CN1665932B - 具有修饰的蛋白酶依赖向性的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有复制能力的细胞致融合型载体，其蛋白酶依赖向性经过修饰。制备了编码经修饰的F蛋白基因M基因缺陷型病毒载体，其中副粘病毒的F蛋白的切割位点被修饰成由另一种蛋白酶切割的序列。载体中的基因组RNA在用此载体转染的细胞中被复制，并依赖上述另一种蛋白酶的存在，通过细胞融合的方式感染扩散邻近的细胞；但是，没有病毒颗粒被释放。编码由蛋白酶(其活性在癌症中增强)切割的F蛋白的本发明的载体，在体内显示抑制癌症生长的作用。

Description

具有修饰的蛋白酶依赖向性的载体
技术领域
本发明涉及具有经修饰的蛋白酶依赖向性的细胞融合载体，以及制备所述载体的方法。本发明的载体可用作显示癌症特异性感染的基因治疗用载体。
背景技术
关于癌症的基因治疗的开发近年来取得了进展。到目前为止，本发明人使用仙台病毒(SeV)开发出了基因治疗用载体。SeV属于副粘病毒科病毒，是以非分节段负链RNA为其基因组的病毒。副粘病毒载体具有高转染率以及异源基因的过度表达能力，并且被期待为癌症基因治疗用载体。目前，已有多例使用副粘病毒对癌症进行治疗的尝试。例如，用腮腺炎病毒感染的BHK21细胞，在患肿瘤的裸鼠中显示有抗肿瘤效应(Minato，N.等，J.Exp.Med.149，1117-1133，1979)。另外，类似地其它副粘病毒也有抗肿瘤效应的报道。最近，致融合蛋白(fusogenic)的抗肿瘤效应吸引了人们的注意。Galanis等，报道了用携带麻疹病毒F蛋白和HN蛋白的腺病毒载体感染的癌症细胞形成合胞体，在体内显示了抗肿瘤效应(Galanis，E.等，Hum.Gene Ther.12，811-821，2001)。
勿庸置疑，不发生转移的癌症可以通过外科手术去除该部分进行治疗，而转移癌和恶性癌症被认为是同义的。浸润性转移癌已知过度表达基质金属蛋白酶(MMP)和/或纤溶酶原激活物(uPA，tPA)(Cox，G.，and O’Byrne，K.J.，Anticancer Res.21，4207-4219，2001；Andreasen，P.A.等，Cell Mol.Life.Sci.57，25-40，2000)。该过度表达被认为是因为癌细胞周围的细胞外基质(ECM)是癌细胞转移和浸润过程中防止细胞易位的屏障.癌细胞需表达降解ECM的酶(MMP，uPA，tPA)来降解其周围的细胞外基质(ECM)以后，才可能发生浸润和转移.
另一方面，就癌症的基因治疗而言可以举出下列3个问题。首先，由于基因导入到癌细胞中的效率较低，或者不能轻易将基因导入到实体癌的核心处，，因此基因没有被转染到整个癌症中。相应地，没有被转染的余下的癌细胞开始再次增殖，从而导致复发。其次，基因在转染癌细胞的同时，还转染正常细胞。此转染会损伤正常细胞，从而导致副作用的增加。第三， 随着癌症逐渐变为恶性，出现浸润和转移，这是治疗所有类型的癌症时存在的问题。目前，还没开发出可解决这些问题的载体。
发明内容
本发明提供具有经修饰的蛋白酶依赖向性(protease-dependent tropism)的新的细胞融合载体以及用于制备该载体的方法，该载体只在特定蛋白酶存在的条件下才浸润到周围的细胞中。
病毒中的副粘病毒家族(包括仙台病毒)，其包膜中含有两种蛋白。融合(F)蛋白实现该病毒与其宿主细胞之间的膜融合，从而使核壳释放到细胞质中。血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白具有血细胞凝集活性和神经氨酸酶活性，并且在与宿主受体结合中起作用。F和HN蛋白也称为刺突蛋白，这是由于它们存在于病毒包膜表面的缘故。基质(M)蛋白沿包膜内部排列，使病毒颗粒具有刚性。本发明的载体可以将基因高效导入到广泛的多种细胞和动物组织中，与已有载体相比，可以获得高水平的表达。
F蛋白(F0)其本身不显示细胞融合活性。其融合活性只能通过宿主来源蛋白酶的切割才得以显示，所述切割是使F0被降解为F1和F2。因此，携带野生型F蛋白的病毒的增殖被限制在表达可切割该蛋白的胰蛋白酶样蛋白酶的组织类型中，例如呼吸粘膜上皮。有多项研究涉及通过修饰F蛋白来修饰副粘病毒感染或致融合力(fusogenecity)。就SeV而言，包含只被α-胰凝乳蛋白酶切割的F的变体丧失胰蛋白酶敏感性，显示是因为其F切割序列的特异向性发生了改变(Tashiro，M.等，J.Gen.Virol.73(Pt 6)，1575-1579，1992)。此外，在新城疫病毒和麻疹病毒中，已显示由于对F的切割序列的修饰导致合胞体形成能力以胰蛋白酶依赖的方式发生改变(Li，Z.等，J.Virol.72，3789-3795，1998；Maisner，A.等，J.Gen.Virol.81，441-449，2000)。
通过如上述修饰F蛋白的切割序列，载体可感染表达特定蛋白酶的特定组织并在其中增殖。然而，副粘病毒载体的一个问题是从细胞中二次释放病毒，这出现在载体被导入靶细胞以后。在被可复制病毒感染的细胞中，形成病毒粒子并释放子代病毒。因此，病毒颗粒还扩散到除靶组织以外的位点。尽管上述包含野生型F蛋白的病毒颗粒在缺乏胰蛋白酶样酶时不显示感染性，但是病毒颗粒本身依然从细胞中被释放出。在体内给药时，扩散到血液中的病毒将扩散到整个身体。此外，缺乏复制能力的病毒样颗粒 (VLP)的释放在F基因缺陷型SeV转染的细胞中也可观察到(Li，H.O.等，J.Viro1.74，6564-6569，2000；WO 00/70055；WO 00/70070)。对靶组织以外的组织的感染以及对免疫反应的诱导都是人们对二次释放的病毒颗粒的担心。
本发明人发现，缺乏病毒包膜基因中M基因的副粘病毒不形成病毒颗粒，但其可通过感染细胞与和这些感染细胞接触的细胞发生融合，形成合胞体而进行细胞融合型感染(WO 00/09700)。这些M缺陷型病毒在转染细胞中复制，并在存在胰蛋白酶的条件下递送到邻近细胞中。然而，这种现象只在F被切割并活化的条件下出现。在包含野生型F蛋白的病毒中，病毒的转移不会出现在没有胰蛋白酶样蛋白酶存在的条件下。本发明人推定通过修饰这种M缺陷型病毒中的F蛋白向性，可以开发出不产生二次释放的病毒颗粒，而且仅可在特定组织中传播感染的新载体。特别是，许多浸润性转移癌已知具有增强的可降解ECM的蛋白酶(如MMP，uPA，和tPA)活性。因此，本发明人利用该M缺陷型SeV的蛋白酶依赖性细胞融合型感染特性，并结合在癌症中过度表达MMP，uPA，和tPA的现象，来制备特异性感染并扩散到浸润性转移癌的SeV载体。
M缺陷型病毒缺乏颗粒形成所需的M基因。因此，病毒颗粒或者不被释放，或者其释放被极度抑制。当传统的重构法用于制备具有复制能力的重组病毒(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)时，能制备M缺陷型病毒的RNP但不能制备感染性病毒颗粒(WO 00/09700)。当使用M缺陷型病毒载体作为癌症治疗制剂时，将M缺陷型病毒制备成为感染性病毒颗粒是极其有用的。在此，本发明人开发了将M缺陷型病毒制备成为病毒颗粒的新制备法。
为实现构建VLP释放受抑制的载体，本发明人考虑在病毒基因中使用温度敏感性突变。已有关于可在低温生长但不能在高温生长的突变病毒株的报道。本发明人设想在高温下抑制病毒颗粒形成的突变蛋白，尤其是突变的M蛋白可用来抑制VLP形成，使得病毒的产生可在低温(例如32℃)下进行，但病毒的实际应用例如基因治疗可在较高的温度(例如37℃)下进行。为此，本发明人构建了F基因缺陷型重组仙台病毒载体，其编码突变M和突变HN蛋白，所述蛋白具有已有报道的M和HN蛋白中的全部六种温度敏感突变(M蛋白有三种，HN蛋白有三种)。检测该病毒的VLP释放水平，约为野生型病毒的1/10或更低。此外，在细胞中导入具有抑制VLP释放 的仙台病毒载体，使用抗M蛋白抗体进行免疫染色来分析细胞中的M蛋白亚细胞定位。结果显示，与导入野生型病毒的细胞相比，导入具有抑制VLP释放的病毒可显著降低M蛋白在细胞表面的聚集。具体地，M蛋白的浓缩模式(condensation pattern)在高温(38℃)下极度减少。在由含有温度敏感型突变M基因的SeV感染的细胞中，用共聚焦激光显微镜对M和HN蛋白的亚细胞定位进行精密检测。结果显示，M蛋白在细胞表面的定位明显减少(即使在低温(32℃))，并且观察到其形态与微管相似。在高温(37℃)下，M蛋白定位在中心体附近的微管上，即靠近高尔基体。加入微管解聚剂导致M蛋白定位结构被破坏。这种情况见于包含温度敏感型突变M基因的SeV和野生型M基因的SeV。从而得出M蛋白实际上可能通过沿微管定位发挥作用。这些发现证实了具有温度敏感型突变的病毒中的二次病毒释放水平降低是由于M蛋白的细胞内定位不足而导致的，该定位步骤被认为在病毒颗粒形成中具有核心作用。因此，VLP形成可通过阻碍M蛋白的正常细胞内定位而被有效抑制。此外，与微管的相互作用对M蛋白的功能可能是重要的。例如，二次颗粒释放可通过M蛋白亚细胞定位的破坏而被降低，该步骤可通过使用基因突变或抑制M蛋白从高尔基体沿微管在细胞内移动的药剂来实现。本发明人发现，降低或消除了颗粒形成能力的重组病毒载体可以通过制备包含使M蛋白定位发生缺陷的突变的病毒载体来提供。
通过从病毒中消除M基因，本发明人构建了在该病毒转染的细胞中M蛋白在细胞表面上的聚集被完全抑制了的一种病毒。为此，本发明人构建了诱导性表达野生型M蛋白的辅助细胞，用于制备M基因缺陷型病毒。通过使用这些细胞，首次回收了下述病毒颗粒，所述病毒颗粒中F修饰的M基因缺陷型病毒的RNP包含在含有野生型M蛋白的包膜中。本发明的方法使得可以产生浓度为1×108PFU/ml或更高的病毒颗粒，首次提供了足以应用于实际使用，尤其是临床使用的重组病毒。此外，本发明的病毒制备体系避免了被其它病毒污染的可能，并可产生出高度安全，高滴度的载体用于基因治疗。通过使用利用表达M蛋白的辅助细胞来提供M蛋白的本发明的M缺陷型SeV制备系统，首次实现了提供适用于实用化的、F修饰M缺陷型副粘病毒。
本发明人使用如上述构建的感染性病毒颗粒，证实了体内实际抗肿瘤效果。将基质金属蛋白酶(MMP)(其在癌症中活性增强)活化的M缺陷型病 毒给药使用于癌细胞移植的小鼠，证实该病毒通过细胞融合型感染在整个癌组织中扩散。在野生型病毒给药的癌症中，所述病毒甚至在数天后还被限制在注射位点。反之，本发明的载体显示对癌组织的高渗透力，所述载体在整个癌组织中扩散。本发明载体对癌组织增生的抑制作用与对照组(没有给药病毒或给药野生型病毒)相比是明显的。迄今为止，使用逆转录病毒来制作靶向表达MMP的细胞的载体(Peng，K.-W.等，Human Gene Therapy 8，729-738，1997；Peng，K.-W.等，Gene Therapy 6，1552-1557，1999；Martin，F.等，J.Virol.73，6923-6929，1999)。本发明利用与上述逆转录病毒的识别序列完全不同的设计。此外，这些报告的目标是特异性感染癌组织，即只靶向癌组织。因此，通过本发明首次提供了在癌组织中特异性(在细胞内)扩散感染的载体。
此外，本发明人通过在病毒颗粒形成过程中控制蛋白酶的加入而成功制备了位于病毒表面具有未切割的F蛋白的病毒颗粒F-未切割型病毒。如此这般，这些病毒不具有感染力；但是，它们在用切割病毒表面F蛋白的蛋白酶处理或者在这种蛋白存在时将病毒加入到细胞的情况下，显示特异性感染力。这种可诱导的感染性病毒载体能使载体特异性感染产生特定蛋白酶的癌症细胞。
此外，本发明人成功的将野生型F蛋白用于制备包含修饰型F基因的载体，以开发出在载体制备过程中利用切割野生型F蛋白的蛋白酶来制备病毒颗粒的方法。根据该方法，可使用表达野生型F蛋白的辅助细胞和切割野生型F蛋白的酶例如胰蛋白酶来进行病毒扩增。获得的病毒颗粒的包膜中包含切割后的野生型F蛋白，并具有感染力。然而，由于病毒基因组中包含修饰后的F基因(其中病毒基因组编码的F蛋白的切割位点被修饰)，所述感染仅在特定蛋白酶存在下扩散。这种使用野生型F蛋白制备病毒的方法的优点是有利于制备不依赖被整合到载体基因组中的经修饰的F基因的病毒颗粒。
如上所述，本发明提供了一种载体，其感染仅在存在表达于特定组织(如癌组织)中的蛋白酶时扩散。本发明的载体不产生显著量的病毒颗粒，但可通过细胞融合将载体转移到周围细胞中。本发明的载体通过其活性在癌症中尤其增强的蛋白酶获得感染力，该载体对肿瘤生长具有强抑制效果。因此，使用这些载体对癌症进行基因治疗被认为非常有效。
因此，本发明涉及蛋白酶依赖向性被修饰的细胞融合型载体，以及制备该载体的方法。具体地，本发明涉及：
[1]包含副粘病毒基因组RNA的复合物，其中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述复合物还包括以下特性：
(1)在已导入所述复合物的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)在所述蛋白酶存在的条件下，具有将所述RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由复合物转染的细胞接触的细胞。
[2][1]的复合物，其中所述复合物是病毒颗粒。
[3][2]的复合物，还包含野生型F蛋白。
[4][1]-[3]之一的复合物，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
[5][1]-[4]之一的复合物，其中所述蛋白酶是其活性在癌症中增强的蛋白酶。
[6][1]-[5]之一的复合物，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶或纤溶酶原激活物。
[7][1]-[6]之一的复合物，其中由所述蛋白酶切割的序列包括Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg。
[8][1]-[7]之一的复合物，其中野生型F蛋白的胞质区在修饰后的F蛋白中部分缺失。
[9][1]-[8]之一的复合物，其中修饰后的F蛋白与HN蛋白融合。
[10]制备包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒的方法，在该病毒颗粒中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒颗粒：
(1)具有在已导入所述病毒颗粒的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)显示在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)在所述蛋白酶存在的条件下，具有将所述基因组RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由包含基因组RNA的病毒颗粒转染的细胞接触的细胞； 所述方法包括以下步骤：
(i)在表达副粘病毒野生型M蛋白的细胞中，扩增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因组RNA的RNP；和
(ii)收集释放到细胞培养上清中的病毒颗粒。
[11]制备包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒的方法，在该病毒颗粒中(a)编码了条件突变性M蛋白，和(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒颗粒：
(1)具有在已导入所述病毒颗粒的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)显示在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)在所述蛋白酶存在的条件下，具有将所述基因组RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由包含基因组RNA的病毒颗粒转染的细胞接触的细胞；所述方法包括以下步骤：
i)在突变型M蛋白的容许条件下，在细胞中扩增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因组RNA的RNP；和
(ii)收集释放到细胞培养上清中的病毒颗粒。
[12][10]或[11]的方法，其中步骤(i)在小于或等于35℃的温度进行。
[13][10]或[11]的方法，还包括在至少步骤(i)或(ii)之一中提供切割修饰后F蛋白的蛋白酶的步骤；或者包含使用所述蛋白酶处理步骤(ii)中收集的病毒颗粒的步骤。
[14][10]或[11]的方法，还包括在步骤(i)中在细胞内表达副粘病毒野生型F蛋白；和在至少步骤(i)或(ii)之一中提供切割野生型F蛋白的蛋白酶的步骤；或者包含使用所述蛋白酶处理步骤(ii)中收集的病毒颗粒的步骤。
[15]用于癌症的治疗性组合物，其包含[5]的复合物和可药用的载体。
[16]重组的修饰后副粘病毒F蛋白，其在切割位点包含Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg，并在存在基质金属蛋白酶或纤溶酶原激活物的条件下显示致细胞融合力。
[17]编码[16]的蛋白的核酸。
[18]一种病毒颗粒，其包含[16]的蛋白或者编码该蛋白的核酸。
[19]一种具有细胞致融合活性的融合蛋白，其包含副粘病毒F和HN蛋 白的跨膜区，其中所述F和HN蛋白在胞质侧互相结合。
[20][19]的融合蛋白，其中该蛋白的切割位点的序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶所切割的序列取代。
[21]编码[19]的蛋白的核酸。
[22]包含[21]的核酸的载体。
[23]一种病毒颗粒，其包含[19]的蛋白或者编码该蛋白的核酸。
本发明术语“副粘病毒”指属于副粘病毒科的病毒，及其衍生病毒。副粘病毒是以非分节负链RNA基因组为特征的一组病毒，包括副粘病毒亚科(包括副粘病毒属(也称为呼吸道病毒属，腮腺炎病毒(Rubulavirus)属和麻疹病毒(Morbillivirus)属)，以及肺病毒亚科(包括肺病毒属和间质肺病毒(Metapneumovirus)属)。具体地，本发明可利用的副粘病毒包括仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒，瘟热病毒(distemper virus)，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3型，等等。更具体地例如，仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(PDV)，犬瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)，小反刍兽疫病毒(peste-des-petits-ruminant)(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更优选的实例包括选自以下组的病毒：仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(PDV)，犬瘟热病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(NipahVirus)。本发明的病毒及其衍生病毒优选属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属，腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)，且更优选呼吸道病毒属(也称副粘病毒属)。本发明可利用的呼吸道病毒属的病毒包括人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙台病毒(也称小鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然毒株，野生型毒株，突变株，实验室传代株，人工构建的毒株等。
术语“重组蛋白”和“重组病毒”分别指通过重组多核苷酸产生的 蛋白和病毒。术语“重组多核苷酸”指在自然状态下未结合的多核苷酸。具体地，重组多核苷酸包含其多核苷酸链已被人工重组的多核苷酸，以及合成的多核苷酸。重组多核苷酸可使用传统的基因重组法通过将多核苷酸合成，核酶处理，连接酶处理等步骤来制备。重组蛋白可以通过表达编码该蛋白的重组多核苷酸组合来制备。重组病毒可以通过以下步骤制备：表达编码病毒基因组的多核苷酸，所述多核苷酸是通过遗传工程构建的；然后重构所述病毒。
本发明术语“基因”指遗传物质，其包括例如RNA，DNA等核酸。本发明中，编码蛋白的核酸称为蛋白基因。但是，基因并非必需编码蛋白，例如其可编码功能型RNA例如核酶，反义RNA等。基因可以是天然来源或人工设计的序列。本发明术语“DNA”包括单链DNA和双链DNA。术语“编码蛋白”指为使多核苷酸在适宜的条件下表达该蛋白，使此多核苷酸包含反义或有义ORF，所述ORF是编码该蛋白的氨基酸序列。
本发明提供了具有复制能力的细胞融合载体，其蛋白酶依赖向性已经被修饰。在宿主内环境中，这种载体在转染到细胞内后不释放显著量的病毒样颗粒，并且只在特定蛋白酶存在时浸润到周围细胞中。具体地，本发明的载体包括：
一种复合物，其包含副粘病毒基因组RNA，其中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码修饰过的F蛋白，所述蛋白的切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，且所述复合物还包括以下特性：
(1)在已导入所述复合物的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)在所述蛋白酶存在的条件下，具有将所述RNA导入细胞的能力，所述细胞是与所述复合物转染的细胞接触的细胞。所述复合物由于具有复制基因组RNA并将其导入到邻近细胞的功能，在本发明中也称载体。术语“载体”指将核酸导入到细胞内的载体。
更具体地，上述复合物包含副粘病毒的基因组RNA和与该RNA结合的病毒蛋白。本发明的复合物可由例如副粘病毒基因组RNA以及病毒蛋白即核糖核蛋白(RNP)组成。RNP可以导入靶细胞，例如与所需的转染试剂组合。更具体地，这种RNP是包含副粘病毒基因组RNA，N蛋白，P蛋白和 L蛋白的复合物。当RNP被导入细胞后，在病毒蛋白的作用下从基因组RNA转录编码病毒蛋白的顺反子的同时，基因组本身也进行复制，并产生子代RNP。基因组RNA的复制可通过使用RT-PCR，Northern杂交等方法检测RNA拷贝数的增加而证实。
上述复合物更优选副粘病毒病毒颗粒。术语“病毒颗粒，，指通过病毒蛋白的作用从细胞中释放的含有核酸的小颗粒。病毒颗粒可以是各种形状，例如球形或杆状，根据病毒种类的不同而不同。它们比细胞小得多，通常其大小约在10nm到800nm之间。副粘病毒病毒颗粒具有包含基因组RNA和病毒蛋白的上述RNP，并且由细胞膜来源的脂质膜(或包膜)封闭的结构。病毒颗粒可显示或不显示感染性(见下文)。例如，一些病毒颗粒显示潜在感染性，例如本来不显示感染性，但经过特殊处理后可获得感染性。
术语“副粘病毒基因组RNA”指能够与副粘病毒蛋白形成RNP，并具有在这些蛋白的作用下表达基因组中基因的功能，同时该核酸复制后可形成子代RNP的RNA。副粘病毒的基因组是负链单链RNA，是一种以反义模式编码基因的RNA。通常，副粘病毒基因组在位于3，前导区和5，尾随区之间包含反义系列的病毒基因。在每种基因的开放阅读框架(ORFs)之间，存在一系列序列：转录终止序列(E序列)，间插序列(I序列)，以及转录起始序列(S序列)。因此，编码各种基因ORF的RNA被分别转录为各自的顺反子。本发明载体中包含的基因组RNA编码(以反义模式)核壳(N)，磷光体(phosphor)(P)，和大(L)蛋白。这些蛋白是表达RNA编码的基因群以及自律性复制所述RNA自身所必须的。此外，所述RNA以反义方向编码融合(F)蛋白，其诱导将RNA扩散到邻近细胞所必须的细胞膜融合。优选，基因组RNA进一步以反义方向编码血凝素-神经氨酸酶(HN或H)蛋白。然而，在一些细胞中，HN蛋白不是感染所必须的(Markwell，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)，978-982，1985)，感染可以通过单独的F蛋白来实现。此外，载体可组合除HN以外的具有细胞结合能力的蛋白以及F蛋白来感染细胞。因此，本发明的载体可以使用不编码HN基因的基因组RNA来构建。
副粘病毒亚科病毒的基因通常如下表示：N基因通常也称“NP”。
呼吸道病毒属    NP    P/C/V    M    F    HN    -       L
腮腺炎病毒属    NP    P/V      M    F    HN    (SH)    L
麻疹病毒属    NP    P/C/V    M    F    H    -    L
例如，分类于副粘病毒科呼吸道病毒属的仙台病毒的基因核苷酸序列的数据库登录号是：NP基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131；以及L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。其它病毒编码的病毒基因的登录号如下：N基因为AF014953(CDV)，X75961(DMV)，D01070(HPIV-1)，M55320(HPIV-2)，D10025(HPIV-3)，X85128(Mapuera)，D86172(腮腺炎病毒)，K01711(MV)，AF064091(NDV)，X74443(PDPR)，X75717(PDV)，X68311(RPV)，X00087(SeV)，M81442(SV5)，和AF079780(Tupaia)；P基因为X51869(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，X04721(HPIV-3)，M55975(HPIV-4a)，M55976(HPIV-4b)，D86173(腮腺炎病毒)，M89920(MV)，M20302(NDV)，X75960(PDV)，X68311(RPV)，M30202(SeV)，AF052755(SV5)，和AF079780(Tupaia)；C基因为AF014953(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，D00047(HPIV-3)，AB016162(MV)，X68311(RPV)，AB005796(SeV)，和AF079780(Tupaia)；M基因为M12669(CDV)，Z30087(DMV)，S38067(HPIV-1)，M62734(HPIV-2)，D00130(HPIV-3)，D10241(HPIV-4a)，D10242(HPIV-4b)，D86171(腮腺炎病毒)，AB012948(MV)，AF089819(NDV)，Z47977(PDPR)，X75717(PDV)，M34018(RPV)，U31956(SeV)，和M32248(SV5)；F基因为M21849(CDV)，AJ224704(DMV)，M22347(HPN-1)，M60182(HPIV-2)，X05303(HPIV-3)，D49821(HPIV-4a)，D49822(HPIV-4b)，D86169(腮腺炎病毒)，AB003178(MV)，AF048763(NDV)，Z37017(PDPR)，AJ224706(PDV)，M21514(RPV)，D17334(SeV)，和AB021962(SV5)；HN(H或G)为AF112189(CDV)，AJ224705(DMV)，U709498(HPIV-1)，D000865(HPIV-2)，AB012132(HPIV-3)，M34033(HPIV-4A)，AB006954(HPIV-4B)，X99040(腮腺炎病毒)，K01711(MV)， AF204872(NDV)，Z81358(PDPR)，Z36979(PDV)，AF132934(RPV)，U06433(SeV)，和S76876(SV-5)。每种病毒已知有一种以上毒株，且不同毒株可具有包含除以上所示序列以外的序列的基因。
这些病毒蛋白的ORF在基因组RNA上以上述E-I-S顺序被置于反义方向。在基因组RNA上，离3’端最近的ORF仅需要位于3’前导序列区和ORF之间的S序列，而不需要E和I序列。另一方面，离基因组RNA5’端最近的ORF仅需要位于5’尾随区和ORF之间的E序列，而不需I和S序列。使用例如IRES序列可以将两种ORF转录成相同的顺反子。在这种情况下，这两个ORF之间不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因组在3’前导序列之后，以反义方向依次编码N，P，M，F，HN，和L蛋白的六种ORF序列，末端是5’尾随区。在本发明的基因组RNA上，病毒基因的结构不限于此；但是，优选与野生型病毒相似的基因结构，即依次编码N，P，(M，)F，HN，和L蛋白的ORF，其后是5’尾随区。在特定类型的副粘病毒中，病毒基因的数目不是6个。然而，即使在这种情况下，每种病毒的基因位置可以采取与各类野生型病毒相似的结构，或可以作适宜的改变。关于M蛋白的ORF将在下文描述。根据本发明载体的一个实施方案，该ORF可被排除或者可编码突变M蛋白。此外，在本发明载体的另一实施方案中，基因组编码的F蛋白的切割位点序列被修饰成一种可被不能切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代(下文)。本发明的基因组RNA还可编码一或多种异源基因。异源基因是指需要在靶细胞中表达的任何目的基因。所述异源基因优选插入基因组非编码区中的位点。例如，其可插入3’前导序列和离3’末端最近的病毒蛋白ORF之间，插入各病毒蛋白ORF之间，和/或插入离5’末端最近的病毒蛋白ORF和5’尾随区之间。在M基因缺陷型基因组中，可以插入缺陷区。当将异源基因插入到副粘病毒基因组中时，插入的多核苷酸片段具有的链长度优选6的倍数(Journal of Virology 67(8)，4822-4830，1993)。在插入的异源基因和病毒ORF之间，构建E-I-S序列。或者，可通过IRES插入异源基因。
异源基因的表达水平可通过付加在基因上游(负链3’侧)的转录起始序列的类型来调节(WO 01/18223)。此外，表达水平可根据异源基因插入基因组中的位置进行调节。异源基因离负链3’端越近，该异源基因的表达水平就越高；同样，异源基因离5’端越近，其表达水平就越低。因此，可以通 过异源基因的插入位点调节所需异源基因的表达水平以及优选其与编码病毒蛋白的上游和下游基因的最佳组合。通常，高表达水平被认为对异源基因有利。因此，异源基因优选与高效转录起始序列相连，并且插入负链基因组3’端附近。更具体地，其优选插入3’前导区和离3’端最近的病毒蛋白ORF之间。可选，异源基因可以插入离3’端最近的病毒基因ORF和次最接近基因的ORF之间。反之，当不优选插入基因高表达时，为实现病毒载体中低水平表达的适当效果，可使用以下方法：例如将载体中基因的插入位置尽可能设计在接近负链基因组的5’末端，或者使用具有低效率的转录起始序列。
任何包含在本发明载体中的病毒基因可从经修饰的野生型病毒基因中获取，从而有利于例如降低病毒蛋白的免疫原性，或者增强RNA转录和复制效率的目的。具体地，在副粘病毒载体中，例如转录或复制功能可以通过修饰至少一种以下复制因子而增强：N，P，和L基因。结构蛋白HN具有包含血凝素活性和神经氨酸酶活性。如果，例如通过降低血凝素活性可使血液中病毒的稳定性增强。另一方面，如果例如修饰神经氨酸酶的活性，可调节其感染力。此外，膜融合和/或颗粒形成能力可通过修饰F蛋白的除切割位点以外的结构域来调节。例如，通过对可能成为细胞表面抗原分子(例如F和HN蛋白)的抗原呈递表位等进行分析，可制备对这些蛋白具有减弱的抗原呈递能力的病毒载体。
具有缺陷辅助基因的载体可用作本发明的载体。例如，通过敲除V基因，SeV辅助基因，SeV对宿主例如小鼠的致病性可明显降低而不损害基因在培养细胞中的表达和复制(Kato，A.等，J.Virol.71，7266-7272，1997；Kato，A.等EMBO J.16，578-587，1997，；Curran，J.等，WO 01/04272，EP1067179)。这种减毒载体优选作为体内和回体(ex vivo)非毒性基因转移的病毒载体。
在优选实施方案中，本发明的复合物实质上是均一的。术语“实质上均一的复合物”是指与并非本发明复合物的副粘病毒RNP或病毒颗粒分离的复合物，其不是本发明的复合物。即，本发明实质上均一的复合物不包含具有颗粒形成能力的其它副粘病毒RNP或病毒颗粒。本文术语“颗粒形成能力”是指载体在用该病毒载体感染的细胞中释放感染性和/或非感染性病毒颗粒(称为病毒样颗粒)的能力，该过程为“二次释放”。此外，具有修 饰的F蛋白切割位点的本发明复合物不包含下述病毒RNP，所述病毒RNP基因组中包含编码野生型F蛋白或具有与野生型同等融合活性的F蛋白的基因，且所述复合物也不包含含有该基因组的病毒颗粒。
根据本发明的实施方案，上述基因组RNA编码的F蛋白的切割位点序列被由另一种蛋白酶切割的序列所取代。副粘病毒F蛋白(F0)本身不显示细胞膜融合活性。然而，当切割F0片段的细胞外区(或病毒颗粒的外结构域)时，其显示融合活性。切割产生的两种F蛋白片段，即N末端侧和C末端侧片段，分别为F1和F2，其通过二硫键相连。术语 “切割F蛋白”指在细胞膜外侧的结构域切割膜上F蛋白，从而产生具有细胞融合力片段的过程。术语“切割位点序列”指蛋白酶进行切割所需的氨基酸序列或其中的必要残基。副粘病毒F蛋白的切割位点是本领域已知的，并且可以被胰蛋白酶样细胞内蛋白酶例如弗林蛋白酶(furin)切割。
弗林蛋白酶普遍存在于几乎所有细胞的高尔基体内。弗林蛋白酶的识别基序是Arg-X-Lys/Arg-Arg(RXK/RR)(通过“/”分隔的两种氨基酸表示任一氨基酸)。高致病性人PIV3(RTKR)，SV5(RRRR)，腮腺炎病毒(RHKR)，NDV(毒性株)强毒株(RQR/KR)，麻疹病毒(RHKR)，RS病毒(RKRR)等的切割位点包括这些基序的序列。强毒株的F蛋白对所有细胞中的蛋白酶都具有敏感性，该毒株的病毒可以在所有器官中通过切割F蛋白进行多步增殖。因此，这些病毒的感染是致命的。另一方面，具有弱毒性的仙台病毒(PQSR)，人PIV1(PQSR)，和NDV(无毒性株)弱毒株(K/RQG/SR)不含有该基序，只含Arg(其是丝氨酸蛋白酶识别序列)。副粘病毒F蛋白切割位点的序列已经彻底分析，且本领域熟练技术人员可根据文献识别它们(见例如，“Uirusu-gaku(Virology)”，Hatanaka，M.ed.，Tokyo，Asakura Shoten，247-248，1997)。
此外，切割位点可通过鉴定在可使副粘病毒生长的细胞，组织，个体等中生长的病毒的F蛋白的切割位点或者通过鉴定在这些细胞，个体等中表达的回收的F蛋白的切割位点而证实。可选地，F蛋白可通过用切割该蛋白的切割位点的蛋白酶例如胰蛋白酶处理细胞表面表达的F蛋白来人工切割鉴定。根据本发明的实施方案之一，F蛋白包含可以被另一种蛋白酶切割的修饰型F蛋白切割位点。为此，F蛋白的天然切割序列可以通过取代，缺失，和/或插入一或多个氨基酸来进行修饰，以便重构可以被另一种蛋白酶 切割的序列。对氨基酸序列的修饰可以通过传统的定点诱变法来进行。此外，修饰的F蛋白可保持被可切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的特性(见实施例)。编码这种经修饰的F蛋白的载体与野生型F蛋白相比具有扩大的蛋白酶依赖向性。
由另一种蛋白酶切割的序列可以是被优选蛋白酶切割的那些序列。例如，可以使用在作为载体导入优选靶组织或者靶细胞中选择性表达的蛋白酶切割的序列(WO 01/20989)。通过使用包含可被蛋白酶(如上述在靶组织中有活性)切割的序列的F蛋白基因设计载体，可在具有该蛋白酶活性的条件下，实现载体的增殖和特异性转移到周围细胞的良好特性。例如通过使用在特定组织中特异性表达或活化的蛋白酶的切割序列，可构建仅在所述组织中特异性浸润的载体。此外，通过利用在特定条件下(例如疾病)特异性表达或活化的蛋白酶的切割序列，可构建在这种条件下(例如仅在特定疾病损伤中)特异性浸润的载体。细胞内和细胞外的蛋白酶都可利用。例如，分泌到细胞外的蛋白酶，以及在膜表面表达的蛋白酶是优选的。可选地，所选蛋白酶可以是任何存在于F蛋白转运途径中(从细胞内翻译到在细胞表面分泌)的适宜蛋白酶。
许多疾病是由蛋白酶基因的异常表达导致的，包括，例如属于病理学总论范畴的所有类型的疾病，例如代谢性疾病，循环系统障碍，炎症和免疫性疾病，感染性疾病，和恶性肿瘤等。具体例子包括肌肉萎缩症中的钙蛋白酶，自我免疫性疾病以及神经疾病中的泛素蛋白-蛋白酶体系统的破坏，，老年性痴呆症中neprilysin的表达降低，癌浸润和转移中的MMP表达亢进，来自病原体微生物的病原体来源蛋白酶，止血机制中的丝氨酸蛋白酶，以及胎盘中的氨基肽酶。
钙蛋白酶是钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，是作为肌肉萎缩症中参与肌肉蛋白水解的一种酶而研究的。钙蛋白酶经过特定的活化机制，即通过和钙离子结合而被活化，且钙蛋白酶被认为通过对蛋白进行有限的细胞内降解激发肌肉蛋白水解，所述蛋白，例如α-肌动蛋白，肌钙蛋白，和肌联蛋白等对于保持骨骼肌结构非常重要。对于钙蛋白酶的切割序列(Karlsson，J.O.等，Cell Biol.Int.24，235-243，2000)，Leu-Leu-Val-Tyr被用作降解底物。
泛素蛋白-蛋白酶体系统是具有选择性和能动性的细胞内蛋白水解机制，并且是信号转导，细胞周期等的重要细胞功能调节系统。泛素蛋白由 76个氨基酸组成，通过泛素蛋白活化酶(E1)，泛素蛋白结合酶(E2)，和泛素蛋白连接酶(E3)的连续催化反应与蛋白共价结合。泛素蛋白化的蛋白由26S蛋白酶体降解。已知存在几百种E3酶，并且可粗分为HECT型和RING指型。大量疾病表明其中的这些酶具有异常活性。例如Leu-Leu-Val-Tyr被用作26S蛋白酶体的降解底物(Reinheckel，T.等，Arch.Biochem.Biophys.377，65-68，2000)。
关节疾病，例如慢性类风湿性关节炎，是关节软骨组织被破坏导致的运动障碍性疾病。关节软骨的再生能力非常低，并且由于细胞外基质降解使软骨构造被破坏导致进行性关节破坏。在这种软骨细胞外基质降解中，MMP和其近缘基因家族的“分解蛋白(disintegrin)和金属蛋白酶”(ADAM)分子的参与最近受到瞩目。具体地，ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的ADAM)分子被认为是降解软骨蛋白多糖(聚集蛋白聚糖)的必须酶(Tortorella，M.D.等，Science 284，1664-1666，1999)。此前，已经鉴定出了ADAMTS降解聚集蛋白聚糖的序列(Tortorella，M.D.等，J.Biol.Chem.275，18566-18573，2000)。
使用这些蛋白酶的识别序列，可以制备对表达这些蛋白酶的组织的特异载体。
本发明尤其优选的蛋白酶切割序列包括其活性在癌症中增强的那些蛋白酶。通过构建使用这种序列的载体，可构建特异性感染癌组织的载体。这种载体作为癌症治疗的基因转移用载体是非常有用的。在癌症中具有“增强的活性”的蛋白酶是与相应的正常组织或正常细胞中的活性相比，在特定癌组织或癌细胞中显示增强的活性的蛋白酶。其中术语“增强的活性”包括蛋白酶表达水平和/或其自身活性升高。蛋白酶表达水平可通过如下方法测定：例如Northern杂交(使用该蛋白酶基因片段作为探针)，RT-PCR(使用特异性扩增该蛋白酶基因的引物)，或者Westem印迹，ELISA，以及免疫沉降(使用该蛋白酶抗体)。蛋白酶的活性可以通过该蛋白酶底物的降解实验来测定。已知体内的许多蛋白酶的活性由各种抑制因子调节。蛋白酶的活性水平可通过测定这些抑制因子的表达水平来测定。
例如，细胞外基质(ECM)降解酶活性在转移癌中尤其增强(Nakajima，M.and Chop，A.M.，Semin.Cancer Biol.2，115-127，1991；Duffy，M.J.，Clin.Exp.Metastasis 10，145-155，1992；Nakajima，M.“Extracellular matrix degradation enzyme(Japanese)”，Seiki，M.ed.，“Malignant transformation andmetastasis of cancer”，Chugai Igaku，124-136，1993)。在动物中，包含蛋白例如胶原蛋白和蛋白多糖的基质在细胞间隙中形成。细胞外基质具体已知的成分包括，胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，腱生蛋白，弹性蛋白，蛋白多糖等。这些ECM具有调节细胞的粘附，发育，转移等的功能，以及通过与可溶因子结合调节其分布和活性的功能。ECM降解酶对ECM的浸润在癌转移中起重要作用，并且许多报告显示ECM降解酶抑制物可以抑制癌细胞的转移和对基底膜的浸润。特异性感染并浸润癌组织的载体可以通过编码修饰F蛋白而构建，所述F蛋白具有ECM降解酶在其切割位点上进行切割的识别序列。
根据其活性中心的催化性残基的种类，ECM降解酶分类成天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，和金属蛋白酶。具体地，对于体内的ECM降解，丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶(其是神经蛋白酶)起重要作用。丝氨酸蛋白酶广泛分布于微生物，动物，植物中。在高等动物中，它们参与极其广泛的多种生物反应，包括例如食物的消化，血液凝固，纤维蛋白溶解，免疫补体反应，细胞增殖，个体发生，分化，衰老，癌转移等。此外，丝氨酸蛋白酶的活性通常由丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)(通常存在于血浆和组织中)调节，该抑制物发生量性或质性异常可导致炎症。
降解ECM的丝氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶G，弹性硬蛋白酶，纤溶酶，纤溶酶原激活物，肿瘤胰蛋白酶，糜蛋白酶样神经蛋白酶，凝血酶等。纤溶酶通过对以非活性形式存在于体内的纤溶酶原进行有限降解而产生。所述有限降解通过纤溶酶原激活物(PA)及其抑制物，纤溶酶原激活物抑制物(PAI)调节。PA包含组织PA(tPA)，其参与血液凝固，以及尿激酶PA(uPA)，其参与ECM降解(Blasi，F.and Verde，P.，Semin.Cancer Bio.1，117-126，1990)。这两种PA的功能通过与PAI结合而被抑制(Cajot，J.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6939-6943，1990；Baker，M.S.等，Cancer Res.50，4676-4684，1990)。uPA在与细胞表面的uPA受体(uPAR)结合时起作用。纤溶酶降解纤连蛋白，腱生蛋白，层粘连蛋白等，但不能直接降解胶原蛋白。然而，其通过切割该酶的前体的一部分，来活化胶原蛋白降解酶，从而间接降解胶原蛋白。这些酶在癌细胞中通常显示增强的活性，并且与癌细胞转移能力密切相关(Tanaka，N.等，Int.J.Cancer 48，481-484，1991；Boyd，D.等，Cancer Res.48， 3112-3116，1988；Hollas，W.等，Cancer Res.51，3690-3695，1991；Correc，P.等，Int.J.Cancer 50，767-771，1992；Ohkoshi，M.等，J.Natl.Cancer Inst.71，1053-1057，1983；Sakaki，Y.等，New Horizon for Medicine(Japanese)17，1815-1821，1985)。
对uPA和tPA的切割序列已进行了许多研究(Rijken，D.C.等，J.Biol.Chem.257，2920-2925，1982；Wallen，P.等，Biochim.Biophys.Acta 719，318-328，1982；Tate，K.M.等，Biochemistry 26，338-343，1987)通常使用的底物序列包括VGR(Dooijewaard，G.，and KLUFT，C.，Adv.Exp.Med.Biol.156，115-120，1983)和底物S-2288(Ile-Pro-Arg)(Matsuo，O.等，Jpn.J.Physiol.33，1031-1037，1983)。Butenas等使用54种荧光底物来鉴定对tPA高度特异的序列(Butenas，S.等，Biochemistry 36，2123-2131，1997)，并显示tPA对两种序列FPR和VPR具有高降解活性。因此，这些序列是本发明尤其优选的。
其它ECM降解酶分类为半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶。它们也参与癌症的转移和浸润。具体例子包括：组织蛋白酶B(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1，137-152，1990)，其利用层粘连蛋白，蛋白多糖，纤连蛋白，胶原蛋白，原胶原蛋白酶(通过降解活化)等作为底物；组织蛋白酶L(Kane，S.E.and Gottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1，127-136，1990)，其利用弹性蛋白，蛋白多糖，纤连蛋白，层粘连蛋白，弹性硬蛋白酶(活化的)等作为底物；以及组织蛋白酶D(Rochefort，H.，Semin.Cancer Biol.1，153-160，1990)，其利用层粘连蛋白，纤连蛋白，蛋白多糖，以及组织蛋白酶B和L(活化的)作为底物。组织蛋白酶B和L在乳腺癌(Spyratos，F.等，Lancet ii，1115-1118，1989；Lah，T.T.等，Int.J.Cancer 50，36-44，1992)，和结肠癌肉瘤(Shuja，S.等，Int.J.Cancer 49，341-346，1991)中尤其高表达。据提示它们与其抑制因子之间的平衡的破坏与癌的恶性转化有关(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1，137-152，1990；Kane，S.E.and Gottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1，127-136，1990)。
金属蛋白酶是金属酶，其活性中心包含金属元素例如Zn。报道的金属蛋白酶包括caspase，氨基肽酶，血管紧张素I转化酶，和胶原酶。对于降解ECM的金属蛋白酶报道了16种或更多的基质金属蛋白酶(MMP)。代表性MMP包括胶原酶-1，-2，和-3(MMP-1，-8，和-13)，明胶酶A和B(MMP-2和-9)，溶基质素(stromelysin)1，2和3(MMP-3，-10，和-11)，matrilysin(MMP-7)，以及膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。通常，MMP的活性中心为 Zn2+，且其显示酶活性需要Ca2+。此外，MMP作为酶原被分泌(称为潜在MMP或ProMMP)，在细胞外活化后降解体内存在的多种ECM。此外，MMP的活性由一种抑制物抑制，即金属蛋白酶的组织抑制物(TIMP)。ECM降解性金属蛋白酶的其它实例包括降解ECM组成蛋白的氨基肽酶，例如氨基肽酶N/CD13和氨基肽酶B。根据使用抑制物的实验，报道了所有这些蛋白酶与癌症密切相关。
在这些蛋白酶中，胶原酶(例如，MMP-1，-8，和-13)在特定位点切割纤维胶原，即I，II，和III型胶原分子。已知两种明胶酶，即明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)。明胶酶也称IV型胶原酶，并且除了降解IV型胶原蛋白(基底膜的主要成分)以外，还降解V型胶原和弹性蛋白。此外，还已知MMP-2在与MMP-1相同的位置切割I型胶原。MMP-9不降解层粘连蛋白和纤连蛋白；但是MMP-2降解上述蛋白。溶基质素(MMP-3和-10)接受并降解广泛的底物，包括蛋白多糖；III，IV，和IX型胶原；层粘连蛋白；和纤连蛋白。Matrilysin(MMP-7)是缺乏血红素结合蛋白(hemopexin)结构域的分子，其与MMP-3具有相同的底物特异性，特别是，对蛋白多糖和弹性蛋白具有高分解活性。膜型金属蛋白酶(MT-MMPs)(MT1-MMP，MT2-MMP，MT3-MMP，MT4-MMP，MT5-MMP，和MT6-MMP)包含跨膜结构。MT-MMP具有位于前肽区和活性位点之间的插入序列(大约十个氨基酸)。所述插入序列包含Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa是氨基酸)，且在向细胞膜的转运过程中，所述插入序列通过弗林蛋白酶(细胞内加工酶)的切割而活化。已知的MT-MPP包括MT1-MMP(MMP-14)，MT2-MMP(MMP-15)，MT3-MMP(MMP-16)，MT4-MMP(MMP-17)，MT5-MMP(MMP-23)，和MT-6-MMP(MMP-25)。例如，MT1-MMP降解I，II和III型胶原，MT3-MMP降解III型胶原。
已知MMP的过度表达广泛见于癌细胞中。它们分类成由癌细胞自身导致的和由癌间质细胞导致的。例如，间质胶原降解性胶原酶(MMP-1)参与癌细胞的浸润，并且其活性水平与结肠癌的转移能相关(Wooley，D.E.，CancerMetastasis Rev.3，361-372，1984；Tarin，D.等，Br.J.Cancer 46，266-278，1982)。此外，IV型胶原酶(MMP-2和MMP-9)的活性与各种上皮癌的转移能高度相关(Liotta，L.A.and Stetler-Stevenson，W.G.，Semin.Cancer Biol.1，99-106，1990；Nakajima，M.Experimental Medicine 10，246-255，1992)。此外，还已知溶基质素(MMP-3)与皮肤上皮瘤(dermal epithelial tumor)的恶性改变相关 (Matrisian，L.M.and BoWden，G.T.，Semi.Cancer Biol.1，107-115，1990)。溶基质素-3(MMP-11)据观察在乳腺癌和结肠癌中高表达(Basset，T.等，Nature348，699-704，1990；Porte，H.等，Clin.Exp.Metastasis 10(Suppl.1)，114，1992)。
已知MMP的许多切割底物。可被所有MMP降解的底物序列的实例包括  PLGLWAR(Bickett，D.M.等，Anal.Biochem.212，58-64，1993)，GPLGMRGL(Deng，S.J.等，J.Biol.Chem.275，31422-31427，2000)，PQGLEAK(Beekman，B.等，FEBS Lett.390，221-225，1996)，RPKPVEWREAK(Beekman，B.等，FEBS Lett.418，305-309，1997)，和PLALWAR(Jacobsen，E.J.等，J.Med.Chem.42，1525-1536，1999)。MMP-2和-9的切割底物包括PLGMWS(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)和PLGLG(Weingarten，H.等，Biochemistry 24，6730-6734，1985)。
最近，通过噬菌体展示的肽文库扫描确定了MMP-9(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276，20572-20578，2001)，MMP-2(Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277，4485-4491，2002)，和MT1-MMP(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.In JBC Papersin Press，April 16，2002，Manuscript M111574200)的降解底物序列。在这些文章中，设定特定的氨基酸序列，并根据其是否被三种MMP降解而被分成四组。第IV组包括可由MT1-MMP特异性降解的序列，并且对于缺乏Arg的序列而言，VFSIPL和IKYHS序列被认为是不被MMP-9和MMP-2降解，仅被MT-MMP降解的底物。
例如，MMP-9的切割序列是Pro-X-X-Hy(其中，X代表任意残基；Hy，代表疏水残基)，尤其优选Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)。具体地实例包括Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)(切割出现在X和Hy残基之间)。Hy(疏水残基)的例子包括Leu，Val，Tyr，Ile，Phe，Trp，和Met，但不限于此。还鉴定了其它切割序列(例如，见下列文献中的组I，II，IIIA，和IIIB；Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276，20572-20578，2001)，可选择使用所需序列。上述Pro-X-X-Hy可用于MMP-2，此外，也可使用(Ile/Leu)-X-X-Hy，Hy-Ser-X-Leu，和His-X-X-Hy(见例如以下文献中的组I，II，III，和IV：Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277，4485-4491，2002)。MMP家族包括MMP-7，MMP-1，MMP-2，MMP-9，MMP-3，和MT1-MMP(MMP-14)的切割位点可以通过参考天然底物蛋白的序列或者筛选肽文库来适宜选择(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19， 661-667，2001；Woessner，J.F.and Nagase，H.，Matrix metalloproteinases andTIMPs.(Oxford University Press，Oxford，UK，2000)；Fernandez-Patron，C.等，Circ.Res.85，906-911，1999；Nakamura，H.等，J.Biol.Chem.275，38885-38890，2000；McQuibban，G.A.等，Science 289，1202-1206，2000；Sasaki，T.等，J.Biol.Chem.272，9237-9243，1997)。切割位点的8氨基酸序列P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’(切割出现在P1和P1’之间)实例包括VPMS-MRGG(对应MMP-1)，RPFS-MIMG(对应MMP-3)，VPLS-LTMG(对应MMP-7)，和IPES-LRAG(对应MT1-MMP)，但不限于此。PLAYWAR(Nezel-Amett，S.等，Anal.Biochem.195，86，1991)是MMP-8的切割序列的一个例子。MMP的各种合成底物可得，并且可互相比较(见，例如Calbiochem 
Figure S03815574520051229D000211
catalog，Merck中的每种MMP底物)。
通常，组织中的MMP活性通过以下过程调节：酶原产生，酶原活化，以及抑制物对活性酶的抑制。MMP活性参与各种生理现象，例如发育和排卵，受精，植入子宫内膜，以及伤口愈合。MMP活性调节失常导致各种病态，包括例如癌细胞浸润和转移，关节炎，齿龈炎，动脉硬化，肿瘤和纤维化。例如，已知降解基底膜成分的明胶酶(MMP-2和-9)对于癌症转移很重要。MMP-2通过MT1-MMP对MMP-2酶原(pro MMP-2)进行切割而活化。另一方面，MMP-9的活化途径如下，首先通过uPA分解纤溶酶原产生纤溶酶，纤溶酶激活MMP-3酶原，然后活化的MMP-3活化MMP-9酶原。该途径参与癌转移。为将本发明的载体开发成靶向癌症的载体，特别是，将所述参与癌转移的蛋白酶的切割序列作为F蛋白的切割位点导入载体是非常有用的。这种蛋白酶的实例包括MMP-2，MMP-9，uPA，MMP-3，和MT1-MMP，更具体为MMP-2，MMP-9和uPA。
将蛋白酶切割序列整合入F蛋白时，将目的蛋白酶切割序列插入F蛋白的切割位点，并且优选原有的胰蛋白酶样蛋白酶切割位点被去除。为实现该目的，原来的胰蛋白酶样蛋白酶的切割位点周围的氨基酸序列可以被目的蛋白酶切割序列(识别序列)替代。修饰的F蛋白在细胞中表达时被目的蛋白酶切割的同时，必须保持F蛋白的细胞膜融合活性。与F1片段(通过对F蛋白进行切割产生)的N末端接近的氨基酸被认为在细胞膜融合中起重要作用。因此，除非切割被抑制，切割序列的设计优选切割后的F1片段的N末端序列与野生型F蛋白相同。此外，为诱导有效切割反应使用将接头序 列插入切割位点的方法时，与野生型F1相比，优选在切割后的F1片段的N末端加入最小量的氨基酸序列的设计。例如，与野生型F1相比，在切割以后，有五个氨基酸以下，优选四个以下，或更优选三个以下(例如一个，两个，或三个氨基酸)的氨基酸被加入N末端。例如，本发明证实了在切割以后的经修饰的F蛋白的F1片段的N末端加入Met-Thr-Ser(SEQ ID NO：1)序列不损害MMP的切割功能以及细胞膜融合反应。因此，在切割后的F1的N末端加入所述切割序列优选设计成Met-Thr-Ser，或其保守取代序列或包含其部分序列的氨基酸。术语“保守取代”指其氨基酸侧链具有相似的化学性质的氨基酸之间的取代。具体地，Met可用Ile或Val取代，Thr可用Ser或Ala取代，且Ser可用Ala，Asn，或Thr取代。在各位置上氨基酸的取代可独立进行。
MMP-2和MMP-9的优选切割序列的更具体地实例包括包含Pro-Leu/Gln-Gly(SEQ ID NO：2)的序列。该序列是作为底物使用的合成底物中的共有序列(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)，并且将该序列设计在位于修饰的F蛋白被切割后的F2片段的C末端。为此，在野生型F蛋白被切割以后，包含F2片段C末端氨基酸的序列被包含Pro-Leu/Gln-Gly的序列取代。对应F蛋白的F2片段的C末端的一或多个氨基酸的原有序列被适当地去除，并且随后将Pro-Leu/Gln-Gly插入(即，进行取代)。被去除的氨基酸数目与被插入的氨基酸数目相等(例如三个氨基酸)，或者可以在0-10个氨基酸的范围内选择。只要蛋白酶切割和膜融合步骤不被阻碍，可制备使得F1的N末端直接连在Pro-Leu/Gln-Gly下游的F蛋白。然而，在仙台病毒的F蛋白中，切割序列和F1片段优选通过适宜的间隔区相连。尤其优选的包含这种间隔区的切割序列的例子是包括Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO：3)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO：4)的序列。Met，Thr，和Ser可用其它氨基酸保守取代。更优选的例子包括修饰的F蛋白，其中切割后的F2的C末端氨基酸向N末端方向序贯连接的1-10个残基(例如1，2，3，4，5或6个残基)，被包含Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr的序列取代。例如，以仙台病毒F蛋白为例，优选其对应于野生型F蛋白(SEQ ID NO：5)的F2片段的四个C末端氨基酸序列(尽管不同毒株的序列不同，通常是 113Pro-Gln-Ser-Arg116↓)被Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser取代。
本发明所述任何其它所需序列可用作MMP的切割序列。使用肽文库分析各种MMP的底物特异性(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19，661-667，2001)。对MMP-2(Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277(6)，4485-4491，2002)和MMP-9(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276(8)，20572-20578，200 1)进行了详细分析。尤其是对MMP-9而言，从P3到P2’(P3-P2-P1-P1’-P2’；切割发生在P1-P1’之间)的共有序列建议为Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(X＝任何残基；Hy＝疏水残基)。该共有序列也与推荐作为MMP-2的底物序列(Pro-X-X-Hy)之一相同，从而被认为是获取对MMP-2和MMP-9特异性的优良设计。因此，从以上观点来看，支持上述序列(Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr)为优选实例。具体地，F蛋白切割位点的序列优选包含Pro-X-X-Hy-Thr/Ser，并更优选包含Pro-X-X-Hy-Thr/Ser-Thr/Ser(“Thr/Ser”指Thr或Ser)。例如，不优选不与Pro-X-X-Hy-Thr/Ser配对的Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala和Pro-Gln-Gly-Leu-Tyr-Ala(图44)。通过将与Pro-X-X-Hy-Thr/Ser序列配对的肽插入F蛋白切割位点，可构建在MMP存在下显示高浸润力的载体。
优选切割序列的另一实例包括可被纤溶酶原激活物切割的那些序列。uPA和tPA的切割序列的具体实例包括含有Val-Gly-Arg的序列。F蛋白须设计成使得该序列位于切割后的修饰的F蛋白的F2片段的C末端。为此，切割后的野生型F蛋白，包含F2片段的C末端氨基酸的序列可以由包含Val-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)的序列取代。更优选的实例包括修饰的F蛋白，其中切割后的F2的C末端氨基酸向N末端方向序贯连接的1-10个残基(例如1，2，3，4，5或6个残基)被Val-Gly-Arg或包含该序列的序列取代。例如，以仙台病毒F蛋白为例，实例包括一种F蛋白，其中对应野生型F蛋白(SEQ ID NO：5)中的F2片段的C末端的三个氨基酸序列(尽管不同毒株的序列不同，通常是114Gln-Ser-Arg116↓(SEQ ID NO：7))被Val-Gly-Arg取代。
为有效鉴定存在特定蛋白酶时显示致融合力的修饰后F蛋白，可利用任何使用质粒载体的实验系统(实施例31)。具体地，表达修饰后F蛋白的质粒载体被转染到细胞内，并且在蛋白酶存在下对该细胞进行培养以检测是否有合胞体形成。用蛋白酶切割该质粒编码的修饰后F蛋白(其导致合胞体形成)以检测其是否显示融合活性。例如，为测定MMP切割的F蛋白，使用表达MMP的HT1080细胞。可选地，可将MMP加入培养系统。使用 本发明开发的实验系统，可轻易获得具有致融合力的修饰的F蛋白。
编码修饰的F蛋白的载体可将该载体中所含有的基因组RNA导入该载体转染的细胞接触的细胞中，所述过程依赖于切割修饰F蛋白的蛋白酶的存在。切割后的F蛋白可导致接触细胞之间的细胞融合，并且使RNP扩散到融合细胞当中。即，本发明的载体不形成病毒颗粒，然而，由于载体浸润到例如上述的接触细胞中，它可将载体转移到定位的区域。所述蛋白酶可以在细胞内或细胞外表达，或可以外源性添加。
本发明提供的修饰的F蛋白显示依赖特定蛋白酶的细胞致融合力。通过利用该蛋白，可构建仅在该蛋白酶存在下导致细胞融合或进行特异性感染的病毒载体，药物-基因递送载体例如脂质体。例如，通过将含有F和HN基因的腺病毒载体中的F基因设计成可被癌细胞中特异性表达的蛋白酶切割的修饰F蛋白的基因(Galanis，E.等，Hum.Gene Ther.12，811-821，2001)，以此开发可在特定蛋白酶存在下导致细胞融合的载体。此外，例如，使用F和HN蛋白将逆转录病毒假型化(pseudotyping)时(Spiegel，M.等，J Virol.72(6)，5296-5302，1998)，可利用修饰的F蛋白(该蛋白由在癌症中表达的蛋白酶切割)构建靶向癌细胞的载体(特异性感染癌症)。如上所述，除本发明中的载体以外，本发明提供的修饰的F蛋白和编码该蛋白的核酸可用来开发各种载体，所述载体依赖蛋白酶的存在。
此外，本发明提供包含修饰的F蛋白(通过缺失细胞质区增加了细胞致融合力)的副粘病毒载体。胞质区的部分氨基酸被缺失，使得0-28个，优选1-27个，更优选4-27个氨基酸存在于修饰后F蛋白的胞质区中。术语“胞质区”指膜蛋白的胞质侧，且在F蛋白中，其对应膜(TM)区的C末端区(见图42)。例如，F蛋白的胞质区包含6-20个，优选10-16个，且更优选13-15个氨基酸，其与野生型F蛋白相比，显示明显的高水平细胞融合力。因此，通过制备包含修饰的F蛋白(其胞质区包含大约14个氨基酸)的副粘病毒载体，获取与使用野生型F蛋白的载体相比具有更高的细胞致融合力的载体。优选，所述缺失的F蛋白缺乏10个或更多，更优选20个或更多，更优选25个或更多，且更优选28个或更多的野生型F蛋白的C末端氨基酸。根据最优选的实例，胞质区缺失型F蛋白缺乏大约28个野生型F蛋白的C末端氨基酸。基因组包含编码这些胞质区缺失型F蛋白的基因的副粘病毒载体与普通的载体相比，具有更高的细胞融合力，并因此，具有更强的浸润到 周围细胞中的能力。如本文所述，对F蛋白切割位点进行修饰可产生仅在特定蛋白酶存在时显示高浸润能力的载体。
本发明还涉及由副粘病毒所携带的两种刺突蛋白构成的融合蛋白。副粘病毒具有在细胞融合中起作用的蛋白(称“F”蛋白)和在细胞粘附中起作用的蛋白(称“HN”或“H”蛋白)。本文中，前者通常称为F蛋白，后者称HN蛋白。将这两种蛋白表达为融合蛋白时，其与所述蛋白分开表达时相比，显示极强的致融合力。在所述融合蛋白中，所述蛋白通过其胞质区的一部分相结合。具体地，所述融合蛋白包含位于N末端的F蛋白，和位于其C末端的HN(或H)蛋白。当融合所述蛋白时，可融合全长的所述蛋白，或可选地，融合胞质区部分或全部缺失的F蛋白和HN(或N)蛋白。在后一种情况下，从F蛋白TM区的下游到HN(或H)蛋白的氨基酸残基数目是5个以上，优选10个以上，更优选14个以上，且更优选20个以上。例如将胞质区缺失型F蛋白与HN(或H)蛋白融合时，优选通过将长度适当的接头肽加入F蛋白部分的C末端来调节长度。具体地，优选使用通过任意接头肽与HN(或H)蛋白融合的胞质区缺失型F蛋白(包含胞质区的14个残基)。接头肽的氨基酸序列没有特别的限制；但优选采用不具有显著生理活性的多肽，包括该多肽的适宜实施例见图43(SEQ ID NO：80)。
本发明还涉及编码这些融合蛋白的核酸，以及包含这些核酸的表达载体。由这些表达载体转染的细胞显示强致融合力，并通过与周围细胞进行融合形成合胞体。表达载体没有特别的限制，并且包括，例如质粒载体和病毒载体。对于DNA载体而言，优选与强启动子例如CAG启动子(包含鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子的嵌合启动子)联用(Niwa，H.等，Gene 108，193-199，1991)。表达本发明蛋白的病毒载体在转染细胞中产生强融合。适宜病毒载体的实例包括逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，负链RNA病毒载体，单纯疱疹病毒载体，(逆转录病毒载体，慢病毒载体？)，Semliki森林(Semliki forest)病毒载体，新培斯病毒载体，痘苗病毒载体，禽痘病毒载体，以及其它优选病毒载体。表达本发明蛋白的副粘病毒载体对多种组织都显示高浸润力。具体地，使用M基因缺失的副粘病毒载体(其编码具有修饰的F蛋白切割位点的本发明的融合蛋白)，可以产生在特定组织中诱导强细胞融合的载体。
这些重组病毒载体，可使用本领域众所周知的方法制备。例如，最常用 于基因治疗的腺病毒载体可以通过Saito等的方法和其它方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，1320-24，1996；Kanegae等，Acta Paediatr.Jpn.，38，182-188，1996；Kanegae等，“Baiomanyuaru shiriizu 4-Idenshi-donyu to Hatsugen·Kaisekiho (BiomanualSeries 4：Methods for gene transfection，expression，and analysis)”，Yodosha，43-58，1994；Kanegae等，Cell Engineering，13(8)，757-763，1994)构建。此外，例如逆转录病毒载体(Wakimoto等，Protein Nucleic acid and Enzyme(Japanese)40，2508-2513，1995)，腺伴随病毒载体(Tamaki等，Protein Nucleicacid and Enzyme(Japanese)40，2532-2538，1995)可通过传统方法制备。作为制备其它能够将基因转移到哺乳动物中的病毒载体的具体方法，已知制备重组痘苗病毒的方法，其公开的日文翻译版国际公开Hei 6-502069，审查过的公开日本专利申请(JP-B)Hei 6-95937，和JP-B Hei 6-71429中均有描述。制备重组乳头瘤病毒的已知方法包括JP-B Hei 6-34727，和公开的日文翻译版国际公开Hei 6-505626中描述。此外，制备重组腺相关病毒和重组腺病毒的已知方法在包括未审查的公开日本专利申请(JP-A)Hei 5-308975和公开的日文翻译版国际公开Hei 6-508039中分别描述。
在RNA基因组(其包含在本发明一实例提供的载体中)中，编码基质(M)蛋白的基因(即M基因)被突变或缺失。根据本发明，F蛋白的切割位点被修饰成可被另一种蛋白酶切割的序列，并且M基因被突变或缺失以抑制颗粒形成能力。因此，具有全新性质的载体(其不释放病毒颗粒，且仅浸润一组表达特定蛋白酶的细胞)被成功地开发出来。M基因的突变消除或显著降低了宿主内环境中的颗粒形成活性。表达该M蛋白的细胞中的这种突变可通过检测该蛋白在细胞表面的聚集降低来鉴定(见实施例)。
根据本发明，抑制颗粒的二次释放(即释放VLP)的最有效的修饰，证实是M蛋白的缺失。该事实也由有关仙台病毒(SeV)和其它负(-)链RNA病毒中M蛋白在病毒粒子形成中的作用的研究报告所支持。例如，发现疱疹性口炎病毒(VSV)中M蛋白的单独过度表达导致VLP出芽(Justice，P.A.等，J.Virol.69，3156-3160，1995)；同样，副流感病毒VLP形成据报道也仅在M蛋白过度表达时出现(Coronel，E.C.等，J.Virol.73，7035-7038，1999)。虽然这种仅由M蛋白导致的VLP形成没有在所有(-)链RNA病毒中观察到，但可以以此对M蛋白作为(-)链RNA病毒中病毒粒子形成的核心(Garoff，H.等， Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，1171-1190，1998)，取得共识。
M蛋白在病毒粒子形成中的具体作用总结如下：病毒粒子在细胞膜上所谓的脂筏(lipid raft)中形成(Simons，K.and Ikonen，E.，Nature 387，569-572，1997)。这些最初被鉴定为不溶于非离子清洁剂(例如Triton X-100)的脂质片段(Brown，D.A.and Rose，J.K.，Cell 68，533-544，1992)。已显示了以下病毒的病毒粒子在脂筏中的形成：流感病毒(Ali，A.等，J.Virol.74，8709-8719，2000)，麻疹病毒(MeV；Manie，S.N.等，J.Virol.74，305-311，2000)，SeV(Ali，A.andNayak，D.P.，Virology 276，289-303，2000)等。在这些脂筏位点，M蛋白浓缩包膜蛋白(也称刺突蛋白)和核糖核蛋白(RNP)，以促进病毒粒子形成。换言之，M蛋白可对病毒装配和出芽起驱动作用(Cathomen，T.等，EMBO J.17，3899-3908，1998；Mebatsion，T.等，J.Virol.73，242-250，1999)。实际上，显示M蛋白与流感病毒(Zhang，J.等，J.Virol.74，4634-4644，2000)，SeV(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67，651-663，1993)的刺突蛋白胞质尾结合。它还结合流感病毒(Ruigrok，R.W.等，Virology 173，311-316，1989)，副流感病毒，SeV(Coronel，E.C.等，J.Virol.75，1117-1123，2001)等的RNP。此外，对于SeV(Heggeness，M.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，6232-6236，1982)和疱疹性口炎病毒等(VSV；Gaudin，Y.等，Virology 206，28-37，1995；Gaudin，Y.等，J.Mol.Biol.274，816-825，1997)，据报道M蛋白与其自身形成寡聚物。因此，M蛋白具有与许多病毒成分和脂质结合的能力，认为该蛋白作为病毒组装和出芽的驱动力而起作用。
此外，一些报道提示对包膜蛋白(刺突蛋白)的修饰也可抑制VLP的释放。以下实验性实施例是具体的报道，其中病毒粒子的形成证实被抑制：狂犬病毒(RV)中G蛋白缺陷导致VLP形成降低了1/30(Mebatsion，T.等，Cell84，941-951，1996)。当M蛋白缺陷时，该水平降低到1/500,000或更低(Mebatsion，T.等，J.Virol.73，242-250，1999)，此外，对麻疹病毒(MeV)而言，细胞-细胞融合在M蛋白缺陷时增强(Cathomen，T.等，EMBO J.17，3899-3908，1998)。推定这是由于病毒粒子形成受到抑制的缘故(Li，Z.等，J.Virol.72，3789-3795，1998)。此外，F或H蛋白胞质尾(胞质侧的尾)中发生突变时，也会导致类似的融合增强(Cathomen，T.等，J.Virol.72，1224-1234，1998)。因此，单独导入导致F和/或HN蛋白的胞质尾缺失的突变也可抑制颗粒形成。 然而，据报道尤其是在SeV中，F缺失型(WO 00/70070)或HN缺失型(Stricker，R.and Roux，L.，J.Gen.Virol.72，1703-1707，1991)中有许多VLP存在.因此，由修饰这些刺突蛋白获得的效果是比较局限的。此外，SeV在以下几个方面也已经得到证实：当SeV的F和HN蛋白在分泌途径上时(具体地，当它们位于高尔基体中时等)，其胞质尾(F和HN蛋白的)与M蛋白结合(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67，651-663，1993；Sanderson，C.M.等，J.Virol.68，69-76，1994)。因此，认为该结合对有效地将M蛋白转移到细胞膜脂筏(病毒粒子在其中形成)上很重要。并且认为胞质中存在的M蛋白通过该结合，经F和HN蛋白的分泌途径被转移到细胞膜。如上所述，M蛋白在病毒颗粒形成中起重要作用。使用修饰的M蛋白基因(其消除M蛋白在细胞表面的聚集)可产生不具有病毒粒子形成能力的载体。
M蛋白的亚细胞定位可通过细胞分级测定，以及使用免疫染色直接检测M蛋白的定位。在免疫染色中，例如，用荧光标记抗体染色M蛋白后，可在共聚焦激光显微镜下观察。可选地，细胞被裂解后，可通过使用已知的细胞分级法制备细胞级分，并且可随后使用例如免疫沉降或Western印迹，利用M蛋白抗体，通过鉴定含M蛋白的级分来进行定位。病毒粒子在所谓的细胞膜脂筏中形成，即不溶于非离子清洁剂例如Triton X-100的脂质片段。M蛋白具有结合刺突蛋白，RNP，以及M蛋白本身，进而结合脂质的能力，因此，认为其参与病毒成分在脂筏中的聚集。由此，推定M蛋白(通过电泳利用脂筏片段检测)反映了聚集的M蛋白。即，当可检测到的M蛋白的量降低时，可判断为细胞表面的M蛋白聚集也降低。M蛋白在细胞表面的聚集可使用本发明人用来检测亚细胞定位的免疫细胞学染色法直接观察。该方法利用了可用于免疫细胞学染色的抗M抗体。使用该方法进行研究时，当M蛋白聚集时，在细胞膜附近可观察到较强的浓缩图像。当M蛋白不发生聚集时，观察不到上述浓缩模式，也没有清晰的细胞膜轮廓，细胞质整体呈现较浅的染色。因此，当只能观察到很少的或者没有浓缩模式，细胞膜轮廓不清楚，且细胞质整体呈现较浅染色时，可判断为细胞表面的M蛋白聚集下降。
具有显著降低细胞表面聚集活性的突变M蛋白与野生型M蛋白相比，被认为具有显著降低颗粒形成的能力。上述病毒颗粒形成能力的降低具有统计学显著性(例如，在显著水平为5％或更低时)。通过使用例如Student t 检验或Mann-Whitney U检验进行统计检验。包含突变M基因的病毒载体在宿主内环境中的颗粒形成能力被降低到优选1/5以下的水平，更优选1/10以下，更优选1/30以下，更优选1/50以下，更优选1/100以下，更优选1/300以下，且更优选1/500以下的水平。最优选，本发明的载体在宿主内环境中基本缺乏病毒粒子产生能力。术语“基本缺乏“指在宿主内环境中没有检测到病毒颗粒的产生。在这种情况下，存在的病毒颗粒浓度为103/ml以下，优选102/ml以下，更优选101/ml以下。
病毒颗粒的存在可通过在电子显微镜等下观察直接证实。可选地，可使用病毒核酸或蛋白作为指示物来进行检测或定量。例如，病毒颗粒中的基因组核酸可以通过常规的核酸检测法例如聚合酶链反应(PCR)来检测和定量。可选地，包含异源基因的病毒颗粒可以通过将其感染到细胞中并检测该基因的表达来定量。非感染性病毒颗粒可以通过利用转染剂将所述颗粒导入细胞以后检测基因表达来定量。本发明的病毒颗粒包含没有感染性的颗粒，例如VLP。
此外，病毒的滴度可通过例如测定细胞感染单位(CIU)或血细胞凝血活性(HA)(WO 00/70070；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996；Yonemitsu，Y.and Kaneda，Y.，“Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated genedelivery to vascular cells.”，Ed.by Baker，A.H.，Molecular Biology of VascularDiseases.Methods in Molecular Medicine.，Humana Press.，295-306，1999)来测定。对于用标记基因例如GFP基因标记的载体，可使用该标记作为标志物(例如作为GFP-CIU)通过直接计数感染的细胞来定量病毒滴度，如实施例所述。由此测定的滴度可认为与CIU相等(WO 00/70070)。例如，当细胞被可能包含有病毒颗粒的样品转染时，可以通过检测不到其有感染力滴度来证实丧失了病毒颗粒产生能力。没有感染力的病毒颗粒(VLP)可通过使用脂转染剂进行转染来检测。具体地，例如可使用DOSPER脂质体转染剂(Roche，Basel，Switzerland；Cat.No.1811169)。将100μl含有或不含有病毒颗粒的溶液和12.5μl DOSPER混合后，在室温下放置10分钟。将此混合物转染到长满培养皿底部的6孔板细胞中，并每经15分钟振摇一次。VLP可以通过转染二天后是否具有感染细胞来进行检测。
术语“宿主内环境”指包含导致野生型副粘病毒(所述载体来自该病毒)增殖的自然宿主内环境，或者具有等同病毒增殖的环境。宿主内环境可以 具有，例如，该病毒的最佳生长条件。以哺乳动物为宿主的副粘病毒，其宿主内环境指哺乳动物体内环境，或者与其等同的环境。其温度大约37℃-38℃(例如，37℃)，对应哺乳动物体内的温度。体外条件的实例包括常规细胞培养条件，更具体为在潮湿环境中，含有或不含血清的培养基(pH 6.5to 7.5)，37℃，5％CO2。
由于环境条件导致的修饰M蛋白的活性差异在包括M蛋白的条件性突变中具有重要意义，例如温度敏感性突变。术语“条件性突变”指在宿主内环境中显示“功能丧失型”变异特性，而在特异环境中显示功能活性的突变。例如，可优选使用编码温度敏感性突变M蛋白的基因，其大部分或全部功能在37℃下丧失但在较低温度下恢复。术语“温度敏感性突变”指其活性在高温(例如37℃)下比在低温(例如32℃)下时显著降低的突变。本发明人使用M蛋白的温度敏感性突变体成功的制备了其颗粒形成能力在37℃(该温度对应宿主内环境)时明显降低的病毒颗粒。该M蛋白突变体在低温条件(例如，32℃)下在细胞表面发生聚集并形成病毒颗粒；而在宿主正常体温(37℃)条件下，该蛋白丧失聚合力且不能形成病毒颗粒。在基因组中包含编码这种温度敏感性M蛋白突变体的核酸的载体优选作为本发明的载体。这种病毒载体的M蛋白被编码成条件突变型M蛋白，所述条件突变型M蛋白在M蛋白具有功能的条件，即容许条件下通过病毒载体的复制发挥其功能以形成病毒颗粒。当以这种方式产生的病毒颗粒在正常环境中被感染时，M蛋白不能起作用，因此没有颗粒形成。
温度敏感型M基因突变没有特别的限制，但其包括例如至少一个选自以下的氨基酸位点：仙台病毒M蛋白的G69，T116，和A118，优选两个选自其中的位点，并更优选具有所述所有三个位点。包含同源突变的其它(-)链RNA病毒M蛋白也可适宜地使用。本文中，G69指M蛋白中的第69个氨基酸即甘氨酸，T116指M蛋白中的第116个氨基酸即苏氨酸，且A183指M蛋白中的第183个氨基酸即丙氨酸。
编码M蛋白的基因(即M基因)在(-)链RNA病毒中被广泛保存，并已知具有与病毒核壳及包膜蛋白相互作用的功能(Garoff，H.等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，117-190，1998)。SeV M蛋白的氨基酸序列104-119(104-KACTDLRITVRRTVRA-119/SEQ ID NO：45)推定形成α-螺旋，并鉴定为病毒颗粒形成的重要区域(Mottet，G.等，J.Gen.Virol.80，2977-2986， 1999)。该区域在(-)链RNA病毒中被广泛保存。M蛋白氨基酸序列在(-)链RNA病毒中相似。具体地，副粘病毒亚科的病毒中已知的M蛋白通常是具有330-380个氨基酸残基的碱基蛋白。它们的结构在整个区域是相似的，特别是C末端的一半区域具有特别高的同源性(Gould，A.R.，Virus Res.43，17-31，1996；Harcourt，B.H.等，Virology 271，334-349，2000)。因此，例如与SeV M蛋白的G69，T116和A183同源的氨基酸可轻易鉴定。
对应SeV M蛋白的G69，T116和A183的其它(-)链RNA病毒M蛋白的同源位点上的氨基酸残基可由本领域熟练技术人员利用包括比对形成功能的氨基酸序列同源性搜索程序例如BLAST或比对形成程序例如CLUSTAL W，通过与SeV M蛋白进行比对而鉴定。对应SeV M蛋白中的G69的M蛋白同源位点包括人副流病毒-1(HPIV-1)中的G69；人副流感病毒-3(HPIV-3)；海豹瘟热病毒(PDV)中和犬瘟热病毒(CDV)的G70；海豚麻疹病毒(DMV)中的G71；小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)中的G70；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的G81；人副流感病毒-2(HPIV-2)中的G70；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的E47；和腮腺炎病毒(Mumps)中的E72。(括号中的描述表示简称；字母和数字表示氨基酸和位置)。对应SeV M蛋白中的T116的M蛋白同源位点包括人副流感病毒-1(HPIV-1)中的T116；人副流感病毒-3(HPIV-3)中的T120；海豹瘟热病毒(PDV)和犬瘟热病毒(CDV)中的T104；海豚麻疹病毒(DMV)中的T105；小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)中的T104；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的T120；人副流感病毒-2(HPIV-2)和猴副流感病毒5(SV5)中的T117；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的T121；腮腺炎病毒(Mumps)中的T119；和新城疫病毒(NDV)中的S120。对应SeV M蛋白中的A183的M蛋白同源位点是人副流感病毒-1(HPIV-1)中的A183；人副流感病毒-3(HPIV-3)中的F187；海豹瘟热病毒(PDV)和犬瘟热病毒(CDV)中的Y171；海豚麻疹病毒(DMV)中的Y172；小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)中的Y171；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的Y187；人副流感病毒-2(HPIV-2)中的Y184；猴副流感病毒5(SV5)中的F184；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的F188；腮腺炎病毒(Mumps)中的F186；和新城疫病毒(NDV)中的Y187。在上述病毒中， 适合用于本发明的病毒包括含有编码M蛋白突变体的基因组的那些病毒，其中的氨基酸残基在上述三个位点之一被取代，优选在这三个位点中任意两个被取代，且更优选在所有三个位点被取代。
氨基酸突变包括任何其它理想氨基酸的突变。然而，优选取代其侧链具有不同化学性质的氨基酸。氨基酸可分组为碱性氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)；酸性氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)；不带电荷极性氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)；非极性氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)；分枝氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)；和芳香氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。属于特定氨基酸组的一种氨基酸残基可用属于不同组的另一种氨基酸取代。具体例子包括但不限于：  用酸性或中性氨基酸取代碱性氨基酸；用非极性氨基酸取代极性氨基酸；用分子量小于20个天然氨基酸平均分子量的氨基酸取代分子量大于上述平均值的氨基酸；以及反过来，用分子量大于该平均值的氨基酸取代分子量小于该平均值的氨基酸。例如，可适宜地使用包含选自G69E，T116A，和A183S的突变的仙台病毒M蛋白或包含其同源位置突变的其它副粘病毒M蛋白。本文中，G69E指位于M蛋白第69位的甘氨酸被谷氨酸取代的突变，T116A指其中第116位的苏氨酸被丙氨酸取代的突变，而A183S指其中第183位的丙氨酸被丝氨酸取代的突变。换言之，仙台病毒M蛋白中的G69，T116和A183以及其它病毒中的同源M蛋白位点可分别由谷氨酸(E)，丙氨酸(A)，和丝氨酸取代。这些突变优选联合利用，且尤其优选包含所有上述三种突变。M基因诱变可根据已知的诱变方法进行。例如，如实施例所述，可使用含有目的突变的寡核苷酸导入突变。
例如对麻疹病毒而言，可以使用温度敏感株P253-505的M基因序列(其中抗M蛋白单克隆抗体的表位序列已经改变)(Morikawa，Y.等，Kitasato Arch.Exp.Med.64，15-30，1991)。此外，麻疹病毒M蛋白的104位残基苏氨酸，或者腮腺炎病毒M蛋白的119位残基苏氨酸(上述残基对应SeV M蛋白的116位残基苏氨酸)，可以用其他氨基酸(例如丙氨酸)取代。
根据更优选的实施方案，本发明的载体包含M基因缺失。术语“M基因缺失”指M基因的功能缺失，包含功能缺陷型突变的M基因的情况，以及M基因从载体中缺失的情况。功能缺陷型M基因突变可以通过例如缺失 M基因蛋白编码序列，或者插入另一序列而产生。例如，可以将终止密码子插入M蛋白编码序列当中(WO 00/09700)。更优选，本发明的载体完全缺失M蛋白编码序列。和编码条件突变型M蛋白的载体不同，没有M蛋白开放阅读框架(ORF)载体在任何条件下都不能产生病毒颗粒。
为了制备本发明的载体，在RNP(其包含副粘病毒基因组RNA)重构所需的病毒蛋白即N，P和L蛋白存在下，对编码副粘病毒基因组RNA的cDNA进行转录。病毒RNP可以通过形成负链基因组(即与病毒基因组相同的反义链)或者正链(编码病毒蛋白的有义链)而进行重构。为提高重构效率，优选形成正链。RNA末端的3’前导序列和5’尾随序列优选尽可能精确反映天然病毒基因组的序列。为精确控制转录产物的5’末端，可将T7 RNA聚合酶识别序列用作转录起始位点来在细胞中表达该RNA聚合酶。转录产物地3’末端可以通过如下方法控制：例如将自主切割型核酶编码到所述3’末端来保证其被精确地切断(Hasan，M.K.等，J.Gen.Viro1.78，2813-2820，1997；Kato，A.等，EMBO J.16，578-587，1997；Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997)。
为了使异源基因容易插入到cDNA当中，可以在编码RNA基因组的cDNA中设计异源基因插入的克隆位点。所述位点包含基因组的蛋白非编码区的任何优选位置。具体地，所述位点可以插入到3’前导区和最接近3’末端的病毒蛋白ORF之间，各种病毒蛋白ORF之间，和/或最接近5’末端的病毒蛋白ORF和5’尾随区之间。在M基因缺陷型基因组中，所述克隆位点可被设计成位于M基因的缺失位点。所述克隆位点可以是，例如限制酶的识别序列。所述克隆位点可以是包含多种限制酶识别序列的所谓多克隆位点。该克隆位点可以分别存在于基因组的多个位点上，从而可将多个异源基因分别插入到基因组的不同位置。
缺乏颗粒形成能力的重组病毒RNP可以根据例如“Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997”，“Kato，A.等，EMBO J.16，578-587，1997”and“Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997”中的描述构建。该方法描述如下：
为导入异源基因，首先制备包含目的异源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。所述DNA样品优选25ng/μl或以上的浓度，并通过电泳鉴定为单质粒。以下描述了利用NotI位点将异源基因插入到编码病毒基因组RNA的DNA中的实例：如果靶cDNA序列含有NotI识别位点，优选使用 例如定点诱变技术，在不改变其编码氨基酸序列的基础上，通过只改变其核苷酸序列，预先将该位点去除。使用PCR从该DNA样品中扩增并回收目的基因片段。通过将NotI位点附加在两种引物的5’区，使扩增片段的两端都具有NotI位点。E-I-S序列或其部分包含在引物中，使得E-I-S序列位于异源基因插入位点两侧的病毒基因的ORF和异源基因(将其并入病毒基因组之后)的ORF之间。
例如，为保证NotI进行切割，正向侧(forward side)合成DNA序列如下：在其5’侧任意选择两个或更多核苷酸(优选四个核苷酸，不包括例如GCG和GCC这样来自NotI识别位点的序列；更优选ACTT)，并且将NotI识别位点“gcggccgc”加入其3’侧。此外，间隔序列(9个任意核苷酸，或者9+6的倍数个核苷酸)，和ORF(大约25个核苷酸并包含目的cDNA的起始密码子ATG的序列)也被顺次加到3’侧。优选从目的cDNA选择大约25个核苷酸，使得G或C成为正向侧合成寡DNA的3’末端最后的核苷酸。
反向侧合成DNA序列如下：从5’侧选择两或多个任意核苷酸(优选四个核苷酸，不包括例如GCG和GCC这样来自NotI识别位点的序列；更优选ACTT)，并且将NotI识别位点“gcggccgc”加入其3’侧并且进一步将寡DNA插入片段加在其3’末端以调节长度。该寡DNA的长度设计成使得最终PCR扩增产物的NotI片段(包含E-I-S序列)的核苷酸数目是6的倍数(所谓的“6倍规则”；Kolakofski，D.等，J.Virol.72，891-899，1998；Calain，P.andRoux，L.，J.Virol.67，4822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.67，4822-4830，1993)。当使用加入了E-I-S序列的引物时，将与仙台病毒S序列互补的序列，优选5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO：8)，与I序列互补的序列，优选5’-AAG-3’，以及与E序列互补的序列，优选5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO：9)，付加在插入片段的寡DNA的3’侧。并在上述序列的3’侧进一步加入包含互补序列的适当长度的序列，所述互补序列大约为25个核苷酸(从目的cDNA的终止密码子开始逆向计数)，且选择G或C为此反向侧合成DNA的3’末端的最后的核苷酸。
可根据常规方法使用Taq聚合酶或其他DNA聚合酶等进行PCR。如此扩增的目的片段用NotI消化后，插入到质粒载体pBluescript中的NotI位点。由此获得的PCR产物的核苷酸序列可使用测序仪证实，以选择包含正确序列的质粒。用NotI从质粒中切下插入片段，并将其克隆到携带基因组cDNA 的质粒的NotI位点中。可选地，重组仙台病毒cDNA可以通过将所述片段直接插入NotI位点获得，而无需经过质粒载体的克隆步骤。
例如，重组仙台病毒基因组cDNA可根据参考文献中的描述构建(Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997)。例如将包含NotI限制位点(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′)(SEQ ID NO：10)的18-bp的间隔序列插入到经克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))的前导序列和N蛋白的ORF之间，并由此获得含有来自丁型肝炎病毒反基因组链的自主切割核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，J.General Virology 78，2813-2820，1997)。
此外，例如将M基因缺损或者导入温度敏感性突变时，编码基因组RNA的cDNA用限制酶消化后，回收此包含M基因的片段并将其克隆到适当的质粒中。在此质粒中构建M基因诱变或M基因缺失的位点。突变的导入可以通过例如使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)并根据试剂盒中描述的方法实施。例如，M基因缺损或缺失可以通过联合使用PCR-连接法来进行，从而实现M基因ORF的全部或部分缺失，并连接适当的间隔序列。获得M基因突变型或缺陷型序列后，回收包含所述序列的片段，并且使用该序列取代原来的全长cDNA中的M基因。由此，可产生包含突变的M基因的病毒基因组cDNA。使用类似的方法，可将突变导入例如F和/或HN基因。
本发明的载体可通过在病毒蛋白存在下，于细胞内转录编码基因组RNA的DNA来进行重构。本发明提供编码本发明载体的病毒基因组RNA的DNA，其可用于制备本发明的载体。此外，本发明还涉及编码该载体基因组RNA的DNA在制备本发明载体中的用途。从(-)链RNA病毒的基因组cDNA进行病毒重构可使用已知的方法实施(WO 97/16539；WO 97/16538；Durbin，A.P.等，Virology 235，323-332，1997；Whelan，S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，8388-8392，1995；Schnell.M.J.等，EMBO J.13，4195-4203，1994；Radecke，F.等，EMBO J.14，5773-5784，1995；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4477-4481，1995；Garcin，D.等，EMBO J.14，6087-6094，1995；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virol.71，1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，15400-15404，1996)。使用这些方法，(-)链RNA 病毒或作为病毒组成部分的RNP可从其DNA重构，所述(-)链RNA病毒包括例如副流感病毒，疱疹性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，仙台病毒等。本发明的载体可以根据这些方法重构。
具体地，本发明的载体可以通过以下步骤产生：(a)在表达N，P和L蛋白的细胞中转录cDNA，所述cDNA编码上述副粘病毒基因组RNA(负链RNA)或其互补链(正链)；和(b)从所述细胞或其培养物上清中收集包含基因组RNA的复合物。转录的基因组RNA在N，L，和P蛋白存在下进行复制以形成RNP复合物。当步骤(a)在切割所述基因组编码的修饰的F蛋白的蛋白酶存在下进行时，产生的RNP被转移到与所述细胞接触的细胞，并借以进行感染扩散和载体扩增。根据该方法，即使不存在功能性M蛋白，本发明的载体也可以以RNP的形式产生。
起始从DNA中转录基因组RNA所需的酶，例如T7 RNA聚合酶，可通过转染表达所述酶的质粒或病毒载体而提供。可选地，所述酶可通过将其基因整合入细胞染色体中，在病毒重构中诱导表达提供。此外，基因组RNA和载体重构所需的病毒蛋白，可通过例如导入表达这些蛋白的质粒提供。为提供这些病毒蛋白，可使用辅助病毒例如野生型副粘病毒或者特定的突变型副粘病毒。然而，由于这会导致这些病毒造成的污染，所以不优选使用辅助病毒。
将表达基因组RNA的DNA转移到细胞中的方法包括，例如，以下方法：1)制备可由靶细胞吸收的DNA沉淀物的方法；2)制备具有较少细胞毒活性并适宜于靶细胞吸收的含正电荷DNA的复合物的方法；和3)使用电脉冲瞬间在靶细胞膜上产生可使DNA分子通过的微孔的方法。
在上述方法2)中，可用多种转染试剂，实例包括DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)等。方法1)的实例是使用磷酸钙进行转染的方法，进入细胞内的DNA虽然被并入吞噬体，但已知也有足够量的DNA可进入到细胞核中(Graham，F.L.andVan Der Eb，J.，Virology 52，456，1973；Wigler，M.and Silverstein，S.，Cell 11，223，1977)。Chen和Okayama已经研究如何优化该转染技术，并报道可在如下条件获得最佳沉淀：1)在含2％-4％CO2的空气中，在35℃下将细胞和共沉淀物一同温育15-24小时；2)使用比线形DNA具有更高活性的环状DNA；和3)沉淀混合物中DNA的浓度是20-30μg/ml(Chen，C.and Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.7，2745，1987)。方法2)适合一次性转染。过去的已知方法是使用含有适当浓度比的目的DNA的DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885，M.W.5×105)混合物进行转染。由于许多复合物都在内体中被分解，通过加入氯奎来增强其结果(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，3015，1983)。方法3)指电穿孔法，因其具有细胞选择性，优于方法1)和2)而被更广泛使用。方法3)据称在脉冲电流持续时间，脉冲形状，电场(电极之间的间隙，伏特)强度，缓冲液导电性，DNA浓度以及细胞密度的最理想条件下有效。
上述三类中，方法2)操作简便，适用于使用大量细胞进行很多试验样品的检验。因此转染剂适用于将DNA导入细胞进行载体重构。优选，使用Superfect转染剂(QIAGEN，Cat.No.301305)或DOSPER脂质体转染剂(Roche，Cat.No.1811169)，但所述转染剂不限于此。
具体地，从cDNA重构病毒载体可例如如下进行：
在24孔或6孔塑料培养板或直径100mm的培养盘中将猴肾来源的LLC-MK2细胞培养到100％满底，使用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生物素(100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)的极限必需培养基(MEM)。这些细胞随后例如以2PFU/细胞的浓度，用表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3感染。该病毒已经在1μg/ml补骨脂素(psoralen)存在下，用UV照射处理20分钟灭活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。加入的补骨脂素的量以及UV照射的时间可以适当调节。感染一小时后，可通过脂转染法等用2μg-60μg，更优选3μg-20μg，上述编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA转染细胞。这种方法使用Superfect(QIAGEN)，并使用表达产生病毒RNP所必须的在转录过程中起作用于的病毒蛋白的几种质粒(0.5μg-24μg的pGEM-N，0.25μg-12μg的pGEM-P和0.5μg-24μg的pGEM-L)(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。编码N，P，和L的表达载体的比例优选为2∶1∶2。质粒的量可适当调节，例如1μg-4μg的pGEM-N，0.5μg-2μg的pGEM-P，和1μg-4μg的pGEM-L。
转染后的细胞在无血清MEM(如需要含100μg/ml的利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，更优选仅含40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma))中培养。试剂浓度可优化成使得痘苗病毒导致的细胞毒活性最小化，以及病毒回收 率最大化(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。转染后，大约培养48小时到72小时，然后重复三次冷冻融化过程破坏所述细胞。使用从上述破坏细胞回收的含有RNP的细胞破损物再次转染LLC-MK2细胞，然后进行培养。RNP可以与例如脂转染胺试剂以及聚阳离子脂质体形成复合物后，导入细胞。具体地，可利用多种脂转染试剂。这些试剂的实例有DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)等。可加入氯奎以防止RNP再内体中分解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，3015，1983)。在RNP转染的细胞中，可完成从RNP表达病毒基因及复制RNP的步骤，以扩增该载体。通过稀释获得的细胞裂解物并重复扩增，痘苗病毒vTF7-3可被完全去除。可重复再扩增，例如重复3次或以上。获得的RNP保存在-80℃。
用于重构的宿主细胞不受限制，只要病毒载体可被重构即可。例如，在重构仙台病毒载体时，可使用猴肾来源的LLC-MK2细胞和CV-1细胞，培养的细胞例如仓鼠肾来源的BHK细胞，人来源的细胞等。通过在这些细胞中表达适宜的包膜蛋白，可获得包膜中包含该蛋白的感染性病毒粒子。
当病毒基因组中的M基因缺损或缺失时，这种病毒感染的细胞不形成病毒颗粒。因此，本发明的载体尽管可以通过上述方法制备成RNP或包含RNP的细胞，但不能制备成病毒颗粒.另外，在转染后细胞中增殖的RNP仅可被转送到接触细胞中。因此，感染扩散较慢，导致难以大量产生高滴度病毒载体。本发明提供将本发明载体制备成病毒颗粒的方法。溶液中的病毒颗粒比RNP更稳定。此外，通过使病毒颗粒具有感染性，载体可以通过与细胞的简单接触而无需转染剂就可导入靶细胞中。因此，病毒颗粒在工业应用中尤其有用。作为将本发明的载体制备成病毒颗粒的方法，使用包含具有条件性突变的M基因的病毒基因组在容许条件下重构所述病毒。具体地，通过在容许条件下培养由上述步骤(a)或步骤(a)和(b)获得的复合物转染的细胞，使M蛋白发挥功能形成颗粒。产生包含编码具有条件性突变的突变M蛋白的基因组RNA的病毒颗粒的方法包括以下步骤：(i)在该突变M蛋白的容许条件下，在细胞内扩增副粘病毒N，P，和L蛋白和包含该基因组RNA的RNP；和(ii)收集释放到细胞培养上清中的病毒颗粒。例如温度敏感型突变M蛋白可以在其容许温度下培养。
另一种将本发明的载体制备成病毒颗粒的方法为使用表达M蛋白的辅 助细胞的方法。通过使用M辅助细胞，本发明人将一种载体制备成病毒颗粒，所述载体中F蛋白的切割位点被修饰成被另一种蛋白酶切割的序列，且M基因突变或缺失。由于本发明的方法不需要辅助病毒，例如野生型副粘病毒，不产生具有颗粒形成能力的含M基因的病毒。因此，本发明的载体可制备成较纯的形式。本发明提供了一种病毒颗粒，其包含(i)副粘病毒基因组RNA，其中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，并(b)编码了修饰的F蛋白，其切割位点序列被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，且所述病毒颗粒还(1)具有在由所述病毒颗粒感染的细胞中复制基因组RNA的能力；(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生显示明显降低或消除；和(3)在所述蛋白酶存在下，具有将基因组RNA导入与用含有该基因组RNA的病毒颗粒转染的细胞接触的细胞中的能力。根据优选的实施方案，这种病毒颗粒将不产生病毒颗粒。
在表达功能性M蛋白的细胞中制备本发明病毒颗粒的方法，包括以下步骤：(i)在表达副粘病毒的野生型M蛋白或等同的蛋白的细胞中扩增RNP(其包含该副粘病毒N，P和L蛋白和基因组RNA)；(ii)收集释放到细胞培养上清中的病毒颗粒。只要野生型M蛋白具有形成病毒颗粒的能力，其可来自非基因组RNA的来源的副粘病毒。此外，标记肽可加到所述蛋白中，或可选地，当其通过适当的表达载体表达时，来自载体的接头肽可加到所述蛋白上。如上述，所用蛋白不一定是野生型M蛋白本身，但可以是具有与野生型M蛋白等同的病毒颗粒形成能力的蛋白。从表达M蛋白的细胞中产生的病毒颗粒的包膜中包含这些细胞表达的M蛋白；然而，其不包含编码该蛋白的基因。因此，野生型M蛋白不能继续在该病毒感染的细胞中表达。因此，病毒颗粒不能形成。
制备表达M蛋白的辅助细胞可如下述进行。为制备以可诱导的形式表达M蛋白的载体，例如可使用可诱导的启动子或利用重组的表达调节系统(例如Cre/loxP)。Cre/loxP诱导表达型质粒可使用例如质粒pCALNdlw构建，所述质粒可设计成利用Cre DNA重组酶诱导表达基因产物(Arai，T.等，J.Virology 72，1115-1121，1998)。作为能够表达M蛋白的细胞，优选建立能够持续高表达M蛋白的辅助细胞株，通过诱导整合入其染色体中的M基因的表达。例如，猴肾来源的细胞系LLC-MK2等可用作这样的细胞。LLC-MK2细胞在含10％热处理的不活化胎牛血清(FBS)，50单位/ml青霉素G钠和50 μg/ml链霉素的MEM中，在37℃，含5％的CO2的大气中进行培养。根据已知的方案，上述被设计成利用Cre DNA重组酶诱导表达M基因产物的质粒用磷酸钙法(哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))导入LLC-MK2细胞。
例如，10μg M-表达质粒可以导入在1 0cm的细胞培养板中长成40％满底的LLC-MK2细胞中。这些细胞随后在37℃的孵箱中，于含10％FBS的10ml的MEM中以及5％的CO2下孵育。孵育24小时后，剥离细胞后悬浮于10ml培养基中。所述悬液随后加在5个直径10cm的培养皿中：将5ml悬液加在一个皿中，以2ml/皿加入两个皿中，及0.2ml/皿加入两个皿中。每个皿中的细胞在含10％FBS和1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的10mlMEM中培养14天；每两天换一次培养基。以此来选择基因被稳定导入的细胞株。使用克隆环收集培养基上生长的G418-抗性细胞。收集的每种克隆的细胞进一步扩大培养到铺满10cm的培养板为止。
辅助细胞中M蛋白高表达水平对于回收高滴毒病毒是十分重要的。为此，例如上述对M-表达细胞的选择优选进行两次或更多。例如，转染包含特定药物抗性标记基因的M-表达质粒，且使用该药物选择包含M基因的细胞。随后，使用包含另外一种特定药物抗性标记基因的M-表达质粒转染相同的细胞，并使用该第二种药物抗性基因选择细胞。如此，通过两次转染后选出的细胞与一次转染的细胞相比，很可能具有更高水平的M蛋白表达功能。因此，优选使用通过两次转染构建的M辅助细胞。由于M辅助细胞可同时表达F基因，以此可制备F和M基因都有缺陷的感染性病毒颗粒(WO03/025570)。如在上述，也建议对表达F基因的质粒转染两次以上，以提高F蛋白诱导表达的水平。本文所述修饰的F蛋白的基因可用作F基因。
M蛋白诱导表达可通过将孵育细胞到铺满6cm的皿而获得，且随后，例如使用腺病毒AxCANCre优选以MOI＝3感染这些细胞，这是根据Saito等(Saito等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法进行的。
为使用表达野生型M蛋白或其等同蛋白的细胞(M辅助细胞)制备本发明的病毒颗粒，可将本发明上述的RNP导入这些细胞并随后进行培养。RNP可通过如下方法导入M辅助细胞中：例如将含RNP的细胞裂解物转染到M辅助细胞中，或通过将产生RNP的细胞和M辅助细胞共培养诱导细胞融合。也可通过在M辅助细胞中转录基因组RNA，并在N，P和L蛋白存在 下，重新合成RNP来实现。
本发明上述步骤(i)(使用M辅助细胞扩增RNP的步骤)优选在低温进行。在制备使用温度敏感型突变M蛋白的载体中，病毒颗粒的制备必须在容许温度以下的温度进行。然而，令人吃惊地，本发明人发现在本发明的方法中，当使用野生型M蛋白在低温下进行病毒粒子形成操作时，也可以有效的产生病毒颗粒。本发明中，术语“低温”指35℃或以下，优选34℃或以下，更优选33℃或以下，且最优选32℃或以下。
根据本发明，病毒颗粒可以释放到病毒产生细胞的细胞外液中，例如病毒滴毒为1×105CIU/ml以上，优选1×106CIU/ml或以上，更优选5×106 CIU/ml或以上，更优选1×107CIU/ml或以上，更优选5×107CIU/ml或以上，更优选1×108CIU/ml或以上，且更优选5×108CIU/ml或以上。所述病毒滴毒可通过本发明或其它文献中描述(Kiyotani，K.等，Virology 177(1)，65-74，1990；WO 00/70070)的方法测定。
从M缺陷型病毒基因组cDNA重构重组病毒载体的方法的一个优选实施方案如下。即，所述方法包含以下步骤：(a)在表达形成感染性病毒颗粒所需的病毒蛋白(即NP，P，L，M，F，和HN蛋白)的细胞中转录编码(负链或正链)基因组RNA的DNA；(b)将这些细胞与表达整合到染色体中的M基因的细胞(即M辅助细胞)进行共培养；(c)从该培养物制备细胞提取物；(d)用所述提取物转染表达整合到染色体中的M基因的细胞中(即M辅助细胞)，并培养这些细胞；和(e)从该培养物上清中回收病毒颗粒。步骤(d)优选在上述低温条件下进行。获得的病毒颗粒可通过对辅助细胞的再次感染进行扩增(优选在低温下)。具体地，所述病毒可根据实施例中的描述重构。回收的病毒颗粒稀释后，可再次转染到M辅助细胞进行扩增。所述扩增步骤可重复进行两次或三次或更多次。获得的病毒保存液可保存在-80℃。病毒滴度通过测定血凝素活性(HA)来决定。HA可通过“终点稀释法”测定。
具体地，首先，将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿的密度铺在100mm的板上。当使用T7 RNA聚合酶诱导基因组RNA的转录时，细胞可培养24小时，并随后在用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7)以大约MOI＝2在室温感染1小时，所述痘苗病毒已经用补骨脂素和长波长紫外线(365nm)处理了20分钟(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)。用不含血清的MEM洗涤所述细胞后，分别使用表达基 因组RNA的质粒和表达副粘病毒N，P，L，F，和HN蛋白的质粒，利用合适的脂转染试剂转染细胞。质粒的比例可以是，例如6∶2∶1∶2∶2∶2，但不限于此。培养5小时后，用无血清MEM洗涤所述细胞两次，并随后在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(cytosine-β-D-arabinofuranoside)(AraC，Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。培养24小时后，所述细胞用持续表达M蛋白的细胞(M辅助细胞)以大约8.5×106细胞/皿的密度进行覆盖，然后在37℃，含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中继续培养两天(P0)。收集培养的细胞，并将其悬于2ml/皿的Opti-MEM中。重复冻融三次后，直接将裂解物转染到M辅助细胞，并在32℃，含40μg/ml AraC和切割F蛋白的蛋白酶的无血清MEM中培养(P1)。3-14天后，从收集的培养物上清中取出一部分，并用其感染重新调制的M辅助细胞，然后在32℃，含40μg/ml AraC和上述蛋白酶的无血清MEM中培养(P2)。3-1 4天后，再度感染新制备的M辅助细胞，并在存在(用于制备F-切割的病毒)或不存在(用于制备F-不切割的病毒颗粒)上述蛋白酶的条件下，使用无血清MEM培养3-7天(P3)。通过重复再扩增3次或以上，最初使用的痘苗病毒可被完全消除。将BSA以1％的最终浓度加入收集的培养物上清中，并保存在-80℃。
本发明的病毒颗粒可以是其修饰的F蛋白被切割的具有感染性的病度颗粒，或者可以是具有潜在感染性的病毒颗粒，即其初始形式不具有感染力，但经过切割所述修饰的F蛋白的蛋白酶处理后就具有感染性。由所述基因组编码的修饰F蛋白存在于病毒颗粒的包膜上，然而，其在未被切割时缺乏感染力。这种病毒通过用切割修饰F蛋白的切割序列的蛋白酶处理而获得感染力，或者在该蛋白酶存在下与细胞或组织接触，通过该F蛋白被切割而获得感染力。为使用病毒生产细胞通过上述病毒的产生步骤获取其修饰的F蛋白没有被切割的病毒颗粒，病毒扩增的最后步骤可在缺乏切割修饰的F蛋白的蛋白酶下进行。反之，可在所述蛋白酶存在下制备F蛋白被切割的具有感染性的病毒颗粒。
此外，在病毒颗粒产生过程中通过在细胞中表达病毒基因组中没有编码的包膜蛋白，可产生其包膜包含该蛋白的病毒颗粒。这种包膜蛋白的一个实例是野生型F蛋白。以这种方式产生的病毒颗粒的基因组RNA只编码修饰的F蛋白，但在其包膜上可携带所述野生型F蛋白和该修饰的F蛋白。 通过在病毒颗粒产生的步骤中提供野生型F蛋白并在切割该蛋白的胰蛋白酶存在下进行扩增，所述病毒颗粒通过切割病毒颗粒上的野生型F蛋白而获得感染性。根据该方法，即使不使用切割修饰F蛋白的蛋白酶，也可以制备高滴度的感染性病毒颗粒。因此，本发明的病毒颗粒可以是包含副粘病毒野生型F蛋白的病毒颗粒。野生型F蛋白和病毒基因组不必要来自同类型的副粘病毒，且所述野生型F蛋白可以是来自另一种副粘病毒的包膜蛋白。
此外，可产生其包膜包含除野生型F蛋白以外的任何理想病毒包膜蛋白的病毒颗粒。具体地，在病毒重构中，所望的包膜蛋白可以在细胞中表达以产生包含该包膜蛋白的病毒载体。对这些蛋白没有特别的限制。优选的实例包括疱疹性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本发明的病毒颗粒包括含有包膜蛋白例如VSV-G蛋白的假型病毒载体，所述蛋白来自除了基因组RNA所来源的病毒以外的病毒。同样，与上述野生型F蛋白相同，将该病毒颗粒感染到细胞后，病毒载体不表达该蛋白，这是由于该包膜蛋白不被病毒基因组RNA编码的缘故。
本发明的病毒颗粒可包含嵌合蛋白，例如在细胞外区的包膜表面含有可与特定细胞结合的一或多种蛋白，例如粘附因子，配体，受体，抗体或其片段；在细胞内区含有病毒包膜来源的多肽。由此，可产生感染特异性组织的靶的载体。上述蛋白可以在病毒载体重构时，通过在细胞内表达来提供。具体实例包括含有可溶因子例如细胞因子的受体结合区的片段，或者细胞表面蛋白的抗体片段(WO 01/20989)。
制备具有基因缺陷型病毒载体时，可将例如两种或更多种类型的载体(每种载体包含有不同的病毒基因组中缺陷的病毒基因)导入相同的细胞。每种被缺陷的病毒蛋白都可由上述载体的表达来提供。这种互相补充导致感染性病毒颗粒形成，且可在复制循环中扩增病毒载体。即，当将两种或多种类型的本发明载体以病毒蛋白互补模式组合接种时，可大规模且低成本制备各种病毒基因缺陷型病毒载体的混合物。由于这些病毒缺乏病毒基因，它们的基因组大小比完整病毒基因组小，因此它们可包含更大的异源基因。此外，由于病毒基因缺陷，这些病毒是无繁殖力的，并且在细胞外被稀释，因此共感染力很难在这些病毒中保持。因为这些载体没有繁殖力，所以对控制向周围环境的释放而言是有利的。
为了获取大量的病毒载体可将通过上述方法获得的病毒载体感染到含胚鸡蛋中以扩增该载体。例如，可通过产生M基因转基因鸡，然后将载体接种到鸡蛋中进行扩增。使用鸡蛋制备病毒载体的基本方法已经开发出来(“Shinkei-kagaku Kenkyu-no Saisentan Protocol III，Bunshi Shinkei SaibouSeirigaku(Leading edge techniques protocol III in neuroscience research，Molecular，Cellular Neurophysiology)”，edited by Nakanishi，等，KOSEISHA，Osaka，pp.153-172，1993)。具体地，例如将受精卵转移到孵卵箱中，且在37℃-38℃培养9-12天.使胚胎生长。病毒载体随后接种到尿囊膜腔，将受精卵培养数天以使病毒载体增殖。培养期间等的条件可随着所增殖重组病毒的不同而变化.随后收集含有病毒的尿囊液。从尿囊液中分离并纯化病毒载体根据常规方法进行(“Protocols of Virology”by Masato Tashiro，edited by Nagaiand Ishihama，Medical View，pp.68-73，1995)。
回收的病毒载体可经纯化到基本纯。可通过已知的纯化和分离方法进行纯化，所述方法包括过滤，离心，柱层析纯化等，或者其组合。本文术语“基本纯”指作为组分的病毒载体是其所在样品中的主要部分。通常，基本纯的病毒载体可通过证实病毒来源的蛋白和样品中总蛋白(不包括加入的作为载体或稳定剂的蛋白)的比例是10％或以上，优选20％或以上，更优选50％或以上，更优选70％或以上，更优选80％或以上，甚至更优选90％或以上。具体地，纯化副粘病毒方法，例如通过使用纤维素硫酸酯或交联的多糖硫酸酯的方法(JP-B No.Sho 62-30752；JP-B Sho 62-33879；JP-B Sho62-30753)，以及吸附于含硫酸海藻糖的多糖和/或其分解产物的方法(WO97/32010)等。
F蛋白的切割位点被修饰的M基因缺陷型载体只在特定蛋白酶存在下，通过细胞融合型感染在细胞之间转送载体。因此，本发明的载体可用于靶向表达特定蛋白酶的组织的基因治疗。通常的载体可以将基因转移到靶组织的表层；但它们不能穿透到组织内部。与此相反，本发明的载体具有渗透到具有增强的蛋白酶活性的靶组织深处的能力。例如，对于已经浸润到正常组织深部的癌组织，通过用本发明的载体感染一部分可被该载体感染的癌细胞的表层部分，而将该载体转送到靶组织深部。
本发明的载体可适用于癌症，动脉硬化，关节疾病例如类风湿性关节炎等疾病。例如，在如RA等关节疾病中，如前所述细胞外基质降解导致软 骨高级构造(higher order structure)发生坏损，进而破坏关节。通过使用本发明的载体去除导致ECM降解酶活性增强的细胞，以期待减缓关节破坏的进程。此外，在动脉硬化中，会出现由巨噬细胞来源的泡沫细胞的聚集。这些泡沫细胞分泌大量金属蛋白酶，其结果是破坏纤维性肥厚以致斑块崩解。通过使用本发明的载体杀死表达MMP的巨噬细胞，可以实现对动脉硬化的治疗。此外，如下所述，在癌症中各种蛋白酶均被激活。本发明的载体可用作特异性感染并浸润癌症的治疗性载体。
为制备包含本发明载体的组合物，必要时将载体与理想的可药用担体或溶剂联用。“可药用的担体或溶剂”指可和载体一同给药而不明显抑制该载体的基因导入的物质。例如，载体可以通过用生理盐水，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)适当稀释配制成组合物。当载体在鸡卵中增殖时，所述组合物可以含有尿囊液。此外，包含所述载体的组合物可以含有担体或溶剂，例如去离子水，5％的葡聚糖溶液等。此外，所述组合物还可含有植物油，悬浮剂，清洁剂，杀生物剂等。此外，还可将防腐剂和其它添加剂加入所述组合物。含有本发明载体的组合物可用作试剂以及药物。
载体剂量可据疾病类型，病人体重，年龄，性别和症状，给药目的，待给药组合物的剂型，给药方法，待导入基因的类型等来判断，本领域熟练技术人员可常规确定正确剂量。载体给药剂量优选约105-1011CIU/ml，更优选在约107-109CIU/ml，更优选约1×108-5×108CIU/ml。可将所述载体和可药用担体混合给药。关于癌组织等，载体可多个靶位点给药，使得所述载体均匀分布于癌组织中。每次人个体给药的优选剂量是2×109-2×1010 CIU。在临床可接受的副作用范围内，可一次或多次给药。日给药次数与此类同。当将病毒载体给药除人以外的动物时，例如给药剂量可以将上述剂量根据靶动物和人之间的体重比或给药靶位点的体积比(例如，平均值)进行换算。包含本发明载体的组合物可以给药所有哺乳动物种类，包括人，猴，小鼠，大鼠，兔，绵羊，牛，狗等。
本发明的载体尤其可用于治疗癌症。用本发明载体感染的细胞在蛋白酶存在下通过细胞融合形成合胞体。利用此特性，本发明的载体可用于治疗特定蛋白酶活性增强的癌症。本发明提供用于癌症的治疗组合物，其包含可药用的担体和本发明的载体(其编码由在癌症中显示活性增强的蛋白酶切割的F蛋白)。此外，本发明涉及该载体在制备癌症治疗组合物中的用途。 本发明还涉及癌症的治疗方法，包括将这种载体给药癌组织的步骤。由于ECM降解酶的活性在浸润性和转移性恶性癌症中增强，包含由ECM降解酶切割的F蛋白的基因的载体可特异性感染恶性癌症，从而导致癌组织的死亡。
本发明的载体还包含异源基因。所述异源基因可以是监控载体感染的标记基因或对癌症的治疗性基因。治疗基因的实例包括关于细胞凋亡的细胞诱导基因；编码具有细胞毒活性的蛋白的基因；细胞因子；和激素。将本发明载体给药癌症时，包含癌症部位的直接给药(体内)，以及先将所述载体导入病人来源的细胞或其它细胞，再将所述细胞注入癌症的间接给药(离体)。
靶向的癌症可以是其中特异性蛋白酶的活性增强的任何癌症。实例包括具有浸润性和转移性的恶性肿瘤(肺癌，胃癌，结肠癌，食道癌，乳腺癌等)。然而，例如MMP，uPA，和tPA的蛋白酶在一些恶性癌症中表达水平较低。因此，能否靶向癌症可根据是否有增强活性的蛋白酶的存在进行判断。本发明的载体尤其可用于浸润到食道癌的粘膜下层的癌症，在内括约肌中发展到III和IV期的结肠癌，以及浸润很深导致不能完全由手术去除的浸润性黑色素瘤。
附图简述
图1是F缺陷型SeV基因组cDNA的构建图解，其中温度敏感性突变已被导入M基因。
图2描述了构建的病毒基因结构，包含根据在M基因导入温度敏感性突变来抑制二次颗粒释放为目的的病毒基因结构，以及为探讨该导入突变的效果而构建或使用的病毒基因结构。
图3提供了持续表达F蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/A)中GFP表达的显微图像，所述细胞在用SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后分别在32℃和37℃培养6天。
图4描述了使用Western印迹对持续表达SeV-F蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/A)中的F蛋白表达水平，进行随时间变化的半定量测定结果，所述细胞在不含胰蛋白酶，不含血清的MEM中，在32℃或37℃培养。
图5提供了LLC-MK2细胞中GFP表达的显微图像，所述细胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后 在32℃，37℃或38℃培养3天。
图6描述了随时间采样(同时加入新鲜培养基)的LLC-MK2细胞培养上清中的血凝(HA)活性，所述细胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后在32℃，37℃或38℃培养。
图7代表细胞与病毒样颗粒(VLP)中M蛋白水平的比例。该比例通过使用抗M抗体用Western印迹测定。LLC-MK2细胞从用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后，在37℃培养两天，从细胞培养物中回收培养上清。每个泳道含有的培养物相当于来自6孔板各孔中培养物的1/10。
图8显示LLC-MK2细胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后，培养12，18，24，50，或120小时的培养上清中的SEAP活性。
图9显示用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后培养24，50，或120小时的LLC-MK2细胞培养上清中的HA活性。
图10表示通过使用抗M抗体的Western印迹测定VLP量。LLC-MK2细胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后培养5天。离心培养上清以回收病毒。每个泳道含有的培养物相当于6孔板各孔中的内含物的1/10。
图11显示根据释放到细胞培养基中的LDH的量估计的细胞毒活性。LLC-MK2，BEAS-2B或CV-1细胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，或10感染。细胞培养在无血清或含10％FBS的培养基中，并且分别在感染后3或6天进行细胞毒活性实验。图中示出细胞的相对细胞毒活性值，其以相等数目的细胞(其100％都被细胞变性剂(Triton)裂解)的细胞毒活性作为100％。
图12表示M蛋白在LLC-MK2细胞中的亚细胞定位，这是通过使用抗M抗体进行免疫染色观察的，其中所述细胞是用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔ-F-GFP以MOI＝1感染后在32℃，37℃或38℃培养2天的细胞。
图13提供了在共聚焦激光显微镜下观察到的M和HN蛋白的亚细胞定位立体三维图像。A-10细胞使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或 SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并随后在含由10％血清的培养基中在32℃或37℃培养一天。这些图像是用抗M抗体和抗HN抗体通过免疫染色获得的。
图14提供了在共聚焦激光显微镜下观察到的M和HN蛋白的亚细胞定位立体三维图像。A-10细胞使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并随后在含由10％血清的培养基中在32℃或37℃培养两天。这些图像是用抗M抗体和抗HN抗体通过免疫染色获得的。
图15表示微管解聚剂对M和HN蛋白的亚细胞定位的影响。A-10细胞使用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并且立即将微管解聚剂，秋水仙碱或秋水仙胺，加入这些细胞中使得终浓度为1μM。这些细胞在含有10％血清的培养基中32℃培养。两天后，使用抗M抗体和抗HN抗体对细胞进行免疫染色，并随后在共聚焦激光显微镜下观察。这些图像显示了M和HN蛋白的亚细胞定位的立体三维图像。
图16表示微管解聚剂对M和HN蛋白的亚细胞定位的影响。A-10细胞使用SeV18+/F-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并且立即将微管解聚剂秋水仙碱加入这些细胞中，使得终浓度为1μM。这些细胞在含有10％血清的培养基中32℃或37℃培养。两天后，使用抗M抗体和抗HN抗体对细胞进行免疫染色，并随后在共聚焦激光显微镜下观察。这些图像显示了M和HN蛋白的亚细胞定位的立体三维图像。
图17表示包含EGFP基因的M缺陷型SeV基因组cDNA的构建。
图18图示了F缺陷型和M缺陷型SeV基因组cDNA的构建。
图19图示了所构建的F缺陷型和/或M缺陷型SeV基因的结构。
图20表示包含潮霉素抗性基因的M基因表达质粒的构建。
图21表示，诱导性表达克隆化M蛋白(和F蛋白)的克隆细胞用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AcCANCre)感染，然后通过Western印迹对细胞中M和F蛋白的表达水平进行半定量比较。
图22表示用辅助细胞(LLC-MK2/F7/M)的克隆#18和#62对M缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)进行的病毒重构。
图23显示SeV18+/ΔM-GFP的病毒生产力(CIU和HAU随时间变化过程)
图24提供了用来证实SeV18+/ΔM-GFP病毒粒子中的基因结构的RT-PCR结果的照片和图。
图25表示比较SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+GFP以及SeV18+/ΔF-GFP的结果，其中对LLC-MK2细胞进行感染后，对来自这些细胞和细胞培养上清中的病毒蛋白进行Western印迹来从蛋白的角度证实SeV18+/ΔM-GFP的病毒结构。
图26表示SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP(制备了连续稀释液并使用Western印迹检测)感染的LLC-MK2细胞培养物上清中病毒来源蛋白的定量比较，使用抗SeV抗体(DN-1)。
图27显示用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染的LLC-MK2细胞培养物上清(随时间收集)中的HA活性。
图28提供了用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染的LLC-MK2细胞，感染5天后获得的荧光显微图像。
图29提供了如下制备的LLC-MK2细胞的荧光显微图像：LLC-MK2细胞用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染，感染5天后收集培养物上清，并使用阳离子脂质体(Dosper)转染到LLC-MK2细胞。两天后，进行显微观察。
图30显示F1/F2切割位点(F蛋白活化位点)的氨基酸序列的设计。在癌细胞中高表达的蛋白酶(MMP或uPA)的识别序列是根据合成底物的识别序列设计的。从上开始，显示了SEQ ID NO：40-44的序列。
图31图示了M缺陷型SeV载体cDNA的构建，所述载体中F活化位点被修饰。
图32图示了F修饰的M缺陷型仙台病毒载体导致的蛋白酶依赖性细胞融合型感染。通过使用LLC-MK2细胞，可证实F的修饰导致蛋白酶依赖性细胞融合型感染。用每种M缺陷型SeV(SeV/ΔM-GFP(A，B，C，J，K，和L)，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP(D，E，F，M，N，和O)，以及SeV/F(uPA)ΔM-GFP(G，H，I，P，O，和R))感染细胞，同时加入0.1μg/ml胶原酶(梭菌(Clostridium))(B，E，和H)，MMP-2(C，F，和I)，MMP-9(J，M，和P)，uPA(K，N，和Q)，以及7.5μg/ml胰蛋白酶(L，Q，和R)。四天后，在荧光显微镜下观察细胞。只有加入胰蛋白酶的LLC-MK2细胞中，包含未修饰F的SeV/ΔM-GFP导致感染细胞与周围细胞的融合，以致细胞融合型感染并形成多核细胞，即合胞体 (L)。在加入胶原酶，MMP-2，和MMP-9的LLC-MK2细胞中，包含导入F的MMP降解序列的SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP可致细胞融合型感染以形成合胞体(E，F，和M)。另一方面，据观察包含导入F的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和组织型PA(tPA)降解序列的SeV/(uPA)ΔM-GFP在胰蛋白酶存在下，导致细胞融合型感染，且进一步修饰后，在有uPA(Q和R)时形成合胞体。
图33表示了F修饰的M缺陷型仙台病毒载体导致的癌细胞蛋白酶依赖性细胞融合型感染。用试验检验是否能观察到内源蛋白酶选择性细胞融合型感染。使用以下细胞：HT1080，表达MMP的癌细胞株(A，D，和G)；MKN28，表达tPA的癌细胞株(B，E，和H)；和SW620，不表达这些蛋白酶中任何一种的的细胞株(C，F，和I)。在HT1080细胞中，只有SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染扩散十倍或以上(D)。在表达tPA的细胞株MKN28中，只观察到SeV/F(uPA)ΔM-GFP的细胞融合型感染。在不表达上述两种酶中任何一种蛋白酶的SW620细胞中，没有观察到感染扩散。
图34表示通过佛波醇酯对MMP的诱导以及F修饰的，M缺陷型仙台病毒载体对细胞融合型感染的诱导。MMP-2和MMP-9的表达通过明胶酶谱法(gelatinzymography)证实，其中存在凝胶水解(gelatinolytic)活性的部分变透明(A)。泳道C表示对照。泳道T是使用20nM PMA诱导后所得的上清的结果。对应MMP-9的带在HT1080和Panc I中观察到，证明了对MMP-9的诱导。对于MMP-2，几乎没有任何活性的潜在型MMP-2在诱导前的PancI中检测到。如图34B所示，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP由于诱导了MMP-9而显示细胞融合型感染。
图35表示F修饰的，M缺陷型仙台病毒载体在体内的细胞融合型感染。制备了HT1080患癌裸鼠。其中，使用皮下注射后7-9天，癌直径大于3mm的动物。50μL的SeV被一次注入动物中。两天后，在荧光显微镜下观察癌。图A，D，G，和J是亮视野图像；B，E，H，和K对应GFP的荧光图像；以及C，F，I，和L是放大图像。仅在分别注入SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP的位点周围的区域观察到荧光(图E和H)。反之，观察到SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP注射将荧光扩散到整个癌组织(图K)。在放大图中，在注入SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP的细胞中可清晰的观察到每个细胞中的荧光；然而，注射了SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的细胞轮廓不清楚，提示出现细胞融合。
图36显示F修饰的，M缺陷型仙台病毒载体的体内细胞融合型感染。对图35中GFP与整个癌的比例使用NIH Image根据其面积测定。结果SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP分别显示10％和20％的感染；而SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP显示90％的感染，提示感染明显扩散。
图37显示患癌裸鼠中F修饰的M缺陷型SeV载体的抗肿瘤效果。对图35中的小鼠癌体积进行测定。将四组SeV注入直径3mm或以上的癌中。两天后再次注射，并测定癌体积。注入了PBS，SeV-GFP，和SeV/ΔM-GFP的癌的体积显示快速增长。反之注入了SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的癌体积(图36的实验中显示扩散到整个癌)不显示明显的增殖并保持原来的较小体积。与其它3组相比，观察到明显的抗肿瘤效果，根据t检验P＜0.05。
图38表示F非切割型F修饰的M缺陷型SeV载体对蛋白酶表达癌细胞的选择性感染。使用以下几种细胞株检验蛋白酶表达是否能引起选择性感染：表达MMP的HT1080细胞株，表达tPA的MKN28细胞株，和几乎不表达蛋白酶的SW620。SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP导致的感染可在表达MMP的HT1080细胞株中观察到，但在表达tPA的MKN28细胞株中观察不到。SeV/F(uPA)ΔM-GFP导致的感染可在表达tPA的MKN28细胞株中观察到，但在表达MMP的HT1080细胞株中没有观察到。
图39显示F非切割型F修饰的M缺陷型SeV载体获得的感染能力，这是由于纤维母细胞诱导MMP-3和MMP-7所致的。使用SW480和WiDr细胞在体外检验由纤维母细胞诱导的MMP能否导致F修饰的M缺陷型SeV载体的感染力的变化。将人纤维母细胞(hFB)与SW480和WiDr细胞共培养导致SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染(B和D)。这种现象在不发生诱导的SW620细胞中观察不到(F)。
图40显示F修饰的M缺陷型SeV载体对人主动脉平滑肌细胞的MMP选择性感染。SeV/ΔM-GFP的感染只能通过加入胰蛋白酶来增强。反之SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染在加入胶原酶，MMP-2，MMP-3，和MMP-9后增强。
图41表示F修饰的M缺陷型SeV载体中蛋白酶依赖性F蛋白的切割。通过Western印迹证实仙台病毒的F0经蛋白酶依赖性切割成为F1。包含F未修饰的M缺陷型SeV载体(显示于泳道1，4，7，和10)，在F中插入了MMP#2切割序列的M缺陷型SeV载体(显示于泳道2，5，8，和11)，以及在 F中插入了uPA切割序列的M缺陷型SeV载体(显示于泳道3，6，9，和12)用上述蛋白酶在37℃处理30分钟(未处理(泳道1，2，和3)；0.1ng/mlMMP-9(泳道4，5，和6)；0.1ng/ml uPA(泳道7，8，和9)；和7.5μg/ml胰蛋白酶(泳道10，11，和12))。结果，根据插入的蛋白酶底物而出现F1切割。即，胰蛋白酶切割F未修饰M缺陷型SeV载体的F蛋白，MMP-9切割在F蛋白中插入了MMP#2序列的那些M缺陷型SeV载体的F蛋白，uPA切割在F蛋白中插入了uPA序列的那些M缺陷型SeV载体的F蛋白。
图42显示F胞质区缺失突变体的产生，并对通过与HN同时表达比较了其致融合力。图42A是仙台病毒F蛋白胞质区缺失突变体的构建。从上起为SEQ ID NO：76-79。图42B显示F蛋白胞质区缺失突变体的产生以及和HN同时表达所获得的致融合力的比较。将每种仙台病毒F蛋白胞质区缺失突变体和HN在加入7.5μg/ml胰蛋白酶的LLC-MK2细胞中同时表达。四天后，用苏木精进行核染色，并计数形成合胞体的核的数目。
图43显示了F/HN嵌合蛋白可导致致融合力剧增。图43A显示F/HN嵌合蛋白的结构。接头序列在SEQ ID NO：80中描述。图43B显示通过插入接头序列增加F/HN嵌合蛋白的致融合力。每种仙台病毒F/HN嵌合蛋白和HN在加入7.5μg/ml胰蛋白酶的LLC-MK2细胞中同时表达。
图44的图和照片概述了将MMP底物序列插入F/H嵌合蛋白的F切割位点中。图44A图示插入了MMP底物序列的F修饰型F/HN嵌合蛋白的结构。从上起，SEQ ID NO：81-89。图44B图示了在MMP表达细胞HT1080中表达F修饰型F/HN导致合胞体形成。
图45显示了F肽(融合肽)的修饰以及其对合胞体形成的浓度依赖性效应。图45A是融合肽修饰构建图。从上起，SEQ ID NO：90-93。
图45B显示了与MMP#2，MMP#6，和MMP#6G12A等加入的胶原酶(梭菌)浓度相关的致融合力。
图46显示了改良型F修饰M缺陷型仙台病毒的基因组结构。
图47图示了改良型F修饰M缺陷型仙台病毒在低水平表达MMP的癌中的扩散。图中显示，改良型F修饰M缺陷型仙台病毒感染两天后的细胞融合的扩散。
图48图示了癌细胞株中MMP-2和MMP-9的表达。显示了使用癌细胞株上清的明胶酶谱(gelatinzymography)测定结果。
图49显示了改良型F修饰的M缺陷型仙台病毒在低水平表达MMP的肿瘤中的扩散。图中标出了感染两天后每0.3cm2的合胞体数目。“ΔM”表示SeV18+/ΔM-GFP，“#2”表示SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP，“#6”表示SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP，“#6ct14”表示SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，“F/HN嵌合体”表示SeV(TDK)/Fct 14(MMP#6)/接头序列/HNΔM-GFP。
最佳实施方式
本发明具体描述了实施例；但不限于该等实施例。所有引用文献都作为部分内容包含在本发明中。
1.构建具有降低或缺陷的颗粒形成能力的SeV载体
[实施例1]构建温度敏感性突变型SeV基因组cDNA：
构建了SeV基因组cDNA，其中将温度敏感性突变导入M基因。图1图示了所述cDNA的构建，其描述如下。含有位于F缺失位点的EGFP基因的F缺陷型全长仙台病毒基因组cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP:Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)用NaeI消化。含M基因的片段(4922bp)通过琼脂糖凝胶电泳分离。切下目的带后，通过QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN，Bothell，WA)回收DNA，并亚克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位点(pBlueNaeIfrg-ΔFGFP构建)。根据试剂盒说明书中的方法，通过使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将温度敏感性突变导入pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的M基因中。根据Kondo等报道的Cl.151株的序列(Kondo，T.等，J.Biol.Chem.268，21924-21930，1993)，导入M基因中的三种类型突变是G69E，T116A和A183S。用于导入突变的合成寡核苷酸序列如下：
G69E(5′-gaaacaaacaaccaatctagagagcgtatctgacttgac-3′/SEQ ID NO：11，5′-gtcaagtcagatacgctctctagattggttgtttgtttc-3′/SEQ ID NO：12)，
T116A(5′-attacggtgaggagggctgttcgagcaggag-3′/SEQ ID NO：13，5′-ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat-3′/SEQ ID NO：14)和
A183S(5′-ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3′/SEQ ID NO：15，5′-ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc-3′/SEQ ID NO：16).
质粒pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的M基因含有上述三种突变，其由SalI消 化并随后用ApaLI进行部分消化。含全部M基因的片段随后被回收(2644bp)。pSeV18+/ΔF-GFP用ApaLI/NheI消化，并回收含HN基因的片段(6287bp)。这两个片段被亚克隆到Litmus38(New England Biolabs，Beverly，MA)SalI/NheI 位点(LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP构建)。通过使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒，根据试剂盒说明书中的方法，将温度敏感性突变以将突变导入M基因相同的方式导入LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP的HN基因中。根据Thompson等报道的ts271株的序列(Thompson，S.D.等，Virology 160，1-8，1987)，导入HN基因中的三个突变是A262T，G264R和K461G。用于导入突变的合成寡核苷酸序列如下：
A262T/G264R(5′-catgctctgtggtgacaacccggactaggggttatca-3′/SEQ ID NO：17，5′-tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3′/SEQ ID NO：18)，和
K461G(5′-cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtacaata-3′/SEQ ID NO：19，5′-tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-3′/SEQ ID NO：20).
上述说明描述了分别在不同载体中将突变导入M和HN基因的方法.此外，也可通过质粒(LitmusSalI/NheIfrg-ΔFGFP)将所有突变导入M和HN基因两者中，其中所述质粒是通过在Litmus38的SalI/NheI位点亚克隆含M和HN基因片段(8931bp)获得的，所述片段用SalI/NheI消化pSev18+/ΔF-GFP得到的。如上所述，连续导入突变总共包含六个温度敏感性突变；其中三个突变位于M基因中，三个突变位于HN基因中(LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP构建)。
LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP用SalI/NheI消化并回收8931bp的片段。不包含M和HN基因的另一片段(8294bp)通过用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP获得。将这两个片段连接在一起构建F缺陷型全长仙台病毒基因组cDNA(pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)，所述cDNA包含位于M和HN基因中的6个温度敏感性突变，且EGFP基因位于F缺失位点(图2)。
此外，为定量质粒中基因的表达水平，构建了含分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因的cDNA。具体地，用NotI切出含有位于SEAP基因下游的终止信号-中间序列-起始信号序列的SEAP片段(1638bp)(WO00/70070)。在进行电泳后回收该片段并纯化。随后将该片段插入pSeV18+/ΔF-GFP和pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP各自的NotI位点。产生的质粒分别为pSeV18+SEAP/ΔF-GFP和pSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(图2)。
[实施例2]导入温度敏感性突变的病毒的重构和扩增：
病毒重构根据Li等报道的方法进行(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)。使用诱导型Cre/loxP表达系统制备的F蛋白辅助细胞被用来重构F缺陷型病毒。该系统利用pCALNdLw质粒，所述质粒被设计成使用Cre DNA重组酶介导诱导型基因产物的表达(Arai，T.等，J.Virol.72，111 5-1121，1988)。在该系统中，使用Saito等的用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)对被所述质粒转染的辅助细胞进行感染以表达插入基因的方法(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)。对于SeV-F蛋白而言，含有F基因的转化细胞在本文称LLC-MK2/F7，且经AxCANCre诱导后持续表达F蛋白的细胞在本文称LLC-MK2/F7/A。
包含温度敏感性突变的病毒重构以如下方法进行：将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿铺在100-mm的皿上，并随后培养24小时。用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒(已经由补骨脂素和长波长紫外光(365nm)处理20分钟)(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)在室温下对上述细胞感染(MOI＝2)一小时。用无血清MEM洗涤细胞。质粒，pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，分别以12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的量重悬于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。加入相当于1μg DNA/5μL的SuperFect转染试剂(Qiagen，Bothell，WA)并混合。产生的混合物在室温下放置15分钟，最后加入3ml含3％FBS的Opti-MEM后，将该混合物加入细胞。培养5小时后，用无血清MEM洗涤细胞两次，并在含40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。培养24小时后，持续表达F蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/A:Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)以8.5×106细胞/皿的量进行上层覆盖。这些细胞随后在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中，在37℃再培养两天(P0)。收集细胞并将沉淀用2ml Opti-MEM/皿重悬。冻融处理三次，并将裂解物直接转染到LLC-MK2/F7/A细胞中。该细胞在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中在32℃培养 (P1)。5-7天后，用部分培养物上清感染新制备的LLC-MK2/F7/A细胞，并在相同的含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中在32℃培养(P2)。3-5天后，再次感染刚制备的LLC-MK2/F7/A细胞，并将该细胞在仅含7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中在32℃培养3-5天(P3)。将BSA以终浓度1％加入回收的培养物上清中，并将混合物储存在-80℃。将储存的病毒溶液解冻，并用于以后的实验中。
通过这种方法制备的病毒溶液的滴度如下：SeV18+/ΔF-GFP，3×108GFP-CIU/ml；SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，7×107GFP-CIU/ml；SeV18+SEAP/ΔF-GFP，1.8×108GFP-CIU/ml；SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP，8.9×107 GFP-CIU/ml(GFP-CIU在WO 00/70070中定义)。另一方面，对于包含GFP的载体，通过直接对表达GFP荧光蛋白的细胞计数所测定的CIU被定义为GFP-CIU。证实GFP-CIU值与相应的CIU值基本相等(WO 00/70070)。在SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP滴度的测定中，在32℃和37℃下观察到持续表达F蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/A)在感染后出现空斑的扩散。图3显示感染后6天观察到的图形。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP空斑在32℃有一定程度的扩散，但在37℃扩散程度大大降低。这提示病毒粒子形成在37℃降低。
[实施例3]培养温度(32℃)对病毒重构的影响：
在导入温度敏感性突变的病毒重构实验中(实施例2)，包括P1和其后的培养都在32℃进行。使用该温度是由于作为参考的温度敏感性突变导入病毒在32℃生长良好(Kondo，T.等，J.Biol.Chem.268，21924-21930，1993；Thompson，S.D.等，Virology 160，1-8，1987)。为便于对试验条件的详细探讨，在SeV的重构中(包含导入温度敏感性突变的病毒以外的其它病毒)，通过在32℃下进行包括P1和随后的培养可提高重构效率，从而很有可能回收以前难以获得的病毒。
考虑在32℃下病毒重构效率提高有两个原因。第一点，当在32℃培养时，认为由AraC(补充它的目的是抑制痘苗病毒扩增)造成的细胞毒活性受到抑制。作为病毒重构的培养条件，在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM中培养LLC-MK2/F7/A细胞时，37℃下培养3-4天后即可导致细胞的破坏，包括剥离的细胞增加。但在32℃下培养时，培养7-10天后仍有足够量的细胞维持在可持续培养的水平上。在重构转录和/或复制 效率不良，或者感染性病毒粒子的形成不良的SeV时，可培养持续时间被认为是病毒重构成功与否的直接反映。第二点是，在32℃培养细胞时，LLC-MK2/F7/A中可维持F蛋白表达。将持续表达F蛋白的LLC-MK2/F7/A细胞在含10％FBS的MEM中37℃培养，直到铺满6孔板，然后用含7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM置换培养基，且进一步在32℃或37℃培养细胞。使用细胞刮器随时间回收细胞，并用抗F蛋白抗体(小鼠单克隆抗体)进行Western印迹以半定量分析细胞内F蛋白。F蛋白的持续表达在37℃下可维持两天，随后降低。然而，在32℃下表达持续至少8天(图4)。这些结果证实了在32℃下进行病毒重构的有效性(P1阶段之后)。
上述Western印迹使用以下方法进行：从6孔板中的一个孔回收的细胞保存在-80℃，然后在100μl 1x稀释SDS-PAGE的样品缓冲液(Red LoadingBuffer Pack；New England Biolabs，Beverly，MA)中解冻。随后在98℃加热样品10分钟，离心，并将10μl等分上清液加在SDS-PAGE凝胶上(multigel10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。在15mA电泳2.5小时后，使用半干法在100mA进行一小时将蛋白转移到PVDF膜(ImmobilonPVDF transfer membrane；Millipore，Bedford，MA)。转移膜浸在封闭液(BlockAce；Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.，Sapporo，Japan)中在4℃保持一小时或以上，在含10％Block Ace(补充1/1000体积的抗F蛋白抗体)的第一抗体溶液中浸泡，并随后在4℃过夜所述膜。用含0.05％Tween 20的TBS(TBST)洗涤3次再用TBS洗涤3次后，浸在含10％Block Ace并补充1/5000体积的HPR偶联型抗小鼠IgG+IgM抗体(山羊F(ab’)2抗小鼠IgG+IgM，HRP；BioSource Int.，Camarillo，CA)的第二抗体溶液中。随后在室温搅动样品1小时。所述膜用TBST洗涤3次，并用TBS洗涤3次。随后用化学发光法(ECL western印迹检测试剂；Amersham Pharmacia biotech，Uppsala，Sweden)检测膜上的蛋白。
[实施例4]定量导入了本发明温度敏感性突变的病毒的二次释放颗粒(HA测定，Western印迹)：
利用包含所有病毒蛋白和GFP片段(780bp)的自主复制型SeV，与SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP一起比较了二次释放颗粒的水平，其中所述GFP片段在NotI位点包含位于GFP基因下游的终止信号- 中间序列-起始信号序列(SeV18+GFP：图2)。
LLC-MK2细胞在6孔板上生长到满底。将3×107CIU/ml的每种病毒溶液以100μl每孔(MOI＝3)加入这些细胞中，且转染细胞一小时。用MEM洗涤细胞后，将无血清MEM(1ml)加入各孔，并分别将细胞在32℃，37℃和38℃培养。每天取样，并在取样后立刻添加1ml新鲜无血清MEM。随时间培养和取样。感染后3天，在荧光显微镜下观察GFP表达显示，三种类型的病毒在三种温度条件下(32℃，37℃和38℃)的感染水平几乎相等，且GFP表达相似(图5)。
二次释放颗粒的定量使用血凝活性(HA活性)测定，根据Kato等(Kato，A.，等，Genes Cell 1，569-579，1996)的方法进行。具体地，用圆底96孔板，使用PBS连续稀释病毒溶液。病毒溶液50μl在各孔中被连续两倍稀释。将用PBS稀释到1％的50μl保存鸡血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)加入到上述50μl稀释病毒溶液中，且混合后在4℃放置一小时。观察红细胞凝集。判定凝集样品中的最高病毒稀释度为HA活性度。此外，一个凝血单位(HAU)计算为1×106病毒，并表达为病毒数量(图6)。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的二次释放颗粒明显降低，大约是37℃培养的SeV18+/ΔF-GFP的二次释放颗粒的1/10。同时，SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP病毒颗粒形成在32℃也有降低，且虽然较少但仍能维持一定数量的病毒颗粒产生，因此可以进行制备。
Western印迹也可用于定量二次释放颗粒。同上所述，用所述病毒以MOI＝3感染LLC-MK2细胞，并在感染两天后回收培养物上清和细胞。培养物上清在48,000g离心45分钟回收病毒蛋白。SDS-PAGE后，进行Western印迹，使用抗M蛋白抗体检测这些蛋白。该抗-M蛋白抗体是新制备的多克隆抗体，从用以下三种合成肽的混合物免疫的兔血清中制备：对应SeV M蛋白的氨基酸1-13(MADIYRFPKFSYE+Cys/SEQ ID NO：21)，23-35(LRTGPDKKAIPH+Cys/SEQ ID NO：22)，和336-348(Cys+NVVAKNIGRIRKL/SEQ ID NO：23)。根据实施例3中所述的方法进行Western印迹，其中第一抗体即抗M蛋白抗体，以1/4000的稀释度使用，其二级抗体即与HRP结合的抗兔IgG抗体(抗兔IgG(山羊)H+L conj.；ICN P.，Aurola，OH)，以1/5000的稀释度使用。用SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染的细胞，其M蛋白同等程度的大量表达，但病毒蛋白的表达却降低(图7)。Western印迹还证实二次释放的病毒颗粒减少。
[实施例5]导入温度敏感性突变的病毒所含基因的表达水平(SEAP实验)：
使用SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP时，可减少二次颗粒的释放。如果所含基因的表达水平同时降低，这种修饰对于基因表达载体来说是没有使用价值的。因此，有必要对基因表达水平进行评估。用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染LLC-MK2细胞，并随时间(感染后12，18，24，50和120小时)收集培养物上清。上清中的SEAP活性用Reporter Assay Kit-SEAP(TOYOBO，Osaka，Japan)根据试剂盒说明测定。两者间的SEAP活性相当(图8)。也测定了该样品的血凝活性(HA活性)。SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP的HA活性降低到十分之一(图9)。在48,000g离心45分钟从该样品中回收病毒蛋白，并随后通过Western印迹使用抗M抗体进行半定量测定。上清中病毒蛋白的水平也降低(图10)。这些发现表明诱导温度敏感性突变将导致二次颗粒释放的水平降低到约1/10，而所含基因的表达水平基本不降低。
[实施例6]导入温度敏感性突变的病毒的细胞毒活性(LDH实验)：
SeV感染通常是具有细胞毒活性的。因此，从这方面检验导入的突变的影响。LLC-MK2，BEAS-2B和CV-1细胞各以2.5×104细胞/孔铺于96孔板上(100μL/孔)，然后进行培养。LLC-MK2和CV-1细胞在含有10％FBS的MEM中，并将BEAS-2B细胞在含10％FBS的1∶1的D-MEM和RPMI(Gibco-BRL，Rockville，MD)的混合培养基中培养。培养24小时后，通过加入5μL/孔的SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP溶液(用含1％的BSA的MEM稀释)进行病毒感染。6小时后，含有病毒溶液的培养基被去除，并用相应的新鲜培养基(含或不含10％FBS)置换。如果使用无FBS培养基，感染后3天对培养物上清取样，或者如果使用含FBS培养基，感染后6天取样。通过使用细胞毒活性检测试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)根据试剂盒说明定量分析细胞毒活性。病毒载体在LLC-MK2细胞中都不具有细胞毒活性。此外，CV-1和BEAS-2B细胞中测定的SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP细胞毒活性相当于或小于SeV18+/ΔF-GFP的细胞毒活性(图11)。因此，由于导入温度敏感型突变导致的二次颗粒释放的抑制不诱导细胞毒活 性。
[实施例7]研究二次颗粒释放抑制的机制：
为说明与导入温度敏感型突变相关的二次颗粒释放抑制的部分机制，检测了M蛋白的亚细胞定位。LLC-MK2细胞用各类型SeV(SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)感染，并在32℃，37℃或38℃培养两天。所述细胞用抗M抗体进行免疫染色。如下进行免疫染色：用PBS洗涤培养细胞一次，加入在-20℃冷却的甲醇，并在4℃固定细胞15分钟。用PBS洗涤细胞3次后，在室温用含2％山羊血清和0.1％ Triton的PBS溶液封闭一小时。用PBS再洗涤三次后，将细胞与含2％山羊血清的第一抗体溶液(10μg/mL抗M抗体)在37℃反应30分。用PBS洗涤3次后，用含2％山羊血清的二级抗体溶液(10μg/mLAlexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)偶联物：Molecular Probes，Eugene，OR)在37℃与细胞反应15分钟。最后，再用PBS洗涤三次后，在荧光显微镜下观察细胞。对于含有F和HN蛋白的自主复制型SeV18+GFP，在所有检测温度下都可在细胞表面检测到浓缩的M蛋白(图12)。对该M蛋白浓缩图像已有报道(Yoshida，T.等，Virology 71，143-161，1976)，并推定其反映病毒粒子形成的位点。具体地，对于SeV18+GFP，M蛋白在所有温度下都可正常定位在细胞表面，表明有足量的病毒粒子形成。另一方面，对于SeV18+/ΔF-GFP，M蛋白浓缩在38℃剧烈减少。据信M蛋白定位于细胞表面，与F蛋白和HN蛋白的胞质尾结合(Sanderson，C.M.等，J.Virology 68，69-76，1994；Ali，A.等，Virology 276，289-303，2000)。由于这两种蛋白之一即F蛋白在SeV18+/ΔF-GFP中缺失，此缺陷被推定对M蛋白定位有影响。所述影响预期对SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP更强，且还预期即使在37℃，M蛋白定位也将受到干扰且二次释放的颗粒数目也将减少。
[实施例8]研究二次颗粒释放的抑制机制(2)：
为更详细研究SeV蛋白的亚细胞定位，使用共聚焦激光显微镜(MRC1024；Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)进行分析。A-10细胞(大鼠成肌细胞)用SeV18+SEAP/ΔF-GFP和SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(MOI＝1)分别感染，并随后在含有10％血清的MEM中在32℃或37℃进行 培养。一或两天后，使用抗M抗体和抗HN抗体对细胞进行免疫染色。如下进行免疫染色：感染细胞用PBS洗涤一次，将冷却到-20℃的甲醇加入细胞中，并在4℃固定细胞15分钟。所述细胞用PBS洗涤3次，并随后在室温使用含2％山羊血清，1％BSA和0.1％Triton的PBS溶液封闭一小时。所述细胞与含2％山羊血清的抗M第一抗体溶液(10μg/ml抗M抗体)在37℃反应30分钟。随后与抗HN第一抗体溶液(1μg/ml抗HN抗体(IL4-1))在37℃反应30分钟。用PBS洗涤三次后，所述细胞与含2％山羊血清的二级抗体溶液(10μg/ml Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG(H+L)偶联物以及10μg/mlAlexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)偶联物：Molecular Probes，Eugene，OR)在37℃反应15分钟。细胞用PBS洗涤三次，并用稀释4000倍的TO PRO3(Molecular Probes，Eugene，OR)对核进行染色。所述细胞在室温放置15分钟。最后，为防止猝灭(quenching)，使用Slow Fade Antifade Kit溶液(MolecularProbes，Eugene，OR)替换液体，其在共聚焦显微镜下观察细胞。图13显示感染一天后的结果。红色代表M蛋白定位；绿色代表HN蛋白定位；且黄色为两者的共同定位。深红色部分(Farred)经过颜色转换，因此蓝色代表细胞核。对于SeV18+SEAP/ΔF-GFP，每种蛋白的定位模式在32℃和37℃之间差异不大，且观察到M蛋白和HN蛋白在细胞表面的定位。另一方面，对于SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP，每种蛋白在上述两个温度下的定位与SeV18+SEAP/ΔF-GFP中的定位都不同。具体地，几乎没有任何M蛋白定位与细胞表面。具体地，在37℃，M和HN蛋白几乎完全分离，M蛋白定位于推定接近微管中间体的位点(例如接近高尔基体)。从感染后培养两天的细胞获得了类似的结果。特别在SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP-感染的细胞中，亚细胞M蛋白定位在感染后一天和两天之间没有改变(图14)，且显示蛋白转运似乎停止。该结果还显示由于导入温度敏感型突变的病毒造成的二次颗粒释放减少是由于M蛋白定位缺陷导致的，其对颗粒形成有重要作用。
当细胞感染SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以后在32℃培养时，染色的M蛋白的形态与微管的形态相似(图13)。为显示微管的参与，加入增强微管解聚的试剂，然后研究了M蛋白(和HN蛋白)定位的改变。A-10细胞用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并立即以1μM的终浓度加入解聚试剂秋水仙碱(Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)或秋水仙胺 (Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)。随后在32℃培养细胞。感染后两天，M和HN蛋白的亚细胞定位通过上述同样的方法观察。缺乏解聚剂时，M蛋白分布在形态上与微管相似(图13)。然而，加入解聚剂导致该结构的破坏，且所述蛋白检测为大的纤维结构(图15)。该结构可以是M蛋白本身的聚合物，或者与解聚微管的残基结合的M蛋白。在任一情况下，如图13所示，似乎可以断定M蛋白位于用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后在32℃培养的细胞的微管上。
为证明上述M蛋白在微管中的定位是温度敏感型病毒的特征，评估了病毒SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后关于微管解聚剂(秋水仙碱)对的M蛋白(和HN蛋白)定位改变的影响。A-10细胞由SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1进行感染，且立即以1μM的终浓度加入所述解聚剂秋水仙碱。所述细胞在32℃或37℃培养。感染两天后，M蛋白(和HN蛋白)的亚细胞定位通过上述相同方法观察。结果显示在图16中。两种病毒感染的细胞显示类似的特征。具体地，当细胞感染后在32℃培养时，观察到的M蛋白为大的纤维状结构，与图15中的类似。显示M蛋白与微管的共存也见于SeV18+/ΔF-GFP感染的情况。具体地，在用SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染并在37℃培养的细胞中，观察到的M蛋白定位在推定接近高尔基体的区域。
根据以上结果，可推出以下结论：M蛋白在高尔基体附近合成；其沿微管(例如与动力蛋白例如肌动蛋白结合)在细胞内转运，主要与F和HN蛋白的胞质尾结合(Sanderson，C.M.等，J.Virology 68，69-76，1994；Ali，A.等，Virology 276，289-303，2000)；且M蛋白定位于细胞表面，然后形成颗粒。在包含温度敏感型突变的病毒中，直到沿微管进行细胞内转运的所有过程在32℃都正常。然而，从微管移位到细胞表面的阶段可能被阻碍，导致了沿微管的定位结果。在37℃，推定即使是沿微管的细胞内转运也受阻，由此观察到定位于高尔基体附近。M蛋白合成推定在高尔基体附近发生。然而，在这些位点附近观察到了M蛋白的聚集，此结果显示其合成区域可能在其它地方。然而，据报道，微管蛋白，即微管的成分，参与SeV转录和复制活化，并促进其转录和复制(Moyer，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，5405-5409，1986；Ogino，T.等，J.Biol.Chem.274，35999-36008，1999)。此外，由于高尔基体位于中心体附近(其中预计有大量微管蛋白存在)，所述病 毒蛋白可能在接近微管中心体处合成(即，接近高尔基体)。此外，尽管SeV突变株F1-R的M基因含有突变，其在感染细胞后修饰微管，且所述修饰可使得颗粒形成不依赖F1-R株的细胞极性(Tashiro，M.等，J.Virol.67，5902-5910，1993)。换言之，本实施例所得结果可通过推定M蛋白沿微管蛋白在细胞内转运而解释。在推定的机制中，将温度敏感性突变导入M和HN基因可导致缺陷型M蛋白亚细胞定位，导致二次颗粒释放的减少。
[实施例9]构建包含EGFP基因的M基因缺陷型SeV的基因组cDNA：
cDNA的构建使用M缺陷型SeV(其是M基因缺陷型(pSeV18+/ΔM：WO 00/09700))的全长基因组cDNA。构建方案如图1 7所示。包含pSeV18+/ΔM的M缺陷位点的BstEII片段(2098bp)亚克隆到pSE280(pSE-BstEIIfrg结构)的BstEII位点。pSE280位点的EcoRV识别位点通过用SalI/XhoI消化随后进行连接而缺失(Invitrogen，Groningen，Netherlands)。包含GFP基因的pEGFP(TOYOBO，Osaka，Japan)用Acc65I和EcoRI消化，且消化物的5’-末端通过使用DNA截短试剂盒(Takara，Kyoto，Japan)形成平末端。平末端片段随后亚克隆到pSE-BstEIIfrg中，其已经由EcoRV消化并由BAP(TOYOBO，Osaka，Japan)处理。所述包含EGFP基因的BstEII片段，插入最初的pSeV18+/ΔM以构建包含位于M缺陷位点的EGFP基因的M基因缺陷型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔM-GFP)。
[实施例10]构建M基因缺陷和复制能力缺陷型SeV基因组cDNA：
构建了缺失M基因和F基因的SeV基因组cDNA。下述构建方案如图18所示。M基因的缺失使用pBlueNaeIfrg-ΔFGFP，其可通过将F缺陷型仙台病毒全长基因组cDNA(其包含位于F基因缺陷位点的EGFP基因)的NaeI片段(4922 bp)(pSeV18+/ΔF-GFP:Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)亚克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位点而构建。缺失设计成利用紧接在M基因之后的ApaLI位点来直接切割M基因。即，ApaLI识别位点插入P基因后，使得待切除的片段变成6n，诱变使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)根据试剂盒说明进行。用于诱变的合成寡核苷酸序列如下：
5’-agagtcactgaccaactagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3’/SEQ ID NO：24和
5’-tgaggatggtaggatgcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct-3’/SEQ ID NO：25.
诱变后，产生的突变cDNA用ApaLI(在37℃，5分钟)部分消化，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Bothell，WA)回收，然后进行连接。再次用QIAquick PCR纯化试剂盒回收，用BsmI和StuI消化，并用于转化DH5α以制备M基因缺陷的(和F基因缺陷的)DNA(pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP)。
M基因缺陷的pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP(和F基因)用SalI和ApaLI消化并回收包含M基因缺陷位点的1480bp片段。pSeV18+/ΔF-GFP用ApaLI/NheI消化并回收含HN基因的片段(6287bp)，且这两个片段被克隆到Litmus 38(New Engl和Biolabs，Beverly，MA)的  SalI/NheI位点(LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP结构)。通过用SalI/NheI消化LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP回收的7767bp片段与另一用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP所得的片段(8294bp)连接，后一片段不包含基因例如M和HN基因。由此，构建了在缺陷位点(pSeV18+/ΔMΔF-GFP)包含EGFP基因的M缺陷型和F缺陷型仙台病毒全长基因组cDNA。如此构建的M缺陷型(和M缺陷型及F缺陷型)病毒的结构如图19所示。该基因组cDNA可用于构建包含所需修饰后F蛋白的M缺陷型和F缺陷型SeV。
[实施例11]制备表达SeV-M蛋白的辅助细胞
为制备表达M蛋白的辅助细胞，使用Cre/loxP表达诱导系统。为构建该系统，使用质粒pCALNdLw，其被设计为使用Cre DNA重组酶来诱导表达基因产物(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。该系统也用于制备F蛋白的辅助细胞(LLC-MK2/F7细胞)(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)。
<1>表达M基因的质粒的结构：
为制备M蛋白诱导表达辅助细胞，使用上述LLC-MK2/F7细胞利用上述系统将M基因导入到这些细胞。转移F基因时，由于pCALNdLw/F使用了新霉素抗性基因，利用相同细胞导入其他基因时，使用不同的药物抗性基因是必要的。因此，根据图20所述的方案，包含M基因的质粒(pCALNdLw/M：M基因插入pCALNdLw的SwaI位点)的新霉素抗性基因 用潮霉素抗性基因取代。即，用HincII和EcoT22I消化pCALNdLw/M后，含M基因的片段(4737bp)通过在琼脂糖上进行电泳分离并切除相应的带，用QIAEXII Gel提取系统回收该片段。同时，用XhoI消化pCALNdLw/M并回收不包含新霉素抗性基因的片段(5941bp)，然后用HincII进一步消化并回收1779bp的片段。通过使用pcDNA3.1hygro(+)(Invitrogen，Groningen，Netherlands)作为模板，使用以下2种引物进行PCR制备潮霉素抗性基因：
hygro-5’(5’-tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgag-3’/SEQ ID NO：26)和
hygro-3’
(5’-aatgcatgatcagtaaattacaatgaacatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3’)/SEQ ID NO：27).
PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒回收，并使用XhoI和EcoT22I消化。通过连接这三个片段构建pCALNdLw-hygroM。
<2>克隆诱导表达SeV-M和SeV-F蛋白的辅助细胞：
使用Superfect转染试剂通过产品说明进行转染。具体地，进行以下步骤：LLC-MK2/F7细胞以5×105细胞/皿铺在直径60mm的Petri皿中，并随后在含10％FBS的D-MEM中培养24小时。pCALNdLw-hygroM(5μg)在不含FBS也不含抗生素的D-MEM(共150μl)中稀释。搅拌混合物，并加入30μl的Superfect转染试剂，并再次搅拌混合物。在室温放置10分钟后，加入含10％FBS的D-MEM(1ml)。搅拌由此制备的转染混合物，并加入已经用PBS洗涤一次的LLC-MK2/F7细胞。在孵箱中在37℃和5％CO2大气中培养3小时后，去除转染混合物，并且用PBS洗涤细胞三次。加入含10％FBS的D-MEM 5ml继续培养24小时后，细胞用胰蛋白酶解离，以大约5个细胞/孔的稀释度铺于96孔板上，并在含10％FBS的D-MEM(补充150μg/ml潮霉素)(Gibco-BRL，Rockville，MD)中培养约两周。培养从单细胞增殖的细胞克隆并使其在6孔板上扩增。共制备了130个克隆，对该等克隆进行如下分析。
<3>分析诱导表达SeV-M(和SeV-F)蛋白的辅助细胞克隆：
用Western印迹半定量分析如上述获得的130个克隆中的M蛋白的表达量。每个克隆铺于6孔板上，并在接近满底状态时，根据Saito等(Saito， I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法，用表达Cre DNA重组酶(AxCANCre)的重组腺病毒(稀释于含5％FBS的MEM中)以MOI＝5进行感染。在32℃培养两天后，去除培养物上清。使用PBS洗涤细胞一次，并通过使用细胞刮器进行分离。通过将如此回收的细胞的1/10加样于各个泳道进行SDS-PAGE，然后使用抗M蛋白抗体根据实施例3和4所述的方法进行Western印迹。在130个克隆中，针对具有相对较高的M蛋白表达水平的那些克隆，通过Western印迹用抗F蛋白抗体(f236：Segawa，H.等，J.Biochem.123，1064-1072，1998)分析。两个结果都显示在图21中。
[实施例12]评估诱导表达SeV-M蛋白的辅助细胞：
使用在实施例11中克隆的诱导表达SeV-M蛋白的辅助细胞，进行M缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)的病毒重构，并评价这些细胞克隆的病毒产生能力。将SeV18+/ΔM-GFP的P0裂解物加入各克隆中，并检验了是否能观察到GFP蛋白的扩散(是否实现了M蛋白的提供(trans-supply))。如下制备P0裂解物。将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿铺于直径100mm的Petri皿上，培养24小时，并随后以MOI＝2用PLWUV-VacT7在室温感染1小时。质粒pSeV18+/ΔM-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，pGEM/F-HN和pGEM/M分别以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg和4μg/皿的重量比悬于Opti-MEM中。将相当于1μg DNA/5μl的SuperFect转染试剂加入这些悬液并混合。所述混合物在室温放置15分钟，并最后加入3ml含3％FBS的Opti-MEM中。将混合物加入细胞，并随后培养所述细胞。培养5个小时后，所述细胞用无血清MEM洗涤两次，并在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培养。培养24小时后，将LLC-MK2/F7/A细胞以8.5×106 细胞/皿铺于皿中，并进一步在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中在37℃培养两天(P0)。回收这些细胞，并将沉淀重悬于2ml/皿Opti-MEM，通过重复三次冷冻和解冻循环制备P0裂解物。同时，将10个不同的克隆铺于24孔板上。当接近满底时，用AxCANCre以MOI＝5感染，并在32℃培养两天。这些细胞用SeV18+/ΔM-GFP的P0裂解物以200μl/孔进行转染，并使用含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM在32℃培养。由SeV18+/ΔM-GFP造成的GFP蛋白的扩散在克隆#18和#62 (图36)中可观察到。所述扩散在克隆#62中特别快，因此所述克隆用于随后的实验中。当该细胞在用AxCANCre诱导前称为LLC-MK2/F7/M62。诱导后，持续表达F和M蛋白时称为LLC-MK2/F7/M62/A。继续用LLC-MK2/F7/M62/A细胞制备SeV18+/ΔM-GFP。P2感染后6天，制备9.5×107 GFP-CIU的病毒。P4感染后5天，制备3.7×107GFP-CIU的病毒。
如实施例3所示，推定在P1阶段后于32℃培养对于回收SeV18+/ΔM-GFP病毒特别重要。在SeV18+/ΔM-GFP中，该现象可能与M蛋白是由表达细胞(LLC-MK2/F7/M62/A)供给有关；感染的扩散极慢，且在P1感染后7天才能观察到(图22)。因此，在病毒重构实验中，“P1阶段以后在32℃培养”对由其在重构具有低效转录-复制或低形成感染性病毒颗粒能力的SeV中非常有效。
[实施例13]使用诱导表达SeV-M蛋白的辅助细胞研究病毒制备条件：
对上述病毒进行了生产性研究。将LLC-MK2/F7/M62/A细胞铺于6孔板上并在37℃培养。当细胞接近满底时，将温度变为32℃。一天后，这些细胞以MOI＝0.5用SeV18+/ΔM-GFP感染。培养物上清随时间回收，并用新鲜培养基置换。回收的上清用于测定CIU和HAU。感染4-6天后回收的上清中含有最多的病毒量(图23)。HAU在感染后可保持6天以上，但在该时间点上已显示有较强的细胞毒活性，其原因认为不是来自病毒颗粒，而是来自游离的或与细胞碎片结合的HA蛋白的活性。因此认为，优选在感染后第5天之内从培养物上清中回收病毒。
[实施例14]M基因缺陷型SeV的结构确认：
SeV18+/ΔM-GFP的病毒基因通过RT-PCR确认，而病毒蛋白通过Western印迹确认。在RT-PCR中，使用感染后6天的P2阶段病毒。QIAamp病毒RNA袖珍试剂盒(QIAGEN，Bothell，WA)用于从病毒溶液中回收RNA。Thermoscript RT-PCR系统(Gibco-BRL，Rockville，MD)用于制备所述cDNA。这两种系统都按试剂盒说明中的方法使用。后者试剂盒提供的随机六聚物用作cDNA制备的引物。为证实所述PCR产物是由RNA由来的，同时在反转录酶存在或缺失下进行了RT-PCR。使用上述制备的cDNA作为模板进行PCR，使用两对引物：P基因上的F3593(5’-ccaatctaccatcagcatcagc-3’/SEQ IDNO：28)和F基因上的R4993(5’-ttcccttcatcgactatgacc-3’/SEQ ID NO：29)的一 种组合物，以及P基因上的F3208(5’-agagaacaagactaaggctacc-3’/SEQ ID NO：30)和R4993的另一组合物。如从SeV18+/ΔM-GFP的基因结构预期到的，1073 bp和1458 bp DNA的扩增分别从前一组合物和后一组合物观察到(图24)。当反转录酶被缺失(RT-)时，基因扩增不出现。当插入的基因是M基因而不是GFP基因(pSeV18+GFP)时，分别扩增1400bp和1785bp的DNA。这些DNA与上述PCR产物的大小明显不同，支持了该病毒在结构上缺失M基因的这一事实。
蛋白确认使用Western印迹进行。LLC-MK2细胞分别用SeV18+/ΔM-GFP(图中显示为ΔM)，SeV18+/ΔF-GFP(图中显示为F)，和SeV18+GFP(图中显示为18+)以MOI＝3进行感染，并在感染后3天回收培养物上清和细胞。培养物上清在48,000g离心45分钟以回收病毒蛋白。SDS-PAGE后，进行Western印迹，用抗M蛋白抗体，抗F蛋白抗体，和DN-1抗体(兔多克隆)(其主要检测NP蛋白)，根据实施例3和4中的方法检测蛋白。在用SeV18+/ΔM-GFP感染的细胞中，没有检测到M蛋白而观察到F和/或NP蛋白。因此，从蛋白角度上也证实了该病毒具有SeV18+/ΔM-GFP的结构(图25)。在用SeV18+/ΔF-GFP感染的细胞中没有观察到F蛋白，但所有检测的病毒蛋白都在用SeV18+GFP感染的细胞中检测到。此外，只有极少的NP蛋白在用SeV18+/ΔM-GFP感染的细胞的培养物上清中检测到，表明没有或只有极少的二次释放颗粒。
[实施例15]存在或缺失M基因缺陷型SeV的二次释放颗粒的定量分析：
如实施例14所述，LLK-MK2细胞用SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝3感染，并在感染后三天回收培养物上清，通过孔径0.45μm的滤器过滤，并随后在48,000g离心45分钟以回收病毒蛋白。随后使用Western印迹半定量地检测培养物上清中的病毒蛋白。从SeV18+/ΔF-GFP感染的细胞中制备了类似地样品用作对照。制备各样品的连续稀释物并对其进行Western印迹，使用DN-1抗体(主要识别NP蛋白)检测蛋白。SeV18+/ΔM-GFP感染的细胞的培养物上清中的病毒蛋白水平估计为SeV18+/ΔF-GFP感染的细胞的约1/100(图26)。SeV18+/ΔF-GFP的样品HA活性为64HAU，SeV18+/ΔM-GFP的样品HA活性低于2HAU。
检验了该实验的随时间的变化过程。即，LLC-MK2细胞用SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝3进行感染，且随时间(每天)回收培养物上清以测定HA活性(图27)。感染后四天以上时，虽然较低仍可检测到HA活性。然而，感染后4天或4天以上的SeV18+/ΔM-GFP-感染的细胞中，LDH活性(细胞毒活性指示物)测定显示有明显的细胞毒活性(图28)。这表明，HA活性升高很有可能不是由于VLP，而是由于与细胞碎片结合的或游离的HA蛋白活性引起的。此外，感染后5天获得的培养物上清使用Dosper脂质体转染试剂(阳离子脂质体)(Roche，Basel，Switzerland)进行检验。培养物上清(100μl)与Dosper(12.5μl)混合，在室温放置十分钟，然后转染到在6孔板上培养到满底的LLC-MK2细胞。转染后两天在荧光显微镜下观察，显示在用SeV18+/ΔF-GFP感染的细胞上清(其含有二次释放颗粒)中可观察到许多GFP阳性细胞，而在SeV18+/ΔM-GFP感染的细胞上清中只能观察到非常少的或几乎没有GFP-阳性细胞(图29)。从上述结果可见，因M蛋白缺失，颗粒的二次释放几乎被完全抑制。
2.构建由于修饰了蛋白酶依赖向性而具有降低或缺损的颗粒形成能力的SeV载体
利用上述构建M缺陷型SeV的重构系统，如下构建其中F蛋白切割位点被修饰的SeV。
[实施例16]构建具有修饰的F蛋白活化位点的M缺陷型SeV基因组cDNA：
构建经修饰的F蛋白的F1/F2切割位点(活化位点)的M缺陷型SeV基因组cDNA，其切割位点含有在癌细胞中高度表达的蛋白酶的识别序列。构建基于用作MMP-2和MMP-9的合成底物的序列的各种序列，以及基于uPA底物的序列。图30显示4种序列：两种基于用作MMP-2和MMP-9的合成底物的序列而设计的序列(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)，其具有或不具有修饰[PLG↓MTS(SEQ ID NO：3)和PLG↓LGL(SEQ ID NO：31)；下文中，包含这些序列的F蛋白分别称为F(MMP#2)和F(MMP#3)]；另一序列通过仅插入3个氨基酸的序列PLG(其为MMP合成底物共通(common)序列)而设计(下文中，具有该序列的F蛋白称为F(MMP#4))；以及基于uPA底物，VGR(SEQ ID NO：6)设计的序列，(下 文中，包含该序列的F蛋白称为F(uPA))。
对于目的MMP(MMP-2和MMP-9)，为将其设计成其更具有选择性作用的序列，参考了对可购得的合成底物序列同时进行的底物特异性的详细研究报告(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19(7)，661-667，2001；Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277(6)，4485-4491，2002)。尤其对于MMP-9，推荐从P3-P2’的共有序列，Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(X＝任何残基；Hy＝疏水残基)(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276(23)，20572-20578，2001)。因此，为使得其与共有序列保持一致，将F(MMP#2)序列由初始的合成底物序列PLG↓MWS设计成PLG↓MTS序列。
基因构建方案显示于图31。M缺陷型仙台病毒的全长基因组cDNA(pSeV18+/ΔM-GFP)(其中EGFP基因被插入M缺陷位点)，用SalI和NheI消化。包含F基因的片段(9634bp)通过琼脂糖凝胶电泳分离，并随后用QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN，Bothell，WA)切出相应带并进行回收。获得的片段亚克隆到LITMUS38(New Engl和Biolabs，Beverl y，MA)(LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP的结构)的SalI/NheI位点中。对F基因的诱变在该LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP上，使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)根据试剂盒说明的方法进行。用于诱变的合成寡核苷酸的序列如下：
5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’(SEQ ID NO：32)
和
5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’(SEQ ID NO：33)用于转化成F(MMP#2)；
5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3’(SEQ ID NO：34)
和
5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’(SEQ ID NO：35)用于转化成F(MMP#3)；
5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3’ (SEQ ID NO：36)和
5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3’(SEQ ID NO：37)用于转化成F(MMP#4)；
和
5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCCCgtGggGAGATTCTTCGGTGCTGTGATTG-3’(SEQ ID NO：38)
和
5’-CAATCACAGCACCGAAGAATCTCccCacGGGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3’(SEQ ID NO：39)用于转化成F(uPA)。
小写字母表示突变的核苷酸。
包含位于F基因上的目标突变的LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP用SalI/NheI消化，并收集包含F基因的片段(9634bp)。包含位于F缺陷位点的EGFP基因的F缺陷型仙台病毒全长基因组cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP:Li，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000；WO 00/70070)用SalI和NheI消化以收集包含NP基因的片段(8294 bp)；使用合成寡DNA将多克隆位点导入质粒(pSeV/SalINheIfrg-MCS：PCT/JP00/06051)中。所得质粒用SalI和NheI消化以收集该片段(8294bp)。将回收的上述两个片段互相连接以构建M缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP，pSeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP，或pSeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP，其包含F(MMP#2)，F(MMP#3)或F(MMP#4)基因(设计成通过MMP可活化的F基因)，和M缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/F(uPA)ΔM-GFP)，其包含F(uPA)基因(设计成通过uPA可活化的F基因)。
[实施例17]具有修饰的F活化位点的M缺陷型SeV载体的重构和扩增：
病毒的重构根据Li等(Li，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000；WO00/70070)报告的方法进行。由于病毒是M缺陷型，使用可提供M蛋白的上述辅助细胞(如实施例11中)。Cre/loxP表达诱导系统用于该辅助细胞的制备。所述系统利用pCALNdLw质粒，该质粒被设计成利用Cre DNA重组酶来诱导表达基因产物(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。因此，使用Saito等(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等， J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法，用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染该质粒的转化体，以表达插入的基因(见实施例11和12)。
其中F的活化位点被修饰的M缺陷型SeV的重构如下进行。LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿铺于100-mm的皿中，并培养24小时。表达T7聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)用补骨酯素和长波长紫外线照射下(365nm)处理20分钟，并在室温感染(MOI＝2)细胞一小时。所述细胞用无血清MEM洗涤后，将pSeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP(可选为，pSeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP，pSeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP，或pSeV18+/F(uPA)ΔM-GFP)，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，和pGEM/F-HN(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)等质粒以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的量分别悬于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。对应1μg DNA/5μl的SuperFect转染试剂(Qiagen，Bothell，WA)加入溶液中，混合，随后在室温放置15分钟。最后，所述混合物加入到3ml的含有3％FBS的Opti-MEM中，并随后加入到细胞中培养。培养5小时后，所述细胞用无血清MEM洗涤两次，并在含和40μg/ml胞苷酸β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。培养24小时后，持续表达M蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/M62/A)以8.5×106细胞/皿的密度进行上层覆盖，并在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中在37℃再培养两天(P0)。收集这些细胞，并将沉淀悬于2ml/皿的Opti-MEM中。重复三次冻融后，所述裂解物直接转染到LLC-MK2/F7/M62/A中，并在32℃含40μg/ml AraC，7.5μg/ml胰蛋白酶，和50U/mlIV型胶原酶的无血清MEM(ICN，Aurola，OH)(P1)中培养。3-14天后，取出部分培养物上清转染到刚制备的LLC-MK2/F7/A细胞中，并在32℃含40μg/ml AraC，7.5μg/ml胰蛋白酶，和50U/ml IV型胶原酶(P2)的无血清MEM中培养。3-14天后，将培养物再次转染到刚制备的LLC-MK2/F7/M62/A细胞中，并在32℃含7.5μg/ml胰蛋白酶和50U/ml IV型胶原酶(P3)的无血清MEM中培养3-7天。将BSA加入到收集的培养物上清中使得终浓度为1％，并将培养物保存在-80℃。解冻病毒株溶液用于随后的制备和体外实验。
此外，能以高滴度产生M缺陷型SeV载体的辅助细胞 (LLC-MK2/F7/M62-#33)通过将同一系统的SeV-M基因(和SeV-F基因)(pCALNdLw：Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)导入LLC-MK2/F7/M62辅助细胞(并继续细胞的克隆)成功获得。使用这些细胞，其中F基因没有突变的M缺陷型SeV载体(SeV18+/ΔM-GFP)可以以1×108 GFP-CIU/ml(GFP-CIU定义在WO 00/70070中)或更高滴度产生。此外，使用这些细胞还实现了SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV18+/F(uPA)ΔM-GFP的1×108GFP-CIU/ml或更高滴度的制备。
当对SeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP和SeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP使用同样的方法进行重构时，不能收集病毒颗粒。为收集这些病毒颗粒，必须进一步检验重构条件。考虑到它们不能在相同条件下收集的事实，在F(MMP#3)和F(MMP#4)中的F1/F2切割位点的设计上(F蛋白的活化位点)可能存在问题，其导致例如低切割效率或切割后的F蛋白的活性较弱。
[实施例18]制备具有修饰的F活化位点的M缺陷型SeV载体的体内试验用样品：
各种用于体内实验的M缺陷型SeV载体通过简易纯化法制备，其中病毒颗粒通过超离心而沉淀。LLC-MK2/F7/M62-#33在6孔板上长到几乎满底，用AxCANCre(MOI＝5)感染，并随后在32℃培养两天。这些细胞用SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP或SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝0.5感染。当使用SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP感染细胞时，在含7.5μg/ml胰蛋白酶和50U/mlIV型胶原酶的无血清MEM(1ml/孔)中在32℃培养3天；使用SeV18+/ΔM-GFP感染时，细胞在仅含7.5μg/ml胰蛋白酶的无血清MEM(1ml/孔)中培养3天。从六个孔内收集上清，并混合，然后在2,190g离心15分钟。收集的上清通过滤器滤过(其孔内径为0.45μm)，并随后进一步在40,000g离心30分钟。产生的沉淀悬于500μl PBS中制备纯化的病毒溶液。如上述制备的M缺陷型SeV载体的滴度为1.3×109和4.5×109GFP-CIU/ml(分别对应SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV18+/ΔM-GFP)。实施例17和18中制备的病毒中的F蛋白是已切割的，且所述病毒具有感染力。这种SeV称为F-切割的SeV或感染型SeV。下文中，SeV18+/ΔM-GFP，SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GF P，和SeV18+/F(uPA)ΔM-GFP也分别简化为SeV/ΔM-GFP，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，和SeV/F(uPA)ΔM-GFP。
[实施例19]评估F修饰M缺陷型SeV载体的蛋白酶依赖向性感染和细胞融合型感染：
<1>外源性实验：
其中从外部将蛋白酶加入到细胞系的感染方法称为外源性实验。下述实施例描述了外源性实验的基本步骤。使用不同条件实验时，在各实施例中进行具体描述。LLC-MK2细胞培养到铺满96孔板(5×105细胞/孔)。用MEM洗涤两次后，加入含SeV(F-切割型：1×105CIU/ml，或F-未切割型：1×107颗粒/ml(表示为HA单位；见实施例25)]的50μl MEM感染细胞。同时，也加入含50μl MEM的蛋白酶，并在37℃培养细胞。四天后，在荧光显微镜下观察到了感染的扩散。计数1mm2内的细胞中表达GPF的细胞数。使用的蛋白酶，胶原酶(IV型胶原酶)购自ICN Biomedicals Inc.，MMP-2(活性MMP-2)，MMP-3，MMP-7，MMP-9(活性MMP-9)，和纤维蛋白溶酶购自COSMO BIO Co.ltd。
<2>内源性实验：
通过在细胞内表达蛋白酶而不是从细胞外加入蛋白酶的感染方法称为内源性实验。下述实施例描述了内源性实验的基本步骤。使用不同条件时，在各实施例中进行具体描述。各种癌细胞培养到铺满96孔板(5×105细胞/孔)。用MEM洗涤两次后，加入含SeV(F-切割型：1×105CIU/ml，或F-未切割型：1×107HAU/ml(详见实施例25))的50μl MEM感染细胞。此时，在培养基中添加终浓度为1％的FBS。四天后，在荧光显微镜下观察到了感染的扩散。计数1mm2内的细胞中表达GPF的细胞数。
[实施例20]通过F修饰的M缺陷型仙台病毒载体引起的蛋白酶依赖性细胞融合型感染(外源性实验)：
使用几乎不表达蛋白酶的LLC-MK2细胞，证实F的修饰是否造成蛋白酶依赖性细胞融合型感染(通过上述外源性实验进行测定)(图32)。用三种类M缺陷型SeV(如实施例17所述)，SeV/ΔM-GFP，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，和SeV/F(uPA)ΔM-GFP感染细胞。同时，分别加入0.1μg/ml IV型胶原酶 (溶组织梭菌(Clostridium histolyticum))，0.1μg/ml活性MMP-2，0.1μg/ml活性MMP-9，或0.1μg/ml uPA，或7.5μg/ml胰蛋白酶。四天后，在荧光显微镜下观察细胞。具有未修饰F的SeV/ΔM-GFP，仅在加入胰蛋白酶的LLC-MK2中可观察到感染细胞与其周围细胞的融合，导致细胞融合型感染和多核细胞(合胞体)形成(图32L)。其F蛋白中插入MMP降解序列的SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP显示LLC-MK2的细胞融合型感染(其中加入了胶原酶，活性MMP-2，和活性MMP-9)，导致合胞体形成(图32E，32F，和32M)。另一方面，其F蛋白中插入了尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和组织型PA(tPA)降解序列的SeV/F(uPA)ΔM-GFP在胰蛋白酶存在下显示了细胞融合型感染，并且对F蛋白进一步修饰时，在存在uPA时显示合胞体，多核细胞的形成(图32Q和32R)。这些结果表明，由于各种蛋白酶降解底物序列被插入到M缺陷型SeV的F蛋白中，导致降解底物依赖性细胞融合型感染，并将感染扩散到接触的细胞。
[实施例21]癌细胞株的MMP表达特异性细胞融合型感染(内源性实验)：
使用实施例17中制备的SeV，进行内源性实验以测定是否存在内源蛋白酶选择性细胞融合型感染。使用表达MMP的癌细胞株，HT1080(人纤维母细胞肉瘤)(Morodomi，T.等，Biochem.J.285(Pt 2)，603-611，1992)，表达tPA的细胞株，MKN28(人胃癌细胞系)(Koshikawa，N.等，Cancer Res.52，5046-5053，1992)，和不表达任一蛋白酶的细胞株，SW620(人结肠癌细胞系)。MKN28得自Riken Institute of Physical and Chemical Research(Cell No.RCB1000)，HT1080(ATCC No.CCL-121)和SW620(ATCC No.CCL-227)，以及用于以下实施例的SW480(ATCC No.CCL-228)，WiDr(ATCC No.CCL-218)，和Panc-1(ATCC No.CRL-1469)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使用提供细胞的各研究所所使用的培养基。此外，将FBS以1％的终浓度加入所有培养基中。如图33所示，在表达MMP的细胞株HT1080中，只有用SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染扩散10倍或更多。此外，在表达tPA的细胞株MKN28中，只有用SeV/F(uPA)ΔM-GFP的感染可观察到细胞融合型感染扩散。在不表达任一蛋白酶的SW620中，根本没有观察到感染的扩散。
[实施例22]由佛波醇酯诱导的MMP造成的细胞融合型感染：
据报道，癌细胞周围的生长因子，可在体内诱导MMP。该现象可使用佛波醇酯，即佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸(PMA)在体外重现。为研究可重现该条件(其中MMP表达被诱导)下的感染，使用PancI，已知通过PMA活化MMP-2并诱导MMP-9的胰腺癌细胞株，通过F修饰的M缺陷型SeV载体检验细胞融合型感染的存在或缺失(Zervos，E.E.等，J.Surg.Res.84，162-167，1999)。PancI和其它癌细胞株培养在96孔中直到满底(5×105细胞/孔)。所述内源性实验用实施例17中制备的SeV进行。用MEM洗涤两次后，加入50μl含有1×105CIU/ml SeV的MEM，用来感染(MOI＝0.01)。加入相同量的(50μl)MEM(含40nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸(Sigma)。同时，将FBS加入培养基使其终浓度为1％。
MMP-2和MMP-9的诱导表达通过凝胶酶谱法(其中存在凝胶水解活性的部分变透明)证实(Johansson，S.，和Smedsrod，B.，J.Biol.Chem.261，4363-4366，1986)。具体地，收集每种培养物的上清并溶于样品缓冲液中。所述混合物与丙稀酰胺混合，使凝胶终浓度为1mg/ml以制备8％的丙稀酰胺凝胶。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，所述凝胶用10mM Tris(pH 8.0)和2.5％Triton X-100洗涤，在明胶酶活化缓冲液(50mM Tris，0.5mM CaCl2，10-6M ZnCl2)中在37℃保温一天后，用1％考马斯蓝R-250，5％醋酸，和10％甲醇染色(图34的上半部)。“C”代表对照，且“T”代表由20nM PMA诱导的样品上清。所述图上部显示MMP-9在HT1080和Panc I中被诱导。诱导前，在Panc I中检测到了潜在型MMP-2，该潜在型已知几乎不具有任何凝胶水解活性。如图34(下半部)所示，用SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP感染的Panc I通过MMP诱导引起了细胞融合型感染。
[实施例23]SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP感染的HT1080细胞株在体内的扩散：
制备HT1080患癌裸鼠。将人纤维母细胞瘤细胞株HT1080以5×106个细胞(50μL，1×108细胞/mL)，经皮下注入BALB/c裸鼠(Charles River)的右背皮肤。7-9天后，使用肿瘤直径大于3mm的动物。癌体积(其形状推定为椭圆形)为30-100mm3。将50μl的以下F-切割型SeV一次性注入肿瘤部位： MEM(对照)(N＝5)；含SeV-GFP的MEM(1×108CIU/ml)(N＝5)；含SeV/ΔM-GFP的MEM(1×108CIU/ml)(N＝7)；和含SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的MEM(1×108CIU/ml)(N＝7)。两天后，在荧光显微镜下观察上述癌(图35)。SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP仅在注射位点附近的区域观察到荧光(图35E和35H)。反之，对于SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，观察到荧光扩散到整个癌(图35K)。放大图像显示，SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP显示单个细胞的荧光，而对于SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，细胞形状不清楚，提示细胞融合。此外，整个癌区和GFP表达区在上述图像中通过NIH image测定。GFP表达区在整个癌中的比例为10％(对应SeV-GFP)和20％(对应SeV/ΔM-GFP)，而对应SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的所述比例为90％，明显表明感染扩散(图36)。在除癌组织以外的组织中，细胞融合型感染在与癌细胞邻接的筋膜和皮下连接组织中几乎不能观察到。因此，在这些条件下，确定感染不扩散到癌组织以外的正常组织。
[实施例24]F修饰的M缺陷型SeV载体对患癌裸鼠的抗肿瘤效果：
HT1080患瘤小鼠如图35中所述的相同方法制备。8或9天后，肿瘤直径大于3mm的动物被选出，并将50μl以下四种F-切割型SeV注入癌位点：MEM(N＝5)；含SeV-GFP(1×108CIU/ml)的MEM(N＝5)；含M SeV/ΔM-GFP(1×108CIU/ml)的MEM(N＝7)；和含SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP(1×108CIU/ml)的MEM(N＝7)。两天后，将等量的SeV再次注入癌位点。每隔一天测定癌位点的长轴(a)，短轴(b)和厚度(c)的长度。推定癌是椭圆体形，癌体积按V＝π/6×abc计算。分别给药PBS，SeV-GFP，和SeV/ΔM-GFP的癌迅速长大。反之，给药SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的癌(其中载体扩散到整个癌，如图37所示)，明显没有扩增并保持较小的体积。通过t检验分析显示显著性差异，与其它三组相比，其体积明显更小，P＜0.05。这表明所述载体即使没有搭载治疗基因仍具有抗癌效果。
[实施例25]F-未切割/F修饰的M缺陷型SeV载体的制备和选择性感染：
在上述使用的SeV载体的制备步骤中，通常在含有7.5μg/ml高浓度胰蛋白酶和50U/ml胶原酶的培养基中进行培养，以诱导F的切割，并收集F切割的载体(见实施例17和18)。在本实施例中，F未切割的SeV通过收集 在制备过程中不加入蛋白酶的SeV而产生。
具体地，LLC-MK2/F7/M62/A细胞在10cm的皿中培养直到满底。用实施例1 7中制备的每种F修饰的M缺陷型SeV感染细胞(MOI＝5)。一小时后，去除上清并用MEM培养基洗涤两次。将4ml MEM加入细胞并在32℃培养。5天后，收集上清，并加入牛血清白蛋白(BSA)(终浓度为1％)。测定HAU滴度后，将上清保存在-70℃备用。收集每种F修饰的M缺陷型SeV，使其浓度范围在22-23HAU/ml(？)(1HAU＝1×106病毒颗粒/ml，并因此对应1×108-1×109颗粒/ml)，并通过稀释调节到1×108病毒颗粒/ml。
该外源性试验的结果证实了成功制备了SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV/F(uPA)ΔM-GFP载体，该等载体分别以MMP依赖的以及以uPA-或tPA依赖的方式感染LLC-MK2细胞(外源性蛋白酶的数据未显示)。此外，通过内源性实验检验蛋白酶表达是否造成选择性感染，例如使用表达MMP的HT1080细胞株，表达tPA的MKN28细胞株以及几乎不表达所述蛋白酶的SW620细胞株(图38)。SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP感染表达MMP的HT1080细胞株，但不感染表达tPA的MKN28细胞株。SeV/F(uPA)ΔM-GFP感染表达tPA的MKN28细胞株但不感染表达MMP的HT1080细胞株。如上所述，每种SeV显示蛋白酶依赖的选择性感染。
[实施例26]由人纤维母细胞对MMP-3和MMP-7的诱导导致的F修饰的M缺陷型SeV载体感染：
通过与纤维母细胞共培养或者体内培养，在SW480和WiDr细胞中可分别诱导MMP-3和MMP-7(Kataoka，H.等，Oncol.Res.9，101-109，1997；McDonnell，S.等，Clin.Exp.Metastasis.17，341-349，1999)。使用这些细胞研究F修饰的M缺陷型SeV载体的感染在体内是否改变。每种癌细胞株在96孔板培养直到满底(5×104细胞/孔)。用MEM洗涤两次后，加入含1HAU/ml的F-未切割的SeV(1HAU＝1×106病毒颗粒/ml，并因此相当于1×106颗粒/ml)的50μl MEM用于感染。正常人肺纤维母细胞(TAKARA)以5×104细胞/孔的浓度加入细胞中并在37℃培养四天(图39)。SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP可感染SW480和WiDr细胞(通过与人纤维母细胞共培养)。这种现象在SW620中没有观察到，其是不可诱导的。
[实施例27]F修饰的M缺陷型SeV载体对人主动脉平滑肌细胞的MMP选择性感染：
MMP的错误表达(aberrant expression)除在癌症中有报道外，还在动脉硬化，类风湿性关节炎，伤口愈合中有所报道(Galis，Z.S.，和Khatri，J.J.，Circ.Res.90，251-262，2002；Martel-Pelletier，J.等，Best Pract.Res.Clin.Rheumatol.15，805-829，2001)。
为证明F修饰的M-缺失型SeV载体对这些疾病的可应用性，进行了载体对人主动脉平滑肌细胞的MMP选择性感染。人平滑肌细胞(TAKARA)培养于96孔板直到满底(5×105细胞/孔)。用MEM洗涤两次后，将50μl含SeV(F-未切割型：1HAU/ml(1×106颗粒/ml))的MEM加入细胞进行感染。将等量(50μl)的含蛋白酶MEM加入其中，并在37℃培养四天。计算每1mm2 的细胞中表达GFP的细胞数目(图40)。SeV/ΔM-GFP的感染通过仅加入胰蛋白酶增强，然而SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染通过加入胶原酶，MMP-2，MMP-3和MMP-9增强。
[实施例28]F修饰的M缺陷型SeV载体中F蛋白的蛋白酶依赖性切割：
如实施例20所示，通过将各蛋白酶降解序列插入F蛋白，F修饰的M缺陷型SeV载体显示依赖于这些降解序列的细胞融合型感染。此外，修饰后F0的切割是否以蛋白酶依赖的方式出现通过Western印迹证实。通过以下方法对病毒取样。三种类型的病毒颗粒，SeV/ΔM，SeV/F(MMP#2)ΔM，和SeV/F(uPA)ΔM，以MOI＝3感染M蛋白诱导的辅助细胞。感染后两天，收集上清并在18,500g离心三小时，并将沉淀重悬于PBS中。对各病毒悬液而言，加入蛋白酶使胰蛋白酶的终浓度为7.5μg/ml，MMP-9的终浓度为0.1ng/ml，且uPA的终浓度为0.1ng/ml，并在37℃保温30分钟。将样品缓冲液加入各混合物以制备SDS-PAGE样品。根据标准方法进行SDS-PAGE和Western印迹(Kido，H.等“Isolation and characterization of a noveltrypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells.A possibleactivator of the virus fusion glycoprotein.”J Biol Chem 267，13573-13579，1992)。通过用三种合成肽(FFGAVIGT+Cys：117-124，EAREAKRDIALIK：143-155，和CGTGRRPISQDRS：401-413；分别为SEQ ID NO：46，47，和48)的混合物进行免疫，获得作为抗血清的兔抗F1抗体。HRP标记的抗兔IgG 抗体(ICN，Aurola，OH)用作二级抗体，且使用化学荧光法(ECL Western印迹检测试剂；Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于检测。图41显示用上述蛋白酶在37℃处理以下物质30分钟的结果：包含未修饰的F的M缺陷型SeV载体(1，4，7，和10)，具有插入F的MMP#2序列的M缺陷型SeV载体(2，5，8，和11)，以及具有插入F的uPA序列的M缺陷型SeV载体(3，6，9，和12)。
如图41所示，F1的切割根据各插入的蛋白酶底物，分别在以下情况下出现，即：对于具有未修饰的F的M缺陷型SeV载体为在胰蛋白酶存在的条件下，对于具有插入F的MMP#2序列的M缺陷型SeV载体为在MMP存在的条件下，对于具有插入F的uPA序列的M缺陷型SeV载体为在uPA存在的条件下。在此尽管未提示有关资料，对于插入了uPA序列的M缺陷型SeV载体，当降解时间延长到四小时的情况下时，F1的切割在胰蛋白酶存在的条件下可观察到。这与实施例20的结果相符，并表明合胞体形成以F切割依赖的方式出现。
[实施例29]通过F蛋白胞质区缺失增加融合力：
副粘病毒对宿主的入侵通过病毒膜和宿主细胞膜融合实现。在这一侵入机制中，仙台病毒的HN蛋白与宿主的唾液酸结合，且F蛋白导致细胞膜融合。在该步骤中，由于HN的结合导致的F蛋白的构象变化据提示是重要的(Russell，C.J.，Jardetzky，T.S.和Lamb，R.A.，“Membrane fusionmachines of paramyxovirus：capture of intermediates of fusion.”EMBO J.20，4024-34，2001)。因此，在细胞上单独表达大部分的副粘病毒的F蛋白时不显示细胞致融合力。只有同时表达HN蛋白的细胞具有致融合力。副粘病毒中F和HN蛋白胞质区的缺失已知增强其致融合力(Cathomen，T.，Naim，H.Y.和Cattaneo，R.，“Measles virus with altered envelope protein cytoplasmic tailsgain cell fusion competence.”J.Virol.72，1224-34，1998)。为测定仙台病毒中的F蛋白的胞质区的哪个缺失突变体导致致融合力增加最多，制备缺失突变体，并将其插入pCAGGS表达载体(Niwa，H.等，Gene 108，193-199，1991)。与搭载有HN的pCAGGS进行共转染并且根据形成的合胞体的数目证实产生的致融合力。
对各突变基因(其中F的胞质区已经缺失)进行PCR，使用以下引物，产 生的片段用XhoI和NotI处理，并随后连接于pCAGGS载体。用于PCR的引物如下：Fct27引物
(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQ ID NO：49，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’/SEQ IDNO：50)；Fct14引物(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQ ID NO：51，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/SEQ IDNO：52)；和
Fct4引物(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQID NO： 53，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/SEQ IDNO：54)(Kobayashi M.等，J.Viol.，77，2607，2003)。
为测定细胞致融合力，将LLC-MK2或HT1080细胞铺于24孔板直到满底。将3μl Fugene 6与50μl Opti-MEM混合。2μg的各种pCAGGS表达质粒与等量的pCAGGS/EGFP混合，并随后加入Opti-MEM和Fugene 6的混合物中。在室温放置15分钟后，将混合物加入24孔板中(其中的培养基用500μl MEM培养基置换)。在37℃，5％CO2培养3小时后，所述培养基用含1％FBS的MEM置换(用于HT1080)，并用含7.5μg/ml胰蛋白酶或指定浓度的IV型胶原酶(Clostridium)的MEM置换(用于LLC-MK2)。培养48小时后，计数融合的合胞体的数目/每×100视野(0.3cm2)(倒置显微镜)。可选地，培养的细胞在4％多聚甲醛中固定2小时，转移到70％的乙醇中，并随后转移到蒸馏水中，用苏木精染色5分钟，并用水洗涤以计数每0.3cm2中形成合胞体的核的数目。
其胞质区缺失的三种F蛋白的氨基酸序列显示于图42(A)，且其融合活性显示于图42(B)。如图42(B)所示，仅表达F蛋白的细胞不融合，但与HN共转染的细胞显示融合活性。此外，具有为使得胞质区变成14个氨基酸，而缺失了28个氨基酸序列的F蛋白(Fct14)显示最高的致融合力。
[实施例30]F/HN嵌合蛋白导致致融合力大幅度上升：
副粘病毒包膜蛋白，即F和HN蛋白分别在细胞膜上形成三聚体和四聚体，并已知通过其胞外域以及M蛋白相互作用(Plemper，R.K.，Hammond， A.L.和Cattaneo，R.，“Measles envelope glycoproteins hetero-oligomerize in theendoplasmic reticulum.”J.Biol.Chem.276，44239-22346，2001)。如图42所示，单独的F蛋白不显示致融合力，且HN蛋白对其致融合力是必须的。因此，产生包含F和HN蛋白的嵌合蛋白以通过在细胞膜上同时表达F和HN蛋白(作为融合蛋白)而制备具有增强的致融合力的载体。F蛋白是II型膜蛋白且HN是I型膜蛋白。因此如图43(A)所示，制备嵌合蛋白(Fct14/HN)以在细胞膜上形成U形，且其包含两个跨膜结构域。显示高度致融合力的Fct14用作F蛋白。由50个氨基酸组成的接头序列被插入两个蛋白之间(Fct 14/接头/HN)。根据目前搜索的数据库，该接头序列显示与任何蛋白不具有同源性。(使用无义序列，其是通过反转猴免疫缺陷病毒(SIVagm)的env的胞质区的氨基酸序列的N末端到C末端而合成的)。
制备F/HN嵌合蛋白基因的表达质粒的方法在下文中具体描述。所述F/HN嵌合蛋白基因被插入pCAGGS载体。分别对F基因和HN基因进行PCR，且获得的两个片段连接于pCAGGS。在该步骤中，制备了两种质粒，即将150-bp接头基因(50amino acids)插入或不插入F/HN基因中。所用引物的序列如下：F基因引物(F-F：5’-ATCCGAATTCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG-3’/SEQ ID NO：55和
Fct14-R：
5’-ATCCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3’/SEQ ID NO：56)；接头/HN基因引物(接头-HN-F：5’-ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3’/SEQ ID NO：57)
和HN-R：5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCATAA-3’/SEQID NO：58)；和HN基因引物(5’-ATCCGCGGCCGCAATGGATGGTGATAGGGGCA-3’/SEQ ID NO：59和5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3’/SEQ ID NO：60).
如图43(B)所示，不具有接头序列的嵌合蛋白显示低致融合力.与其相比，插入接头序列时的致融合活性显著增加，大约是共转染F和HN蛋白时 的5倍。
[实施例31]致融合力的功能维持和底物特异性：
为获得致融合力，不仅需要将F蛋白与HN蛋白同时表达，还需要通过蛋白酶将F蛋白切成两个亚单位(F1和F2)。在图42和43中，在胰蛋白酶存在下测定致融合力，且不存在胰蛋白酶时所示致融合力完全缺失。F蛋白的切割序列在图43所示的Fct14/接头/HN嵌合蛋白中修饰，使得其以MMP依赖的方式获得致融合力。报道了许多MMP的降解底物序列。其中，选择8种序列进行了修饰尝试。切割位点的氨基酸序列如图44(A)所示进行修饰，使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。蛋白酶切割后的融合肽的序列也考虑在修饰中。副粘病毒F蛋白F1区的N末端，其称为融合肽，据报道对其融合活性很重要，且F蛋白的致融合力有时通过该区内氨基酸的突变而丢失(Bagai，S.和Lamb，R.A.，“A glycine to alaninesubstitution in the aramyxoviral SV5 fusion peptide increases the initial rate offusion.”Virology 238，283-90，1997)。因此，已指明其重要性的F1的N末端区序列没有改变。在上述情况下，当插入已知为MMP的降解底物的常见六个残基序列时，F1的N末端将被设计成由MMP降解后有三个残基被加入其后。这表明，所述添加虽然可使得MMP对其进行降解，但也可能会影响F蛋白的致融合力。因此，在设计通过MMP依赖的切割而活化的F蛋白时，必须考虑以下两点：(1)MMP的底物特异性；以及(2)切割后F蛋白致融合力的保持。
MMP#1是作为MMP合成底物的最著名的序列。该序列还用于靶向其它MMP。MMP#3和MMP#8也是可购得的合成底物序列。MMP-2和MMP-9的降解底物序列PLGMWS，分别跟据由噬菌体展示揭示的共有序列(MMP-9的Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr))而修饰成PLGMTS和PQGMTS(分别为SEQ ID NO：61和62)作为MMP#2和MMP#6。根据Shneider等(AmericanSociety of Gene therapy，Annual meeting No.1163，2002，Boston)的报道，MMP#5被构建为PQGLYA(SEQ ID NO：63)。在MMP#4中，降解后融合肽的序列没有修饰。MMP#7的序列是通过对MMP-2的噬菌体展示法发现的。
制备具有位于F/HN融合基因中的修饰的F活化位点的表达质粒的细节在下文中描述。构建F/HN融合基因后，F的活化位点的诱变在pBluescript F/HN上进行。为导入突变，根据试剂盒说明使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。用于进行诱变的合成寡核苷酸的序列如下：
F(MMP#1)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGT GCTGTGATTGGTACTATCG-3’/SEQ ID NO：64，和5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ IDNO：65)；
F(MMP#2)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO：32，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO：33)；
F(MMP#3)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3’/SEQ ID NO：34，和5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO：35)；
F(MMP#4)：
(5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-33’/SEQ ID NO：36，和5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3’/SEQ ID NO：37)；
F(MMP#5)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcagggCttGtatgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO：66，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcataCaaGccctgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO：67)；
F(MMP#6)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcaaggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-33’/SEQ ID NO：68，和 5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccttgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQID NO：69)；
F(MMP#7)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCctTgcTtaCtataCGgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO：70，和5’-GAIAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcCGtataGtaAgcAagGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO：71)；和
F(MMP#8)：
(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCttGgCGAGaTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO：72，以及5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAtCTCGcCaaGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO：73)。
小写字母表示突变的核苷酸。修饰后，所述序列用EcoRI切割并与pCAGGS连接。
包含各序列的各载体，以及包含EGFP基因(pCAGGS/EGFP)的载体以等量混合，并将混合物转染到高表达MMP的HT1080细胞中。结果，只有导入了MMP#2和MMP#6序列的基因出现细胞融合并形成合胞体(图44(B))。这些序列的共同之处是用蛋白酶进行切割后，将Hy-S/T-S/T序列(MTS)添加到F1蛋白的N末端。因此，认为Hy-S/T-S/T序列(尤其是MTS序列)的添加很可能满足了下述两项必须条件：(1)由HT1080-来源的MMP切割F蛋白，和(2)切割后F蛋白保持致融合力。另一方面，对MMP#1，MMP#3，MMP#4，MMP#5，MMP#7，和MMP#8完全没有观察到细胞融合。由于除MMP#4的序列以外的所有序列都来自MMP的合成底物并预期被蛋白酶切割，提示将三个氨基酸肽加入F1可能限制切割后的F蛋白的活性。对于MMP#4，在这种情况下，很可能切割本身不发生。虽然数据未显示，从由于佛波醇酯在HT1080中诱导MMP，导致对MMP#4可观察到合胞体形成这一事实显而易见。
此外，除了对MMP#2和MMP#6序列的致融合力进行比较以外，还测定了从#6的融合肽序列的序列的N末端起第7和第12个残基由G修饰成A的序列的MMP浓度依赖的细胞致融合力(图45)。用于该F/HN融合基因 的诱变的寡核苷酸序列如下：
5’-CTTCGGTGCTGTGATTGcTACTATCGCACTTGcAGTGGCGACATCAGCAC-3’(SEQ ID NO：74)
和
5’-GTGCTGATGTCGCCACTgCAAGTGCGATAGTAgCAATCACAGCACCGAAG-3’(SEQ ID NO：75)。小写字母表示导入突变的核苷酸。表达质粒的制备如上所述，通过在诱变后，用EcoRI切出序列并将其连接于pCAGGS制备。
结果，发现MMP#6具有的致融合力比MMP#2高2-3倍。重要的是，即使是在低蛋白酶浓度条件下，MMP#6仍诱导细胞融合。即，在低浓度下实现F蛋白活化。然而，当进一步导入G到A的突变(据报道该突变增加F蛋白的致融合力)(Peisajovich，S.G.，Epand，R.F.，Epand，R.M.和Shai，Y.，“Sendaiviral N-terminal fusion peptide consists of two similar repeats，both of whichcontribute to membrane fusion.”Eur.J.Biochem.269，4342-50，2002))(#6G12A)时，所述致融合力降低到1/10或更低。这些结果解释，通过简单插入蛋白酶切割序列来修饰蛋白酶依赖向性时，在大多数的情况下会导致F蛋白活性不能保持，丢失其致融合力。在导入目的降解序列时，可通过使用该系统证实构建病毒的所述致融合力。此外，由于pCAGGS携带的Fct14/接头/HN显示明显的融合活性，预期该质粒的转染具有抗肿瘤效应。此外，通过将该嵌合蛋白导入M缺陷型仙台病毒，预期可进一步增加抗肿瘤效应。
[实施例32]构建具有增加的致融合力的改良型F修饰的M缺陷型SeV基因组cDNA：
实施例29和30显示通过修饰pCAGGS载体携带的F蛋白增加致融合力。通过对M缺陷型仙台病毒载体进行类似修饰，预期可制备致融合力增加的改良的F修饰的ΔM SeV。改良的F修饰的M缺陷型SeV基因组cDNA的基因构建是通过以下方法进行的。SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP根据与实施例16中同样的方法构建。F基因的突变在LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP上用SEQ ID NO：69的寡核苷酸，和QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)根据试剂盒说明进行。SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP的cDNA的构建是通过将突变LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP的SalI和NheI- 消化的片段以及包含NP基因的片段偶联(通过SalI和NheI消化携带位于F缺失位点上的EGFP基因的F缺陷型仙台病毒全长基因组cDNA获得(pSeV+18/F-GFP；Li，H等，J.Viol.74，6564-6569，2000；WO00/70070))(图46)。多克隆位点仙病毒cDNA(称为pSeV(TDK))(JP-A 2002-272465)是用来构建M缺陷型仙台病毒(其中F蛋白胞质区的28个氨基酸是缺失的(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP))和携带F/HN嵌合蛋白(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP)的M缺陷型仙台病毒的基本框架。M缺陷型仙台病毒SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，其中F蛋白胞质区被截短，如下构建。由于用TDK作框架，首先构建pSeV(TDK)/ΔM-GFP。GFP/EIS(加入编码转录起始和终止信号的EIS序列的GFP)通过PCR使用合成引物(Nhe-GFP-F：ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO：94)，和GFP-EIS-BssHII：
ATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(SEQ ID NO：95))，以LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP为模板进行扩增。用NheI和BssHII处理多克隆位点仙台病毒cDNA和扩增的GFP/EIS，且产生的片段被偶联以用GFP取代M蛋白来制备pSeV(TDK)/ΔM-GFP。
Fct14(MMP#6)通过PCR用实施例13中制备的pCAGGS/Fct14(MMP#6)/接头/HN作为模板，使用合成引物，Mlv-F：ATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG(SEQ ID NO：96)和Fct14-EIS-SalI：
ATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTAACGGTCATCT GGATTACC(SEQ ID NO：97)进行扩增。Fct14(MMP#6)插入F的位置以取代F基因，从而构建pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP(图46)。随后，构建携带F/HN嵌合蛋白的M缺陷型仙台病毒(pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP)。GFP/EIS通过PCR以GFP为模板，使用合成引物(Nhe-GFP-F：ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO：98)和GFP-EIS-SalI：
ATCCGCTAGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACG GAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(SEQ ID NO：99))进行扩增。GFP/EIS和多克隆位点仙台病毒cDNA用NheI和SalI处理。产生的片段被偶联以缺失M和F基因，并用GFP取代以产生pSeV(TDK)/ΔMΔF-GFP。Fct14(MMP#6)/接头/HN通过PCR用实施例31中制备的Fct14(MMP#6)/接头/HN作为模板，使用合成引物(F/HN5’Nhe-F：ATCCGCTAGCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG(SEQ ID NO：100)，和F/HN3’Nhe-EIS-R：ATCCGCTAGCACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA(SEQ ID NO：101))进行扩增。pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP通过将Fct14(MMP#6)/接头/HN偶联于上述pSeV(TDK)/ΔMΔF-GFP的NheI位点而构建。
[实施例33]改良的F修饰的M缺陷型仙台病毒的重构和扩增：
从实施例32中构建的cDNA重构病毒根据Li等的方法(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)进行。然而，由于cDNA与实施例17中的M缺陷型是相同的，需使用提供M蛋白的辅助细胞(实施例11)。Cre/loxP表达诱导系统用于制备辅助细胞。该系统使用质粒pCALNdLw，所述质粒设计成可诱导地通过Cre DNA重组酶表达基因产物(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。插入的基因通过将重组腺病毒(AxCANCre)(其表达Cre DNA重组酶)感染到该质粒的转化体而表达，所述过程采用Saito等的方法(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995)；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)。F蛋白活化位点被修饰的M缺陷型SeV如下述进行重构。LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿铺于100-mm皿上，培养24小时，然后在室温用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)(以MOI＝2)感染一小时(PLWUV-VacT7：Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)，所述痘苗病毒已经用补骨酯素和在长波长紫外线(365nm)下处理了20分钟。用无血清MEM洗涤细胞。pSeV/F(MMP#6)ΔM-GFP(可选地为，pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP或pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP)，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，pGEM/M，和pGEM/F-HN(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569， 2000；WO 00/70070)质粒分别以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg，和4μg/皿的密度悬于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。相当于1μg DNA/5μl的SuperFect转染试剂(Qiagen，Bothell，WA)加入混合物中并进行混合。在室温放置15分钟后，将混合物最后和3ml含3％FBS的Opti-MEM混合，加入细胞中，并进行培养。培养5小时后，细胞用无血清MEM洗涤两次，并随后在含40μg/ml胞苷酸β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC：Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培养。培养24小时后，持续表达F蛋白的细胞(LLC-MK2/F7/M62/A：实施例12)以8.5×106细胞/皿进行上层覆盖，并在37℃含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中再培养两天(P0)。收集这些细胞，并将沉淀以2ml/皿悬于Opti-MEM中。重复冷冻解冻循环3次后，将裂解物直接转染到LLC-MK2/F7/M62/A，且细胞培养在32℃含40μg/ml AraC，7.5μg/ml胰蛋白酶，和50U/ml IV型胶原酶的无血清MEM中(ICN，Aurola，OH)(对于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP仅含胰蛋白酶)(P1)。3-14天后，收集部分培养物上清，转染到刚制备的LLC-MK2/F7/M62/A中，并将细胞培养在32℃含40μg/ml AraC，7.5μg/ml胰蛋白酶，和50U/mlIV型胶原酶的无血清MEM中(对于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP仅含胰蛋白酶)(P2).3-14天后，用部分培养物感染刚制备的LLC-MK2/F7/M62/A，并将细胞在32℃含7.5μg/ml胰蛋白酶和50U/ml IV型胶原酶的无血清MEM(对于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP仅含胰蛋白酶)培养3-7天(P3)。收集培养物上清，并加入BSA(终浓度为1％)，并保存于-80℃。解冻保存的病毒溶液，并用于以后的制备和体外试验中。
如上述，成功制备了F蛋白裂解位点从PLGMTS(SEQ ID NO：61)修饰成PQGMTS(SEQ ID NO：62)的SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP，其胞质区缺失28个氨基酸的SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，和携带F/HN嵌合蛋白的SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP。
[实施例34]改良的F修饰的M缺陷型仙台病毒载体的致融合活性的增加：
为研究实施例33中制备的病毒的效力，对具有MMP-2和MMP-9的 不同表达水平的各种癌细胞株，以及未检测到其有MMP表达的LLC-MK2细胞进行感染，并测定载体的细胞致融合力(图47)。各癌细胞(HT1080，U87MG，A172，U251，SW480，和LLC-MK2)铺于24-孔板上(使用各细胞提供处指定的各种培养基)直到满底。U87MG(ATCC No.HTB-14)和A172(ATCCNo.CRL-1620)购自ATCC。U251(IFO50288)购自JCRB细胞库。用MEM培养基洗涤两次后，以MOI＝0.1感染各M缺陷型仙台病毒载体(SeV/ΔM-GFP)。细胞在室温放置1小时，并用MEM培养基洗涤，然后将含1％FBS的0.5ml MEM加入24孔板。培养48小时后，计数融合的合胞体的数目每×100视野(0.3cm2)(倒置显微镜)。可选地，培养的细胞在4％多聚甲醛中固定两小时，转移到70％乙醇然后转移到蒸馏水中，用苏木精染色5分钟，并用水洗涤以计数每0.3cm2中形成合胞体的核数。结果显示于图49。
MMP-2和MMP-9的表达通过实施例22中进行的凝胶酶谱法证实(图48)。结果，证实HT1080，U87MG，和A172细胞中表达MMP2。此外，低水平的MMP-9表达在U251和SW480细胞中证实。MMP-2在LLC-MK2细胞中的表达是由于培养基中所含的1％的血清中的MMP-2活性导致的。各癌细胞株在感染两天后，观察GFP的扩散。结果，在U251和SW480中观察到了致融合活性(用改良的F修饰的M缺陷型仙台病毒载体感染)，其对传统SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP不显示感染的扩散。特别是，用搭载有F/HN嵌合蛋白的M缺陷型仙台病毒载体(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接头/HNΔM-GFP)感染的那些细胞显示致融合活性。尽管数据未显示，小鼠Lewis肺癌和小鼠结肠-26癌，同样可被改良的M缺陷型仙台病毒载体感染也显示致融合活性。载体的改良预期进一步增强所述效果，并可期待对具有低浓度MMP的癌症显示治疗效果。
工业实用性
本发明提供了在目的蛋白酶存在下特异性扩散感染的载体。本发明的载体不显示病毒样颗粒的明显生成，并仅通过细胞融合转移到周围细胞中。因此，本发明的载体可用来感染位于目的组织局部的限制区域。具体地，本发明提供将其感染特异性扩散到癌症的载体。这些载体对肿瘤增殖有强抑制效果。使用本发明的载体对癌症进行基因治疗很可能成为有很小副作用的新癌症疗法。
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Claims (26)

1.包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒或者病毒核糖核蛋白，其中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其F1-F2切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒颗粒或者病毒核糖核蛋白还包括以下特性：
(1)在已导入所述病毒颗粒或者病毒核糖核蛋白的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)将所述RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白转染的细胞接触的、表达所述蛋白酶的细胞，由此诱导表达所述蛋白酶的细胞发生融合。
2.权利要求1的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，还包含野生型F蛋白。
3.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
4.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中所述蛋白酶是在癌症中活性增强的蛋白酶。
5.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶或纤溶酶原激活物。
6.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中由所述蛋白酶切割的序列包含Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg。
7.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中野生型F蛋白的胞质区在修饰后的F蛋白中部分缺失。
8.权利要求1-2之一的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白，其中修饰后的F蛋白与HN蛋白融合。
9.制备包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒的方法，在该病毒颗粒中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其F1-F2切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代；所述病毒颗粒：
(1)具有在已导入所述病毒颗粒的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)显示在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)具有将所述基因组RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由包含所述基因组RNA的病毒颗粒转染的细胞接触的、表达所述蛋白酶的细胞，由此诱导表达所述蛋白酶的细胞发生融合；所述方法包括以下步骤：
(i)在表达副粘病毒野生型M蛋白的细胞中，扩增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因组RNA的RNP，所述基因组RNA(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其F1-F2切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代；和
(ii)收集释放到细胞培养物上清液中的包含所述基因组RNA的病毒颗粒。
10.权利要求9的方法，其中所述蛋白酶是在癌症中活性增强的蛋白酶。
11.权利要求9的方法，其中步骤(i)在等于或小于35℃的温度进行。
12.权利要求9的方法，还包括在至少步骤(i)或(ii)之一中提供切割修饰后F蛋白的蛋白酶的步骤；或者包括使用所述蛋白酶处理步骤(ii)中收集的病毒颗粒的步骤。
13.权利要求9的方法，还包括在步骤(i)中在细胞内表达副粘病毒野生型F蛋白；和在至少步骤(i)或(ii)之一中提供切割野生型F蛋白的蛋白酶的步骤；或者包括使用所述蛋白酶处理步骤(ii)中收集的病毒颗粒的步骤。
14.用于癌症的治疗性组合物，其包含权利要求4的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白和可药用的载体。
15.重组的修饰后副粘病毒F蛋白，其切割位点包含Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg，并在存在基质金属蛋白酶或纤溶酶原激活物的条件下显示致细胞融合力。
16.编码权利要求15的蛋白的核酸。
17.一种病毒颗粒，其包含权利要求15的蛋白或者编码该蛋白的核酸。
18.包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白在制备用于诱导表达下述蛋白酶的细胞发生融合的药物中的用途，在所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其F1-F2切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白还包括以下特性：
(1)在已导入所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)将所述RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白转染的细胞接触的、表达所述蛋白酶的细胞，由此诱导表达所述蛋白酶的细胞发生融合。
19.包含副粘病毒基因组RNA的病毒颗粒或病毒核糖核蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途，在所述复合物中(a)编码M蛋白的核酸被突变或缺失，且(b)编码了一种修饰过的F蛋白，其F1-F2切割位点序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，且其中所述蛋白酶是在癌症中活性增强的蛋白酶，所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白还包括以下特性：
(1)在已导入所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白的细胞中复制所述基因组RNA的能力；
(2)在宿主内环境中病毒颗粒的产生明显减少或缺乏；和
(3)将所述RNA导入细胞的能力，所述细胞是与由所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白转染的细胞接触的、表达所述蛋白酶的细胞，由此诱导癌细胞的融合。
20.权利要求18或19的用途，其中使用病毒颗粒。
21.权利要求18或19的用途，其中所述病毒颗粒或病毒核糖核蛋白还包含野生型F蛋白。
22.权利要求18或19的用途，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
23.权利要求18或19的用途，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶或纤溶酶原激活物。
24.权利要求18或19的用途，其中由所述蛋白酶切割的序列包含Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg。
25.权利要求18或19的用途，其中野生型F蛋白的胞质区在修饰后的F蛋白中部分缺失。
26.权利要求18或19的用途，其中修饰后的F蛋白与HN蛋白融合。
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