows the extent of cell fusion 2 days after infection with improved F-modified M-deficient Sendai virus.
  • Fig. 48 is a photograph showing the expression of MMP2 and MMP9 in cancer cell lines. Gelatin zymography of the supernatant of the cancer cell line is shown.
  • FIG. 49 shows the spread of improved F-modified M-deleted Sendai in cancers with low MMP expression.
  • ⁇ is SeV18 + / AM-GFP
  • # 2j is SeV18 + / F (secret # 2)
  • ⁇ -GFP “ # 6 ”is Se V / F (MMP # 6)
  • a M-GFP,“ # 6ctl4j is 3 ⁇ 0! () /? 14 (3 ⁇ 4 »1? # 6) ⁇ 3 ⁇ 41-6 ???
  • F / H Chimera J represents SeV (TDK) / Fct 14 (MMP # 6) / Linker / HN ⁇ M-GFP.
  • Virology 74, 6564-6569 (2000), W000 / 70070 was digested with Nael, the fragment containing M gene (4922bp) was separated by agarose electrophoresis, the corresponding panda was excised, recovered with QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN, Bothell, WA), and pBluescript II ( It was subcloned into the EcoRV site of St ratagene, La Jo 11 a, CA) (construction of pBlueNaelfr g- ⁇ FGFP).
  • the temperature-sensitive mutation was introduced into the M gene on this pBlueNaelf rg- ⁇ FGFP using the QuikChange ' M Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) according to the method described in the kit.
  • the type of mutation introduced into the M gene uses the sequence of C1. 151 strain (Kondo, T. et al., J. Biol. Chem. 268: 21924-21930 (1993)) reported by Kondo et al. Then, three mutations were introduced: G69E, T116A, and A183S.
  • the sequence of the synthetic oligo used for mutagenesis is G69E (5 '-gaaacaaacaacca atctagagagcgtatctgacttgac-3 / ⁇ ⁇ ⁇ IJ ⁇ " ⁇ : 1 1, 5 -gtcaagtcagatacgctctctaga ttggttgtttgtttc- 3> // SEQ ID NO: 1 2), T116A ( 5 '-attacggtgaggagggctgttcgag caggag-3' ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ row number ⁇ ": 1 3, 5 -ctcctgctcgaacagccctctcaccgtaat-3 '/ column c column number ⁇ 1 4) and A183S (5 _ ggggcaatcaccatatccaagatcccaagacc-3 , 5 ggtctttgggatcttggatatggtgattgc
  • PBlueNaelfrg-AFGFP having 3 mutations on the M gene was digested with Sail and then partially digested with ApaLI to recover a fragment (2644 bp) containing the entire M gene.
  • P SeV18 + / AF-GFP was digested with ApaLI / Nhel to recover a fragment containing the HN gene (6287 bp).
  • the temperature-sensitive mutagenesis of the HN gene is performed on this LitmusSall / Nhelfrg-Mts ⁇ FGFP using the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit as in the case of the mutagenesis.
  • LitmusSall / Nhelfrg-MtsH ts Does not contain the fragment (8931bp) recovered by digesting with Sall / Nhel, and the M and HN genes recovered by digesting pSeV18 + / AF-GFP with Sall / Nhel.
  • the fragment (8294bp) was ligated, and F-deleted Sendai virus full-length genomic cDNA ( P SeV18 + / MtsHNts ⁇ with 6 temperature-sensitive mutations in the M and HN genes and the EGFP gene in the F deletion site) F-GFP) (Fig.
  • a cDNA carrying the secreted alkaline phosphatase (S EAP) gene was also constructed. That is, a SEAP fragment (W000 / 70070) having a termination signal-intervening sequence-initiation signal downstream of the SEAP gene was excised with Notl (1638 bp), recovered after electrophoresis, purified, purified with P SeV18 + / AF-GFP and pSeV18 + / MtsHNts ⁇ was incorporated into the Notl site of F-GFP. They were pSeV18 + SEAP / AF_GFP and pSeV18 + SEAP / MtsHNts ⁇ F-GFP, respectively (FIG. 2).
  • Virus reconstitution was performed according to the report of Li et al. (Li, H. -0. Et al., J. Virology 74. 6564-65 69 (2000), W000 / 70070).
  • F protein helper cells were used to reconstitute the F deletion virus.
  • the Cre / loxP expression induction system is used for the production of the helper cells.
  • the system is a plasmid pCALNdLw (Arai, T. et al., J.A.) designed to induce gene products with Cre DNA recombinase.
  • a recombinant adenovirus (Ax CANCre) expressing Cre DNA recombinase was transformed into the plasmid transformant by the method of Saito et al. (Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821
  • the reconstruction of the temperature-sensitive mutagenesis virus was performed as follows. LLC- M 2 cells are seeded in 5 x 10 6 cells / dish in a 100 ⁇ petri dish, cultured for 24 hours, and treated with psoralen and long-wave ultraviolet light (365 nm) for 20 ⁇ ⁇ for recombination expressing T7 polymerase. Nanttoquasia Wininoles (PLWUV-VacT7: Fuerst, TR et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) was infected for 1 hour at room temperature (moi 2).
  • Plasmid pSeV18 + / MtsHNts A F_GFP, pG EM / NP, pGEM / P, pGEM / L and pGEM / F-HN (Kato, A.
  • the titers of each virus solution prepared by this method were SeV18V AF-GFP, SeV18 + / MtsH Nts ⁇ F-GFP, SeV18 + SEAP / ⁇ F-GFP and SeV18 + SEAP / MtsHts ⁇ F-GFP, 3 X 10 8 , 7 X 10 7 , 1.8 X 10 8 and 3 ⁇ 4.
  • 9 X 10 7 GFP-CIU / mL the definition of GFP-CIU is described in WOOO / 70070).
  • CIU directly counted and quantified by GFP fluorescence is defined as GFP-CIU.
  • GFP-CIU shows substantially the same value as CIU (WOOO / 70070). Measure these titers As for SeV18 + / AF-GFP and SeV18 + / MtsHNts A F-GFP, the spread of plaques after infection in cells that continuously express F protein (LLC-MK2 / F7 / A) is 32 ° C to 37 ° C. Observed with C. The photograph 6 days after infection is shown in Fig. 3. SeV18 + / MtsHNts ⁇ F- GFP had some plaque spread at 32 ° C, but decreased drastically at 37 ° C, suggesting decreased virion formation. .
  • the temperature after P1 was performed at 32 ° C. This is because the virus used as a reference for the introduction of temperature-sensitive mutations has good growth at 32 ° C (Kondo, T. et ah, J. Biol. Chem. 268: 219 24-21930 (1993), Thompson, SD et ah, Virology 160: 1-8 (1987)), but by examining the experimental conditions in detail, SeV reconstruction (other than temperature-sensitive mutagenesis virus) However, it became clear that the reconfiguration efficiency increased by performing the process at 32 ° C after P1, and it was highly possible to collect even things that were difficult to obtain.
  • the second point is that the expression of F protein in LLC-MK2 / F7 / A is maintained when cultured at 32 ° C.
  • Cells that continuously express F protein (LLC-MK2 / F7 / A) are cultured at 37 ° C until confluent in MEM containing 10% FBS in a 6-well plate, and contain 7.5 ⁇ g / mL Trypsin. substituted serum ⁇ MEM such include 32 ° C Arure, were cultured in 3 7 ° C, Cells were collected with a cell scraper over time, and Western blotting using an anti-F antibody (mouse monoclonal) was performed to semi-quantitatively analyze intracellular F protein.
  • expression was maintained for 2 days but decreased thereafter, but at 32 ° C, F protein expression was maintained for at least 8 days (Fig. 4). From this point, the effectiveness of reconstruction at 32 ° C (after P1) was confirmed.
  • the Western blotting was performed by the following method. Cells collected from lwell of a 6-well plate were stored frozen at -80 ° C, and then lysed with 100 SDS-PAGE sample buffer (Red Loading Buffer Pack; New England Biolabs, Beverly, MA) diluted to lx. Heated at ° C for 10 minutes. After centrifugation, 10 ⁇ L of the supernatant was loaded onto SDS-PAGE gel (Multigel 10/20; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan).
  • PVDF membrane Immobilon Transferred to PVDF transfer membrane; Millipore, Bedford, MA by semi-dry method for 1 hour at 100 mA Transfer membrane (Procedure) (Bloc k Ace; Snow Brand Milk Products Co., Ltd, Sapporo, Japan; After standing for 1 hour or longer, it was immersed in a primary antibody solution containing 10% Block Ace and 1/1000 volume of anti-F antibody added, and allowed to stand at 4 ° C. 0. 05 ° /.
  • SeV18 + / AF-GFP and SeV18 + / MtsHNts AF-GFP an autonomously replicating form with all viral proteins and a GFP fragment (780 bp) with a GFP gene at the Notl site and a termination signal-intervening sequence-initiating signal downstream of it.
  • HA activity hemagglutination activity
  • 1H J was converted to 1 X 10 6 viruses and expressed as the number of viruses (Figure 6). It was judged that SeVl 8 + / MtsHNts ⁇ F-GFP significantly decreased the secondary emission particles and decreased to about 1/10 of SeV18 + / ⁇ F-GFP at 37 ° C. SeV18 + / MtsHNts A F_GFP also reduced the formation of virus particles even at 32 ° C, but it was thought that it was possible to produce it because some particles were produced to some extent.
  • the antibodies are newly prepared polyclonal antibodies, which are SeV-M protein 1-13 (MADIYRFPKFSYE + CysZ SEQ ID NO: 2 1), 23-35 (LRTGPDKKAIPH + CysZ SEQ ID NO: 2 2) and 336-348 (Cys + Usagi immunized by mixing 3 kinds of synthetic peptides of NVVAK IGRIRKLZ SEQ ID NO: 2 3) It was prepared from serum. Western-Blotting was performed according to the method described in Example 3. The anti-M antibody of the primary antibody was diluted 1/4000, and the anti-rabbit IgG antibody bound to HRP of the secondary antibody.
  • Example 5 Temperature-sensing ⁇ Live mutation-introduced viral gene expression level (SEAP assay) In SeV18 + / MtsHNts AF-GFP, the amount of secondary released particles decreased, but at the same time, the expression level of the on-loading gene decreased. As a result, the expression level of the gene expression vector was verified.
  • SeV18 + SEAP / AF-GFP and SeV18 + SEAP / MtsH ts A F-GFP infected with LLC-MK2 cells at moi 3 and then cultured over time (after infection 12, 18, 24, 50, 120 hours) The supernatant was collected, and the SEAP activity in the supernatant was performed according to the method described in the kit using Reporter Assay Kit-SEAP (T0Y0B0, Osaka, Japan). There was almost no difference in SEAP activity between the two (Fig. 8).
  • HA activity hemagglutination activity
  • SeV18 + SEAP / MtsHNts ⁇ F-GFP hemagglutination activity
  • Fig. 9 The virus of the same sample was centrifuged at 48,000 g for 45 minutes to recover the viral protein, and then semi-quantitatively analyzed by Western-Blotting using an anti-M antibody. In this case as well, a decrease in viral protein in the supernatant was confirmed (Fig. 10). It was judged that the introduction of temperature-sensitive mutations could reduce the secondary release particles to about 1/10 without substantially reducing the expression level of the onboard gene.
  • LLC-2, BEAS-2B, and CV-1 cells were seeded and cultured on a 2.5-well plate at 2.5 ⁇ 10 4 cells / we 11 (100 ⁇ L / well).
  • LLC-MK2 and CV-1 contain MEM containing 10% FBS
  • BEAS-2B contain 10% FBS
  • D-MEM and RPMI Gibco-BRL, R A 1: 1 mixture of ockville, MD
  • SeV18 + / AF-GFP or SeV18 + / MtsHNts A F-GFP solution diluted with EM containing 1% BSA at 5 ⁇ L / well, and infect the virus solution after 6 hours.
  • the medium containing was replaced with each medium with or without 10% FBS. If the medium does not contain FBS, sample the culture supernatant 3 days after infection, and if the medium contains FBS 6 days after infection, use the Cytotoxicity Detection Kit (Roche, Basel, Switzerland). Cytotoxic quantification was performed according to the method. In LLC-MK2, no cell damage was observed in both cases.
  • the cytotoxicity of SeV18 + / MtsHNts ⁇ F-GFP was determined to be the same as or lower than that of SeV18 + / ⁇ F-GFP (FIG. 11). In other words, it was concluded that cytotoxicity was not induced by the suppression of secondary release particles upon introduction of temperature-sensitive mutagenesis.
  • SeV18 + GFP which is an autonomously replicating type and has both F and HN proteins
  • a concentrated image of M protein on the cell surface was observed at any of the temperatures studied (Fig. 12).
  • M protein enrichment images have already been reported (Yoshida, T. et al., Virology 71: 143-161 (1976)) and are thought to reflect the location of virion formation. That is, in SeV18 + GFP, at any temperature Oh! / However, it is thought that the localization of M protein on the cell surface is normal and that a sufficient amount of virions are formed.
  • SeV18 + / AF-GFP the concentration of M protein was extremely reduced at 38 ° C.
  • SeV18 + / AF-GFP lacks one of the F proteins and is thought to affect the localization of the M protein.
  • SeV18 + / MtsHNts AF-GFP had a strong effect, and it was predicted that even at 37 ° C, M protein localization was hindered, resulting in a decrease in secondary emission particles.
  • immunostaining was performed 1 day and 2 days later using anti-M antibody and anti-HN antibody. Immunostaining was performed by the following method.
  • T0_PR03 Molecular Plobes, Eugene, OR
  • Slow Fade Antifade Kit to suppress quenching (Molecular Plobes, Eugene, OR) Observation was performed under a confocal laser microscope. The results one day after infection are shown in Fig. 13. Red indicates the localization of M protein and green indicates the localization of HN protein. In addition, since the color of far red is converted, blue is the nucleus.
  • SeV18 + SEAP / A F-GFP there is no significant difference in the localization of each protein at either 32 ° C or 37 ° C, and the localization of M protein and HN protein on the cell surface Has been observed.
  • the localization of each protein is different from that of SeV18 + SEAP / AF-GFP at both temperatures, and the localization of M protein on the cell surface is different. rare.
  • the M protein and HN protein are almost completely separated, and the M protein is localized near the centrosome of the microtubule (ie, near the Golgi body). doing.
  • This structure may be due to the aggregation of the M protein itself or the depolymerized microtubule debris, but in any case, the SeV18 + SEAP can be seen in Figure 13 M protein when cultured at 32 ° C after infection with / MtsHNts ⁇ F-GFP Highly likely to be localized along the microtubule! /.
  • M protein M protein
  • Fig. 16 Two days after infection, the intracellular localization of M protein (Oi protein) was observed by the same method as described above. The results are shown in Fig. 16. Both virus-infected cells showed similar phenomena. That is, when cultured at 32 ° C after infection, it was observed as a large fibrous structure as in FIG. In the case of SeV18 + / AF-GFP, M protein may coexist with microtubules. Furthermore, at 37 ° C, it was observed especially in SeV18 + / MtsHNts AF-GFP-infected cells, and was localized at a site expected to be near the Golgi apparatus.
  • the Golgi apparatus is located near the central body where many tubulins are expected to exist. It can be expected to be synthesized near the central body of the microtubule (ie, near the Golgi apparatus).
  • Fl-R strain a variant of SeV, has a mutation in the M gene, but changes the microtubule after infection to enable particle formation independent of the polarity of the F1-R strain cells. (Tashiro,. Et al., J. Virol. 67, 5902-5910 (1993)). That is, the results of this example can also be explained by assuming intracellular movement of the M protein along the tubulin. In this expected mechanism, the introduction of the temperature-sensitive mutation into the M and ⁇ genes causes defects in the subcellular localization of the M protein, resulting in the reduction of secondary release particles. It was determined that
  • M-deleted Sendai virus full-length genomic cDNA (p SeV18 + / AM: W000 / 09700) lacking the M gene was used.
  • the construction scheme is shown in Figure 17.
  • was subcloned into (construction of pSE-BstEIIfrg).
  • PEGFP (T0Y0B0, Osaka, Japan) carrying the GFP gene was digested with Acc65I and EcoRI, 5 with DNA blunting Kit (Takara, Kyoto, Japan), and end smoothed by filling in with EcoRV. After digestion, it was subcloned into pSE-BstEIIfrg that had been treated with BAP (T0Y0B0, Osaka, Japan). The BstEII fragment containing the EGFP gene was restored to the original pSe V18 + / AM, and an M-deleted SeV genomic cDNA (pSeV 18 + / ⁇ -GFP) carrying the EGFP gene at the M deletion site was constructed.
  • SeV genomic cDNA lacking both M and F genes was constructed.
  • the construction scheme described below is shown in Figure 18.
  • F-deleted Sendai virus full-length genomic cDNA carrying the EGFP gene at the F deletion site (pSeV18 + / A F-GFP: Li, H.— 0. et al., J. Virology 74 , 6564-6569 (2000), WO00 / 7O070) using pBlueNaelfrg- ⁇ FGFP constructed by subcloning the Nael fragment (4922bp) into the EcoRV site of pJBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA). Gene deletion was performed. A design was made to cut out the M gene using the ApaLI site immediately after the M gene.
  • PBlueNaelfrg-AMA FGFP from which M (and F gene) was deleted was digested with Sail and ApaLI, and a fragment (1480 bp) containing the M deletion site was recovered.
  • P SeV18 + / AF-GFP was digested with ApaLI / Nhel to recover a fragment containing the HN gene (6287 bp), and these two fragments were transferred to the Sall / Nhel site of Litmus38 (New England Biolabs, Beverly, MA). Subcloned (construction of LitmusSall / Nhelfrg-AMAFGFP).
  • Example 1 1 Preparation of helper cells expressing SeV-M protein
  • the Cre / loxP expression induction system was used for the production of helper cells expressing M protein.
  • Adopted in F protein helper cell (LLC-MK2 / F7 cell) production (Li, H. -0. Et al., J. Virology 74, 6564-6569 (2000), WOOO / 70070)
  • the plasmid pCALNdLw (Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988)) designed to induce and express gene products with Cre, DNA recombinase was used.
  • helper cells that induce the expression of M protein
  • the previously prepared LLC-MK 2 / F7 cells were used, and M cells were introduced into this cell using the same system.
  • pCALNdLw / F used at the time of F gene introduction has a neomycin resistance gene
  • introduction of another resistance gene is indispensable in order to use the same cell.
  • the neomycin resistance gene in the M gene-containing plasmid (pCALNdLw / M: M gene introduced into the pCALNdLw Swal site) was replaced with the hygromycin resistance gene.
  • pCALNdLw / M was digested with Hindi and EcoT22I, a fragment (4737 bp) containing the M gene was separated by agarose electrophoresis, the corresponding panda was excised, and recovered with the QIAEXII Gel Extraction System. At the same time, the pCALNdLw / M was cleaved with Xhol, and a fragment (5941 bp) that did not contain the neomycinB "gene was recovered, then further cleaved with Hindi, and a 1779 bp fragment was recovered.
  • the cells are detached with trypsin, diluted in a 96-well plate at a rate of about 5 cells / well, and D-containing 10% FBS containing 150 / zg / mL hygroraycin (Gibco-BRL, Rockville, MD). Cultivated in MEM for about 2 weeks. Clones that spread from single cells were expanded to 6-well plates. A total of 130 clones prepared in this way were analyzed as follows.
  • the expression level of M protein was analyzed semi-quantitatively by Western-blotting.
  • Recombinant adenovirus (AxCA Cre) expressing Cre DNA recombinase diluted in MEM containing 5% FBS in a confluent state was seeded on a 6-well plate. Saito et al. (Saito, I. et al. , Nucl. Acid. Res.
  • LLC-MK2 cells were seeded at 5 x 10 6 cells / dish in a petri dish of 100 resolution, cultured for 24 hours, and then infected with PLWUV-VacT7 for 1 hour at room temperature (moi 2). After washing with MEM, plasmids pSeV18 + / AM-GFP, pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L, pGEM / F-HN and pGEM / M were respectively 4 / g, 2 / zg, 4 / ig.
  • SeV18 + / AM-GFP using LLC-MK2 / F7 / M62 / A, 9.5 X 10 7 6 days after P2 infection, 3.7 X 10 7 GFP 5 days after P4 infection -Prepared CIU virus.
  • SeV18 + / ⁇ M-GFP may be caused by supplying M protein to cells from cells that express M protein (LLC-MK2 / F7 / M62 / A), but the spread of infection is very slow 7 days after P1 infection Finally, the spread was seen (Fig. 2 2). That is, even in the reconstitution experiment of the virus, ⁇ P1 and subsequent cultures at 32 ° C are very effective when reconstituting SeV with poor transcription / replication efficiency or infectious virion formation efficiency. I support it.
  • the virus gene of SeV18 + / ⁇ M-GFP was confirmed by RT-PCR and the virus protein was confirmed by Western blotting.
  • RT-PCR used a virus 6 days after P2 infection.
  • the random hexamer attached to the kit was used as a primer for cDNA preparation.
  • production from RNA As a confirmation of the presence of the product, the same reaction was performed with or without reverse transcriptase.
  • F3593 (5,-ccaatctaccatcagcatcag c-3, / SEQ ID NO: 2 8) on the P gene and R4993 (5,-ttcccttcatcgactatgacc-3, Z SEQ ID NO: 29) on the F gene using the prepared cDNA as a template PCR was performed with the combination and two combinations of F3208 (5'-agagaacaagact aaggctacc-3, / SEQ ID NO: 30) and R4993 on the P gene.
  • F3208 5'-agagaacaagact aaggctacc-3, / SEQ ID NO: 30
  • R4993 As expected from the gene structure of SeV 18 + / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -GFP, amplifications of 1073 bp and 1458 bp were observed from the former and the latter, respectively (FIG. 24).
  • SeV18 + / ⁇ M-GFP ( ⁇ M in the figure), SeV18 + / AF-GFP (AF in the figure) and SeV18 + GFP (18+ in the figure) were infected with LLC-MK 2 with mo L 3 and 3 days after infection. The culture supernatant and cells were recovered, and the culture supernatant was centrifuged at 48,000 g for 45 minutes to recover virus protein. After SDS-PAGE, Western blotting was performed to detect with anti-M antibody, anti-F antibody and DN-1 antibody (rabbit polyclonal) that mainly recognizes NP protein. The procedure was as described in Example 3 and Example 4.
  • SeV18 + / ⁇ M-GFP-infected cells M protein was not observed and F or P was observed, confirming that the structure was SeV18 + / AM-GFP from the protein side (Fig. 25). At this time, F protein was not observed in SeV18 + / ⁇ F-GFP infected cells, and all virus proteins examined were observed in SeV18 + GFP. In addition, regarding the viral protein in the culture supernatant, the amount of NP observed in SeV18 + / AM-GFP was expected to be very small, with no or very few secondary release particles.
  • Example 15 M Quantitative solution regarding the presence or absence of secondary release particles of SeV!
  • Example 14 SeV18 + / ⁇ -GFP was infected with LLC-MK2 at moi 3 as described in 4, and the culture supernatant was collected 3 days after infection and passed through a 0.45 m filter at 48,000 g. Centrifuge for 45 minutes, Western-blotting using collected virus protein, and culture semi-quantitatively Viral protein in the supernatant was detected.
  • a sample prepared by similarly infecting SeV18 + / AF-GFP was used. Each dilution series was prepared and subjected to Western blotting and detected with DN-1 antibody (mainly NP protein recognition).
  • DN-1 antibody mainly NP protein recognition
  • SeV18 + / AM-GFP was infected with LLC-MK2 with m.o.i.3, and the culture supernatant was collected over time (every day), and the HA activity was measured (FIG. 27). A small amount of HA activity was observed 4 days after infection. However, when LDH activity, which is an index of cytotoxicity, was measured on the same sample, SeV18 + / ⁇ M-GFP-infected cells showed obvious cytotoxicity after 4 days of infection (Fig. 28). The increase in HA activity was not attributed to virus-like particles, but it was predicted that there was a high possibility that activity was caused by HA protein bound to or released from cell fragments.
  • SeV18 + / ⁇ F-GFP-infected cells in the presence of secondary release particles showed many GFP-positive cells in the culture supernatant, whereas SeV18 + / AM-GFP A few GFP positive cells were present in the culture supernatant of the infected cells but were hardly observed (Fig. 29). From the above results, it was concluded that the secondary release particles can be almost suppressed by deleting the M protein.
  • the cleavage site of F protein is as follows: A SeV with a modified position was constructed.
  • An M-deleted SeV genomic cDNA was constructed in which a recognition sequence for a protease highly expressed in cancer cells was introduced at the F1 / F2 cleavage site of F (the active site of F).
  • Synthesis of MMP-2 and MMP-9 Various sequences based on the sequences used as substrates and sequences based on uPA substrates were designed.
  • Figure 30 shows the sequence of the synthetic substrate (Netzel-Arnett, S. et al., Anal. Biochem. 195, 86-92 (1991)) used as a substrate for MMP-2 and 3 ⁇ 4MP-9.
  • F ( MMP # 2) and F (MMP # 3) Two sequences [PUU MTS (SEQ ID NO: 3) and PLG LGL (SEQ ID NO: 3 1), originally or modified with new modifications, are referred to below as F ( MMP # 2) and F (MMP # 3)], a sequence in which only the 3-amino acid sequence PLG common to the synthetic substrate of MMP is introduced (hereinafter, F protein having the same sequence is referred to as F (MMP # 4))
  • F (uPA) The design of four sequences of sequences based on the substrate VGR (SEQ ID NO: 6) of uPA (hereinafter, F protein having the same sequence is represented as F (uPA)) is shown.
  • the gene construction scheme is shown in Figure 31.
  • M-deleted Sendai virus full-length genomic cDNA (pSeV18 + / AM-GFP) carrying the EGFP gene at the M deletion site was deleted with Sail and Nhel, and the fragment containing the F gene (9634 bp) was separated by agarose electrophoresis. Cut out the corresponding band and run with QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN, Bothell, WA) And subcloned into the Sall / Nhel site of LITMUS38 (New England Biolabs, Beverly, MA) (construction of LitmusSall / Nhelfrg AM-GFP).
  • M deletion with ligation of both fragments and F (MMP # 2), F (MMP # 3) or F (MMP # 4) gene (F gene designed to be activated by MMP)
  • Type SeV cDNA (pSeV18 + / F (MP # 2) ⁇ -GFP, pSeV18 + / F (MMP # 3) ⁇ -GFP or pSeV18 + / F (secret # 4) ⁇ -GFP) and F (uPA) genes (active in uPA)
  • P SeV18 + / F (uPA) ⁇ -GFP P SeV18 + / F (uPA) ⁇ -GFP
  • Example 17 Reconstitution and amplification of M-deficient SeV vector in which the active site of F has been converted The reconstitution of virus was reported by Li et al. (Li, H. -0. Et al., J. Virol 74. 6564-6569
  • helper cell (Example 11) capable of supplying M protein to trans was used.
  • Cre / loxP expression induction system is used for the preparation of helper cells. The system is Cre
  • a plasmid KpCALNdLw (Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988)) designed to induce and express gene products by DNA recombinase.
  • Reconstruction of M-deleted SeV with the F active site changed was performed as follows. Recombinant vaccinia virus (PLWUV) expressing T7 polymerase, seeded with LLC-MK2 cells in a 100 mm dish at 5 x 10 6 cells / dish, cultured for 24 hours, and treated with psoralen and long-wave ultraviolet light (365 nm) for 20 minutes -VacT7: Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) was infected for 1 hour at room temperature (M0I 2).
  • PLWUV vaccinia virus
  • plasmid pSeV18 + / F (MMP # 2) ⁇ -GFP (or pSeV18 + / F (MMP # 3) ⁇ -GFP, pSeV18 + / F (MMP # 4) ⁇ -GFP, or pSeV18 + / F (uPA) AM—GFP), pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L (Kato, A. et al., Genes cells 1, 5 69-579 (1996)) and pGEM / F-HN ( .. li, H. -0 et al , J. Virology 74.
  • the cells were cultured at 32 ° C using MEM containing IV but no serum (P2). Re-infection with freshly-prepared LLC-MK2 / F7 / M62 / A after 3 to 14 days and adding serum-free MEM containing 7.5 g / mL Trypsin and 50 U / mL collagenase type IV Incubate at 32 ° C for 3-7 days
  • helper cells As a helper cell that supplies M protein to trans, LLC-MK2 / F7 / M62 and the same system (pCALNdLw: Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988))
  • Helper cells (LL C-MK2 /) that can prepare M-deficient SeV vectors at higher titers by introducing the SeV-M gene (and SeV-F gene) and continuing cell cloning. F7 / M62- # 33) was successfully created.
  • an M-deficient SeV vector (SeV18 + / AM-GFP) with no mutations in the F gene is used as' 1 X 10 8 GFP-CI U / mL (GFP-CIU definition).
  • SeV18 + / F MP # 2
  • SeV18 + / F MP # 2
  • ⁇ ⁇ -GFP SeV18 + / F
  • uP A In the case of ⁇ M-GFP, preparation with a titer of 1 X 10 8 GFP-CIU / raL or more was possible.
  • Each 3 ⁇ 4M-deficient SeV vector for in vivo studies was prepared by a simple purification method by pell et down virus particles by ultracentrifugation. After growing LLC-MK2 / F7 / M6 2- # 33 almost confluently on a 6-well plate, AxCANCre was infected with M0I 5 and cultured at 32 ° C for 2 days. These cells were infected with SeV18 + / F ( ⁇ # 2) ⁇ M-GFP or SeV18 + / ⁇ -GFP at 0.5, and 7.5 ig / in the case of SeV18 + / F (MP # 2) ⁇ -GFP.
  • MEM (lmL / well) containing mL Trypsin and 50 U / mL collagenas e type IV without serum, SeV18 + / AM_GFP with 7.5 / ⁇ g / mL Trypsin only and no serum
  • the cells were cultured in MEM (lmL / well) for 3 days at 32 ° C.
  • the 6-well fractions were collected and the supernatant was collected, then centrifuged at 2,190 g for 15 minutes, and the collected supernatant was filtered through a 0.45 / im inner diameter filter and further centrifuged at 40,000 g for 30 minutes.
  • the pellet was suspended L purified virus solution in PBS 500 beta L.
  • the titers of M-deleted SeV betaters prepared in this way are SeV18 + / F (Absolute # 2) ⁇ -GFP and SeV18 + / AM-GFP, respectively.1.3 X 10 9 and 4. 5 ⁇ 10 9 GFP-CIU / mL.
  • the viruses prepared in Examples 17 and 18 have infectivity because the F protein is cleaved. SeV F cleavage like this It is called type SeV or infectious type SeV.
  • Example 19 Method for evaluating protease-dependent infection and cell fusion infection of F-modified M-deficient SeV vector
  • Collagenase type IV was purchased from IC N Biomedicals Inc, MMP2 (active MMP2), MMP3, MMP7, MMP9 (active MMP9), and plasmin was purchased from Cosmo Bio.
  • An infection procedure in which infection is established by a protease expressed by cells without adding external protease to the cell system is called an endogenous experiment.
  • the basic procedure of the original experiment performed in the following examples is shown. The cases where the conditions were different were described in the respective examples.
  • Each cancer cell was cultured in a 96-well plate so as to be confluent (5 ⁇ 10 5 cell / well). After washing twice with MEM, SeV [F cleavage type: 1 X 10 5 CIU / ml or F non-cleavage type: 1 X 10 7 HAU / ml (see Example 25)] Infected. At this time, FBS was added to the medium to a final concentration of 1%. Four days later, the spread of infection was observed with a fluorescence microscope. Also, 1 ⁇ 2 fine Cells expressing GFP per cell were counted.
  • SeV / ⁇ -GFP without F modification is a multinucleated cell with LLC-MK2 added with trypsin, which causes cell fusion with cells around the infected cell, and cell fusion type infection is observed. synthitium was formed (Fig. 3 2 L).
  • SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP, which incorporates an MMP degradation sequence into F protein, is a multinucleated cell synthitium that is infected with LLC-MK2 with collagenase, active MMP2, and active MMP9. (Fig. 3 2 E, F, M).
  • SeV / F (uPA) ⁇ -GFP which incorporates urokinase-type plasminogen activa tor (uPA) and tissue-type PA (tPA) degradation sequence into F protein, showed cell fusion type infection in the presence of trypsin, Furthermore, the F protein was modified to form synthitium, a multinucleated cell, with uPA (Fig. 32 Q, R). This is because by incorporating each protease degradation substrate sequence into the F protein, the M-deficient SeV undergoes cell fusion infection depending on the degradation substrate sequence, and the infection spreads to the cells in contact with it. It shows that it will go.
  • HT1080 human fibroblastic sarcoma
  • MMP-expressing cancer cell line (Morodomi, T. et al. (199 2) Biochem. J. 285 (Pt 2), 603-611)
  • tPA-expressing strain 28 human Gastric cancer cell line
  • SW620 human colorectal cancer strain
  • RCB1000 HT1080 (ATCC No. CCL-121), SW620 (ATCC No. CCL-227), and the following examples.
  • SW4 80 ATCC No. CCL-228), iDr (ATCC No. CCL-218) and Pane-1 (ATCC No. CRL-1469) used in Japan were distributed by ATCC (American type culture collection) A thing was used.
  • As the medium the medium used at the dispensing destination was used.
  • FBS was added to all the media to a final concentration of 1%.
  • SeMP / F MMP # 2
  • ⁇ -GFP alone is spread more than 10 times in MMP expression strain HT1980
  • SeV / F (uPA) in tPA expression strain MK N28. Only ⁇ -GFP has a spread of cell fusion infection. Neither protease was expressed, and STO20 showed no spread of infection.
  • Pane I infected with SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP was shown to show cell fusion type infection by MMP induction.
  • HT1080 tumor bearing nude mice were prepared.
  • a human fibroblast HT1080 was injected subcutaneously into the right back of a BALB-nude nude mouse (charles river) with 5 ⁇ 10 6 cells (50 ⁇ 1 of 1 ⁇ 10 8 cells / ml). Individuals whose major axis exceeded 3 mm after 7-9 days were used.
  • SeV-GFP and SeV / ⁇ -GFP can be confirmed to show fluorescence only around the injection (Fig. 35 E, H). On the other hand, it was observed that SeV / F (Ken # 2) ⁇ -GFP spreads throughout the cancer.
  • Example 2 5 Preparation of F non-cleavage / F-modified M-deficient SeV vector and selective infection
  • 7.5 ⁇ g / It was cultured and collected in a medium containing 50 ml / ml of trypsin with a high concentration of 50 U / ml collagenase and used as an F-cleavage SeV vector (see Examples 17 and 18).
  • SeV was recovered without adding proteaase during production, and F non-cleavable SeV was produced.
  • Example 1 LLC-MK2 / F7 / M62 / A cells were cultured confluently in a 10 cm dish.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • SeV / F (MMP # 2) ⁇ -GFP is infected in the silent expression strain HT1080, but in the tPA expression strain MKN28, no infection is observed.
  • SeV / F (uPA) AM to GFP is infected in the tPA-expressing strain MKN28 but not in the MMP-expressing strain HT1080.
  • each SeV showed selectivity for infection depending on the protease expression.
  • SW480 and WiDr have been shown to induce MMP3 and MP7 by co-culture with fibroblast or in vivo culture, respectively (Kataoka, H. et aL (1997)
  • HAU 1 X 10 6 particles / ml in terms of viral particles 1 X 10 6 particles / ml) of? 7 non-cleavable SeV-containing MEM 50 1 added, were infected.
  • Normal human lung fibroblast (TAKARA) was added at 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C for 4 days (Fig. 9 9 ) Both SW480 and WiDr became infected with SeV / F (MMP # 2) AM-GFP by co-culturing human fibroblasts. This phenomenon is not observed with SW620, which does not require induction.
  • Example 2 8 Protease-dependent F cleavage of F-modified M-deficient SeV vector
  • Re-suspended with S. Protease is added to each virus suspension to a final concentration of 7.5 g / ml trypsin, O. l ng / m 1 MMP9, 0.1 ng / ml uPA, and treated at 37 ° C for 30 min. After that, sample buffer was added to make an SDS-PAGE sample. SDS-PAGE and Western plotting were performed according to standard methods (Kido, H. et al. Isolati on and characterization of a novel trypsin— liKe protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells. A possible activator of the viral fusion glycoprotein J Biol Chew 267, 13573-9 (1992)).
  • Anti- Fl Usagi antibody immunizes with three synthetic synthetic peptides (FFGAVIGT + Cys: 117-124, EAREAKRDIALIK: 143-155, CGTGRRPISQ DRS: 401-413; SEQ ID NOs: 4 6, 4 7, 4 8 respectively). Serum was obtained.
  • the secondary antibody is HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (ICN, Aurola, 0H). S (ECL Western blotting detection reagents; Amersham Biosciences. Uppsala, Sweden) was used.
  • Figure 4 1 shows that the M-deleted SeV vector (1, 4, 7, 10) without F modification (1, 4, 7, 10), and the M-deleted SeV vector inserted with F # 2 sequence (2, 5 , 8, 11), M-deletion type SeV vector (3, 6, 9, 12) inserted with uPA sequence in F was treated with the above protease at 37 ° C for 30 minutes. Yes.
  • Example 29 Increase in fusion ability due to deletion of F cell domain ⁇ Invasion of the host by paramyxovirus is established by fusion of the virus membrane and the host cell membrane.
  • the invasion mechanism is that Sendai virus HN protein binds to sialic acid on the host side, and F protein causes cell membrane fusion. At that time, the bond of H It is said that it is important to change the conformation of F (Russell, C. J., Jardetzky, TS & Lamb, RA Memorane fusion machines of paramyxoviruses: capture of intermediates of fusion.
  • pCAGGS-equipped HN was transferred at the same time, and its fusion ability was confirmed by the number of syncytiums.
  • Fct27 primer (5 '-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3' / SEQ ID NO: 49, 5, -ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3 '/ SEQ ID NO: 50)
  • Fct 14 primer (5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3 '/ SEQ ID NO: 5 5 '-ATAGT TTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3, / SEQ ID NO: 5 2)
  • Fct4 primer (5,-C CGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3' / SEQ ID NO: 5 3, 5 '-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAC CTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3'
  • LLCMK2 or 080 cells were confluent to a 24-well plate.
  • 50 // I Opt i-MEM was mixed with 3 1 Fugene6.
  • Each pCAGGS expression plasmid was mixed with 2 ⁇ g and an equal amount of pCAGGS / EGFP, and then added to a mixture of Opti-MEM and Fugen6. After standing at room temperature for 15 minutes, the medium was replaced with 500 / xl MEM medium. Added to the plate. 37. C, 5% C0 2 after 3 hours incubation, the case where 1% FBS added M EM, LLCMK2 of HT1080 7. 5 / g / ml Trypsin or collagenase type of the specified concentration
  • the medium was replaced with MEM medium supplemented with IV (Clostridium). After culturing for 48 hours, the number of fused syncytia per 100-fold field (0.3 cm 2 ) of an inverted microscope was counted. Moshiku after 4% Paraformaldehyde fixed to 2 hours, 70% ethanol, after distillation water replacement, after 5 minutes hematoxylin staining, washed with water, to form syncytia and that 0.3 cm 2 of per Rinokaku I've worked on the numbers.
  • Figure 42 (A) shows the amino acid sequence deleted from the three types of cytoplasmic domains of F
  • Figure 42 (B) shows its fusion activity.
  • Fig. 4 2 (B) no cells fused with F alone, but the fusion ability was shown by co-transfecting H. It was also revealed that F protein (Fctl4) with a sequence in which 28 amino acids were deleted so that the cytoplasmic domain was 14 amino acids had the highest fusion ability.
  • the paramyxovirus envelope protein is a trimer of F and tetramer of HN on the cell membrane. It is clear that they interact with each other through the ectodomain and M protein. (Plemper, RK, Hammond,
  • a texture 9 protein was prepared (Fctl4 / HN).
  • F protein Fctl4 having high fusion ability was used.
  • a linker sequence consisting of 50 amino acids was inserted between the two proteins (Fct 14 / Linker / HN). This linker sequence is homologous to any protein in the current search. Ij who does not have (Simian immunodeficiency virus (SIVagm) env cyt oplasraic domain non-sense sequence synthesized by reversing the N-terminal and C-terminal amino acid sequences of the amino acid sequence was used.)
  • the F / HN chimeric protein gene was loaded into the pCAGGS vector. PCR was performed on the F gene and HN gene, and the two fragments were ligated into pCAGGS. At this time, one with or without a 150 b linker gene (50 amino acid) inserted between the F / HN genes was prepared. The primer sequences are shown below.
  • F gene primer (F-F: 5, -ATCCGAATTCAGTTCMTGACAGCATATATCCAGAG- 37 SEQ ID NO: 5 5; Fctl4- R: 5 '-AT CCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3' / SEQ ID NO: 5 6), Linker / HN gene primer (Linker— HN -F: 5 '-ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAG CMCGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCC ATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3' / SEQ ID NO: 5 7, HN-R: 5 '-ATCCGCGGCCGCT TMGACTCGGCCTTGCATM - 37 SEQ ID NO: 5 8), HN gene primer (5' -ATCCGCGGCCG CAATGGATGGTGATAGGGGCA-3 '/ SEQ ID NO
  • the chimeric protein without the linker sequence shows low fusion ability, but compared to the simultaneous transfection of F and HN by inserting a linker. It was found that the fusion activity increased dramatically.
  • the amino acid sequence at the cleavage site was modified with the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) as shown in Fig. 44 (A). What was considered in this modification was the sequence of the fusion peptide after cleavage by the protease.
  • the N-terminal region of F1 of Paramyxovirus F protein is called Fusion peptide, and it is important for its fusion activity, and it has been reported that amino acid mutations in that region may lose F protein fusion ability. (Bagai, S. & Lamb, RA A glycine to alanine substitution in the paramyxovirus SV5 fusi on peptide increases the initial rate of fusion.
  • MMP # 1 is the most well-known sequence as a synthetic substrate for MMP. This sequence is also used for targeting by other MMPs. MMP # 3 and # 8 are also commercially available sequences as synthetic substrates. MMP # 2 and 6 follow the consensus sequence Pro-X-X-Hy- (Ser / Thr) for MMP9, which was revealed by phage display. PLGMTS and PQGMTS were modified (SEQ ID NOs: 61 and 62, respectively). ⁇ P # 5 was named PQGLY (SEQ ID NO: 63) according to a report by Shneider et al. (American Society of Gene Therapy, Annual meeting No. 1163 2002, Boston). MMP # 4 does not change the sequence of the fusion peptide after degradation.
  • MMP # 7 is a sequence revealed by phage display for MMP2. Details of the preparation of an expression plasmid in which the F activation site of the F / HN fusion gene is modified are shown below. After constructing the F / HNife combined gene, on the pBluscript F / HN, Mutation was introduced. Mutation was introduced using the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, Calif.) According to the method described in the kit. The sequence of the synthetic oligo used for mutagenesis is
  • MMP # 1 ( 5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGT GC TGTGATTGGTACTATCG-3> / SEQ ID NO: 64, 5, -CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaa C ccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG -3> / SEQ ID NO: 65),
  • MMP # 2 (5, -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCT GTGATTGGTACTATC-3 '/ SEQ ID NO: 32, 5, -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCa tGccAa g AggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGA
  • MMP # 3 (5, -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCT GTGATTGGTACTATCG-3, / SEQ ID NO: 34, 5 '-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCc cCaGGccAagAggGGCATTGTGTGGATCGT
  • Hy-S / T-S / T sequences (especially MTS sequences) retains the fusion ability of the F protein after cleavage as well as the cleavage of the F protein by concealment derived from HT1080. It is likely that the requirements of both parties have been met.
  • MMP # 1, # 3, # 4, # 5,, # 7, and # 8 no cell fusion was observed. Since all sequences except for # 4 are derived from the synthetic substrate of MMP, it is expected that cleavage by protease occurs, so the peptide of 3-amino acid added to F1 is the F protein after cleavage. This suggests the possibility of limiting the activity of.
  • MMP # 4 there is a high possibility that cleavage by the protease itself does not occur under these conditions. The basis for this is not shown in the data, but it is also clear that MMP # 4 can form syncytium by induction of concealment by Phorbol ester of HT1080.
  • the lower case notation indicates the mutated base.
  • Preparation of expression plasmids in the same manner as described above, cut with EcoRI after introduction of the mutations were performed by P C AGGS Heraigeshon.
  • MMP # 6 was found to have a 2-3 times higher fusion ability than MMP # 2.
  • the important point is that in the case of MMP # 6, cell fusion occurs even under low protease concentration conditions, and F protein activity at low concentrations is realized.
  • a mutation from G to A that has been reported as an increase in the fusion ability of F protein (Peisajovich, SG, Epand, RF, Epand, RM & Shai, Y.
  • Sendai virus N-terminal fusio n Peptide consists of two similar repeats, both of which contribute to me mbrane fusion.Eur J Biochem 269, 4342-50 (2002)) (# 6G12A) reduces the fusion ability to less than 1/10. I have. From these results, it was clarified that the activity of F protein cannot be maintained simply by inserting a protease-degrading sequence simply because of the modification of tropism by protease, and the fusion ability is often lost. When introducing the target degradation sequence, this system can be used to confirm the fusion ability and construct a virus.
  • Example 3 2 Construction of improved F-modified M-deficient SeV genomic cDNA with increased fusion ability
  • An improved FS c-modified M-deleted SeV genomic cDNA was constructed by the following method. Se V / F (MMP # 6) ⁇ -GFP was carried out in the same manner as in Example 16.
  • Mutation into the F gene is performed using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 69, using the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Lajolla, CA) on the LITMUSSall / NhelfrgAM-FP according to the method described in the kit. It was. Mutated LITMUSSall / Nhelf rg AM-Fragment after digestion with Sal I and Nhe I and EGFP gene at F deletion site Digestion of the full-length F-deficient Sendai virus genomic cDNA (pSeV + 18 / F-GFP: Li, H et al J. Viol.
  • SeV / F MMP # 6 ⁇ -GFP cDNA
  • Fig. 46 M-deficient Sendai virus (SeV (TDK) / Fctl4 (Above # 6) ⁇ -GFP) and F / HN chimeric protein with 28 amino acids deleted from the cytoplasmic domain of F protein
  • the virus (SeV (TDK) I Fctl4 (MMP # 6) / Linker / HN ⁇ M-GFP) was constructed using the multicloning cytosendai virus cDNA (referred to as pSeV (TDK)) (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • TDK Sendai virus SeV
  • MMP # 6 Fctl4
  • ⁇ -GFP which was trancated from the cytoplasmic domain of the F protein, was constructed as follows. In order to use TDK as a skeleton, pSeV (TDK) / AM-GFP was first prepared.
  • Synthetic primers Nhe-GFP-F: ATCCGCTAGCCCGTACGGCCAT GGTGAGCAAG (SEQ ID NO: 94) and GFP-EIS-BssHII: ATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCA CCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGCTTTACTTGTACAGCGTCTTACTTGTACAGCG
  • GFP / EIS GFP with an EIS sequence encoding the transcription initiation and termination signal
  • Sendai virus cDNA were treated with Nel and BssHII, and the fragment was ligated to replace the M protein with GFP.
  • PSeV (TDK) I ⁇ M-GFP was prepared.
  • the synthesis primer Mlv-F ATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG (SEQ ID NO: 96), and Fctl 4-EIS-Sal I: ATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTCGCATACTTT Fctl4 (MMP # 6) amplified by PCR using GATTACC (SEQ ID NO: 97) is inserted and replaced at the position of F instead of F gene, and pSeV (TDK) / Fctl4 (MMP # 6) ⁇ - GFP was constructed (Figure 46).
  • PSeV (TDK) / ⁇ F-GFP was prepared by deletion and replacement with GFP. Further, Fctl4 (MMP # 6) / Linker / HN prepared in Example 31 was used as a saddle, and a synthetic primer (F / HN5, Nhe-F: ATCCGCTAGCAGT TCAATGACAGCATATATCCAGAG (SEQ ID NO: 100), F / HN3 ′ Nhe-EIS -R: Fctl4 (MMP # 6) / Linker / HN amplified by PCR using ATCCGCTAGCACG ATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA (SEQ ID NO: 101)) Nhe I site of pSeV (TDK) / ⁇ ⁇ ⁇ F-G FP PSeV (TDK) / Fctl4 (MMP # 6) / Linker / HN ⁇ M-GFP was constructed.
  • Example 3 Virus reconstruction from the cDNA constructed in 2 was performed according to the report of Li et al. (Li, H.-0. Et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WOOO / 70070). . However, it was an M deletion type as in Example 17 and therefore a helper cell (Example 11) capable of supplying M protein to trans was used. Cre / loxP expression induction system is used for helper cell production. The system uses the plasmid pCALNdLvr (Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988)) designed to induce and express gene products using Cre DNA recombination.
  • a recombinant adenovirus (AxCANCre) that expresses Cre DNA recombinase was transformed into the transformant of the plasmid by the method of Saito et al. (Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3 816-3821 ( 1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1211 (1998)), and the inserted gene is expressed.
  • the composition was as follows: LLC-MK2 cells were seeded in 100 mm dishes at 5 X 10 6 cells / dish, cultured for 24 hours, and then treated with psoralen and long-wavelength ultraviolet light (365 nm) for 20 minutes.
  • Recombinant vaccinia virus expressing T7 polymerase (PLWUV-VacT7: Fuerst, TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 , 8122—8126 (1986)) was infected for 1 hour at room temperature (M0I 2).
  • plasmid pSeV / F (# 6) ⁇ -GFP (or pSeV (TDK) / Fctl4 (MMP # 6) ⁇ M-GFP, pSeV (TDK) / Fctl4 ( MMP # 6) / Linker / HN ⁇ -GFP), pGE / NP, pGEM / P, pGEM / L (Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996)) pGEM / M and pGEM / F— HN (Li, H. -0. Et al., J. Virology 74.
  • the lysate is transferred directly to LLC-MK2 / F7 / M62 / A, 40 ⁇ g / mL AraC, 7.5 ⁇ g / mL Trypsin and 50 U / mL Containing type IV collagenase (ICN, Aurola, OH) (pSeV (TDK) / Fctl4 (MMP # 6) / Linker / HN ⁇ M-GFP, trypsin only).
  • MEM MEM at 32 ° C without serum Cultured (P1). After 3-4 days, remove a portion of the culture supernatant and infect with freshly prepared LLC-MK2 / F7 / M62 / A.
  • SeV / F (disclosed # 6) ⁇ -GFP, cytoplasmic domain was deleted by 28 amino acids, with the F protein cleavage site changed to PLGMTS (SEQ ID NO: 61) and PQGMTS (SEQ ID NO: 62).
  • (TDK) / Fct 14 (MMP # 6) SeV (TDK) with ⁇ M-GFP and F / HN chimeric protein
  • Example 33 In order to examine the performance of the virus produced in Example 33, we measured the cell fusion ability by infecting various cancer cell lines with different expression levels of MMP2 and 11 MP9 and LLCMK2 in which MMP expression was not detected.
  • Various cancer cells (HT1080, U87MG, A172, U251, SW480, LLCMK2) were confluent to a 24-well plate in the medium indicated by the donor.
  • U87MG ATCC NO. HTB-14
  • A172 ATCC No. CRL-1620
  • U251 IF050288 was purchased from JCRB cell bank.
  • MMP2 and 9 were confirmed by gelatin zymography performed in Example 22 (Fig. 48). As a result, the expression of MMP2 was confirmed in HT1080, U87MG, and A172. In addition, U251 and SW4S0 confirmed the occurrence of low and concealment. LLCMK2 appears to have MMP2 expression at 1 ° /. Since it contains serum, the activity of MMP2 in the serum is visible. Two days after infection in each cancer cell line, the spread of GFP was observed. As a result, the conventional SeV / F (MMP # 2) ⁇ M-GFP was not widely used in U251 and SW480!
  • the present invention provides a vector that specifically spreads infection in the presence of a desired protease.
  • the vector of the present invention does not produce virus-like particles significantly, and transfers the vector to neighboring cells by cell fusion. Therefore, the vector of the present invention is useful for infecting a vector localized to the target tissue.
  • the present invention provides vectors that spread cancer-specific infection. This vector has a strong and inhibitory effect on tumor growth. Cancer gene therapy using the vector of the present invention has high potential as a new cancer therapy with few side effects.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

プロテアーゼ依存性ト口ピズムが改変されたべクター
技術分野
本発明は、 プロテアーゼ依存性ト口ピズムが改変された細胞融合型ベクターお よびその製造方法に関する。 本発明のベクターは、 癌特異的に感染する遺伝子治 療ベクターとして有用である。
背景技術
近年、 癌に対ずる遺伝子治療の開発が進展している。 これまで本発明者らはセ ンダイウィルス （SeV) を用いて遺伝子治療ベクターの開発を行ってきた。 SeVは パラミクソウィルス科ウィルスの一種で、 非分節型ネガティブ鎖 RNAをゲノムに持 つウィルスのグループに属す。 パラミクソウィルスベクターは、 外来遺伝子の高 導入率および高発現を可能とするベクターであり、 癌の遺伝子治療用ベクターと しても期待されている。 パラミスソウィルスによる癌治療の試みは多数なされて いる。 例えば、 BHK21細胞に Mumps virusを感染させると、 担癌ヌードマウスで抗 癌効果を示すことが報告された （Minato, N. et al. (1979) J. Exp. Med. 149, 1117-1133) 。 また、 その他のパラミクソウィルスでも同様に抗腫瘍効果が報告さ れている。 最近、 Fusogenic proteinの抗癌効果が注目されている。 Galanisらは 、 measles virus の F, HN蛋白質を搭載した adenovirus vectorが、 感染した癌細 胞がシンシチウムを形成し、 in vivoで抗癌効果を報告している （Galanis, E. et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12, 811-821) 。
言うまでもなく、 転移しない癌はその部分を外科的に取り除けばよく、 転移す ることと悪性の癌とは同義であるとされている。 その浸潤転移する癌は、 マトリ ックスメタ口プロテアーゼ （MMP) および/またはプラスミノーゲンァクチベータ 一 (uPA, tPA) を高発現することが知られている （Cox, G.， and 0' Byrne, K. J. (2001) Anticancer Res. 21, 4207-4219； Andreasen, P. A. et al. (2000) Cell Mol. Life. Sci. 57, 25-40) 。 その理由として、 癌細胞が転移浸潤する際、 その まわりにある細胞外マトリックス （ECM) が障壁となり細胞の移動ができないので 、 癌はその ECMを分解する酵素 （MMP, uPA, tPA) を発現し、 ECM分解することによ つてはじめて、 浸潤、 転移が可能になるためであると考えられている。
一方、 癌遺伝子治療の問題点として 3つのことがあげられている。 第一に癌細 胞への導入効率が低かったり、 固形癌深部への導入ができないため、 癌全体への 導入ができず、 残った癌が再ぴ増殖を始め再発することである。 第二に癌への導 入と同時に正常細胞へも導入され、 正常細胞にも傷害を与え、 副作用が大きくな つていることである。 第三にこれは癌治療全体の問題でもあるが、 癌の悪性化に ともなう浸潤転移である。 これらの問題を解決するベクターは未だ開発されてい ない。 発明の開示
本発明は、 プロテアーゼ依存性トロピズムが改変され、 特定のプロテアーゼ存 在下でのみ周囲の細胞に浸潤する新たな細胞融合型ベクターおよびその製造方法 を提供する。
センダイウィルスを含むパラミクソウィルス科ウィルスは、 そのエンベロープ に 2つの蛋白を有している。 F (fusion) 蛋白質はウィルスとその宿主である細胞 とを膜融合をさせ、 ヌクレオ力プシドを細胞質へ放出させる。 HN (hemagglutini n-neuraminidase) 蛋白質は赤血球凝集能とのノィラミナーゼ活性をもち、 宿主レ セプタ一へ結合する役割を果たす。 F蛋白質およひ ΉΝ蛋白質はスパイク蛋 質とも 呼ばれ、 ウィルスのエンベロープ表面に露出している。 また M (matrix) 蛋白質は エンベロープを裏打ちし、 ウィルス粒子に強固さを付与している。 このベクター の特徴は広範な細胞と動物組織に高効率で遺伝子導入可能で、 力 既存のベタタ 一と比較し、 高い努現量を実現していることである。 '
F蛋白質 （F0) はそのままでは細胞融合活性を示さず、 宿主由来のプロテアーゼ により開裂して F1と F2に分解されることによってはじめてその融合活性を示すよ うになる。 従って、 野生型の F蛋白質を持つウィルスの増殖は、 この蛋白質を開裂 できる trypsin様のプロテアーゼを発現する気道粘膜上皮などの組織に制限されて しまう。 パラミクソウィルスでは Fの改変による感染のト口ピズムもしくは融合能 の改変についての様々な研究がなされている。 SeVでは、 α-キモトリブシンでの み開裂する Fを持つ変異体がトリプシン感受性を失い、 そのトロピズムが Fの開裂 配列特異的に変わることが示されている （Tashiro, M. et al. (1992) J. Gen. V irol. 73 (Pt 6) , 1575-1579) 。 Newcastle disease virus Measles virusでは 、 Fの開裂配列を改変し、 そのシンシチウム形成能がトリプシン依存的に変わるこ とを示している （Li, Z. et al. (1998) J. Virol. 72, 3789-3795; Maisner, A. et al. (2000) J. Gen. Virol. 81， 441—449)。
このように、 Fの開裂配列を改変することにより、 あるプロテアーゼを発現する 特定の組織等にベクタ一を感染およぴ増殖させることが可能となると考えられる 。 し力 し、 パラミクソウィルスベクターが持つ問題点の 1つに、 標的細胞へのベ クタ一導入後に起こる細胞からのウィルスの 2次放出がある。 複製型ウィルスを 感染させた細胞ではビリオンが形成され娘ウィルスが放出されるため、 標的組織 以外にもウィルス粒子が拡散する。 上述のように野生型 F蛋白質を持つウィルス粒 子はトリプシン様酵素の非存在下では感染性を示さないものの、 ウィルス粒子自 身は細胞から放出される。 生体内投与においては、 血中に拡散したウィルスが全 身に到達することも懸念される。 さらに、 複製能を持たない F遺伝子欠損 SeV (Li,
H. O. et al. (2000) J. Virol. 74, 6564-6569； W000/70055; WO00/70070) を導 入した細胞等からもウィルス様粒子 （VLP: virus like particle) の放出が観察 されている。 このような 2次放出粒子は、 標的とする組織以外への感染や免疫反 応を誘発することが懸念される。 本発明者らは、 ウィルスエンベロープ遺伝子の中で、 M遺伝子を欠損するパラミ クソウィルスは、 粒子形成が起こらないが感染細胞とそれに接した細胞が融合す ることによってシンシチゥムを形成し、 細胞融合型の感染をすることを見出して いる （TOOO/09700) 。 これらの M欠損型ウィルスは、 導入細胞において複製され、 トリプシン存在下で隣接する細胞に伝達される。 しかしながら、 この現象は Fが開 裂して活性化する条件においてのみ起こる現象であり、 野生型 F蛋白質を持つウイ ルスでは trypsin様のプロテアーゼがな 、状態ではウィルスの伝達は起きな!/、。 本 発明者らは、 この M欠損型ウィルスにおいて F蛋白質のト口ピズムを改変すれば、 2次放出粒子を産生せず、 特定の組織でのみ感染を広げられる新規なベクターを 開発できるのではないかと考えた。 特に浸潤転移癌においては、 ECMを分解する MM P, uPA, tPAなどのプロテアーゼ活性が亢進しているものが多く知られている。 そ こで本発明者らは、 この M欠失型 SeVのプロテアーゼ依存的細胞融合型感染と癌に おける MMP, uPA, tPA高発現の現象を組み合わせて利用し、 浸潤転移癌特異的に感 染し広がつてゆく SeVベタタ一を作製した。
M欠損型ウィルスは粒子形成に必要な M遺伝子を欠損して ヽるため、 通常ウィル ス粒子は放出しな！/、か極度に抑制されて 、る。 複製能を持つ組み換えウィルスの 産生に用いる通常の再構成法 （Kato， A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569-579 ) を用いた場合、 M欠損型ウィルスの RNPを調製することはできるが感染性ウィル ス粒子は製造できない （W000/09700) 。 実際の癌治療薬として M欠失型ベクターを 利用するためには、 M欠失型ウィルスを感染性ウィルス粒子として調製できれば極 めて有用である。 そこで本発明者らは、 M欠失型ウィルスをウィルス粒子として調 製するための新たな製造方法の開発を行つた。
术発明者らはまず、 VLP放出が抑制されたべクタ一 構築するための一つの解決 法として、 ウイルス遺伝子の温度感受性変異の利用を考えた。 低温で生育するが 高温では増殖できな!/、幾つかの変異型ゥィルスが報告されている。 本発明者らは 、 特に高温でのビリオン形成が抑制されるような変異蛋白質、 特に M蛋白に変異を 有するものを利用すれば、 低温で （例えば 32°C) ウィルス生産を行い、 遺伝子治 療等の実応用時はそれよりは高温 （例えば 37°C) で行うことにより、 VLP形成を抑 制できる可能 1·生があると考えた。 この目的のために、 本発明者らは M蛋白質および HN蛋白質で報告されている、 それぞれ 3つ、 計 6つの温度感受性変異を持つ変異 M およひ ΉΝ蛋白質をコードする F遺伝子欠損型の組み換えセンダイウィルスベクター を構築した。 このウィルスの VLP放出を調べたところ、 野生型ウィルスに比べ約 1/ 10またはそれ以下であることが判明した。 さらに、 VLP放出が抑制されたセンダイ ウィルスベクターを導入した細胞における M蛋白質の局在を、 抗 M抗体を利用した. 免疫染色により解析した結果、 野生型ウィルスを導入した細胞では見られる細胞 表面の M蛋白質の凝集が、 VLP放出抑制型ウィルスの場合は有意に減少しており、 特に高温 （38°C) において M蛋白の濃縮像が極端に減少していた。 温度感受性変異 M遺伝子を含むこの SeVを感染させた細胞における M蛋白質およぴ HN蛋白質の細胞内 局在を共焦点レーザー顕微鏡により詳しく調べたところ、 低温 （32°C) において も細胞表面での M蛋白の局在は有意に低下しており、 微小管 （microtubule) の形 態に近い形で観察された。 さらに、 高温 （37°C) では M蛋白は微小管の中心体付近
(すなわちゴルジ体付近） に局在して存在していた。 微小管脱重合剤を添加する と、 温度感受性 M遺伝子を持つ SeVのみならず、 野生型 M遺伝子を持つ SeVにおいて も、 M蛋白質の局在構造が破壊されたことから、 M蛋白質は実際に微小管に沿って 局在して機能している可能性が高いと判断された。 以上の知見から、 温度感受性 変異導入ゥィルスで二次放出粒子が減少しているのは、 粒子形成の中心的な役割 を担っていると考えられている M蛋白の細胞内局在の不全であると断定された。 従 つて、 M蛋白質の正常な細胞内局在を妨げることにより、 VLPの形成を効果的に抑 制することができると考えられる。 た、 M蛋白質の機能には微小管との相互作用 が重要であり、 例えば M蛋白質がゴルジ体から微小管に沿って細胞内移動すること を阻害するような遺伝子変異や薬剤を開発することにより、 M蛋白の細胞内局在の 不具合を生じさせ、 結果的に二次放出粒子の減少を達成することが可能と判断さ れる。 すなわち本発明者らは、 M蛋白質の局在に欠陥を生じさせるような変異を有 するウィルスベクターを調製することによって、 粒子形成能が低下または消失し た組み換えゥィルスベクターを得ることができることを見出した。
また本発明者らは、 M遺伝子をウィルスから欠失させることによって、 ウィルス を導入した細胞における M蛋白質の細胞表面の凝集が完全に欠如したゥィルスの構 築を試みた。 この目的のために、 本発明者らは M遺伝子欠失型ウィルスの生産に利 用可能な野生型 M蛋白質を誘導的に発現させることができるヘルパー細胞を構築し た。 この細胞を利用することにより、 野生型 M蛋白質を含むエンベロープに、 F改 変型の M遺伝子欠損ウィルスの RNPが包まれたウイルス粒子を回収することに初め て成功した。 本発明の方法により I X 108 PFU/ml以上の濃度でウィルス粒子を製造 することが可能となり、 臨床を含む実用に耐える組み換えウィルスを初めて提供 することが可能となった。 また本発明のウィルス製造系は、 他のウィルスの混入 を否定できる安全性の高い高タイターの遺伝子治療用ベクターの生産を可能にす る。 M発現細胞を利用して M蛋白質をトランスに供給する、 本発明の M欠失型 SeV生 産システムにおいて初めて、 実用に適した F改変型 M欠失型のパラミクソウィルス が提供された。
本発明者らは、 上記のように構築した感染性ウィルス粒子を用いて、 実際の抗 腫瘍効果を in vivoにおいて検証した。 癌細胞を移植したマウスに対して、 この癌 で活性が亢進するマトリクスメタ口プロテアーゼ （MMP)で活性化される M欠失型ゥ ィルスを投与したところ、 細胞融合型の感染を通して癌組織内にウィルスが広が ることが確認された。 野生型ウィルスを投与した癌では、 数日後でもウィルスは 注入部位に限定されていたのに対し、 本発明のべクターでは癌組織に対して強い 浸透力を示し、 癌全体にベクターの広がりが認められた。 ウィルス未投与または ' 野生型ウィルスを投与した対照に比べ、 癌の増殖に対する抑制効果は明白であつ た。 これまでにもレトロウイルスにおいて MMP発現細胞を標的とするベクターが作 製されているが （Peng, K. -W. et al. , 1997, Human Gene Therapy 8 : 729 - 738; P eng, K. -W. et ah , 1999, Gene Therapy 6: 1552—1557; Martin, F. et al. , 199 9, J. Virol. 73: 6923-6929) 、 本発明とは認識配列のデザインが全く異なってい る。 また、 これらの報告は癌組織への特異的な感染、 則ちターゲッティングのみ を目的としたものであり、 癌組織で特異的に （細胞間で） 感染が広がり治療効果 を発揮するベクターは本発明において初めて提供された。
さらに本発明者らは、 ウィルス粒子産生時にプロテアーゼの添加を制御するこ とにより、 ウィルス表面の F蛋白質が開裂されていないウィルス粒子 （F非開裂型 ウィルス） を調製することに成功した。 このウィルスは、 そのままでは感染性を 持たないが、 ウィルス表面の F蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理するか、 ある いは該プロテアーゼ存在条件下で細胞に添加することにより、 特異的に感染能を 示すことができた。 このような潜在感染型ウィルスベクターにより、 特定のプロ テ了ーゼを産生する癌細胞に特異的にベクターを感染させることが可能となった また本発明者らは、 改変 F遺伝子を持つベクターを、 野生型 F蛋白質を用いて作 製することにより、 ベクター作製時に野生型 F蛋白質を開裂するプロテア一ゼを用 いてウィルス粒子を製造する方法を開発した。 この方法によれば、 野生型 F蛋白質 を発現するヘルパー細胞を用いて、 トリプシン等の野生型 F蛋白質を開裂する酵素 によりウィルス増幅を行うことができる。 得られたウィルス粒子は、 開裂した野 生型 F蛋白質をエンベロープに含み感染性を有するが、 ウィルスゲノムは F蛋白質 の開裂部位が改変された改変 F遺伝子をコードするため、 特定のプロテア一ゼの存 在下でし力感染を広げられない。 野生型 F蛋白質を用いてウィルスを調製する方法 は、 ベクターゲノムに組み込む改変 F遺伝子に依存せずにゥィルス粒子を製造する ことが可能であるため有利である。 '
このように本発明は、 癌などの特定の組織で発現するプロテアーゼ存在下での み感染を広げるベクターを提供する。 本発明のベクターはウィルス様粒子を有意 に産生せず、 細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。 特に癌 で活性が亢進するプロテアーゼで感染性を獲得する本発明のベクターは、 腫瘍増 殖に対する強い抑制作用を持っており、 このべクターを用いた癌の遺伝子治療は 極めて有効と考えられる。
すなわち本発明は、 プロテアーゼ依存性ト口ピズムが改変された細胞融合型べ クタ一およびその製造方法等に関し、 より具体的には
〔1〕 パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) M蛋白質をコードする核 酸が変異または欠失しており、 力つ ( b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂 部位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列 に置換された蛋白質をコードするゲノム RNAを含む複合体であり、 以下の性質を有 する複合体、
( 1 ) 該複合体が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有する、
( 2 ) 宿主内環境においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失してい る、
( 3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該複合体が導入された細胞と接触す る細胞に、 該 RNAを導入する能力を有する、
〔2〕 ウィルス粒子である、 〔1〕 に記載の複合体、
〔3〕 野生型 F蛋白質をさらに含む、 〔2〕 に記載の複合体、
〔4〕 該パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 〔1〕 から 〔3〕 のい ずれかに記載の複合体、
〔5〕 該プロテアーゼが、 癌で活性が亢進するプロテアーゼである、 〔1〕 から 〔4〕 のいずれかに記載の複合体、
〔6〕 該プロテアーゼが、 マトリックスメタ口プロテアーゼまたはプラスミノー ゲンァクチべ一ターである、 〔1〕 から 〔5〕 のいずれかに記載の複合体、
〔7〕 該プロテアーゼによって開裂される配列が、 Pro - Leu- Gly、 Pro-Gin- Gly、 または Val - Gly- Argを含む、 〔1〕 から 〔6〕 のいずれかに記載の複合体、
〔 8〕 該改変 F蛋白質において、 野生型 F蛋白質が持つ細胞質ドメィンの一部が欠 失している、 〔1〕 から 〔7〕 のいずれかに記載の複合体、
〔9〕 該改変 F蛋白質が HN蛋白質と融合している、 〔1〕 から 〔8〕 のいずれかに 記載の複合体、
〔1 0〕 パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) M蛋白質をコードする 核酸が変異または欠失しており、 かつ （b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開 裂部位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配 列に置換された蛋白質をコードするゲノム脆を有するウィルス粒子であって、 （
1 ) 該ウィルス粒子が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有し、 （
2 ) 宿主内環境においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、 ( 3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該ゲノム RNAを有するウィルス粒子が導 入された細胞と接触する細胞に、 該ゲノム R Aを導入する能力を有するウイルス粒 子の製造方法であって、
(i) パラミクソウィルスの野生型 M蛋白質を発現する細胞において、 該パラミ クソウィルスの N、 P、 および L蛋白質、 およぴ該ゲノム RNAを含む RNPを増幅させる 工程、
(ii) 該細胞の培養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方 法、
〔1 1〕 パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) 条件的変異を有する M 蛋白質をコードし、 カゝっ ( b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部位の配列 力 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換され た蛋白質をコードするゲノム RNAを有するウィルス粒子であって、 （1 ) 該ウィル ス粒子が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有し、 （2 ) 宿主内環 境においてウ^ルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており'、 ( 3 ) 該プロ テアーゼの存在に依存して、 該ゲノム RNAを有するウィルス粒子が導入された細胞 と接触する細胞に、 該ゲノム RNAを導入する能力を有するウィルス粒子の製造方法 であって、 (i) 該 M変異蛋白質の許容条件下、 細胞内で該パラミクゾウィルスの N、 P、 お よぴ L蛋白質、 およぴ該ゲノム RNAを含む RNPを増幅させる工程
(ii) 該細胞の培養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方 法、
〔1 2〕 工程 （i) を 35°C以下で行う、 〔1 0〕 または 〔1 1〕 に記載の方法、 〔1 3〕 工程 (i) 〜 （ii) の少なくともいずれかの時期において該改変 F蛋白質 を開裂させるプロテアーゼを存在させる力、 あるいは工程 (ii) において回収さ れたウィルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、 〔1 0〕 または 〔1 1〕 に記載の製造方法、
〔1 4〕 工程 (i) において該細胞内でパラミクソウィルスの野生型 F蛋白質を発 現させ、 工程 (i) 〜 （ii) の少なくともいずれかの時期に該野生型 F蛋白質を開 裂するプロテアーゼを存在させるか、 あるいは工程 (ii) において回収されたゥ ィルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、 〔1 0〕 または 〔1 1〕 に 記載の製造方法、
〔1 5〕 〔5〕 に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組 成物、
〔1 6〕 パラミクソウィルス F蛋白質の改変蛋白質であって、 開裂部位に Pro - Leu- Gly、 Pro-Gln-Glys または Va!l- Gly- Argを含み、 マトリックスメタ口プロテアーゼ またはプラスミノーゲンァクチべ一ターの存在下で細胞融合能を示す組み換え蛋 白質、
〔1 7〕 〔1 6〕 に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔1 8〕 〔1 6〕 に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウィル ス粒子 '
〔1 9〕 パラミクソウィルス F蛋白質おょぴ HN蛋白質の膜貫通領域を持ち、 細胞質 側において互いの蛋白質が結合している融合蛋白質であって、 細胞融合活性を持 つ蛋白質、 〔2 0〕 〔1 9〕 に記載の融合蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋 白質、
[ 2 1〕 〔1 9〕 に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔2 2〕 〔2 1〕 に記載の核酸を含むベタタ一、
〔2 3〕 〔1 9〕 に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウィル ス粒子、 に関する。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科 Paramyxovirid ae) に属するウィルスまたはその誘導体を指す。 パラミクソウィルスは、 非分節 型ネガティブ鎖 RNAをゲノムに持つウィルスのグループの 1つで、 パラミクソウイ ルス亜科 (Paramyxovirinae) (パラミクソウィルス属 （レスピロウィルス属とも 言う） 、ルブラウィルス属、 およびモーピリウィルス属を含む） およびニューモ ウィルス亜科 (Pneumovirinae) (ニューモウィルス属およびメタニューモウィル ス属を含む） を含む。 本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、 具体的 にはセンダイウィルス（Sendai virus)、 ニュー力ッスノレ病ゥイノレス（Newcastle di sease virus)、 お/こふく力ぜヮィノレス (Mumps virus)、 麻 ゥィルス (Measles vir us)、 RSウイノレス (Respiratory syncytial virus)、 牛 ウィルス (rinderpest vir us)、 ジステンパーウィルス（distemper virus)、 サノレノ《ラインフノレェンザウイノレ ス (SV5) 、 ヒ トパラインフルエンザウイルス 1, 2， 3型等が挙げられる。 より具 体的には、 例えば Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus - 1 (HPIV - 1) 、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin moloillivirus (DMV)、 peste - des- peti ts - ruminants virus (PDPR)、 measles virus ( V)、 rinderpest virus (RPV)、 He ndra virus (Hendra) s Nipah virus (Nipah)、 human parainfluenza vi s - 2 (HP IV - 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza vims - 4a ( HPIV— 4 &)、 human parainfluenza virus - 4b (HPIV— 4b)、 mumps virus (Mumps)、 お よび Newcastle disease virus (NDV) などが含まれる。 より好ましくは、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus - 1 (HPIV-1)、 human parainfluenza vi rus-3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CD V)、 dolphin raolbillivirus (DMV)、 peste - des-petits -： ruminants virus (PDPR) 、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 およ ぴ Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウィルスが例示できる。 本発 明のウィルスは、 好ましくはパラミクソウィルス亜科 （レスピロウィルス属、 ル ブラウィルス属、 およびモービリウィルス属を含む） に属するウィルスまたはそ の誘導体であり、 より好ましくはレスピロウィルス属 （Respirovirus) (パラミ クソウィルス属 （Paramyxovirus) とも言う） に属するウィルスまたはその誘導体 である。 本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、 例えばヒト パラインフルエンザウイルス 1型 (HPIV- 1) 、 ヒトパラインフルエンザウイルス 3型 (HPIV - 3) 、 ゥシパラインフルエンザウイルス 3型 (BPIV-3) 、 センダイウイ ルス（Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる）、 お よぴサルパラインフルエンザウイルス 10型 （SPIV- 10) などが含まれる。 本発明に おいてパラミクソウィルスは、 最も好ましくはセンダイウィルスである。 これら のウィルスは、 天然株、 野生株、 変異株、 ラボ継代株、 および人為的に構築され 'た株などに由来してもよい。
組み換え蛋白質および組み換えウィルスとは、 それぞれ組み換えポリヌクレオ チドを介して生成した蛋白質おょぴウィルスを言う。 組み換えポリヌクレオチド とは、 自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。 具体 的には、 組み換えポリヌクレオチドは、 人の手によってポリヌクレオチド鎖がつ なぎ替えられたり、 あるいは合成されたポリヌクレオ^ドなどが含まれる。 組み 換えポリヌクレオチドは、 ポリヌクレオチド合成、 ヌクレアーゼ処理、 リガーゼ 処理等を組み合わせて、 公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができ る。 組み換え蛋白質は、 蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現さ せることにより生産することができる。 組み換えウィルスは、 遺伝子操作により 構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、 ウィルス を再構築することによって生成することができる。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、 RNAおよび DNA等の核酸が含まれる 。 本発明において蛋白質をコードする核酸は、 該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。 また遺 伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、 例えば遺伝子はリボザィムまたはァ ンチセンス RNAなどの機能的 RNAをコードするものであってもよい。 遺伝子は天然 由来または人為的に設計された配列であり得る。 また、 本発明において 「DNA」 と は、 一本鎮 DNAおよぴニ本鎖 DNAを含む。 また蛋白質をコードするとは、 ポリヌク レオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配 列をコードする 0RFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明は、 プロテアーゼ依存性ト口ピズムが改変された複製能を有する細胞融 合型ベクターを提供する。 このベクターは、 宿主内環境において細胞への導入後 にウィルス様粒子を有意に放出せず、 特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細 胞に浸潤するベクターである。 本発明のベクターは、 具体的には以下の複合体を 言う。
パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) M蛋白質をコードする核酸が 変異または欠失しており、 力つ ( b ) 5女変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部位 の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置 換された蛋白質をコードするゲノム RNAを含む複合体であり、 以下の性質を有する 複合体。
( 1 ) 該複合体が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有する。
( 2 ) 宿主内環境にお!/、てウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している
( 3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該複合体が導入された細胞と接触する 細胞に、 該 RNAを導入する能力を有する。 この複合体は、 ゲノム RNAを複製しそれ を隣接細胞に導入する働きを有することから、 本発明においてベクターとも呼ぶ 。 ベクターとは、 核酸を細胞に導入する担体を言う。
上記複合体は、 具体的には該パラミクソウィルスのゲノム RNAとこれに結合する ウィルス蛋白質を含む複合体である。 本発明の複合体は、 例えばパラミクソウイ ルスのゲノム RNAとウィルス蛋白質からなる複合体、 すなわちリボヌクレオプロテ イン （RNP) であってよい。 RNPは、 例えば所望のトランスフエクシヨン試薬と組 み合わせて細胞に導入することができる。 このような匿は、 具体的にはパラミク ソウィルスのゲノム RNA、 N蛋白質、 P蛋白質、 および L蛋白質を含む複合体である 。 RNPは細胞内に導入されると、 ウィルス蛋白質の働きによりゲノム RNAからウイ ルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、 ゲノム自身が複製され 娘 RNPが形成される。 ゲノム RNAの複製は、 該 R Aのコピー数の増加を RT - PCRまたは ノーザンハイブリダイゼーシヨン等により検出することにより確認することがで さる。
また上記複合体は、 より好ましくはパラミクソウィルスのウィルス粒子である 。 ウィルス粒子とは、 ウィルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、 核酸を 含む微小粒子を言う。 ウィルス粒子の形状はウィルスの種類により球状、 棍棒状 など様々であってよいが、 細胞より十分に小さく、 その大きさは通常 10nm〜800nm 程度である。 パラミクソウィルスのウィルス粒子は、 ゲノム RNAとウィルス蛋白質 を含む上記 RNPが細胞膜由来の脂質膜 （エンベロープという） に含まれた構造をし ている。 ウィルス粒子は、 感染性を示すものでも示さないものでもよい （後述） 。 例えば、 そのままでは感染性を示さないが、 特定の処理により感染性を獲得す るような潜在的に感染性を有するウイルス粒子であってもよい。
またパラミクソウィルスのゲノム R Aとは、 パラミクソウィルスのウィルス蛋白 質と共に R Pを形成し、 該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、 該核酸が複製 して娘匿が形成される機能を持つ RNAを言う。 パラミクソウィルスは一本鎖ネガ ティブ鎖 R Aをゲノムに持つウィルスであるので、 このような RNAは搭载遺伝子を アンチセンスとしてコードしている。 一般にパラミクソウィルスのゲノムは、 3， リーダー領域と 5， トレイラー領域の間に、 ウィルス遺伝子がアンチセンスとして 並んだ構成をしている。 各遺伝子の 0RFの間には、 転写終結配列 （E配列） -介在配 列 （I配列） -転写開始配列 （S配列） が存在し、 これにより各遺伝子の 0RFをコー ドする RNAが別々のシストロンとして転写される。 本発明のベクターに含まれるゲ ノム RNAは、 該 RNAにコードされる遺伝子群の発現おょぴ RNA自身の自律的な複製に 必要なウィルス蛋白質である N (ヌクレオキヤプシド） 、 P (ホスホ） 、 および L (ラージ） をアンチセンスにコードしている。 また該 RNAは、 隣接細胞への該 R A の伝播に必要な細胞膜融合を起こす蛋白質である F (フュージョン） 蛋白質をアン チセンスにコードしている。 好ましくは、 ゲノム RNAはさらに H (へマグルチェ ン-ノイラミニダーゼ） （または H) 蛋白質をアンチセンスにコードしている。 伹 し、 ある種の細胞では感染に HN蛋白質は必要なく （Markwell, M. A. et al. , Proc . Natil. Acad. Sci. USA 82 (4)： 978-982 (1985) ) 、 F蛋白質のみで感染が成立す る。 また、 細胞に結合し得る H以外の蛋白質を F蛋白質と組み合わせてベクターを 感染させることができる。 従って、 HN遺伝子をコードしないゲノム RNAを用いても 、 本発明のベクターを構築することは可能である。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、 一般 に次のように表記される。 一般に、 N遺伝子は" NP〃と表記されることもある。
レスピロウィルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルプラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
例えばパラミクソウイルス科 Parawxovirida ) のレスピロウイルス （Respir ovirus) に分類されるセンダイウィルスの各 伝子の塩基配列のデータベースの ァクセッション番号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、 P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、 M遺伝子については D11446, K02742 ， M30202, M30203, M30204, 69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子について は D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152 , Χ02131、 ΗΝ遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M690 46, X00586, X02808, X56131、 L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30 204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。 またその他のウィルスがコードする ウィルス遺伝子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961 ； HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV- 3， D10025; Mapuera, X85128; Mumps,
D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X6831 1； SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、 P遺伝子については、 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV- 4a, M55975 ； HPIV- 4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; R ？ V, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780, C遺伝子 については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; W , AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、 M遺伝子 については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV- 3, D00130; HPIV - 4a， D10241; HPIV - 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948;
NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; およ ぴ SV5, M32248、 F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1. M223 47； HPIV-2, M60182; HPIV-3. X05303, HPIV- 4a， D49821; HPIV- 4b， D49822; Mum ps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV , M21514; SeV, D17334; および SV5， AB021962, HN (Hまたは G) 遺伝子について は CDV， AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3 , AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711 ； NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV- 5， S76876が例示できる。 但し、 各ウィルスは複数の株が知られてお り、 株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。 これらのウィルス蛋白質の ORFは、 ゲノム RNAにおレ、て上記の E - I-S配列を介して アンチセンスに配置される。 ゲノム RNAにおいて最も 3，に近い 0RFは、 3'リーダー 領域と該 0RFとの間に S配列のみが必要であり、 Eおよび I配列は必要ない。 またゲ ノム RNAにおいて最も 5，に近い 0RFは、 5， トレイラ一領域と該 0RFとの間に E配列の みが必要であり、 Iおよび S配列は必要ない。 また 2つの 0RFは、 例えば IRES等の配 列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。 このような場合 は、 これら 2つの 0RFの間には E - 1- S配列は必要ない。 野生型のパラミクソウィルス の場合、 典型的な RNAゲノムは、 3，リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 H、 および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの 0RFが順に並んでおり、 それに続いて 5 ' トレイラ一領域を他端に有する。 本発明のゲノム RNAにおいては、 ウィルス遺伝 子の配置はこれに限定されるものではないが、 好ましくは、 野生型ウィルスと同 様に、 3，リーダー領域に続き、 N、 P、 （M、 ) F、 HN、 および L蛋白質をコードする ORFが順に並ぴ、 それに続いて 5' トレイラー領域が配置されることが好ましい。 あ る種のパラミクソウィルスにおいては、 ウィルス遺伝子は 6つではないが、 そのよ うな場合でも上記と同様に各ウィルス遺伝子を野生型と同様の配置とするカゝ、 あ るいは適宜変更することができる。 M蛋白質の 0RFについては後述する力 本発明 のベクターの 1つの態様においては、 この 0RFは存在しないか、 あるいは変異 M蛋 白質をコードしている。 また本発明のベクターの 1つの態様においては、 ゲノム にコードされる F蛋白質の開裂部位は、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼ によって開裂される配列に改変されている （後述） 。 本発明のゲノム RNAは、 1つ またはそれ以上の外来遺伝子をコードすることができる。 外来遺伝子としては、 標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。 外来 遺伝子の導入位置は、'例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位に挿入す ることができ、 例えば 3'リーダー領域と 3，に最も近いウィルス蛋白質 0RFとの間、 各ウィルス蛋白質 0RFの間、 および/または 5，に最も近いウィルス蛋白質 0RFと 5' ト レイラ一領域の間に揷入することができる。 M遺伝子を欠失するゲノムでは、 その 欠失領域に揷入することができる。 パラミクソウィルスに外来遺伝子を導入する 場合は、 ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が 6の倍数となるように揷 入することが望ましい （Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 199 3) 。 挿入した外来遺伝子とウィルス ORFとの間には、 E-I-S配列が構成されるよう にする。 あるいは、 IRESを介して外来遺伝子を揷入してもよい。
外来遺伝子の発現レベルは、 その遺伝子の上流 （ネガティブ鎖の 3'側） に付加 する転写開始配列の種類により調節することができる （TO01/18223) 。 また、 ゲ ノム上の外来遺伝子の挿入位置によつて制御することができ、 ネガティプ鎖の 3' の近くに揷入するほど発現レベルが高く、 5，の近くに揷入するほど発現レベルが 低くなる。 このように、 外来遺伝子の挿入位置は、 該遺伝子の所望の発現量を得 るために、 また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適 となる様に適宜調節することができる。 一般に、 外来遺伝子は高い発現が得られ ることが有利と考えられるため、 外来遺伝子は、 効率の高い転写開始配列に連結 し、 ネガティブ鎖ゲノムの 3'端近くに揷入することが好ましい。 具体的には、 3， リーダー領域と 3'に最も近いウィルス蛋白質 0RFとの間に揷入される。 あるいは、 3'に一番近いウィルス遺伝子と 2番目の遺伝子の 0RFの間に挿入してもよい。 逆に 、 導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、 例えばベクターにおける挿入遺伝 子の揷入位置をネガティブ鎖ゲノムのなるベく 5'側に設定したり、 転写開始配列 を効率の低 、ものにするなどして、 ウイルスべクターからの発現レベルを低く抑 えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
また本発明のベクターは、 例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させる ために、 または R Aの転写効率や複製効率を高めるために、 ベクターに含まれる任 意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。 具体的には、 例え ばパラミクソウィルスベクターにおいては、 複製因子である N、 P、 および L遺伝子 の中の少なくとも一つを改変し、 転写または複製の機能を高めることが考えられ る。 また、 構造体蛋白質の 1つである HN蛋白質は、 赤血球凝集素であるへマダル チニン （hemagglutinin) 活性とノィラミニダーゼ (neuraminidase) 活性との両 者の活性を有する力 例えば前者の活性を弱めることができれば、 血液中でのゥ ィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、 例えば後者の活性を改変す ることにより、 感染能を調節することも可能である。 また、 F蛋白質も、 開裂部位 以外のドメインも改変することにより、 膜融合能および/または粒子形成能を調節 することもできる。 また、 例えば、 細胞表面の抗原分子となりうる F蛋白質や HN蛋 白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、 これを利用してこれらの蛋白質に関する 抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、 アクセサリー遺伝子が欠損したものであつ てよい。 例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックァゥトす ることにより、 培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく'、 マウ ス等の宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する （Kato， A. et al. , 1997, J. Virol. 71 :7266-7272； Kato, A. et al.， 1997, EMBO J. 16 :578—587; Curran, J . et al. , W001/04272, EP1067179) 。 このような弱毒化ベクターは、 in vivoま たは ex vivoにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして有用である また好ましい態様において、 本発明の複合体は実質的に均一な複合体である。 実質的に均一な複合体とは、 該複合体が、 本発明の複合体ではないパラミクソゥ ィルスの RNPまたはウィルス粒子から分離されていることを言う。 すなわち実質的 に均一な本発明の複合体は、 粒子形成能を有する他のパラミクソウィルス RNPも該 ウィルスのウィルス粒子も含んでいない。 ここで粒子形成能とは、 ウィルスべク タ一を感染させた細胞において、 感染性ウィルス粒子および/または非感染性ゥィ ルス粒子 （これ ウィルス様粒子という） を放出 （これを 2次放出'という） する ベクターの能力を言う。 また、 F蛋白質の開裂部位が改変された本発明の複合体に おいては、 野生型 F蛋白質またはこれと同等の融合活性を有する F蛋白質をコード する遺伝子をゲノムに含むウィルス RNPも該ゲノムを含むウィルス粒子も含んでい ない。
本発明の一態様においては、 上記ゲノム RNAにコードされる F蛋白質は、 該蛋白 質の開裂部位の配列が、 他のプロテアーゼによって開裂される配列に置換されて いる。 パラミクソウィルスの F蛋白質 （F0) は、 そのままでは細胞膜融合活性を示 さないが、 F0断片の細胞外ドメイン （またはウィルス粒子外ドメイン） が開裂す ることによってその融合活性を示すようになる。 開裂により生じた 2つの F蛋白質 断片は N末側が F2、 および C末側が F1と呼ばれ両者はジスルフィド結合により結合 している。 F蛋白質を開裂するとは、 このように膜上の F蛋白質を膜の外側のドメ ィンにおいて切断し、 細胞融合能を獲得させるような断片を生じさせることを言 う。 開裂部位の配列とは、 プロテアーゼによる開裂のために必要なァミノ酸配列 またはその中の本質的な残基を言う。 パラミクソウィルスの F蛋白質の開裂部位は 知られており、 それらは細胞内の furin等のトリプシン様プロテアーゼにより切断 される。
furinは、 ほとんどの細胞のゴルジ体に普遍的に存在する。 furinの認識モチー フは、 Arg~X- Lys/Arg~Arg (RXK/RR) (7〃で区切られた 2つのアミノ酸はどちらか であることを表す） である。 病原性の高い、 Human PIV3 (RTKR) 、 SV5 (RRRR) 、 Mumps virus (RHKR) 、 NDV (virulent strain) 強毒株 （RQR/KR) 、 Measles viru s (RHKR) 、 RS virus (RKRR) などは開裂部位にこれらのモチーフの配列を持って いる。 強毒株の Fは、 すべての細胞に存在するプロテアーゼに感受性をもち、 どの 臓器でも Fの開裂を伴って多段階増殖するため、 感染が致命的になってしまう。 一 方、 病原性の低い、 Sendai virus (PQSR) 、 Human PIV1 (PQSR) 、 NDV (avirulen t strain) 弱毒株 （K/RQG/SR) ではこのモチーフに当てはまらず、 セリンプロテ ァーゼ認識配列である Argのみ持っている。 パラミクソウィルスの F蛋白質開裂部 位の配列はよく解析されており、 当業者であれば適宜文献を参照して知ることが できる （例えばウィルス学， 畑中正一編集， 東京， 朝倉書店， 1997, pp. 247-248 を参照） 。 また開裂部位は、 当該パラミクソウィルスが増殖可能な細胞、 組織、 または個 体等で増殖させたウィルスの F蛋白質、 あるいは該細胞または個体等で F蛋白質を 発現させ回収した F蛋白質の開裂部位を同定することにより確認することができる 。 また、 細胞表面に発現する F蛋白質を、 この蛋白質の開裂部位を開裂するトリプ シン等のプロテアーゼで処理することにより、 人為的に F蛋白質を開裂させ同定す ることもできる。 本発明の一態様において F蛋白質は、 F蛋白質開裂部位のァミノ 酸配列が改変され、 他のプロテアーゼにより開裂されるような配列となっている 。 このためには、 F蛋白質の生来の開裂配列を、 1またはそれ以上のアミノ酸の置 換、 欠失、 および/または揷入により改変し、 他のプロテアーゼにより開裂される ような配列に再構築する。 アミノ酸配列の改変は、 公知の部位特異的変異導入法 により行うことができる。 なお、 改変 F蛋白質は、 野生型 F蛋白質を開裂するプロ テアーゼ （トリプシン等） により開裂される性質が維持されていてもよい （実施 例参照）。 このような改変 F蛋白質をコードするベクターは、 プロテアーゼ依存个生 ト口ピズムが野生型 F蛋白質に比べて拡大される。
他のプロテアーゼにより開裂される配列としては、 所望のプロテアーゼにより 開裂される配列であってよく、 例えばベクター導入の標的としたい所望の組織ま たは細胞で発現されるプロテアーゼにより開裂される配列を用いることができる (W001/20989) 。 このように標的組織で活性があるプロテア一ゼで開裂される配 列を持つ F蛋白質遺伝子を用いてベクターを設計することにより、 このプロテア一 ゼ活性が存在する環境下で特異的に周囲の細胞にベクターを増幅し伝達するとい う優れた性質を実現させることができる。 例えば、 ある組織で特異的に発現また は活性ィヒされるプロテアーゼの切断配列を利用すれば、 該組織内でのみ特異的に ί曼潤するベクターを構築することができる。 また、'ある状態、 例えばある疾患で 特異的に発現または活 '性化するプロテアーゼの切断配列を利用すれば、 その状態 でのみ （例えば特定の疾患領域内でのみ） 特異的に浸潤するベクターを構築する ことができる。 プロテアーゼは細胞内または細胞外に存在するものであってよく 、 例えば細胞外に分泌されるプロテアーゼや、 膜表面に発現する膜型プロテア一 ゼなどが好適である。 また、 F蛋白質が細胞内において翻訳され、 細胞表面に分泌 されるまでの輸送経路上に存在する所望のプロテアーゼであってよい。
プ口テアーゼ遺伝子の発現異常によって生じる疾患の数は膨大で、 代謝性疾患 、 循環障害、 炎症 *免疫疾患、 感染症、 悪性腫瘍など、 病理学総論で极われてい る全ての範疇に属する疾患を含んでいる。 例えば、 筋ジストロフィー症における カルパイン、 自己免疫疾患や神経疾患におけるュビキチン ·プロテアソームシス テムの破錠、 アルツハイマー病のネプリライシンの発現低下、 癌の浸潤♦転移に おける MMPの発現亢進、 病原微生物による病原体由来プロテアーゼ、 止血機構にお けるセリンプロテアーゼ、 胎盤におけるアミノぺプチターゼなどがあげられる。 カルシウム依存性システィンプロテアーゼであるカルパインは筋ジストロブイ 症の筋蛋白質分解に関わる酵素として研究されてきた。 カルパインはカルシウム との結合によつて活性化される特異的な活性化機構を有し、 骨格筋の構造維持に 重要なひ-ァクチニン、 トロポニン、 コネクチンなどの蛋白質を細胞内で限定分解 し、 筋蛋白質分解の引き金を引くと考えられている。 カルパインの切断配列 (Kar lsson, J. 0. et al. (2000) Cell Biol. Int. 24, 235 - 243) としては、 例えば L eu-Leu- Val - Tyrが分解基質として用いられている。
ュビキチン ·プロテアソームシステムは、 細胞内における選択的かつ能動的な 蛋白質分解機構であり、 シグナル伝達や細胞周期などの重要な細胞機能制御シス テムである。 76個のアミノ酸からなるュビキチンは、 ュビキチン活性ィヒ酵素 （E1 ) , ュビキチン結合酵素 （E2) およびュビキチンリガーゼ （E3) による連続的な 触媒作用で蛋白質と共有結合し、 ュビキチン化蛋白質は 26Sプロテアソームにより 分解される。 '数百種類存在する E3酵素は HECT型と RINGフィン ー型に大別され、 これらの酵素活性の異常はきわめて多くの疾患に関与する。 26Sプロテアソーム に対する分解基質としては例えば Leu - Leu - Val - Tyrが用いられている （Reinheckel ， T. et al. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 377, 65-68) 。 慢性関節リュウマチをはじめとする関節疾患は、 関節軟骨の組織破壌により運 動障害をきたす疾患である。 関節軟骨の再生能はきわめて弱く、 細胞外マトリツ タス分解による軟骨高次構造の崩壌は進行性の関節破壌へと導く。 このような軟 骨細胞外マトリックス分解には、 MMPとその近縁遺伝子ファミリーの ADAM (a disi ntegrin and metal loproteinase) 分子の関わりが最近注目されている。 特に ADAM TS (ADAM with thrombospondin motif) 分子は軟骨プロテオグリカン （ァグリカ ン） の分解に必須の酵素と考えられている （Tortorella, M. D. et al. (1999) Sc ience 284, 1664-1666)。 ADAMTSによって agricanが分解された配列が特定されて いる （Tortorella, M. D. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 18566-18573)。 これらのプロテアーゼの認識配列を用いることにより、 該プロテアーゼが発現 する組織に特異的なベクターを調製することができる。
本発明において特に好ましいプロテア一ゼ開裂配列は、 癌で活性が亢進するプ 口テアーゼの切断配列である。 このような配列を利用してベクターを構築するこ とにより、 癌特異的に感染を広げるベクターを構築することが可能となり、 癌治 療用の遺伝子送達ベクターとして極めて有用となる。 癌で活性が亢進するプロテ ァーゼとは、 ある癌組織または癌細胞において、 その癌に対応する正常糸且織また は正常細胞と比べ活性が亢進しているプロテア一ゼを言う。 ここで活性の亢進は 、 プロテアーゼの発現レベルの亢進および/または活性自体の亢進であつてよい。 プロテアーゼの発現レベルは、 該プロテアーゼの遺伝子断片をプローブにしたノ ーザンハイプリダイゼーシヨン、 該プロテアーゼ遺伝子を特異的に増幅するプラ イマ一を用いた RT- PCR、 あるいは該プロテアーゼに対する抗体を用いたゥエスタ ンプロット、 ELISA、 免疫沈降などにより測定することができる。 またプロテア一 ゼの活性'は、 該プロテア一ゼの基質を用いた分解アツセィ ίこより知ることができ る。 生体内プロテアーゼは、 種々の阻害因子により活性が調節されているものが 数多く知られている。 プロテアーゼの活性レベルは、 これらの阻害因子の発現レ ベルを測定することによつても測定することができる。 例えば細胞外マトリックス （extracellular matrix; ECM) 分解酵素の活性は、 特に転移性の癌において活性が亢進している （Nakajima, M. and Chop, A. M. , Se min. Cancer Biol. 2 : 115 - 127, 1991； Duffy, M. J. , Clin. Exp. Metastasis 10: 145-155, 1992； 中島元夫 「細胞外マトリクス分解酵素」 ， 清木元治編集 「癌の 悪性ィヒと転移 J ， 中外医学社， pp. 124-136, 1993年） 。 動物においては、 細胞間 の隙間に、 コラーゲンやプロテオダリカンなどの蛋白からなるマトリッタスが形 成されている。 細胞外マトリックスの成分としては、 具体的には、 コラーゲン ' フィプロネクチン .ラミニン ·テネイシン ·エラスチン ·プロテオグリカンなど が知られている。 これらの ECMは、 細胞の接着、 進展、 または移動等の機能を調節 したり、 可溶性因子を結合してその分布や活性を調節する機能等を有している。 癌転移には ECM分解酵素による ECMの浸潤が深く関わっており、 実際 ECM分解酵素の 阻害剤による転移または基底膜浸潤の阻害が多数報告されている。 ECM分解酵素に よる切断の認識配列を開裂部位に持つ改変 F蛋白質をコードするベクターを設計す ることにより、 癌特異的に感染およぴ浸潤するベクターを構築することができる
ECM分解酵素は、 活性中心にある触媒残基の種類によってァスパラギン酸プロテ ァーゼ、 システィンプロテアーゼ、 セリンプロテアーゼおよびメタ口プロテア一 ゼに分類される。 中でも生体内での ECM分解には中性プロテア一ゼのセリンプロテ ァーゼとメタ口プロテアーゼが中心的な役割を果たしている。 セリンプロテア一 ゼは、 微生物、 動物、 植物等に広く分布し、 高等動物においては、 食物の消化、 血液の凝固、 線溶、 免疫補体反応、 細胞増殖、 発生、 分化、 老化、 癌転移などき わめて多くの生体反応に関与している。 また、 セリンプロテアーゼの活性は、一 般に血漿や組織内に存在する'セリンプロテアーゼインヒビター （serpin) によつ て調節されており、 この量的あるいは質的異常は炎症などの原因となる。
ECM分解 1生セリンプロテアーゼとしては、 カテブシン G、 エラスターゼ、 プラス ミン、 プラスミノーゲンァクチべ一ター、 腫瘍トリプシン、 キモトリブシン様中 性プロティナーゼ、 トロンビンなどが挙げられる。 プラスミンは、 生体内で不活 性な状態で存在するプラスミノーゲンが限定分解されて生じる。 この限定分解を プラスミノ一ゲンァクチべーター （plasminogen activator; PA) とそのインヒビ ターであるプラスミノーゲンァクチべ一ターインヒビター （plasminogen act i vat or inhibitor; PAI) が制御している。 PAには、 血液凝固に関係する組織型 PA (tP A) と、 ECM分解に関係するゥロキナーゼ型 PA (uPA) とがある （Blasi, F. and Ve rde, P. Semin. Cancer Bio. 1 : 117—126, 1990) 。 これらの 2つの PAは、 PAIと結 合するとその作用が阻害される （Cajot， J. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6939-6943, 1990； Baker, M. S. et al. , Cancer Res. 50:4676-4684, 199 0)。 uPAは細胞表面の uPAレセプター （uPAR) と結合した状態で作用することがで きる。 プラスミンはフイブロネクチン、 テネイシン、 ラミニンなどを分 するが 、 コラーゲンは直接分解することができない。 し力 し、 コラーゲン分解酵素の前 駆体の一部を切断して活性化することにより、 間接的にコラーゲンを分解する。 これらが癌細胞においてしばしば活性が亢進しており、 転移能ともよく相関して いる （Tanaka, N. et al. , Int. J. Cancer 48:481—484， 1991； Boyd, D. et al. ， Cancer Res. 48： 3112 - 3116, 1988; Hollas, W. et al. , Cancer Res. 51： 369 0-3695, 1991； Correc, P. et al. , Int. J. Cancer 50: 767-771， 1992； Ohkosh i, M. et al. , J. Natl. Cancer Inst. 71： 1053—1057, 1983； Sakaki, Y. et al . , 現代医療 17： 1815-1821， 1985)。
uPA, tPAの切断配列についての研究も多くなされている （Rijken, D. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2920-2925； Wallen, P. et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta 719， 318—328; Tate, K. M. et al. (1987) Biochemistry 26, 33 8-343) 。 一般に用いられている substrate配列は VGR (Dooi jewaard, G. , and KL UFT, C. (1983) Adv. Exp. Med. Biol. 156, 115 - 120) と、 Substrate S-2288 (I le-Pro-Arg) (Matsuo, 0. et al. (1983) Jpn. J. Physiol. 33, 1031—1037) で ある。 Butenasは 54種類の蛍光基質を用いて、 tPAに対する特異性の高い配列を提 示し （Butenas, S. et al. (1997) Biochemistry 36, 2123-2131) 、 FPR, VPRが 高い tPAに対する分解活性を示した。 従って、 これらの配列は特に好適に用いられ る。
また、 システィンプロテアーゼまたはァスパルティックプロテアーゼに分類さ れる ECM分解酵素も知られており、 これらも癌の転移およに浸潤に関与している。 具体的には、 ラミニン、 プロテオグリカン、 フィプロネクチン、 コラーゲン、 プ ロコラゲナーゼ （分解により活性化する） 等を基質とするカテブシン B (Sloane, B. F. , Semin. Cancer Biol. 1 : 137-152, 1990) 、 エラスチン、 プロテオグリカン 、 フイブロネクチン、 ラミニン、 エラスターゼ （活性化） 等を基質とするカテブ シン (Kane, S. E. and Gottesraan, . M. , Semin. Cancer Biol. 1 : 127-136, 199 0) 、 並びに、 ラミニン、 フィプロネクチン、 プロテオダリカン、 カテブシン Bお ょぴ L (活性化） を基質とするカテブシン D (Rochefort, H. , Semin. Cancer Biol . 1： 153-160, 1990) などが挙げられる。 カテブシン Bおよび Lは特に乳癌組織 (Sp yratos, F. et al. , Lancet ii : 1115 - 1118， 1989； Lah, T. T. et al. , Int. J. Cancer 50: 36-44, 1992) 、 大腸瘙カルシノーマ （Shuja, S. et al.， Int. J. C ancer 49： 341-346, 1991) に強く発現しており、 阻害因子との均衡の破綻と癌の 悪性化との関与も示唆されている （Sloane, B. F. , Semin. Cancer Biol. 1 : 137 - 1 52, 1990； Kane, S. E. and Gottesraan, M. M.， Semin. Cancer Biol. 1 : 127—136, 1990) 。
メタ口プロテアーゼ （metalloproteinase) は Znなどの金属元素を含む金属酵素 であり、 カスパーゼ、 アミノぺプチダーゼ、 アンギオテンシン I変換酵素、 コラゲ i "一ゼなどが報告されている。 ECMを分解するメタ口プロテアーゼとしては、 16種 類以上のマトリックスメタ口プロテアーゼ （matrtix metalloproteinase; MMP) が報告されている。 代表的な MMPとしては、 コラゲナーゼ -1、 2、 3 (MMP-1、 8、 13 ) 、 ゼラチナーゼ A、 B (匿 -2、 9) 、 ストロメライシン 1、 2、 3 (MMP- 3、 10、 11 ) 、 マトリライシン （MMP - 7) 、 膜型メタ口プロテアーゼ （MT1 - MMP、 MT2-MMP) な どが挙げられる。 一般に匿は、 活性中心に Zn2+を有し、 酵素活性に Ca2+を必要とす る。 また潜在型酵素 （latent MMPまたは ProMMPという） として分泌され、 細胞外 で活性化を受け生体内に存在する種々の ECMを分解する。 また MMPは、 共通のイン ヒビターである tissue inhibitor of mettaloproteinases (TIMP) によって活' 14 が阻害される。 他に、 ECM分解生のメタ口プロテアーゼとしては、 アミノぺプチダ ーゼが挙げられ、 例えば ECM構成蛋白質などを分解するアミノぺプチダーゼ N/CD13 およぴァミノべプチダーゼ Βなどが含まれる。 阻害剤を用いた実験から、 これらの プロテアーゼはいずれも癌と深く関与していることが報告されている。
その中でコラゲナーゼ （collagenase) (MMP- 1, 8, 13) は、 線維性コラーゲン である I, II, III型コラーゲン分子を特異的部位で切断する。 ゼラチナーゼ （gel atinase) は、 ゼラチナーゼ A (MMP- 2) およびゼラチナーゼ B (MMP- 9) の 2つのタ イブが知られている。 ゼラチ^ "一ゼは IV型コラゲナーゼともよばれ、 基底膜の主 成分である IV型コラーゲンを分解する力 V型コラーゲンおよびエラスチンも分解 する。 また、 MMP - 2は I型コラーゲンを MMP-1と同じ部位で切断することが知られて いる。 MMP-9はラミニンおよぴフイブロネクチンを分解しないが、 MMP- 2はこれら を分解する。 ストロメライシン （stromelysin) (MMP- 3, 10) は広い基質性を有 し、 プロテオグリカン、 III、 IV、 IX型コラーゲン、 ラミニン、 フィプロネクチン などを分角する。 マトリライシン （matrilysin) (MMP- 7) は、 へモぺキシンドメ インをもたない分子であり、 基質特異性は MMP- 3と共通し、 特にプロテオダリカン およびエラスチンに対する分解活性が高い。 膜型メタ口プロテアーゼ （membrane- type MMP; MT-MMP) (MT1, 2, 3， 4， 5, 6- MMP) は膜貫通構造をもつ MMPである。 MT -匿は、 プロペプチドドメインと活性部位の間に挿入配列 （約 10アミノ酸） を 有する。 この挿入配列は Arg- Xaa- Lys- Arg (Xaaは任意のアミノ酸） を含み、 細胞 膜上に輸送される過程で、 細胞内プロセシング酵素である furinにより開裂され活 性ィ匕される。 MT-匿としては、 MT1- MMP (MMP-14) 、 MT2-MMP (MMP-15) 、 MT3-MMP (MMP-16) 、 MT4-MMP (MMP-17) 、 MT5-MMP (MMP- 23) 、 および MT- 6- MMP (MMP-25 ) などが知られ、 例えは HT1-MMPは I， II， III型コラーゲンを、 MT3-匿は III型コ ラーゲンを分解する。
MMPの過剰発現は癌細胞で広範囲に起こっていることがわかっている。 それらは 癌自身と癌間質細胞による発現に分けられる。 例えば間質コラーゲンを分解する コラゲナ ゼ （MMP は癌細胞の浸潤に関与しており、 大腸癌等でもその活性レ ベルは転移性と相関している （Wooley, D. E.， Cancer Metastasis Rev. 3： 361 - 3 72, 1984； Tarin, D. et al. , Br. J. Cancer 46： 266 - 278, 1982) 。 また、 タイ プ IVコラゲナーゼ （MMP-2、 MMP-9) は様々な上皮性癌において活性と転移能との 間に高い相関関係がある (Liotta, L. A. and Stetler-Stevenson, W. G. , Semin. Cancer Biol. 1： 99-106, 1990； Nakajima, M. 実験医学 10: 246-255, 1992) 。 また、 ストロメライシン （M P-3) も皮膚の上皮性腫瘍の悪性ィ匕に相関しているこ とカ知られて ヽる (Matrisian, L. M. and Bowden, G. T. , Semi. Cancer Biol. 1： 107-115, 1990) 。 ストロメライシン- 3 (MMP- 11) は乳癌おょぴ大腸癌などにおい て高発現が観察されている （Basset, T. et al.， Nature 348： 699-704, 1990； P orte, H. et al. , Clin. Exp. Metastasis 10 (Suppl. 1) : 114, 1992) 。
MMPの切断基質は、 多数知られている。 MMP全般を分解する基質配列として PLGLW AR (Bickett, D. M. et al. (1993) Anal. Biochem. 212, 58—64) 、 GPLGMRGL (De ng, S. J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 31422-31427) 、 PQGLEAK (Beekma n, B. et al. (1996) FEBS Lett. 390, 221-225) 、 RPKPVEWREAK (Beekman, B. e t al. (1997) FEBS Lett. 418, 305-309) 、 PLALWAR (Jacobsen, E. J. et al. (1 999) J. Med. Chem. 42, 1525-1536) がある。 MMP- 2， 9の分解基質として PLGMWS
(Netzel-Arnett, S. et al. (1991) Anal. Biochem. 195， 86-92) と PLGLG (Wei ngarten, H. et al. (1985) Biochemistry 24, ' 6730-6734) がある。
最近、 phage - displayed peptide library screening によって、 MMP9 (Kridel, S. J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578) ， MMP2 (Chen, E. I. e t al. (2002) J. Biol. Chem. 277， 4485-4491) , MT1-MMP (Kridel, S. J. et al • (2002) J. Biol. Chem. In JBC Papers in Press, April 16, 2002, Manuscrip t M111574200) に対する分解基質配列が明らかにされている。 これらの論文で、 特定されたアミノ酸配列を 3つの MMP に対する分解能の有無によって 4つのグルー プに分類されている。 Group IVが MT1- MMPに特異的に分解される配列で、 Argのな い配列として VFSIPL, IKYHSの配列が MMP9, MMP2で分解できず MT- MMPでのみ分解で きる基質としてしめされている。
例えば、 MMP9の切断配列としては、 Pro - X-X- Hy (Xは任意の残基， Hyは疎水性残 基を表す） が挙げられ、 特に Pro- X-X-Hy- (Ser/Thr) が好ましい。 より具体的には 、 Pro- Arg- (Ser/Thr)- Hy- (Ser/Thr)が例示できる （X-Hy間で切断が起きる） 。 Hy
(疎水性残基） としては、 これらに限定されないが、 例えば Leu、 Val、 Tyr、 lie 、 Phe、 Trp、 Metが挙げられる。 あるいは、 これ以外の切断配列も同定されており
(例えば以下の文献の Group I, II， IIIA, IIIB を参照； Kridel, S. J. et al. ( 2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578) 、 これらの所望の配列を用いることが できる。 また M P2に関しても上記の Pro- X- X-Hyであってよく、 他にも、 （Ile/Leu ) -X-X-Hy, Hy-Ser- X-Leu、 His- X-X- Hyなどが例示できる （例えば以下の文献の Gro up I, II, III， IV を参照； Chen, E. I. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 44 85-4491) 0 MMP- 7、 匿- 1、 MMP- 2、 匿- 9、 雇 P- 3、 MT1-MMP (MMP- 14) を含む MMP ファミリーの切断配列は、 例えば天然の基質蛋白質の配列を参考にしたり、 ある いはべプチドライブラリ一のスクリ一ユング等によって適宜選択することができ る （Turk, B. E. et al. , Nature Biotech. 19, 661 - 667 (2001)； Woessner, J. F. and Nagase, H. Matrix metalloproteinases and TIMPs. (Oxford Iniversity P ress, Oxford, UK, 2000)； Fernandez-Patron, C. et al. , Circ. Res. 85: 906- 911, 1999； Nakamura, H. et al. , J. Biol. Chem. ' 275： 38885-38890, 2000； Mc Quibban, G et al. , Science 289： 1202-1206, 2000； Sasaki, T. et al. , J.
Biol. Chem. 272： 9237-9243, 1997) 。 例えば切断部位の 8アミノ酸 P4 - P3- P2-P 1- PI' - P2' - P3' - P4' (PI- Ρ 間で切断される） を例示すれば、 MMP - 1は VPMS- MRGG 、 MMP- 3は RPFS - MIMG、 MMP-7は VPLS - LTMG、 MTl-MMPは IPES - LRAGなどが挙げられ るがこれらに制限されない。 MMP-8には例えば PLAY AR (Nezel- Amett, S. et al. , Anal. Biochem. 195： 86, 1991) が拳げられる。 MMPの合成基質は様々なものが 入手可能であり、 これらの配列を比較することもできる （例えば Calbiochem登 録商標 カタログ， Merk, の各 MMP Substrate参照） 。
通常、 組織内の MMP活性は、 潜在型酵素の産生、 その潜在型酵素の活性化、 およ ぴ活性型酵素のインヒビターによる阻害の過程で調節されており、 発生排卵、 受 精、 子宮内膜への着床、 および創傷治癒などの様々な生理現象に関与している。 M
MP活性の調節の障害は、 癌細胞の浸潤 ·転移、 関節炎、 歯肉炎、 動脈硬化、 腫瘍 、 線維症などの様々な病態に寄与する。 例えば、 癌の転移には基底膜成分を分解 するゼラチナーゼ （MMP- 2、 -9) が重要であることが知られている。 MMP-2は、 MT 1 - MMPによる pro - MMP- 2の切断により活性ィ匕される。 また MMP-9の活性化には、 uPA によりまずプラスミノーゲンからプラスミンがつくられ、 proMMP- 3を活性ィヒし、 a ctive MMP-3が ProMMP-9を活性化する経路が存在し、 この経路は癌の転移に関与し ている。 本発明のベクターを癌標的ベクターとして開発するためには、 F蛋白質の 開裂部位にこれらの癌転移に関与するプロテアーゼで切断される配列を導入する ことが特に有用である。 このようなプロテアーゼとしては、 例えば MMP-2、 MMP-9 、 uPA、 MMP- 3、 および MT1- MMPが挙げられ、 特に MMP- 2、 MMP-9、 および uPAが挙 げられる。
プロテアーゼ切断配列を F蛋白質に組み込む場合は、 F蛋白質の開裂部位に目的 のプロテアーゼ切断配列を挿入し、 もともとある Trypsin様プロテアーゼによる切 断部位をデジエネレートさせることが好ましい。 このためにはもともとの Trypsin 様プロテアーゼによる切断部位周辺のアミノ酸配列を、 目的のプロテアーゼ切断 配列 （認識配列） に置換すればよい。 改変 F蛋白質は、 細胞で発現したときに目的 のプロテアーゼで切断され、 かつ F蛋白質の細胞膜融合作用を維持されている蛋白 質である。 F蛋白質が開裂して生じる F1断片の N末端付近のアミノ酸は、 細胞膜融 合に重要な機能を有していると考えられる。 従って、 切断が阻害されない限り、 切断後の F1断片の N末端が、 野生型 F蛋白質の F1断片の N末端と同一となるように切 断配列を設計することが好ましい。 また効率的な切断反応を起こすために切断部 位にリンカーを揷入する場合には、 切断後の F1断片の N末端に、 野生型 F1と比べ最 小限のアミノ酸が付加されるように設計することが望ましい。 例えば、 切断後の N 末端には、 野生型 F1に比べ 5ァミノ酸以内、 好ましくは 4ァミノ酸以内、 より好ま しくは 3アミノ酸以内 （例えば 1、 2、 または 3アミノ酸） が付カ卩されるようにする 。 例えば本発明において、 改変 F蛋白質の F1断片の N末端に Met- Thr- Ser (配列番 号： 1 ) を付加しても、 MMPによる切断反応おょぴ切断後の細胞膜融合反応が障害 されないことが判明した。 従って、 切断後の F1の N末端に Met - Thr-Serまたはそ の保存的置換配列、 あるいはそれらの部分配列からなるアミノ酸が付加されるよ うに開裂配列を設計することは好ましい。 保存的置換とは、 アミノ酸の側鎖の化 学的性質が類似したアミノ酸間での置換を言う。 具体的には、 Metに関しては lie または Valへの置換、 Thrに関しては Serまたは Alaへの置換、 Serに関しては Ala、 A sn、 または Thrへの置換が挙げられる。 各位置のアミノ酸の置換は独立に行ってよ い。
具体的には、 好ましい切断配列として、 例えば MMP - 2および- 9の切断配列として は Pro-Leu/Gln-Gly (配列番号： 2 ) を含む配列を挙げることができる。 この配列 は、 基質として利用されている合成基質 （Netzel - Arnett, S. et al. , Anal. Bio chem. 195, 86-92 (1991) ) に共通の配列であり、 この配列が、 改変した F蛋白質 を切断後の F2断片の C末端に来るように F蛋白質を設計する。 このためには、 野生 型 F蛋白質の切断後の F2断片の C末端のアミノ酸を含む配列を、 Pro-Leu/Gln-Glyを 含む配列に置換すればよい。 もともとの F蛋白質の F2断片の C末端の 1または数ァ ミノ酸に相当する配列を適宜欠失させ、 Pro - Leu/Gin- Glyを揷入する （すなわち置 換する） 。 欠失させるアミノ酸は、 例えば揷入するアミノ酸数を同じ （例えば 3ァ ミノ酸） とする力、 0〜10アミノ酸程度の範囲で選択することができる。 プロテア ーゼによる開裂およぴ膜融合の過程が障害されない限り、 Pro- Leu/Gln- Glyの下流 に F1の N末端が直接連結するように F蛋白質を調製することができるが、 センダイ ウィルスの F蛋白質などにお Vヽては、 開裂配列と F1断片は適当なスぺーサーを介し て連結されることが好ましい。 このようなスぺーサーを含む開裂配列としては、 特に好ましくは、 Pro- Leu/Gln- Gly- Met- Thr-Ser (配列番号： 3 ) 、 または Pro-L eu/Gln-Gly-Met-Thr (配列番号： 4 ) を含む配列が挙げられる。 Met、 Thr、 およ ぴ Serは、 他のァミノ酸に保存的置換してもよい。 より好ましくは、 開裂後の F2に おいて C末端となるアミノ酸から N末方向に連続する 1〜： 10残基、 例えば 1、 2、 3 、 4、 5、 または 6残基が、 Pro- Leu/Gln- Gly-Met-Thr- Ser、 または Pro- Leu/Gln-Gl y-Met-Thrカゝらなる配列に置換された改変 F蛋白質を好ましい蛋白質として挙げる ことができる。 例えば、 センダイウィルス F蛋白質を例に挙げれば、 野生型 F蛋白 質において F2断片の C末 4アミノ酸に相当する配列 （株によるが典型的には 113Pr o-Gln-Ser-Arg1161 ) (配列番号： 5 ) を Pro- Leu/Gln_Gly- Met- Thr - Serなどに置 換した F蛋白質を例示することができる。
また、 MMPの切断配列としては他にも、 例えば本明細書に記載した所望の配列を 用いることができる。 各種 MMPの基質特異性に関してはぺプチドライブラリ一を利 用して解析が行われている （Turk, B. E. et ah , Nature Biotech. 19, 661-667 (2001) ) 。 また、 着目している MMP- 2 (Chen, E. I. et al.， J. Biol. Chem. 277 ( 6) 4485-4491 (2002) ) 及ひMP- 9 (Kridel, S. J. et al. , J. Biol. Chem. 276 (8 ) 20572-20578 (2001) ) についても詳細な解析が行われ、 特に MMP-9について、 Pr o-X-X-Hy-(Ser/Thr)の P3から P2， （P3-P2- PI- Ρ - Ρ2'； 切断は PI - Ρ1，間で起こる） までのコンセンサス配列 （Χ=全ての残基， Hy=疎水性残基） が提唱されている。 このコンセンサス配列は、 MMP-2について提唱されているものの一つ （Pro - X- X-Hy ) にも合致するので、 MMP-2及び MMP- 9について特異性を出すためには良いデザィ ンの一つであると考えられる。 この点からも、 上記例示した配列 （Pro- Leu/Gln - G ly_Met - Thr - Serまたは Pro - Leu/Gln- Gly- Met- Thr) は好ましい例として支持される 。 すなわち、 F蛋白質開裂部位は Pro - X-X- Hy- Thr/Ser、 さらに好ましくは Pro- X-X - Hy- Thr/Ser - Thr/Serを含む配列が好ましい （ "Thr/Ser" は Thrまたは Serのどちら かを表す） 。 例えば、 Pro- X-X-Hy- Thr/Serに当てはまらない Pro-Leu- Gly- Leu - Tr p-Alaおよび Pro - Gin- Gly-Leu-Tyr - Alaは好ましくない （図 4 4 )。 Pro - X- X- Hy - Th r/Ser配列に合致するぺプチドを F蛋白質開裂部位に組み込めば、 MMP存在下で高い 浸潤力を示すベクターを製造することができる。
また、 好ましい切断配列としては他に、 プラスミノーゲンァクチべ一ターによ り切断される配列が挙げられる。 具体的には、 uPAおよび tPAの切断配列として Va 1-Gly-Argを含む配列が挙げられる。 この配列が、 改変した F蛋白質を切断後の F2 断片の C末端に来るように F蛋白質を設計する。 このためには、 野生型 F蛋白質の切 断後の F2断片の C末端のアミノ酸を含む配列を、 Val-Gly - Arg (配列番号： 6 ) を 含む配列に置換すればよい。 より好ましくは、 開裂後の F2の C末端となるアミノ酸 から N末方向に連続する 1〜： 10残基、 例えば 1、 2、 3、 4、 5、 または 6残基を Va卜 Gly-Argまたはこれを含む配列に置換された改変 F蛋白質を好ましい蛋白質として 挙げることができる。 例えば、 センダイウィルス F蛋白質を例に挙げれば、 野生型 F蛋白質において F2断片の C末 3アミノ酸に相当する配列 （株によるが典型的には 11 4Gln-Ser-Arg1161 ) (配列番号： 7 ) を Val- Gly-Argに置換した F蛋白質を例示する ことができる。
特定のプロテア ゼ存在下で融合能を発揮する改変 F蛋白質を効率良く同定する ために、 プラスミドベクターを用いたアツセィ系を利用することができる （実施 例 3 1 ) 。 すなわち、 改変 F蛋白質を発現するプラスミドベクターを細胞のトラン スフエクションし、 プロテアーゼ存在下で培養してシンシチウム形成を検出する 。 シンシチウムを形成させるプラスミドにコードされる改変 F蛋白質は、 プロテア ーゼにより開裂し融合能を示すを判断される。 例えば MMPにより開裂する F蛋白質 をアツセィするには、 MMPを発現する HT1080細胞を用いることができる。 あるいは 、 培養系に MMPを添加してもよい。 本発明において開発されたこのアツセィ系を用 いれば、 融合能を持った改変 F蛋白質を容易に取得することが可能である。
改変 F蛋白質をコードするベクターは、 該改変 F蛋白質を開裂するプロテアーゼ の存在に依存して、 該ベクターが導入された細胞と接触する細胞に、 ベクターに 含まれるゲノム R Aを導入することができる。 開裂した F蛋白質の働きにより、 接 触する細胞同士が細胞融合を起こし、 融合した細胞に RNPが拡散する。 すなわち、 本発明のベクターは、 ウィルス粒子は形成しないが、 このように接触する細胞に ベクターが浸潤するために、 限局した領域にベクターを伝達することができる。 プロテアーゼは、 細胞内または細胞外に発現するものであってもよく、 あるいは 外来的に添加されたものであってもよい。
本発明により提供される改変 F蛋白質は、 特定のプロテアーゼに依存的に細胞融 合能を示す能力を有する。 この蛋白質を利用して、 そのプロテアーゼ存在下での み細胞融合を生じさせる或いは特異的に感染するウィルスベクター、 あるいはリ ポソームなどの薬剤 ·遺伝子送達ベクターを作り出すことができる。 例えば、 F, HN遺伝子を搭載した adenovirus vector (Galanis, E. et al. , Hum. Gene Ther. 12, 811-821 (2001) ) の F遺伝子に癌で発現するプロテア一ゼで開裂する改変 F蛋 白質の遺伝子を搭載することにより、 特定のプロテアーゼ存在下で細胞融合を生 じさせるベクターを開発することが可能である。 更には、 例えばレトロウイルス を F, H蛋白でシユードタイプィ匕する場合に （Spiegel, M. et al. , J Virol. 72 ( 6) 5296-5302 (1998) ) 、 その製造過程において、 癌で発現するプロテア一ゼで開 裂する改変 F蛋白質を利用すれば、 癌で特異的に感染する癌細胞標的化ベクターを 開発することが可能かも知れない。 このように、 本発明により提供される改変 F蛋 白質およびこれをコードする核酸は、 本発明のベクター以外にも、 プロテアーゼ ίこ依存する種々のベクターの開発に利用すること できる。
また本発明は、 細胞質ドメィンの欠失により細胞融合能が高められた改変 F蛋白 質を含むパラミクソウィルスベクターを提供する。 この改変 F蛋白質は、 細胞質ド メインに 0個〜 28個、 より好ましくは 1〜27個、 より好ましくは 4〜27個のアミノ酸 を有するように、 細胞質ドメインの一部のアミノ酸を欠失させた F蛋白質である。 細胞質ドメインとは、 膜蛋白質の細胞質側のドメインであり、 F蛋白質においては 膜貫通 (TM)領域の C末側領域である （図 4 2参照） 。 例えば、 細胞質ドメインとし て 6〜20個、 より好ましくは 10〜： 16個、 より好ましくは 13〜： 15個のアミノ酸を有す る F蛋白質は、 野生型 F蛋白質に比べ有意に高い細胞融合能を示す。 従って、 約 14 ァミノ酸の細胞質ドメインを有するように改変された F蛋白質を含むパラミクソゥ ィルスベクターを調製すれば、 野生型 F蛋白質を用いるよりも高い細胞融合能を持 つベクターを得ることができる。 好ましくは、 この欠失 F蛋白質は、 野生型 F蛋白 質の C末端の 10アミノ酸またはそれ以上、 より好ましくは 15アミノ酸またはそれ以 上、 より好ましくは 20アミノ酸またはそれ以上、 より好ましくは 25アミノ酸また はそれ以上、 より好ましくは 28アミノ酸またはそれ以上を欠失している。 最も好 ましい態様では、 細胞質ドメィン欠失型の F蛋白質は野生型 F蛋白質の C末端の約 28 アミノ酸を欠失している。 これらの細胞質ドメイン欠失型の F蛋白質をコードする 遺伝子をゲノムに含むパラミクソウィルスベクターは、 通常のベクターに比べ細 胞融合能が高いことから、 周囲の細胞へより強く浸潤することができる。 この F蛋 白質の開裂部位を本明細書に記載したように改変すれば、 特定のプロテアーゼの 存在下でのみ、 高い浸潤力を発揮するべクターを得ることができる。
さらに本宪明は、 パラミクソウィルスが持つ 2種のスパイク蛋白質の融合蛋白質 に関する。 パラミクソウィルスには細胞融合を機能すると考えられる蛋白質 （こ れを F蛋白質と呼ばれる） と、 細胞への接着に機能すると考えられる蛋白質 （HN または Hなどと呼ばれる） を有している。 本明細書において、 前者を F蛋白質、 後者を H蛋白質を総称する。 この 2つの蛋白質を融合蛋白質として発現させると 、 另 々に発現させる場合に比べ非常に強い融合能を発揮することができる。 この 融合蛋白質は、 互いの細胞質ドメインの部分で両者の蛋白質が結合されている。 具体的には、 融合蛋白質の N末端側に F蛋白質を、 C末端側に HN (または H) 蛋白質 を含んでいる。 両者の蛋白質を融合させる場合、 全長蛋白質同士を融合させても よいが、 F蛋白質の細胞質ドメインの一部または全部を欠失させた蛋白質を H (ま たは H) 蛋白質に融合させてもよい。 この場合、 F蛋白質の TM領域の下流から HN ( または H) 蛋白質までの長さを 5残基以上、 より好ましくは 10残基以上、 より好ま しくは 14残基以上、 より好ましくは 20残基以上とする。 例えば、 F蛋白質の細胞質 ドメインを欠失させた蛋白質を HN (または H) 蛋白質に融合させる場合、 F蛋白質 部分の C末に適当な長さのリンカーべプチドを付加して長さを調節することは好ま しレ、。 具体的には、 14残基の F蛋白質の細胞質ドメインを持つ細胞質ドメイン欠失 型の F蛋白質に、 任意のリンカ一ペプチドを介して HNまたは H) 蛋白質に融合させ た蛋白質を好適に用いることができる。 リンカ一ペプチドの長さは、 例えば約 50 残基とすることができる。 リンカーべプチドのァミノ酸配列に特に制限はないが 、 有意な生理活性を持たないポリペプチドが好ましく、 例えば図 4 3 (配列番号 ： 8 0 ) に例示したようなポリペプチドを用いることができる。
また本発明は、 これらの融合蛋白質をコードする核酸、 およぴ該核酸を搭載す る発現ベクターに関する。 この発現ベクターを導入した細胞は、 強い融合能を示 し周囲の細胞と融合してシンシチウムを形成する。 発現ベクターとしては特に制 限はなく、 プラスミドベクターおよびウィルスベクターなどが例示できる。 DNAベ クタ一の場合は、 例えば CAGプロモーター （ニヮトリ ァクチンプロモーターと CM Vェンハンサ一とのキメラプロモーター） （Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108： 193-199) などの強力なプロモーターを組み合わせることが好ましい。 また、 この 蛋白質を発現するウィルスベクターは、 導入細胞で強い融合を引き起こす。 ウイ ノレスベクターとしては、 レトロウイノレスベタター、 レンチウイノレスベクター、 ァ デノウィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクタ一、 マイナス鎖 RNAウィルスべ クタ一、純へノレぺスウイノレスベクター、 レトロウイノレスベクター、 レンチウイノレ スベクター、 セムリキ森林ウィルスベクター、 シンドビスウィルスベクター、 ヮ クシニァウィルスベクター、 フオウルボックスウィルスベクター、 その他の所望 のウィルスベクターが例示できる。 特にこの蛋白質を発現するパラミクソウィル スベクターは、 様々な組織に対して高い浸潤力を発揮することができる。 特に、 本明細書に記載した F開裂部位を改変した融合蛋白質をコードする、 M遺伝子欠失 型のパラミクソウィルスベクターを用いれば、 特定の組織で強い細胞融合を引き 起こすベタターを製造することが可能である。
これらの組み換えウィルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製するこ とができる。 例えば、 遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスべ クタ一の作製は、 斎藤らの方法おょぴ他 （Miyakeら、 1996、 Proc. Natl. Acad. S ci. USA、 93巻、 1320- 24頁； Kanegaeら、 1996、 Acta Paediatr. JpnN 38巻、 182-1 88頁；鐘ケ江ら、 バイオマニュアルシリーズ 4-遺伝子導入と発現 ·解析法、 1994 、 43 - 58頁、 羊土社；鐘ケ江ら、 1994、 細胞工学、 13巻、 8号、 757- 763頁） に従つ て製造することができる。 また、 例えばレトロウイルスベクター （脇本ら、 1995 、 蛋白質核酸酵素、 40巻、 2508 - 2513頁） 、 およびアデノ随伴ウィルスベクター ( 玉寄ら、 1995、 蛋白質核酸酵素、 40卷、 2532- 2538頁) なども、 公知の方法により 調製することができる。 哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウィルスベクター を製造するための詳細は、 組換えワクシニアウィルスを製造する方法としては、 特表平 6-502069、 特公平 6- 95937、 特公平 6- 71429が知られている。 組換えパピ口 一マウィルスを製造する方法としては特公平 6- 34727、 特表平 6-505626が知られて いる。 組換えアデノ随伴ウィルスを製造する方法としては、 特開平 5 - 308975が知 られている。 組換えアデノウイルスを製造する方法としては、 特表平 6 - 508039が 知られている。
本発明の一態様において提供されるべクターに含まれる RNAゲノムにおいては、 M (マトリックス） 蛋白質をコードする遺伝子 （M遺伝子） が変異または欠損して いる。 本発明において、 F蛋白貧の開裂部位を他のプロテアーゼで切断される配列' に改変し、 さらに M遺伝子を変異または欠失させて粒子形成能を抑制することによ つて、 ウィルス粒子を放出せず、 特定のプロテアーゼを発現する細胞集団内での みべクターを浸潤させる全く新し 、性質を持つたべクタ一が開発された。 M遺伝子 の変異は、 宿主内環境における粒子形成活性を消失または有意に低下させる変異 である。 このような変異は、 この M蛋白質を発現する細胞において、 該蛋白質の細 胞表面の凝集が低下することにより同定することができる （実施例参照） 。
本発明により、 2次放出粒子、 即ち VLP放出の抑制を目的とした改変を行う場合 、 M蛋白を欠失させることが最も効果的であることが実証された。 このことは、 ビ リオン形成における M蛋白の役割に関するセンダイウィルス （SeV) や他のマイナ ス鎖 RNAウィルスにおける報告によっても支持される。 例えば、 vesicular stomat itis virus (VSV) では M蛋白の強発現のみでウィルス様粒子 （VLP: virus like p article) の発芽が観察されており （Justice, P. A. et al.， J. Virol. 69； 315 6-3160 (1995) ) 、 また Parainfluenza virusの場合も M蛋白のみの強発現で VLPが 生じることが報告されている (Coronel, E. C. et al.， J. Virol. 73； 7035-7038
(1999) ) 。 このような M蛋白単独での VLP形成に関しては、 全てのマイナス鎖 RNA ウィルスで観察されているわけではないが、 M蛋白がビリオン形成の cor eになって いることは、 マイナス鎖 RNAウィルスで共通していると認識することができる （Ga roff, H. et al. , Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62； 1171-1190 (1998) ) 。
ビリオン形成に対する M蛋白の具体的な役割に関して主に以下のようにまとめる ことができる。 ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト （Lipid r afts) と呼ばれている場 (Simons, K. and Ikonen, E. Nature 387； 569-572 (19 97) ) であり、 元々は Triton X- 100のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質 画分として同定された （Brown, D. A. and Rose, J. K. Cell 68； 533-544 (1992) ) 。 インフルエンザウイルス （Ali， A. et al. , J. Virol. 74； 8709-8719 (2000 )) 、 麻疹ウィルス （Measles virus; MeV： Manie, S. N. et al. , J. Virol. 74； 305-311 (2000) ) 及ぴ SeV (Ali， A. and Nayak, D. P. Virology ' 276； 289-303 (2 000) ) 等でリピッドラフト （Lipid rafts) でのビリオン形成が証明されており、 そこで M蛋白はエンベロープ蛋白 （spike蛋白とも表記される） や ribonucleoprote in (RNP) を濃縮しビリオン形成を促進する、 即ちウィルスアセンブリと出芽 （bu dding) の駆動力となっていると考えられる （Cathomen, T. et al. , ΕΜΒΟ J. 17； 3899-3908 (1998) , Mebatsion, Τ. et al. , J. Virol. 73； 242-250 (1999) ) 。 実際に、 M蛋白は spike蛋白の cytoplasmic tailと結合することが、 インフルェン ザウィルス (Zhang, J. et al. , J. Virol. 74； 4634-4644 (2000) ) 及ぴ SeV (Sa nderson, C M. et al. , J. Virol. 67； 651-663 (1993) ) 等で示されており、 ま た RNPとの結合もインフルエンザウイルス （Ruigrok, R. W. et ah , Virology 173 ； 311-316 (1989) ) や、 ノ ラインフルエンザウイルス及ぴ SeV (Coronel, E. C. et al. , J. Virol. 75； 1117-1123 (2001) ) 等で示されている。 更に、 M蛋白自身の オリゴマー开成への関与が SeV (Heggeness, M. H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 79； 6232-6236 (1982)及ぴ水疱性口内炎ウィルス （Vesicular Stomatitis Vir us; VSV： Gaudin, Y. et al. , Virology 206； 28—37 (1995) , Gaudin, Y. et al. ， J. Mol. Biol. 274； 816 - 825 (1997) ) 等で報告され、 これら多くのウィルスコ ンポーネント及ぴ脂質との結合能がウィルスアセンブリと出芽の駆動力としての 役割を担わせていると考えることができる。
また、 エンベロープ蛋白 （spike蛋白） に関しても改変により VLP放出抑制に繋 がる可能性も既に幾つカゝ示唆されている。 ビリオン形成が実際に減少した具体的 な報告として以下の実験例がある。 狂犬病ウィルス （Rabies virus; RV) の場合 、 G蛋白欠失型において VLP形成が 1/30に減少し （Mebatsion, T. et al.， Cell 84 ； 941-951 (1996) ) 、 M蛋白欠失型においては 1/500， 000以下に減少したと報告さ れている (Mebatsion, T. et al.， J. Virol. 73； 242-250 (1999) ) 。 また、 麻 疹ウィルス （MeV) の場合、 M蛋白欠失型において cell- to- cellの融合が亢進し （C athomen, T. et al.， EMBO J. 17; 3899-3908 (1998) ) 、 これはビリオン形成が 抑制された為であると考えることができる （Li, Z. et al. , J. Virol. 72 (5) , 3 789-3795 (1998) ) 。 また、 同様の融合宂進カ^或いは H蛋白の cytoplasmic tail ( 細胞質側のテール） の変異によっても生じている （Cathomen, T. et al. , J. Vir ol. 72； 1224-1234 (1998) ) 。 従って、 Fおよび/または HN蛋白の cytoplasmic tai 1のみを欠失させる変異を導入することにより、 粒子形成を抑制することも考えら れる。 但し、 特に SeVにおいては F欠失型 (WO0O/70O70) 或いは HN欠失型 (Stricke r， R. and Roux, L. , J. Gen. Virol. 72； 1703-1707 (1991) ) において多くの VL Pが存在することが報告されており、 これらのスパイク蛋白質の改変による効果は 限定されることが予想される。 さらに SeVにおいては以下の点も明らかになつてい る。 SeVの F及ぴ HNが分泌経路に載っている間 （即ちゴルジ体等に存在している間 ) 、 それぞれ （F及ひ ΉΝ) の Cytoplasmic tailが M蛋白と結合していることが示さ れている （Sanderson, C M. et al. , J. Virol. 67； 651-663 (1993) , Sanderson , C M. et al. , J. Virol. 68; 69-76 (1994) ) 。 即ち、 ビリオン形成の場である 細胞膜上のリピッドラフト （Lipid Rafts) へ M蛋白が効率的に運搬されるために は、 F及ひ ΉΝの Cytoplasmic tailとの結合が重要であり、 M蛋白は細胞質に存在し ながら F及ひ ¾ と結合することで、 F及び HNの分泌経路に乗った形で細胞膜へ運搬 されていると予想される。 このように、 M蛋白質はウィルス粒子の形成に本質的な 役割を果たしており、 M蛋白質の細胞膜上の凝集を失わせるような変異 M蛋白質遺 伝子を用いることにより、 粒子形成能を持たないベタターを作り出すことが可能 となる。
細胞における M蛋白質の局在の検出は、 細胞分画による方法、 および免疫染色に より M蛋白質の局在を直接検出する方法などで実施することができる。 免疫染色で は、 例えば蛍光標識された抗体を用いて M蛋白質を染色し、 共焦点レーザー顕微鏡 下で観察することができる。 また、 細胞を溶解後、 公知の細胞分画法により細胞 画分を得て、 M蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降またはウェスタンプロッティ ング等により M蛋白質が含まれる画分を同定することにより局在を調べることがで きる。 ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト （Lipid rafts) と 呼ばれている場であり、 Triton X- 100のような非ィオン性界面活性剤に不溶性の 脂質画分である。 M蛋白質は spike蛋白、 RNP及び M蛋白自身更には脂質との結合能 により、 このリピッドラフトでウィルスコンポーネントを凝集すると考えられて いることから、 リピッドラフト分画後、 電気泳動等で検出される M蛋白は凝集した M蛋白質を反映していると捉えることができる。 すなわち、 検出される M蛋白質量 が低下していれば、 細胞表面の M蛋白質の凝集が低下していると判断される。 一方 、 本発明者らが利用した細胞免疫染色により細胞内局在を検出する方法では、 細 胞膜上の M蛋白の凝集を直接観察することが可能である。 この場合、 細胞免疫染色 に利用可能な抗 M抗体を利用する。 この方法で検出した場合、 M蛋白質が凝集して いれば、 細胞膜近傍に強い濃縮像が観察され、 M蛋白の凝集がなければ濃縮像はな く細胞膜の輪郭が明確でなくなり、 細胞質全体が薄く染色される。 このように濃 縮像が少ない或いは濃縮像がなく、 細胞膜の輪郭がぼやけて観察され、 細胞質全 体が薄く染色された場合に、 細胞表面の M蛋白質の凝集が低下していると判断され る。
野生型 M蛋白質に比べ、 細胞表面における凝集が有意に低下ずる変異 M蛋白質は 、 粒子形成能が有意に低下していると判断される。 ウィルスの粒子形成能の低下 は、 例えば統計学的に有意 （例えば有意水準 5%またはそれ以下の %値） に低下して いる。 統計学的な検定は、 例えばスチューデントの t検定またはマンホイット-一 U検定などにより行うことができる。 変異 M遺伝子を持つウィルスベクターは、 宿 主内環境における粒子形成能が好ましくは 1/5以下、 より好ましくは 1/10以下、 よ り好ましくは 1/30以下、 より好ましくは 1/50以下、 より好ましくは 1/100以下、 よ り好ましくは 1/300以下、 より好ましくは 1/500以下に低下している。 本発明のベ クタ一は、 最も好ましくは宿主内環境におけるウィルス粒子の産生能が実質的に 喪失している。 実質的に喪失するとは、 宿主内環境におけるウィルス粒子の産生 が検出されないことを言う。 このような場合、 ウィルス粒子は 103/ml以下、 好ま しくは 102/ml 下、 より好ましくは lOVml以下である。 '
ウィルス粒子の存在は、 電子顕微鏡等で直接確認することができる。 あるいは 、 ウィルスに含まれる核酸または蛋白質を指標に検出および定量することが可能 である。 例えば、 ウィルス粒子中に含まれるゲノム核酸を PCR等の一般的な核酸検 出法で検出および定量してもよい。 あるいは、 外来遺伝子を持つウィルス粒子は 、 これを細胞に感染させ該遺伝子の発現を検出することにより定量することがで きる。 感染性を持たないウィルス粒子は、 トランスフエクシヨン試薬と組み合わ せて細胞に導入し、 遺伝子発現を検出することにより定量することができる。 本 発明においてウィルス粒子は、 感染能を持たない粒子も含まれ、 例えば VLPを含む また、 ウィルスの力価は、 例えば CIU (Cell-Infected Unit) 測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる （W000/70070; Kato, A . et al. , 1996， Genes Cells 1： 569-579； Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y. , Hemag gulutinating virus of Japan— liposome - mediated gene delivery to vascular c ells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press : pp. 295-306, 1999) 。 また、 実施例に記載 したように、 GFPなどのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、 マーカー の指標に直接的に感染細胞を力ゥントすることにより力価を定量することができ る （例えば GFP - cmとして） 。 このようにして測定した力価は、 CIUと同等に扱う ことができる （WO0O/70070) 。 例えばウィルス粒子が含まれる可能性のある試料 を細胞にトランスフエクシヨンしても検出可能な感染価を示さないことにより、 ウィルス粒子の生産能の喪失を確認することができる。 感染能を持たないウィル ス粒子 （VLP等） の検出は、 例えばリポフエクシヨン試薬を用いたトランスフエク シヨンにより行うことができる。 具体的には、 例えば DOSPER Liposomal Transfec t ion Reagent (Roche, Basel, Switzerland; Cat No. 1811169) を用いて行うこ とができる。 ウィルス粒子を含むあるいは含まない溶液 100 1に DOSPER 12. 5 μ 1 を混合し、 室温で 10分放置後、 6 wellプレートにコンフルェントに培養した細胞 に 15分毎に振盪しながらトランスフエクションする。 2日後に感染細胞の有無を検 出することで VLPの検出が可能である。
宿主内環境とは、 対象とするベクターが由来するパラミクソウィルスの野生型 が自然界において通常増殖する宿主内の環境またはそれと同等のウィルス増殖を もたらす環境を言う。 宿主内環境は例えば該ウィルスの至適增殖条件であってよ い。 哺乱動物を宿主とするパラミクソウィルスであれば、 哺乳動物生体内あるい はそれと同等の環境を言う。 その温度は、 哺乳動物体内に相当する約 37〜38°C ( 例えば 37°C) である。 インビトロであれば、 通常の細胞培養条件、 具体的には血 清含有または非含有培地中 （pH 6. 5〜7. 5) 、 37°C、 5%C02、 湿環境下の培養環境 が挙げられる。
環境条件による変異 M蛋白質の活性の違いは、 M蛋白質の温度感受性変異などの 条件的変異において意味を持っている。 条件的変異とは、 宿主内環境では機能欠 失型 (loss of function) の変異形質を示すが、 ある環境において活性を示す変 異を言う。 例えば 37°Cでは機能がほとんどまたは全く失われるが、 低温条件にお いては機能が回復する温度感受性変異 M蛋白質をコードする遺伝子を好適に用いる ことができる。 温度感受性変異とは、 低温 （例えば 32°C) に比べ、 高温 （例えば 3 7°C) において有意に活性が低下する変異を言う。 本発明者らは、 M蛋白質の温度 感受性変異体を用いて、 宿主内環境に相当する 37°Cにおいて粒子形成能が劇的に 低下したウィルス粒子を製造することに成功した。 この変異 M蛋白質は、 低温条件 下 （例えば 32°C) では細胞表面への凝集を示し、 ウィルス粒子を形成させるが、 通常の宿主体内の温度 (37°C) では凝集性が失われウィルス粒子を形成すること ができない。 このような温度感受性変異 M蛋白質をコードする核酸をゲノムに持つ ベクターは、 本発明のベクターとして好適である。 条件的変異 M蛋白質をコードす るウィルスベクターは、 M蛋白質が機能できる条件、 すなわち許容条件でベクター を複製させることにより M蛋白質が機能してウイルス粒子が形成される。 このよう にして製造したウィルス粒子は、 通'常環境下で感染させると M蛋白質が機能できず に粒子を形成しない。
M遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、 例えばセン ダイウィルスの M蛋白質の G69、 T116、 および A183からなる群より選択される少な くとも 1つ、 好ましくは任意に選択される 2つ、 さらに好ましくは 3つすベての ァミノ酸部位、 あるいは他の (-)鎖 RNAゥィルス M蛋白質のそれらと相同な部位に変 異を含むものを好適に用いることができる。 ここで G69とは M蛋白質の 69番目のァ ミノ酸 Gly、 T116とは M蛋白質の 116番目のアミノ酸 Thr、 A183とは M蛋白質の 183番 目のアミノ酸 Alaを指す。
M蛋白質をコードする遺伝子 （睡伝子） は、 （-)鎖腿ウィルスで広く保存され ており、 ウィルスのヌクレオ力プシッドとエンベロープの両者に相互作用する機 能を有することが知られている （Garoff, H. et al. , Microbiol. Mol. Biol. Re v. 62 : 117-190 (1998) ) 。 また、 SeV M蛋白質において amphiphilic α-helixと予 想されている 104-119 (104- KACTDLRITVRRTVRA- 119 配列番号： 4 5 ) は粒子形成 に重要な領域として同定されている (Genevieve Mottet et al. , J. Gen. Virol. 80:2977-2986 (1999)) 力 当該領域は (-)鎖 RNAウィルス間で良く保存されてい る。 M蛋白質のアミノ酸配列は (-)鎖 RNAウィルスで類似しており、 特にパラミクソ ウィルス亜科においては既知の M蛋白質は共通して全長約 330〜380ァミノ酸からな る塩基性蛋白質であり、 全領域にわたって類似性があるが、 特に C端側半分での類 似性が高い （Gould, A. R. Virus Res. 43: 17-31 (1996)、 Harcourt, B. H. et al .， Virology 271:334-349 (2000) ) 。 従って、 例えば SeV M蛋白質の G69、 T116、 及び A183と相同なアミノ酸は容易に同定することが可能である。
SeV M蛋白質の G69、 Π16、 及び A183と対応する他の（一）鎖腿ウィルス Μ蛋白質 の相同な部位のアミノ酸は、 当業者であれば、 例えば BLASTなどのアミノ酸配列の ホモロジ一検索プログラム （ァライメント作成機能を持つもの） または CLUSTAL W などのァライメント作成プログラムを用いて SeV M蛋白質のアミノ酸と整列化する ことにより同定することができる。 例えば SeV M蛋白質の G69に相当する各 M蛋白質 の相同部位としては、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV-1) (括弧は略称） で あれば G69、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV-3) であれば G73、 phocine dist emper virus (PDV)ぉょぴ canine distemper virus (CDV)であれば G70、 dolphin m olbillivirus ' (丽)であれば G71、 peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、 m easles virus (MV)、 および rinderpest virus (RPV)であれば G70、 Hendra virus (Hendra)および Nipah virus (Nipah)であれば G81、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)であれば G70、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)およぴ human p arainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)であれば E47、 mumps virus (Mumps)であれば E7 2が挙げられる （文字と番号はアミノ酸とその位置を表す） 。 また、 SeV M蛋白質 の T116に相当する各 M蛋白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であれば T116、 human parainfluenza virus - 3 (HPIV- 3)でれば T120、 pho cine distemper virus (PDV)および canine distemper virus (CDV)であれば T104 、 dolphin molbillivirus (DMV)であれは T105、 peste - des-petits- ruminants vir us (PDPR)、 measles virus (MV)およぴ rinderpest virus (RPV)であれば T104、 He ndra virus (Hendra)およ ^Nipah virus (Nipah)であれば T120、 human parainflu enza virus- 2 (HPIV-2)およぴ simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば T117 、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)お び human parainfluenza virus- 4 b (HPIV- 4b)であれば T121、 mumps virus (Mumps)であれば Tl 19、 Newcastle disea se virus (NDV)であれば S120が挙げられる。 SeV M蛋白質の A183に相当する各 M蛋 白質の相同部位としては、 human parainfluenza virus-1 (HPIV- 1)であれば A183 、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)であれな F187、 phocine distemper vir us (PDV)およぴ canine distemper virus (CDV)であれば Y171、 dolphin molbilliv irus (DMV)であれば Y172、 peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)および rinderpest virus (RPV)であれは Y171、 Hendra virus (Hendra) およ O^Nipah virus (Nipah)であれば Y187、 human parainfluenza virus - 2 (HPIV- 2)であれは Y18'4、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)であれば' F184、 human par ainfluenza virus - 4a (HPIV-4a)およぴ human parainfluenza virus - 4b (HPIV- 4b) であれは F188、 mumps virus (Mumps)であれば F186、 Newcastle disease virus (N DV)であれば Y187が挙げられる。 ここに挙げたウィルスにおいて、 それぞれの M蛋 白質に上記の 3つの部位のいずれか、 好ましくは任意の 2部位の組み合わせ、 さら に好ましくは 3つの部位全てのァミノ酸が他のァミノ酸に置換された変異 M蛋白質 をコードするゲノムを有するウィルスは、 本発明において好適である。
アミノ酸変異は、 所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、 好ましくは、 側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。 例えばアミノ酸は、 塩基性 アミノ酸 （例えばリジン、 アルギニン、 ヒスチジン） 、 酸性アミノ酸 （例えばァ スパラギン酸、 グルタミン酸） 、 非荷電極性アミノ酸 （例えばグリシン、 ァスパ ラギン、 グルタミン、 セリン、 スレオニン、 チロシン、 システィン） 、 非極性ァ ミノ酸 （例えばァラニン、 パリン、 ロイシン、 イソロイシン、 プロリン、 フエ二 ルァラニン、 メチォニン、 トリプトファン） 、 ]3分岐アミノ酸 （例えばスレオ- ン、 パリン、 イソロイシン） 、 および芳香族アミノ酸 （例えばチロシン、 フエ二 ルァラユン、 トリプトファン、 ヒスチジン） などのグループに分類することがで きるが、 あるアミノ酸について、 そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外 のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。 具体的には、 塩基性アミノ酸であ れは、 酸性または中性ァミノ酸への置換、 極性ァミノ酸であれは非極性ァミノ酸 への置換、 20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸 であれば、 その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、 逆にその平均分子量よ り小さいアミノ酸であれば、 それより大きいァミノ酸への置換などが挙げられる が、 それに限定されない。 例えばセンダイウィルス M蛋白質における G69E、 T116A 、 および A183Sからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な位置に変異 を含む他のパラミクソウィルスの M蛋白質を用いることができる。 ここで G69Eとは 、 M蛋白質の 69番目のアミノ酸 Glyが Gluに置換された変異、 Π16Αとは、 M蛋白質の 116番目のアミノ酸 Thr力 laに置換された変異、 A183Sとは； M蛋白質の 183番目の アミノ酸 Ala力 erに置換された変異を言う。 すなわち、 センダイウィルス M蛋白 質の G69、 T116、 および A183あるいは他のウィルス Μ蛋白質の相同部位を、 それぞ れ Glu (E)、 Ala (A) , および Ser (S) へ置換することができる。 これらの変異は 組み合わせて有していることが好ましく、 特に上記 3変異の全てを保持している ことがより好ましい。 M遺伝子への変異の導入は、 公知の変異導入方法に従って実 施することができる。 例えば実施例に記載のように目的の変異を入れたオリゴヌ クレオチドを用いて導入することが可能である。
また、 例えば麻疹ウィルスにおいては、 M蛋白のモノクローナル抗体に対するェ ピトープが変化している温度感受性株の P253- 505 (Morikawa, Y. et al. , Kitasa to Arch. Exp. Med.，64; 15 - 30 (1991) ) の M遺伝子配列を用いてもよい。 また、 S eV M蛋白質の 116番目の Thrに対応する麻疹ウィルス M蛋白質の 104番目の Thr、 また はムンプスウィルスの M蛋白質の 119番目の Thrを他のアミノ酸 （例えば Ala) に置 換してもよい。
本発明のベクターは、 さらに好ましい態様においては M遺伝子を欠損している。 M遺伝子の欠損とは、 M¾伝子の機能が失われていることを言い、 機能欠失型の変 異を有する M遺伝子を持つ場合および M遺伝子を欠失する場合を含む。 M遺伝子の機 能欠失型変異は、 例えば M遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、 他の配列を 挿入することにより作製することができる。 例えば、 M蛋白質コード配列の途中に 停止コドンを設計することができる （TO00/09700) 。 本努明のベクターは、 最も 好ましくは M蛋白質のコード配列を完全に欠失している。 M蛋白質の 0RFを欠失した ベクターは、 条件的変異 M蛋白質をコードするベクターとは違い、 任意の条件にお いてウィルス粒子を形成する能力を失っている。
本発明のベタターを製造するには、 パラミクソウィルスのゲノム RNAを含む R P の再構成に必要なウィルス蛋白質、 すなわち N、 P、 および L蛋白質の存在下、 パラ ミクソウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写させる。 転写によりネガティ プ鎖ゲノム (すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖) を生成させてもよ く、 あるいはポジティブ鎖 （ウィルス蛋白質をコードするセンス鎖） を生成させ ても、 ウィルス RNPを再構成することができる。 ベクターの再構成効率を高めるに は、 好ましくはポジティブ鎖を生成させる。 RNA末端は、 天然のウィルスゲノムと 同様に 3'リーダー配列と 5' トレイラ一配列の末端をなるベく正確に反映させるこ とが好ましい。 転写産物の 5'端を正確に制御するためには、 例えば転写開始部位 として T7 R Aポリメラーゼ認識配列を利用し、 該 R Aポリメラーゼを細胞内で発現 させればよい。 転写産物の 3'端を制御するには、 例えば転写産物の 3'端に自己切 断型リボザィムをコードさせておき、 このリボザィムにより正確に 3'が切り出さ れるようにすることができる （Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813— 2820, 1997、 Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16： 578-587及び Yu， D. et al. ， 1997, Genes Cells 2： 457-466)。
外来遺伝子を容易に揷入できるようにするために、 ゲノム RNAをコードする cDNA 中に外来遺伝子を揷入するためのクローニングサイトを設計することができる。 その部位は、 例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の位置であってよく、 具 体的には 3，リーダー領域と 3'に最も近いウィルス蛋白質 0RFとの間、 各ウィルス蛋 白質 0RFの間、 および/または 5'に最も近いウィルス蛋白質 0RFと 5' トレイラ一領域 の間に揷入することができる。 M遺伝子を欠失するゲノムでは、 その欠失領域にク ローニングサイトを設計することができる。 クローニングサイトは、 例えば制限 酵素の認識配列とすることができる。 クローニングサイトは、 複数の制限酵素認 識配列を有する、 いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。 複数の外来 遺伝子をゲノム中の別々の位置に揷入できるように、 クローニングサイトは、 ゲ ノム中の複数箇所に存在してもよレ、。
例えば粒子形成能を持たない組み換えウィルス匿は、 Hasan, M. K. et al. , J . Gen. Virol. 78： 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al.， 1997, EMBO J. 16： 57 8-587及ぴ Yu, D. et al. , 1997, Genes Cells 2： 457-466の記載等に準じて、 次のようにして構築することができる。 '
外来遺伝子を組み込む場合は、 まず目的の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA 試料を用意する。 DNA試料は、 25ng/ /_i l以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミ ドと確認できることが好ましい。 以下、 Notl部位を利用してウィルスゲノム RNAを コードする DNAに外来遺伝子を揷入する場合を例にとって説明する。 目的とする cD NA塩基配列の中に Notl認識部位が含まれる場合は、 部位特異的変異挿入法などを 用いて、 コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Notl 部位を予め除去しておくことが好ましい。 この試料から目的の遺伝子断片を PCRに より増幅し回収する。 2つのプライマーの 5'部分に Notl部位を付加しておくことに より、 増幅された断片の両端を Notl部位とする。 ウィルスゲノム上に挿入された 後の外来遺伝子の 0RFとその両側のウィルス遺伝子の 0RFとの間に E- 1 - S配列が配置 されるように、 プライマー中に E-I-S配列またはその部分を含めるようにする。 例えば、 フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側 に任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由 来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましくは ACTT) を選択し、 その 3'側に Notl 認識部位 gcggccgcを付加し、 さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩 基または 9に 6の倍数を加えた数の塩基を付カ卩し、 さらにその 3'側に所望の cDNA の開始コドン ATCからこれを含めて 0RFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とす る。 最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフ ォヮード側合成ォリゴ DNAの 3'の末端とすることが好まし 、。
リパース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド （好ましくは GC Gおよび GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、 更に好ましくは A CTT) を選択し、 その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付カ卩し、 さらにその 3'側に長 さを調節するための挿入断片のオリゴ DNAを付加する。 このオリゴ T)NAの長さは、 E - I-S配列を含む最終的な PCR増幅産物の Notl断片の鎖長が 6の倍数になるように 塩基数を設計する （いわゆる 「6のルーノレ (rule of six) J ； Kolakofski, D. e t al.， J. Virol. 72 :891—899， 1998； Calain, P. and Roux, L.， J. Virol. 67： 4822-4830, 1993； Calain, P. and Roux, L.， J. Virol. 67： 4822-4830, 1993) 。 このプライマーに E- 1- S配列を付加する場合には、 揷入断片ののオリゴ DNAの 3' 側にセンダイゥィルスの S配列の相捕鎖配列、 好ましくは 5， -CTTTCACCCT-3' (配列 番号： 8 ) 、 I配列の相補鎖配列、 好ましくは 5' - MG - 3'、 E配列の相補鎖配列、 好 ましくは 5' - TTTTTCTTACTACGG - 3' (配列番号： 9 ) 、 さらにその 3，側に所望の cDNA 配列の終始コドンから逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基力 または C になるように長さを選択して配列を付加し、 リバース側合成 DNAの 3'の末端とする
PCRは、 Taqポリメラーゼまたはその他の DNAポリメラーゼを用いる通常の方法を 用いることができる。 増幅した目的断片は Notlで消化した後、 プラスミドベクタ — pBluescriptの Not I部位に揷入する。 得られた PCR産物の塩基配列をシークェン サ一で確認し、 正しい配列のプラスミドを選択する。 このプラスミドから挿入断 片を Notlで切り出し、 ゲノム cDNAを含むプラスミドの Notl部位にクローニングす る。 またプラスミドベクターを介さずに Notl部位に直接揷入し、 組み換えセンダ ィウィルス cDNAを得ることも可能である。
例えば、 組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、 文献記載の方法に準 じて構築することができる （Yu， D. et al.， Genes Cells 2 : 457-466, 1997； Ha san, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813 - 2820， 1997) 。 例えば、 Notl制限 部位を有する 18bpのスぺーサー配列 （5' - (G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3' ) (配列番 号： 1 0 ) を、 クローニングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (pSeV(+) ) のリ 一ダー配列と N蛋白質の 0RFとの間に挿入し、 デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム 鎖 （antigenomic strand) 由来の自己開裂リポザィム部位を含むプラスミド pSeVl 8+b (+)を得る （Hasan, M. K. et al. , 1997, J. General Virology 78： 2813 - 2820 ) 。
さらに、 例えば M遺伝子を欠損させたり、 あるいは温度感受性変異を導入する場 合、 ゲノム RNAをコードする cDNAを制限酵素で消化して、 M遺伝子を舍むフラグメ ントを回収し、 適当なプラスミドにクローニングする。 M遺伝子の変異または M遺 伝子欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。 変異導入には、 例えば QuikChan ge™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) などを利用し て Kitに記載の方法に従って実施することができる。 M遺伝子の欠損または欠失の ためには、 例えば PCR-ライゲーシヨン方法の組み合わせで行い、 M遺伝子の 0RF全 部または一部を欠失させ、 適宜適当なスぺーサー配列で連結することができる。 M 遺伝子の変異体または欠失体が得られたら、 これを含むフラグメントを回収し、 もとの全長ゲノム cDNAの M遺伝子と置換することにより、 M遺伝子に変異を持つゥ ィルスゲノム cDNAを調製することができる。 同様の方法で、 例えば Fおよび/また は H遺伝子等に変異を導入することができる。
ゲノム RNAをコードする DNAを、 上記のウィルス蛋白質存在下で細胞内で転写さ せることにより、 本発明のベクターを再構成することができる。 本発明は、 本発 明のベクターの製造のための、 本発明のベクターのウィルスゲノム RNAをコードす る!)皿を提供する。 また本発明は、 本発明のベクターの製造に適用するための、 該 ベクターのゲノム RNAをコードする DNAの使用に関する。 マイナス鎖 RNAウィルスの ゲノム cDNAからのウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる （W 097/16539； TO97/16538; Durbin, A. P. et al. , 1997, Virology 235： 323—332;
Whelan, S. P. et al. , 1995, Pro Natl. Acad. Sci. USA 92： 8388-8392; Sc hnell. M. J. et al.， 1994, EMBO J. 13： 4195-4203； Radecke, F. et al. , 199 5, EMBO J. 14： 5773-5784； La son, N. D. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. US A 92： 4477-4481； Garcin, D. et al. , 1995， EMBO J. 14： 6087 - 6094; Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1： 569-579； Baron, M. D. and Barrett, T. , 1997 ， J. Virol. 71 : 1265 - 1271 ; Bridgen, A. and Elliott, R. M. , 1996, Proc. Na tl. Acad. Sci. USA 93 : 15400-15404) 。 これらの方法により、 パラインフルェ ンザ、 水疱性口内炎ウィルス、 狂犬病ウィルス、 麻疹ウィルス、 リンダ一ペスト ウィルス、 センダイウィルスなど ¾r含むマイナス鎖 RNAウィルスまたはウィルス成 分となる R Pを DNAから再構成させることができる。 これらの方法に準じて、 本発 明のべクターを再構成させることができる。
具体的な手順は、 （a ) 上記パラミクソウィルスゲノム RNA (ネガティブ鎖 RNA ) またはその相捕鎮 （ポジティブ鎖） をコードする cDNAを、 N、 P、 および L蛋白質 を発現する細胞で転写させる工程、 ( b ) 該細胞またはその培養上清から該ゲノ ム RNAを含む複合体を回収する工程、 により製造することができる。 転写されたゲ ノム RNAは N、 L、 および P蛋白質の存在下で複製され RNP複合体を形成する。 工程
( a ) を、 該ゲノムがコードする改変 F蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在下 で実施することにより、 形成された RNPが該細胞に接触する細胞へ伝達され、 感染 が広がりベクターが増幅する。 この方法により、 機能的な M蛋白質が存在しなくて も、 RNPの形態で本発明のベクターを製造することができる。
DNAからの最初のゲノム RNAの転写に必要な T7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、 こ れを発現するプラスミドゃウィルスベクターの導入によって実施することができ るし、 または、 例えば細胞の染色体にこの遺伝子の発現を誘導できるように組み 込んでおき、 ウィルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもでき る。 またゲノム RNA、 およびべクタ一再構成に必要なウィルス蛋白質は、 例えばこ れらを発現するプラスミドの導入によって供給する。 これらのウィルス蛋白質の 供給において、 野生型またはある種の変異パラミクソウィルスなどのヘルパーゥ ィルスを用いることもできるが、 これらのウィルスの混入を招くため好ましくな い。
ゲノム RNAを発現する DNAを細胞内に導入する方法には、 例えば次のような方法 、 ①目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、 ②目的の細胞による取 りこみに適し、 カゝっ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方 法、 ③目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスに よつて瞬間的に開ける方法などがある。
②としては、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用 " きる。 例えば、 D0TMA ( Roche) 、 Superfect (QIAGEN #301305) 、 D0TAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169 ) などが挙げられる。 ①としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフエ クション法が挙げられ、 この方法によって細胞内に入った DNAは貧食小胞に取り込 まれるが、 核内にも十分な量の DNAが入ることが知られている （Graham, F. し an d Van. Der Eb， J. , 1973, Virology 52: 456； Wigler, M. and Silverstein, S.，
1977, Cell 11： 223) 。 Chenおよび Okayamaはトランスファ 技術の最適化を検 討し、 1) 細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% C02、 35°C、 15〜 24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、 3) 沈殿混液中の DNA濃度 が 20〜30 ;i g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している （Chen, C. and Oka yama, H. , 1987, Mol. Cell. Biol. 7： 2745) 。 ②の方法は、 一過的なトランス フエクシヨンに適している。 古くは DEAE-デキストラン （Sigma #D- 9885 M. W. 5 X 105 ) 混液を所望の DNA濃度比で調製し、 トランスフエクシヨンを行う方法が知ら れている。 複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、 効果を高 めるためにクロ口キンを加えることもできる （Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80： 3015) 。 ③の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、 細胞選 択性がな 、という点で①ゃ②の方法に比べて汎用性が高い。 効率はパルス電流の 持続時間、 ノ、。ルスの形、 電界 （電極間のギャップ、 電圧） の強さ、 バッファーの 導電率、 DNA濃度、 細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、 3つのカテゴリーの中で②の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多 数の検体を検討することができるので、 ベクター再構成のための DNAの細胞への導 入には、 トランスフエクシヨン試薬が適している。 好適には Superfect Transfec tion Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305) 、 または DOSPER Liposomal Transfecti on Reagent (Roche, Cat No. 1811169) が用いられるが、 これらに制限されない cDNAからのウイルスべクタ一の再構成は具体的には例えば次のようにして行う ことができる。 ' '
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100腿ペトリ皿等で、. 10%ゥシ 胎児血清 (FCS)および抗生物質 （100 units/ml ペニシリン Gおよび 100 μ g/ml スト レプトマイシン） を含む最少必須培地 （MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC- MK2 をほぼ 100%コンフルェントになるまで培養し、 例えば 1〃 g/ml psoralen (ソヲ レン） 存在下 UV照射処理を 20分処理で不活化した、 T7 RNAポリメラーゼを発現す る組換えワクシニアウィルス VTF7-3 (Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83： 8122—8126, 1986、 Kato, A. et al. , Genes Cells 1： 569-579, 19 96) を 2 PFU/細胞で感染させる。 ソラレンの添加量およ mJV照射時間は適宜調整 することができる。 感染 1時間後、 2〜60 μ ^ より好ましくは 3〜20 gの組換えセ ンダイウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、 ウィルス RNPの生成に必須なトラ ンスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド （0. 5〜24 §の &£ -1^、 0. 2 5〜12 μ gの pGEM— P、 およぴ 0. 5〜24 gの pGEM— L) (Kato, A. et al.， Genes Cells
1 : 569-579, 1996) と共に Superfect (QIAGEN社） を用いたリポフエクシヨン法 等によりトランスフヱクシヨンする。 N、 P、 および Lをコードする発現ベクターの 量比は 2 : 1 : 2 とすることが好ましく、 プラスミド量は、 例えば 1〜4μ δの pGEM - N、 0. 5〜2 μ gの pGEM-P、 および 1〜4 μ gの pGEM- L程度で適宜調整する。
トランスフエクションを行った細胞は、 所望により 100 μ g/mlのリファンピシン
(Sigma) 及ぴシトシンァラビノシド （AraC) 、 より好ましくは g/mlのシトシ ンァラビノシド （AraC) (Sigma) のみを含む血淸不含の MEMで培養し、 ワクシニ ァウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、 ウィルスの回収率を最大にするよう に薬剤の最適濃度を設定する （Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1 : 569-579 ) 。 トランスフエクシヨンから 48〜72時間程度培養後、 細胞を回収し、 凍結融解 を 3回繰り返して細胞を破砕した後、 RNPを含む破砕物を LLC-MK2細胞に再度トラ ンスフエクシヨンして培養する。 トランスフエクシヨンは、 例えばリポフエタ ト アミンゃポリカチォニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入 することが可能である。 具体的には、 種々のトランスフエクシヨン試薬が利用で きる。 例えば、 DOTMA (Roche) 、 Superfect (QIAGEN #301305) 、 D0TAP、 DOPE, D 0SPER (Roche #1811169) などが挙げられる。 エンドソーム中での分解を防ぐため 、 クロ口キンを加えることもできる （Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl. Acad. S ci. USA 80： 3015) 。 RNPが導入された細胞では、 RNPからのウィルス遺伝子の発 現および RNPの複製の過程が遂行しベクターが増幅する。 得られた細胞溶解物を希 釈して再増幅を繰り返すことにより、 ワクシニアゥィルス vT T - 3は完全に除去す ることができる。 再増幅は、 例えば 3回上繰り返す。 得られた RNPは- 80°Cで保存 することができる。
ウィルスベクターが再構成する限り、 再構成に用いる宿主細胞は特に制限され ない。 例えば、 センダイウィルスベクター等の再構成においては、 サル腎由来 LLC MK2細胞および CV- 1細胞、 ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞、 ヒト由来 細胞等を使うことができる。 これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現さ せることで、 その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることも できる。
ウィルスゲノム中の M遺伝子が欠損または欠失していると、 このウィルスが感染 した細胞からはウィルス粒子が形成されないため、 上記のような方法では RNPまた は RNPを含む細胞として本宪明のベクタ を調製することはできても、 ウィルス粒 子としてベクターを調製することはできない。 また、 RNPのトランスフエクシヨン を行った後は、 細胞内で増殖した匿は接触している細胞へのみ伝達されるため感 染の拡大が遅く、 高タイターのウィルスベクターを大量に調製するのは難しい。 本発明は、 本発明のベクターをウィルス粒子として産生するための方法を提供す る。 ウィルス粒子は RNPに比べ溶液中で安定であり、 さらに感染性を持たせること によりトランスフエクション試薬などを必要とせず細胞に接触させるだけでぺク ターを標的細胞に導入することができるため、 産業上の利用に特に優れている。 本発明のベクターをウィルス粒子として産生する方法の 1つは、 条件的変異を有 す M遺伝子を持つウィルスゲノムを用いて、 許容条#下でウィルスを再構成させ る方法である。 すなわち、 上記の工程 （a ) 、 あるいは上記工程 ( a ) および （ b ) により得られた複合体を導入した細胞を培養する際に、 許容条件下で行うこ とにより、 M蛋白質を機能させ粒子を形成させることができる。 条件的変異を有す る M変異蛋白質をコードするゲノム RNAを含むウィルス粒子を製造する方法は、 （i ) 該 M変異蛋白質の許容条件下、 細胞内でパラミクソウィルスの N、 P、 および L蛋 白質、 およぴ該ゲノム R Aを含む R Pを増幅させる工程、 および （ii) 該細胞の培 養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方法である。 例えば温 度感受性 M変異蛋白質であれば、 許容温度で培養する。
また、 本発明のベクターをウィルス粒子として製造するもう 1つの方法は、 M蛋 白質を発現するヘルパー細胞を用いる方法である。 本発明者らは、 Mヘルパー細胞 を用いることによって、 F蛋白質の開裂部位が他のプロテアーゼで切断される配列 に改変されており、 さらに M遺伝子を変異または欠失するベクターをウィルス粒子 として産生させた。 本発明の方法は野生型パラミクソウィルスなどのヘルパーゥ ィルスを必要としないため、 M遺伝子を含んだ粒子形成能を持つウィルスが混入す ることがなく、 本発明のベクターを純粋に調製することが可能である。 本発明は 、 （i)パラミクソウィルスのゲノム腿であって、 （a ) M蛋白質をコードする核酸 が変異または欠失しており、 かつ （b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部 位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に 置換された蛋白質をコードするゲノム RNAを有するウィルス粒子であって、 （ 1 ) 該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有し、 （ 2 ) 宿主内環境においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、 （3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該ゲノム RNAを有するウィルス粒子が導入さ れた細胞と接触する細胞に、 該ゲノム RNAを導入する能力を有するウィルス粒子を 提供する。 好ましい態様では、 このウィルス粒子はウィルス粒子を産生しない。 機能的 M蛋白質を発現する細胞中で本発明のウィルス粒子を製造する方法は、
(i) パラミクソウィルスの野生型 M蛋白質またはそれと同 の蛋白質を発現する 細胞において、 該パラミクソウィルスの N、 P、 および L蛋白質、 およぴ該ゲノム RN Aを含む RNPを増幅させる工程、
(ii) 該細胞の培養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方法である。 野生型 M蛋白質はウィルス粒子を形成させる活性を有する限り 、 ゲノム RNAと違うパラミクソウィルスに由来していてもよい。 また、 タグべプチ ド等が付加されていてもよいし、 適当な発現ベクターから発現される際に、 ベタ ター由来のリンカーべプチドが付加されていてもよい。 このように野生型 M蛋白質 そのものでなくても、 それと同等のウィルス粒子形成能を有する蛋白質を用いる ことができる。 M発現細胞から産生されたウィルス粒子は、 この細胞で発現させた M蛋白質をエンベロープに含んでいるが、 この蛋白質をコードする遺伝子は含んで いない。 従って、 このウィルスが感染した細胞では、 もはや野生 MM蛋白質は発現 せず、 ウィルス粒子を形成できない。
M蛋白を発現するヘルパー細胞の作製は、 以下のように行うことができる。 例え ば M遺伝子の誘導的な発現が可能なベクターを構築するため、 誘導性プロモーター または Cre/loxPなどの組み換えによる発現制御系などを利用する。 Cre/loxP誘導 型発現プラスミドの構築には、 例えば、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物 を誘導発現されるように設計されたプラスミド pCALNdlw (Arai, T. et al. , J. V irology 72, 1998, plll5-1121) 等を利用することができる。 M蛋白質を発現でき る細胞として、 M遺伝子が染色体に組み込まれ、 誘導により M蛋白質を持続的に高 発現可能なヘルパー細胞株を樹立することが好ましい。 細胞は、 例えばサル腎臓 由来細胞株 LLC- MK2細胞等を用いることができる。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱処理 した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、 ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、 およびスト レプトマイシン 50/ g/mlを添加した MEMで 37°C、 5% C02で培養する。 Cre DNAリ コンビナーゼにより M遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミ ドを、 リン酸カノレシゥム法 (mammalian transfection kit (Stratagene) ) により 、 周知のプロトコールに従って LLC- MK2細胞に遺伝子導入を行う。 '
例えば、 10cmプレートを用い、 40%コンフルェントまで生育した LLOMK2細胞に 10 の M発現プラスミドを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 %C02インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培 地に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0. 2ml 2枚に蒔き、 G4 18 (GIBC0-BRL)を 1200 μ g/mlを含む 10mlの 10°/。FBSを含む MEM培地にて培養を行い、 2日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、 遺伝子の安定導入株の選択を行う。 該培地により生育してきた G418に耐1生を示す細胞はクローユングリングを用いて 回収する。 回収した各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大 培養を続ける。
ヘルパー細胞において M蛋白質が高発現することが、 高力価のウィルスを回収す るために重要である。 そのためには、 例えば上記の M発現細胞の選択を 2回または それ以上行うことが好ましい。 例えばある薬剤耐性マーカー遺伝子を持つ M発現プ ラスミドをトランスフエクシヨンし、 その薬剤を用いて M¾伝子を保持する細胞を 選択した後、 別の薬剤耐性マーカー遺伝子を持つ M発現プラスミドを再度、 この細 胞にトランスフエクシヨンしこの別の薬剤耐性マーカーで細胞を選択することに より、 1回目のトランスフヱクシヨンで選択された細胞よりも、 さらに M蛋白質を 高発現できる細胞を選択することが可能である。 このように、 2回のトランスフエ クションを経て構築された Mヘルパー細胞を好適に用いることができる。 Mヘルパ 一細胞は、 同時に F遺伝子も発現することにより、 Fおよび M遺伝子の両方を欠損す る感染性ウィルス粒子を産生させることができる （W003/025570) 。 この場合、 F 遺伝子の発現プラスミドも 2回以上トランスフエクシヨンし、 F蛋白質の発現誘導 レベルをより高めることが好ましい。 F遺伝子としては、 本明細書に記載したよう な改変 F蛋白質の遺伝子の用いることができる。
M蛋白質の発現誘導は、 細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた 後、 例えば、 アデノウイルス AxCA Creを斉藤らの方法 （Saito et al. , ucl. Aci ds Res. 23： 3816—3821 (1995)； Arai, T. et al. , J. Virol. 72， 1115 - 1121 (199 8) ) により、 好ましくは moi=3程度で感染させて行う。
野生型 M蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞 （Mヘルパー細胞） を 用いて本発明のウィルス粒子を産生させるには、 この細胞に上迷した本発明の RNP を導入して培養すればよい。 RNPの導入は、 例えば RNPを含む細胞溶解物などを Mへ ルパー細胞にトランスフエクションしてもよいし、 あるいは RNPを産生する細胞と Mヘルパー細胞とを共培養することによつても、 細胞融合により Mヘルパー細胞に R NPを導入することができる。 あるいは、 Mヘルパー細胞内で、 ゲノム RNAを転写さ せ、 N、 P、 および L蛋白質の存在下で RNPを新規に形成させてもよい。
本発明においては、 上記の工程 (i) (Mヘルパー細胞で RNPを増幅させる工程） を低温で行うことが好まし!/、。 温度感受性変異 M蛋白質を用 、たべクタ一産生では 、 ウィルス粒子産生過程を許容温度以下で行うことが必要である力 驚くべきこ とに、 野生型 M蛋白質を用いた本方法においても、 ウィルス粒子を形成させる過程 を低温で行うことで効率的な粒子形成を行わせることが可能であることが判明し た。 低温とは、 具体的には 35°C以下、 より好ましくは 34°C以下、 さらに好ましく は 33°C以下、 最も好ましくは 32°Cまたはそれ以下である。
本発明の方法によれば、 本宪明のウィルス粒子は、 例えば 1 X 105 CIU/mL以上 、 好ましくは 1 X 106 CIU/raL以上、 より好ましくは 5 X 106 CIU/mL以上、 より好ま しくは 1 X 107 CIU/mL以上、 より好ましくは 5 X 107 CIU/mL以上、 より好ましくは 1 X 108 CIU/mL以上、 より好ましくは 5 X 108 CIU/raL以上の力価でウィルス産生細 胞の細胞外液中に放出させることが可能である。 ウィルスの力価は、 本明細書お ょぴ他に記載の方法により測定することができる （Kiyotani, K. et al.， Virolo gy 177 (1) , 65-74 (1990) ; W000/70070) 。
M欠失型のウィルスゲノム cDNAから組み換えウィルスベクターを再構成させるた めのより好ましい一態様としては、 以下のような方法が挙げられる。 すなわち、
( a ) ゲノム RNA (ポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよい） をコードする DNAを 、 感染性ウィルス粒子の形成に必要なウィルス ¾白質群 （すなわち NP、 P、 L、 M、 F、 および H蛋白質） を発現する細胞で転写させる工程、 ( b ) 該細胞と、 染色体 に組み込まれた M遺伝子が発現する細胞 （Mヘルパー細胞） を共培養する工程、 ( c ) 該培養から細胞抽出物を調製する工程、 （d ) 該抽出物を染色体に組み込ま れた M遺伝子が発現する細胞 （Mヘルパー細胞） にトランスフエクシヨンして培養 する工程、 および （e ) 該培養上清からウィルス粒子を回収する工程、 を含む方 法である。 工程 （d ) は上記の低温条件にて行うことが好ましい。 得られたウイ ルス粒子は、 再度 Mヘルパー細胞に感染させて （好ましくは低温で） 増幅すること ができる。 具体的には、 実施例の記載に従ってウィルスを再構成させることがで きる。 回収したウィルス粒子は、 希釈後、 再度 Mヘルパー細胞に感染させて増幅す ることができる。 この増幅過程は例えば 2または 3回またはそれ以上行うことがで きる。 得られたウィルスストックは- 80°Cで保存することができる。 ウィルス力価 は赤血球凝集活性 (HA)を測定することにより決定することができる。 HAは 「endo - point希釈法」 により決定することができる。
具体的には、 まず LLC- MK2細胞を 5 X 106 cells/dishで 100mmのシャーレに播く 。 T7 RNAポリメラーゼによりゲノム RNAの転写を行わせる場合には、 細胞培養 24時 間後、 ソラレン （psoralen) と長波長紫外線 (365nm) で 20分間処理した T7ポリメ ラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス （PLWUV- VacT7： Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986) ) を MOI 2程度で 室温で 1時間感染させる。 細胞を無血清の MEMで洗浄した後、 ゲノム RNAを発現す るプラスミド、 およびパラミクソウィルスのそれぞれ N、 P、 L、 F、 およひ ΈΝ蛋白 質を発現する発現プラスミド適当なリポフエクシヨン試薬と用いてこの細胞にト ランスフヱクトする。 プラスミドの量比は、 例えば順に 6 : 2 : 1 : 2 : 2 : 2 とす ることができるがこれに限定されない。 5時間培養後血清を含まない MEMで 2回洗 净し、 40 g/mLの Cytosine j3 -D-arabinofuranoside (AraC： Sigma, St. Louis, M0) 及ぴ 7. 5 i g/niLの Trypsin (Gibco-BRL, Rockville, MD) を含む MEMで培養す る。 24時間培養後、 約 8. 5X 106 cells/dishあたりに M蛋白を持続発現する細胞 （ Mヘルパー細胞） を重層し、 40 /z g/mLの AraC及ぴ 7. 5/z g/mLの Trypsinを含む MEMで 更に 2日間 37°Cで培養する （P0) 。 これらの細胞を回収し、 ペレットを 2mLZdish あたりの Opt i - MEMに懸濁する。 凍結融解を 3回繰り換えした後、 ライゼ一トをそ のまま Mヘルパー細胞にトランスフエクシヨンし、 40 /i g/mLの AraC、 および F蛋白 質を開裂できるプロテアーゼを含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養する （P1 )。 3〜 1 4日後培養上清の一部をとり、 新たに調製した Mヘルパー細胞に感染さ せ、 4(^ g/raLの AraCおよぴ該プロテアーゼを含み血清を含まない MEMを用い 32°C で培養する （P2)。 3〜1 4日後に新たに調製した Mヘルパー細胞に再度感染させ 、 該プロテアーゼの存在下 （F開裂型ウィルスを調製する場合） または非存在下 （ F非開裂型ウィルス粒子を調製する場合） 、 血清を含まない MEMを用い 32°Cで 3〜 7日間培養する （P3) 。 このように再増幅を 3回以上繰り返すことにより、 最初 に用いたヮクシニアゥィルスは完全に除去することができる。 回収した培養上清 に終濃度 1%になるように BSAを添加し- 80°Cにて保存する。
本発明のウイルス粒子は、 ウィルス粒子が持つ改変 F蛋白質が開裂された感染性 を有する粒子、 あるいは、 そのままでは感染性を有さないが、 該改変 F蛋白質を開 裂するプロテアーゼの処理により感染性を示す潜在的感染能を有するウィルス粒 子であってよい。 ウィルス粒子のエンベロープには、 ゲノムがコードする改変 F蛋 白質が存在しているが、 該蛋白質が開裂されていない場合は、 そのままでは感染 性を有さない。 このようなウィルスは、 この改変 F蛋白質の開裂配列を切断できる プロテァーゼで処理するか、 あるいは該プロテアーゼの存在下で細胞または組織 に接触させることにより、 該 F蛋白質が開裂し感染性を獲得する。 改変 F蛋白質が 開裂していないウィルス粒子を得るには、 上記のウィルス産生細胞においてウイ ルスを製造する際に、 その最終段階におけるウィルス増幅を改変 F蛋白質を開裂す るプロテア一ゼの非存在下で行うことにより実施することができる。 逆に該プロ テアーゼの存在下でウィルスを調製することにより F蛋白質が開裂した感染性ウイ ルス粒子を調製することができる。 '
またウィルス粒子の製造過程において、 細胞においてウイ レスゲノムがコード していないエンベロープ蛋白質を発現させ、 この蛋白質をエンベロープに含むゥ ィルス粒子を産生させることができる。 このようなエンベロープ蛋白質としては 例えば野生型 F蛋白質が挙げられる。 このようにして産生したウィルス粒子は、 ゲ ノム RNAには改変 F蛋白質をコードしているが、 エンベロープにはこの蛋白質に加 え野生型 F蛋白質も有する。 ウィルス粒子の製造段階において野生型 F蛋白質をト ランスに供給し、 これを開裂するトリプシン存在下で増幅させることにより、 ゥ ィルス粒子の野生型 F蛋白質を開裂して感染性を獲得させることができる。 この方 法によれば、 5女変 F蛋白質を開裂するプロテアーゼを用いなくても感染性ウィルス 粒子を高タィタ一で調製することが可能となる。 このように本発明のウィルス粒 子としては、 パラミクソウィルスの野生型 F蛋白質を含むウィルス粒子であってよ い。 野生型 F蛋白質は、 ウィルスゲノムと同一種に由来しなくても、 他のパラミク ソウィルスのエンベロープ蛋白質であってよい。
また野生型 F蛋白質でなくても、 所望のウィルスエンベロープ蛋白質をェンベロ ープに有するウィルス粒子を作製してよい。 すわなちウィルス再構成の際に、 所 望のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、 このエンベロープ蛋白 質を有するウィルスベクターを製造することができる。 このような蛋白質に特に 制限はない。 例えば水疱性口内炎ウィルス （VSV) の G蛋白質 （VSV- G) などは好適 である。 本発明のウィルス粒子には、 VSV-G蛋白質などのように、 ゲノム RNAが由 来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシユードタ イブウィルスベクターが含まれる。 この場合も上記野生型 F蛋白質の場合と同様、 ウィルスのゲノム RNAにはこのエンベロープ蛋白質はコードされないため、 ウィル ス粒子が細胞に感染した後は、 ウィルスベクターからこの蛋白質が発現されるこ とはない。
また、 本発明のウィルス粒子は、 例えば、 エンベロープ表面に特定の細胞に接 着しうるような接着因子、 ガンド、 受容体等の蛋白質、 抗体またはその断片、 あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、 ウィルスエンベロープ由来のポリ ぺプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。 こ れにより、 特定の糸且織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。 これらはウィルスベクターの再構成時に、 細胞内で発現させることによりトヲン スに供給することができる。 具体的には、 例えばサイト力インなどの可溶性因子 の受容体結合ドメィンを含む斬片、 または細胞表面蛋白質に対する抗体断片など が挙げられる (W001/20989)。
なお、 ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、 例えば、 ベクターに含 まれるウィルスゲノム上で欠損しているウイルス遺伝子が異なる 2種またはそれ 以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、 それぞれで欠損するウィルス蛋白質が 、 他のベクターからの発現により供給されるため、 互いに相補しあって感染力の あるウィルス粒子が形成され、 複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅さ れる。 すなわち、 2種またはそれ以上の本発明のベクターを、 ウィルス蛋白質を 相補する組み合わせで接種すれば、 それぞれのゥィルス遺伝子欠損型ゥィルスべ クタ一の混合物を大量かつ低コストで生産することができる。 これらのウィルス は、 ウィルス遺伝子が欠損しているため、 ウィルス遺伝子を欠損していないウイ ルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持すること ができる。 また、 ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは 細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、 不稔化するため、 環境放 出管理上の利点がある。
また、 大量にウィルスベクターを得るために、 上記の方法で得られたウィルス ベクターを発育鶏卵に感染させ、 該ベクターを増幅することができる可能性もあ る。 例えばニヮトリを使って M遺伝子のトランスジエニック体を作製し、 この鶏卵 にべクターを接種して増幅させればょレ、。 鶏卵を使つたウイルスべクタ一の製造 の基本的な方法は既に開発されている （中西ら編，（1993) , 「神経科学研究の先端 技術プロトコール III, 分子神経細胞生理学」 ， 厚生社， 大阪， pp. 153-172) 。 具 体的には、 例えば、 受精卵を培養器に入れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、 胚を成 長させる。 ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、 数日間卵を培養してウィルスべ クタ一を増殖させる。 培養期間等の条件は、 増幅する組み換えウィルスにより変 わり得る。 その後、 ウィルスを含んだ尿液を回収する。 尿液からのウィルスべク ターの分離 ·精製は常法に従って行うことができる （田代眞人， 「ウィルス実験プ ロトコール」 ， 永井、 石浜監修， メジカルビユー社， pp. 68-73 (1995)) 。
回収したウイ スベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。 精製方法はフィルトレーシヨン （濾過） 、 遠心分離、 およびカラム精製等を含む 公知の精製 ·分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。 「実質的 に純粋 J とは、 ウィルスベクターが、 それが存在する試料中の成分として主要な 割合を占めることを言う。 典型的には、 実質的に純粋なウィルスベクターは、 試 料中に含まれる全蛋白質 （但しキヤリァーゃ安定剤として加えた蛋白質は除く） のうち、 ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が 10%以上、 好ましくは 20%以上、 より好ましくは 50%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さら に好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。 パラミクソゥ ィルスの具体的な精製方法としては、 例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋 ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 （特公昭 62- 30752号公報、 特公昭 62 - 33879号公報、 およぴ特公昭 62- 30753号公報） 、 およびフコース硫酸含有多糖およ び/またはその分解物に吸着させる方法 （W097/32010) 等を例示することができる
F開裂部位が改変された M遺伝子欠失型のベクターは、 特定のプロテア一ゼが存 在する環境下でのみ、 細胞融合型の感染によりベクターを細胞間に伝達する。 従 つて、 本発明のベクターは、 あるプロテアーゼを発現する組織を標的にした遺伝 子治療に有用である。 通常のベクターでは、 標的組織の表層に遺伝子導入するこ とはできても、 組織内部にまでベクターを浸透させることは難しい。 しかし本発 明のベ^ターは、 標的とするプロテアーゼ活性が亢進している組織内にベクター を深く浸潤させる能力を持っている。 例えば正常組織の深部まで浸潤した癌細胞 に対しても、 本発明のベクターを用いることにより、 癌細胞の一部のベクター感 染可能な表層部分にそのベクターを感染させることによって、 標的細胞の内部ま でベクターを伝達する事が可能である。
疾患への適用としては、 癌、 動脈硬化、 および慢性関節リウマチ （M) をはじ めとする関節疾患などが拳げられる。 例えば RA等の関節疾患では、 上記のように 細胞外マトリックス^^による軟骨高次構造の崩壌が進行し関節が破壊される。 本発明のベタターにより ECM分解酵素活性が亢進した細胞を取り除くことにより、 関節破壌を低下させることが期待される。 また、 動脈硬化においては、 マクロフ ァージ由来泡沫細胞の集簇が進行する。 泡沫細胞はメタロプロテアーゼを大量に 分泌し、 その結果線維性肥厚を破壊しプラーク破綻を引き起こす。 本発明のベタ ターを用いて MMPを発現するマクロファージを殺すことにより、 このような動脈硬 化の治療を行うことが可能と考えられる。 また後述のように、 癌においては種々 のプロテアーゼが活性化している。 本発明のベクターは、 癌特異的に感染'浸潤 する治療ベクターとして有用である。
ベクターを含む組成物の製造においては、 ベクターは必要に応じて薬理学的に 許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。 「薬学的に許容 される担体または媒体」 とは、 ベクターと共に投与することが可能であり、 ベタ ターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。 例えばベクターを生理食 塩水やリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などで適宜希釈して組成物とすることができ る。 ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。 またべク ターを含む組成物は、 脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等の担体または媒体 を含んでいてもよい。 さらに、 その他にも、 植物油、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定 剤、 殺生物剤等が含有されていてもよい。 また保存剤やその他の添加剤を添加す ることができる。 本発明のベクターを含む組成物は試薬として、 および医薬とし て有用である。 ' '
ベクターの投与量は、 疾患、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状、 投与目的、 投与 組成物の形態、 投与方法、 導入遺伝子等により異なるが、 当業者であれば適宜決 定することが可能である。 投与されるベクター量は好ましくは約 105 CIU/mlから約 1011 CIU/ml、 より好ましくは約 107 CIU/mlから約 109 CIU/ml、 最も好ましくは約 1 X 108 CIU/mlから約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与する ことが好ましい。 癌組織等に投与する！^、 ベクターの投与は標的部位に均等に 行きわたるよう複数箇所に投与することができる。 ヒトにおいては 1回当たりの 投与量は 2 X 105 CIU〜 2 X 1010 CIUが好ましく、 投与回数は、 1回または臨床上 容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、 1日の投与回数についても同様で ある。 ヒト以外の動物についても、 例えば目的の動物とヒトとの体重比または投 与標的部位の容積比 （例えば平均値） で上記の投与量を換算した量を投与するこ とができる。 本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィヌなど全ての哺乳動物が含まれる。 特に本発明のベクターは癌の治療に有用である。 本発明のベクターが感染した 細胞では、 プロテアーゼ存在下で細胞融合によりシンシチウムを形成させる。 こ の性質を利用して、 本発明のベクターを特定のプロテアーゼの活性が亢進してい る癌の治療に用いることが可能である。 本発明は、 癌で活性が亢進するプロテア ーゼにより開裂する F蛋白質をコードする本発明のべクターおよび薬学的に許容さ れる担体を含む癌の治療組成物を提供する。 また本発明は、 該ベクターの癌治療 組成物の製造における使用に関する。 また本発明は、 該ベクターを癌に投与する 工程を含む、 癌の治療方法を提供する。 浸潤転移する悪性の癌では ECM分解酵素の 活性が亢進していることから、 ECM分解酵素により開裂する F蛋白質遺伝子を有す るベクターを用いれば、 悪性の癌に特異的にベクターを感染させ癌組織を死滅さ せることができる。
ベクターには、 外来遺伝子を搭載させることができる。 外来遺伝子は、 ベクタ 一の感染をモ-ターチるためのマーカー遺伝子であってもよく、 あるいは癌の治 療用遺伝子を用いてもよい。 治療用遺伝子としては、 例えばアポトーシス等の細 胞誘導性遺伝子、 細胞毒性を持つ蛋白質をコードする遺伝子、 サイトカイン、 ホ ルモン、 その他が挙げられる。 本発明のベクターは、 癌への直接 (in vivo) 投与 、 および患者由来細胞またはそれ以外の細胞に本発明のベクターを導入し、 その 細胞を癌に注入する間接 （ex vivo) 投与により癌に投与することができる。
対象となる癌は特定のプロテアーゼ活性が亢進する所望の癌であってよく、 癌 種としてはほとんどの浸潤転移する悪性の腫瘍 （肺癌、 胃癌、 大腸癌、 食道癌、 乳癌など） が挙げられる。 し力 し、 悪性癌においても MMP, uPA, tPAなどのプロテ ァーゼの発現の低 、ものもあるため、 プロテアーゼ活性の亢進の有無によって適 用を判断する。 食道癌における粘膜下層への浸潤癌、 大腸癌における固有筋層へ の III， IV期の進行癌や、 浸潤性のメラノーマの深部に進入した外科的にとりきれ ない癌への適用に、 本発明のベクターは特に優れている。 図面の簡単な説明
図 1は、 M遺伝子に温度感受性変異を導入した F欠失型 SeVゲノム cDNAの構築スキ ームを示す図である。
図 2は、 M遺伝子への温度感受性変異導入による 2次放出粒子抑制を目的として 構築したゥィルス遺伝子及びその変異導入の効果を比較検討する為に構築した或 いは使用したウィルス遺伝子の構造を示す図である。
図 3は、 SeV18+/ Δ F- GFP或いは SeV18+/MtsHNts Δ F- GFPを、 F蛋白を持続発現す る細胞 （LLC-MK2/F7/A) に感染し、 それぞれ 32°C及ぴ 37°Cで 6日間培養後の GFP発 現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図 4は、 SeV - F蛋白を持続発現する細胞 （LLC- MK2/F7/A) について、 32°C或いは 37°Cで trypsin及ぴ血清を含まなレヽ MEMで培養し経時的に F蛋白の発現量を Western- blottingで半定量的に観測した結果を示す写真である。
図 5は、 LLC- MK2細胞に SeV18+GFP, SeV18+/ Δ F- GFP或いは SeV18+/MtsHNts Δ F-G FPを m. o. i. 3で感染し 32°C， 37°C或いは 38°Cで培養し 3日後の GFP発現を示す顕微 鏡像を示す写真である。
図 6は、 LLC - M 2細胞に SeV18+GFP, SeV18+/ Δ F- GFP或いは SeV18+/MtsHNts Δ F-G FPを m. o. i. 3で感染し 32°C, 37°C或いは 38°Cで培養し経時的にサンプリング （同時 に新しい培地に交換） した培養上清の赤血球凝集活性 （HA活性） を示す図である 図 7は、 LLC- MK2細胞に SeV18+GFP, SeV18+/ AF- GFP或いは SeV18+/MtsHNts AF-G FPを m. o 3で感染し、 37°Cで培養 2日後の培養上清及ぴ細胞を回収して、 1 lane 当り 6 well plate培養 lwell分の 1/10相当量を用いて、 抗 M抗体を利用した Wester η - blottingにより求めた、 細胞内とウィルス様パーティクル （VLP) 間の M蛋白の 存在比率を示す写真である。
図 8は、 LLC-MK2細胞に SeV18+SEAP/ Δ F- GFP或!/、は SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F- GFP を m. o. i. 3で感染し、 培養 12, 18, 24, 50， 120時間後にサンプリングした培養上 清を用いて測定した SEAP活性を示す図である。
図 9は、 LLC-MK2細胞に SeV18+SEAP/ Δ F- GFP或!/、は SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F-GFP を m. o. i. 3で感染し、 培養 24， 50, 120時間後にサンプリングした培養上清の HA活 を示す図である。
図 1 0は、 LLC- MK2細胞に SeV18+SEAP/ Δ F- GFP或 ヽは SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F-GF Pを m. o. i. 3で感染し、 培養 5日後にサンプリングした培養上清について遠心後ウイ ルスを回収し、 1 lane当り 6 well plate培養 lwell分の 1/10相当量を用いて、 抗 M 抗体を利用した Western- blottingにより求めたウィルス様パーティクル量を示す 写真である。
図 1 1は、 LLC-MK2, BEAS - 2B或いは CV-1細胞に SeV18+ / Δ F-GFP或いは SeV18+/ MtsHNts AF - GFPを m. o. i. 0. 01, 0. 03, 0. 1， 0. 3， 1, 3, 10で感染し、 血清を含ま ない或いは 10% FBSを含む培地で培養し、 血清を含まない培地の場合は感染 3日 後に 10% FBSを含む培地の場合は感染 6日後に、 培地 Φに放出された LDH量から 見積った細胞障害性を示す図である。 同じ細胞数の細胞を細胞変性剤 (Triton) を用いて 100% lysis した時の値を 100%とした相対値で表した。
図 1 2は、 LLC- MK2糸田胞に SeV18+GFP, SeV18+/ AF - GFP或いは SeV18+/MtsHNts Δ F- GFPを m. o. i. 1で感染し、 32°C, 37。C或いは 38。Cで培養し、 培養 2日後に抗 M抗 体を利用して免疫染色を行うことにより求めた M蛋白の細胞内局在を示す写真であ る。
図 1 3は、 A-10細胞に SeV18+SEAP/AF - GFP或いは SeV18+SEAP/MtsHNts AF-GFPを m. o. i. 1 で感染し、 32°C或いは 37°Cで培養し、 10°/。血清を含む培地で培養 1日後に 抗 M抗体おょぴ抗 HN抗体を利用して免疫染色を行!/、、 共焦点レーザー顕微鏡を利用 して観察した M蛋白及び HN蛋白の細胞内局在を示す写真である。 ステレオ立体画像 で示した。
図 1 4は、 A- 10細胞に SeV18+SEAP/AF- GFP或いは SeV18+SEAP/MtsHNts AF-GFPを m. o. i. 1 で感染し、 32°C或いは 37°Cで培養し、 10%血清を含む培地で培養 2日後に 抗 M抗体おょぴ抗 HN抗体を利用して免疫染色を行い、 共焦点レーザー顕微鏡を利用 して観察した M蛋白及び HN蛋白の細胞内局在を示す写真である。 ステレオ立体画像 で示した。
図 1 5は、 M蛋白及び HN蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示 す写真である。 A- 10細胞に SeV18+SEAP/MtsHNts AF-GFPを m. o. i. 1 で感染し、 直 後に微小管の脱重合試薬であるコルヒチン （colchicine) 或いはコルセミド （col cemide) を終濃度 Ι μ Μになるように添加し、 32°Cで培養した。 10%血清を含む培地 で培養 2日後に ¾¾1抗体及ぴ抗 HN抗体を利用して免疫染色を行い、 共焦点レーザー 顕微鏡を利用して観察した M蛋白及ぴ HN蛋白の細胞内局在を観察した。 ステレオ立 体画像で示した。
図 1 6は、 M蛋白及ぴ HN蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示 す写真である。 A- 10細胞に SeV18+/ Δ F- GFP或いは SeV18+/MtsH ts Δ F- GFPを m. o. i. 1 で感染し、 直後に微小昝の脱重合試薬である colchicineを終濃度 な るように添加し、 32°C或 ヽは 37°Cで培養した。 10%血清を含む培地で培養 2日後に 抗 M抗体及ぴ抗 HN抗体を利用して免疫染色を行い、 共焦点レーザー顕微鏡を利用し て観察した M蛋白及ひ Ή蛋白の細胞内局在を観察した。 ステレオ立体画像で示した 図 1 7は、 EGFP遺伝子を有する M欠失型 SeVゲノム cDNAの構築スキームを示す図 である。
図 1 8は、 F及び M両欠失型 SeVゲノム cDNAの構築スキームを示す図である。
図 1 9は、 構築した Fおよび/または M欠失型 SeV遺伝子の構造を示す図である。 図 2 0は、 hygromycin耐性遺伝子を有する M遺伝子発現プラスミドの構築スキー ムを示す図である。
図 2 1は、 クローニングした M (及ひ T) 蛋白を誘導発現する細胞について、 Cre DNAリコンビ^ ^一ゼを発現する組み換えアデノウイルス （AcCANCre) を感染後、 W estern-blott ingによる M及び F蛋白の半定量的な発現比較を示す写真である。
図 2 2は、 ヘルパー細胞 （LLC- MK2/F7/M) クローン #18及ぴ #62を用いた M欠失型 SeV (SeV18+/ AM-GFP) のウィルス再構成を示す写真である。
図 2 3は、 SeV18+/ AM- GFPのウィルス生産性 （CIUと HAUの経時変化） を示す図 である。
図 2 4は、 SeV18+/ Δ M- GFPのビリオン中の遺伝子構造確認の為の RT- PCRの結果 を示す写真およぴ図である。
図 2 5は、 SeV18+/ AM-GFPのウィルス構造を蛋白の視点から確認する為に、 LL C - MK2細胞に感染後の細胞及ぴ培養上清中のゥィルス蛋白について Western- blotti ngを行!/ヽ、 SeV18+GFP及ぴ SeV18+/ Δ F- GFPとの比較結果を示す写真である。
図 2 6は、 SeV18V Δ M- GFP及ぴ SeV 18+/ Δ F- GFP感染 LLC-MK2細胞培養上清中のゥ ィルス由来蛋白の定量比較 （希釈系列を作製して Western- blotting) を示す写真 である。 抗 SeV抗体 （DN- 1) を用いた。
図 2 7は、 SeV18+/ Δ M - GFP或!/、は SeV18+/ Δ F- GFPを LLC - MK2に m. o. i. 3で感染し 、 経時的に回収した培養上清中の HA活性を示す図である。
図 2 8は、 SeV18+/ ΔΜ- GFP或いは SeV18+/ Δ F- GFPを LLC-MK2に m. o. i. 3で感染し 、 感染 5日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。 図 2 9は、 SeV18+/ Δ Μ- GFP或いは SeV18+/ Δ F- GFPを LLC - MK2に m. o. i. 3で感染し 、 感染 5日後に回収した培養上清について、 カチォニックリボソーム （Dosper) を用いて LLC- M 2にトランスフエクシヨンした 2日後の蛍光顕微鏡像を示す写真で める。
図 3 0は、 F1/F2の開裂部位 （F蛋白質の活性化部位） のアミノ酸配列のデザィ ンを示す図である。 癌細胞で高発現しているプロテアーゼ （MMP或いは uPA) の認 識配列を合成基質の配列を元にデザインした。 上から順に配列番号： 4 0〜4 4 図 3 1は、 Fの活性化部位を変換した M欠失型 SeVベクターの cDNA構築スキームを 示す図である。
図 3 2は、 F改変 M欠失型センダイウィルスベクターによるプロテアーゼ依存的 細胞融合型感染を示す写真である。
LLC- K2を用いて、 Fの改変によってそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染 が成立しているかを確かめた。 SeV/ΔΜ- GFP (A, B, C, J, K, L) 、 SeV/F(MMP#2) 厶 M— GFP (D, E, F, M, N, 0) 、 SeV/F (uPA) Δ M—GFP (G, H, I, P， 0， R) の各 10： 失型の SeVを細胞に感染させ、 同時に 0. l /z g/ml collagenase (Clostridium) (B , E, H) , MMP2 (C, F, I) ， MMP9 (J, M, P) , uPA (K, N， Q) , 7. 5 μ g/ml Try psin (L, Q, R) を加えた。 4日後、 蛍光顕微鏡で観察した。 Fを改変していない Se ν/ ΔΜ-GFPは、 trypsinを加えた LLC - MK2でのみ、 感染した細胞の周りの細胞と細胞 融合をおこし、 細胞融合型感染がみられ、 多核細胞である synthitiumを形成した
(L) 。 MMP分解配列を Fに組み込んだ SeV/F(MMP#2) Δ M-GFPは、 collagenase, MMP 2， MMP9 を加えた LLC- MK2で、 細胞融合型感染がみられ、 多核細胞である synthiti um¾r形成し 7こ (E, F, M) o 一方、 urokinase— type plasminogen activator (uPA ) ， tissue-type PA (tPA) 分解配列を Fに組み込んだ SeV/F(uPA) ΔΜ- GFPでは、 tr ypsinで細胞融合型感染がみられ、 さらに改変したことによつて uPAで多核細胞で ある synthitiumを形成した （Q, R) 。 ' 図 3 3は、 F改変 M欠失型センダイウィルスベクターによる癌細胞のプロテア一 ゼ依存的細胞融合型感染を示す写真である。
匿発現癌細胞株である HT1080 (A, D, G) , tPA発現株である MKN28 (B, E, H) , どちらのプロテアーゼも発現していない細胞株 SW620 (C, F, I) を用いて、 内 在性のプロテアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうか実験をおこなつ た。 HT1080では SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPのみ 10倍以上その感染がひろがつていて （D ) 、 tPA発現株 MKN28では SeV/F(uPA) ΔΜ- GFPのみが細胞融合型感染のひろがりがみ られる （H) 。 どちらのプロテアーゼの発現もない SW620では全く感染のひろがり はみられない。
図 3 4は、 Phorbol Esterによる匿誘導と F改変 M欠失型センダイウィルスべク タ一の細胞融合型感染の誘導を示す写真である。
MMP2, 9の発現を gelatin分解活性がある部分が白くぬける gelatin zymography 法によって確認した （A) 。 レーン Cが対照 （control) , Tが 20 nM PMAによって誘 導された上澄みを用いたもので、 HT1080と Pane Iで MMP9のパンドが確認され、 MMP 9が誘導されていることがわかる。 匿 2は、 Pane I で誘導前に潜在型 (latent)の M MP2が検出されているがそれは潜在型であるため活性がほとんどな 、。 Bが示すよ うに、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ - GFPは、 MP9誘導によって細胞融合型感染がみられること が示された。
図 3 5は、 in vivoにおける F改変 M欠失型センダイウィルスべクターの細胞融合 型感染を示す写真である。
HT1080の担癌ヌードマウスを作製した。 皮下に注射後、 7〜9日後に長径が 3 mm を越えた個体を角いた。 50 の SeVを 1度だけ注入した。 2日後、 蛍光顕微鏡に て観察した。 A, D, G, Jが明視野、 B， E， H, Kがそれに対応する GFPの蛍光像、 C, F, I, Lはその拡大像である。 SeV- GFP、 SeV/ ΔΜ - GFPは注入したまわりのみ蛍光 がみられることが確認できる （パネル E， H) 。 それに対して SeV/F (匿 #2) ΔΜ - GF Pでは癌全体に広がることが観察された （パネル K) 。 拡大したものでは、 SeV - GF P、 SeV/ Δ M-GFPが細胞 1つ 1つの蛍光が確認されるのに対して、 SeV/F ( ΜΡ#2) Δ M-GFPでは細胞の形がはつきりせず細胞融合していることが示唆された。
図 3 6は、 in vivoにおける F改変 M欠失型センダイウィルスべクターの細胞融合 型感染を示す図である。 図 3 5の写真像における GFPの癌全体に対する割合を NIH imageによって面積から測定した。 その結果、 図に示すように SeV- GFPが 10%、 SeV/ 厶 M-GFP力 ¾0%であるのに対して SeV/F (MMP#2) ΛΜ - GFPでは 90°/。の感染がみられ、 明 らかな感染の広がりが確認された。
図 3 7は、 担癌ヌードマウスによる F 5女変 M欠失型 SeVベクターの抗腫瘍効果を 示す図である。 図 3 5の腫瘍体積の大きさを計測した。 3 讓以上に発達した癌に 4 群の SeVを注入した。 2日後、 再度注入し、 癌の大きさを計測した。 PBS， SeV- GFP ， SeV/ Δ Μ- GFPは急速に癌が大きくなるのに対して、 図 3 6で示したように癌全体 に広がっていた SeV/F(MMP#2) ΔΜ-GFPを注入した癌は明らかに増殖せず小さいまま であった。 t検定により P〈0. 05で有意に他の 3群と比較して抗癌効果がみられた 図 3 8は、 F非開裂型 F改変 M欠失型 SeVベクターの癌細胞へのプロテアーゼ発現 選択的感染を示す写真である。
MP発現株 HT1080, tPA発現株 MKN28, プロテアーゼをほとんど発現していない SW 620で、 プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどう力調べた。 SeV/F(MMP#2) 厶 M-GFPは MMP発現株 HT1080で感染がみられるが、 tPA発現株 MKN28では、 感染がみ られない。 SeV/F(uPA) ΔΜ-GFPは、 tPA発現株 MKN28では感染がみられるが、 MMP発 現株 HT1080では感染がみられな 、。
図 3 9は、 F非開裂 F改変 M欠失型 SeVベクターの fibroblast による MMP3， 7の誘 導による感染 の獲得を示す写真である。 '
およぴ WiDrを使つて in vitroで fibroblastによる MMPの誘導で F改変 M欠失 型 SeVべクターの感染が変化する力 どうか調べた。 SW480, WiDrともに human fibro blast (hFB) を co - cultureすることによって、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ - GFPが感染する ようになった （B, D) 。 誘導のかからない SW620ではその現象はみられない （F) 図 4 0は、 ヒト大動脈平滑筋細胞への F改変 M欠失型 SeVベクターの MMP選択的感 染を示す写真である。 SeV/ ΔΜ - GFPでは trypsinを加えることによってのみ感染が 亢進するのに対して、 SeV/F (匿 #2) ΔΜ- GFPでは collagenase, MMP2, MMP3, およ ぴ腹 P9でその感染が亢進する。
図 4 1は、 F改変 M欠失型 SeVベクターのプロテアーゼ依存的 Fの開裂を示す写真 である。
プ口テアーゼ依存的なセンダイウイルスの F0から F1への開裂をウェスターンプ ロッテイングによって確認した。 レーン 1, 4, 7， 10力 を改変していない M欠失 型 SeVベクター、 レーン 2, 5, 8, 11が Fに MMP#2配列を揷入した M欠失型 SeVべク ター、 レーン 3， 6， 9, 12が Fに uPA配列を挿入した M欠失型 SeVベクターを上記の プロテアーゼ （未処理， レーン 1, 2， 3； 0. 1 ng/ml MMP9, レーン 4, 5, 6; 0. 1 ng/ml uPA, レーン 7， 8, 9； 7. 5 / g/ml trypsin, レーン 10, 11， 12) で 37。C 、 30分間処理した。 その結果、 trypsinが Fを改変していない M欠失型 SeVベクター を、 MMP9が Fに MMP#2配列を揷入した M欠失型 SeVベクターを、 uPA力 に uPA配列を揷 入した M欠失型 SeVベクターをそれぞれ揷入したプロテアーゼ基質に従って、 F1へ 開裂させた。
図 4 2は、 Fの細胞質ドメイン欠失変異体 (cytoplasmic domain deletion muta nt) の作製と HNとの同時発現による融合能の比較を示す図である。
A; センダイウィルス Fタンパク質の細胞質ドメイン欠失変異体構築図。 上から順 に酉己歹番号： 7 6〜 7 9。
B; Fの細胞質ドメイン欠失変異体の作製と H との同時発現による融合能の比較。 7 . 5 μ g/ml trypsin添加 LLCMK2細胞へセンダイウィルス Fタンパク質のそれぞれの cy toplasmic domain deletion mutantと H を同時発現した後、 4日後、 hematoxylin によつて核染色し、 シンシチゥム形成した核の数を力ゥントした。 図 4 3は、 F/HNキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させることを示す図で ある。
A: F/HNキメラタンパク構造図。 図中のリンカ一配列は配列番号： 8 0とした。 B: F/HNキメラタンパクは Linkerの揷入によって融合能が上昇する。 7. 5 i g/ml t rypsin添加した LLCMK2細胞へそれぞれのセンダイウィルス F/HNキメラタンパクと H Nを同時発現させた。
図 4 4は、 F/HNキメラタンパクの F開裂部位への MMP基質配列の挿入の概略を示 す図おょぴ写真である。
A: MMP基質配列を挿入した F改変 F/HNキメラタンパクの構築図。 上から順に配列番 号： 8 1〜8 9。
B; MMP発現細胞 ΗΠ080への F改変 F/HNの発現によるシンシチウム形成。
図 4 5は、 Fペプチド （Fusion peptide) 改変と濃度依存的シンシチウム形成へ の影響を示す図である。
A: Fusion peptide改変構築図。 上から順に配列番号： 9 0〜9 3。
B: MMP#2, #6, #6G12Aの collagenase (Clastridium)添加濃度による融合能。
図 4 6は、 改良型 F改変 M欠失型センダイウィルスのゲノム構造を示す図である 図 4 7は、 MMP発現量の低い癌においての改良型 F改変 M欠失型- の広がりを示す写真である。 改良型 F改変 M欠失型センダイウィルス感染 2日後の 細胞融合のひろがりを示す。
図 4 8は、 癌細胞株における MMP2および MMP9の発現を示す写真である。 癌細胞 株の上清の Gelatin zymographyを示す。
図 4 9は、 MMP発現量の'低い癌においての改良型 F改変 M欠失型センダイゥ ルス の広がりを示す図である。 感染 2日後の 0. 3cm2あたりのシンシチウム数の比較を 示す。 「ΔΜ」 は SeV18+/ AM- GFP、 「#2j は SeV18+/F (匿 #2) ΔΜ- GFP、 「#6」 は Se V/F(MMP#6) A M-GFP, 「#6ctl4j は3^ 0!() /? 14 (¾»1?#6)厶¾1-6？？、 「F/Hキメラ J は SeV (TDK) /Fct 14 (MMP#6) /Linker/HN厶 M-GFPを表す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よって制限されるものではない。 なお、 本明細書に引用された文献は全て本明細 書の一部として組み込まれる。
1 . 粒子形成能を低下または欠損させた SeVベクタ一の構築
[実施例 1 ] 温度感受性変異導入 SeVゲノム cDNAの構築
M遺伝子に温度感受性変異を導入した SeVゲノム cDNAの構築を行つた。 下記記載 の cDNA構築のスキームを図 1に表した。 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した F欠失 型センダイウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV18+/ AF-GFP： Li, H. -0. et al. , J. V irology 74, 6564-6569 (2000) , W000/70070) を Naelで消化し、 M遺伝子を含む断 片 （4922bp) をァガロース電気泳動で分離、 該当するパンドを切り出し、 QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN, Bothell, WA) で回収し、 pBluescript II (St ratagene, La Jo 11 a， CA) の EcoRVサイトにサブクローニングした （pBlueNaelfr g- Δ FGFPの構築） 。 M遺伝子への温度感受性変異導入はこの pBlueNaelf rg- Δ FGFP 上で、 QuikChange'M Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA ) を利用して Kitに記載の方法に従って行った。 M遺伝子上への変異導入の種類は K ondoらが報告している C1. 151 strain (Kondo, T. et al. , J. Biol. Chem. 268： 21924-21930 (1993) ) の配列を利用し、 G69E， T116A及び A183Sの 3箇所の変異導 入を行った。 変異導入に使用した合成オリゴの配列は、 G69E (5' -gaaacaaacaacca atctagagagcgtatctgacttgac-3 /酉己歹 IJ番"^ : 1 1 , 5 -gtcaagtcagatacgctctctaga ttggttgtttgtttc- 3> //配列番号： 1 2 ) 、 T116A (5' -attacggtgaggagggctgttcgag caggag-3' Ζ¾ΰ列番^" : 1 3 , 5 -ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat-3' /目 c列番 号 ·· 1 4 ) 及ぴ A183S (5 _ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3 酉じ列番号： 1 5 , 5一 ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc - 3' Z酉己歹 lj¾号： 1 6 ) である。 M遺伝子上に 3箇所の変異を有する pBlueNaelfrg- AFGFPを Sailで消化後 ApaLIで 部分消化を行い、 全 M遺伝子を含むフラグメント （2644bp) を回収した。 一方で PS eV18+/ AF- GFPを ApaLI/Nhelで消化して HN遺伝子を含む断片 （6287bp) を回収し、 この 2種の断片を Litmus38 (New England Biolabs, Beverly, MA) の Sall/Nhelサ ィトにサブクローニングした (LitmusSall/Nhelfrg- Mts AFGFPの構築） 。 HN遺伝 子への温度感受性変異導入はこの LitmusSall/Nhelfrg- Mts Δ FGFP上で、 M遺伝子へ の変異導入時と同様に QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kitを利用して Ki tに記載の方法に従つて行つた。 HN遺伝子上への変異導入の種類は Thompsonらが報 告している ts271 strain (Thompson, S. D. et al.， Virology 160： 1-8 (1987) ) の配列を利用し、 A262T, G264R及ひ K461Gの 3箇所の変異導入を行った。 変異導入 に使用した合成オリゴの配列は、 A262T/G264R (5' -catgctctgtggtgacaacccggacta ggggttatca-3' Z酉 3列番"^ : 1 7 , 5 -tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3 Z酉 G列番 ： 1 8 ゝ 及ひ K461G (5， -cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtac aata-3' Z酉己列畨"^ : 1 9 , 0 -tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-^' Z配列番号： 2 0 ) である。 今回は M或いは HN遺伝子への変異導入を別々のべクタ 一上で行つたが、 pSeV18+/ Δ F - GFPを Sal I/Nhelで消化し得られる M及び H遺伝子を 含むフラグメント （8931bp) を Litmus38の Sall/Nhelサイトにサブクローユングし て得られるプラスミド （LitmusSall/Nhelfrg- AFGFP) を利用して、 M及ぴ HN遺伝 子への全変異を導入することは可能である。 このようにして順次変異導入を行い
、 M遺伝子上に 3箇所、 HN遺伝子上に 3箇所の計 6箇所の温度感受性変異を導入し た （LitmusSall/Nhelfrg-MtsHNts AFGFPの構築） 。
LitmusSall/Nhelfrg- MtsH ts AFGFPを Sall/Nhelで消化して回収したフラグメン ト （8931bp) と、 また pSeV18+/ A F- GFPを Sall/Nhelで消化して回収した M及ぴ HN等 遺伝子を含まないフラグメント （8294bp) をライゲーシヨンして、 M及び HN遺伝子 に6箇所の温度感受性変異を有し、 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した F欠失型セ ンダイウィルス全長ゲノム cDNA (PSeV18+/MtsHNts Δ F-GFP) を構築した （図 2 ) 更に、 搭载遺伝子発現量の定量を行う為に、 分泌型アルカリホスファターゼ （S EAP) 遺伝子を搭載した cDNAの構築も行った。 即ち、 SEAP遺伝子の下流に終止シグ ナル -介在配列-開始シグナルを有する SEAP断片 (W000/70070) を Notlで切り出し (1638bp) 、 電気泳動後回収.精製し、 PSeV18+/ A F - GFP及び pSeV18+/MtsHNts厶 F- GFPの Notlサイトに組み込んだ。 それぞれ、 pSeV18+SEAP/ AF_GFP及ぴ pSeV18+SE AP/MtsHNts Δ F-GFPとした （図 2 )。
[実施例.2 ] 温度感受性変異導入ゥィルスの再構成と増
ウィルスの再構成は Liらの報告 （Li, H. -0. et al. , J. Virology 74. 6564-65 69 (2000) , W000/70070) に従って行った。 F欠失型ウィルスを再構成させるため 、 F蛋白のヘルパー細胞を利用した。 当該ヘルパー細胞作製には Cre/loxP発現誘導 システムを利用している。 当該システムは Cre DNA リコンビナーゼにより遺伝子 産物を誘導努現するように設計されたプラスミド pCALNdLw (Arai, T. et al. , J.
Virol. 72： 1115-1121 (1988) ) を利用したものであり、 同プラスミドのトラン スフオーマントに Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス （Ax CANCre) を Saitoらの方法 (Saito, I. et al. , Nucl. Acid. Res. 23, 3816 - 3821
(1995) , Arai, T. et al.， J. Virol. 72, 1115—1121 (1998) ) で感染させて揷 入遺伝子を発現させる。 SeV - F蛋白の場合、 F遺伝子を有する同トランスフォーマ ント細胞を LLC- MK2/F7と記載し、 AxCANCreで誘導後 F蛋白を持続発現している細胞 を LLC-MK2/F7/Aと記載することにする。
温度感受性変異導入ゥィルスの再構成は以下のように行つた。 LLC- M 2細胞を 5 X 106 cells/dishで 100讓のシャーレに播き、 24時間培養後、 ソラレン （psoralen ) と長波長紫外線 （365nm) で 20^·間処理した T7ポリメラーゼを発現するリコンビ ナントワクシェアウイノレス (PLWUV- VacT7： Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. A cad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986) ) を室温で 1時間感染させた (m. o. i. 2) 。 細胞を血清を含まない MEMで洗浄した後、 プラスミド pSeV18+/MtsHNts A F_GFP, pG EM/NP, pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F- HN (Kato, A. et al.， Genes Cells 1， 569-5 79 (1996) ) をそれぞれ 12 /z g, 4^ g, 2 ^ g, 4/z g及ぴ 4 g/dishの量比で Opti - ME M (Gibco-BRL, Rockville, MD) に懸濁し、 1 μ g DNA/5 μ L相当の SuperFect tran sfection reagent (Qiagen, Bothell, WA) を入れて混合し、 室温で 15分間放置後 、 最終的に 3% FBSを含む Opti- MEM 3raLに入れ、 細胞に添加して培養した。 5時間培 養後血清を含まない MEMで 2回洗浄し、 40 j g/mLの Cytosine j3 -D-arabinofurano side (AraC： Sigma, St. Louis, MO) 及ぴ 7. 5 μ g/mLの Trypsin (Gibco-BRL, Rock ville, MD) を含む MEMで培養した。 24時間培養後、 8. 5 X 106 cells/dishあたり に F蛋白を持続発現する細胞 （LLC- MK2/F7/A： Li， H. - 0. et al. , J. Virology 74 . 6564-6569 (2000) , WOOO/70070) を重層し、 40 g/mLの AraC及ぴ 7. 5 μ g/mLの T rypsinを含む MEMで更に 2日間 37°Cで培養した （P0) 。 これらの細胞を回収し、 ぺ レットを 2mL/dishあたりの Opti- MEMに懸濁した。 凍結融解を 3回繰り返した後 、 ライゼ一トをそのまま LLC-MK2/F7/Aにトランスフエクシヨンし、 40 g/mLの Ar aC及び 7. 5 μ g/raLの Trypsinを含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養した （P1) 。 5〜 7日後培養上清の一部をとり、 新たに調製した LLC- MK2/F7/Aに感染させ、 同 40 / g/mLの AraC及び 7. 5 μ g/mLの Trypsinを含み血清を含まない MEMを用い 32°C で培養した （P2)。 3〜 5日後に新たに調製した LLC-MK2/F7/Aに再度感染させ、 7 . 5 μ g/mLの Trypsinのみを含み血清を含まな 、MEMを用い 32°Cで 3〜 5日間培養し た （P3) 。 回収した培養上清に終濃度 1%になるように BSAを添加し- 80°Cにて保存 した。 保存ウィルス液を解凍し、 その後の実験に供した。
この方法で調製した各ウィルス溶液のタイターは SeV18V AF- GFP， SeV18+/MtsH Nts厶 F-GFP, SeV18+SEAP/ Δ F- GFP及ぴ SeV18+SEAP/MtsH ts Δ F- GFPでそれぞれ、 3 X 108, 7 X 107, 1. 8 X 108及 ¾. 9 X 107 GFP- CIU/mL (GFP- CIUの定義は WOOO/70070 に記載） であった。 なお、 GFPを搭載したベクターについては、 GFPの蛍光で直接 的にカウントして定量した CIUが GFP-CIUと定義される。 GFP - CIUは、 CIUと実質的 に同じ値を示すことが確認されている （WOOO/70070) 。 これらのタイターを測定 する際、 SeV18+/ A F - GFP及ぴ SeV18+/MtsHNts A F-GFPについて、 F蛋白を持続発現 する細胞 （LLC- MK2/F7/A) に感染後のプラークの広がりを 32°C及ぴ 37°Cで観察し た。 感染 6日後の写真を図 3に示したが、 SeV18+/MtsHNts Δ F- GFPは 32°Cではある 程度プラークの広がりがあるものの 37°Cでは激減しており、 ビリオン形成の減少 が示唆された。
[実施例 3 ] ウィルス再構成における培養温度 (32°C) の効果
実施例 2で示した温度感受性導入ゥィルスの再構成実験にぉ 、て、 P1以降の温 度を 32°Cで行った。 これは温度感受性変異を導入するにあたって変異の参考にし たウィルスが 32°Cでの生育が良い (Kondo, T. et ah , J. Biol. Chem. 268 : 219 24-21930 (1993) , Thompson, S. D. et ah , Virology 160： 1—8 (1987) ) こと力 ら試みたものであるが、 当該実験条件を詳細に観察することで、 SeV再構成にあた つては （温度感受性変異導入ウィルス以外でも） 、 P1以降で 32°Cで行うことで再 構成効率が上昇し、 従来取れ難かったものでも回収できるようになる可能性が高 いことが明らかになった。
32°Cでウィルス再構成効率が上昇する理由として 2点考えられる。 まず、 ワク シニアウィルスの増幅を抑制する為に添加している AraCによる細胞毒性が、 32°C での培養の方が抑制されていると考えられる点である。 再構成時の条件である、 4 0 μ g/mLの AraC及ぴ 7. 5 μ g/mLの Trypsinを含み血清を含まない MEMを用いて LLC- ΜΚ 2/F7/Aを培養した場合、 37°Cでは 3- 4日後で既に細胞障害が惹起され剥がれた細胞 が増えてくるのに対し、 32°Cで培養した場合は 7- 10日は十分に培養継続が可能で あり細胞が維持されている。 転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成 効率の良くない SeVを再構成する場合、 培養継続期間は再構成の可否に直接反映さ れると ^えられる。 2点目は 32°Cで培養した場合には LLC-MK2/F7/Aにおける F蛋白 の発現が維持されている点である。 F蛋白を持続発現する細胞 （LLC-MK2/F7/A) を 6 wellプレートに 10% FBSを含む MEMでコンフルェントになるまで 37°Cで培養後、 7 . 5 μ g/mLの Trypsinを含み血清を含まな ヽ MEMに置換し 32°C或レ、は 37°Cで培養し、 経時的にセルスクレーパーで細胞を回収した後、 抗 F抗体 （マウスモノクローナル ) を利用した Western- blottingを行うことで、 細胞内の F蛋白質を半定量的に解析 した。 37°Cでは 2日間は発現が維持されているもののそれ以降は減少していたが 、 32°Cでは少なくとも 8日間は F蛋白の発現が維持されていた （図 4 ) 。 この点か らも 32°Cでの再構成 （P1以降） の有効性が確認された。
上記 Western- blottingは以下の方法で行った。 6 wellプレートの lwellから回収 した細胞を- 80°Cで凍結保存後、 lxに希釈した SDS- PAGE用サンプルバッファー （Re d Loading Buffer Pack; New England Biolabs, Beverly, MA) 100 で溶解し、 98°Cで 10分間加熱した。 遠心後、 上清 10 μ Lを SDS- PAGEゲル （マルチゲル 10/20； D aiichi Pure Chemicals Co. , Ltd, Tokyo, Japan; にロードしに。 15mMで 2. 5時間 泳動後、 PVDF膜 (Immobilon PVDF transfer membrane; Millipore, Bedford, MA ) にセミドライ法にて 100mAで 1時間転写した。 転写膜をプロッキング溶液 (Bloc k Ace; Snow Brand Milk Products Co. , Ltd, Sapporo, Japan;
Figure imgf000083_0001
1時間以上 放置した後、 10% Block Aceを含み抗 F抗体を 1/1000容量添加した一次抗体溶液に 浸し、 4°Cでー晚放置した。 0. 05°/。 Tween20を含む TBS (TBST) で 3回、 更に TBSで 3 回洗浄した後、 10% Block Aceを含み HRPを結合した抗マウス IgG+IgM抗体 （Goat F (ab, ) 2 Anti-Mouse IgG+IgM, HRP; BioSource Int. , Camarillo, CA) を 1/5000容 量添加した二次抗体溶液に浸し、 室温で 1時間振盪した。 TBSTで 3回、 TBSで 3回 洗净し 7こ後、 ィ匕ギ 光法 (ECL western blotting detection reagents ; Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden) により検出した。
[実施例 4 ] 温度感受性変異導入ウィルスの 2次放出粒子定量 （HA assay, Wes tern-Blotting)
SeV18+/AF-GFP, SeV18+/MtsHNts AF- GFPと共に、 全てのウィルス蛋白を有する 自律複製型で Notl部位に GFP遺伝子とその下流に終止シグナル-介在配列-開始シグ ナルを有する GFP断片 （780bp) を搭載した SeV (SeV18+GFP：図 2 ) を用いて比較 を行った。 6 well plateにおいてコンフルェントに増殖させた LLC- MK2細胞に、 3 X 107 CIU /mLの各ウィルス溶液を lwellあたり IOO Lを添加して （m. o. i. 3) 1時間感染し、 MEMで洗浄後、 lwellあたり lmLの血清を含まな Vヽ MEMを添加して 32°C, 37°C及び 38 °Cの各温度で培養した。 1日毎にサンプリングし、 サンプリング後直ぐに血清を含 まない新しい MEMlmLを添加して経時的に培養 ·サンプリングを行った。 感染 3日 後に蛍光顕微鏡下で GFP発現の観察を行った所 3種のウィルス共に、 また 32°C, 37 °C及ぴ 38°Cの全ての条件において、 ほぼ同程度に感染し、 また類似した GFPの発現 があると予想された （図 5 ) 。
2次放出粒子は赤血球凝集活性 （HA活性） で定量し、 Katoらの方法 （Kato, A. et al. , Genes Cell 1, 569-579 (1996) ) に倣って行った。 即ち、 丸底の 96穴プ レートを使用し、 ウィルス液を段階的に PBSで希釈し各 well 50 の 2倍希釈系列 を作製した。 その 50;z Lに 1%濃度に PBSで希釈したニヮトリ保存血 （コスモバイオ， Tokyo, Japan) 50 /i Lを混合し、 4°Cで 1時間放置し赤血球の凝集を観察し、 凝集 したもののうち最もウィルス希釈率の高 ヽものの希釈率を HA活性として判定した 。 また、 1H Jを 1 X 106 ウィルスと換算して、 ウィルス数で表した （図 6 ) 。 SeVl 8+/MtsHNts Δ F- GFPで 2次放出粒子がかなり減少し、 37°Cで SeV18+/ Δ F- GFPの約 1/ 10に減少していると判断された。 また、 SeV18+/MtsHNts A F_GFPは、 32°Cでもウイ ルス粒子形成は減少しているが、 少ないながらもある程度は粒子がでるので、 生 産が可能になっていると考えられた。
別の観点からの 2次放出粒子の定量として、 Western- Blottingによる定量を行 つた。 上記と同じように LLC-MK2細胞に m. o. i. 3で感染後、 感染 2日後に培養上清 と細胞を回収し、 培養上清は 48， 000gで 45分間遠心しウィルス蛋白を回収した。 SD S - PAGE後、 Western- Blottingを行い、 抗 M抗体で検出した。 抗 体は新たに調製 したポリクローナル抗体であり、 SeV-M蛋白質の 1-13 (MADIYRFPKFSYE+CysZ配列 番号： 2 1 ) , 23-35 (LRTGPDKKAIPH+CysZ配列番号： 2 2 ) 及び 336- 348 (Cys+ NVVAK IGRIRKLZ配列番号： 2 3 ) の合成ペプチドを 3種混合して免疫したゥサギ 血清から調製したものである。 Western- Blottingは実施例 3に記載の方法で行い 、 一次抗体の抗 M抗体は 1/4000希釈、 二次抗体の HRPを結合した抗ラビット IgG抗体
(Anti-rabbit IgG (Goat) H+L conj.； ICN P.， Aurola, OH) は 1/5000容量に希 釈したものを使用した。 SeV18+/MtsHNts Δ F- GFPでは、 細胞中には Mil白が同程度 に多く発現しているのに対し virusの蛋白量が減少しており （図 7 ) 、 Western - B1 ottingの手法によっても、 当該ウィルスに於レ、て 2次放出粒子が減少しているこ とが確認された。
[実施例 5 ] 温度感受†生変異導入ウィルスの搭載遺伝子発現量 (SEAP assay) SeV18+/MtsHNts AF - GFPにおいて 2次放出粒子が減少しているが、 それと同時に 搭載遺伝子の発現量が減少していては遺伝子発現ベクターとしては意味のない改 変になつてしまうので、 その発現量について検証を行った。 SeV18+SEAP/ AF- GFP 及ぴ SeV18+SEAP/MtsH ts A F- GFPを LLC-MK2細胞に m. o. i. 3で感染後、 経時的に （感 染 12, 18, 24, 50, 120時間後） 培養上清を回収し、 上清中の SEAP活性を Reporte r Assay Kit- SEAP (T0Y0B0, Osaka, Japan) を利用して Kitに記載の方法に従って 行った。 SEAP活性は両者間での差が殆どなかった （図 8 ) 。 また同サンプルにつ いて赤血球凝集活性 （HA活性） を測定したが、 HA活性は SeV18+SEAP/MtsHNts厶 F - G FPでやはり約 1/10に減少していた （図 9 ) 。 また、 同サンプルのウィルスを 48, 00 0gで 45分間遠心しウイルス蛋白を回収した後、 Western- Blottingで抗 M抗体を利用 して半定量的に解析した。 この場合も、 上清中のウィルス蛋白の減少が確認され た （図 1 0 ) 。 温度感受性変異の導入によって、 搭載遺伝子の発現量を殆ど減少 することなく、 2次放出粒子を約 1/10に減少できたと判断された。
[実施例 6 ] 温度感受性変異導入ゥィルスの細胞障害性 （LDH assay)
SeV感染 ίこよって細胞が障害を受ける場合も多い。 この点 関して、 変異導入に よる影響を調べた。 LLC- ΜΚ2, BEAS- 2B及ぴ CV-1細胞をそれぞれ 2. 5 X 104 cells/we 11 (100 μ L/well) で％well plateに播き培養した。 培養には LLC- MK2及ぴ CV - 1に は 10% FBSを含む MEMを、 BEAS- 2Bには 10% FBSを含む D- MEM及ぴ RPMI (Gibco-BRL, R ockville, MD) の 1 : 1混合液を使用した。 24時間培養後、 1% BSAを含む EMで希 釈した SeV18+/ A F - GFP或いは SeV18+/MtsHNts A F- GFP溶液を 5 μ L/wellで添カ卩し感 染させ、 6時間後ウィルス液を含む培地を除き、 10% FBSを含む或いは含まない各 培地に置き換えた。 FBSを含まない培地の場合は感染 3日後に、 FBSを含む培地の 場合は感染 6日後に培養上清をサンプリングし、 Cytotoxicity Detection Kit (R oche, Basel, Switzerland) を利用して Kitに記載の方法に従って細胞障害性の定 量を行った。 LLC-MK2では両者ともに細胞障害は観察されなかった。 また CV - 1及ぴ BEAS- 2Bにお 、ては、 SeV18+/MtsHNts Δ F-GFPの細胞障害性は SeV18+/ Δ F-GFPと同 等以下であると判断された （図 1 1 ) 。 即ち、 温度感受性変異導入での 2次放出 粒子の抑制による細胞障害性の惹起はな ヽと結論した。
[実施例 7 ] 2次放出粒子抑制メカニズムの検討
温度感受性変異導入によって 2次粒子抑制が可能となったメ力ニズムの一端を 調べる為に、 M蛋白の細胞内局在について調べた。 各 SeV (SeV18+GFP, SeV18+/ A F-GFP, SeV18+/MtsHNts Δ F-GFP) を LLC- MK2細胞にそれぞれ感染し、 32。C、 37°C或 いは 38°Cで培養し 2日後に抗 M抗体を利用して免疫染色を行った。 免疫染色は以下 の方法で行った。 培養細胞を PBSで 1回洗浄した後、 - 20°Cに冷却したメタノールを 添加し 4°Cで 15分間固定した。 PBSで 3回洗浄後、 Goat Serum及ぴ 0. 1% Tritonを 含む PBS溶液で室温 1時間 Blockingを行った。 再度 PBSで 3回洗浄後、 2% Goat Serum を含む一次抗体溶液 （lO ju g/mL抗 M抗体） で 37°C30分間反応した。 PBSで 3回洗浄後 、 2% Goat Serumを含む二次抗体溶液 (10 μ g/mL Alexa Fluor 488 goat anti-rab bit IgG (H+L) conjugate： Molecular Plobes, Eugene, OR) で 37°C15分間反応し た。 最後に PBSで 3回洗浄後、 蛍光顕微鏡下で観察した。 自律複製型で F， HN両蛋白 有する SeV18+GFPでは、 検討した何れの温度においても細胞表面での M蛋白の濃 縮像が観察された （図 1 2 ) 。 このような M蛋白の濃縮像に関しては既に報告され ており （Yoshida, T. et al. , Virology 71： 143-161 (1976) ) 、 ビリオン形成の 場所を反映していると考えられている。 即ち SeV18+GFPにおいては、 何れの温度に お！/、ても M蛋白の細胞表面への局在が正常であり、 十分量のビリオンが形成して^ヽ ることを示していると考えられる。 一方 SeV18+/AF-GFPでは、 38°Cにおいて M蛋白 の濃縮像が極端に減少した。 M蛋白は F及ぴ HN蛋白のそれぞれの Cytoplasmic tail に結合して、 細胞表面へ局在すると考えられており （Sanderson, C. M. et al. , J . Virology 68： 69-76 (1994)、 Ali, A. et al. , Virology 276： 289—303 (2000) ) 、 SeV18+/ AF- GFPではその一方の F蛋白を欠失している為、 M蛋白の局在に影響 していると考えられる。 また、 SeV18+/MtsHNts AF - GFPではその影響が強く出て、 37°Cでさえ M蛋白の局在に支障が出て、 結果的に 2次放出粒子減少に繋がつたもの と予想、された。
[実施例 8 ] 2次放出粒子抑制メカニズムの検討 ( 2 )
細胞内における SeV蛋白の細胞内局在をより詳細に調べるために、 共焦点レーザ 一顕微鏡 (MRC1024; Bio-Rad Laboratories Inc. , Hercules, CA) による解析を 実施した。 SeV18+SEAP/ A F- GFP及ぴ SeV18+SEAP/MtsHNts A F-GFPを A- 10細胞 （rat myoblast) にそれぞれ感染し (m. o. i. 1) 、 32°C或いは 37°Cで 10%血清を含む MEM で培養し、 1日後及び 2日後に抗 M抗体及ぴ抗 HN抗体を利用して免疫染色を行つた。 免疫染色は以下の方法で行った。 培養感染細胞を PBSで 1回洗浄した後、 - 20°Cに冷 却したメタノールを添加し 4°Cで 15分間固定した。 PBSで 3回洗浄後、 2°/。 Goat Seru m, 1% BSA及ぴ 0. 1% Tritonを含む PBS溶液で室温 1時間ブロッキングを行った。 2% Goat Serumを含む Mの一次抗体溶液 （10 /i g/mL抗 M抗体） で 37°C30分間反応し、 更 に HNの一次抗体溶液 （ g/mL抗 HN抗体 （IL4- 1) ) で 37°C30分間反応した。 PBSで 3回洗浄後、 2% Goat Serumを含む二次抗体溶液 ( 10 μ g/mL Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (H+L) conjugate及ぴ 10 μ g/mL Alexa Fluor 488 goat anti-m ouse IgG (H+L) conjugate： Molecular Plobes, Eugene, OR)' で 37°C15分間反応し た。 PBSで 3回洗浄後、 核を染色するために 1/4000に希釈した T0_PR03 (Molecular Plobes, Eugene, OR) を添加後室温で 15分間放置し、 最後に消光を抑えるために 、 Slow Fade Antifade Kit (Molecular Plobes, Eugene, OR) の溶液に置換し、 共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。 感染 1日後の結果を図 1 3に示したが、 赤色 が M蛋白、 緑色が HN蛋白の局在を示し、 共存している場合には黄色に表される。 ま た遠赤色を色変換しているので青色が核である。 SeV18+SEAP/ A F-GFPの場合は、 3 2°C, 37°C何れの温度においても各蛋白の局在に大きな違いはなく、 細胞表面への M蛋白及ぴ HN蛋白の局在が観察されている。 一方 SeV18+SEAP/MtsHNts A F- GFPの場 合は、 両温度ともに各蛋白質の局在に SeV18+SEAP/ A F - GFPの場合と比べ違いがあ り、 細胞表面での M蛋白の局在がほとんどない。 特に 37°Cの場合は、 M蛋白と HN蛋 白がほぼ完全に分離し、 M蛋白は微小管 （microtubule) の中心体付近 （すなわち ゴルジ体付近） とも予想される部分に局在して存在している。 感染後 2日間培養し た場合も同様の結果が得られており、 特に SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F- GFP感染細胞に おいては、 M蛋白の細胞内局在に感染 1日後と変化がなく （図 1 4 ) 、 それぞれの 位置で移動が止まっているように見える。 この結果によっても、 温度感受性変異 導入ウイルスで二次放出粒子が減少しているのは、 粒子形成の中心的な役割を担 つていると考えられている M蛋白の局在不全であると断定された。
また、 SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F-GFP感染後 32°Cで培養した場合、 M蛋白が微小管 の形態に近い形で染色されている （図 1 3 ) 。 実際に微小管の関与を証明するた めに、 微小管の脱重合を促進する薬剤を添加し、 M蛋白 （及ひ ¾N蛋白） の局在の変 化を調べた。 SeV18+SEAP/MtsHNts A F_GFPを A- 10に m. o. i. 1 で感染後、 直後に脱 £合 薬で ¾>る colchicine (Nakarai Tesque, Kyoto, Japan) 或レヽ f colcemide (Nakarai Tesque, Kyoto, Japan) を終濃度 Ι μ Μ添加し、 32°Cで培養した。 感 染 2日後に上述と同じ方法で、 M蛋白、 HN蛋白の細胞内局在を観察した。 脱重合試 薬を添加しない場合は、 M蛋白は微小管様形態に似た分布を示した （図 1 3 ) のに 対し、 脱重合試薬を添加することで、 その構造が壊 、 大きな繊維状構造体とし て検出された （図 1 5 ) 。 この構造は、 M蛋白そのもが凝集したものか或いは脱重 合した微小管の残骸に M蛋白が結合している可能性があるが、 何れにしても図 1 3 に見られる、 SeV18+SEAP/MtsHNts Δ F- GFP感染後 32°Cで培養した場合の M蛋白は、 微小管に沿つて局在している可能性が高！/、と判断された。
上記の微小管への M蛋白の局在が温度感受性ゥィルスの特有のものカゝ否かを調べ るために、 SeV18+/ AF- GFP及ぴ SeV18+/MtsHNts厶 F- GFPの両ウィルスについて、 感 染後の M蛋白 （及び HN蛋白） の局在変化に対する微小管脱重合試薬 (colchicine) の影響を調べた。 SeV18+/ΔF-GFP或ぃはSeV18V^ίtsHNts ΔF-GFPをA-10にm. o. i. 1 で感染後、 直後に脱重合試薬である colchicineを終濃度 Ι μ Μ添加し、 32°C或い は 37°Cで培養した。 感染 2日後に上述と同じ方法で、 M蛋白 （及ひ ΉΝ蛋白） の細胞 内局在を観察した。 結果を図 1 6に示すが、 両ウィルス感染細胞共に類似の現象 を示した。 即ち、 感染後 32°Cで培養した場合は図 1 5と同様に大きな繊維状構造 体として観察された。 SeV18+/ AF- GFPの場合も M蛋白は微小管と共存している可 能性が示唆された。 更に、 37°Cにおいては特に SeV18+/MtsHNts AF-GFP感染細胞に ぉ 、て、 ゴルジ体付近と予想される部位に局在して観察された。
以上の結果から、 以下のことが推察される。 M蛋白はゴルジ体付近で合成され、 主に F及ぴ HN蛋白のそれぞれの Cytoplasmic tailに結合した状態 （Sanderson, C M . et al. , J. Virology 68： 69—76 (1994)、 Ali, A. et al.， Virology 276： 28 9-303 (2000)) で微小管に沿って （例えばキネシンのようなモーター蛋白に結合 して） 細胞内を移動し、 細胞表面へ局在し粒子形成が達成される。 温度感受性変 異を導入したウィルスにおいては、 32°Cにおいては微小管に沿った細胞内移動ま では正常であるが、 微小管から細胞表面へ局在する段階で不具合が生じ、 微小管 に沿つての局在が観察されていると考えることができる。 37°Cにおいては微小管 に沿った細胞内移動さえ不具合が生じ、 ゴルジ体付近で局在が観察されていると 捉えることができる。 M蛋白質の合成の場としては、 ゴルジ体付近と予想されるが 、 凝集が観'察されるのがその付近ということであって、 合成の場そのものは別で ある可能性がある。 但し、 過去の報告例によると、 微小管のコンポーネントであ る tubulinは SeVの転写 ·複製活性に関与し、 転写 ·複製を促進することが報告さ れており （Moyer, S. A. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 5405-5409 (1986)； Ogino, T. et all. J. Biol. Chera. 274, 35999-36008 (1999) ) 、 また ゴルジ体は、 その tubulinが多く存在すると予想される中心体付近に局在すること から微小管の中心体付近 （すなわちゴルジ体付近） で合成されると予想できる。 更に、 SeVの変異株である Fl- R strainは M遺伝子に変異を有しているが、 感染後微 小管を変化させて、 F1 - R strainの細胞の極性に依存しない粒子形成を可能にして いると考えられている (Tashiro, . et al. , J. Virol. 67, 5902 - 5910 (1993) ) 。 即ち、 tubulinに沿った M蛋白の細胞内移動を想定することで、 本実施例の結 果も説明できる。 このように予想されるメカニズムにおいて、 M及ひ ΉΝ遺伝子へ当 該温度感受性変異を導入することで、 M蛋白の細胞内局在の不具合を生じ、 結果的 に二次放出粒子の減少が達成されていると判断された。
[実施例 9 ] EGFP遺伝子を有する M欠失型 SeVゲノム cDNAの構築
cDNAの構築には M遺伝子を欠失した M欠失型センダイゥィルス全長ゲノム cDNA (p SeV18+/ AM： W000/09700) を利用した。 構築のスキームを図 1 7に表した。 pSeV 18+/ ΔΜの M欠失部位を含む BstEII断片 （2098bp) を、 予め Sall/Xholで消化後ライ ゲーシヨンして EcoRV認識部位を欠失させた pSE280 (Invitrogen, Groningen, Net herlands) の BstEIIサイトにサブクローニングした （pSE- BstEIIfrgの構築） 。 GF P遺伝子を有する pEGFP (T0Y0B0, Osaka, Japan) を Acc65I及ぴ EcoRIで消化し DNA blunting Kit (Takara, Kyoto, Japan) での 5，末端の fill inにより末端の平滑ィ匕 を行い、 EcoRVで消化後 BAP (T0Y0B0, Osaka, Japan) 処理を行った pSE- BstEIIfrg にサブクロー-ングした。 この EGFP遺伝子を含む BstEIIフラグメントをもとの pSe V18+/ AMに戻し、 M欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した M欠失型 SeVゲノム cDNA (pSeV 18+/ ΔΜ- GFP) を構築した。
[実施例 1 0 ] 失複製能欠失型 SeVゲノム cDNAの構築 '
Mおよび F遺伝子の両方を欠失する SeVゲノム cDNAを構築した。 下記記載の構築の スキームを図 1 8に表した。 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した F欠失型センダイ ウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV18+/ A F-GFP： Li, H.— 0. et al. , J. Virology 74 , 6564-6569 (2000), WO00/7O070) の Nael断片 (4922bp) を pJBluescript II (Str atagene, La Jolla, CA) の EcoRVサイトにサブクローユングして構築した pBlueNa elfrg-厶 FGFPを用いて M遺伝子の欠失を行った。 M遺伝子直後の ApaLIサイトを利用 して M遺伝子を切り出すようにデザィンした。 即ち、 切り出す fragmentが 6nとなる ように P遺伝子直後に ApaLI認識配列を導入した。 変異導入は QuikChange™ Site-Di rected Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) を禾幌して Kitに ti載の方 法に従って行った。 変異導入に使用した合成オリゴの配列は 5， - agagtcactgaccaa ctagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3' /目 S列番号： 2 4 , 5 - t gaggat ggt aggat gcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct- 3' /配列番号： 2 5 ) である。 変異導入後 、 ApaLIで部分消化し （37°C， 5分） 、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Bothell, WA) で回収した後そのままライゲーシヨンを行った。 再度、 QIAquick P CR Purification Kitで DNAを回収し、 Bsml及ぴ Stulで消化後 DH5 αへ形質転換して Μ遺伝子 （及ぴ F遺伝子） を欠失した DNA (pBlueNaelf rg- Δ Μ Δ FGFP) を調製した。
M (及び F遺伝子） を欠失した pBlueNaelfrg- AMA FGFPを Sail及び ApaLIで消化を 行い、 M欠失部位を含むフラグメント （1480bp) を回収した。 一方で PSeV18+/ AF- GFPを ApaLI/Nhelで消化して HN遺伝子を含む断片 （6287bp) を回収し、 この 2種の 断片を Litmus38 (New England Biolabs, Beverly, MA) の Sall/Nhelサイトにサブ クローニングした （LitmusSall/Nhelfrg- AMAFGFPの構築） 。 LitmusSall/N elfr g-厶 MAFGFPを Sall/Nhelで消化して回収したフラグメント （7767bp) と、 また pSe V18+/ AF- GFPを Sall/Nhelで消化して回収した M及ひ ΉΝ等遺伝子を含まないフラグ メント （8294bp) をライゲーシヨンして、 M及ぴ F遺伝子を欠失しその欠失部位に E GFP遺伝子を搭載した M及ぴ F欠失型センダイウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV18+/厶 M厶 F- GFP) を構築した。 構築した M欠失型 （及び M及び F欠'失型） ウィルスの構造を 図 1 9に表した。 このゲノム cDNAは、 所望の改変 F蛋白質を含む M及ぴ F欠失型 SeV の作製に有用である。
[実施例 1 1 ] SeV - M蛋白を発現するヘルパー細胞の作製 M蛋白を発現するヘルパー細胞作製の為に Cre/loxP発現誘導システムを利用した 。 当該システム構築のため、 F蛋白のヘルパー細胞 （LLC- MK2/F7細胞） 作製 (Li, H. -0. et al.， J. Virology 74, 6564-6569 (2000) , WOOO/70070) において採用 した Cre, DNA リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計された プラスミド pCALNdLw (Arai, T. et al. , J. Virol. 72： 1115-1121 (1988) ) を利 用した。
〈1 > M発現プラスミドの構築
M蛋白を発現誘導するヘルパー細胞の作出の為に、 既に作製している上記 LLC - MK 2/F7細胞を利用し、 この細胞に同システムでの M遺伝子導入を行うこととした。 但 し、 F遺伝子導入時に使用した pCALNdLw/Fは neomycin耐性遺伝子を有している為、 同細胞を利用する為には別の耐性遺伝子の導入が必須であり、 まず図 2 0に記載 のスキームで M遺伝子搭載プラスミド （pCALNdLw/M： pCALNdLwの Swalサイトに M遺 伝子導入） の neomycin耐性遺伝子を hygromycin耐性遺伝子に置き換えた。 即ち、 p CALNdLw/Mを Hindi及ぴ EcoT22Iで消化し M遺伝子を含む断片 (4737bp) をァガロー ス電気泳動で分離、 該当するパンドを切り出し、 QIAEXII Gel Extraction System で回収した。 同時に、 同 pCALNdLw/Mを Xholで切断、 neomycinB"性遺伝子を含まな い断片 (5941bp) を回収後、 更に Hindiで切断し 1779bpの断片を回収した。 Hygro mycininii性遺 子は pcDNA3. lhygro (+) (Invitrogen, Groningen, Netherlands) を ァンプレ1 ~トに hygro - 5， (5， -tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacg tctgtcgag-3' /目列番号 : 2 6 ) 及ぴ hygro- 3 (5 -aatgcatgatcagtaaattacaatga acatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3 列番号： 2 7 ) の 2種のプライマーを用いて PCRを行い、 QIAquick PCR Purぱ ication Kit で'回収した後 Xhol及ぴ EcoT22Iで消化して調製した。 これら 3種の断片をライゲー ションし pCALNdLw- hygroMを作製した。
< 2 > SeV- M及ぴ F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞のクローニング
トランスフエクシヨンには Superfect Transfection Reagentを用 Vヽプロトコ一 ルに記載の方法で行った。 即ち以下の方法をとつた。 LLC- MK2/F7細胞を 5 X 105 ce lls/dishで 60讓シャーレに播き、 10。/。 FBSを含む D- MEMで 24時間培養した。 pCALNdL w~hygroMの 5 μ gを FBS及ぴ抗生物質を含まな Vヽ D-MEMに希釈し （総量で 150 μ L) 、 撹拌後 Superfect Transfection Reagent 30/z Lを添加、 再度撹拌し室温で 10分間 放置した。 放置後、 10%FBSを含む D- MEMを lmL添加し撹拌後、 PBSで 1回洗浄した LL C-MK2/F7細胞へこのトランスフエクション混合液を添加した。 37°C, 5% C02 ィン キュベータ一で 3時間培養後、 トランスフエクシヨン混合液を除去し、 PBSで 3回 洗浄、 10% FBSを含む D- MEMを 5mL添加し 24時間培養した。 培養後、 トリプシンで細 胞を剥がし、 96wellプレートに約 5cells/wellの割り合いで希釈し、 150 /z g/mLの h ygroraycin (Gibco-BRL, Rockville, MD) を含む 10% FBS入りの D- MEMで約 2週間培 養した。 単一の細胞から広がったクローンを 6wellプレートまで拡大培養した。 こ のようにして調製した合計 130クローンについて以下解析を行った。
< 3 > SeV- M及び F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞クローンの解析
得られた 130種のクローンについて、 M蛋白の発現量を Western-blottingで半定 量的に解析した。 各クローンを 6wellプレートに播き、 ほぼコンフルェントの状態 で、 5% FBSを含む MEMで希釈した Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデ ノウィルス （AxCA Cre) を Saitoらの方法 （Saito, I. et al. , Nucl. Acid. Res.
23, 3816-3821 (1995) , Arai, T. et al. , J. Virol. 72, 1115—1121 (1998) ) で m. o. i. 5で感染させた。 32°Cで 2日間培養後、 培養上清を除去し PBSで 1回洗浄 し、 セルスクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。 llaneあたりこの 1/10量 をアプライして SDS-PAGEを行つた後、 抗 M抗体を利用して実施例 3及び 4に記載の 方法で Western - blottingを行った。 130クローンの中で比較的 M蛋白の発現量の多 かったものに関して、 抗 F抗体 (f236 ： Segawa, H. et al. , J. Biochem. 123, 10 64-1072 (1998) ) を利用した Western- blottingの結果と併せて図 2 1に記載した
[実施例 1 2 ] SeV-M 白を誘導発現するヘルパー細胞の評価 実施例 1 1でクローユングした SeV-M蛋白を誘導発現するへルバニ細胞を用いて M欠失型 SeV (SeV18+/AM-GFP) のウィルス再構成を実施し、 これらの細胞クロー ンのウィルス産生能を評価した。 SeV18+/ AM- GFPの P0 lysateを各クローンに添加 し、 GFP蛋白の広がりが観測されるか （M蛋白のトランス供給が達成される力 否 かについて検証した。 P0 lysateの調製は以下のように行った。 LLC- MK2細胞を 5 X 106 cells/dishで 100議のシャーレに播き、 24時間培養後、 PLWUV- VacT7を室温 で 1時間感染させた （m. o. i. 2) 。 細胞を血清を含まない MEMで洗浄した後、 プラ スミド pSeV18+/ AM- GFP, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/F- HN及び pGEM/Mをそれ ぞれ 4/ g, 2 /z g, 4/i g, 4 i g及び 4/i gZdishの量比で Opti-MEMに懸濁し、 1 / g 0^ 5 1^相当の3卯6 6 transfection reagentを入れて混合し、 室温で 1 5分間放置後、 最終的に 3% FBSを含む Opti-MEM 3mLに入れ、 細胞に添加して培養し た。 5時間培養後血清を含まなレヽ MEMで 2回洗浄し、 40 t g/mLの AraC及ぴ 7. 5 μ g/mL の Trypsinを含む MEMで培養した。 24時間培養後、 8. 5 X 106 cells/dishあたりに L LC- K2/F7/Aを重層し、 40 μ g/mLの AraC及ぴ 7. 5 μ g/mLの Trypsinを含む MEMで更に 2日間 37°Cで培養した （P0) 。 これらの細胞を回収し、 ペレットを 2mL/dishあた りの Opti- MEMに懸濁、 凍結融解を 3回繰り返えして P0 lysateを調製した。 一方 で 10種のクローンを 24 wellプレートに播き、 ほぼコンフルェントの時に AxCANCre を m. o. i. 5で感染し、 感染後 32°Cで 2日間培養した細胞を準備した。 この細胞に S eV18+/ ΔΜ- GFPの P0 lysateを各 200 μ L/wellでトランスフエクシヨンし、 40 g/raL の AraC及ぴ 7. 5 μ g/mLの Trypsinを含み血清を含まなレヽ MEMを用い 32°Cで培養した 。 #18及ぴ #62のクローンで SeV18+/ AM - GFPによる GFP蛋白の広がりが観察された （ 図 2 2 ) 。 特に、 #62の方で広がりが早く、 以下の実験にはこの #62を使用した。 当該細胞について AxCANCre誘導前のものを LLC-MK2/F7/M62と記载し、 誘導後のも ので F及び M蛋白を持続発現しているものを LLC- MK2/F7/M62/Aと記載することにす る。 LLC- MK2/F7/M62/Aを利用して SeV18+/ AM- GFPの調製を継続し、 P2の感染 6日 後に 9. 5 X 107, P4の感染 5 日後に 3. 7 X 107 GFP- CIUのゥィルスを調製した。 本実験において、 実施例 3に示すように、 P1以降を 32°Cなどの低温で培養する こと力 eV18+/ ΔΜ-GFPのゥィルス回収にとつて非常に重要と考えられた。 SeV18+/ 厶 M - GFPにおいて M蛋白を発現細胞 （LLC-MK2/F7/M62/A) からトランスに供給して いることが原因と考えられるが、 感染の広がりが非常に遅く P1の感染 7日後でよ うやく広がりが見られた （図 2 2 ) 。 即ち、 当該ウィルスの再構成実験において も、 「P1以降を 32°Cで培養する j ことが転写複製効率の良くない或いは感染性ビ リオン形成効率の良くない SeVを再構成する場合に非常に有効であることを支持し ている。
[実施例 1 3 ] SeV- M蛋白を誘導発現するヘルパー細胞を用レ、たウイルス生産条 件の検討
上記のウィルスの生産性の面での検討も行った。 LLC- MK2/F7/M62/Aを 6well pla teに播き 37°Cで培養した。 ほぼコンフルェントの状態で 32°Cに移行させ、 1日後 に SeV18+/ AM-GFPを m. o. i. 0. 5で感染し、 経時的に培養上清を回収し新たな培地 を添加した。 回収した上清について CIUと HAUを求めた。 感染 4〜6日後で最も多 くのウィルスが回収された （図 2 3 ) 。 HAUは感染 6日後以降も維持されているが 、 この時点では細胞障害性が強く出ており、 ウイルスパーティクル由来では無く 、 細胞断片に結合している或いは遊離している HA蛋白による活性が出ているもの と予想された。 即ち、 ウィルスを回収するには感染 5日後までの培養上清を回収 することが好ましいと考えられる。
[実施例 1 4 ] M欠失型 SeVのゥィルスの構造確認
SeV18+/ Δ M- GFPのゥィルス遺伝子を RT-PCRで、 ゥィノレス蛋白を Western-blottin gで確認した。 RT- PCRは P2の感染 6日後のウィルスを利用した。 ゥィルス溶液から の RNAの回収は QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Bothell, WA) を利用し、 ま た cDNA調製は Thermoscript RT-PCR System (Gibco-BRL, Rockville, MD) を利用 して、 両システムともに添付のプロトコールに記載の方法で行った。 cDNA調製時 のプライマーにはキットに添付の random hexamerを使用した。 また、 RNAからの産 物であることの確認として、 reverse transcriptaseの有無で同反応を行った。 調 製した cDNAをテンプレートとして P遺伝子上の F3593 (5，- ccaatctaccatcagcatcag c-3，/配列番号： 2 8 ) と F遺伝子上の R4993 (5， - ttcccttcatcgactatgacc- 3， Z 配列番号： 2 9 ) の組み合わせと、 同じく P遺伝子上の F3208 (5' - agagaacaagact aaggctacc- 3， /配列番号： 3 0 ) と R4993の組み合わせの 2種で PCRを行った。 SeV 18+/ ΔΜ- GFPの遺伝子構造から予想されたように、 前者及び後者からそれぞれ 1073 bp及ぴ 1458bpの増幅が観察された （図 2 4 ) 。 reverse transcriptase無し （RT- ) の場合は当該遺伝子の増幅はなく、 また GFP遺伝子ではなく M遺伝子が挿入して いる場合 (pSeV18+GFP) はそれぞれ 1400bp及ぴ 1785bpなので明らかに大きさが異 なり、 本ウィルスは M欠失型の遺伝子構造であることを支持した。
Western - blottingにより蛋白側からの確認を行った。 SeV18+/ Δ M-GFP (図中 Δ M) ， SeV18+/AF-GFP (図中 AF) 及び SeV18+GFP (図中 18+) を m. o. L 3で LLC- MK 2に感染し、 感染 3日後に培養上清と細胞を回収し、 培養上清は 48, 000gで 45分間 遠心しウィルス蛋白を回収した。 SDS- PAGE後、 Western- Blottingを行い、 抗 M抗体 、 抗 F抗体及ぴ主に NP蛋白を認識する DN- 1抗体 （ラビットポリクローナル） で検出 した。 実施例 3及ぴ実施例 4に記載の方法で行つた。 SeV18+/ Δ M - GFP感染細胞で は M蛋白が観測されず F或いは Pは観測されたことから、 蛋白側からも SeV18+/ AM - GFPの構造であることが確認された （図 2 5 ) 。 この時、 SeV18+/ Δ F-GFP感染細胞 では F蛋白が観測されず、 SeV18+GFPでは調べた全てのウィルス蛋白質が観測され た。 また、 培養上清のウィルス蛋白に関しては、 SeV18+/ AM-GFPにおいては NPの 観測量が非常に少なく、 二次放出粒子が無いか或いは非常に少ないと予想された
[実施例 1 5 ] M 失型 SeVの 2次放出粒子の有無に関する定量的解!)？ 実施例 1 4記載のように SeV18+/ ΔΜ- GFPを m. o. i. 3で LLC- MK2に感染し、 感染 3 日後に培養上清を回収し、 0. 45 m径のフィルターを通した後 48, 000gで 45分間遠 心し、 回収したウィルス蛋白を用いて Western-blottingを行い、 半定量的に培養 上清中のウィルス蛋白を検出した。 対照として SeV18+/ AF-GFPを同様に感染して 調製したサンプルを使用した。 それぞれの希釈系列を作製し Western- blottingを 行い DN-1抗体 （主に NP蛋白認識） で検出した。 SeV18V AM- GFP感染細胞上清中の ウィルス蛋白は SeV18+/ AF - GFP感染細胞のものの約 1/100であると判断された （図 2 6 ) 。 また、 同サンプルの HA活性は SeV18+/ A F-GFP (64 HAU) なのに対し SeV18 +/ ΔΜ- GFP «2 HAU) であった。
同実験を再度経時的に行った。 即ち、 SeV18+/ AM- GFPを m. o. i. 3で LLC-MK2に感 染し、 経時的に （一日毎に） 培養上清を回収し、 HA活性を測定した （図 2 7 ) 。 感染 4日後以降に少ないながらも HA活性が観測された。 但し、 同サンプルについ て細胞障害性の指標となる LDH活性を測定した所、 SeV18+/ Δ M- GFP感染細胞では感 染 4日後以降明らかな細胞障害性が惹起しており （図 2 8 ) 、 HA活性の上昇はゥ ィルス様パーティクルに起因するのでは無く、 細胞断片に結合している或いは遊 離している HA蛋白による活性が出ている可能性が高いと予想された。 更に、 感染 5日後の培養上清について、 カチォニックリボソームである Dosper Liposomal Tr ansfection Reagent (Roche, Basel, Switzerland) を用いて板 ID:し 7こ。 良口ち、 培 養上清 lOO /i Lと Dosper 12. 5 μ Lを混合し室温で 10分放置後、 6 wellプレートにコ ンフルェントに培養した LLC- MK2細胞にトランスフエクシヨンした。 2日後に蛍光 顕微鏡下で観察した所、 二次放出粒子の存在する SeV18+/ Δ F- GFP感染細胞の培養 上清では、 多くの GFP陽性細胞が観察されるのに対し、 SeV18+/ AM- GFP感染細胞の 培養上清では GFP陽性細胞は僅かには存在したが殆ど観察されなかった （図 2 9 ) 。 以上の結果より、 M蛋白を欠失することで、 二次放出粒子はほとんど抑制可能で あると結論できた。
2 . プロテアーゼ依存性トロピズムを変換した、 粒子形成能を低下または欠損さ せた SeVベクターの構築
上記で構築した M欠損 SeVの再構成系を利用して、 以下のように F蛋白質の開裂部 位を改変した SeVの構築を行つた。
[実施例 1 6 ] F蛋白質の活性化部位を変換した M欠失型 SeVゲノム cDNAの構築
Fの F1/F2の開裂部位 （Fの活性ィ匕部位） に癌細胞で高発現しているプロテアーゼ の認識配列を導入した M欠失型 SeVゲノム cDNAを構築した。 MMP- 2及び MMP- 9の合成 基質として利用されている配列を元にした様々な配列、 及び uPAの基質を元にした 配列をデザィンした。 図 3 0には、 MMP-2及ひ ¾MP- 9の基質として利用されている 合成基質の配列 （Netzel- Arnett， S. et al.， Anal. Biochem. 195, 86-92 (1991 ) ) を元にし、 または新たに修正を加えてデザインした 2種の配列 [PUU MTS (配 列番号： 3 ) および PLG LGL (配列番号： 3 1 ) ；以下、 これらの配列を有する F 蛋白をそれぞれ F(MMP#2) 及び F(MMP#3)と表す] 、 MMPの合成基質に共通の 3アミ ノ酸配列 PLGのみを導入した配列 （以下、 同配列を有する F蛋白を F(MMP#4)と表す ) 及ぴ uPAの基質 VGR (配列番号： 6 ) を元にした配列 （以下、 同配列を有する F蛋 白を F(uPA) と表す） の 4種の配列のデザインが示されている。
着目している MMP (MMP- 2及び MMP-9) に、 より選択的に作用するように実際のデ ザィンを行う場合、 市販されている合成基質の配列とともに基質特異性を詳細に 検討した報告 (Turk, B. E. et al. , Nature Biotech. 19 (7) 661-667 (2001)； Ch en, E. I. et al. , J. Biol. Chem. 277 (6) 4485—4491 (2002) ) を参考にすること が出来る。 特に MMP-9に関しては、 Pro- X - X- Hy- (Ser/Thr)の P3から P2， までのコン センサス配列 （X=全ての残基， Hy=疎水性残基） が提唱されている （Kridel, S. J . et al. , J. Biol. Chem. 276 (23) 20572-20578 (2001) ) 。 そこで、 F (匿 #2)に ついては、 このコンセンサス配列に合致するように、 元の合成基質の配列 PLG i MT Sから本デザィンの PLG I MTSに新たにデザィンを行っている。
遺伝子構築のスキームを図 3 1に示した。 M欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した M 欠失型センダイウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV18+/AM-GFP) を Sail及び Nhelで消 化し、 F遺伝子を含む断片 （9634 bp) をァガロース電気泳動で分離、 該当するパ ンドを切り出し、 QIAEXII Gel Extraction System (QIAGEN, Bothell, WA) で回 収し、 LITMUS38 (New England Biolabs, Beverly, MA) の Sall/Nhelサイトにサブ クローユングした （LitmusSall/Nhelfrg AM-GFPの構築） 。 F遺伝子への変異導入 はこの LitmusSall/ helfrg AM-GFP上で、 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesi s Kit (Stratagene, La Jolla, CA) を利用して Kitに記載の方法に従って行った 。 変異導入に使用した合成オリゴの配列は、 F(MMP#2)への変換のためには 5，-CTG TCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3 ， （配列番号： 3 2 ) および 5に GATAGTACCMTCACAGCACCGMGMaCTCGtCatGccAagAg gGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3' (配列番号： 3 3 ) 、 F(MMP#3)への変換には
5' -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTA CTATCG-3' (配列番号： 3 4 ) および 5， -CGATAGTACCMTCACAGCACCGMGMTaaCccCa GGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3' (配列番号： 3 5 ) 、 F(MMP#4)へ の変換には 5' -CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3' (配列番号
: 3 6 ) および 5，- MTCACAGCACCGMGMTCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG~3， （配列 番号： 3 7 ) 、 及ぴ F(uPA) への変換には 5' - GACACAAMTGCCGGTGCTCCCgtGggGAGA TTCTTCGGTGCTGTGATTG-3' (配列番号： 3 8 ) および 5' - CMTCACAGCACCGMGMTCTC ccCacGGGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3' (配列番号： 3 9 ) である。 小文字表記が変異 導入塩基を示している。
F遺伝子上に目的の変異を有する LitmusSall/Nhelfrg AM-GFPを Sall/Nhelで消化 して、 F遺伝子を含むフラグメント （9634 bp) を回収した。 一方で、 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した F欠失型センダイウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV18+/ Δ F-GF P： Li, H. - 0. et al.， J. Virol. 74， 6564-6569 (2000) , W000/70070) を Sail及 t ielで消化し NP遺伝子を含む断片 (8294bp) に、 合成オリゴ DNAを利用してマル チクロ一ユングサイトを導入したプラスミド （pSeV/ A SalINlieIfrg~MCS： PCT/JP0 0/06051) を、 Sail及ぴ Nhelで消化してフラグメント （8294bp) を回収した。 この 両フラグメントをライゲーションし、 F(MMP#2)、 F(MMP#3) 或いは F(MMP#4) の遺 伝子 （MMPで活性化されるようにデザィンした F遺伝子） を有する M欠失型 SeV cDNA (pSeV18+/F(M P#2) ΔΜ - GFP、 pSeV18+/F(MMP#3) ΔΜ- GFP或いは pSeV18+/F (匿 #4) ΔΜ-GFP) 、 及び F (uPA) の遺伝子 （uPAで活性ィ匕されるようにデザインした F遺伝 子） を有する M欠失型 SeV cDNA (PSeV18+/F (uPA) Δ -GFP) を構築した。
[実施例 1 7 ] Fの活性ィ匕部位を変換した M欠失型 SeVベクターの再構成と増幅 ウィルスの再構成は Liらの報告 （Li, H. -0. et al. , J. Virol. 74. 6564-6569
(2000) , W000/70070) に従って行った。 M欠失塑であるので、 M蛋白をトランスに 供給することが可能な上記のヘルパー細胞 （実施例 1 1 ) を利用した。 当該ヘル パー細胞作製には Cre/loxP発現誘導システムを利用している。 当該システムは Cre
DNA リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミ KpCALNdLw (Arai, T. et al.， J. Virol. 72： 1115 - 1121 (1988) ) を利用したも のであり、 同プラスミドのトランスフォーマントに Cre DNAリコンビナーゼを発現 する組み換えアデノウイルス （AxCANCre) を Saitoらの方法 （Saito, I. et al. , Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995)， Arai, T. et al. , J. Virol. 72， 111 5-1121 (1998)) で感染させて揷入遺伝子を発現させた （実施例 1 1および 1 2参 照） 。
Fの活性ィ匕部位を変換した M欠失型 SeVの再構成は以下のように行った。 LLC- MK2 細胞を 5 X 106 cells/dishで 100mmのシャーレに播き、 24時間培養後、 ソラレン （ psoralen) と長波長紫外線 （365nm) で 20分間処理した T7ポリメラーゼを発現する リコンビナントワクシニアウィルス （PLWUV- VacT7： Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986) ) を室温で 1時間感染させた （M0I 2) 。 細胞を無血清の MEMで洗浄した後、 プラスミド pSeV18+/F(MMP#2) ΔΜ- GFP ( 或いは pSeV18+/F(MMP#3) ΔΜ- GFP、 pSeV18+/F(MMP#4) ΔΜ- GFP、 または pSeV18+/F ( uPA) AM— GFP) , pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L (Kato, A. et al. , Genes cells 1， 5 69-579 (1996) ) 及び pGEM/F - HN (Li, H. -0. et al. , J. Virology 74. 6564 - 6569 (2000)， WO00/7OO70) をそれぞれ 12 μ §, 4/i g, 2 i g, 4μ g及ぴ 4μ gZdishの量 比で Opti- MEM (Gibco-BRL, Rockville, MD) に懸濁し、 1 g DNA/5 L相当の Sup erFect transfection reagent (Qiagen, Bothell, WA) を入れて混合し、 室温で 1 5分間放置後、 最終的に 3% FBSを含む Opti- MEM 3mLに入れ、 細胞に添加して培養し た。 5時間培養後血清を含まない MEMで 2回洗浄し、 40 §/ の Cytosine j3 -D~ar abinofuranoside (AraC： Sigma, St. Louis, MO) 及び 7. 5 μ g/mLの Trypsin (Gibe o-BRL, Rockville, MD) を含む MEMで培養した。 24時間培養後、 8. 5 X 106 cells/ dishあたりに M蛋白質を持続発現する細胞 （LLC- MK2/F7/M62/A) を重層し、 40 g/ mLの AraC及ぴ 7. 5 μ g/mLの Trypsinを含む MEMで更に 2日間 37°Cで培養した （P0) 。 これらの細胞を回収し、 ペレットを 2mL/dishあたりの Opti- MEMに懸濁した。 凍結融解を 3回繰り換えした後、 ライゼートをそのまま LLC- MK2/F7/M62/Aにトラ ンスフエクシヨンし、 40 μ g/raLの AraC：、 7. 5 μ g/mLの Trypsin及ぴ 50U/mLの collag enase type IV (ICN, Aurola, OH) を含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養し た （P1) 。 3〜1 4日後培養上清の一部をとり、 新たに調製した LLC-MK2/F7/Aに 感染させ、 40 / g/mLの AraC、 7. 5 /z g/mLの Trypsin及ぴ 50U/mLの collagenase type
IVを含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養した （P2) 。 3 ~ 1 4日後に新た に調製した LLC- MK2/F7/M62/Aに再度感染させ、 7. 5 g/mLの Trypsin及ぴ 50U/mLの c ollagenase type IV を含み血清を含まない MEMを用い 32°Cで 3〜 7日間培養した
(P3) 。 回収した培養上清に終濃度 1%になるように BSAを添加し- 80°Cにて保存し た。 保存ウィルス液を解凍し、 その後の生産及ぴ in vitro実験に供した。
また、 M蛋白をトランスに供給するヘルパー細胞として、 LLC - MK2/F7/M62に、 更 に同システム (pCALNdLw： Arai, T. et al. , J. Virol. 72： 1115—1121 (1988) ) の SeV-M遺伝子 （及ぴ SeV - F遺伝子） を導入し、 細胞のクローニングを継続するこ とで、 より高いタイターでの M欠失型 SeVベクターを調製可能なヘルパー細胞 （LL C - MK2/F7/M62- #33) の作出に成功した。 この細胞を用いて調製した場合、 F遺伝子 に変異を導入していない M欠失型 SeVベクター (SeV18+/ A M-GFP) を' 1 X 108 GFP-CI U/mL (GFP- CIUの定義は W000/70070に記載） 以上のタイターで調製することが可能 となった。 尚、 同細胞を利用した場合、 SeV18+/F ( MP#2) Δ Μ - GFP及ぴ SeV18+/F (uP A)厶 M - GFPの場合もともに 1 X 108 GFP - CIU/raL以上のタイターでの調製が可能であ つた。
同様の方法で再構成を行った場合、 SeV18+/F(MMP#3) ΔΜ- GFP及ぴ SeV18+/F(MMP# 4) ΔΜ - GFPについてはウィルス粒子を回収することが出来なかった。 これらのもの についてもウィルス粒子を回収するには、 更に再構成の条件を検討しなければな らないが、 同じ条件で回収出来なかったことから、 F (MMP#3)及ぴ F (MMP W)におい ては、 F1/F2開裂部位 （F蛋白の活性ィ匕部位） のデザイン上に問題があり、 例えば 開裂効率が悪！/、、 或いは開裂後の F蛋白の活性が弱！/、等の影響が出ている可能性が ある。 逆に、 F(MMP#2)のデザインで高タイターのウィルス粒子が回収できたこと から、 このデザインであれば、 開裂効率が良く、 開裂後の F蛋白の活性にも影響し ない良 V、デザィンであると考えられた。
[実施例 1 8 ] Fの活性ィ匕部位を変換した M欠失型 SeVベタターの in vivo用サン プル調製
in vivo検討用各 ¾M欠失型 SeVベクターの調製は、 超遠心でウィルス粒子を pell et downする簡易精製法で行った。 LLC-MK2/F7/M62- #33を 6 well plateでほぼコン フルェントに増殖した後、 AxCANCreを M0I 5で感染し、 感染後 32°Cで 2日間培養し た。 この細胞に SeV18+/F (ΜΜΡ#2) Δ M- GFP或いは SeV18+/ Δ Μ- GFPを ΜΟΙ 0. 5で感染し 、 SeV18+/F( MP#2) ΔΜ- GFPの場合は 7. 5 i g/mLの Trypsin及び 50 U/mLの collagenas e type IVを含み血清を含まない MEM (lmL/well) で、 SeV18+/ AM_GFPの場合は 7. 5 /^ g/mLの Trypsinのみを含み血清を含まない MEM (lmL/well) 中で、 3日間 32°Cで 培養した。 各 6well分をまとめて上清を回収後、 2, 190gで 15分間遠心し、 回収した 上清を内径 0. 45 /i mフィルターでろ過し、 更に 40, 000gで 30分間遠心した。 pellet を PBS 500 β Lで懸濁 L精製ウィルス溶液とした。 このようにして調製しこ M欠失型 SeVベタターのタイターは、 SeV18+/F (匿 #2) ΔΜ - GFP及ぴ SeV18+/ AM-GFPでそれぞ れ、 1. 3 X 109及ぴ 4. 5 X 109 GFP- CIU/mLであった。 実施例 1 7および 1 8で作製 したウィルスは F蛋白質が開裂されており感染性を有する。 このような SeVを F開裂 型 SeVまたは感染型 SeVと呼ぶ。 また、 以下 SeV18+/ Δ M- GFP、 SeV18+/F(MMP#2) Δ M-GFP、 及ぴ SeV18+/F(uPA) ΔΜ- GFPを、 それぞれ SeV/ AM_GFP、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ-G FP、 SeV/F(uPA) ΔΜ-GFP とも略記する。
[実施例 1 9 ] F改変 M欠失型 SeVベクターのプロテアーゼ依存的感染および細胞 融合型感染の評価方法
Exogenous experiment
細胞系に外からプロテアーゼを添加する感染手順を Exogenous experimentと呼 ぶ。 以下の実施例において行った exogenous experiment の基本的な手順を示す 。 これと異なる条件で行った場合はそれぞれの実施例において記載した。 96 well plate に LLC- M 2を confluent (5 X 105 cell/well) になるように培養した。 MEM で 2回洗浄後、 SeV [F開裂型： 1 X 105 CIU/mlもしくは F非開裂型： 1 X 107 particles /ml (HA換算；実施例 2 5参照） ] 含有 MEMを 50μ 1加え、 感染させた。 同時に同量 50^ 1のプロテアーゼ含有 MEMを加えた。 37°Cで培養した。 4日後、 蛍光顕微鏡に て感染のひろがりを観察した。 また、 1讓2の細胞あたりの GFPの発現している細 胞をカウントした。 プロテアーゼは、 collagenase (collagenase type IV) は IC N Biomedicals Inc社、 MMP2 (active MMP2) , MMP3, MMP7, MMP9 (active MMP9) 、 およびプラスミンは、 コスモバイオ社より購入して使用した。
Endogenous experiment
細胞系に外からプロテアーゼを添加せず、 細胞が発現するプロテアーゼにより 感染を成立させる感染手順を Endogenous experimentと呼ぶ。 以下の実施例におい て行った endogenous experiment の基本的な手順を示す。 これと異なる条件で行 つた場合はそれぞれの実施例において記載した。 96 well plate に各癌細胞を con fluent (5 X 105 cell/well) になるように: t養した。 MEMで 2回洗浄後、 SeV [F開 裂型： 1 X 105 CIU/mlもしくは F非開裂型： 1 X 107 HAU/ml (実施例 2 5参照） ] 含 有 MEMを 50 1カロえ、 感染させた。 この時、 培地には終濃度 1 %となるように FBSを 添加した。 4日後、 蛍光顕微鏡にて感染のひろがりを観察した。 また、 1讓 2の細 胞あたりの GFPの発現している細胞をカウントした。
[実施例 2 0 ] F改変 M欠失型センダイウィルスベクターによるプロテアーゼ依 存的細胞融合型感染 （Exogenous experiment)
プロテアーゼをほとんど発現していない LLC- MK2細胞を用いて、 Fの改変によつ てそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染が成立しているかを上記の Exogeneou s experimentにより確かめた （図 3 2 ) 。 SeV/ ΔΜ- GFP、 SeV/F (匿 #2) Δ Μ- GFP、 S eV/F (uPA) ΔΜ-GFPの 3種類の M欠失型の SeV (実施例 1 7 ) を細胞に感染させ、 同 時にそれぞれ ΟΛ μ g/ml の collagenase type IV (Clostridium histolyticum) , active MMP2, active MMP9, または uPA， あるいは 7. 5 g/ml Trypsin を加え た。 4日後、 蛍光顕微鏡で観察した。 Fを改変していない SeV/ Δ Μ - GFPは、 trypsin を加えた LLC- MK2でのみ、 感染した細胞の周りの細胞と細胞融合をおこし、 細胞融 合型感染がみられ、 多核細胞である synthitiumを形成した （図 3 2 L) 。 MMP分解 配列を F蛋白質に組み込んだ SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPは、 collagenase, active MMP2, active MMP9を加えた LLC- MK2で細胞融合型感染がみられ、 多核細胞である synthi tiumを形成した (図 3 2 E, F, M) 。 一方、 urokinase - type plasminogen activa tor (uPA) , tissue-type PA (tPA) 分解配列を F蛋白質に組み込んだ SeV/F (uPA) ΔΜ-GFPでは、 trypsin存在下で細胞融合型感染がみられ、 さらに F蛋白質を改変し たことによって uPAで多核細胞である synthitiumを形成した （図 3 2 Q, R) 。 こ れは、 それぞれのプロテアーゼ分解基質配列を F蛋白質に組み込むことによって、 M欠失型 SeVは、 その分解基質配列依存的に細胞融合型感染をして、 接している細 胞に感染が広がっていくことを示している。
[実施例 2 1 ] 癌細胞株の MMP発現特異的な細胞融合型感染 （Endogenous exper iment
MMP発現癌細胞株である HT1080 (ヒト線維芽肉腫） (Morodomi, T. et al. (199 2) Biochem. J. 285 (Pt 2) , 603 - 611) , tPA発現株である画 28 (ヒト胃癌細胞 株） (Koshikawa, N. et al. (1992) Cancer Res. 52, 5046-5053) ， どちらのプ 口テアーゼも発現していない細胞株 SW620 (ヒト大腸癌株） を用いて、 内在性のプ 口テアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうカゝ、 実施例 1 7で作製した S eVを用いて Endogenous experimentにより実験を行った。 これらの癌細胞のうち 、 MKN28は理ィ匕学研究所 （Cell No. RCB1000) より、 また HT1080 (ATCC No. CCL - 121) ， および SW620 (ATCC No. CCL- 227) , 並びに以下の実施例で使用する SW4 80 (ATCC No. CCL- 228) ， iDr (ATCC No. CCL- 218) , Pane- 1 (ATCC No. CRL- 14 69) は、 ATCC (American type culture collection) より分与されたものを用い た。 培地はそれぞれ分与先で用いられている培地を用いた。 この時、 全ての培地 に終濃度 1 %となるように FBSを添加した。 図 3 3で示すように、 MMP発現株 HT108 0では SeV/F(MMP#2) ΔΜ-GFPのみ 10倍以上その感染がひろがつていて、 tPA発現株 MK N28では SeV/F(uPA) ΔΜ- GFPのみが細胞融合型感染のひろがりがみられる。 どちら のプロテアーゼの発現もな 、STO20では全く感染のひろがりはみられない。
[実施例 2 2 ] Phorbol Esterでの MP誘導による細胞融合型感染
癌細胞はその周りに存在する増殖因子などによって生体内では MMPが誘導されて いることが報告されている。 その現象は Phorbol Esterである phorbol 12-myrista te 13- acetate (PMA) によって in vitroで再現することが可能である。 この MMP発 現の誘導が再現された条件における感染を調べるために、 PMAによつて MMP2の活性 化と MMP9の誘導が知られている Pane I (膝臓癌株） を用いて、 F改変 M欠失型 SeVベ クタ一の細胞融合型感染の有無を調べた （Zervos, E. E. et al. (1999) J. Surg. Res. 84， 162-167)。 96 well plate に Panelおよび他の癌細胞株を confluent (5 X 105 cell/well) になるように培養した。 実施例 1 7で作製した SeVを用いて Endogenous experimentにより実験を行った。 MEMで 2回洗浄後、 Moi=0. 01になる ように 1 X 105 CIU/mlの SeV含有 MEMを 50 μ 1カ卩え: 感染させた。 同量 50 μ 1の 40 ηΜ phobol 12-myristate 13- acetate (Sigma) を含む MEMを加えた。 この時、 培地に 終濃度 1 %となるように FBSを添加した。
MMP2, 9の誘導発現は gelatin分解活性がある部分が白くぬける gelatin zymogra phy法 （Johansson, S.， and Smedsrod, B. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4363-43 66) によって確認した。 具体的には、 それぞれの培養の上澄みをとり、 Sample bu fferで溶解した。 最終濃度が 1 mg/ml gelatinとなるようアクリルアミドに混合し 、 8% acrylamide gelを作製した。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、 10 mM
Tris pH 8. 0， 2. 5% Triton X- 100で洗浄した。 Gelatinase活性化バッファー （50 mM Tris, 0. 5 mM CaCl2, 10— 6 M ZnCl2) で 37。C 1日培養後、 1%クマジプルー R - 25 0、 5%酢酸、 10°/。メタノールで染色した （図 3 4上パネル） 。 Cが対照 （control) ，
Tが 20 nM PMAによって誘導された上澄みを用いたもので、 ΗΠ080と Pane Iで MMP9 が誘導されていることがわかる。 Pane Iで誘導前に潜在型の MMP2が検出されてい るがそれは潜在型で gelatin分解活性はほとんどないことが知られている。 図 3 4
(下パネル) が示すように、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPに感染した Pane Iは、 MMP誘導 によつて細胞融合型感染がみられるようになることが示された。
[実施例 2 3 ] In vivoにおける HT1080細胞株感染 SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPのひろ がり
HT1080の担癌ヌードマウスを作製した。 BALBん nude mouse (charles river) の右背部の皮下にヒト線維芽腫 HT1080を 5 X 106 cell (1 X 108 cell/ml を 50 μ 1) 注入した。 7〜9日後に長径が 3 mmを越えた個体を用いた。 癌を楕円形とみなした 体積は 30〜； 100 mm3 となり、 そこに以下の F開裂型 SeVを 50 μ 1癌部位に 1度だけ注 入した： MEM (対照） （N=5) ， SeV-GFP (1 X 108 CIU/ml) を含む MEM (N=5) , SeV /厶 M - GFP (1 X 108 CIU/ml) を含む MEM (N=7) , SeV/F (MMP#2) ΔΜ- GFP (1 X 10s CIU /ml) を含む MEM (N=7) 。 2日後、 蛍光顕微鏡にて観察した （図 3 5 ) 。 SeV- GFP 、 SeV/ ΔΜ-GFPは注入したまわりのみ蛍光がみられることが確認できる （図 3 5 E , H) 。 それに対して SeV/F (匿 #2) ΔΜ - GFPでは癌全体に広がることが観察された
(図 3 5 K) 。 拡大したものでは、 SeV- GFP、 SeV/ ΔΜ- GFPが細胞 1つ 1つの蛍光 が確認されるのに対して、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPでは細胞の形がはっきりせず細胞 融合していることを示唆している。 また、 上部から写真の像における癌全体およ ぴ GFPの発現の面積を NIH image によってもとめた。 癌全体に対する GFP発現領域 の割合は、 SeV - GFPが 10%、 SeV/ ΔΜ - GFP力 ½0%であるのに対して SeV/F(M P#2) ΔΜ-G FP投与では 90%の感染がみられ、 明らかな感染の広がりが確認された （図 3 6 )。 癌以外の組織に関しては、 癌細胞との境界に存在する筋膜及び皮下の結合組織に 対して細胞融合型感染はほとんど観察されず、 この条件では癌以外の正常組織に は感染は広がらないと判断された。
[実施例 2 4 ] 担癌ヌ一ドマウスによる F改変 M欠失型 SeVベタタ一の抗腫瘍効果 図 3 5と同様に HT1080担癌マウスを作製した。 8または 9日後、 腫瘍径が 3mra以上 の個体を選択し、 以下の 4群の F開裂型 SeVを 50 1癌部位に注入した： MEM (N=5) , SeV-GFP (1 X 108 CIU/ml) を含む MEM (N=5) , SeV/ AM-GFP (1 X 108 ClU/mlを含 む MEM (N=7) , SeV/F(MMP#2) ΔΜ-GFP (1 X 108 CIU/ml) を含む MEM (N=7)。 2日 後、 もう一度同量の SeVを癌部位に注入した。 癌部位の大きさの長径 (a) 、 短径 (b) 、 厚み （c) を 1日おきに計測した。 腫瘍体積は、 楕円形とみなし、 腫瘍体 積 V= 7c /6X abcで計算した。 PBS, SeV-GFP, SeV/ AM-GFPは急速に癌が大きくなる のに対して、 図 3 7で示したようにベクターが癌全体に広がっていた SeV/F(MMP#2 ) ΔΜ-GFP投与癌は明らかに増殖せず小さいままであった。 t検定による有意差検 定でも Pく 0. 05で有意に他の 3群と比較して小さいことが判明した。 これは治療遺 伝子を搭載していないにもかかわらず、 その抗癌効果があることが示している。
[実施例 2 5 ] F非開裂/ F改変 M欠失型 SeVベクターの作製と選択的感染 上記で用いた通常の SeVベクターの作製には Fの開裂を起こさせるために 7. 5 μ g/ mlの高い濃度のトリプシンおょぴ 50U/mlの collagenaseがはいった培地で培養、 回収し、 F開裂型 SeVベクターとした （実施例 1 7および 1 8参照） 。 ここでは、 感染時のプロテアーゼ依存的な遶択を実現するため、 作製時にプロテア一ゼを加 えずに SeVを回収し、 F非開裂型 SeVを作製した。
具体的には、 10cm dishに LLC- MK2/F7/M62/A細胞を confluentに培養した。 実施 例 1 7で調製した各 F改変 M欠失型 SeVを Moi=5になるように感染させた。 1時間後 、 上澄みを取り 2回 MEM培地で洗浄した。 4ml MEMを加え 32°Cで培養した。 5日後 、 上澄みを回収し、 最終濃度が 1°/。になるように Bovine Serum Albumin (BSA) を カロえた。 HAU titerを測定後、 使用まで- 70°Cで保存した。 それぞれの F改変 M欠失 型 SeVは 27〜21β HAU/ml (1 HAU = 1 X 106 particles/ml のウィルス粒子に換算さ れるので 1 X 108〜1 X 109 particles/ml に相当する） の間で回収され、 希釈によ り 1 X 108 particles/ml にあわせた。
Exogeneous experimentの結果、 LLC- MK2への感染が、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ- G Pは、 MP依存的に、 SeV/F(uPA) ΔΜ-GFPは、 uPAまたは tPA依存的に感染するベクターが 作製できたことが確認された （exogeneous proteaseのデータは示さない） 。 MMP 発現株 HT1080, tPA発現株 MKN28, プロテアーゼをほとんど発現していない SW620で 、 プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどうかを endogenous experimentに より試みた （図 3 8 ) 。 SeV/F(MMP#2) ΔΜ-GFPは匿発現株 HT1080で感染がみられ るが、 tPA発現株 MKN28では、 感染がみられない。 SeV/F(uPA) AM~GFPは、 tPA発現 株 MKN28では感染がみられるが、 MMP発現株 HT1080では感染がみられない。 このよ うにプロテア ゼ発現依存的にそれぞれの SeVが感染の選択性が示された。
[実施例 2 6 ] Human fibroblastによる匿 3， MMP7誘導による F改変 M欠失型 SeV ベクターの感染
SW480および WiDrは fibroblastと共培養、 もしくは in vivoでの培養によってそ れぞれ MMP3, MP7が誘導されることが示されている （Kataoka, H. et aL (1997)
Oncol. Res. 9, 101-109； Mc Donnell, S. et al. (1999) Clin. Exp. Metastas is. 17, 341-349) 。 これらの細胞を使って in vivoで F改変 M欠失型 SeVベクターの 感染が変化するかどうか調べた。 96 well plate にそれぞれの癌細胞株を conflue nt (5 X 104 cell/well) に ¾るように培養した。 MEMで 2回洗浄後、 1 HAU/ml ' (1
HAU=1 X 106 particles/ml のウィルス粒子に換算して 1 X 106 particles/ml) の!7 非開裂型 SeV含有 MEMを 50 1加え、 感染させた。 5 X 104 cell/well になるように Normal human lung fibroblast (TAKARA) を加え、 4日間 37°Cで培養した （図 3 9 ) 。 SW480および WiDrは、 ともに human fibroblastを co- cultureすることによって 、 SeV/F(MMP#2) AM- GFPが感染するようになった。 誘導のかからない SW620ではそ の現象はみられない。
[実施例 2 7 ] ヒ ト大動脈平滑筋細胞への F改変 M欠失型 SeVべクターの匿選択 的感染
MMPの発現異常の疾病は癌以外にも動脈硬化、 リュウマチ、 創傷治癒などで報告 されている （Galis, Z. S.， and Khatri, J. J. (2002) Circ. Res. 90, 251—262; artel-Pelletier, J. et al. (2001) Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. 15, 805-829) 。
これらの疾患への応用の可能性を示すため、 ヒト大動脈平滑筋細胞への F改変 M 欠失型 SeVベクターの MMP選択的感染を試みた。 96 well plateに human smooth m uscle cell (TAKARA) を confluent (5 X 105 cell/well) になるように培養した。 MEMで 2回洗浄後、 SeV (F非開裂型： 1 HAU/ml (1 X 106 particle/ml) 含有 MEMを 5 Ομ ΐ力 tlえ、 感染させた。 同量 50 μ ΐのプロテアーゼ含有 MEMを加え、 4日間 37°Cで培 養した。 1mm2の細胞あたりの GFPの発現している細胞をカウントした （図 4 0 ) 。 SeV/ AM-GFPでは trypsinを加えることによってのみ感染が宂進したのに対して 、 SeV/F(MMP#2) ΔΜ- GFPでは collagenase, MMP2, MMP3, MMP9でその感染が亢進し た。
[実施例 2 8 ] F改変 M欠失型 SeVベクターのプロテアーゼ依存的 Fの開裂 実施例 2 0で F改変 M欠失型 SeVベタターは、 それぞれのプロテアーゼ分解配列を Fタンパク質に組み込むことによって、 M欠失型 SeVは、 その分解配列依存的に細胞 融合型感染をすることを示した。 さらに改変後にプロテアーゼ依存的に F0の開裂 が起こっているかどうかウェスターンプロッティングによつて確かめた。 ウ^ル スのサンプリングは以下の方法で行った。 SeV/ ΔΜ, SeV/F (MMP#2) ΔΜ, SeV/F (uPA ) ΔΜの 3種類のウィルス粒子を M0I=3で Mタンパク誘導したヘルパー細胞に感染さ せた。 感染 2日後、 上澄みを回収し、 xl8500 gで 3時間遠心し、 その沈殿物を PB Sで再けん濁した。 それぞれのウィルス懸濁液に 7. 5 g/ml トリプシン、 O. l ng/m 1 MMP9, 0. 1 ng/ml uPAの最終濃度になるようにプロテアーゼを添加し、 37°C、 30 min処理後、 サンプルバッファーを加え、 SDS-PAGEサンプルとした。 SDS-PAGE及 ぴウェスターンプロッティングは定法に従って行った （Kido, H. et al. Isolati on and characterization of a novel trypsin— liKe protease found in rat bro nchiolar epithelial Clara cells. A possible activator of the viral fusion glycoprotein. J Biol Chew 267, 13573-9 (1992) ) 。 抗 Flゥサギ抗体は 3つの混 合合成ペプチド （FFGAVIGT+Cys : 117—124， EAREAKRDIALIK: 143 - 155, CGTGRRPISQ DRS: 401-413； それぞれ配列番号： 4 6、 4 7、 4 8 ) を免疫し抗血清を得た。
2次抗体には HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 (ICN, Aurola, 0H) を用い、 発色の検出に はィ匕'乎资光？ S (ECL Western blotting detection reagents; Amersham Bioscienc es. Uppsala, Sweden) を用いた。 図 4 1には、 Fを改変していない M欠失型 SeVベ クタ一 （1, 4, 7, 10) , Fに匿 #2配列を揷入した M欠失型 SeVベクター （2， 5， 8, 11)、 Fに uPA配列を揷入した M欠失型 SeVベクター （3， 6, 9, 12) を上記のプロテ ァーゼで 37°C、 30分間処理したときの結果が示されている。
図 4 1から分かるように、 トリプシン存在下では Fを改変していない M欠失型 SeV ベクターで、 MMP存在下では Fに MMP#2配列を揷入した M欠失型 SeVベクターで、 u PA存在下では Fに uPA配列を挿入した M欠失型 SeVベクターで、 それぞれ揷入したプ 口テアーゼ基質に従って、 F1への開裂が起こっていた。 ここには示さないが uPA配 列を挿入した M欠失型 SeVベクターにおいてはトリプシン存在下で、 その分解時間 を 4時間にすると F1への開列が見られた。 これは実施例 2 0の結果と合致し、 Fの 開裂依存的にシンシチゥムの形成がおきていることが示された。
[実施例 2 9 ] Fの細胞貪ドメィン欠失による融合能の上昇 ' パラミクソウィルスによる宿主への侵入はウィルスの膜と宿主側の細胞膜の融 合によって成立する。 その侵入機構はセンダイウィルスの HNタンパクが宿主側の シアル酸に結合し、 Fタンパクが細胞膜の融合を起こす。 その際、 Hの結合によつ て Fのコンフオメーシヨンが変わることが重要であるとされている （Russell, C. J .， Jardetzky, T. S. & Lamb, R. A. Memorane fusion machines of paramyxovirus es : capture of intermediates of fusion. Embo J 20， 4024-34 (2001) ) 0 その ため、 ほとんどのパラミクソウイルスの Fタンパクは単独で細胞に発現させても細 胞同士の融合能がなく、 HNを同時に発現した細胞のみ融合能を持つ。 パラミクソ ウィルスにおいて Fおよび HNの細胞質ドメイン （cytoplasmic domain) を削るとそ の融合能が上昇する事が知られている （Cathomen, T. , Nairn, H. Y. & Cattaneo, R. Measles viruses with altered envelope protein cytoplasmic tails gain c ell fusion competence. J Virol 72, 1224 - 34 (1998) ) 。 センダイウィルスにお いて、 どの Fの細胞質ドメィンの欠失変異体が融合能を最もよく上昇させるかを、 欠失変異体を作製し、 pCAGGS発現ベクター （Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108：
193-199) に搭載した後、 pCAGGS搭載 HNを同時にトランスフエクシヨンし、 その 融合能をシンシチウムの数によって確認した。
Fの cytoplasmic domainを削った変異体遺伝子は、 以下のプライマーによって、 それぞれ PCRを行い、 断片を Xho I， Not I処理後、 pCAGGSベクターにライゲーシ ョンした。 Fct27 primer (5' - CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA - 3' /配列番号： 4 9 , 5， -ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3' /配列番号： 5 0 )， Fct 14 primer (5' - CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA - 3' /配列番号： 5 1， 5' -ATAGT TTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC - 3， /配列番号： 5 2 )， Fct4 primer (5， - C CGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3' /配列番号 : 5 3 , 5' -ATAGTTTAGCGGCCGCTCAC CTTCTGAGTCTATAAAGCAC- 3' /配列番号： 5 4 ) (Kobayashi M et al. J. Viol. , vol
77: 2607, 2003)。
細胞融合能の測定のため、 LLCMK2もしくは ΗΠ080細胞を 24ゥヱルプレートへ con fluent になるようにまいた。 50 // I Opt i- MEMに対して 3 1 Fugene6を混合した。 各 pCAGGS発現プラスミドを 2 μ gと等量の pCAGGS/EGFPを混合後、 Opti - MEMと Fugen6 の混合液に加えた。 室温で 15分間放置後、 500 /x l MEM培地に培地交換した 24ゥェ ルプレートへ添加した。 37。C, 5%C02で 3時間培養後、 HT1080の場合 1% FBS添加 M EM, LLCMK2の場合 7. 5/ g/ml Trypsinもしくは指定された濃度の collagenase type
IV (Clostridium) を添加した MEM培地へ置換した。 48時間培養後、 倒立顕微鏡の 100倍視野あたり（0. 3 cm2)の融合したシンシチウムの数をカウントした。 もしく は 4% Paraformaldehyde固定を 2時間後、 70%エタノール， 蒸留水置換後、 5分間 hematoxylin染色を行った後、 水洗し、 シンシチウムを形成している 0. 3 cm2当た りの核の数を力ゥントした。
3種類の Fの細胞質ドメインの欠失させたアミノ酸配列を図 4 2 (A)に， その融 合活性を図 4 2 (B)に示す。 図 4 2 (B)で示すように、 F単独では融合した細胞はな いが、 H を共トランスフヱクシヨンすることによって融合能を示した。 また、 細 胞質ドメィンが 14ァミノ酸になるように 28ァミノ酸を削った配列の Fタンパク質 （ Fctl4) が最もその融合能が高いことが明らかになった。
[実施例 3 0 ] F/HNキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させる
パラミクソウィルスのエンベロープタンパクは、 細胞膜上で Fは 3量体で、 HNは 4量体を形成しており、 お互いの外部ドメイン （Ectodomain) および Mタンパク質 を介して相互作用していることが明らかになつている （Plemper, R. K. , Hammond,
A. L. & Cattaneo, R. Measles virus envelope glycoproteins hetero—o丄 igomer lze in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 276, 44239-46 (2001) ) 。 図 4 2で示したように Fは単独では融合能をもたず、 HNが必須である。 このことより Fと Hのキメラタンパクを作製し、 同じ細胞膜上に同時に融合タンパクとして Fと H Nを発現させることによって、 より融合能の高いベクターの作製を試みた。 Fは II 型の膜タンパクであり、 HNは I型の膜タンパクであることより、 図 4 3 (A)で示す ように、 2つの膜貫通ドメィ'ンを持つ細胞膜上で U字型を形成するようなキメ 9タ ンパクを作製した (Fctl4/HN)。 Fタンパクは融合能の高かった Fctl4を用いた。 同 時にその 2つのタンパクの間に 50アミノ酸からなるリンカ一配列を挿入した （Fct 14/Linker/HN)。 このリンカ一配列は現在の検索ではどのタンパクにもホモロジ一 を持たない酉己歹 Ijである。 (Simian immunodeficiency virus (SIVagm) の envの cyt oplasraic domainのァミノ酸配列の N末端と C末端を逆にして合成した non-sense な 配列を用いた。 ）
F/HNキメラタンパク遺伝子の発現プラスミドの調製方法の詳細を以下に示す。 F /HNキメラタンパク遺伝子を pCAGGSベクタ一に搭載した。 F遺伝子及ぴ HN遺伝子に ついてそれぞれ PCRを行い、 2つの断片を pCAGGSにライゲーシヨンした。 この時、 F/HN遺伝子間に 150 b のリンカ一遺伝子 (50 amino acid) を揷入したもの、 し ないものを作製した。 以下にプライマーの配列を示す。 F遺伝子プライマー (F - F: 5， -ATCCGAATTCAGTTCMTGACAGCATATATCCAGAG- 37配列番号： 5 5 ; Fctl4- R: 5' -AT CCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3' /配列番号： 5 6 )、 Linker/HN遺伝子プ ライマー （Linker— HN—F： 5' -ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAG CMCGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCC ATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3' /配列番号： 5 7 , HN-R: 5' -ATCCGCGGCCGCT TMGACTCGGCCTTGCATM - 37配列番号： 5 8 ) , HN遺伝子プライマ （5' -ATCCGCGGCCG CAATGGATGGTGATAGGGGCA-3' /配列番号： 5 9 , 5' -ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGC A - 3' /配列番号： 6 0 )。
図 4 3 (B)で示すようにリンカー配列のないキメラタンパクでは低い融合能を示 すのに対してリンカーを揷入することによって Fと HNを同時にトランスフエクショ ンすることに比べて約 5倍その融合活性が飛躍的に上昇することが判明した。
[実施例 3 1 ] 融合能の機能維持と基質特異性
Fタンパク質が融合能を獲得するためには、 HNが同時に発現するだけではなく、 プロテアーゼによって Fタンパク質が 2つのサブユニット （Fl， F2) に開裂するこ とが不可欠である。 図 4' 2および 4 3ではトリプシン存在下での融合能を ¾定し ており、 トリプシンがない状態では全く融合能がない。 図 4 3で示した Fctl4/Lin ker/HNキメラタンパクが MMP依存的に融合能を獲得するように、 Fの開裂配列の改 変を試みた。 匿の分解基質の配列については多くの報告があり、 その中から 8種 類の配列に対して改変を試みた。 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit ( Stratagene, La Jolla, CA) によって図 4 4 (A)のように開裂部位のァミノ酸配列 を改変した。 この改変で考慮したことは、 プロテアーゼによる切断後の Fusion pe ptideの配列である。 パラミクソウィルスの Fタンパク質の F1の N末端領域は Fusion peptideと呼ばれ、 その融合活性に重要であり、 その領域のアミノ酸の変異が、 F タンパク質の融合能を消失する場合があることが報告されている （Bagai, S. & L amb, R. A. A glycine to alanine substitution in the paramyxovirus SV5 fusi on peptide increases the initial rate of fusion. Virology 238, 283-90 (19 97) ) 。 そのため重要性が指摘されている Flの N末端領域配列はそのまま残存させ ることにした。 その場合も、 MMPの分解基質として一般的な 6残基配列を導入する 場合には、 M Pによる分解後に F1の N末端に 3残基が付加されるデザインとなり、 M MPによる分解は起こったとしても、 F蛋白の融合能に影響を与える可能性があると 推測された。 則ち、 匿依存的に開裂し活性ィ匕する F蛋白のデザインを行うには、 M MPによる基質特異性と共に、 開裂後の F蛋白の融合能の保持という 2点を考慮して デザィンを行うことが必須である。
MMP#1は最も MMPの合成基質としてよく知られている配列である。 この配列はそ の他の MMPによるターゲッティングにも用いられている配列である。 MMP#3およぴ# 8も合成基質として市販されている配列である。 MMP#2， 6は、 MMP2, 9の分解基質 P LGM Sの配列をファージディスプレイ （phage display) で明らかになった MMP9に 対するコンセンサス配列 Pro- X- X- Hy- (Ser/Thr) にしたがって PLGMTS, PQGMTSと 改変した （それぞれ配列番号： 6 1および 6 2 ) 。 匪 P#5は Shneiderらの報告 （Am erican Society of Gene therapy, Annual meeting No. 1163 2002, Boston) よ り PQGLY (配列番号： 6 3 ) とした。 MMP#4は分解後の Fusion peptideの配列が改 変されない。 MMP#7は MMP2に対する phage displayで明らかになった配列である。 以下に、 F/HN融合遺伝子の Fの活性化部位を改変した発現プラスミドの調製の詳 細を示した。 F/HNife合遺伝子を構築後、 pBluscript F/HN上で、 Fの活性化部位の 変異を導入した。 変異の導入には、 QuikChange™ Site - Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) を利用して Kitに記載の方法に従って行った。 変異 導入に使用した合成オリゴの配列は、
F(MMP#1)： (5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGT GC TGTGATTGGTACTATCG-3> /配列番号： 64, 5， -CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaa C ccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3> /配列番号： 65) 、
F (MMP#2)： (5， -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCT GTGATTGGTACTATC-3' /配列番号： 32, 5， -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCa tGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3， /配列番号： 33) 、
F (MMP#3)： (5， -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCT GTGATTGGTACTATCG- 3， /配列番号： 34, 5' -CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCc cCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGAQlG- 3'/配列番号： 35),
F( MP#4)： (5' -CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3' /配列番号： 36, 5'- ；^¾じ八0€八(^& & 1：((^& 0§666& 6じ八( ¾6じ八1 "^¾-3'/配列番号： 37)
F (MMP#5)： (5， -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcagggCttGtatgctTTCTTCGGTGCT
GTGATTGGTACTATC-3' /配列番号： 66， 5' -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcataCa aGccctgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG- 3，/配列番号： 67)
F(MMP#6)： (5， -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcaaggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCT
GTGATTGGTACTATC-3' /配列番号： 68， 5' -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAA aCTCGt
CatGccttgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3' /配列番号： 69)
F(MMP#7)： (5， - CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCctTgcTtaCtataCGgctTTCTTCGGTGC
TGTGATTGGTACTATC- 3， /配歹 lj番号： 70， 5， -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcCGt ataGtaAgcAagGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3' /配列番号： 71)
F (MMP#8)： (5， -CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCttGgCGAGaTTCTTCGGTGCT
GTGATTGGTACTATC-3' /配列番号： 72， 5， -GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAtCTCGcC aaGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3' /配列番号： 7 3 ) 小文字表記が変異導入塩基を示している。 改変後、 EcoRIで切り出し、 pCAGGSへ ライゲーションを行った。
それぞれの配列を有するベクターと EGFP遺伝子を有するベクター （pCAGGS/EGFP ) を等量混合し、 MMPを高発現している HT1080にトランスフエクシヨンした。 その 結果、 MMP#2及ぴ #6の配列の遺伝子を導入した時のみ細胞融合が生じ、 シンシチウ ムを形成した （図 4 (B) ) 。 これらの配列に共通であるのは、 プロテアーゼによる 切断後、 F1タンパクの N末端に Hy - S/T-S/T配列 (MTS) が付加されることである。 このことより Hy-S/T - S/T配列 （特に MTS配列） の付加であれば、 HT1080由来の匿 による F蛋白の切断と共に、 開裂後の F蛋白の融合能が保持されており、 これら両 者の必要条件を満たしている可能性が高いと考えられる。 一方、 MMP#1, #3, #4, #5, , #7, および #8の場合、 細胞融合が全く見られなかった。 匿 #4を除くすべて の配列は MMPの合成基質由来の配列なので protease による切断は生じていると予 想されること力 ら、 F1に付加された 3ァミノ酸のぺプチドが切断後の Fタンパクの 活性を限定している可能性が示唆された。 また、 MMP#4についてはこの条件ではプ 口テアーゼによる切断そのものが生じていない可能性が高い。 その根拠として、 データは示さないが、 HT1080の Phorbol esterによる匿の誘導によって MMP#4がシ ンシチウムの形成がみられるようになることでも明らかである。
さらにこの MMP#2, #6の配列の融合能の比較とともに #6の Fusion peptide配列の N末端側から 7番目と 12番目の配列を Gから Aへ改変した配列にっ 、て MMP濃度依存 的な細胞融合能を測定した（図 4 5 )。 この F/HN融合遺伝子の変異導入に使用した 合成オリゴの配列は、 5， -CTTCGGTGCTGTGATTGcTACTATCGCACTTGcAGTGGCGACATCAGCA C- 3， （配列番号'： 7 4 ) および 5，- GTGCTGATGTCGCCACTgCMGTGCGATAGTAgCMTCACA GCACCGAAG-3' (配列番号： 7 5 ) である。 小文字表記が変異導入塩基を示してい る。 発現プラスミドの調製は上記と同様に、 変異を導入後に EcoRIで切り出し、 PC AGGSヘラィゲーションすることにより行なった。 その結果、 MMP#6の方が MMP#2に比較して、 2-3倍融合能が高いことがわかった。 重要な点は MMP#6の場合、 低濃度のプロテアーゼ濃度条件下でも細胞融合が生じ、 低濃度での Fタンパクの活性ィ匕が実現していることである。 し力 しながら、 Fタン パクの融合能の上昇する変異として報告されている Gから Aへの変異 （Peisajovich , S. G. , Epand, R. F.， Epand, R. M. & Shai, Y. Sendai virus N - terminal fusio n peptide consists of two similar repeats, both of which contribute to me mbrane fusion. Eur J Biochem 269, 4342-50 (2002) ) をさらに導入した場合 (# 6G12A) 、 融合能が 1 0分の 1以下に減少してしまった。 これらの結果より、 プロ テアーゼによるトロピズムの改変のためプロテアーゼ分解配列を単に揷入するだ けでは Fタンパクの活性を維持することができず Fusion能を失う場合が多いことが 明らかになった。 目的とする分解配列を導入する場合、 この系を用いて融合能の 確認を行レ、ウィルスを構築することが可能である。 また、 この pCAGGSに搭載した F ctl4/Linker/HNのキメラ遺伝子のみで顕著な融合活性を示すことより、 このプラ スミ ド導入による抗癌効果があること推測される。 さらに、 このキメラタンパク を M欠失型センダイゥイノレスへ搭載することによってさらなる抗癌効果の上昇が期 待される。
[実施例 3 2 ] 融合能を上昇させた改良型 F改変 M欠失型 SeVゲノム cDNAの構築 実施例 2 9および 3 0において pCAGGSベクターに搭載した Fを改変することによ つて融合能が上昇することを示したが、 同様の改変を M欠失型センダイウィルスべ クタ一に行うことによって、 融合能を上昇させた改良型 F改変 ΔΜ SeVの作製を試 みた。 改良型 FS c変 M欠失型 SeVゲノム cDNAの遺伝子構築を以下の方法で行った。 Se V/F(MMP#6) ΔΜ- GFPに関しては、 実施例 1 6と同様の方法で行った。 F遺伝子への 変異導入は配列番号： 69のオリゴヌクレオチ を用い、 LITMUSSall/NhelfrgAM - G FP上で QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Lajolla, CA) を利用して Kit に記載の方法に従って行った。 変異を導入した LITMUSSall/Nhelf rg AM - GFPの Sal I， Nhe I 消化後のフラグメントと F欠失部位に EGFP遺伝子を搭 載した F欠失型センダイウィルス全長ゲノム cDNA (pSeV+18/F - GFP:Li, H et al J. Viol. 74, 6564-6569 (2000) , W0000/70070) の Sal I及び Nhe Iで消化した NP遺伝 子を含むフラグメントをライゲーションし、 SeV/F(MMP#6) ΔΜ- GFPの cDNAを構築し た （図 4 6 )。 Fタンパク質の細胞質ドメインの 28アミノ酸を欠失させた M欠失型セ ンダイウィルス （SeV (TDK) /Fctl4(匿 #6) ΔΜ- GFP) および F/HNキメラタンパクを 搭載した M欠失型センダイウィルス（SeV (TDK) I Fctl4 (MMP#6) /Linker/HN Δ M- GFP) の構築はマルチクローニングサイトセンダイウィルス cDNA (pSeV(TDK)と称す） （ 特開 2002-272465) を基本骨格とした。 Fタンパク質の細胞質ドメィンを trancate した M欠失型センダイウィルス SeV(TDK) /Fctl4 (MMP#6) ΔΜ-GFPは以下のように構築 した。 TDKを骨格にするため、 まず pSeV(TDK) / AM-GFPを作製した。 LITMUSSall/Nh elfrgAM-GFPを錶型にして合成プライマー （Nhe- GFP- F: ATCCGCTAGCCCGTACGGCCAT GGTGAGCAAG (配列番号： 94) と GFP - EIS-BssHII ： ATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCA CCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC (配列番号： 95) ) を使って PCR によつて増幅した GFP/EIS (転写開始終結シグナルをコードする EIS配列を付加し た GFP)とマルチクローニングサイトセンダイウィルス cDNAを N el， BssHII処理を し、 フラグメントを ライゲーシヨンすることによって Mタンパクを GFPに置換し、 pSeV (TDK) I Δ M-GFPを作製した。
さらに実施例 31で作製した pCAGGS/Fctl4 (MMP#6) /Linker/HNを,にして合成プ ライマー Mlv- F: ATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG (配列番号： 96) 、 及ぴ Fctl 4-EIS-Sal I : ATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTAACGGTCATCT G GATTACC (配列番号： 97) を使つて PCRによつて増幅した Fctl4 (MMP#6)を F遺伝子の 力わりに Fの位置に挿入、 置換し、 pSeV(TDK) /Fctl4 (MMP#6) ΔΜ-GFPを構築した （ 図 4 6 )。 次に、 F/HNキメラタンパクを搭載した M欠失型センダイウィルス （PSeV ( TDK) /Fctl4 (MMP#6) /Linker/HN Δ M-GFP) の構築を行った。 GFPを錶型にして合成 プライマー （Nhe-GFP - F: ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG (配列番号： 98) と GFP-EIS-Sal I ： ATCCGCTAGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTA CTTGTACAGCTCGTC (配列番号： 99) ) を使って PCRによって増幅した GFP/EISとマル チクロ一ユングサイトセンダイウィルス cDNAを Nhe I， Sal I処理をし、 フラグメ ントを ライゲーシヨンすることによって M遺伝子および F遺伝子を欠失させ、 GFP に置換した、 pSeV (TDK) / ΔΜΔ F- GFPを作製した。 さらに実施例 31で作製した Fctl4 (MMP#6) /Linker/HNを铸型にして、 合成プライマー (F/HN5， Nhe-F: ATCCGCTAGCAGT TCAATGACAGCATATATCCAGAG (配列番号： 100) , F/HN3' Nhe-EIS-R: ATCCGCTAGCACG ATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA (配列番号： 101) )を 使つて PCRによつて増幅した Fctl4 (MMP#6) /Linker/HNを上記の pSeV (TDK) / Δ Μ Δ F- G FPの Nhe I部位にラィゲーションすることによつて pSeV (TDK) /Fctl4 (MMP#6) /Linke r/HN Δ M-GFPを構築した。
[実施例 3 3 ] 改良型 F改変 M欠失型センダイウィルスの再構成と増幅
実施例 3 2で構築した cDNAからのウィルスの再構成は Liらの報告 (Li, H. -0. e t al. , J. Virology 74. 6564-6569 (2000) , WOOO/70070) に従って行った。 しか し、 実施例 1 7と同様に M欠失型であるので、 M蛋白をトランスに供給することが 可能なヘルパー細胞 （実施例 1 1 ) を利用した。 ヘルパー細胞作製には Cre/loxP 発現誘導システムを利用している。 当該システムは Cre DNA リコンビ^ "一ゼによ り遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミド pCALNdLvr (Arai, T. e t al. , J. Virol. 72: 1115-1121 (1988) ) を利用したものであり、 同プラスミド のトランスフォーマントに Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイ ルス （AxCANCre) を Saitoらの方法 (Saito, I. et al. , Nucl. Acid. Res. 23, 3 816-3821 (1995) , Arai, T. et al.， J. Virol. 72, 1115—1121 (1998) ) で感染 させて挿入遺伝子を発現させる。 Fの活性ィ匕部位を変換した M欠失型 SeVの再構成は 以下のように行った。 LLC- MK2細胞を 5 X 106 cells/dishで 100mmのシャーレに播 き、 24時間培養後、 ソラレン （psoralen) と長波長紫外線 (365nm) で 20分間処理 した T7ポリメラーゼを発現するリコンピナントワクシニアゥィルス (PLWUV-VacT7 ： Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122—8126 (1986) ) を室温で 1時間感染させた （M0I 2) 。 細胞を無血清の MEMで洗浄した後、 プラス ミド pSeV/F (匿 #6) ΔΜ- GFP (或ぃはpSeV (TDK) /Fctl4 (MMP#6) ΔM-GFP， pSeV(TDK) / Fctl4(MMP#6) /Linker/HN Δ -GFP) ， pGE /NP, pGEM/P, pGEM/L (Kato, A. et al . , Genes cells 1, 569-579 (1996) ) pGEM/M及ぴ pGEM/F— HN (Li, H. -0. et al. , J. Virology 74. 6564-6569 (2000) , OOO/70070) をそれぞれ 12 μ ε， 4/z g, 2 /i g ， 4 g， 4J^ g及ぴ4Ju gZdishの量比で0pti—MEM (Gibco-BRL, Rockville, MD) に 懸獨し、 1 μ g L相当の SuperFect transfection reagent (Qiagen, Bothe
11, WA) を入れて混合し、 室温で 15分間放置後、 最終的に 3% FBSを含む Opti-MEM 3mLに入れ、 細胞に添加して培養し 。 5時間培養後血清を含まな ヽ MEMで 2回洗浄 し、 40 g/mLの Cytosme β -D-arabinofuranoside (AraC： Sigma, St. Louis, M0) 及ぴ 7. 5 g/mLの Trypsin (Gibco-BRL, Rockville, MD) を含む MEMで培養した 。 24時間培養後、 8. 5 X 106 cells/dishあたりに F蛋白を持続発現する細胞 （LLC- MK2/F7/M62/A ：実施例 1 2 ) を重層し、 40 μ g/mLの AraC及ぴ 7. 5 g/mLの Trypsi nを含む MEMで更に 2日間 37°Cで培養した （P0) 。 これらの細胞を回収し、 ペレツ トを 2mLZdishあたりの Opti-MEMに懸濁した。 凍結融解を 3回繰り換えした後、 ライゼ一トをそのまま LLC- MK2/F7/M62/Aにトランスフエクシヨンし、 40μ g/mLの AraC, 7. 5 μ g/mLの Trypsin及び 50U/mLの type IV collagenase (ICN, Aurola, OH ) を含み（pSeV (TDK) /Fctl4 (MMP#6) /Linker/HN Δ M- GFPの場合 trypsinのみ）血清を 含まな 、MEMを用い 32°Cで培養した （P1)。 3〜 1 4日後培養上清の一部をとり、 新たに調整した LLC- MK2/F7/M62/Aに感染させ、 40 g/mLの AraC、 7. 5 μ g/mLの Try psin及び 50U/raLの type IV collagenaseを含み（pSeV (TDK) /Fctl4 (MMP#6) /Linker/H N ΔΜ- GFPの場合 trypsinのみ）血清を含まない MEMを用い 32°Cで培養した （P2)。 3〜 1 4日後に新たに調整した LLC - MK2/F7/M62/Aに再度感染させ、 7. 5 μ g/mLの Tr ypsin及ぴ 50U/mLの type IV collagenaseを含み （pSeV (TDK) /Fct 14 (MMP#6) /Linker /HN ΔΜ- GFPの場合 trypsinのみ） 血清を含まない MEMを用い 32。Cで 3〜 7日間培養 した （P3) 。 回収した培養上清に終濃度 1%になるように BSAを添加し- 80°Cにて保 存した。 保存ウィルス液を解凍し、 その後の生産及び in vitro実験に供した。 以上のように、 F蛋白質開裂部位を PLGMTS (配列番号： 61) 力 ら PQGMTS (配列番 号： 62) にした SeV/F (匿 #6) ΔΜ- GFP、 cytoplasmic domainを 28アミノ酸削った S eV (TDK) /Fct 14 (MMP#6) Δ M- GFP、 およぴ F/HNのキメラタンパクを搭載した SeV (TDK)
/Fctl4 (MMP#6) /Linker/HN Δ M - GFPの作製に成功した。
[実施例 3 4 ] 改良型 F5女変 M欠失型センダイウィルスべクターの融合活性の上 昇
実施例 3 3で製造したゥィルスの性能を調べるため、 以下のように MMP2およひ 11 MP9の発現量の違う様々な癌細胞株と MMPの発現が検出されない LLCMK2へ感染させ 細胞融合能を測定した （図 4 7 ) 。 各種癌細胞 （HT1080， U87MG, A172, U251, SW 480, LLCMK2) を供与先より指示された培地で 24well plateへ confluent になるよ うにまいた。 U87MG (ATCC NO. HTB-14) , A172 (ATCC No. CRL-1620) は ATCCより 購入した。 U251 (IF050288) は JCRB cell bank より購入した。 MEM培地で 2回洗 浄後、 それぞれの M欠失型センダイウィルスベクター (SeV/ ΔΜ- GFP) を丽 =0. 1で 感染させた。 室温で 1時間放置後、 MEM培地で洗浄し、 0. 5 mlの 1%FBS添加 MEMを 24 well plateに加えた。 48時間培養後、 倒立顕微鏡の 100倍視野あたり（0. 3 cm2)の 融合したシンシチウムの数を力ゥントした。 もしくは ^Paraformaldehydeを使用 して 2時間固定処理を行なった後、 70°/。エタノール、 蒸留水置換後、 5分間 hematox ylin染色を行い、 水洗後、 シンシチウムを形成している 0. 3 cm2当たりの核の数を カウントした。 結果を図 4 9に示した。
MMP2, 9の発現は実施例 2 2で行つた gelatin zymographyによつて確かめた （図 4 8 ) 。 その結果、 HT1080, U87MG, A172で MMP2の発現が確認された。 また U251と SW4S0で低 、匿 9の発 ¾が確認された。 LLCMK2で MMP2の発現があるよう みえるの は 1°/。血清を含んでいるため、 血清中の MMP2の活性が見えている。 それぞれの癌細 胞株に感染後 2日後、 GFPの広がりを観察した。 その結果、 従来型の SeV/F(MMP#2) Δ M- GFPでは広がらなかつた U251, SW480にお!/、て改良型 F改変 M欠失型センダイゥ ィルスべクタ一において、 特に F/HNキメラタンパクを搭載した M欠失型センダイゥ ィルスベクター （SeV (TDK) /Fctl4 (MMP#6) /Linker/H Δ M-GFP) で融合活性がみら れるようになった。 データでは示さないが、 マウス肺癌 Lewis lung carcinoma, およびマウス大腸癌 colon 26においても、 同様に改良型にすることによって、 M欠 失型センダイウィルスベクター感染後、 融合活性が見られるようになり、 改良型 にすることによってさらなる効果の増大と低!/ヽ濃度の MMP量の癌にも効果が期待さ れる。 産業上の利用の可能性
本発明により、 所望のプロテアーゼ存在下で特異的に感染を広げるベクターが 提供された。 本発明のベクターはウィルス様粒子を有意に産生せず、 細胞融合に より隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。 従って、 本発明のベクターは、 目的とする組織の局所に限局してベクターを感染させるために有用である。 特に 本発明により癌特異的に感染を広げるベクターが提供された。 このベクターは、 腫瘍増殖に対する強 、抑制作用を持つている。 本発明のベクターを用いた癌の遺 伝子治療は、 副作用の少ない新たな癌治療として高い可能性を持っている。

Claims

請求の範囲
1 . パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) M蛋白質をコードする核酸 が変異または欠失しており、 かつ （b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部 位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に 置換された蛋白質をコードするゲノム RNAを含む複合体であり、 以下の性質を有す る複合体。
( 1 ) 該複合体が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有する。
( 2 ) 宿主内環境においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失している
( 3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該複合体が導入された細胞と接触する 細胞に、 該 RNAを導入する能力を有する。
2 . ウィルス粒子である、 請求項 1に記載の複合体。
3 . 野生型 F蛋白質をさらに含む、 請求項 2に記載の複合体。
4 . 該パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 請求項 1から 3のいずれ かに記載の複合体。
5 . 該プロテアーゼが、 癌で活性が亢進するプロテアーゼである、 請求項 1から 4のいずれかに記載の複合体。
6 . 該プロテアーゼが、 マトリックスメタ口プロテアーゼまたはプラスミノーゲ ンァクチベータ一である、 請求項 1力 ら 5のいずれかに記載の複合体。
7 . 該プロテアーゼによって開裂される配列が、 Pro- Leu- Gly、 Pro- Gin- Gly、 ま たは Val - Gly-Argを含む、 請求項 1カゝら 6のいずれかに記載の複合体。
8 . 該改変 F蛋白質において、 野生 F蛋白質が持つ細胞質ドメィンの一部が欠失 している、 請求項 1力ら 7のいずれかに記載の複合体。
9 . 該改変 F蛋白質が HN蛋白質と融合している、 請求項 1から 8のいずれかに記載 の複合体。
1 0 . パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) M蛋白質をコードする核 酸が変異または欠失しており、 かつ （b ) Ξ女変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂 部位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列 に置換された蛋白質をコードするゲノム RNAを有するウィルス粒子であって、 （1 ) 該ウィルス粒子が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有し、 （2 ) 宿主内環境においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、 （ 3 ) 該プロテアーゼの存在に依存して、 該ゲノム RNAを有するウィルス粒子が導入 された細胞と接触する細胞に、 該ゲノム RNAを導入する能力を有するウィルス粒子 の製造方法であって、
(i) パラミクソウィルスの野生型 M蛋白質を発現する細胞において、 該パラミク ソウィルスの N、 P、 および L蛋白質、 およぴ該ゲノム RNAを含む RNPを増幅させるェ 程、
(ii) 該細胞の培養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方法
1 1 . パラミクソウィルスのゲノム RNAであって、 （a ) 条件的変異を有する M蛋 白質をコードし、 かつ （b ) 改変 F蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部位の配列が 、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された 蛋白質をコードするゲノム脆を有するウィルス粒子であって、 （1 ) 該ウィルス 粒子が導入された細胞内で該ゲノム RNAを複製する能力を有し、 （2 ) 宿主内環境 においてウィルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、 （3 ) 該プロテ ァーゼの存在に依存して、 該ゲノム RNAを有するウィルス粒子が導入された細胞と 接触する細胞に、 該ゲノム RNAを導入する能力を有するウィルス粒子の製造方法で あって、
(i) 該 M変異蛋白質の許容条件下、 細胞内で該パラミクソウィルスの N、 P、 およ び L蛋白質、 および該ゲノム RNAを含む RNPを増幅させる工程
(ii) 該細胞の培養上清に放出されたウィルス粒子を回収する工程、 を含む方法
1 2 . 工程 （i) を 35°C以下で行う、 請求項 1 0または 1 1に記載の方法。
1 3 . 工程 （i) 〜 （ii) の少なくともいずれかの時期において該改変 F蛋白質を 開裂させるプロテアーゼを存在させる力、 あるいは工程 （ii) において回収され たウィルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、 請求項 1 0または 1 1 に記載の製造方法。
1 4 . 工程 (i) において該細胞内でパラミクソウィルスの野生型 F蛋白質を発現 させ、 工程 (i) 〜 （ii) の少なくともいずれかの時期に該野生型 F蛋白質を開裂 するプロテアーゼを存在させる力 あるいは工程 (ii) において回収されたウイ ルスあ i子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、 請求項 1 0または 1 1に記載 の製造方法。
1 5 . 請求項 5に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組 成物。
1 6 . パラミクソウィルス F蛋白質の改変蛋白質であって、 開裂部位に Pro-Leu - G1 y、 Pro-Gln-Gly, または Val_Gly - Argを含み、 マトリックスメタ口プロテアーゼま たはプラスミノーゲンァクチべ一ターの存在下で細胞融合能を示す組み換え蛋白 質。
1 7 . 請求項 1 6に記載の蛋白質をコードする核酸。
1 8 . 請求項 1 6に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウィル ス粒子。
1 9 . パラミクソウィルス F蛋白質おょぴ HN蛋白質の膜貫通領域を持ち、 細胞質側 において互いの蛋白質が結合している融合蛋白質であって、 細胞融合活性を持つ 蛋白質。 ' .
2 0 . 請求項 1 9に記載の融合蛋白質であって、 該蛋白質の開裂部位の配列が、 野生型 F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋
21. 請求項 19に記載の蛋白質をコードす'る核酸。
22. 請求項 21に記載の核酸を含むベクター。
23. 請求項 19に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウィル ス粒子。
PCT/JP2003/005528 2002-04-30 2003-04-30 Vecteur avec tropisme dependant de la protease modifie WO2003093476A1 (fr)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN038155745A CN1665932B (zh) 2002-04-30 2003-04-30 具有修饰的蛋白酶依赖向性的载体
CA2484538A CA2484538C (en) 2002-04-30 2003-04-30 Vectors with modified protease-dependent tropism
KR1020047017455A KR101058294B1 (ko) 2002-04-30 2003-04-30 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 벡터
US10/513,094 US7402427B2 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Vectors with modified protease-dependent tropism
AU2003234775A AU2003234775A1 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Vector with modified protease-dependent tropism
EP03728016.1A EP1505154B1 (en) 2002-04-30 2003-04-30 Paramyxovirus vectors with modified protease-dependent tropism
JP2004501612A JP4448440B2 (ja) 2002-04-30 2003-04-30 プロテアーゼ依存性トロピズムが改変されたベクター
HK06102193.5A HK1081996A1 (en) 2002-04-30 2006-02-18 Vectors with modified protease-dependent tropism
US12/140,715 US7709621B2 (en) 2002-04-30 2008-06-17 Vectors with modified protease-dependent tropism
US12/712,905 US20100297732A1 (en) 2002-04-30 2010-02-25 Vectors with modified protease-dependent tropism

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-129351 2002-04-30
JP2002129351 2002-04-30

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10513094 A-371-Of-International 2003-04-30
US12/140,715 Division US7709621B2 (en) 2002-04-30 2008-06-17 Vectors with modified protease-dependent tropism

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003093476A1 WO2003093476A1 (fr) 2003-11-13
WO2003093476A9 true WO2003093476A9 (fr) 2004-06-03

Family

ID=29397304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/005528 WO2003093476A1 (fr) 2002-04-30 2003-04-30 Vecteur avec tropisme dependant de la protease modifie

Country Status (9)

Country Link
US (3) US7402427B2 (ja)
EP (1) EP1505154B1 (ja)
JP (1) JP4448440B2 (ja)
KR (1) KR101058294B1 (ja)
CN (2) CN1665932B (ja)
AU (1) AU2003234775A1 (ja)
CA (1) CA2484538C (ja)
HK (1) HK1081996A1 (ja)
WO (1) WO2003093476A1 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
AU2003234775A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Dnavec Research Inc. Vector with modified protease-dependent tropism
ATE459707T1 (de) * 2003-06-30 2010-03-15 Dnavec Research Inc Negativ-strang rna-virus-vektoren, welche ein gen mit veränderten hypermutierbaren regionen tragen
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
WO2005056752A2 (en) 2003-10-24 2005-06-23 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
JP4999330B2 (ja) 2004-01-22 2012-08-15 株式会社ディナベック研究所 サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを含むハイブリッドプロモーターを利用したマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの製造方法
KR20070004637A (ko) * 2004-01-22 2007-01-09 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 바이러스 벡터의 제조방법
WO2005087269A1 (ja) * 2004-03-16 2005-09-22 Dnavec Research Inc. 腫瘍増殖を抑制する方法
JP2006180780A (ja) * 2004-12-27 2006-07-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 持続感染型センダイウイルスベクター
KR20080068098A (ko) 2005-10-28 2008-07-22 디나벡크 가부시키가이샤 Ｒｎａ 바이러스 또는 ｄｎａ 바이러스의 스파이크단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터를 사용한 기도상피 간세포로의 유전자 도입
US8007808B2 (en) * 2008-04-04 2011-08-30 The Board Of Trustees Of The Univeristy Of Illinois Composition and method for facilitating the internalization of a therapeutic agent into a cell
EP3543256A1 (en) * 2009-01-12 2019-09-25 Cytomx Therapeutics Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
DE102010018961B4 (de) * 2010-04-23 2012-09-20 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Genetisch modifiziertes Paramyxovirus zur Behandlung von Tumorerkrankungen
US20110311587A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-22 Pramila Walpita Fusogenic virus-like particles and uses thereof
WO2014103310A1 (ja) 2012-12-26 2014-07-03 バイオコモ株式会社 ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを利用したワクチン
CN105541969A (zh) * 2015-12-28 2016-05-04 合肥安德生制药有限公司 一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用
JP7117087B2 (ja) * 2017-07-10 2022-08-12 株式会社Ｉｄファーマ 癌の治療組成物
JPWO2020246567A1 (ja) * 2019-06-05 2020-12-10

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9200117D0 (en) * 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
EP0864645B9 (en) 1995-10-31 2006-03-22 Dnavec Research Inc. Negative-strand rna virus vector having autonomously replicating activity
WO2000009700A1 (en) * 1998-08-11 2000-02-24 Dnavec Research Inc. Rna virus vector having contact infiltration capability
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
JP3602058B2 (ja) 1999-05-18 2004-12-15 株式会社ディナベック研究所 エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウイルスベクター
WO2003025570A1 (en) 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
WO2001020989A1 (en) 1999-09-22 2001-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
US6896881B1 (en) * 1999-09-24 2005-05-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
AU2003234775A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Dnavec Research Inc. Vector with modified protease-dependent tropism
JP4999330B2 (ja) * 2004-01-22 2012-08-15 株式会社ディナベック研究所 サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを含むハイブリッドプロモーターを利用したマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの製造方法
KR20070004637A (ko) * 2004-01-22 2007-01-09 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 바이러스 벡터의 제조방법
WO2005087269A1 (ja) * 2004-03-16 2005-09-22 Dnavec Research Inc. 腫瘍増殖を抑制する方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003093476A1 (fr) 2003-11-13
JPWO2003093476A1 (ja) 2005-09-08
US20050221292A1 (en) 2005-10-06
EP1505154B1 (en) 2015-09-16
KR101058294B1 (ko) 2011-08-22
CN101054419A (zh) 2007-10-17
HK1081996A1 (en) 2006-05-26
CN1665932B (zh) 2010-12-15
US7709621B2 (en) 2010-05-04
CN1665932A (zh) 2005-09-07
AU2003234775A1 (en) 2003-11-17
US20100297732A1 (en) 2010-11-25
CA2484538A1 (en) 2003-11-13
JP4448440B2 (ja) 2010-04-07
US20080299642A1 (en) 2008-12-04
CA2484538C (en) 2014-03-25
EP1505154A1 (en) 2005-02-09
US7402427B2 (en) 2008-07-22
KR20050000414A (ko) 2005-01-03
EP1505154A4 (en) 2006-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7709621B2 (en) Vectors with modified protease-dependent tropism
EP1715048A1 (en) Process for producing virus vector
JP3766596B2 (ja) パラミクソウイルスに由来するｒｎｐ
JPWO2003025570A1 (ja) 粒子形成能が低下した（−）鎖ｒｎａウィルスベクターの検査方法および製造方法
EP1344829B1 (en) Paramyxovirus vector encoding fibroblast growth factor 2 (fgf2) and use thereof
KR20020014786A (ko) 엔벨로프 유전자 결손 파라믹소과 바이러스 벡터
US20040053877A1 (en) Paramyxovirus vector for transfering foreign gene into skeletal muscle
KR100774796B1 (ko) 파라믹소바이러스 벡터의 혈관으로의 유전자 도입용도
KR20090052857A (ko) 비복제형 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터
JPWO2003102183A1 (ja) 抗体をコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用
JP4791651B2 (ja) 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター
JPWO2004067752A1 (ja) リボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用
JPWO2005001082A1 (ja) 高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ｒｎａウイルスベクター
JP7117087B2 (ja) 癌の治療組成物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGE 26/49, DRAWINGS, ADDED

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004501612

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2484538

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020047017455

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003728016

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038155745

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020047017455

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003728016

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10513094

Country of ref document: US