KR20050000414A - 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 복제능을 갖는 세포융합형 벡터를 제공한다. 파라믹소바이러스의 F 단백질의 개열부위가 다른 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 개변된 개변 F 단백질을 코드하는, M 유전자 결손형 바이러스 벡터를 제조하였다. 이 벡터는 도입된 세포내에서 벡터에 포함되는 게놈 RNA를 복제하여, 상기 다른 프로테아제의 존재에 의존하여 인접하는 세포에 세포융합형 감염을 확산하지만, 바이러스 입자는 방출하지 않는다. 암에서 활성이 항진하는 프로테아제로 개열되는 F 단백질을 코드하는 본 발명의 벡터는 in vivo에서 암증식 억제작용을 나타낸다.

Description

프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 벡터{Vector with modified protease-dependent tropism}

최근, 암에 대한 유전차치료의 개발이 진전되고 있다. 지금까지 본 발명자 등은 센다이 바이러스(SeV)를 사용하여 유전자치료 벡터의 개발을 행하여 왔다. SeV는 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스의 일종으로, 비분절형(nonsegmented) 네거티브 가닥 RNA(negative strand RNA)를 게놈에 갖는 바이러스의 그룹에 속한다. 파라믹소바이러스 벡터는 외래유전자의 고도입율 및 고발현을 가능하게 하는 벡터로, 암의 유전자치료용 벡터로서도 기대되고 있다. 파라믹소바이러스에 의한 암치료의 시도는 다수 이루어져 있다. 예를 들면, BHK21 세포에 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus)를 감염시키면, 항암 누드 마우스에서 항암효과를 나타내는 것이 보고되었다(Minato, N. et al. (1979) J. Exp. Med. 149, 1117-1133). 또한, 그 밖의 파라믹소바이러스에서도 마찬가지로 항종양효과가 보고되어 있다. 최근, Fusogenic protein의 항암효과가 주목되고 있다. 갈라니스(Galanis) 등은 홍역 바이러스(measles virus)의 F, HN 단백질을 탑재한 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector)가, 감염된 암세포가 신시티움(syncytium)을 형성하여 in vivo에서 항암효과를 보고하고 있다(Galanis, E. et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12, 811-821).

말할 것 까지도 없이, 전이되지 않는 암은 그 부분을 외과적으로 제거하면 되고, 전이되는 것과 악성 암은 동일한 정의로 되어 있다. 그 침윤(浸潤) 전이되는 암은, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 및/또는 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator)(uPA, tPA)를 고발현하는 것이 알려져 있다(Cox, G., and O'Byrne, K. J. (2001) Anticancer Res. 21, 4207-4219; Andreasen, P. A. et al. (2000) Cell Mol. Life. Sci. 57, 25-40). 그 이유로서 암세포가 전이 침윤될 때, 그 주변에 있는 세포외 매트릭스(ECM)가 장벽이 되어 세포가 이동할 수 없기 때문에, 암은 그 ECM을 분해하는 효소(MMP, uPA, tPA)를 발현하여 ECM을 분해함으로써 비로소 침윤, 전이가 가능해지기 때문이라고 생각되고 있다.

한편, 암 유전자치료의 문제점으로서 3가지를 들고 있다. 첫째로, 암세포로의 도입효율이 낮거나, 고형암 심부로의 도입이 불가능하기 때문에, 암 전체로의 도입이 불가능하여 남은 암이 다시 증식을 시작하여 재발하는 것이다. 둘째로, 암으로의 도입과 동시에 정상 세포로도 도입되어, 정상 세포에도 상해를 주어 부작용이 커지고 있는 것이다. 셋째로, 이는 암치료 전체의 문제이기도 한데, 암의 악성화에 동반되는 침윤 전이이다. 이들 문제를 해결하는 벡터는 아직 개발되어 있지 않다.

본 발명은 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 세포융합형 벡터 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 암 특이적으로 감염시키는 유전자치료 벡터로서 유용하다.

발명의 개시

본 발명은 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변되어, 특정 프로테아제 존재하에서만 주위의 세포에 침윤하는 새로운 세포융합형 벡터 및 그의 제조방법을 제공한다.

센다이 바이러스를 포함하는 파라믹소바이러스과 바이러스는 그 엔벨로프(envelope)에 2개의 단백을 가지고 있다. F(fusion) 단백질은 바이러스와 그의 숙주인 세포를 막융합시켜, 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 세포질로 방출시킨다. HN(hemagglutinin-neuraminidase) 단백질은 적혈구 응집능(凝集能)과 뉴라미니다아제(neuraminidase)활성을 가져, 숙주 리셉터로 결합하는 역할을 이룬다. F 단백질 및 HN 단백질은 스파이크(spike) 단백질으로도 불리고, 바이러스의 엔벨로프 표면에 노출되어 있다. 또한 M(matrix) 단백질은 엔벨로프를 배접하여 바이러스 입자에 강고함을 부여하고 있다. 이 벡터의 특징은 광범위한 세포와 동물조직에 고효율로 유전자를 도입 가능하고, 또한 기존의 벡터와 비교하여 높은 발현량을 실현하고 있는 것이다.

F 단백질(F0)은 그 자체로는 세포융합 활성을 나타내지 않고, 숙주 유래의 프로테아제에 의해 개열(開裂)되어, F1과 F2로 분해됨으로써 비로소 그 융합 활성을 나타내게 된다. 따라서, 야생형 F 단백질을 갖는 바이러스의 증식은, 이 단백질을 개열할 수 있는 트립신(trypsin) 유사의 프로테아제를 발현하는 기도점막 상피 등의 조직에 제한되어 버린다. 파라믹소바이러스에서는 F의 개변에 의한 감염의 트로피즘 또는 융합능의 개변에 대한 여러 연구가 이루어져 있다. SeV에서는 α-키모트립신(chymotrypsin)으로만 개열하는 F를 갖는 변이체가 트립신 감수성을 잃어, 그 트로피즘이 F의 개열서열 특이적으로 바뀌는 것이 나타내어져 있다(Tashiro, M. et al. (1992) J. Gen. Virol. 73 (Pt 6), 1575-1579). 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 홍역 바이러스(Measles virus)에서는 F의 개열서열을 개변하여, 그 신시티움 형성능이 트립신 의존적으로 바뀌는 것을 나타내고 있다(Li, Z. et al. (1998) J. Virol. 72, 3789-3795; Maisner, A. et al. (2000) J. Gen. Virol. 81, 441-449).

이와 같이, F의 개열서열을 개변함으로써, 어떤 프로테아제를 발현하는 특정 조직 등에 벡터를 감염 및 증식시키는 것이 가능해지는 것으로 생각된다. 그러나, 파라믹소바이러스 벡터가 갖는 문제점 중 하나에, 표적세포로의 벡터 도입 후에 일어나는 세포로부터의 바이러스의 2차 방출이 있다. 복제형 바이러스를 감염시킨 세포에서는 비리온(virion)이 형성되어 딸바이러스(daughter virus)가 방출되기 때문에, 표적세포 이외에도 바이러스 입자가 확산된다. 상술한 바와 같이 야생형 F 단백질을 갖는 바이러스 입자는 트립신 유사 효소의 비존재하에서는 감염성을 나타내지 않지만, 바이러스 입자 자신은 세포로부터 방출된다. 생체내 투여에 있어서는, 혈중에 확산된 바이러스가 전신에 도달되는 것도 우려된다. 더욱이, 복제능을 갖지 않는 F 유전자 결손 SeV(Li, H. O. et al. (2000) J. Virol. 74, 6564-6569; WO00/70055; WOOO/70070)를 도입한 세포 등으로부터도 바이러스 유사 입자(VLP: virus like particle)의 방출이 관찰되고 있다. 이러한 2차 방출 입자는 표적으로하는 조직 이외로의 감염이나 면역반응을 유발하는 것이 우려된다.

본 발명자 등은 바이러스 엔벨로프 유전자 중에서, M 유전자를 결손하는 파라믹소바이러스는 입자 형성이 일어나지 않지만, 감염세포와 그것에 접한 세포가 융합함으로써 신시티움을 형성하여, 세포융합형 감염을 하는 것을 발견하고 있다(WO00/09700). 이들 M 결손형 바이러스는 도입세포에 있어서 복제되어, 트립신 존재하에서 인접하는 세포에 전달된다. 그러나, 이 현상은 F가 개열되어 활성화하는 조건에 있어서만 일어나는 현상으로, 야생형 F 단백질을 갖는 바이러스에서는 트립신 유사의 프로테아제가 없는 상태에서는 바이러스의 전달은 일어나지 않는다. 본 발명자 등은 이 M 결손형 바이러스에 있어서 F 단백질의 트로피즘을 개변하면, 2차 방출 입자를 생산하지 않고 특정 조직에서만 감염을 확산시킬 수 있는 신규한 벡터를 개발할 수 있는 것은 아닌가 생각하였다. 특히 침윤 전이암에 있어서는 ECM을 분해하는 MMP, uPA, tPA 등의 프로테아제 활성이 항진(亢進)하고 있는 것이 많이 알려져 있다. 따라서 본 발명자 등은 이 M 결실형 SeV의 프로테아제 의존적 세포융합형 감염과 암에 있어서의 MMP, uPA, tPA 고발현의 현상을 조합해서 이용하여, 침윤 전이암 특이적으로 감염시켜 확산되어 가는 SeV 벡터를 제작하였다.

M 결손형 바이러스는 입자 형성에 필요한 M 유전자를 결손하고 있기 때문에, 통상 바이러스 입자는 방출하지 않거나 극도로 억제되고 있다. 복제능을 갖는 재조합 바이러스의 생산에 사용하는 통상의 재구성법(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579)을 사용한 경우, M 결손형 바이러스의 RNP를 조제할 수는 있지만, 감염성 바이러스 입자는 제조할 수 없다(WO00/09700). 실제의 암 치료약으로서M 결실형 벡터를 이용하기 위해서는, M 결실형 바이러스를 감염성 바이러스 입자로서 조제할 수 있으면 매우 유용하다. 따라서 본 발명자 등은 M 결실형 바이러스를 바이러스 입자로서 조제하기 위한 새로운 제조방법의 개발을 행하였다.

본 발명자 등은 먼저, VLP 방출이 억제된 벡터를 구축하기 위한 하나의 해결법으로서, 바이러스 유전자의 온도감수성 변이의 이용을 생각하였다. 저온에서 생육되지만 고온에서는 증식할 수 없는 몇개의 변이형 바이러스가 보고되어 있다. 본 발명자 등은 특히 고온에서의 비리온 형성이 억제되는 변이 단백질, 특히 M 단백에 변이를 갖는 것을 이용하면, 저온에서(예를 들면 32℃) 바이러스 생산을 행하고, 유전자치료 등의 실제 응용시에는 그것 보다는 고온(예를 들면 37℃)에서 행함으로써, VLP 형성을 억제할 수 있을 가능성이 있다고 생각하였다. 이 목적을 위해, 본 발명자 등은 M 단백질 및 HN 단백질에서 보고되어 있는, 각각 3개, 합계 6개의 온도감수성 변이를 갖는 변이 M 및 HN 단백질을 코드하는 F 유전자 결손형 재조합 센다이 바이러스 벡터를 구축하였다. 이 바이러스의 VLP 방출을 조사한 바, 야생형 바이러스에 비해 약 1/10 또는 그 이하인 것이 판명되었다. 더욱이, VLP 방출이 억제된 센다이 바이러스 벡터를 도입한 세포에 있어서의 M 단백질의 국재를 항M 항체를 이용한 면역염색에 의해 해석한 결과, 야생형 바이러스를 도입한 세포에서는 보이는 세포 표면의 M 단백질의 응집이, VLP 방출 억제형 바이러스의 경우는 유의(有意)하게 감소되어 있고, 특히 고온(38℃)에 있어서 M 단백의 농축상(濃縮像)이 극단적으로 감소되어 있었다. 온도감수성 변이 M 유전자를 포함하는 이 SeV를 감염시킨 세포에 있어서의 M 단백질 및 HN 단백질의 세포내 국재를 공초점(共焦点) 레이저 현미경에 의해 상세하게 조사한 바, 저온(32℃)에 있어서도 세포 표면에서의 M 단백의 국재는 유의하게 저하되어 있어, 미소관(microtubule)의 형태에 가까운 형태로 관찰되었다. 더욱이, 고온(37℃)에서는 M 단백은 미소관의 중심체 부근(즉 골지체 부근)에 국재하여 존재하고 있었다. 미소관 탈중합제를 첨가하면, 온도감수성 M 유전자를 갖는 SeV 뿐 아니라, 야생형 M 유전자를 갖는 SeV에 있어서도 M 단백질의 국재 구조가 파괴된 것으로부터, M 단백질은 실제로 미소관을 따라 국재하여 기능하고 있을 가능성이 높다고 판단되었다. 이상의 사실로부터, 온도감수성 변이 도입 바이러스에서 2차 방출 입자가 감소하고 있는 것은, 입자 형성의 중심적인 역할을 담당하고 있는 것으로 생각되고 있는 M 단백의 세포내 국재의 부전(不全)이라고 단정되었다. 따라서, M 단백질의 정상 세포내 국재를 방해함으로써, VLP의 형성을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, M 단백질의 기능에는 미소관과의 상호작용이 중요하여, 예를 들면 M 단백질이 골지체로부터 미소관을 따라 세포내 이동하는 것을 저해하는 유전자 변이나 약제를 개발함으로써, M 단백의 세포내 국재의 불구합(disruption)을 발생시켜, 결과적으로 2차 방출 입자의 감소를 달성하는 것이 가능할 것으로 판단된다. 즉 본 발명자 등은, M 단백질의 국재에 결함을 생기게 하는 변이를 갖는 바이러스 벡터를 조제함으로써, 입자 형성능이 저하 또는 소실된 재조합 바이러스 벡터를 얻을 수 있는 것을 발견하였다.

또 본 발명자 등은, M 유전자를 바이러스로부터 결실시킴으로써, 바이러스를 도입한 세포에 있어서의 M 단백질의 세포 표면의 응집이 완전히 결여된 바이러스의 구축을 시도하였다. 이 목적을 위해, 본 발명자 등은 M 유전자 결실형 바이러스의생산에 이용 가능한 야생형 M 단백질을 유도적으로 발현시킬 수 있는 헬퍼 세포를 구축하였다. 이 세포를 이용함으로써, 야생형 M 단백질을 포함하는 엔벨로프에 F 개변형 M 유전자 결손 바이러스의 RNP가 싸인 바이러스 입자를 회수하는 것에 처음으로 성공하였다. 본 발명의 방법에 의해 1×10⁸PFU/ml 이상의 농도로 바이러스 입자를 제조하는 것이 가능해져, 임상을 포함하는 실용에 견디는 재조합 바이러스를 처음으로 제공하는 것이 가능해졌다. 또 본 발명의 바이러스 제조계는 다른 바이러스의 혼입(混入)을 부정할 수 있는 안전성이 높은 고역가(high-titer)의 유전자 치료용 벡터의 생산을 가능하게 한다. M 발현 세포를 이용하여 M 단백질을 트랜스에(in trans) 공급하는, 본 발명의 M 결실형 SeV 생산 시스템에 있어서 처음으로, 실용에 적합한 F 개변형 M 결실형 파라믹소바이러스가 제공되었다.

본 발명자 등은 상기와 같이 구축한 감염성 바이러스 입자를 사용하여, 실제의 항종양효과를 in vivo에 있어서 검증하였다. 암세포를 이식한 마우스에 대해, 이 암에서 활성이 항진하는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)로 활성화되는 M 결실형 바이러스를 투여한 바, 세포융합형 감염을 통해 암조직 내에 바이러스가 확산되는 것이 확인되었다. 야생형 바이러스를 투여한 암에서는, 수일 후에도 바이러스는 주입 부위에 한정되어 있었던 것에 대해, 본 발명의 벡터에서는 암조직에 대해 강한 침투력을 나타내, 암 전체에 벡터의 확산이 인지되었다. 바이러스 미투여 또는 야생형 바이러스를 투여한 대조에 비해, 암의 증식에 대한 억제효과는 명백하였다. 지금까지도 레트로바이러스(retrovirus)에 있어서 MMP 발현세포를 표적으로 하는벡터가 제작되고 있지만(Peng, K.-W. et al., 1997, Human Gene Therapy 8: 729-738; Peng, K.-W. et al., 1999, Gene Therapy 6: 1552-1557; Martin, F. et al., 1999, J. Virol. 73: 6923-6929), 본 발명과는 인식서열의 디자인이 전혀 상이하다. 또한, 이들 보고는 암조직으로의 특이적인 감염, 즉 타겟팅만을 목적으로 한 것으로, 암조직에서 특이적으로(세포 사이에서) 감염이 확산되어 치료 효과를 발휘하는 벡터는 본 발명에 있어서 처음으로 제공되었다.

더욱이 본 발명자 등은 바이러스 입자 생산시에 프로테아제의 첨가를 제어함으로써, 바이러스 표면의 F 단백질이 개열되어 있지 않은 바이러스 입자(F 비개열형 바이러스)를 조제하는 것에 성공하였다. 이 바이러스는 그 자체로는 감염성을 갖지 않지만, 바이러스 표면의 F 단백질을 개열하는 프로테아제로 처리하거나, 또는 상기 프로테아제 존재 조건하에서 세포에 첨가함으로써 특이적으로 감염능을 나타낼 수 있었다. 이러한 잠재(潛在) 감염형 바이러스 벡터에 의해, 특정 프로테아제를 생산하는 암세포에 특이적으로 벡터를 감염시키는 것이 가능해졌다.

또 본 발명자 등은, 개변 F 유전자를 갖는 벡터를 야생형 F 단백질을 사용해서 제작함으로써, 벡터 제작시에 야생형 F 단백질을 개열하는 프로테아제를 사용하여 바이러스 입자를 제조하는 방법을 개발하였다. 이 방법에 의하면, 야생형 F 단백질을 발현하는 헬퍼 세포를 사용하여, 트립신 등의 야생형 F 단백질을 개열하는 효소에 의해 바이러스 증폭을 행할 수 있다. 얻어진 바이러스 입자는 개열된 야생형 F 단백질을 엔벨로프에 포함하여 감염성을 갖지만, 바이러스 게놈은 F 단백질의 개열부위(cleavage site)가 개변된 개변 F 유전자를 코드하기 때문에, 특정 프로테아제의 존재하에서 밖에 감염을 확산할 수 없다. 야생형 F 단백질을 사용해서 바이러스를 조제하는 방법은, 벡터 게놈에 삽입하는 개변 F 유전자에 의존하지 않고 바이러스 입자를 제조하는 것이 가능하기 때문에 유리하다.

이와 같이 본 발명은, 암 등의 특정 조직에서 발현하는 프로테아제 존재하에서만 감염을 확산하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 바이러스 유사 입자를 유의하게 생산하지 않고, 세포융합에 의해 인접하는 주위의 세포에 벡터를 전달한다. 특히 암에서 활성이 항진하는 프로테아제로 감염성을 획득하는 본 발명의 벡터는, 종양 증식에 대한 강한 억제작용을 가지고 있어, 이 벡터를 사용한 암의 유전자치료는 매우 유효하다고 생각된다.

즉 본 발명은 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 세포융합형 벡터 및 그의 제조방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는

[1] 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이, 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 포함하는 복합체로, 이하의 성질을 갖는 복합체,

(1) 상기 복합체가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고,

(2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며,

(3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 복합체가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 RNA를 도입하는 능력을 갖는다.

[2] [1]에 있어서, 바이러스 입자인 복합체,

[3] [2]에 있어서, 야생형 F 단백질을 추가로 포함하는 복합체,

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 복합체,

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로테아제가 암에서 활성이 항진하는 프로테아제인 복합체,

[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로테아제가 매트릭스 메탈로프로테아제 또는 플라스미노겐 활성제인 복합체,

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로테아제에 의해 개열되는 서열이 Pro-Leu-Gly, Pro-Gln-Gly, 또는 Val-Gly-Arg를 포함하는 복합체,

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 개변 F 단백질에 있어서, 야생형 F 단백질이 갖는 세포질 도메인의 일부가 결실되어 있는 복합체,

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 개변 F 단백질이 HN 단백질과 융합하고 있는 복합체,

[10] 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자로서, (1) 상기 바이러스 입자가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고, (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며, (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 게놈 RNA를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자의 제조방법으로서,

(i) 파라믹소바이러스의 야생형 M 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정,

(ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법,

[11] 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) 조건적 변이를 갖는 M 단백질을 코드하고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자로서, (1) 상기 바이러스 입자가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고, (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며, (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 게놈 RNA를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자의 제조방법으로서,

(i) 상기 M 변이 단백질의 허용 조건하, 세포내에서 상기 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정,

(ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법,

[12] [10] 또는 [11]에 있어서, 공정 (i)를 35℃ 이하에서 행하는 방법,

[13] [10] 또는 [11]에 있어서, 공정 (i)~(ii) 중 적어도 어느 하나의 시기에 있어서 상기 개변 F 단백질을 개열시키는 프로테아제를 존재시키거나, 또는 공정 (ii)에 있어서 회수된 바이러스 입자를 상기 프로테아제로 처리하는 공정을 포함하는 제조방법,

[14] [10] 또는 [11]에 있어서, 공정 (i)에 있어서 상기 세포내에서 파라믹소바이러스의 야생형 F 단백질을 발현시키고, 공정 (i)~(ii) 중 적어도 어느 하나의 시기에 상기 야생형 F 단백질을 개열하는 프로테아제를 존재시키거나, 또는 공정 (ii)에 있어서 회수된 바이러스 입자를 상기 프로테아제로 처리하는 공정을 포함하는 제조방법,

[15] [5]의 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료조성물,

[16] 파라믹소바이러스 F 단백질의 개변 단백질로서, 개열부위에 Pro-Leu-Gly, Pro-Gln-Gly, 또는 Val-Gly-Arg를 포함하고, 매트릭스 메탈로프로테아제 또는 플라스미노겐 활성제의 존재하에서 세포융합능을 나타내는 재조합 단백질,

[17] [16]의 단백질을 코드하는 핵산,

[18] [16]의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자,

[19] 파라믹소바이러스 F 단백질 및 HN 단백질의 막관통영역을 가지고, 세포질측에 있어서 서로의 단백질이 결합하고 있는 융합단백질로서, 세포융합 활성을 갖는 단백질,

[20] [19]의 융합단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질,

[21] [19]의 단백질을 코드하는 핵산,

[22] [21]의 핵산을 포함하는 벡터,

[23] [19]의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스란 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체를 가리킨다. 파라믹소바이러스는 비분절형 네거티브 가닥 RNA를 게놈에 갖는 바이러스 그룹의 하나로, 파라믹소바이러스 아과(Paramyxovirinae)(파라믹소바이러스속(레스피로바이러스속(Respirovirus)이라고도 한다), 루블라바이러스속(Rubulavirus) 및 모빌리바이러스속(Morbillivirus)을 포함한다) 및 뉴모바이러스 아과(Pneumovirinae)(뉴모바이러스속 및 메타뉴모바이러스속(Metapneumovirus)을 포함한다)를 포함한다. 본 발명을 적용 가능한 파라믹소바이러스로서는 구체적으로는 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytical virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 Sendai virus(SeV), human parainfluenza virus-1(HPIV-1), human parainfluenza virus-3(HPIV-3), phocine distemper virus(PDV), caninedistemper virus(CDV), dolphin molbillivirus(DMV), peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), measles virus(MV), rinderpest virus(RPV), Hendra virus(Hendra), Nipah virus(Nipah), human parainfluenza virus-2(HPIV-2), simian parainfluenza virus 5(SV5), human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a), human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b), mumps virus(Mumps) 및 Newcastle disease virus(NDV) 등이 포함된다. 보다 바람직하게는, Sendai virus(SeV), human parainfluenza virus-1(HPIV-1), human parainfluenza virus-3(HPIV-3), phocine distemper virus(PDV), canine distemper virus(CDV), dolphin molbillivirus(DMV), peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), measles virus(MV), rinderpest virus(RPV), Hendra virus(Hendra) 및 Nipah virus(Nipah)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스를 예시할 수 있다. 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 파라믹소바이러스 아과(레스피로바이러스속, 루블라바이러스속 및 모빌리바이러스속을 포함한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이고, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스속(Respirovirus)(파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 본 발명을 적용 가능한 레스피로바이러스속 바이러스로서는 예를 들면 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형으로도 불리운다) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 본 발명에 있어서 파라믹소바이러스는 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 이들 바이러스는 천연주,야생주, 변이주, 라보계대주(laboratory-passaged strain) 및 인위적으로 구축된 주(strain) 등에 유래해도 된다.

재조합 단백질 및 재조합 바이러스란 각각 재조합 폴리뉴클레오티드를 매개로 하여 생성한 단백질 및 바이러스를 말한다. 재조합 폴리뉴클레오티드란 자연의 상태와 동일하게는 결합하고 있지 않은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 구체적으로는, 재조합 폴리뉴클레오티드는 사람의 손에 의해 폴리뉴클레오티드 가닥이 바뀌어서 연결되거나 또는 합성된 폴리뉴클레오티드 등이 포함된다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 합성, 뉴클레아제 처리, 리가아제 처리 등을 조합하여, 공지의 유전자 재조합방법에 의해 생성시킬 수 있다. 재조합 단백질은 단백질을 코드하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 재조합 바이러스는 유전자 조작에 의해 구축된 바이러스 게놈을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜, 바이러스를 구축함으로써 생성할 수 있다.

본 발명에 있어서 유전자란 유전물질을 가리키고, RNA 및 DNA 등의 핵산이 포함된다. 본 발명에 있어서 단백질을 코드하는 핵산은 상기 단백질의 유전자라 부른다. 또한 유전자는 단백질을 코드하고 있지 않아도 되고, 예를 들면 유전자는 리보자임(ribozyme) 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이어도 된다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란 단일 가닥 DNA(single-strand DNA) 및 이중 가닥 DNA(double-strand DNA)를 포함한다. 또 단백질을 코드한다는 것은 폴리뉴클레오티드가 상기 단백질을 적당한 조건하에서 발현할 수 있도록, 상기 단백질의 아미노산서열을 코드하는 ORF를 센스 또는 안티센스로 포함하는 것을 말한다.

본 발명은 프로테아제 의존성 트로피즘이 개변된 복제능을 갖는 세포융합형 벡터를 제공한다. 이 벡터는 숙주내 환경에 있어서 세포로의 도입 후에 바이러스 유사 입자를 유의하게 방출하지 않고, 특정 프로테아제 존재하에서만 주위의 세포에 침윤하는 벡터이다. 본 발명의 벡터는 구체적으로는 이하의 복합체를 말한다.

파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이, 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 포함하는 복합체로, 이하의 성질을 갖는 복합체.

(1) 상기 복합체가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖는다.

(2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있다.

(3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 복합체가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 RNA를 도입하는 능력을 갖는다. 이 복합체는 게놈 RNA를 복제하여, 그것을 인접 세포에 도입하는 작용을 갖기 때문에, 본 발명에 있어서 벡터라고도 부른다. 벡터란 핵산을 세포에 도입하는 담체를 말한다.

상기 복합체는 구체적으로는 상기 파라믹소바이러스의 게놈 RNA와 이것에 결합하는 바이러스 단백질을 포함하는 복합체이다. 본 발명의 복합체는, 예를 들면 파라믹소바이러스의 게놈 RNA와 바이러스 단백질로 되는 복합체, 즉 리보핵산단백질(ribonucleoprotein:RNP)이어도 된다. RNP는 예를 들면 목적으로 하는 트랜스펙션(transfection)시약과 조합하여 세포에 도입할 수 있다. 이러한 RNP는 구체적으로는 파라믹소바이러스의 게놈 RNA, N 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 포함하는 복합체이다. RNP는 세포내에 도입되면 바이러스 단백질의 작용에 의해 게놈 RNA로부터 바이러스 단백질을 코드하는 시스트론(cistron)이 전사되는 동시에, 게놈 자신이 복제되어 딸 RNP가 형성된다. 게놈 RNA의 복제는 상기 RNA의 카피수의 증가를 RT-PCR 또는 노던 잡종화(northern hybridization)등에 의해 검출함으로써 확인할 수 있다.

또 상기 복합체는, 보다 바람직하게는 파라믹소바이러스의 바이러스 입자이다. 바이러스 입자란 바이러스 단백질의 작용에 의해 세포로부터 방출되는, 핵산을 포함하는 미소입자를 말한다. 바이러스 입자의 형상은 바이러스의 종류에 따라 구형상, 곤봉형상 등 여러 가지여도 되지만, 세포 보다 충분히 작아 그 크기는 통상 10 nm~800 nm 정도이다. 파라믹소바이러스의 바이러스 입자는 게놈 RNA와 바이러스 단백질을 포함하는 상기 RNP가 세포막 유래의 지질막(엔벨로프라고 한다)에 포함된 구조를 하고 있다. 바이러스 입자는 감염성을 나타내는 것이어도 나타내지 않는 것이어도 된다(후술). 예를 들면, 그 자체로는 감염성을 나타내지 않지만, 특정 처리에 의해 감염성을 획득하는 잠재적으로 감염성을 갖는 바이러스 입자여도 된다.

또한 파라믹소바이러스의 게놈 RNA란 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질과 함께 RNP를 형성하고, 상기 단백질에 의해 게놈 중의 유전자가 발현되어, 상기 핵산이 복제하여 딸 RNP가 형성되는 기능을 갖는 RNA를 말한다. 파라믹소바이러스는단일 가닥 네거티브 가닥 RNA를 게놈에 갖는 바이러스이기 때문에, 이러한 RNA는 탑재 유전자를 안티센스로서 코드하고 있다. 일반적으로 파라믹소바이러스의 게놈은 3'리더영역(3' leader-region)과 5'트레일러영역(5' trailer-region) 사이에, 바이러스 유전자가 안티센스로서 나란히 있는 구성을 하고 있다. 각 유전자의 ORF 사이에는 전사종결서열(E서열)-개재서열(I서열)-전사개시서열(S서열)이 존재하고, 이것에 의해 각 유전자의 ORF를 코드하는 RNA가 각각의 시스트론으로서 전사된다. 본 발명의 벡터에 포함되는 게놈 RNA는 상기 RNA에 코드되는 유전자군의 발현 및 RNA 자신의 자율적인 복제에 필요한 바이러스 단백질인 N(nucleocapsid:뉴클레오캡시드), P(phosphor:포스포) 및 L(large:라지)을 안티센스로 코드하고 있다. 또한 상기 RNA는 인접 세포로의 상기 RNA의 전파에 필요한 세포막융합을 일으키는 단백질인 F(fusion:융합) 단백질을 안티센스로 코드하고 있다. 바람직하게는, 게놈 RNA는 추가로 HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제)(또는 H) 단백질을 안티센스로 코드하고 있다. 단, 어떤 종류의 세포에서는 감염에 HN 단백질은 필요 없어(Markwell, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(4):978-982(1985)), F 단백질만으로 감염이 성립된다. 또한, 세포에 결합할 수 있는 HN 이외의 단백질을 F 단백질과 조합하여 벡터를 감염시킬 수 있다. 따라서, HN 유전자를 코드하지 않는 게놈 RNA를 사용해도, 본 발명의 벡터를 구축하는 것은 가능하다.

예를 들면 파라믹소바이러스 아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, N 유전자는 "NP"로 표기되는 경우도 있다.

레스피로바이러스속(Genus Respirovirus) NP P/C/V M F HN - L

루블라바이러스속(Genus Rublavirus) NP P/V M F HN (SH) L

모르빌리바이러스(Genus Morbillivirus) NP P/C/V M F H - L

예를 들면, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 레스피로바이러스 (Respirovirus)로 분류되는 센다이 바이러스 각 유전자의 염기서열 데이터베이스의 액세션번호는 NP 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것. 또 그 밖의 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하면, N 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 Tupaia, AF079780, P 유전자에 대해서는 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 Tupaia, AF079780, C 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV,Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 Tupaia, AF079780, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV, Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303; HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2, D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876을 예시할 수 있다. 단, 각 바이러스는 복수의 주가 알려져 있어, 주의 차이에 의해 상기에 예시한 것 이외의 서열로 되는 유전자도 존재한다.

이들 바이러스 단백질의 ORF는 게놈 RNA에 있어서 상기의 E-I-S 서열을 매개로 하여 안티센스로 배치된다. 게놈 RNA에 있어서 가장 3'에 가까운 ORF는, 3'리더영역과 상기 ORF 사이에 S 서열만이 필요하고, E 및 I 서열은 필요 없다. 또한 게놈 RNA에 있어서 가장 5'에 가까운 ORF는, 5'트레일러영역과 상기 ORF 사이에 E 서열만이 필요하고, I 및 S 서열은 필요 없다. 또한 2개의 ORF는, 예를 들면 IRES 등의 서열을 사용하여 동일 시스트론으로서 전사시키는 것도 가능하다. 이러한 경우는, 이들 2개의 ORF 사이에는 E-I-S 서열은 필요 없다. 야생형 파라믹소바이러스의 경우, 전형적인 RNA 게놈은 3'리더영역에 이어 N, P, M, F, HN 및 L 단백질을 안티센스로 코드하는 6개의 ORF가 순서대로 나란히 있고, 그것에 이어 5'트레일러영역을 다른쪽 끝에 갖는다. 본 발명의 게놈 RNA에 있어서는, 바이러스 유전자의 배치는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 야생형 바이러스와 마찬가지로, 3'리더영역에 이어 N, P, (M,) F, HN 및 L 단백질을 코드하는 ORF가 순서대로 나란히 있고, 그것에 이어 5'트레일러영역이 배치되는 것이 바람직하다. 어떤 종류의 파라믹소바이러스에 있어서는, 바이러스 유전자는 6개가 아니지만, 그러한 경우에도 상기와 마찬가지로 각 바이러스 유전자를 야생형과 동일한 배치로 하거나, 또는 적절히 변경할 수 있다. M 단백질의 ORF에 대해서는 후술하는데, 본 발명의 벡터 중 하나의 태양에 있어서는, 이 ORF는 존재하지 않거나, 또는 변이 M 단백질을 코드하고 있다. 또 본 발명의 벡터 중 하나의 태양에 있어서는, 게놈에 코드되는 F 단백질의 개열부위는 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 개변되어 있다(후술). 본 발명의 게놈 RNA는 1개 또는 그 이상의 외래유전자를 코드할 수 있다. 외래유전자로서는 표적으로 하는 세포에 있어서 발현시키고자 하는 목적으로 하는 유전자를 사용할 수 있다. 외래유전자의 도입 위치는 예를 들면 게놈의 단백질 비코드영역의 목적으로 하는 부위에 삽입할 수 있고, 예를 들면 3'리더영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF 사이, 각 바이러스 단백질 ORF 사이 및/또는 5'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5'트레일러영역 사이에 삽입할 수 있다. M 유전자를 결실하는 게놈에서는 그 결실영역에 삽입할 수있다. 파라믹소바이러스에 외래유전자를 도입하는 경우는, 게놈으로의 삽입 단편의 폴리뉴클레오티드의 가닥 길이가 6의 배수가 되도록 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol.67, No.8, 4822-4830, 1993). 삽입한 외래유전자와 바이러스 ORF 사이에는, E-I-S 서열이 구성되도록 한다. 또는, IRES를 매개로 하여 외래유전자를 삽입해도 된다.

외래유전자의 발현 레벨은 그 유전자의 상류(네거티브 가닥의 3'측)에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한, 게놈 상의 외래유전자의 삽입위치에 따라 제어할 수 있어, 네거티브 가닥의 3' 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 높고, 5' 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 낮아진다. 이와 같이, 외래유전자의 삽입위치는 상기 유전자의 목적으로 하는 발현량을 얻기 위해, 또 전후의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자와의 조합이 최적이 되도록 적절히 조절할 수 있다. 일반적으로, 외래유전자는 높은 발현을 얻을 수 있는 것이 유리하다고 생각되기 때문에, 외래유전자는 효율이 높은 전사개시서열에 연결하여, 네거티브 가닥 게놈의 3'말단 가까이에 삽입하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 3'리더영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF 사이에 삽입된다. 또는, 3'에 가장 가까운 바이러스 유전자와 2번째 유전자의 ORF 사이에 삽입해도 된다. 반대로, 도입유전자의 고발현이 바람직하지 않은 경우는, 예를 들면 벡터에 있어서의 삽입유전자의 삽입위치를 네거티브 가닥 게놈의 가능한 한 5'측에 설정하거나, 전사개시서열을 효율이 낮은 것으로 하는 등으로 하여, 바이러스 벡터로부터의 발현 레벨을 낮게 억제함으로써 적절한 치료효과를 얻을 수 있도록 하는 것도 가능하다.

또 본 발명의 벡터는 예를 들면 바이러스 단백질에 의한 면역원성을 저하시키기 위해, 또는 RNA의 전사효율이나 복제효율을 높이기 위해 벡터에 포함되는 임의의 바이러스 유전자가 야생형 유전자로부터 개변되어 있어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면 파라믹소바이러스 벡터에 있어서는, 복제인자인 N, P 및 L 유전자 중 적어도 하나를 개변하여, 전사 또는 복제 기능을 높이는 것을 생각할 수 있다. 또, 구조체 단백질의 하나인 HN 단백질은 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutin)활성과 뉴라미니다제(neuraminidase)활성의 양자 활성을 갖지만, 예를 들면 전자의 활성을 약화시킬 수 있으면, 혈액 중에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이고, 예를 들면 후자의 활성을 개변함으로써 감염능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, F 단백질도 개열부위 이외의 도메인도 개변함으로써, 막융합능 및/또는 입자 형성능을 조절하는 것도 가능하다. 또, 예를 들면 세포 표면의 항원분자가 될 수 있는 F 단백질이나 HN 단백질의 항원제시 에피토프(epitope) 등을 해석하고, 이것을 이용하여 이들 단백질에 관한 항원제시능을 약화시킨 바이러스 벡터를 제작하는 것도 가능하다.

또 본 발명의 벡터에 있어서는 액세서리(accessory) 유전자가 결손된 것이어도 된다. 예를 들면 SeV의 액세서리 유전자 중 하나인 V 유전자를 녹 아웃(knocking-out)함으로써, 배양세포에 있어서의 유전자 발현이나 복제는 장해(障害)되지 않고, 마우스 등의 숙주에 대한 SeV의 병원성이 현저히 감소한다(Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179). 이러한 약독화 벡터(attenuatedvector)는 in vivo 또는 ex vivo에 있어서의 독성이 없는 유전자 도입용 바이러스 벡터로서 유용하다.

또 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 복합체는 실질적으로 균일한 복합체이다. 실질적으로 균일한 복합체란, 상기 복합체가 본 발명의 복합체가 아닌 파라믹소바이러스의 RNP 또는 바이러스 입자로부터 분리되어 있는 것을 말한다. 즉, 실질적으로 균일한 본 발명의 복합체는, 입자 형성능을 갖는 다른 파라믹소바이러스 RNP도 상기 바이러스의 바이러스 입자도 포함하고 있지 않다. 여기에서 입자 형성능이란 바이러스 벡터를 감염시킨 세포에 있어서, 감염성 바이러스 입자 및/또는 비감염성 바이러스 입자(이것을 바이러스 유사 입자라고 한다)를 방출(이것을 2차 방출이라고 한다)하는 벡터의 능력을 말한다. 또한, F 단백질의 개열부위가 개변된 본 발명의 복합체에 있어서는, 야생형 F 단백질 또는 이것과 동등한 융합 활성을 갖는 F 단백질을 코드하는 유전자를 게놈에 포함하는 바이러스 RNP도 상기 게놈을 포함하는 바이러스 입자도 포함하고 있지 않다.

본 발명의 한 태양에 있어서는, 상기 게놈 RNA에 코드되는 F 단백질은 상기 단백질의 개열부위의 서열이, 다른 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환되어 있다. 파라믹소바이러스의 F 단백질(F0)은, 그 자체로는 세포막융합 활성을 나타내지 않지만, F0 단편의 세포외 도메인(또는 바이러스 입자외 도메인)이 개열됨으로써 그 융합 활성을 나타내게 된다. 개열에 의해 생긴 2개의 F 단백질 단편은 N 말단측이 F2 및 C 말단측이 F1으로 불리고, 양자는 디설피드 결합에 의해 결합하고 있다. F 단백질을 개열한다는 것은, 이와 같이 막 상의 F 단백질을 막의 바깥쪽 도메인에 있어서 절단하여, 세포융합능을 획득시키는 단편을 생기게 하는 것을 말한다. 개열부위의 서열이란 프로테아제에 의한 개열을 위해 필요한 아미노산서열 또는 그 중의 본질적인 잔기를 말한다. 파라믹소바이러스의 F 단백질의 개열부위는 알려져 있어, 그들은 세포내의 furin 등의 트립신 유사 프로테아제에 의해 절단된다.

furin은 대부분의 세포의 골지체에 보편적으로 존재한다. furin의 인식 모티브는 Arg-X-Lys/Arg-Arg(RXK/RR)("/"로 구분된 2개의 아미노산은 어느쪽인지를 나타낸다)이다. 병원성이 높은 Human PIV3(RTKR), SV5(RRRR), Mumps virus(RHKR), NDV(virulent strain) 강독주(强毒株)(RQR/KR), Measles virus(RHKR), RS virus(RKRR) 등은 개열부위에 이들 모티브의 서열을 가지고 있다. 강독주인 F는 모든 세포에 존재하는 프로테아제에 감수성을 가져, 어떤 장기에서도 F의 개열을 동반하여 다단계 증식하기 때문에, 감염이 치명적으로 되어 버린다. 한편, 병원성이 낮은 Sendai virus(PQSR), Human PIV1(PQSR), NDV(avirulent strain) 강독주(K/RQG/SR)에서는 이 모티브에 적합하지 않아, 세린 프로테아제 인식서열인 Arg만 가지고 있다. 파라믹소바이러스의 F 단백질 개열부위의 서열은 잘 해석되어 있어, 당업자라면 적절히 문헌을 참조하여 알 수 있다(예를 들면 바이러스학, 하타나카 마사카즈 편집, 도쿄, 아사쿠라서점, 1997, pp. 247-248을 참조).

또 개열부위는 해당 파라믹소바이러스가 증식 가능한 세포, 조직, 또는 개체 등에서 증식시킨 바이러스의 F 단백질, 또는 상기 세포 또는 개체 등에서 F 단백질을 발현시켜 회수한 F 단백질의 개열부위를 동정(同定)함으로써 확인할 수 있다.또한, 세포 표면에 발현하는 F 단백질을 이 단백질의 개열부위를 개열하는 트립신 등의 프로테아제로 처리함으로써, 인위적으로 F 단백질을 개열시켜 동정하는 것도 가능하다. 본 발명의 한 태양에 있어서 F 단백질은, F 단백질 개열부위의 아미노산서열이 개변되어, 다른 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 되어 있다. 이를 위해서는, F 단백질의 생래(生來)의 개열서열을 1 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 개변하여, 다른 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 재구축한다. 아미노산서열의 개변은 공지의 부위 특이적 변이 도입법에 의해 행할 수 있다. 또한, 개변 F 단백질은 야생형 F 단백질을 개열하는 프로테아제(트립신 등)에 의해 개열되는 성질이 유지되어 있어도 된다(실시예 참조). 이러한 개변 F 단백질을 코드하는 벡터는 프로테아제 의존성 트로피즘이 야생형 F 단백질에 비해 확대된다.

다른 프로테아제에 의해 개열되는 서열로서는, 목적으로 하는 프로테아제에 의해 개열되는 서열이어도 되고, 예를 들면 벡터 도입의 표적으로 하고자 하는 목적으로 하는 조직 또는 세포에서 발현되는 프로테아제에 의해 개열되는 서열을 사용할 수 있다(WO01/20989). 이와 같이 표적 조직에서 활성이 있는 프로테아제로 개열되는 서열을 갖는 F 단백질 유전자를 사용하여 벡터를 설계함으로써, 이 프로테아제 활성이 존재하는 환경하에서 특이적으로 주위의 세포에 벡터를 증폭하여 전달한다고 하는 우수한 성질을 실현시킬 수 있다. 예를 들면, 어떤 조직에서 특이적으로 발현 또는 활성화되는 프로테아제의 절단서열을 이용하면, 상기 조직 내에서만 특이적으로 침윤하는 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 어떤 상태, 예를 들면 어떤 질환에서 특이적으로 발현 또는 활성화하는 프로테아제의 절단서열을 이용하면, 그 상태에서만(예를 들면 특정 질환영역 내에서만) 특이적으로 침윤하는 벡터를 구축할 수 있다. 프로테아제는 세포내 또는 세포외에 존재하는 것이어도 되고, 예를 들면 세포외로 분비되는 프로테아제나, 막 표면에 발현하는 막형 프로테아제 등이 적합하다. 또한, F 단백질이 세포내에 있어서 번역되어, 세포 표면으로 분비될 때까지의 수송경로 상에 존재하는 목적으로 하는 프로테아제여도 된다.

프로테아제 유전자의 발현 이상에 의해 생기는 질환의 수는 방대하여, 대사성(代謝性) 질환, 순환장애, 염증·면역질환, 감염증, 악성 종양 등, 병리학 총론에서 취급되고 있는 모든 범주에 속하는 질환을 포함하고 있다. 예를 들면, 근디스트로피(muscular dystrophy)증에 있어서의 칼파인(calpain), 자기면역질환이나 신경질환에 있어서의 유비퀴틴·프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system)의 파탄(destruction), 알츠하이머병의 네프릴리신(neprilysin)의 발현 저하, 암의 침윤·전이에 있어서의 MMP의 발현 항진, 병원 미생물에 의한 병원체 유래 프로테아제, 지혈기구에 있어서의 세린 프로테아제, 태반에 있어서의 아미노 펩티다아제 등을 들 수 있다.

칼슘 의존성 시스테인 프로테아제인 칼파인은 근디스트로피증의 근단백질 분해에 관여하는 효소로서 연구되어 왔다. 칼파인은 칼슘과의 결합에 의해 활성화되는 특이적인 활성화 기구를 가지고, 골격근의 구조 유지에 중요한 α-액티닌(actinin), 트로포닌(troponin), 커넥틴(connectin) 등의 단백질을 세포내에서 한정 분해하여, 근단백질 분해의 방아쇠를 당기는 것으로 생각되고 있다. 칼파인의절단서열(Karlsson, J. O. et al. (2000) Cell Biol. Int. 24, 235-243)로서는 예를 들면 Leu-Leu-Val-Tyr이 분해기질로서 사용되고 있다.

유비퀴틴·프로테아좀 시스템은 세포내에 있어서의 선택적이고 또한 능동적인 단백질 분해기구로, 시그날전달이나 세포주기 등의 중요한 세포기구 제어시스템이다. 76개의 아미노산으로 되는 유비퀴틴은, 유비퀴틴 활성화 효소(E1), 유비퀴틴 결합효소(E2) 및 유비퀴틴 리가아제(E3)에 의한 연속적인 촉매작용으로 단백질과 공유 결합하고, 유비퀴틴화 단백질은 26S 프로테아좀에 의해 분해된다. 수백 종류 존재하는 E3 효소는 HECT형과 RING 핑거형으로 크게 나뉘고, 이들 효소활성의 이상은 매우 많은 질환에 관여한다. 26S 프로테아좀에 대한 분해기질로서는 예를 들면 Leu-Leu-Val-Tyr이 사용되고 있다(Reinheckel, T. et al. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 377, 65-68).

만성 관절 류머티스를 비롯한 관절질환은, 관절 연골의 조직 파괴에 의해 운동장애를 초래하는 질환이다. 관절 연골의 재생능은 매우 약하여, 세포외 매트릭스 분해에 의한 연골 고차구조의 붕괴는 진행성 관절 파괴로 유도한다. 이러한 연골 세포외 매트릭스 분해에는 MMP와 그 근연(近緣) 유전자 패밀리의 ADAM(a disintegrin and metalloproteinase) 분자의 관계가 최근 주목되고 있다. 특히 ADAMTS(ADAM with thrombospondin motif) 분자는 연골 프로테오글리칸(proteoglycan)(아그리칸(aggrecan))의 분해에 필수 효소로 생각되고 있다(Tortorella, M. D. et al. (1999) Science 284, 1664-1666). ADAMTS에 의해 아그리칸이 분해된 서열이 특정되어 있다(Tortorella, M. D. et al. (2000) J. Biol.Chem. 275, 18566-18573).

이들 프로테아제의 인식서열을 사용함으로써, 상기 프로테아제가 발현하는 조직에 특이적인 벡터를 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서 특히 바람직한 프로테아제 개열서열은 암에서 활성이 항진하는 프로테아제의 절단서열이다. 이러한 서열을 이용하여 벡터를 구축함으로써, 암 특이적으로 감염을 확산하는 벡터를 구축하는 것이 가능해져, 암 치료용 유전자 송달 벡터로서 매우 유용해진다. 암에서 활성이 항진하는 프로테아제란 어떤 암조직 또는 암세포에 있어서, 그 암에 대응하는 정상 조직 또는 정상 세포와 비교하여 활성이 항진하고 있는 프로테아제를 말한다. 여기에서 활성의 항진은 프로테아제의 발현 레벨의 항진 및/또는 활성 자체의 항진이어도 된다. 프로테아제의 발현 레벨은 상기 프로테아제의 유전자 단편을 프로브(probe)로 한 노던 잡종화, 상기 프로테아제 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용한 RT-PCR, 또는 상기 프로테아제에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯(western blot), ELISA, 면역침강 등에 의해 측정할 수 있다. 또 프로테아제의 활성은 상기 프로테아제의 기질을 사용한 분해 어세이(assay)에 의해 알 수 있다. 생체내 프로테아제는 여러 저해인자에 의해 활성이 조절되고 있는 것이 수 많이 알려져 있다. 프로테아제의 활성 레벨은 이들 저해인자의 발현 레벨을 측정하는 것으로도 측정할 수 있다.

예를 들면 세포외 매트릭스(extracellular matrix; ECM) 분해효소의 활성은, 특히 전이성 암에 있어서 활성이 항진하고 있다(Nakajima, M. and Chop, A. M., Semin. Cancer Biol. 2:115-127, 1991; Duffy, M. J., Clin. Exp. Metastasis 10:145-155, 1992; 나카지마 모토오「세포외 매트릭스 분해효소」, 세이키 모토하루 편집「암의 악성화와 전이」, 츄가이의학사, pp. 124-136, 1993년). 동물에 있어서는, 세포 사이의 간극에 콜라겐이나 프로테오글리칸 등의 단백으로 되는 매트릭스가 형성되어 있다. 세포외 매트릭스의 성분으로서는 구체적으로는 콜라겐·피브로넥틴(fibronectin)·라미닌(laminin)·테나신(tenascin)·엘라스틴(elastin)·프로테오글리칸 등이 알려져 있다. 이들 ECM은 세포의 접착, 진전, 또는 이동 등의 기능을 조절하거나, 가용성 인자를 결합하여 그 분포나 활성을 조절하는 기능 등을 가지고 있다. 암전이에는 ECM 분해효소에 의한 ECM의 침윤이 깊이 관여하고 있어, 실제 ECM 분해효소의 저해제의 의한 전이 또는 기저막 침윤의 저해가 다수 보고되어 있다. ECM 분해효소에 의한 절단의 인식서열을 개열부위에 갖는 개변 F 단백질을 코드하는 벡터를 설계함으로써, 암 특이적으로 감염 및 침윤하는 벡터를 구축할 수 있다.

ECM 분해효소는 활성 중심에 있는 촉매 잔기의 종류에 따라 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제 및 메탈로프로테아제로 분류된다. 그 중에서도, 생체내에서의 ECM 분해에는 중성 프로테아제의 세린 프로테아제와 메탈로프로테아제가 중심적인 역할을 하고 있다. 세린 프로테아제는 미생물, 동물, 식물 등에 널리 분포하고, 고등 동물에 있어서는 음식물의 소화, 혈액의 응고, 섬유소 용해(fibrinolysis), 면역 보체(補體)반응, 세포증식, 발생, 분화, 노화, 암전이 등 매우 많은 생체 반응에 관여하고 있다. 또한, 세린 프로테아제의 활성은 일반적으로 혈장이나 조직내에 존재하는 세린 프로테아제 저해제(serpin)에 의해조절되고 있어, 이 양적 또는 질적 이상은 염증 등의 원인이 된다.

ECM 분해성 세린 프로테아제로서는 카텝신(cathepsins)G, 엘라스타아제(elastase), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 활성제, 종양 트립신, 키모트립신 유사 중성 프로테아제, 트롬빈 등을 들 수 있다. 플라스민은 생체내에서 불활성인 상태에서 존재하는 플라스미노겐이 한정 분해되어 생긴다. 이 한정분해를 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator; PA)와 그의 저해제인 플라스미노겐 활성제 저해제(plasminogen activator inhibitor; PAI)가 제어하고 있다. PA에는 혈액응고에 관계하는 조직형 PA(tPA)와, ECM 분해에 관계하는 우로키나아제(urokinase)형 PA(uPA)가 있다(Blasi, F. and Verde, P. Semin. Cancer Bio. 1: 117-126, 1990). 이들 2개의 PA는 PAI와 결합하면 그 작용이 저해된다(Cajot, J. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6939-6943, 1990; Baker, M. S. et al., Cancer Res. 50: 4676-4684, 1990). uPA는 세포 표면의 uPA 리셉터(uPAR)와 결합한 상태에서 작용할 수 있다. 플라스민은 피브로넥틴, 테나신, 라미닌 등을 분해하지만, 콜라겐은 직접 분해할 수 없다. 그러나, 콜라겐 분해효소의 전구체 일부를 절단하여 활성화함으로써, 간접적으로 콜라겐을 분해한다. 이들이 암세포에 있어서 종종 활성이 항진하고 있어, 전이능과도 자주 상관하고 있다(Tanaka, N. et al., Int. J. Cancer 48: 481-484, 1991; Boyd, D. et al., Cancer Res. 48: 3112-3116, 1988; Hollas, W. et al., Cancer Res. 51: 3690-3695, 1991; Correc, P. et al., Int. J. Cancer 50: 767-771, 1992; Ohkoshi, M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 71: 1053-1057, 1983; Sakaki, Y. et al., 현대의약 17: 1815-1821, 1985).

uPA, tPA의 절단서열에 대한 연구도 많이 이루어져 있다(Rijken, D. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2920-2925; Wallen, P. et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta 719, 318-328; Tate, K. M. et al. (1987) Biochemistry 26, 338-343). 일반적으로 사용되고 있는 기질(substrate)서열은 VGR(Dooijewaard, G., and KLUFT, C. (1983) Adv. Exp. Med. Biol. 156, 115-120)과, substrate S-2288(Ile-Pro-Arg)(Matsuo, O. et al. (1983) Jpn. J. Physiol. 33, 1031-1037)이다. 부테나스(Butenas)는 54종류의 형광기질을 사용하여 tPA에 대한 특이성이 높은 서열을 제시하고(Butenas, S. et al. (1997) Biochemistry 36, 2123-2131), FPR, VPR이 높은 tPA에 대한 분해활성을 나타내었다. 따라서, 이들 서열은 특히 적합하게 사용된다.

또한, 시스테인 프로테아제 또는 아스파르트 프로테아제로 분류되는 ECM 분해효소도 알려져 있어, 이들도 암의 전이 및 침윤에 관여하고 있다. 구체적으로는, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 콜라겐, 프로콜라게나아제(분해에 의해 활성화된다) 등을 기질로 하는 카텝신B(Sloane, B. F., Semin. Cancer Biol. 1: 137-152, 1990), 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스타아제(활성화) 등을 기질로 하는 카텝신L(Kane, S. E. and Gottesman, M. M., Semin. Cancer Biol. 1: 127-136, 1990) 및 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 카텝신B 및 L(활성화)을 기질로 하는 카텝신D(Rochefort, H., Semin. Cancer Biol. 1: 153-160, 1990) 등을 들 수 있다. 카텝신B 및 L은 특히 유방암조직(Spyratos, F. et al., Lancet ii: 1115-1118, 1989; Lah, T. T. et al., Int. J. Cancer 50: 36-44, 1992), 대장암 칼시노마(carcinoma)(Shuja, S. et al., Int. J. Cancer 49: 341-346, 1991)에 강하게 발현하고 있어, 저해인자와의 균형의 파탄과 암의 악성화와의 관여도 시사되어 있다(Sloane, B. F., Semin. Cancer Biol. 1:137-152, 1990; Kane, S. E. and Gottesman, M. M., Semin. Cancer Biol. 1: 127-136, 1990).

메탈로프로테아제(metalloproteinase)는 Zn 등의 금속원소를 포함하는 금속효소로, 카스파제(caspase), 아미노펩티다아제, 안지오텐신(angiotensin) I 변환효소, 콜라게나아제(collagenase) 등이 보고되어 있다. ECM을 분해하는 메탈로프로테아제로서는 16종류 이상의 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase; MMP)가 보고되어 있다. 대표적인 MMP로서는 콜라게나아제-1, 2, 3(MMP-1, 8, 13), 젤라티나아제(gelatinase)A, B(MMP-2, 9), 스트로멜리신(stromelysin) 1, 2, 3(MMP-3, 10, 11), 매트릴리신(matrilysin)(MMP-7), 막형 메탈로프로테아제(MT1-MMP, MT2-MMP) 등을 들 수 있다. 일반적으로 MMP는 활성 중심에 Zn²⁺를 가지고, 효소활성에 Ca²⁺를 필요로 한다. 또한 잠재형 효소(latent MMP 또는 ProMMP라고 한다)로서 분비되어, 세포외에서 활성화를 받아 생체내에 존재하는 여러 ECM을 분해한다. 또한 MMP는 공통의 저해제인 메탈로프로테아제의 조직 저해제(tissue inhibitor of mettaloproteinases:TIMP)에 의해 활성이 저해된다. 그 밖에, ECM 분해성 메탈로프로테아제로서는 아미노펩티다아제를 들 수 있고, 예를 들면 ECM 구성 단백질 등을 분해하는 아미노펩티다아제 N/CD13 및 아미노펩티다아제B 등이 포함된다. 저해제를 사용한 실험으로부터 이들 프로테아제는 모두 암과 깊이 관여하고 있는 것이 보고되어 있다.

그 중에서 콜라게나아제(MMP-1, 8, 13)는 섬유성 콜라겐인 I, II, III형 콜라겐 분자를 특이적 부위에서 절단한다. 젤라티나아제(gelatinase)는 젤라티나아제A(MMP-2) 및 젤라티나아제B(MMP-9)의 2개의 타입이 알려져 있다. 젤라티나아제는 IV형 콜라게나아제라고도 불려, 기저막(基底膜)의 주성분인 IV형 콜라겐을 분해하지만, V형 콜라겐 및 엘라스틴도 분해한다. 또한, MMP-2는 I형 콜라겐을 MMP-1과 동일한 부위에서 절단하는 것이 알려져 있다. MMP-9는 라미닌 및 피브로넥틴을 분해하지 않지만, MMP-2는 이들을 분해한다. 스트로멜리신(stromelysin)(MMP-3, 10)은 넓은 기질성을 가지고, 프로테오글리칸, III, IV, IX형 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 등을 분해한다. 매트릴리신(matrilysin)(MMP-7)은 헤모펙신 도메인(hemopexin domain)을 갖지 않는 분자로, 기질 특이성은 MMP-3과 공통되고, 특히 프로테오글리칸 및 엘라스틴에 대한 분해활성이 높다. 막형 메탈로프로테아제(membrane-type MMP; MT-MMP)(MT1, 2, 3, 4, 5, 6-MMP)는 막관통 구조를 갖는 MMP이다. MT-MMP는 프로펩티드 도메인과 활성부위 사이에 삽입서열(약 10 아미노산)을 갖는다. 이 삽입서열은 Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa는 임의의 아미노산)를 포함하고, 세포막 상으로 수송되는 과정에서 세포내 프로세싱 효소인 furin에 의해 개열되어 활성화된다. MT-MMP로서는 MT1-MMP(MMP-14), MT2-MMP(MMP-15), MT3-MMP(MMP-16), MT4-MMP(MMP-17), MT5-MMP(MMP-23) 및 MT-6-MMP(MMP-25) 등이 알려져, 예를 들면 MT1-MMP는 I, II, III형 콜라겐을 MT3-MMP는 III형 콜라겐을 분해한다.

MMP의 과잉발현은 암세포에서 광범위하게 일어나고 있는 것을 알 수 있다. 그들은 암 자신과 암 간질세포에 의한 발현으로 나뉜다. 예를 들면 간질 콜라겐을분해하는 콜라게나아제(MMP-1)는 암세포의 침윤에 관여하고 있고, 대장암 등에서도 그 활성 레벨은 전이성과 상관하고 있다(Wooley, D. E., Cancer Metastasis Rev. 3: 361-372, 1984; Tarin, D. et al., Br. J. Cancer 46: 266-278, 1982). 또한, 타입 IV 콜라게나아제(MMP-2, MMP-9)는 여러 상피성 암에 있어서 활성과 전이능 사이에 높은 상관관계가 있다(Liotta, L. A. and Stetler-Stevenson, W. G., Semin. Cancer Biol. 1: 99-106, 1990; Nakajima, M. 실험의학 10: 246-255, 1992). 또한, 스트로멜리신(MMP-3)도 피부의 상피성 종양의 악성화에 상관하고 있는 것이 알려져 있다(Matrisian, L. M. and Bowden, G. T., Semi. Cancer Biol. 1: 107-115, 1990). 스트로멜리신-3(MMP-11)은 유방암 및 대장암 등에 있어서 고발현이 관찰되고 있다(Basset, T. et al., Nature 348:699-704, 1990; Porte, H. et al., Clin. Exp. Metastasis 10(Suppl. 1): 114, 1992).

MMP의 절단기질은 다수 알려져 있다. MMP 전반을 분해하는 기질서열로서 PLGLWAR(Bickett, D. M. et al. (1993) Anal. Biochem. 212, 58-64), GPLGMRGL(Deng, S. J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 31422-31427), PQGLEAK(Beekman, B. et al. (1996) FEBS Lett. 390, 221-225), RPKPVEWREAK(Beekman, B. et al. (1997) FEBS Lett. 418, 305-309), PLALWAR(Jacobsen, E. J. et al. (1999) J. Med. Chem. 42, 1525-1536)이 있다. MMP-2, 9의 분해기질로서 PLGMWS(Netzel-Arnett, S. et al. (1991) Anal. Biochem. 195, 86-92)와 PLGLG(Weingarten, H. et al. (1985) Biochemistry 24, 6730-6734)가 있다.

최근, phage-displayed peptide library screening에 의해 MMP9(Kridel, S. J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578), MMP2(Chen, E. I. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 4485-4491), MT1-MMP(Kridel, S. J. et al. (2002) J. Biol. Chem. In JBC Papers in Press, April 16, 2002, Manuscript M111574200)에 대한 분해 기질서열이 분명해져 있다. 이들 논문에서 특정된 아미노산서열을 3개의 MMP에 대한 분해능의 유무에 따라 4개의 그룹으로 분류되어 있다. Group IV가 MT1-MMP에 특이적으로 분해되는 서열로, Arg가 없는 서열로서 VFSIPL, IKYHS의 서열이 MMP9, MMP2로 분해할 수 없어 MT-MMP로만 분해할 수 있는 기질로서 나타나 있다.

예를 들면, MMP9의 절단서열로서는 Pro-X-X-Hy(X는 임의의 잔기, Hy는 소수성 잔기를 나타낸다)를 들 수 있고, 특히 Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)가 바람직하다. 보다 구체적으로는, Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)를 예시할 수 있다(X-Hy 사이에서 절단이 일어난다). Hy(소수성 잔기)로서는 이들에 한정되지 않지만, 예를 들면 Leu, Val, Tyr, Ile, Phe, Trp, Met를 들 수 있다. 또는, 이 이외의 절단서열도 동정되어 있어(예를 들면 이하의 문헌의 Group I, II, IIIA, IIIB를 참조; Kridel, S. J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578), 이들의 목적으로 하는 서열을 사용할 수 있다. 또 MMP2에 관해서도 상기 Pro-X-X-Hy여도 되고, 그 밖에도 (Ile/Leu)-X-X-Hy, Hy-Ser-X-Leu, His-X-X-Hy 등을 예시할 수 있다(예를 들면 이하의 문헌의 Group I, II, III, IV를 참조; Chen, E. I. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 4485-4491). MMP-7, MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MT1-MMP(MMP-14)를 포함하는 MMP 패밀리의 절단서열은, 예를 들면 천연의 기질단백질의 서열을 참고로하거나, 또는 펩티드 라이브러리의 스크리닝 등에 의해 적절히 선택할 수 있다(Turk, B. E. et al., Nature Biotech. 19, 661-667(2001); Woessner, J. F. and Nagase, H. Matrix metalloproteinases and TIMPs. (Oxford University Press, Oxford, UK, 2000); Fernandez-Patron, C. et al., Circ. Res. 85: 906-911, 1999; Nakamura, H. et al., J. Biol. Chem. 275: 38885-38890, 2000; Mc Quibban, G. A. et al., Science 289: 1202-1206, 2000; Sasaki, T. et al., J. Biol. Chem. 272: 9237-9243, 1997). 예를 들면 절단부위의 8 아미노산 P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'(P1-P1' 사이에서 절단된다)를 예시하자면, MMP-1은 VPMS-MRGG, MMP-3는 RPFS-MIMG, MMP-7은 VPLS-LTMG, MT1-MMP는 IPES-LRAG 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. MMP-8에는 예를 들면 PLAYWAR(Nezel-Amett, S. et al., Anal. Biochem. 195: 86, 1991)을 들 수 있다. MMP의 합성기질은 여러 가지 것이 입수 가능하여, 이들 서열을 비교하는 것도 가능하다(예를 들면, Calbiochem 등록상표 카탈로그, Merk의 각 MMP Substrate 참조).

통상, 조직 내의 MMP 활성은 잠재형 효소의 생산, 그 잠재형 효소의 활성화 및 활성형 효소의 저해제에 의한 저해 과정에서 조절되고 있어, 발생 배란, 수정, 자궁내막으로의 착상 및 창상(創傷) 치유 등의 여러 생리현상에 관여하고 있다. MMP 활성의 조절 장애는 암세포의 침윤·전이, 관절염, 치육염(gingivitis), 동맥경화, 종양, 섬유증(fibrosis) 등의 여러 병태에 기여한다. 예를 들면, 암의 전이에는 기저막 성분을 분해하는 젤라티나아제(MMP-2, -9)가 중요한 것이 알려져 있다. MMP-2는 MT1-MMP에 의한 pro-MMP-2의 절단에 의해 활성화된다. 또한 MMP-9의활성화에는 uPA에 의해 먼저 플라스미노겐으로부터 플라스민이 만들어지고, proMMP-3를 활성화하여 active MMP-3이 proMMP-9를 활성화하는 경로가 존재하여, 이 경로는 암의 전이에 관여하고 있다. 본 발명의 벡터를 암표적 벡터로서 개발하기 위해서는, F 단백질의 개열부위에 이들 암전이에 관여하는 프로테아제로 절단되는 서열을 도입하는 것이 특히 유용하다. 이러한 프로테아제로서는 예를 들면 MMP-2, MMP-9, uPA, MMP-3 및 MT1-MMP를 들 수 있고, 특히 MMP-2, MMP-9 및 uPA를 들 수 있다.

프로테아제 절단서열을 F 단백질에 삽입하는 경우는, F 단백질의 개열부위에 목적으로 하는 프로테아제 절단서열을 삽입하고, 원래 있는 트립신 유사 프로테아제에 의한 절단부위를 변성(degenerate)시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는 원래의 트립신 유사 프로테아제에 의한 절단부위 주변의 아미노산서열을 목적으로 하는 프로테아제 절단서열(인식서열)로 치환하면 된다. 개변 F 단백질은 세포에서 발현했을 때에 목적으로 하는 프로테아제로 절단되고, 또한 F 단백질의 세포막융합 작용이 유지되고 있는 단백질이다. F 단백질이 개열되어 생기는 F1 단편의 N 말단 부근의 아미노산은 세포막융합에 중요한 기능을 가지고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 절단이 저해되지 않는 한, 절단 후의 F1 단편의 N 말단이, 야생형 F 단백질의 F1 단편의 N 말단과 동일해지도록 절단서열을 설계하는 것이 바람직하다. 또 효율적인 절단반응을 일으키기 위해 절단부위에 링커(linker)를 삽입하는 경우에는, 절단 후의 F1 단편의 N 말단에 야생형 F1과 비교하여 최소한의 아미노산이 부가되도록 설계하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 절단 후의 N 말단에는 야생형 F1에 비해 5 아미노산 이내, 바람직하게는 4 아미노산 이내, 보다 바람직하게는 3 아미노산 이내(예를 들면 1, 2, 또는 3 아미노산)가 부가되도록 한다. 예를 들면 본 발명에 있어서, 개변 F 단백질의 F1 단편의 N 말단에 Met-Thr-Ser(서열번호:1)을 부가해도, MMP에 의한 절단반응 및 절단 후의 세포막융합 반응이 저해되지 않는 것이 판명되었다. 따라서, 절단 후의 F1의 N 말단에 Met-Thr-Ser 또는 그의 보존적 치환서열, 또는 그들의 부분서열로 되는 아미노산이 부가되도록 개열서열을 설계하는 것은 바람직하다. 보존적 치환이란 아미노산의 측쇄(side chain)의 화학적 성질이 유사한 아미노산 사이에서의 치환을 말한다. 구체적으로는, Met에 관해서는 Ile 또는 Val로의 치환, Thr에 관해서는 Ser 또는 Ala로의 치환, Ser에 관해서는 Ala, Asn, 또는 Thr로의 치환을 들 수 있다. 각 위치의 아미노산의 치환은 독립적으로 행해도 된다.

구체적으로는, 바람직한 절단서열로서 예를 들면 MMP-2 및 -9의 절단서열로서는 Pro-Leu/Gln-Gly(서열번호:2)를 포함하는 서열을 들 수 있다. 이 서열은 기질로서 이용되고 있는 합성기질(Netzel-Arnett, S. et al., Anal. Biochem. 195, 86-92(1991))에 공통의 서열로, 이 서열이 개변된 F 단백질을 절단한 후의 F2 단편의 C 말단에 오도록 F 단백질을 설계한다. 이를 위해서는, 야생형 F 단백질의 절단한 후의 F2 단편의 C 말단의 아미노산을 포함하는 서열을, Pro-Leu/Gln-Gly를 포함하는 서열로 치환하면 된다. 원래의 F 단백질의 F2 단편의 C 말단의 1 또는 여러 아미노산에 상당하는 서열을 적절히 결실시키고 Pro-Leu/Gln-Gly를 삽입한다(즉 치환한다). 결실시키는 아미노산은 예를 들면 삽입하는 아미노산 수를 동일하게(예를들면 3 아미노산) 하거나, 0~10 아미노산 정도의 범위에서 선택할 수 있다. 프로테아제에 의한 개열 및 막융합의 과정이 장해되지 않는 한, Pro-Leu/Gln-Gly의 하류에 F1의 N 말단이 직접 연결되도록 F 단백질을 조제할 수 있지만, 센다이 바이러스의 F 단백질 등에 있어서는, 개열서열과 F1 단편은 적당한 스페이서를 매개로 하여 연결되는 것이 바람직하다. 이러한 스페이서를 포함하는 개열서열로서는 특히 바람직하게는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(서열번호:3), 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(서열번호:4)을 포함하는 서열을 들 수 있다. Met, Thr 및 Ser은 다른 아미노산으로 보존적 치환해도 된다. 보다 바람직하게는 개열 후의 F2에 있어서 C 말단이 되는 아미노산으로부터 N 말단 방향으로 연속하는 1~10 잔기, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 잔기가 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser, 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr로 되는 서열로 치환된 개변 F 단백질을 바람직한 단백질로서 들 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스 F 단백질을 예로 들자면, 야생형 F 단백질에 있어서 F2 단편의 C 말단 4 아미노산에 상당하는 서열(주에 따라 다르지만 전형적으로는¹¹³Pro-Gln-Ser-Arg¹¹⁶↓)(서열번호:5)을 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser 등으로 치환한 F 단백질을 예시할 수 있다.

또한, MMP의 절단서열로서는 그 밖에도 예를 들면 본 명세서에 기재한 목적으로 하는 서열을 사용할 수 있다. 각종 MMP의 기질 특이성에 관해서는 펩티드 라이브러리를 이용하여 해석이 행해지고 있다(Turk, B. E. et al., Nature Biotech. 19, 661-667(2001)). 또한 주목하고 있는 MMP-2(Chen, E. I. et al., J. Biol.Chem. 277(6) 4485-4491(2002)) 및 MMP-9(Kridel, S. J. et al., J. Biol. Chem. 276(8) 20572-20578(2001))에 대해서도 상세한 해석이 행해지고, 특히 MMP-9에 대해서, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)의 P3에서 P2'(P3-P2-P1-P1'-P2'; 절단은 P1-P1' 사이에서 일어난다)까지의 콘센서스 서열(consensus sequence)(X=모든 잔기, Hy=소수성 잔기)이 제창되어 있다. 이 콘센서스 서열은 MMP-2에 대해서 제창되어 있는 것 중 하나(Pro-X-X-Hy)에도 합치하기 때문에, MMP-2 및 MMP-9에 대해 특이성을 나타내기 위해서는 좋은 디자인의 하나라고 생각된다. 이 점으로부터도, 상기 예시한 서열(Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr)은 바람직한 예로서 지지된다. 즉, F 단백질 개열부위는 Pro-X-X-Hy-Thr/Ser, 더욱 바람직하게는 Pro-X-X-Hy-Thr/Ser-Thr/Ser을 포함하는 서열이 바람직하다("Thr/Ser"은 Thr 또는 Ser 중 어느 한쪽을 나타낸다). 예를 들면, Pro-X-X-Hy-Thr/Ser에 적합하지 않은 Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala 및 Pro-Gln-Gly-Leu-Tyr-Ala는 바람직하지 않다(도 44). Pro-X-X-Hy-Thr/Ser 서열에 합치하는 펩티드를 F 단백질 개열부위에 삽입하면, MMP 존재하에서 높은 침윤력을 나타내는 벡터를 제조할 수 있다.

또한, 바람직한 절단서열로서는 그 밖에, 플라스미노겐 활성제에 의해 절단되는 서열을 들 수 있다. 구체적으로는, uPA 및 tPA의 절단서열로서 Val-Gly-Arg를 포함하는 서열을 들 수 있다. 이 서열이 개변된 F 단백질을 절단한 후의 F2 단편의 C 말단에 오도록 F 단백질을 설계한다. 이를 위해서는, 야생형 F 단백질의 절단 후의 F2 단편의 C 말단의 아미노산을 포함하는 서열을 Val-Gly-Arg(서열번호:6)를 포함하는 서열로 치환하면 된다. 보다 바람직하게는, 개열 후의 F2의 C 말단이 되는아미노산으로부터 N 말단 방향으로 연속하는 1~10 잔기, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 잔기를 Val-Gly-Arg 또는 이를 포함하는 서열로 치환된 개변 F 단백질을 바람직한 단백질로서 들 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스 F 단백질을 예로 들자면, 야생형 F 단백질에 있어서 F2 단편의 C 말단 3 아미노산에 상당하는 서열(주에 따라 다르지만 전형적으로는¹¹⁴Gln-Ser-Arg¹¹⁶↓)(서열번호:7)을 Val-Gly-Arg로 치환한 F 단백질을 예시할 수 있다.

특정 프로테아제 존재하에서 융합능을 발휘하는 개변 F 단백질을 효율 좋게 동정하기 위해, 플라스미드 벡터를 사용한 어세이계를 이용할 수 있다(실시예 31). 즉, 개변 F 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터를 세포에 트랜스펙션하고, 프로테아제 존재하에서 배양하여 신시티움 형성을 검출한다. 신시티움을 형성시키는 플라스미드에 코드되는 개변 F 단백질은 프로테아제에 의해 개열되어 융합능을 나타내는 것으로 판단된다. 예를 들면 MMP에 의해 개열되는 F 단백질을 어세이하기 위해서는, MMP를 발현하는 HT1080 세포를 사용할 수 있다. 또는 배양계에 MMP를 첨가해도 된다. 본 발명에 있어서 개발된 이 어세이계를 사용하면, 융합능을 가진 개변 F 단백질을 용이하게 취득하는 것이 가능하다.

개변 F 단백질을 코드하는 벡터는 상기 개변 F 단백질을 개열하는 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 벡터가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 벡터에 포함되는 게놈 RNA를 도입할 수 있다. 개열된 F 단백질의 작용에 의해 접촉하는 세포끼리 세포융합을 일으켜, 융합된 세포에 RNP가 확산된다. 즉, 본 발명의 벡터는 바이러스 입자는 형성하지 않지만, 이렇게 접촉하는 세포에 벡터가 침윤되기 때문에, 국한된 영역에 벡터를 전달할 수 있다. 프로테아제는 세포내 또는 세포외에 발현하는 것이어도 되고, 또는 외래적으로 첨가된 것이어도 된다.

본 발명에 의해 제공되는 개변 F 단백질은 특정 프로테아제에 의존적으로 세포융합능을 나타내는 능력을 갖는다. 이 단백질을 이용하여 그 프로테아제 존재하에서만 세포융합을 생기게 하거나 또는 특이적으로 감염시키는 바이러스 벡터, 또는 리포좀(liposome) 등의 약제·유전자 송달 벡터를 만들어 낼 수 있다. 예를 들면, F, HN 유전자를 탑재한 아데노바이러스 벡터(Galanis, E. et al., Hum. Gene Ther. 12, 811-821 (2001))의 F 유전자에 암에서 발현하는 프로테아제로 개열되는 개변 F 단백질의 유전자를 탑재함으로써, 특정 프로테아제 존재하에서 세포융합을 발생시키는 벡터를 개발하는 것이 가능하다. 더 나아가서는, 예를 들면 레트로바이러스를 F, HN 단백으로 위형화(pseudotyping) 하는 경우에(Spiegel, M. et al., J. Virol. 72(6) 5296-5302(1998)), 그 제조과정에 있어서 암에서 발현하는 프로테아제로 개열되는 개변 F 단백질을 이용하면, 암에서 특이적으로 감염시키는 암세포 표적화 벡터를 개발하는 것이 가능할 지도 모른다. 이와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 개변 F 단백질 및 이를 코드하는 핵산은, 본 발명의 벡터 이외에도 프로테아제에 의존하는 여러 벡터의 개발에 이용할 수 있다.

또 본 발명은 세포질 도메인의 결실에 의해 세포융합능이 높아진 개변 F 단백질을 포함하는 파라믹소바이러스 벡터를 제공한다. 이 개변 F 단백질은 세포질 도메인에 0~28개, 보다 바람직하게는 1~27개, 보다 바람직하게는 4~27개의 아미노산을 갖도록, 세포질 도메인의 일부 아미노산을 결실시킨 F 단백질이다. 세포질 도메인이란 막단백질의 세포질측의 도메인으로, F 단백질에 있어서는 막관통(TM)영역의 C 말단측영역이다(도 42 참조). 예를 들면, 세포질 도메인으로서 6~20개, 보다 바람직하게는 10~16개, 보다 바람직하게는 13~15개의 아미노산을 갖는 F 단백질은, 야생형 F 단백질에 비해 유의하게 높은 세포융합능을 나타낸다. 따라서, 약 14 아미노산의 세포질 도메인을 갖도록 개변된 F 단백질을 포함하는 파라믹소바이러스 벡터를 조제하면, 야생형 F 단백질을 사용하는 것 보다도 높은 세포융합능을 갖는 벡터를 얻을 수 있다. 바람직하게는, 이 결실 F 단백질은 야생형 F 단백질의 C 말단의 10 아미노산 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 15 아미노산 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 20 아미노산 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 25 아미노산 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 28 아미노산 또는 그 이상을 결실하고 있다. 가장 바람직한 태양에서는 세포질 도메인 결실형 F 단백질은 야생형 F 단백질의 C 말단의 약 28 아미노산을 결실하고 있다. 이들 세포질 도메인 결실형 F 단백질을 코드하는 유전자를 게놈에 포함하는 파라믹소바이러스 벡터는 통상의 벡터에 비해 세포융합능이 높기 때문에, 주위의 세포로 보다 강하게 침윤할 수 있다. 이 F 다백질의 개열부위를 본 명세서에 기재한 바와 같이 개변하면, 특정 프로테아제의 존재하에서만 높은 침윤력을 발휘하는 벡터를 얻을 수 있다.

더욱이 본 발명은 파라믹소바이러스가 갖는 2종류의 스파이크 단백질의 융합단백질에 관한 것이다. 파라믹소바이러스에는 세포융합에 기능을 하는 것으로 생각되는 단백질(이를 F 단백질이라 부른다)과, 세포로의 접착에 기능하는 것으로 생각되는 단백질(HN 또는 H 단백질이라 부른다)을 가지고 있다. 본 명세서에 있어서, 전자를 F 단백질, 후자를 HN 단백질이라고 총칭한다. 이 2개의 단백질을 융합단백질로서 발현시키면, 따로 따로 발현시키는 경우에 비해 매우 강한 융합능을 발휘할 수 있다. 이 융합단백질은 서로의 세포질 도메인의 부분에서 양자의 단백질이 결합되어 있다. 구체적으로는, 융합단백질의 N 말단측에 F 단백질을, C 말단측에 HN(또는 H) 단백질을 포함하고 있다. 양자의 단백질을 융합시키는 경우, 전장(全長) 단백질끼리를 융합시켜도 되지만, F 단백질의 세포질 도메인의 일부 또는 전부를 결실시킨 단백질을 HN(또는 H) 단백질에 융합시켜도 된다. 이 경우, F 단백질의 TM영역의 하류로부터 HN(또는 H) 단백질까지의 길이를 5 잔기 이상, 보다 바람직하게는 10 잔기 이상, 보다 바람직하게는 14 잔기 이상, 보다 바람직하게는 20 잔기 이상으로 한다. 예를 들면, F 단백질의 세포질 도메인을 결실시킨 단백질을 HN(또는 H) 단백질에 융합시키는 경우, F 단백질부분의 C 말단에 적당한 길이의 링커 펩티드를 부가하여 길이를 조절하는 것은 바람직하다. 구체적으로는, 14 잔기의 F 단백질의 세포질 도메인을 갖는 세포질 도메인 결실형 F 단백질에, 임의의 링커 펩티드를 매개로 하여 HN(또는 H) 단백질에 융합시킨 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 링커 펩티드의 길이는 예를 들면 약 50 잔기로 할 수 있다. 링커 펩티드의 아미노산서열에 특별히 제한은 없지만, 유의한 생리활성을 갖지 않는 폴리펩티드가 바람직하고, 예를 들면 도 43(서열번호:80)에 예시한 바와 같은 폴리펩티드를 사용할 수 있다.

또 본 발명은 이들 융합단백질을 코드하는 핵산 및 상기 핵산을 탑재하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이 발현 벡터를 도입한 세포는 강한 융합능을 나타내 주위의 세포와 융합하여 신시티움을 형성한다. 발현 벡터로서는 특별히 제한은 없고, 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터 등을 예시할 수 있다. DNA 벡터의 경우는 예를 들면 CAG 프로모터(닭β액틴 프로모터와 CMV 인헨서(enhancer)와의 키메라 프로모터)(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199) 등의 강력한 프로모터를 조합시키는 것이 바람직하다. 또한, 이 단백질을 발현하는 바이러스 벡터는 도입 세포에서 강한 융합을 일으킨다. 바이러스 벡터로서는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 수반 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터(simple herpes viral vector), 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스 벡터(Semliki forest viral vector), 신드비스 바이러스 벡터(sindbis viral vector), 백시니아 바이러스 벡터(vaccinia viral vector), 계두 바이러스 벡터(fowlpox viral vector), 그 밖의 원하는 바이러스 벡터를 예시할 수 있다. 특히 이 단백질을 발현하는 파라믹소바이러스 벡터는 여러 조직에 대해 높은 침윤력을 발휘할 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재한 F 개열부위를 개변한 융합단백질을 코드하는, M 유전자 결실형 파라믹소바이러스 벡터를 사용하면, 특정 조직에서 강한 세포융합을 일으키는 벡터를 제조하는 것이 가능하다.

이들 재조합 바이러스 벡터는 당업자에게 주지의 방법에 따라 조제할 수 있다. 예를 들면, 유전자치료 등에 가장 보통으로 이용되는 아데노바이러스 벡터의 제작은, 사이토(Saito) 등의 방법 및 기타(Miyake 등, 1996, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93권, 1320-24페이지; Kanegae 등, 1996, Acta Paediatr. Jpn, 38권, 182-188페이지; 가네가에 등, 바이오매뉴얼시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법, 1994, 43-58페이지, 요도샤; 가네가에 등, 1994, 세포공학, 13권, 8호, 757-763페이지)에 따라 제조할 수 있다. 또한, 예를 들면 레트로바이러스 벡터(와키모토 등, 1995, 단백질 핵산효소, 40권, 2508-2513페이지) 및 아데노 수반 바이러스 벡터(다마요리 등, 1995, 단백질 핵산효소, 40권, 2532-2538페이지) 등도 공지의 방법에 의해 조제할 수 있다. 포유동물에 유전자 도입 가능한 그 밖의 바이러스 벡터를 제조하기 위한 상세는, 재조합 백시니아 바이러스를 제조하는 방법으로서는, 일본국 특허공표 제(평)6-502069, 일본국 특허공고 제(평)6-95937, 일본국 특허공고 제(평)6-71429가 알려져 있다. 재조합 파필로마바이러스(papillomavirus)를 제조하는 방법으로서는 일본국 특허공고 제(평)6-34727, 일본국 특허공표 제(평)6-505626이 알려져 있다. 재조합 아데노 수반 바이러스를 제조하는 방법으로서는 일본국 특허공개 제(평)5-308975가 알려져 있다. 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법으로서는 일본국 특허공표 제(평)6-508039가 알려져 있다.

본 발명의 한 태양에 있어서 제공되는 벡터에 포함되는 RNA 게놈에 있어서는, M(매트릭스) 단백질을 코드하는 유전자(M 유전자)가 변이 또는 결손되어 있다. 본 발명에 있어서, F 단백질의 개열부위를 다른 프로테아제로 절단되는 서열로 개변하고, 추가로 M 유전자를 변이 또는 결실시켜 입자 형성능을 억제함으로써, 바이러스 입자를 방출하지 않고 특정 프로테아제를 발현하는 세포집단 내에서만 벡터를 침윤시키는 전혀 새로운 성질을 가진 벡터가 개발되었다. M 유전자의 변이는 숙주내 환경에 있어서의 입자 형성 활성을 소실 또는 유의하게 저하시키는 변이이다. 이러한 변이는 이 M 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 단백질의 세포 표면의 응집이 저하됨으로써 동정할 수 있다(실시예 참조).

본 발명에 의해 2차 방출 입자, 즉 VLP 방출의 억제를 목적으로 한 개변을 행하는 경우, M 단백을 결실시키는 것이 가장 효과적인 것이 실증되었다. 이것은, 비리온 형성에 있어서의 M 단백의 역할에 관한 센다이 바이러스(SeV)나 다른 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 보고에 의해서도 지지된다. 예를 들면, 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus:VSV)에서는 M 단백의 강한 발현에서만 바이러스 유사 입자(VLP: virus like particle)의 발아(發芽)아 관찰되고 있고(Justice, P. A. et al., J. Virol. 69; 3156-3160(1995)), 또 파라인플루엔자 바이러스의 경우도 M 단백만의 강한 발현에서 VLP가 생기는 것이 보고되어 있다(Coronel, E. C. et al., J. Virol. 73; 7035-7038(1999)). 이러한 M 단백 단독에서의 VLP 형성에 관해서는, 모든 마이너스 가닥 RNA 바이러스에서 관찰되고 있는 것은 아니지만, M 단백이 비리온 형성의 core가 되어 있는 것은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스에서 공통되어 있다고 인식할 수 있다(Garoff, H. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62; 1171-1190(1198)).

비리온 형성에 대한 M 단백의 구체적인 역할에 관하여 주로 이하와 같이 정리할 수 있다. 비리온 형성의 장(場)이 되는 것은 세포막 상의 지질 래프트(Lipid rafts)라 불리는 장(Simons, K. and Ikonen, E. Nature 387; 569-572(1997))으로, 원래는 Triton X-100과 같은 비이온성 계면활성제에 불용성 지질획분으로서 동정되었다(Brown, D. A. and Rose, J. K. Cell 68; 533-544(1992)). 인플루엔자바이러스(Ali, A. et al., J. Virol. 74; 8709-8719(2000)), 홍역 바이러스(Measles virus; MeV: Manie, S. N. et al., J. Virol. 74; 305-311(2000)) 및 SeV(Ali, A. and Nayak, B. P. Virology 276; 289-303(2000)) 등에서 지질 래프트(Lipid rafts)에서의 비리온 형성이 증명되어 있고, 거기서 M 단백은 엔벨로프 단백(스파이크(spike) 단백으로도 표기된다)이나 리보핵산단백질(RNP)을 농축하여 비리온 형성을 촉진하는, 즉 바이러스 조립과 출아(budding)의 구동력이 되고 있는 것으로 생각된다(Cathomen, T. et al., EMBO J. 17; 3899-3908(1998), Mebatsion, T. et al., J. Virol. 73; 242-250(1999)). 실제로, M 단백은 스파이크 단백의 세포질측 말단(cytoplasmic tail)과 결합하는 것이, 인플루엔자바이러스(Zhang, J. et al., J. Virol. 74; 4634-4344(2000)) 및 SeV(Sanderson, C. M. et al., J. Virol. 67; 651-663(1993)) 등에서 나타나 있고, 또 RNP와의 결합도 인플루엔자바이러스(Ruigrok. R. W. et al., Virology 173; 311-316(1989))나, 파라인플루엔자바이러스 및 SeV(Coronel, E. C. et al., J. Virol. 75; 1117-1123(2001)) 등에서 나타내어져 있다. 더욱이, M 단백 자신의 올리고머 형성으로의 관여가 SeV(Heggeness, M. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79; 6232-6236(1982) 및 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus; VSV: Gaudin, Y. et al., Virology 206; 28-37(1995), Gaudin, Y. et al., J. Mol. Biol. 274; 816-825(1997)) 등에서 보고되어, 이들 많은 바이러스 성분 및 지질과의 결합능이 바이러스 조립과 출아의 구동력으로서의 역할을 담당하고 있는 것으로 생각할 수 있다.

또한, 엔벨로프 단백(스파이크 단백)에 관해서도 개변에 의해 VLP 방출억제로 연결될 가능성도 이미 몇 가지 시사되어 있다. 비리온 형성이 실제로 감소한 구체적인 보고로서의 이하의 실험예가 있다. 광견병 바이러스(Rabies virus; RV)의 경우, G 단백 결실형에 있어서 VLP 형성이 1/30로 감소되고(Mebatsion, T. et al., Cell 84; 941-951(1996)), M 단백 결실형에 있어서는 1/500,000 이하로 감소되었다고 보고되어 있다(Mebatsion, T. et al., J. Virol. 73; 242-250(1999)). 또한, 홍역바이러스(MeV)의 경우, M 단백 결실형에 있어서 cell-to-cell의 융합이 항진하여(Cathomen, T. et al., EMBO J. 17; 3899-3908(1998)), 이것은 비리온 형성이 억제되었기 때문인 것으로 생각할 수 있다(Li, Z. et al., J. Virol. 72(5), 3789-3795(1998)). 또한, 동일한 융합 항진이 F 또는 H 단백의 세포질측 말단의 변이로도 생기고 있다(Cathomen, T. et al., J. Virol. 72; 1224-1234(1998)). 따라서, F 및/또는 HN 단백의 세포질측 말단만을 결실시키는 변이를 도입함으로써, 입자 형성을 억제하는 것도 생각할 수 있다. 단, 특히 SeV에 있어서는 F 결실형(WO00/70070) 또는 HN 결실형(Stricker, R. and Roux, L., J. Gen. Virol. 72; 1703-1707(1991))에 있어서 많은 VLP가 존재하는 것이 보고되어 있어, 이들 스파이크 단백질의 개변에 의한 효과는 한정되는 것이 예상된다. 더욱이 SeV에 있어서는 이하의 점도 분명해져 있다. SeV의 F 및 HN이 분비경로에 올라와 있는 동안(즉, 골지체 등에 존재하고 있는 동안), 각각(F 및 HN)의 세포질측 말단이 M 단백과 결합하고 있는 것이 나타내어져 있다(Sanderson, C. M. et al., J. Virol. 67; 651-663(1993), Sanderson, C. M. et al., J. Virol. 68; 69-76(1994)). 즉, 비리온 형성의 장인세포막 상의 지질 래프트(Lipid Rafts)로 M 단백이 효율적으로 운반되기 위해서는, F 및 HN의 세포질측 말단과의 결합이 중요하여, M 단백은 세포질에 존재하면서 F 및 HN과 결합함으로써, F 및 HN의 분비경로에 오른 형태로 세포막으로 운반되고 있는 것으로 예상된다. 이와 같이, M 단백질은 바이러스 입자의 형성에 본질적인 역할을 하고 있어, M 단백질의 세포막 상의 응집을 잃게 하는 변이 M 단백질 유전자를 사용함으로써, 입자 형성능을 갖지 않는 벡터를 만들어 내는 것이 가능해진다.

세포에 있어서의 M 단백질 국재의 검출은 세포분획에 의한 방법 및 면역염색에 의해 M 단백질의 국재를 직접 검출하는 방법 등으로 실시할 수 있다. 면역염색에서는 예를 들면 형광 표지된 항체를 사용하여 M 단백질을 염색하고, 공초점 레이저 현미경하에서 관찰할 수 있다. 또한, 세포를 용해한 후, 공지의 세포분획법에 의해 세포획분을 얻어, M 단백질에 대한 항체를 사용한 면역침강 또는 웨스턴 블롯팅 등에 의해 M 단백질이 포함되는 획분을 동정함으로써 국재를 조사할 수 있다. 비리온 형성의 장이 되는 것은 세포막 상의 지질 래프트(Lipid rafts)라 불리고 있는 장으로, Triton X-100과 같은 비이온성 계면활성제에 불용성인 지질획분이다. M 단백질은 스파이크 단백, RNP 및 M 단백 자신, 더 나아가서는 지질과의 결합능에 의해 이 지질 래프트에서 바이러스 성분을 응집하는 것으로 생각되고 있기 때문에, 지질 래프트 분획 후, 전기영동 등으로 검출되는 M 단백은 응집된 M 단백질을 반영하고 있는 것으로 파악할 수 있다. 즉, 검출되는 M 단백질량이 저하되어 있으면, 세포 표면의 M 단백질의 응집이 저하되어 있는 것으로 판단된다. 한편, 본 발명자 등이 이용한 세포면역염색에 의해 세포내 국재를 검출하는 방법에서는, 세포막 상의 M 단백의 응집을 직접 관찰하는 것이 가능하다. 이 경우, 세포면역염색에 이용 가능한 항M 항체를 이용한다. 이 방법으로 검출한 경우, M 단백질이 응집되어 있으면 세포막 근방에 강한 농축상이 관찰되고, M 단백의 응집이 없으면 농축상은 없어 세포막의 윤곽이 명확하지 않아, 세포질 전체가 엷게 염색된다. 이와 같이 농축상이 적거나 또는 농축상이 없어 세포막의 윤곽이 흐릿하게 관찰되어, 세포질 전체가 엷게 염색된 경우에, 세포 표면의 M 단백질의 응집이 저하되어 있는 것으로 판단된다.

야생형 M 단백질에 비해 세포 표면에 있어서의 응집이 유의하게 저하되는 변이 M 단백질은, 입자 형성능이 유의하게 저하되어 있는 것으로 판단된다. 바이러스의 입자 형성능의 저하는, 예를 들면 통계학적으로 유의하게(예를 들면 유의수준 5% 또는 그 이하의 %값) 저하되어 있다. 통계학적인 검정은 예를 들면 스튜던트의 t검정 또는 만-휘트니 U검정(Mann-Whitney U-test) 등에 의해 행할 수 있다. 변이 M 유전자를 갖는 바이러스 벡터는 숙주내 환경에 있어서의 입자 형성능이 바람직하게는 1/5 이하, 보다 바람직하게는 1/10 이하, 보다 바람직하게는 1/30 이하, 보다 바람직하게는 1/50 이하, 보다 바람직하게는 1/100 이하, 보다 바람직하게는 1/300 이하, 보다 바람직하게는 1/500 이하로 저하되어 있다. 본 발명의 벡터는 가장 바람직하게는 숙주내 환경에 있어서의 바이러스 입자의 생산능이 실질적으로 상실되어 있다. 실질적으로 상실된다는 것은, 숙주내 환경에 있어서의 바이러스 입자의 생산이 검출되지 않는 것을 말한다. 이러한 경우, 바이러스 입자는 10³/ml 이하, 바람직하게는 10²/ml 이하, 보다 바람직하게는 10¹/ml 이하이다.

바이러스 입자의 존재는 전자현미경 등으로 직접 확인할 수 있다. 또는, 바이러스에 포함되는 핵산 또는 단백질을 지표로 검출 및 정량하는 것이 가능하다. 예를 들면, 바이러스 입자 중에 포함되는 게놈 핵산을 PCR 등의 일반적인 핵산 검출법으로 검출 및 정량해도 된다. 또는, 외래유전자를 갖는 바이러스 입자는 이것을 세포에 감염시켜 상기 유전자의 발현을 검출함으로써 정량할 수 있다. 감염성을 갖지 않는 바이러스 입자는 트랜스펙션 시약과 조합하여 세포에 도입하고, 유전자 발현을 검출함으로써 정량할 수 있다. 본 발명에 있어서 바이러스 입자는 감염능을 갖지 않는 입자도 포함되고, 예를 들면 VLP를 포함한다.

또한, 바이러스의 역가(potency)는 예를 들면 CIU(Cell-Infected Unit)측정 또는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다(WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999). 또한, 실시예에 기재한 바와 같이, GFP 등의 마커 유전자를 탑재한 벡터에 대해서는, 마커의 지표에 직접적으로 감염세포를 카운트함으로써 역가를 정량할 수 있다(예를 들면 GFP-CIU로 하여). 이와 같이 하여 측정한 역가는 CIU와 동등하게 취급할 수 있다(WO00/70070). 예를 들면 바이러스 입자가 포함될 가능성이 있는 시료를 세포에 트랜스펙션해도검출 가능한 감염가를 나타내지 않음으로써, 바이러스 입자의 생산능 상실을 확인할 수 있다. 감염능을 갖지 않는 바이러스 입자(VLP 등)의 검출은, 예를 들면 리포펙션(lipofection) 시약을 사용한 트랜스펙션에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche, Basel, Switzerland; Cat No. 1811169)를 사용해서 행할 수 있다. 바이러스 입자를 포함하거나 또는 포함하지 않는 용액 100 ㎕에 DOSPER 12.5 ㎕를 혼합하여 실온에서 10분 방치한 후, 6웰 플레이트에 컨플루언트(confluent)로 배양한 세포에 15분마다 진탕하면서 트랜스펙션한다. 2일 후에 감염세포의 유무를 검출함으로써 VLP의 검출이 가능하다.

숙주내 환경이란 대상으로 하는 벡터가 유래하는 파라믹소바이러스의 야생형이 자연계에 있어서 통상 증식하는 숙주내의 환경 또는 그것과 동등한 바이러스 증식을 초래하는 환경을 말한다. 숙주내 환경은 예를 들면 상기 바이러스의 적합한 증식조건이어도 된다. 포유동물을 숙주로 하는 파라믹소바이러스라면 포유동물 생체내 또는 그것과 동등한 환경을 말한다. 그 온도는 포유동물 체내에 상당하는 약 37~38℃(예를 들면 37℃)이다. 인 비트로(in vitro)라면 통상의 세포배양 조건, 구체적으로는 혈청 함유 또는 비함유 배지 중(pH 6.5~7.5), 37℃, 5% CO₂, 습한 환경하의 배양환경을 들 수 있다.

환경조건에 의한 변이 M 단백질의 활성의 차이는, M 단백질의 온도감수성 변이 등의 조건적 변이에 있어서 의미를 가지고 있다. 조건적 변이란 숙주내 환경에서는 기능 결실형(loss of function)의 변이 형질을 나타내지만, 어떤 환경에 있어서 활성을 나타내는 변이를 말한다. 예를 들면 37℃에서는 기능이 거의 또는 완전히 결실되지만, 저온 조건에 있어서는 기능이 회복되는 온도감수성 변이 M 단백질을 코드하는 유전자를 적합하게 사용할 수 있다. 온도감수성 변이란 저온(예를 들면 32℃)에 비해 고온(예를 들면 37℃)에 있어서 유의하게 활성이 저하되는 변이를 말한다. 본 발명자 등은 M 단백질의 온도감수성 변이체를 사용하여, 숙주내 환경에 상당하는 37℃에 있어서 입자 형성능이 극적으로 저하된 바이러스 입자를 제조하는 것에 성공하였다. 이 변이 M 단백질은 저온 조건하(예를 들면 32℃)에서는 세포 표면으로의 응집을 나타내 바이러스 입자를 형성시키지만, 통상의 숙주체내의 온도(37℃)에서는 응집성이 결실되어 바이러스 입자를 형성할 수 없다. 이러한 온도감수성 변이 M 단백질을 코드하는 핵산을 게놈에 갖는 벡터는, 본 발명의 벡터로서 적합하다. 조건적 변이 M 단백질을 코드하는 바이러스 벡터는 M 단백질이 기능할 수 있는 조건, 즉 허용 조건에서 벡터를 복제시킴으로써 M 단백질이 기능하여 바이러스 입자가 형성된다. 이렇게 하여 제조한 바이러스 입자는 통상 환경하에서 감염시키면 M 단백질이 기능할 수 없어 입자를 형성하지 않는다.

M 유전자의 온도감수성 변이로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 센다이 바이러스의 M 단백질의 G69, T116 및 A183으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 임의로 선택되는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 모든 아미노산 부위, 또는 다른 (-)가닥 RNA 바이러스 단백질의 그들과 상동한 부위에 변이를 포함하는 것을 적합하게 사용할 수 있다. 여기에서 G69란 M 단백질의 69번째 아미노산 Gly, T116이란 M 단백질의 116번째의 아미노산 Thr, A183이란 M단백질의 183번째의 아미노산 Ala를 가리킨다.

M 단백질을 코드하는 유전자(M 유전자)는 (-)가닥 RNA 바이러스에서 널리 보존되어 있어, 바이러스의 뉴클레오캡시드와 엔벨로프 양자에 상호 작용하는 기능을 갖는 것이 알려져 있다(Garoff, H. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 117-190(1998)). 또한, SeV M 단백질에 있어서 amphiphilic α-helix로 예상되고 있는 104-119(104-KACTDLRITVRRTVRA-119/서열번호:45)는 입자 형성에 중요한 영역으로서 동정되어 있지만(Genevieve Mottet et al., J. Gen. Virol. 80: 2977-2986(1999)), 해당 영역은 (-)가닥 RNA 바이러스 사이에서 잘 보존되어 있다. M 단백질의 아미노산서열은 (-)가닥 RNA 바이러스에서 유사하고, 특히 파라믹소바이러스 아과에 있어서는 기지의 M 단백질은 공통적으로 전장 약 330~380 아미노산으로 되는 염기성 단백질로, 전영역에 걸쳐 유사성이 있지만, 특히 C 말단측 반쪽에서의 유사성이 높다(Gould, A. R. Virus Res. 43: 17-31(1996), Harcourt, B. H. et al., Virology 271: 334-349(2000)). 따라서, 예를 들면 SeV M 단백질의 G69, T116 및 A183과 상동한 아미노산은 용이하게 동정하는 것이 가능하다.

SeV M 단백질의 G69, T116 및 A183과 대응하는 다른 (-)가닥 RNA 바이러스 M 단백질의 상동한 부위의 아미노산은, 당업자라면 예를 들면 BLAST 등의 아미노산서열의 상동성(homology) 검색 프로그램(얼라인먼트(alignment) 작성기능을 갖는 것) 또는 CLUSTAL W 등의 얼라인먼트 작성 프로그램을 사용하여 SeV M 단백질의 아미노산과 정렬화함으로써 동정할 수 있다. 예를 들면 SeV M 단백질의 G69에 상당하는 각 M 단백질의 상동부위로서는, human parainfluenza virus-1(HPIV-1)(괄호는 약칭)이라면 G69, human parainfluenza virus-3(HPIV-3)라면 G73, phocine distemper virus(PDV) 및 canine distemper virus(CDV)라면 G70, dolphin molbillivirus(DMV)라면 G71, peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), measles virus(MV) 및 rinderpest virus(RPV)라면 G70, Hendra virus(Hendra) 및 Nipah virus(Nipah)라면 G81, human parainfluenza virus-2(HPIV-2)라면 G70, human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a) 및 human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b)라면 E47, mumps virus(Mumps)라면 E72를 들 수 있다(문자와 번호는 아미노산과 그 위치를 나타낸다). 또한, SeV M 단백질의 T116에 상당하는 각 M 단백질의 상동부위로서는 human parainfluenza virus-1(HPIV-1)이라면 T116, human parainfluenza virus-3(HPIV-3)라면 T120, phocine distemper virus(PDV) 및 canine distemper virus(CDV)라면 T104, dolphin molbillivirus(DMV)라면 T105, peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), measles virus(MV) 및 rinderpest virus(RPV)라면 T104, Hendra virus(Hendra) 및 Nipah virus(Nipah)라면 T120, human parainfluenza virus-2(HPIV-2) 및 simian parainfluenza virus 5(SV5)라면 T117, human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a) 및 human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b)라면 T121, mumps virus(Mumps)라면 T119, Newcastle disease virus(NDV)라면 S120을 들 수 있다. SeV M 단백질의 A183에 상당하는 각 M 단백질의 상동부위로서는 human parainfluenza virus-1(HPIV-1)이라면 A183, human parainfluenza virus-3(HPIV-3)이라면 F187, phocine distemper virus(PDV) 및 canine distemper virus(CDV)라면 Y171, dolphin molbillivirus(DMV)라면 Y172, peste-des-petits-ruminantsvirus(PDPR), measles virus(MV) 및 rinderpest virus(RPV)라면 Y171, Hendra virus(Hendra) 및 Nipah virus(Nipah)라면 Y187, human parainfluenza virus-2(HPIV-2)라면 Y184, simian parainfluenza virus 5(SV5)라면 F184, human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a) 및 human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b)라면 F188, mumps virus(Mumps)라면 F186, Newcastle disease virus(NDV)라면 Y187을 들 수 있다. 여기에 든 바이러스에 있어서, 각각의 M 단백질에 상기 3개 부위 중 어느 하나, 바람직하게는 임의의 두 부위의 조합, 더욱 바람직하게는 3개 부위의 모든 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 M 단백질을 코드하는 게놈을 갖는 바이러스는 본 발명에 있어서 적합하다.

아미노산 변이는 목적으로 하는 다른 아미노산으로의 치환이어도 되지만, 바람직하게는 측쇄의 화학적 성질이 다른 아미노산으로의 치환이다. 예를 들면 아미노산은 염기성 아미노산(예를 들면 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들면 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전극성 아미노산(예를 들면 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들면 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분지 아미노산(예를 들면 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들면 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등의 그룹으로 분류할 수 있지만, 어떤 아미노산에 대해서 그 아미노산이 속하는 그룹의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 염기성 아미노산이라면 산성 또는 중성 아미노산으로의 치환, 극성 아미노산이라면 비극성 아미노산으로의 치환, 20종류의 천연 아미노산의 평균분자량 보다 큰 분자량을 갖는 아미노산이라면 그 평균분자량 보다 작은 아미노산으로의 치환, 반대로 그 평균분자량 보다 작은 아미노산이라면 그것 보다 큰 아미노산으로의 치환 등을 들 수 있지만, 그것에 한정되지 않는다. 예를 들면 센다이 바이러스 M 단백질에 있어서의 G69E, T116A 및 A183S로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이 또는 그들과 상동한 위치에 변이를 포함하는 다른 파라믹소바이러스 M 단백질을 사용할 수 있다. 여기에서 G69E란 M 단백질의 69번째 아미노산 Gly가 Glu로 치환된 변이, T116A란 M 단백질의 116번째 아미노산 Thr이 Ala로 치환된 변이, A183S란 M 단백질의 183번째 아미노산 Ala가 Ser로 치환된 변이를 말한다. 즉, 센다이 바이러스 M 단백질의 G69, T116 및 A183 또는 다른 바이러스 M 단백질의 상동부위를 각각 Glu(E), Ala(A) 및 Ser(S)로 치환할 수 있다. 이들 변이는 조합하여 가지고 있는 것이 바람직하고, 특히 상기 3개의 변이 모두를 보유하고 있는 것이 보다 바람직하다. M 유전자로의 변이의 도입은 공지의 변이 도입방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면 실시예에 기재한 바와 같이 목적 변이를 넣은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입하는 것이 가능하다.

또한, 예를 들면 홍역 바이러스에 있어서는 M 단백의 단일클론항체에 대한 에피토프(epitope)가 변화되어 있는 온도감수성 주의 P253-505(Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med., 64; 15-30(1991))의 M 유전자서열을 사용해도 된다. 또한, SeV M 단백질의 116번째인 Thr에 대응하는 홍역 바이러스 M 단백질의 104번째인 Thr, 또는 유행성 이하선염 바이러스의 M 단백질의 119번째인 Thr을 다른 아미노산(예를 들면 Ala)으로 치환해도 된다.

본 발명의 벡터는 더욱 바람직한 태양에 있어서는 M 유전자를 결손하고 있다. M 유전자의 결손이란 M 유전자의 기능이 결실되어 있는 것을 말하고, 기능 결실형 변이를 갖는 M 유전자를 갖는 경우 및 M 유전자를 결실하는 경우를 포함한다. M 유전자의 기능 결실형 변이는 예를 들면 M 유전자의 단백질 코드서열을 결실시키거나, 다른 서열을 삽입함으로써 제작할 수 있다. 예를 들면, M 단백질 코드서열의 도중에 정지코돈(termination codon)을 설계할 수 있다(WO00/09700). 본 발명의 벡터는 가장 바람직하게는 M 단백질의 코드서열이 완전히 결실되어 있다. M 단백질의 ORF를 결실한 벡터는 조건적 변이 M 단백질을 코드하는 벡터와는 달리, 임의의 조건에 있어서 바이러스 입자를 형성하는 능력을 결실하고 있다.

본 발명의 벡터를 제조하기 위해서는 파라믹소바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP의 재구성에 필요한 바이러스 단백질, 즉 N, P 및 L 단백질의 존재하, 파라믹소바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 cDNA를 전사시킨다. 전사에 의해 네거티브 가닥 게놈(즉 바이러스 게놈과 동일한 안티센스 가닥)을 생성시켜도 되고, 또는 포지티브 가닥(바이러스 단백질을 코드하는 센스 가닥)을 생성시켜도 바이러스 RNP를 재구성할 수 있다. 벡터의 재구성 효율을 높이기 위해서는 바람직하게는 포지티브 가닥을 생성시킨다. RNA 말단은 천연 바이러스 게놈과 마찬가지로 3'리더서열과 5'트레일러서열의 말단을 가능한 한 정확하게 반영시키는 것이 바람직하다. 전사산물의 5'말단을 정확하게 제어하기 위해서는, 예를 들면 전사개시부위로서 T7 RNA 폴리머라제 인식서열을 이용하여, 상기 RNA 폴리머라제를 세포내에서 발현시키면 된다. 전사산물의 3'말단을 제어하기 위해서는 예를 들면 전사산물의 3'말단에 자기절단형 리보자임을 코드시켜 두고, 이 리보자임에 의해 정확하게 3'이 잘려나가도록 할 수 있다(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466).

외래유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 하기 위해, 게놈 RNA를 코드하는 cDNA 중에 외래유전자를 삽입하기 위한 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 그 부위는 예를 들면 게놈의 단백질 비코드영역의 목적으로 하는 위치여도 되고, 구체적으로는 3'리더영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이, 각 바이러스 단백질 ORF의 사이 및/또는 5'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5'트레일러영역 사이에 삽입할 수 있다. M 유전자를 결실하는 게놈에서는 그 결실영역에 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 클로닝 사이트는 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다. 클로닝 사이트는 복수의 제한효소 인식서열을 갖는 소위 멀티클로닝 사이트로 해도 된다. 복수의 외래유전자를 게놈 중에 각각의 위치에 삽입할 수 있도록, 클로닝 사이트는 게놈 중의 복수 개소에 존재해도 된다.

예를 들면 입자 형성능을 갖지 않는 재조합 바이러스 RNP는 Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466의 기재 등에 준하여, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다.

외래유전자를 삽입하는 경우는 먼저 목적의 외래유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는 25 ng/㎕ 이상의 농도에서 전기영동적으로 단일 플라스미드라고 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이하, NotI 부위를 이용하여 바이러스 게놈 RNA를 코드하는 DNA에 외래유전자를 삽입하는 경우를 예로 들어 설명한다. 목적으로 하는 cDNA 염기서열 중에 NotI 인식부위가 포함되는 경우는, 부위 특이적 변이삽입법 등을 사용하여, 코드하는 아미노산서열을 변화시키지 않도록 염기서열을 개변하여 NotI 부위를 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 이 시료로부터 목적의 유전자 단편을 PCR에 의해 증폭 회수한다. 2개의 프라이머 5'부분에 NotI 부위를 부가해둠으로써, 증폭된 단편의 양쪽 말단을 NotI 부위로 한다. 바이러스 게놈 상에 삽입된 후의 외래유전자의 ORF와 그 양쪽 바이러스 유전자의 ORF 사이에 E-I-S 서열이 배치되도록, 프라이머 중에 E-I-S 서열 또는 그 부분을 포함시키도록 한다.

예를 들면, 포워드측(forward side) 합성 DNA 서열은 NotI에 의한 절단을 보증하기 위해 5'측에 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하고, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 스페이서 서열로서 임의의 9염기 또는 9에 6의 배수를 가한 수의 염기를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA의 개시코돈 ATG로부터 이것을 포함하여 ORF의 약 25염기 상당의 서열을 부가한 형태로 한다. 마지막 염기는 G 또는 C가 되도록 상기 목적으로 하는 cDNA로부터 약 25염기를 선택하여 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 하는 것이 바람직하다.

리버스측(reverse side) 합성 DNA 서열은 5'측으로부터 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 길이를 조절하기 위한 삽입단편의 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는 E-I-S 서열을 포함하는 최종적인 PCR 증폭산물의 NotI 단편의 가닥길이가 6의 배수가 되도록 염기수를 설계한다(이른바 「6의 법칙(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993). 이 프라이머에 E-I-S 서열을 부가하는 경우에는, 삽입 단편의 올리고 DNA의 3'측에 센다이 바이러스의 S 서열인 상보가닥 서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3'(서열번호:8), I 서열의 상보가닥 서열, 바람직하게는 5'-AAG-3', E 서열의 상보가닥 서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(서열번호:9), 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA 서열의 정지코돈으로부터 반대로 세어서 약 25염기 상당의 상보가닥의 마지막 염기가 G 또는 C가 되도록 길이를 선택하여 서열을 부가하고, 리버스측 합성 DNA의 3'의 말단으로 한다.

PCR은 Taq 폴리머라제 또는 그 밖의 DNA 폴리머라제를 사용하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 증폭된 목적 단편은 NotI로 소화한 후, 플라스미드 벡터 pBluescript의 NotI 부위에 삽입한다. 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 서열분석기(sequencer)로 확인하여, 바른 서열의 플라스미드를 선택한다. 이 플라스미드로부터 삽입단편을 NotI로 절단하고, 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 NotI 부위에 클로닝한다. 또 플라스미드 벡터를 매개로 하지 않고 NotI 부위에 직접 삽입하여,재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻는 것도 가능하다.

예를 들면, 재조합 센다이 바이러스 게놈 cDNA라면, 문헌의 기재방법에 준하여 구축할 수 있다(Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997). 예를 들면 먼저 NotI 제한부위를 갖는 18 bp의 스페이서 서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3')(서열번호:10)을, 클로닝된 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV(+))의 리더서열과 N 단백질의 ORF 사이에 삽입하여, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥(antigenomic strand) 유래의 자기개열 리보자임 부위를 포함하는 플라스미드 pSeV18⁺b(+)를 얻는다(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820).

더욱이, 예를 들면 M 유전자를 결손시키거나 또는 온도감수성 변이를 도입하는 경우, 게놈 RNA를 코드하는 cDNA를 제한효소로 소화하고, M 유전자를 포함하는 단편을 회수하여 적당한 플라스미드에 클로닝한다. M 유전자의 변이 또는 M 유전자 결손부위의 구축은 이 플라스미드 상에서 행한다. 변이 도입에는 예를 들면 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA) 등을 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. M 유전자의 결손 또는 결실을 위해서는, 예를 들면 PCR-라이게이션 방법(PCR-ligation method)의 조합으로 행하고, M 유전자의 ORF 전부 또는 일부를 결실시켜 적절히 적당한 스페이서 서열로 연결할 수 있다. M 유전자의 변이체 또는 결실체가 얻어지면, 이것을 포함하는 단편을 회수하여 원래의 전장 게놈 cDNA의 M 유전자와 치환함으로써, M 유전자에 변이를 갖는 바이러스 게놈 cDNA를 조제할 수 있다. 동일한 방법으로 예를 들면 F 및/또는 HN 유전자 등에 변이를 도입할 수 있다.

게놈 RNA를 코드하는 DNA를 상기 바이러스 단백질 존재하에서 세포내에서 전사시킴으로써, 본 발명의 벡터를 재구성할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 벡터 제조를 위한, 본 발명의 벡터의 바이러스 게놈 RNA를 코드하는 DNA를 제공한다. 또 본 발명은 본 발명의 벡터의 제조에 적용하기 위한, 상기 벡터의 게놈 RNA를 코드하는 DNA의 사용에 관한 것이다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 cDNA로부터의 바이러스의 재구성은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다(WO97/16539; WO97/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 이들 방법에 의해 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 바이러스 성분이 되는 RNP를 DNA로부터 재구성시킬 수 있다. 이들 방법에 준하여 본 발명의 벡터를 재구성시킬 수 있다.

구체적인 순서는 (a) 상기 파라믹소바이러스 게놈 RNA(네거티브 가닥 RNA)또는 그의 상보가닥(포지티브 가닥)을 코드하는 cDNA를, N, P 및 L 단백질을 발현하는 세포에서 전사시키는 공정, (b) 상기 세포 또는 그 배양상청으로부터 상기 게놈 RNA를 포함하는 복합체를 회수하는 공정에 의해 제조할 수 있다. 전사된 게놈 RNA는 N, L 및 P 단백질의 존재하에서 복제되어 RNP 복합체를 형성한다. 공정 (a)를 상기 게놈이 코드하는 개변 F 단백질을 개열하는 프로테아제의 존재하에서 실시함으로써, 형성된 RNP가 상기 세포에 접촉하는 세포로 전달되어, 감염이 확산되어 벡터가 증폭된다. 이 방법에 의해 기능적인 M 단백질이 존재하지 않더라도, RNP의 형태로 본 발명의 벡터를 제조할 수 있다.

DNA로부터의 최초의 게놈 RNA의 전사에 필요한 T7 RNA 폴리머라제 등의 효소는 이들 발현하는 플라스미드나 바이러스 벡터의 도입에 의해 실시할 수 있고, 또는 예를 들면 세포의 감염체에 이 유전자의 발현을 유도할 수 있도록 삽입해 두고, 바이러스 재구성시에 발현을 유도함으로써 공급하는 것도 가능하다. 또 게놈 RNA 및 벡터 재구성에 필요한 바이러스 단백질은, 예를 들면 이들을 발현하는 플라스미드의 도입에 의해 공급한다. 이들 바이러스 단백질의 공급에 있어서, 야생형 또는 어떤 종의 변이 파라믹소바이러스 등의 헬퍼 바이러스를 사용하는 것도 가능하지만, 이들 바이러스의 혼입을 초래하기 때문에 바람직하지 않다.

게놈 RNA를 발현하는 DNA를 세포내에 도입하는 방법에는, 예를 들면 다음과 같은 방법, ① 목적 세포에 의해 삽입될 수 있는 DNA 침전물을 만드는 방법, ② 목적 세포에 의한 삽입에 적합하고, 또 세포독성이 적은 양전하 특성을 갖는 DNA를 포함하는 복합체를 만드는 방법, ③ 목적 세포막에 DNA 분자가 빠져나올 수 있을만큼 충분한 구멍을 전기 펄스에 의해 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.

②로서는 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169) 등을 들 수 있다. ①로서는 예를 들면 인산칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의해 세포내에 들어간 DNA는 포식 소체(phagosome)에 삽입되지만, 핵내에도 충분한 양의 DNA가 들어가는 것이 알려져 있다(Graham, F. L. and Van Der Eb. J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223). 첸(Chen) 및 오카야마(Okayama)는 트랜스퍼 기술의 최적화를 검토하여, 1) 세포와 공침전물의 인큐베이션 조건을 2~4% CO₂, 35℃, 15~24시간, 2) DNA는 직쇄형상 보다 고리형상인 것이 활성이 높고, 3) 침전혼액 중의 DNA 농도가 20~30 ㎍/ml일 때 최적의 침전을 얻을 수 있다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). ②의 방법은 일시적인 트랜스펙션에 적합하다. 예전에는 DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885 M. W. 5×10⁵)혼액을 목적으로 하는 DNA 농도비로 조제하여, 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도좀(endosom) 속에서 분해되어 버리기 때문에, 효과를 높기이 위해 클로로퀸(chloroquine)을 가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). ③의 방법은 전기천공법(electroporation)으로 불리는 방법으로, 세포선택성이 없다고 하는 점에서 ①이나 ②의 방법에 비하여 범용성이 높다. 효율은 펄스전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 버퍼의 도전율, DNA 농도, 세포밀도의 최적 조건하에서 좋은 것으로 되어 있다.

이상, 3개의 카테고리 중에서 ②의 방법은 조작이 간편하여 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있기 때문에, 벡터 재구성을 위한 DNA 세포로의 도입에는 트랜스펙션시약이 적합하다. 적합하게는 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche, Cat No. 1811169)가 사용되지만 이들에 제한되지 않는다.

cDNA로부터의 바이러스 벡터의 재구성은 구체적으로는, 예를 들면 다음과 같이 하여 행할 수 있다.

24웰에서 6웰 정도의 플라스틱 플레이트 또는 100 mm 페트리접시 등에서, 10% 소태아혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/ml 페니실린 G 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)을 포함하는 최소 필수배지(MEM)를 사용하여 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2를 거의 100% 컨플루언트가 될 때까지 배양하여, 예를 들면 1 ㎍/ml 소랄렌 (psoralen) 존재하에서 UV 조사 처리를 20분간 처리하여 불활화(不活化)한 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 vTF7-3(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)을 2 PFU/세포로 감염시킨다. 소랄렌의 첨가량 및 UV 조사시간은 적절히 조정할 수 있다. 감염 1시간 후, 2~60 ㎍, 보다 바람직하게는 3~20 ㎍의 재조합 센다이 바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 DNA를, 바이러스 RNP의 생성에 필수인 트랜스에 작용하는 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드(0.5~24 ㎍의 pGEM-N, 0.25~12 ㎍의 pGEM-P 및 0.5~24 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)와 함께 Superfect(QIAGEN사)를 사용한 리포펙션법 등에 의해 트랜스펙션한다. N, P 및 L을 코드하는 발현 벡터의 양비는 2:1:2로 하는 것이 바람직하고, 플라스미드양은 예를 들면 1~4 ㎍의 pGEM-N, 0.5~2 ㎍의 pGEM-P 및 1~4 ㎍의 pGEM-L 정도로 적절히 조정한다.

트랜스펙션을 행한 세포는 목적에 따라 100 ㎍/ml의 리팜피신(Sigma) 및 시토신아라비노시드(AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/ml의 시토신아라비노시드(AraC)(Sigma)만을 포함하는 혈청 불함유 MEM에서 배양하여, 백시니아 바이러스에 의한 세포독성을 최소로 억제하여, 바이러스의 회수율을 최대로 하도록 약제의 최적농도를 설정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션으로부터 48~72시간 정도 배양한 후, 세포를 회수하여 동결 융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, RNP를 포함하는 파쇄물을 다시 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하여 배양한다. 트랜스펙션은 예를 들면 리포펙트아민이나 폴리 양이온성 리포좀 등과 함께 복합체를 형성시켜서 세포에 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169) 등을 들 수 있다. 엔도좀 중에서의 분해를 방지하기 위해 클로로퀸을 가하는 것도 가능하다(Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 3015). RNP가 도입된 세포에서는 RNP로부터의 바이러스 유전자의 발현 및 RNP의 복제 과정이 수행되어 벡터가 증폭된다. 얻어진 세포 용해물을 희석하여 재증폭을 반복함으로써, 백시니아 바이러스 vTF7-3는 완전히제거할 수 있다. 재증폭은 예를 들면 3회 반복한다. 얻어진 RNP는 -80℃에서 보존할 수 있다.

바이러스 벡터가 재구성되는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 센다이 바이러스 벡터 등의 재구성에 있어서는, 원숭이 신장 유래 LLC-MK2 세포 및 CV-1 세포, 햄스터 신장 유래의 BHK 세포 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 사용할 수 있다. 이들 세포에 적당한 엔벨로프 단백질을 발현시킴으로써, 그 단백질을 엔벨로프에 포함하는 감염성 바이러스 입자를 얻는 것도 가능하다.

바이러스 게놈 중의 M 유전자가 결손 또는 결실되어 있으면, 이 바이러스가 감염된 세포로부터는 바이러스 입자가 형성되지 않기 때문에, 상기와 같은 방법으로는 RNP 또는 RNP를 포함하는 세포로서 본 발명의 벡터를 조제할 수는 있어도, 바이러스 입자로서 벡터를 조제할 수는 없다. 또한, RNP의 트랜스펙션을 행한 후에는, 세포내에서 증식된 RNP는 접촉하고 있는 세포로만 전달되기 때문에 감염의 확대가 느려, 고역가의 바이러스 벡터를 대량으로 조제하는 것은 어렵다. 본 발명은 본 발명의 벡터를 바이러스 입자로서 생산하기 위한 방법을 제공한다. 바이러스 입자는 RNP에 비해 용액 중에서 안정하여, 추가로 감염성을 가지게 함으로써 트랜스펙션 시약 등을 필요로 하지 않고 세포에 접촉하는 것 만으로 벡터를 표적 세포에 도입할 수 있기 때문에, 산업상 이용에 특히 우수하다. 본 발명의 벡터를 바이러스 입자로서 생산하는 방법 중 하나는, 조건적 변이를 갖는 M 유전자를 갖는 바이러스 게놈을 사용하여, 허용 조건하에서 바이러스를 재구성시키는 방법이다. 즉, 상기의공정 (a), 또는 상기 공정 (a) 및 (b)에 의해 얻어진 복합체를 도입한 세포를 배양할 때, 허용 조건하에서 행함으로써 M 단백질을 기능시켜 입자를 형성시킬 수 있다. 조건적 변이를 갖는 M 변이 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 포함하는 바이러스 입자를 제조하는 방법은, (i) 상기 M 변이 단백질의 허용 조건하, 세포내에서 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정, 및 (ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다. 예를 들면, 온도감수성 변이 M 단백질이라면 허용 온도에서 배양한다.

또한, 본 발명의 벡터를 바이러스 입자로서 제조하는 또 하나의 방법은, M 단백질을 발현하는 헬퍼 세포를 사용하는 방법이다. 본 발명자 등은 M 헬퍼 세포를 사용함으로써 F 단백질의 개열부위가 다른 프로테아제로 절단되는 서열로 개변되어 있어, 추가로 M 유전자를 변이 또는 결실하는 벡터를 바이러스 입자로서 생산시켰다. 본 발명의 방법은 야생형 파라믹소바이러스 등의 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않기 때문에, M 유전자를 포함한 입자 형성능을 갖는 바이러스가 혼입되지 않아, 본 발명의 벡터를 순수하게 조제하는 것이 가능하다. 본 발명은 (i) 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자로서, (1) 상기 바이러스 입자가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고, (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며, (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 게놈 RNA를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 제공한다. 바람직한 태양에서는 이 바이러스 입자는 바이러스 입자를 생산하지 않는다.

기능적 M 단백질을 발현하는 세포 중에서 본 발명의 바이러스 입자를 제조하는 방법은,

(i) 파라믹소바이러스의 야생형 M 단백질 또는 그것과 동등한 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정,

(ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다. 야생형 M 단백질은 바이러스 입자를 형성시키는 활성을 갖는 한, 게놈 RNA와 다른 파라믹소바이러스에 유래하고 있어도 된다. 또한, 태그 펩티드(tag peptide) 등이 부가되어 있어도 되고, 적당한 발현 벡터로부터 발현될 때, 벡터 유래의 링커 펩티드가 부가되어 있어도 된다. 이와 같이 야생형 M 단백질 그 자체가 아니어도, 그것과 동등한 바이러스 입자 형성능을 갖는 단백질을 사용할 수 있다. M 발현 세포로부터 생산된 바이러스 입자는 이 세포에서 발현시킨 M 단백질을 엔벨로프에 포함하고 있지만, 이 단백질을 코드하는 유전자는 포함하고 있지 않다. 따라서, 이 바이러스가 감염된 세포에서는 이미 야생형 M 단백질은 발현하지 않아 바이러스 입자를 형성할 수 없다.

M 단백을 발현하는 헬퍼 세포의 제작은, 이하와 같이 행할 수 있다. 예를 들면 M 유전자의 유도적인 발현이 가능한 벡터를 구축하기 위해, 유도성 프로모터 또는 Cre/loxP 등의 재조합에 의한 발현제어계 등을 이용한다. Cre/loxP 유도형 발현 플라스미드의 구축에는 예를 들면, Cre DNA 리콤비나아제(recombinase)에 의해 유전자산물이 유도 발현되도록 설계된 플라스미드 pCALNdlw(Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121) 등을 이용할 수 있다. M 단백질을 발현할 수 있는 세포로서 M 유전자가 염색체에 삽입되어, 유도에 의해 M 단백질을 지속적으로 고발현 가능한 헬퍼 세포주를 수립하는 것이 바람직하다. 세포는 예를 들면 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2 세포 등을 사용할 수 있다. LLC-MK2 세포는 10%의 열처리한 부동화(不動化) 소태아혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨 50 단위/ml 및 스트렙토마이신 50 ㎍/ml를 첨가한 MEM에서 37℃, 5% CO₂로 배양한다. Cre DNA 리콤비나아제에 의해 M 유전자산물이 유도 발현되도록 설계된 상기 플라스미드를 인산칼슘법(mammalian transfection kit(Stratagene))에 의해 주지의 프로토콜에 따라 LLC-MK2 세포에 유전자 도입을 행한다.

예를 들면, 10 cm 플레이트를 사용하여 40% 컨플루언트까지 생육한 LLC-MK2 세포에 10 ㎍의 M 발현 플라스미드를 도입 후, 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서, 37℃의 5% CO₂인큐베이터 중에서 24시간 배양한다. 24시간 후에 세포를 떼어내 10 ml 배지에 현탁 후, 10 cm 샬레 5장을 사용하여, 5 ml 1장, 2 ml 2장, 0.2 ml 2장에 뿌려, G418(GIBCO-BRL)을 1200 ㎍/ml를 포함하는 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양을 행하여, 2일 마다 배지를 교환하면서 14일간 배양하여유전자의 안정도입주 선택을 행한다. 상기 배지로 생육해 온 G418에 내성을 나타내는 세포는 클로닝 링(cloning ring)을 사용하여 회수한다. 회수한 각 클론은 10 cm 플레이트에서 컨플루언트가 될 때까지 확대배양을 계속한다.

헬퍼 세포에 있어서 M 단백질이 고발현되는 것이 고역가 바이러스를 회수하기 위해서는 중요하다. 그를 위해서는, 예를 들면 상기의 M 발현 세포의 선택을 2회 또는 그 이상 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 어떤 약제 내성 마커 유전자를 갖는 M 발현 플라스미드를 트랜스펙션하고, 그 약제를 사용하여 M 유전자를 보유하는 세포를 선택 후, 별도의 약제 내성 마커 유전자를 갖는 M 발현 플라스미드를 다시, 이 세포에 트랜스펙션하여 이 별도의 약제 내성 마커에서 세포를 선택함으로써, 1회째 트랜스펙션에서 선택된 세포 보다도, M 단백질을 더 고발현할 수 있는 세포를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같이 2회의 트랜스펙션을 거쳐 구축된 M 헬퍼 세포를 적합하게 사용할 수 있다. M 헬퍼 세포는 동시에 F 유전자도 발현함으로써 F 및 M 유전자 양쪽을 결손하는 감염성 바이러스 입자를 생산시킬 수 있다(WO03/025570). 이 경우, F 유전자의 발현 플라스미드도 2회 이상 트랜스펙션하여 F 단백질의 발현 유도 레벨을 보다 높이는 것이 바람직하다. F 유전자로서는 본 명세서에 기재한 바와 같은 개변 F 단백질의 유전자를 사용할 수 있다.

M 단백질의 발현 유도는 세포를 6 cm 샬레에서 컨플루언트까지 생육시킨 후, 예를 들면 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821(1995); Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121(1998))에 의해 바람직하게는 moi=3 정도에서 감염시켜서 행한다.

야생형 M 단백질 또는 그것과 동등한 단백질을 발현하는 세포(M 헬퍼 세포)를 사용하여 본 발명의 바이러스 입자를 생산시키기 위해서는, 이 세포에 상술한 본 발명의 RNP를 도입하여 배양하면 된다. RNP의 도입은 예를 들면 RNP를 포함하는 세포 용해물 등을 M 헬퍼 세포에 트랜스펙션해도 되고, 또는 RNP를 생산하는 세포와 M 헬퍼 세포를 공배양하는 것으로도 세포 융합에 의해 M 헬퍼 세포에 RNP를 도입할 수 있다. 또는, M 헬퍼 세포내에서 게놈 RNA를 전사시켜 N, P 및 L 단백질의 존재하에서 RNP를 신규하게 형성시켜도 된다.

본 발명에 있어서는, 상기의 공정 (i)(M 헬퍼 세포에서 RNP를 증폭시키는 공정)를 저온에서 행하는 것이 바람직하다. 온도감수성 변이 M 단백질을 사용한 벡터 생산에서는, 바이러스 입자 생산과정을 허용온도 이하에서 행하는 것이 필요하지만, 놀랍게도 야생형 M 단백질을 사용한 방법에 있어서도, 바이러스 입자를 형성시키는 과정을 저온에서 행함으로써 효율적인 입자 형성을 행하게 하는 것이 가능한 것이 판명되었다. 저온이란 구체적으로는 35℃ 이하, 보다 바람직하게는 34℃ 이하, 더욱 바람직하게는 33℃ 이하, 가장 바람직하게는 32℃ 또는 그 이하이다.

본 발명의 방법에 의하면 본 발명의 바이러스 입자는 예를 들면 1×10⁵CIU/mL 이상, 바람직하게는 1×10⁶CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁶CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×10⁷CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁷CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×10⁸CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁸CIU/mL 이상의 역가로 바이러스 생산세포의 세포외액 중으로 방출시키는 것이 가능하다. 바이러스의 역가는 본 명세서 및 그 밖에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다(Kiyotani, K. et al., Virology 177(1), 65-74(1990); WO00/70070).

M 결실형 바이러스 게놈 cDNA로부터 재조합 바이러스 벡터를 재구성시키기 위한 보다 바람직한 한 태양으로서는 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, (a) 게놈 RNA(포지티브 가닥이어도 네거티브 가닥이어도 된다)을 코드하는 DNA를, 감염성 바이러스 입자의 형성에 필요한 바이러스 단백질군(즉 NP, P, L, M, F 및 HN 단백질)을 발현하는 세포에서 전사시키는 공정, (b) 상기 세포와, 염색체에 삽입된 M 유전자가 발현되는 세포(M 헬퍼 세포)를 공배양하는 공정, (c) 상기 배양으로부터 세포 추출물을 조제하는 공정, (d) 상기 추출물을 염색체에 삽입된 M 유전자가 발현되는 세포(M 헬퍼 세포)에 트랜스펙션하여 배양하는 공정 및 (e) 상기 배양상청으로부터 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다. 공정 (d)는 상기의 저온조건에서 행하는 것이 바람직하다. 얻어진 바이러스 입자는 다시 M 헬퍼 세포에 감염시켜(바람직하게는 저온에서) 증폭할 수 있다. 구체적으로는, 실시예의 기재에 따라 바이러스를 재구성시킬 수 있다. 회수한 바이러스 입자는 희석 후, 다시 M 헬퍼 세포에 감염시켜 증폭할 수 있다. 이 증폭과정은 예를 들면 2회 또는 3회 또는 그 이상 행할 수 있다. 얻어진 바이러스 주는 -80℃에서 보존할 수 있다. 바이러스 역가는 적혈구 응집활성(HA)를 측정함으로써 결정할 수 있다. HA는 「endo-point 희석법」에 의해 결정할 수 있다.

구체적으로는, 먼저 LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 100 mm 샬레에 뿌린다. T7 RNA 폴리머라제에 의해 게놈 RNA의 전사를 행하게 하는 경우에는, 세포 배양 24시간 후, 소랄렌(psoralen)과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(PLWUV-VacT7: Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))를 MOI 2 정도에서 실온에서 1시간 감염시킨다. 세포를 무혈청의 MEM으로 세정한 후, 게놈 RNA를 발현하는 플라스미드 및 파라믹소바이러스의 각각 N, P, L, F 및 HN 단백질을 발현하는 발현 플라스미드를 적당한 리포펙션시약을 사용하여 이 세포에 트랜스펙션한다. 플라스미드의 양비는 예를 들면 순서대로 6:2:1:2:2:2로 할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 5시간 배양한 후 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 2회 세정하여, 40 ㎍/mL의 시토신 β-D-아라비노후라노시드(Cytosine β-D-arabinofuranoside)(AraC: Sigma, St. Louis, MO) 및 7.5 ㎍/mL의 트립신(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 MEM에서 배양한다. 24시간 배양 후, 약 8.5×10⁶cells/dish당 M 단백을 지속 발현하는 세포(M 헬퍼 세포)를 중층(重層)하여, 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 추가로 2일간 37℃로 배양한다(P0). 이들 세포를 회수하여 펠릿을 2 mL/dish당 Opti-MEM에 현탁한다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 용해질(lysate)을 그대로 M 헬퍼 세포에 트랜스펙션하여, 40 ㎍/mL의 AraC 및 F 단백질을 개열할 수 있는 프로테아제를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양한다(P1). 3~14일 후 배양상청의 일부를 취하여 새롭게 조제한 M 헬퍼 세포에 감염시키고, 40 ㎍/mL의 AraC 및 상기 프로테아제를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양한다(P2). 3~14일 후에 새롭게 조제한 M 헬퍼 세포에 다시 감염시키고, 상기 프로테아제의 존재하(F 개열형 바이러스를 조제하는 경우) 또는 비존재하(F 비개열형 바이러스 입자를 조제하는 경우), 혈청을 포함하지 않는 MEM을 32℃에서 3~7일간 배양한다(P3). 이와 같이 재증폭을 3회 이상 반복함으로써, 처음에 사용한 백시니아 바이러스는 완전히 제거할 수 있다. 회수한 배양상청에 최종농도 1%가 되도록 BSA를 첨가하여 -80℃에서 보존한다.

본 발명의 바이러스 입자는 바이러스 입자가 갖는 개변 F 단백질이 개열된 감염성을 갖는 입자, 또는 그 자체로는 감염성을 갖지 않지만, 상기 개변 F 단백질을 개열하는 프로테아제의 처리에 의해 감염성을 나타내는 잠재적 감염능을 갖는 바이러스 입자여도 된다. 바이러스 입자의 엔벨로프에는 게놈이 코드하는 개변 F 단백질이 존재하고 있지만, 상기 단백질이 개열되어 있지 않은 경우에는 그 자체로는 감염성을 갖지 않는다. 이러한 바이러스는 이 개변 F 단백질의 개열서열을 절단할 수 있는 프로테아제로 처리하거나, 또는 상기 프로테아제의 존재하에서 세포 또는 조직에 접촉시킴으로써, 상기 F 단백질이 개열되어 감염성을 획득한다. 개변 F 단백질이 개열되어 있지 않은 바이러스 입자를 얻기 위해서는, 상기의 바이러스 생산세포에 있어서 바이러스를 제조할 때, 그 최종단계에 있어서의 바이러스 증폭을 개변 F 단백질을 개열하는 프로테아제의 비존재하에서 행함으로써 실시할 수 있다. 반대로 상기 프로테아제의 존재하에서 바이러스를 조제함으로써 F 단백질이 개열된 감염성 바이러스 입자를 조제할 수 있다.

또 바이러스 입자의 제조과정에 있어서, 세포에 있어서 바이러스 게놈이 코드하고 있지 않은 엔벨로프 단백질을 발현시켜, 이 단백질을 엔벨로프에 포함하는 바이러스 입자를 생산시킬 수 있다. 이러한 엔벨로프 단백질로서는 예를 들면 야생형 F 단백질을 들 수 있다. 이와 같이 하여 생산한 바이러스 입자는, 게놈 RNA에는 개변 F 단백질을 코드하고 있지만, 엔벨로프에는 이 단백질에 더하여 야생형 F 단백질도 갖는다. 바이러스 입자의 제조단계에 있어서 야생형 F 단백질을 트랜스에 공급하여, 이것을 개열하는 트립신 존재하에서 증폭시킴으로써, 바이러스 입자의 야생형 F 단백질을 개열하여 감염성을 획득시킬 수 있다. 이 방법에 의하면, 개변 F 단백질을 개열하는 프로테아제를 사용하지 않아도 감염성 바이러스 입자를 고역가로 조제하는 것이 가능해진다. 이와 같이 본 발명의 바이러스 입자로서는 파라믹소바이러스의 야생형 F 단백질을 포함하는 바이러스 입자여도 된다. 야생형 F 단백질은 바이러스 게놈과 동일 종에 유래하지 않아도, 다른 파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백질이어도 된다.

또 야생형 F 단백질이 아니어도, 목적으로 하는 바이러스 엔벨로프 단백질을 엔벨로프에 갖는 바이러스 입자를 제작해도 된다. 즉 바이러스 재구성시에, 목적으로 하는 엔벨로프 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 이 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 단백질에 특별히 제한은 없다. 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질(VSV-G) 등은 적합하다. 본 발명의 바이러스 입자에는 VSV-G 단백질 등과 같이, 게놈 RNA가 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 포함하는 위형(pseudotype) 바이러스 벡터가포함된다. 이 경우도 상기 야생형 F 단백질의 경우와 마찬가지로, 바이러스의 게놈 RNA에는 이 엔벨로프 단백질은 코드되지 않기 때문에, 바이러스 입자가 세포에 감염된 후에는, 바이러스 벡터로부터 이 단백질이 발현되는 경우는 없다.

또한, 본 발명의 바이러스 입자는 예를 들면 엔벨로프 표면에 특정 세포에 접착할 수 있는 접착인자, 리간드, 수용체 등의 단백질, 항체 또는 그의 단편, 또는 이들 단백질을 세포외영역에 갖고, 바이러스 엔벨로프 유래의 폴리펩티드를 세포내영역에 갖는 키메라 단백질 등을 포함하는 것이어도 된다. 이것에 의해, 특정 조직을 표적으로 하여 감염하는 벡터를 만들어 내는 것도 가능하다. 이들은 바이러스 벡터의 재구성시에 세포내에서 발현시킴으로써 트랜스에 공급할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 사이토카인 등의 가용성 인자의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편, 또는 세포 표면 단백질에 대한 항체 단편 등을 들 수 있다(WO01/20989).

또한, 바이러스 유전자 결손형 벡터를 조제하는 경우, 예를 들면 벡터에 포함되는 바이러스 게놈 상에서 결손되어 있는 바이러스 유전자가 상이한 2종류 또는 그 이상의 벡터를 동일한 세포에 도입하면, 각각에서 결손되는 바이러스 단백질이 다른 벡터로부터의 발현에 의해 공급되기 때문에, 서로 상보하여 감염력이 있는 바이러스 입자가 형성되어, 복제 사이클이 돌아 바이러스 벡터가 증폭된다. 즉, 2종류 또는 그 이상의 본 발명의 벡터를 바이러스 단백질을 상보하는 조합으로 접종하면, 각각의 바이러스 유전자 결손형 바이러스 벡터의 혼합물을 대량으로 또한 저비용으로 생산할 수 있다. 이들 바이러스는 바이러스 유전자가 결손되어 있기 때문에, 바이러스 유전자를 결손하고 있지 않은 바이러스 비해 게놈 사이즈가 작아져,사이즈가 큰 외래유전자를 보유할 수 있다. 또한, 바이러스 유전자의 결손에 의해 증식성이 없는 이들 바이러스는 세포외에서 희석되어 공감염의 유지가 곤란하여, 불임화(sterile) 하기 때문에 환경방출 관리상의 이점이 있다.

또한, 대량으로 바이러스 벡터를 얻기 위해, 상기 방법으로 얻어진 바이러스 벡터를 발육계란에 감염시켜, 상기 벡터를 증폭할 수 있을 가능성도 있다. 예를 들면 닭을 사용하여 M 유전자의 트랜스제닉체를 제작하고, 이 계란에 벡터를 접종하여 증폭시키면 된다. 계란을 사용한 바이러스 벡터의 제조의 기본적인 방법은 이미 개발되어 있다(나카니시 등 편(1993), 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 III, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오사카, pp.153-172). 구체적으로는 예를 들면, 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여 배(embryo)를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 요막강(allantoic membrane cavity)으로 접종하고, 수일간 알을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은 증폭시키는 재조합 바이러스에 의해 변할 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 요액을 회수한다. 요액으로부터의 바이러스 벡터의 분리 ·정제는 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다(다치요 마비토「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마 감수, 메디컬뷰사, pp.68-73(1995)).

회수한 바이러스 벡터는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 필트레이션(여과), 원심분리 및 칼럼정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란 바이러스 벡터가 그것이 존재하는 시료 중의 성분으로서 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 전형적으로는 실질적으로 순수한 바이러스 벡터는 시료 중에 포함되는 전체 단백질(total protein)(단 캐리어나 안정제로서 가한 단백질은 제외한다) 중, 바이러스 벡터 유래의 단백질 비율이 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지함으로써 확인할 수 있다. 파라믹소바이러스의 구체적인 정제방법으로서는 예를 들면 셀룰로오스 황산 에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산 에스테르를 사용하는 방법(일본국 특허공고 제(소)62-30752호 공보, 일본국 특허공고 제(소)62-33879호 공보 및 일본국 특허공고 제(소)62-30753호 공보) 및 푸코오스(fucose) 황산 함유 다당 및/또는 그 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있다.

F 개열부위가 개변된 M 유전자 결실형 벡터는 특정 프로테아제가 존재하는 환경하에서만, 세포융합형 감염에 의해 벡터를 세포 사이에 전달한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 어떤 프로테아제를 발현하는 조직을 표적으로 한 유전자치료에 유용하다. 통상의 벡터에서는 표적 조직의 표층에 유전자 도입하는 것은 가능해도, 조직 내부에까지 벡터를 침투시키는 것은 어렵다. 그러나 본 발명의 벡터는, 표적으로 하는 프로테아제 활성이 항진하고 있는 조직내에 벡터를 깊게 침윤시키는 능력을 가지고 있다. 예를 들면 정상 조직의 심부까지 침윤된 암세포에 대해서도, 본 발명의 벡터를 사용함으로써 암세포의 일부 벡터의 감염 가능한 표층부분에 그 벡터를 감염시킴으로써, 표적 세포의 내부까지 벡터를 전달하는 것이 가능하다.

질환으로의 적용으로서는, 암, 동맥경화 및 만성 관절 류머티스(RA)를 비롯한 관절질환 등을 들 수 있다. 예를 들면 RA 등의 관절질환에서는 상기와 같이 세포외 매트릭스 분해에 의한 연골 고차구조의 붕괴가 진행되어 관절이 파괴된다. 본 발명의 벡터에 의해 ECM 분해효소 활성이 항진된 세포를 제거함으로써, 관절 파괴를 저하시키는 것이 기대된다. 또한, 동맥경화에 있어서는 대식세포(macrophage) 유래 포말(foam)세포의 집적(accumulation)이 진행된다. 포말세포는 메탈로프로테아제를 대량으로 분비하여, 그 결과 섬유성 비후(hyperplasia)를 파괴하여 플라크 파탄(plaque breakdown)을 일으킨다. 본 발명의 벡터를 사용하여 MMP를 발현하는 대식세포를 죽임으로써, 이러한 동맥경화의 치료를 행하는 것이 가능한 것으로 생각된다. 또 후술하는 바와 같이, 암에 있어서는 여러 프로테아제가 활성화되어 있다. 본 발명의 벡터는 암 특이적으로 감염·침윤하는 치료 벡터로서 유용하다.

벡터를 포함하는 조성물의 제조에 있어서는, 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 목적으로 하는 담체 또는 매체와 조합할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체 또는 매체」란 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하여, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 예를 들면 벡터를 생리식염수나 인산완충 생리식염수(PBS) 등으로 적절히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 벡터를 계란에서 증식시킨 경우 등에 있어서는 요액을 포함해도 된다. 또 벡터를 포함하는 조성물은 탈이온수, 5% 덱스트로오스 수용액 등의 담체 또는 매체를 포함하고 있어도 된다. 더욱이, 그 밖에도 식물유, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 또한 보존제나 그 밖의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 시약으로서 및 의약으로서 유용하다.

벡터의 투여량은 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 투여조성물의 형태, 투여방법, 도입 유전자 등에 따라 다르지만, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 투여되는 벡터량은 바람직하게는 약 10⁵CIU/ml에서 약 10¹¹CIU/ml, 보다 바람직하게는 약 10⁷CIU/ml 에서 약 10⁹CIU/ml, 가장 바람직하게는 1×10⁸CIU/ml에서 5×10⁸CIU/ml 범위 내의 양을 약학상 허용 가능한 담체 중에서 투여하는 것이 바람직하다. 암조직 등에 투여하는 경우, 벡터의 투여는 표적 부위에 균등하게 골고루 가도록 복수 개소에 투여할 수 있다. 인간에 있어서는 1회당 투여량은 2×10⁵CIU~2×10¹⁰CIU가 바람직하고, 투여횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하며, 1일 투여횟수에 대해서도 동일하다. 인간 이외의 동물에 있어서도, 예를 들면 목적 동물과 인간과의 체중비 또는 투여 표적부위의 용적비(예를 들면 평균값)로 상기 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 투여대상으로서는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개 등 모든 포유동물이 포함된다.

특히 본 발명의 벡터는 암의 치료에 유용하다. 본 발명의 벡터가 감염시킨 세포에서는 프로테아제 존재하에서 세포융합에 의해 신시티움을 형성시킨다. 이 성질을 이용하여 본 발명의 벡터를 특정 프로테아제의 활성이 항진되어 있는 암의 치료에 사용하는 것이 가능하다. 본 발명은 암에서 활성이 항진하는 프로테아제에 의해 개열되는 F 단백질을 코드하는 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를포함하는 암의 치료조성물을 제공한다. 또 본 발명은 상기 벡터의 치료 조성물의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또 본 발명은 상기 벡터를 암에 투여하는 공정을 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다. 침윤 전이되는 악성 암에서는 ECM 분해효소의 활성이 항진되고 있기 때문에, ECM 분해효소에 의해 개열되는 F 단백질 유전자를 갖는 백터를 사용하면, 악성 암에 특이적으로 벡터를 감염시켜 암조직을 사멸시킬 수 있다.

벡터에는 외래유전자를 탑재시킬 수 있다. 외래유전자는 벡터의 감염을 모니터하기 위한 마커 유전자여도 되고, 또는 암의 치료용 유전자를 사용해도 된다. 치료용 유전자로서는, 예를 들면 세포자멸사(apoptosis) 등의 세포 유도성 유전자, 세포독성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자, 사이토카인, 호르몬, 기타를 들 수 있다. 본 발명의 벡터는 암으로의 직접(in vivo)투여 및 환자 유래 세포 또는 그 이외의 세포에 본 발명의 벡터를 도입하고, 그 세포를 암에 주입하는 간접(ex vivo)투여에 의해 암에 투여할 수 있다.

대상이 되는 암은 특정 프로테아제 활성이 항진하는 목적으로 하는 암이어도 되고, 암종으로서는 대부분의 침윤 전이되는 악성 종양(폐암, 위암, 대장암, 식도암, 유방암)을 들 수 있다. 그러나, 악성 암에 있어서도 MMP, uPA, tPA 등의 프로테아제의 발현이 낮은 것도 있기 때문에, 프로테아제 활성의 항진 유무에 따라 적용을 판단한다. 식도암에 있어서의 점막 하층으로의 침윤암, 대장암에 있어서의 고유근층으로의 III, IV기의 진행암이나, 침윤성 흑색종(melanoma)이 심부에 집입한 외과적으로 잘라낼 수 없는 암으로의 적용에, 본 발명의 벡터는 특히 우수하다.

도면의 간단한 설명

도 1은 M 유전자에 온도감수성 변이를 도입한 F 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축 스킴(scheme)을 나타내는 도면이다.

도 2는 M 유전자로의 온도감수성 변이 도입에 의한 2차 방출 입자 억제를 목적으로 구축한 바이러스 유전자 및 그의 변이 도입 효과를 비교 검토하기 위해 구축했거나 또는 사용한 바이러스 유전자의 구조를 나타내는 도면이다.

도 3은 SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/A)에 감염시켜, 각각 32℃ 및 37℃에서 6일간 배양한 후의 GFP 발현을 나타내는 현미경상을 나타내는 사진이다.

도 4는 SeV-F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/A)에 대해서, 32℃ 또는 37℃로 트립신 및 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 배양하여 경시적으로 F 단백의 발현량을 웨스턴 블롯팅(Western-blotting)으로 반정량적으로 관측한 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 LLC-MK2 세포에 SeV18+GFP, SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜 32℃, 37℃ 또는 38℃에서 배양하여 3일 후의 GFP 발현을 나타내는 현미경상을 나타내는 사진이다.

도 6은 LLC-MK2 세포에 SeV18+GFP, SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜 32℃, 37℃ 또는 38℃에서 배양하여 경시적으로 샘플링(동시에 새로운 배지로 교환)한 배양상청의 적혈구 응집활성(HA)을 나타내는 도면이다.

도 7은 LLC-MK2 세포에 SeV18+GFP, SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜 37℃에서 배양 2일 후의 배양상청 및 세포를 회수하여, 1레인당 6웰 플레이트 배양 1웰 분량의 1/10 상당량을 사용하여, 항M 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 구한, 세포내와 바이러스 유사 입자(VLP) 사이의 M 단백의 존재비율을 나타내는 사진이다.

도 8은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 배양 12, 18, 24, 50, 120시간 후에 샘플링한 배양상청을 사용하여 측정한 SEAP 활성을 나타내는 도면이다.

도 9는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 배양 24, 50, 120시간 후에 샘플링한 배양상청의 HA 활성을 나타내는 도면이다.

도 10은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 배양 5일 후에 샘플링한 배양상청에 대해서 원심한 후 바이러스를 회수하여, 1레인당 6웰 플레이트 배양 1웰 분량의 1/10 상당량을 사용하여, 항M 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 구한 바이러스 유사 입자량을 나타내는 사진이다.

도 11은 LLC-MK2, BEAS-2B 또는 CV-1 세포에 SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10에서 감염시켜, 혈청을 포함하지 않거나 또는 10% FBS를 포함하는 배지에서 배양하고, 혈청을 포함하지 않는 배지의 경우는 감염 3일 후에, 10% FBS를 포함하는 배지의 경우는 감염6일 후에, 배지 중에 방출된 LDH양으로부터 견적을 낸 세포장해성(cytotoxicity)을 나타내는 도면이다. 동일한 세포수의 세포를 세포변성체(Triton)를 사용해서 100% 용해(lysis)했을 때의 값을 100%로 한 상대값으로 나타내었다.

도 12는 LLC-MK2 세포에 SeV18+GFP, SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 1에서 감염시켜 32℃, 37℃ 또는 38℃에서 배양하고, 배양 2일 후에 항M 항체를 이용하여 면역염색을 행함으로써 구한 M 단백의 세포내 국재를 나타내는 사진이다.

도 13은 A-10 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 1에서 감염시켜 32℃ 또는 37℃에서 배양하고, 10% 혈청을 포함하는 배지에서 배양 1일 후에 항M 항체 및 항HN 항체를 이용하여 면역염색을 행하고, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰한 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재를 나타내는 사진이다. 스테레오 입체화상으로 나타내었다.

도 14는 A-10 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 1에서 감염시켜 32℃ 또는 37℃에서 배양하고, 10% 혈청을 포함하는 배지에서 배양 2일 후에 항M 항체 및 항HN 항체를 이용하여 면역염색을 행하고, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰한 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재를 나타내는 사진이다. 스테레오 입체화상으로 나타내었다.

도 15는 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재에 미치는 미소관 탈중합시약의 효과를 나타내는 사진이다. A-10 세포에 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 1에서 감염시킨 직후에, 미소관의 탈중합시약인 콜히친(colchicine) 또는 콜세미드(colcemide)를 최종농도 1 μM이 되도록 첨가하여 32℃에서 배양하였다. 10% 혈청을 포함하는 배지에서 배양 2일 후에 항M 항체 및 항HN 항체를 이용하여 면역염색을 행하고, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰한 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재를 관찰하였다. 스테레오 입체화상으로 나타내었다.

도 16은 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재에 미치는 미소관 탈중합시약의 효과를 나타내는 사진이다. A-10 세포에 SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 m.o.i. 1에서 감염시킨 직후에, 미소관의 탈중합시약인 콜히친을 최종농도 1 μM이 되도록 첨가하여 32℃ 또는 37℃에서 배양하였다. 10% 혈청을 포함하는 배지에서 배양 2일 후에 항M 항체 및 항HN 항체를 이용하여 면역염색을 행하고, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 관찰한 M 단백 및 HN 단백의 세포내 국재를 관찰하였다. 스테레오 입체화상으로 나타내었다.

도 17은 EGFP 유전자를 갖는 M 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축 스킴을 나타내는 도면이다.

도 18은 F 및 M 양쪽 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축 스킴을 나타내는 도면이다.

도 19는 구축한 F 및/또는 M 결실형 SeV 유전자의 구조를 나타내는 도면이다.

도 20은 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자를 갖는 M 유전자 발현 플라스미드의 구축 스킴을 나타내는 도면이다.

도 21은 클로닝한 M(및 F) 단백을 유도 발현하는 세포에 대해서, Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AcCANCre)를 감염시킨 후, 웨스턴 블롯팅에 의한 M 및 F 단백의 반정량적인 발현 비교를 나타내는 사진이다.

도 22는 헬퍼 세포(LLC-MK2/F7/M) 클론 #18 및 #62를 사용한 M 결실형 SeV(SeV18+/△M-GFP)의 바이러스 재구성을 나타내는 사진이다.

도 23은 SeV18+/△M-GFP의 바이러스 생산성(CIU와 HAU의 경시변화)을 나타내는 도면이다.

도 24는 SeV18+/△M-GFP의 비리온 중의 유전자구조 확인을 위한 RT-PCR의 결과를 나타내는 사진 및 도면이다.

도 25는 SeV18+/△M-GFP의 바이러스 구조를 단백의 시점에서 확인하기 위해, LLC-MK2 세포에 감염시킨 후의 세포 및 배양상청 중의 바이러스 단백에 대해 웨스턴 블롯팅을 행하여, SeV18+GFP 및 SeV18+/△F-GFP와의 비교결과를 나타내는 사진이다.

도 26은 SeV18+/△M-GFP 및 SeV18+/△F-GFP 감염 LLC-MK2 세포 배양상청 중의 바이러스 유래 단백의 정량비교(희석계열을 제작하여 웨스턴 블롯팅)를 나타내는 사진이다. 항SeV 항체(DN-1)를 사용하였다.

도 27은 SeV18+/△M-GFP 또는 SeV18+/△F-GFP를 LLC-MK2에 m.o.i. 3에서 감염시켜, 경시적으로 회수한 배양상청 중의 HA 활성을 나타내는 도면이다.

도 28은 SeV18+/△M-GFP 또는 SeV18+/△F-GFP를 LLC-MK2에 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 5일 후의 형광현미경상을 나타내는 사진이다.

도 29는 SeV18+/△M-GFP 또는 SeV18+/△F-GFP를 LLC-MK2에 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 5일 후에 회수한 배양상청에 대해 양이온성 리포좀(Dosper)을 사용하여 LLC-MK2에 트랜스펙션한 2일 후의 형광현미경상을 나타내는 사진이다.

도 30은 F1/F2의 개열부위(F 단백질의 활성화부위)의 아미노산서열의 디자인을 나타내는 도면이다. 암세포에서 고발현하고 있는 프로테아제(MMP 또는 uPA)의 인식서열을 합성기질의 서열을 토대로 디자인하였다. 위에서부터 순서대로 서열번호:40~44.

도 31은 F의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV 벡터의 cDNA 구축 스킴을 나타내는 도면이다.

도면 32는 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터에 의한 프로테아제 의존적 세포융합형 감염을 나타내는 사진이다.

LLC-MK2를 사용하여 F의 개변에 의해 그 프로테아제 의존적으로 세포융합형 감염이 성립되어 있는지를 확인하였다. SeV/△M-GFP(A, B, C, J, K, L), SeV/F(MMP#2)△M-GFP(D, E, F, M, N, O), SeV/F(uPA)△M-GFP(G, H, I, P, O, R)의 각 M 결실형 SeV를 세포에 감염시키고, 동시에 0.1 ㎍/ml 콜라게나아제(Clostridium)(B, E, H), MMP2(C, F, I), MMP9(J, M, P), uPA(K, N, Q), 7.5 ㎍/ml 트립신(L, Q, R)을 가하였다. 4일 후, 형광현미경으로 관찰하였다. F를 개변하지 않은 SeV/△M-GFP는 트립신을 가한 LLC-MK2에서만 감염된 세포의 주위 세포와 세포융합을 일으켜 세포융합형 감염이 보이고, 다핵세포인 신시티움(synthitium)을 형성하였다(L). MMP 분해서열을 F에 삽입한 SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 콜라게나아제, MMP2, MMP9를 가한 LLC-MK2에서 세포융합형 감염이 보이고, 다핵세포인 신시티움을형성하였다(E, F, M). 한편, 우로키나아제형 플라스미노겐 활성제(urokinase-type plasminogen activator(uPA), 조직형(tissue-type) PA(tPA) 분해서열을 F에 삽입한 SeV/F(uPA)△M-GFP에서는 트립신에서 세포융합형 감염이 보이고, 추가로 개변함으로써 uPA에서 다핵세포인 신시티움을 형성하였다(Q, R).

도 33은 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터에 의한 암세포의 프로테아제 의존적 세포융합형 감염을 나타내는 사진이다.

MMP 발현 암세포주인 HT1080(A, D, G), tPA 발현주인 MKN28(B, E, H), 어느쪽 프로테아제도 발현하지 않은 세포주 SW620(C, F, I)을 사용하여 내재성 프로테아제 선택적으로 세포융합형 감염이 보이는지 여부의 실험을 행하였다. HT1080에서는 SeV/F(MMP#2)△M-GFP만이 10배 이상 그 감염이 확산되어 있고(D), tPA 발현주 MKN28에서는 SeV/F(uPA)△M-GFP만이 세포융합형 감염의 확산이 보인다(H). 어느쪽 프로테아제의 발현도 없는 SW620에서는 감염의 확산은 전혀 보이지 않는다.

도 34는 포오볼 에스테르(Phorbol Ester)에 의한 MMP 유도와 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터의 세포융합형 감염의 유도를 나타내는 사진이다.

MMP2, 9의 발현을 젤라틴(gelatin) 분해활성이 있는 부분이 깨끗이 제거되는 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)법에 의해 확인하였다(A). 레인 C가 대조(control), T가 20 nM PMA에 의해 유도된 상등액을 사용한 것으로, HT1080과 Panc I에서 MMP9의 밴드가 확인되어, MMP9가 유도되어 있는 것을 알 수 있다. MMP2는 Panc I에서 유도 전에 잠재형(latent) MMP2가 검출되고 있지만 그것은 잠재형이기 때문에 활성이 거의 없다. B가 나타내는 바와 같이, SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 MMP9유도에 의해 세포융합형 감염이 보이는 것이 나타내어졌다.

도 35는 in vivo에 있어서의 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터의 세포융합형 감염을 나타내는 사진이다.

HT1080의 담암(carcinoma-bearing) 누드 마우스를 제작하였다. 피하에 주사 후, 7~9일 후에 장경(長徑)이 3 mm를 초과한 개체를 사용하였다. 50 ㎕의 SeV를 한번만 주입하였다. 2일 후, 형광현미경으로 관찰하였다. A, D, G, J가 명시야(明視野), B, E, H, K가 그것에 대응하는 GFP의 형광상, C, F, I, L은 그의 확대상이다. SeV-GFP, SeV/△M-GFP는 주입한 주변에만 형광이 보이는 것을 확인할 수 있다(패널 E, H). 그것에 대해 SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 암 전체로 확산되는 것이 관찰되었다(패널 K). 확대한 것에서는 SeV-GFP, SeV/△M-GFP가 세포 하나 하나의 형광이 확인되는 것에 대해, SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 세포의 형태가 선명하지 않아 세포융합하고 있는 것이 시사되었다.

도 36은 in vivo에 있어서의 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터의 세포융합형 감염을 나타내는 도면이다. 도 35의 사진상에 있어서의 GFP의 암 전체에 대한 비율을 NIH image에 의해 면적으로부터 측정하였다. 그 결과, 도면에 나타내는 바와 같이 SeV-GFP가 10%, SeV/△M-GFP가 20%인 것에 대해 SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 90%의 감염이 보여, 명확한 감염의 확산이 확인되었다.

도 37은 담암 누드 마우스에 의한 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 항종양효과를 나타내는 도면이다. 도 35의 종양체적의 크기를 계측하였다. 3 mm 이상으로 발달한 암에 4군의 SeV를 주입하였다. 2일 후, 재주입하여 암의 크기를 계측하였다. PBS,SeV-GFP, SeV/△M-GFP는 급속히 암이 커지는 것에 대해, 도 36에서 나타낸 바와 같인 암 전체에 확산되어 있던 SeV/F(MMP#2)△M-GFP를 주입한 암은 명확히 증식하지 않고 작은 그대로였다. t검정에 의해 P<0.05에서 유의하게 다른 3군과 비교하여 항암효과가 보였다.

도 38은 F 비개열형 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 암세포로의 프로테아제 발현 선택적 감염을 나타내는 사진이다.

MMP 발현주 HT1080, tPA 발현주 MKN28, 프로테아제를 거의 발현하고 있지 않은 SW620에서, 프로테아제 발현에 의한 선택적 감염의 가능 여부를 조사하였다. SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 MMP 발현주 HT1080에서 감염이 보이지만, tPA 발현주 MKN28에서는 감염이 보이지 않는다. SeV/F(uPA)△M-GFP는 tPA 발현주 MKN28에서는 감염이 보이지만, MMP 발현주 HT1080에서는 감염이 보이지 않는다.

도 39는 F 비개열 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 섬유모세포(fibroblast)에 의한 MMP3, 7의 유도에 의한 감염능의 획득을 나타내는 사진이다.

SW480 및 WiDr을 사용하여 in vitro에서 섬유모세포에 의한 MMP의 유도로 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 감염이 변화되는지 여부를 조사하였다. SW480, WiDr 모두 인간 섬유모세포(human fibroblast:hFB)를 공배양(co-culture)함으로써, SeV/F(MMP#2)△M-GFP가 감염되게 되었다(B, D). 유도가 일어나지 않은 SW620에서는 그 현상은 보이지 않는다(F).

도 40은 인간 대동맥 평활근세포로의 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 MMP 선택적 감염을 나타내는 사진이다. SeV/△M-GFP에서는 트립신을 가함으로써만 감염이항진하는 것에 대해, SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 콜라게나아제, MMP2, MMP3 및 MMP9에서 그 감염이 항진한다.

도 41은 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 프로테아제 의존적 F의 개열을 나타내는 사진이다.

프로테아제 의존적인 센다이 바이러스의 F0에서 F1으로의 개열을 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. 레인 1, 4, 7, 10이 F를 개변하지 않은 M 결실형 SeV 벡터, 레인 2, 5, 8, 11이 F에 MMP#2서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터, 레인 3, 6, 9, 12가 F에 uPA서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터를 상기 프로테아제(미처리, 레인 1, 2, 3; 0.1 ng/ml MMP9, 레인 4, 5, 6; 0.1 ng/ml uPA, 레인 7, 8, 9; 7.5 ㎍/ml 트립신, 레인 10, 11, 12)로 37℃, 30분간 처리하였다. 그 결과, 트립신이 F를 개변하지 않은 M 결실형 SeV 벡터를, MMP9가 F에 MMP#2서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터를, uPA가 F에 uPA서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터를 각각 삽입한 프로테아제 기질에 따라 F1으로 개열시켰다.

도 42는 F의 세포질 도메인 결실 변이체(cytoplasmic domain deletion mutant)의 제작과 HN과의 동시 발현에 의한 융합능의 비교를 나타내는 도면이다.

A: 센다이 바이러스 F 단백질의 세포질 도메인 결실 변이체 구축도. 위로부터 순서대로 서열번호:76~79.

B: F의 세포질 도메인 결실 변이체의 제작과 HN과의 동시 발현에 의한 융합능의 비교. 7.5 ㎍/ml 트립신 첨가 LLCMK2 세포로 센다이 바이러스 F 단백질의 각각의 세포질 도메인 결실 변이체와 HN을 동시 발현한 후, 4일 후 헤마톡실린(hematoxylin)에 의해 핵염색하여 신시티움을 형성한 핵수를 카운트하였다.

도 43은 F/HN 키메라 단백은 융합능을 비약적으로 상승시키는 것을 나타내는 도면이다.

A: F/HN 키메라 단백 구조도. 도면 중의 링커 서열은 서열번호:80으로 하였다.

B: F/HN 키메라 단백은 링커의 삽입에 의해 융합능이 상승한다. 7.5 ㎍/ml 트립신을 첨가한 LLCMK2 세포로 센다이 바이러스 F/HN 키메라 단백과 HN을 동시 발현시켰다.

도 44는 F/HN 키메라 단백의 F 개열부위로의 MMP 기질서열의 삽입 개략을 나타내는 도면 및 사진이다.

A: MMP 기질서열을 삽입한 F 개변 F/HN 키메라 단백의 구축도. 위로부터 순서대로 서열번호:81~89.

B: MMP 발현세포 HT1080으로의 F 개변 F/HN의 발현에 의한 신시티움 형성.

도 45는 F 펩티드(Fusion peptide) 개변과 농도 의존적 신시티움 형성으로의 영향을 나타내는 도면이다.

A: Fusion peptide 개변 구축도. 위로부터 순서대로 서열번호:90~93.

B: MMP#2, #6, #6G12A의 콜라게나아제(Clastridium) 첨가농도에 의한 융합능.

도 46은 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스의 게놈 구조를 나타내는 도면이다.

도 47은 MMP 발현량이 낮은 암에 있어서의 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스의 확산을 나타내는 사진이다. 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 감염 2일 후의 세포융합의 확산을 나타낸다.

도 48은 암세포주에 있어서의 MMP2 및 MMP9의 발현을 나타내는 사진이다. 암세포주의 상청의 젤라틴 자이모그래피를 나타낸다.

도 49는 MMP 발현량이 낮은 암에 있어서의 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스의 확산을 나타내는 도면이다. 감염 2일 후의 0.3 ㎠당 신시티움 수의 비교를 나타낸다. 「△M」은 SeV18+/△M-GFP, 「#2」는 SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP, 「#6」는 SeV/F(MMP#6)△M-GFP, 「#6ct14」은 SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP, 「F/HN 키메라」는 SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN△M-GFP를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 인용된 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 삽입된다.

1. 입자 형성능을 저하 또는 결손시킨 SeV 벡터의 구축

[실시예 1] 온도감수성 변이 도입 SeV 게놈 cDNA의 구축

M 유전자에 온도감수성 변이를 도입한 SeV 게놈 cDNA의 구축을 행하였다. 하기 기재의 cDNA 구축의 스킴을 도 1에 나타내었다. F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△F-GFP: Li, H.-O. et al., J. Virology 74, 6564-6569(2000), WO00/70070)를 NaeI로 소화하여, M 유전자를 포함하는 단편(4922 bp)을 아가로오스 전기영동(agarose electrophoresis)으로 분리하고, 해당하는 밴드를 절단하여 QIAEXII Gel Extraction System(QIAGEN, Bothell, WA)으로 회수하여, pBluescript II(Stratagene, La Jolla, CA)의 EcoRV 사이트에 서브클로닝하였다(pBlueNaeIfrg-△FGFP의 구축). M 유전자로의 온도감수성 변이 도입은 이 pBlueNaeIfrg-△FGFP 상에서, QuikChange™ Site-Directed Mutagensis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. M 유전자 상으로의 변이 도입의 종류는 Kondo 등이 보고하고 있는 Cl. 151 strain(Kondo, T. et al., J. Biol. Chem. 268: 21924-21930(1993))의 서열을 이용하여, G69E, T116A 및 A183S 3군데의 변이 도입을 행하였다. 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은 G69E(5'-gaaacaaacaaccaatctagagagcgtatctgacttgac-3'/서열번호:11, 5'-gtcaagtcagatacgctctctagattggttgtttgtttc-3'/서열번호:12), T116A(5'-attacggtgaggagggctgttcgagcaggag-3'/서열번호:13, 5'-ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat'-3'/서열번호:14) 및 A183S(5'-ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3'/서열번호:15, 5'-ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc-3'/서열번호:16)이다.

M 유전자 상에 3군데의 변이를 갖는 pBuleNaeIfrg-△FGFP를 SalI로 소화한 후 ApaLI로 부분소화를 행하여 전체 M 유전자를 포함하는 단편(2644 bp)을 회수하였다. 한편으로 pSeV18+/△F-GFP를 ApaLI/NheI로 소화하고 HN 유전자를 포함하는단편(6287 bp)을 회수하여, 이 2종류의 단편을 Litmus38(New England Biolabs, Beverly, MA)의 SalI/NheI 사이트에 서브클로닝하였다 (LitmusSalI/NheIfrg-Mts△FGFP의 구축). HN 유전자로의 온도감수성 변이 도입은 이 LitmusSalI/NheIfrg-Mts△FGFP 상에서, M 유전자로의 변이 도입시와 동일하게 QuikChange™ Site-Directed Mutagensis Kit를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. HN 유전자 상으로의 변이 도입의 종류는 톰슨(Thompson) 등이 보고하고 있는 ts271 strain(Thompson, S. D. et al., Virology 160: 1-8(1987))의 서열을 이용하여, A262T, G264R 및 K461G 3군데의 변이 도입을 행하였다. 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은 A262T/G264R(5'-catgctctgtggtgacaacccggactaggggttatca-3'/서열번호:17, 5'-tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3'/서열번호:18) 및 K461G(5'-cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtacaata-3'/서열번호:19, 5'-tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-3'/서열번호:20)이다. 이번에는 M 또는 HN 유전자로의 변이 도입을 각각의 벡터 상에서 행하였지만, pSeV18+/△F-GFP를 SalI/NheI로 소화하여 얻어지는 M 및 HN 유전자를 포함하는 단편(8931 bp)을 Litmus38의 SalI/NheI 사이트에 서브클로닝하여 얻어지는 플라스미드(LitmusSalI/NheIfrg-△FGFP)를 이용하여, M 및 HN 유전자로의 전체 변이를 도입하는 것은 가능하다. 이와 같이 하여 순차 변이 도입을 행하여, M 유전자 상에 3군데, HN 유전자 상에 3군데 합계 6군데의 온도감수성 변이를 도입하였다(LitmusSalI/NheIfrg-MtsHnts△FGFP의 구축).

LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNts△FGFP를 SalI/NheI로 소화하여 회수한 단편(8931 bp)과, 또 pSeV18+/△F-GFP를 SalI/NheI로 소화하여 회수한 M 및 HN 등 유전자를 포함하지 않는 단편(8294 bp)을 라이게이션하여, M 및 HN 유전자에 6군데의 온도감수성 변이를 갖고, F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/MtsHNts△F-GFP)를 구축하였다(도 2).

더욱이, 탑재 유전자 발현량의 정량을 행하기 위해 분비형 알칼리포스파타아제(secretory alkaline phosphatase: SEAP) 유전자를 탑재한 cDNA의 구축도 행하였다. 즉, SEAP 유전자의 하류에 종지시그날-개재서열-개시시그날을 갖는 SEAP 단편(WO00/70070)을 NotI로 절단하여(1638 bp) 전기영동한 후, 회수·정제하여 pSeV18+/△F-GFP 및 pSeV18+/MtsHNts△F-GFP의 NotI 사이트에 삽입하였다. 각각, pSeV18+SEAP/△F-GFP 및 pSeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP로 하였다(도 2).

[실시예 2] 온도감수성 변이 도입 바이러스의 재구성과 증폭

바이러스의 재구성은 Li 등의 보고(Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569(2000), WO00/70070)에 따라 행하였다. F 결실형 바이러스를 재구성시키기 위해 F 단백의 헬퍼 세포를 이용하였다. 해당 헬퍼 세포 제작에는 Cre/loxP 발현유도 시스템을 이용하고 있다. 해당 시스템은 Cre DNA 리콤비나아제에 의해 유전자산물을 유도 발현하도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121(1988))를 이용한 것으로, 동일 플라스미드의 형질전환체(transformant)에 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 사이토 등의 방법(Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821(1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121(1998))으로 감염시켜서 삽입유전자를 발현시킨다. SeV-F 단백의 경우, F 유전자를 갖는 동일 형질전환체 세포를 LLC-MK2/F7로 기재하고, AxCANCre로 유도한 후 F 단백을 지속 발현하고 있는 세포를 LLC-MK2/F7/A로 기재하기로 한다.

온도감수성 변이 도입 바이러스의 재구성은 이하와 같이 행하였다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 100 mm의 샬레에 뿌려 24시간 배양한 후, 소랄렌(psoralen)과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(PLWUV-VacT7:Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))를 실온에서 1시간 감염시켰다(m.o.i. 2). 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 세정한 후, 플라스미드 pSeV18+/MtsHNts△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L 및 pGEM/F-HN(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579(1996))을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM(Gibco-BRL, Rockville, MD)에 현탁하여, 1 ㎍ DNA/5 μL 상당의 SuperFect transfection reagent(Qiagen, Bothell, WA)를 넣고 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 3 mL에 넣고 세포에 첨가하여 배양하였다. 5시간 배양한 후 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 2회 세정하여, 40 ㎍/mL의 시토신 β-D-아라비노후라노시드(AraC:Sigma, St. Louis, MO) 및 7.5 ㎍/mL의 트립신(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 MEM에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 8.5×10⁶cells/dish당 F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/A:Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569(2000), WO00/70070)를 중층하여, 40 ㎍/mL의 AraC및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 추가로 2일간 37℃로 배양하였다(P0). 이들 세포를 회수하여 펠릿을 2 mL/dish당 Opti-MEM에 현탁하였다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 용해질을 그대로 LLC-MK2/F7/A에 트랜스펙션하여 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P1). 5~7일 후 배양상청의 일부를 취하여 새롭게 조제한 LLC-MK2/F7/A에 감염시켜, 동일 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P2). 3~5일 후에 새롭게 조제한 LLC-MK2/F7/A에 재감염시켜, 7.5 ㎍/mL의 트립신만을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 3~5일간 배양하였다(P3). 회수한 배양상청에 최종농도 1%가 되도록 BSA를 첨가하여 -80℃에서 보존하였다. 보존 바이러스액을 해동하여 그 다음 실험에 제공하였다.

이 방법으로 조제한 각 바이러스용액의 역가는 SeV18+/△F-GFP, SeV18+/MtsHNts△F-GFP, SeV18+SEAP/△F-GFP 및 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP에서 각각 3×10⁸, 7×10⁷, 1.8×10⁸및 8.9×10⁷GFP-CIU/mL(GFP-CIU의 정의는 WO00/70070에 기재)였다. 또한, GFP를 탑재한 벡터에 대해서는, GFP의 형광으로 직접적으로 카운트하여 정량한 CIU가 GFP-CIU로 정의된다. GFP-CIU는 CIU와 실질적으로 동일한 값을 나타내는 것이 확인되어 있다(WOOO/70070). 이들 역가를 측정할 때 SeV18+/△F-GFP 및 SeV18+/MtsHNts△F-GFP에 대해서, F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/A)에 감염시킨 후의 플라크의 확산을 32℃ 및 37℃에서 관찰하였다. 감염 6일 후의 사진을 도 3에 나타내었지만, SeV18+/MtsHNts△F-GFP는 32℃에서는 어느 정도 플라크의 확산이 있지만 37℃에서는 격감되어 있어 비리온 형성의 감소가 시사되었다.

[실시예 3] 바이러스 재구성에 있어서의 배양온도(32℃)의 효과

실시예 2에서 나타낸 온도감수성 도입 바이러스의 재구성실험에 있어서, P1 이후의 온도를 32℃에서 행하였다. 이는 온도감수성 변이를 도입하는데 있어서 변이의 참고로 한 바이러스가 32℃에서의 생육이 좋아(Kondo, T. et al., J. Biol. Chem. 268: 21924-21930(1993), Thompson, S. D. et al., Virology 160: 1-8(1987)) 시도한 것이지만, 해당 실험조건을 상세하게 관찰함으로써 SeV 재구성시에는(온도감수성 변이 도입 바이러스 이외에서도), P1 이후에서 32℃에서 행함으로써 재구성효율이 상승되어, 종래 취하기 어려웠던 것이라도 회수할 수 있게 될 가능성이 높은 것이 명확해졌다.

32℃에서 바이러스 재구성효율이 상승되는 이유로서 두가지를 생각할 수 있다. 첫째는, 백시니아 바이러스의 증폭을 억제하기 위해 첨가하고 있는 AraC에 의한 세포독성이, 32℃에서의 배양 쪽이 억제되고 있는 것으로 생각되는 점이다. 재구성시의 조건인 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 LLC-MK2/F7/A를 배양한 경우, 37℃에서는 3-4일 후에서 이미 세포장해가 야기되어 벗겨진 세포가 증가되는 것에 대해, 32℃에서 배양한 경우는 7-10일은 충분히 배양 계속이 가능하여 세포가 유지되고 있다. 전사복제효율이 좋지 않거나 또는 감염성 비리온 형성효율이 좋지 않은 SeV를 재구성하는 경우,배양 계속기간은 재구성의 여부에 직접 반영될 것으로 생각된다. 둘째는, 32℃에서 배양한 경우에는 LLC-MK2/F7/A에 있어서의 F 단백의 발현이 유지되고 있는 점이다. F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/A)를 6웰 플레이트에 10% FBS를 포함하는 MEM에서 컨플루언트가 될 때까지 37℃로 배양한 후, 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 치환하여 32℃ 또는 37℃에서 배양하여 경시적으로 셀 스크래퍼(cell scraper)로 세포를 회수한 후, 항F 항체(마우스 단일클론)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 행함으로써 세포내의 F 단백질을 반정량적으로 해석하였다. 37℃에서는 2일 동안은 발현이 유지되고 있지만 그 이후에는 감소되었는데, 32℃에서는 적어도 8일 동안은 F 단백의 발현이 유지되어 있었다(도 4). 이 점에서도 32℃에서의 재구성(P1 이후)의 유효성이 확인되었다.

상기 웨스턴 블롯팅은 이하의 방법으로 행하였다. 6웰 플레이트의 1웰에서 회수한 세포를 -80℃에서 동결 보존한 후, 1x로 희석한 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(Red Loading Buffer Pack; New England Biolabs, Beverly, MA) 100 μL로 용해하여 98℃에서 10분간 가열하였다. 원심 후, 상청 10 μL를 SDS-PAGE겔(멀티겔 10/20; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan)로 로드하였다. 15 mM으로 2.5시간 영동한 후, PVDF막(Immobilon PVDF transfer membrane; Millipore, Bedford, MA)에 세미드라이법(semi-dry method)으로 100 mA에서 1시간 전사하였다. 전사막을 블로킹용액(blocking solution)(Block Ace; Snow Brand Milk Products Co., Ltd, Sapporo, Japan)으로 4℃에서 1시간 이상 방치한 후, 10% Block Ace를 포함하고 항F 항체를 1/1000 용량 첨가한 1차 항체용액에 침지하여 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 TBS(TBST)로 3회, 추가로 TBS로 3회 세정한 후, 10% Block Ace를 포함하고 HRP를 결합한 항마우스 IgG+IgM 항체(Goat F(ab')2 Anti-Mouse IgG+IgM, HRP; BioSource Int., Camarillo, CA)를 1/5000 용량 첨가한 2차 항체용액에 침지하여 실온에서 1시간 진탕하였다. TBST로 3회, TBS로 3회 세정한 후, 화학발광법(ECL western blotting detection reagents; Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)으로 검출하였다.

[실시예 4] 온도감수성 변이 도입 바이러스의 2차 방출 입자 정량(HA assay, Western-Blotting)

SeV18+/△F-GFP, SeV18+/MtsHNts△F-GFP와 함께 모든 바이러스 단백을 갖는 자율복제형으로 NotI부위에 GFP 유전자와 그 하류에 종지시그날-개재서열-개시시그날을 갖는 GFP 단편(780 bp)을 탑재한 SeV(pSeV18+GFP: 도 2)를 사용하여 비교하였다.

6웰 플레이트에 있어서 컨플루언트로 증식시킨 LLC-MK2 세포에 3×10⁷CIU/mL의 각 바이러스용액을 1웰당 100 μL를 첨가하여(m.o.i. 3) 1시간 감염시켜 MEM으로 세정한 후, 1웰당 1 mL의 혈청을 포함하지 않는 MEM을 첨가하여 32℃, 37℃ 및 38℃의 각 온도에서 배양하였다. 1일 마다 샘플링하고 샘플링 직후에 혈청을 포함하지 않는 새로운 MEM 1 mL를 첨가하여 경시적으로 배양·샘플링을 행하였다. 감염 3일 후에 형광현미경 하에서 GFP 발현의 관찰을 행한 곳 3종류의 바이러스 모두, 또 32℃, 37℃ 및 38℃의 모든 조건에 있어서 거의 동일한 정도로 감염되고,또한 유사한 GFP의 발현이 있을 것으로 예상되었다(도 5).

2차 방출 입자는 적혈구 응집활성(HA 활성)으로 정량하여, 가토(Kato) 등의 방법(Kato, A. et al., Genes Cell 1, 569-579(1996))으로 행하였다. 즉, 바닥이 둥근 96웰 플레이트를 사용하여 바이러스액을 단계적으로 PBS로 희석해서 각 웰 50 μL의 2배 희석계열을 제작하였다. 그 50 μL에 1% 농도로 PBS로 희석한 닭 보존혈(코스모바이오, Tokyo, Japan) 50 μL를 혼합하고 4℃에서 1시간 방치하여, 적혈구의 응집을 관찰하여 응집된 것 중 가장 바이러스 희석률이 높은 것의 희석률을 HA 활성으로 판정하였다. 또한, 1 HAU를 1×10⁶바이러스로 환산하여 바이러스 수로 나타내었다(도 6). SeV18+/MtsHNts△F-GFP에서 2차 방출 입자가 상당히 감소하여, 37℃에서 SeV18+/△F-GFP의 약 1/10로 감소되어 있는 것으로 판단되었다. 또한, SeV18+/MtsHNts△F-GFP는 32℃에서도 바이러스 입자 형성은 감소되어 있는데, 적지만 어느 정도는 입자가 나오기 때문에 생산이 가능해져 있는 것으로 생각되었다.

다른 관점에서의 2차 방출 입자의 정량으로서 웨스턴 블롯팅에 의한 정량을 행하였다. 상기와 동일하게 LLC-MK2 세포에 m.o.i. 3에서 감염시킨 후, 감염 2일 후에 배양상청과 세포를 회수하여 배앙상청은 48,000 g으로 45분간 원심하여 바이러스 단백을 회수하였다. SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯팅을 행하여 항M 항체로 검출하였다. 항M 항체는 새롭게 조제한 다중클론항체로, SeV-M 단백질의 1-13(MADIYRFPKFSYE+Cys/서열번호:21), 23-35(LRTGPDKKAIPH+Cys/서열번호:22) 및 336-348(Cys+NVVAKNIGRIRKL/서열번호:23)의 합성 펩티드를 3종류 혼합하여 면역한토끼 혈청으로부터 조제한 것이다. 웨스턴 블롯팅은 실시예 3에 기재된 방법으로 행하여, 1차 항체인 항M 항체는 1/4000 희석, 2차 항체인 HRP를 결합한 항토끼 IgG 항체(Anti-rabbit IgG (Goat) H+L conj.; ICN P., Aurola, OH)는 1/5000 용량으로 희석한 것을 사용하였다. SeV18+/MtsHNts△F-GFP에서는 세포 중에는 M 단백이 동일한 정도로 많이 발현하고 있는데 대해 바이러스의 단백량이 감소되어 있어(도 7), 웨스턴 블롯팅의 수법으로도 해당 바이러스에 있어서 2차 방출 입자가 감소되어 있는 것이 확인되었다.

[실시예 5] 온도감수성 변이 도입 바이러스의 탑재 유전자 발현량(SEAP assay)

SeV18+/MtsHNts△F-GFP에 있어서 2차 방출 입자가 감소되어 있지만, 그것과 동시에 탑재 유전자의 발현량이 감소되어 있어서는 유전자 발현 벡터로서는 의미가 없는 개변이 되어 버리기 때문에, 그 발현량에 대해서 검증을 행하였다. SeV18+SEAP/△F-GFP 및 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 LLC-MK2 세포에 m.o.i. 3에서 감염시킨 후, 경시적으로(감염 12, 18, 24, 50, 120시간 후) 배양상청을 회수하여, 상청 중의 SEAP 활성을 Reporter Assay Kit-SEAP(TOYOBO, Osaka, Japan)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. SEAP 활성은 양자 사이에서의 차이가 거의 없었다(도 8). 또 동일 샘플에 대해서 적혈구 응집활성(HA 활성)을 측정하였지만, HA 활성은 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP에서 역시 약 1/10로 감소되어 있었다(도 9). 또한, 동일 샘플의 바이러스를 48,000 g으로 45분간 원심하여 바이러스 단백을 회수한 후, 웨스턴 블롯팅으로 항M 항체를 이용하여 반정량적으로 해석하였다. 이 경우도, 상청 중의 바이러스 단백의 감소가 확인되었다(도 10). 온도감수성 변이의 도입에 의해 탑재 유전자의 발현량을 거의 감소시키지 않고, 2차 방출 입자를 약 1/10로 감소시킬 수 있었던 것으로 판단되었다.

[실시예 6] 온도감수성 변이 도입 바이러스의 세포장해성(LDH assay)

SeV 감염에 의해 세포가 장해를 받는 경우도 많다. 이 점에 관하여 변이 도입에 의한 영향을 조사하였다. LLC-MK2, BEAS-2B 및 CV-1 세포를 각각 2.5×10⁴cells/well(100 μL/well)로 96웰 플레이트에 뿌려 배양하였다. 배양에는 LLC-MK2 및 CV-1에는 10% FBS를 포함하는 MEM을, BEAS-2B에는 10% FBS를 포함하는 D-MEM 및 RPMI(Gibco-BRL, Rockville, MD)의 1:1 혼합액을 사용하였다. 24시간 배양 한 후, 1% BSA를 포함하는 MEM으로 희석한 SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP 용액을 5 μL/well로 첨가하여 감염시키고, 6시간 후 바이러스액을 포함하는 배지를 제거하여 10% FBS를 포함하거나 또는 포함하지 않는 각 배지로 치환하였다. FBS를 포함하지 않는 배지의 경우는 감염 3일 후에, FBS를 포함하는 배지의 경우는 감염 6일 후에 배양상청을 샘플링하여 Cytotoxicity Detection Kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 세포장해성의 정량을 행하였다. LLC-MK2에서는 양자 모두 세포장해는 관찰되지 않았다. 또한 CV-1 및 BEAS-2B에 있어서는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP의 세포장해성은 SeV18+/△F-GFP와 동등 이하인 것으로 판단되었다(도 11). 즉, 온도감수성 변이 도입에서의 2차 방출 입자의 억제에 의한 세포장해성의 야기는 없는 것으로 결론내렸다.

[실시예 7] 2차 방출 입자 억제 메커니즘의 검토

온도감수성 변이 도입에 의해 2차 방출 억제가 가능해진 메커니즘의 한쪽 말단을 조사하기 위해, M 단백의 세포내 국재에 대해 조사하였다. 각 SeV(SeV18+GFP, SeV18+/△F-GFP, SeV18+/MtsHNts△F-GFP)를 LLC-MK2 세포에 각각 감염시켜, 32℃, 37℃ 또는 38℃에서 배양하고 2일 후에 항M 항체를 이용하여 면역염색을 행하였다. 면역염색은 이하의 방법으로 행하였다. 배양세포를 PBS로 1회 세정한 후, -20℃로 냉각한 메탄올을 첨가하여 4℃에서 15분간 고정하였다. PBS로 3회 세정한 후, 2% Goat Serum 및 0.1% Triton을 포함하는 PBS 용액으로 실온에서 1시간 블로킹(Blocking)을 행하였다. 다시 PBS로 3회 세정한 후, 2% Goat Serum을 포함하는 1차 항체용액(10 ㎍/mL 항M 항체)으로 37℃에서 30분간 반응하였다. PBS로 3회 세정한 후 2% Goat Serum을 포함하는 2차 항체용액(10 ㎍/mL Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(H+L) conjugate: Molecular Plobes, Eugene, OR)으로 37℃에서 15분간 반응하였다. 마지막으로 PBS로 3회 세정한 후, 형광현미경 하에서 관찰하였다. 자립복제형으로 F, HN 양쪽 단백을 갖는 SeV18+GFP에서는 검토한 어느 온도에서도 세포 표면에서의 M 단백의 농축상이 관찰되었다(도 12). 이러한 M 단백의 농축상에 관해서는 이미 보고되어 있어(Yoshida, T. et al., Virology 71: 143-161(1976)), 비리온 형성의 장소를 반영하고 있는 것으로 생각되고 있다. 즉 SeV18+GFP에 있어서는 어느 온도에서도 M 단백의 세포 표면으로의 국재가 정상으로, 충분한 양의 비리온이 형성되어 있는 것을 나타내고 있는 것으로 생각된다. 한편 SeV18+/△F-GFP에서는 38℃에 있어서 M 단백의 농축상이 극단적으로 감소하였다. M 단백은 F 및HN 단백 각각의 세포질측 말단에 결합하여 세포 표면으로 국재하는 것으로 생각되고 있어(Sanderson, C. M. et al., J. Virology 68: 69-76(1994), Ali, A. et al., Virology 276: 289-303(2000)), SeV18+/△F-GFP에서는 그 한쪽 F 단백을 결실하고 있기 때문에, M 단백의 국재에 영향을 주고 있는 것으로 생각된다. 또한, SeV18+/MtsHNts△F-GFP에서는 그 영향이 강하게 나와 37℃에서조차 M 단백의 국재에 지장이 생겨, 결과적으로 2차 방출 입자 감소로 이어진 것으로 예상되었다.

[실시예 8] 2차 방출 입자 억제 메커니즘의 검토(2)

세포내에 있어서의 SeV 단백의 세포내 국재를 보다 상세하게 조사하기 위해, 공초점 레이저 현미경(MRC1024; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA)에 의한 해석을 실시하였다. SeV18+SEAP/△F-GFP 및 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 A-10 세포(rat myoblast)에 각각 감염시켜서(m.o.i. 1), 32℃ 또는 37℃로 10% 혈청을 포함하는 MEM에서 배양하여 1일 후 및 2일 후에 항M 항체 및 항HN 항체를 이용하여 면역염색을 행하였다. 면역염색은 이하의 방법으로 행하였다. 배양 감염세포를 PBS로 1회 세정한 후, -20℃로 냉각한 메탄올을 첨가하여 4℃에서 15분간 고정하였다. PBS로 3회 세정한 후, 2% Goat Serum, 1% BSA 및 0.1% Triton을 포함하는 PBS 용액으로 실온에서 1시간 블로킹을 행하였다. 2% Goat Serum을 포함하는 M의 1차 항체용액(10 ㎍/mL 항M 항체)으로 37℃에서 30분간 반응하고, 추가로 HN의 1차 항체용액(1 ㎍/mL 항M 항체(IL4-1))으로 37℃에서 30분간 반응하였다. PBS로 3회 세정한 후, 2% Goat Serum을 포함하는 2차 항체용액(10 ㎍/mL Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG(H+L) conjugate 및 10 ㎍/mL Alexa Fluor 488 goat anti-mouseIgG(H+L) conjugate: Molecular Plobes, Eugene, OR)으로 37℃에서 15분간 반응하였다. PBS로 3회 세정한 후, 핵을 염색하기 위해 1/4000로 희석한 TO_PRO3(Molecular Plobes, Eugene, OR)을 첨가한 후 실온에서 15분간 방치하고, 마지막으로 소광(quenching)을 억제하기 위해 Slow Fade Antifade Kit(Molecular Plobes, Eugene, OR)의 용액으로 치환하여 공초점 레이저 현미경 하에서 관찰하였다. 감염 1일 후의 결과를 도 13에 나타내었지만, 적색이 M 단백, 녹색이 HN 단백의 국재를 나타내고, 공존하고 있는 경우에는 황색으로 표시된다. 또 원적색(far red)을 색변환하고 있기 때문에 청색이 핵이다. SeV18+SEAP/△F-GFP의 경우는 32℃, 37℃ 중 어느 온도에서도 각 단백의 국재에 커다란 차이는 없어, 세포 표면으로의 M 단백 및 HN 단백의 국재가 관찰되고 있다. 한편 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP의 경우는 양쪽 온도 모두 각 단백질의 국재에 SeV18+SEAP/△F-GFP의 경우와 비교하여 차이가 있어, 세포 표면에서의 M 단백의 국재가 거의 없다. 특히 37℃의 경우는 M 단백과 HN 단백이 거의 완전히 분리되어, M 단백은 미소관(microtubule)의 중심체 부근(즉 골지체 부근)으로도 예상되는 부분에 국재하여 존재하고 있다. 감염 후 2일간 배양한 경우도 동일한 결과가 얻어지고 있으며, 특히 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP 감염세포에 있어서는 M 단백의 세포내 국재에 감염 1일 후와 변화가 없어(도 14), 각각의 위치에서 이동이 멈춰 있는 듯이 보인다. 이 결과에 의해서도, 온도감수성 변이 도입 바이러스에서 2차 방출 입자가 감소되어 있는 것은, 입자 형성의 중심적인 역할을 담당하고 있는 것으로 생각되고 있는 M 단백의 국재 부전인 것으로 단정되었다.

또한, SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP 감염 후 32℃에서 배양한 경우, M 단백이 미소관의 형태에 가까운 형태로 염색되어 있다(도 13). 실제로 미소관의 관여를 증명하기 위해, 미소관의 탈중합을 촉진하는 약제를 첨가하여 M 단백(및 HN 단백) 국재의 변화를 조사하였다. SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP를 A-10에 m.o.i. 1에서 감염시킨 직후에, 탈중합시약인 콜히친(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan) 또는 콜세미드(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)를 최종농도 1 μM 첨가하여 32℃에서 배양하였다. 감염 2일 후에 상술한 것과 동일한 방법으로 M 단백, HN 단백의 세포내 국재를 관찰하였다. 탈중합시약을 첨가하지 않는 경우는 M 단백은 미소관 유사 형태와 닮은 분포를 나타낸(도 13) 것에 대해, 탈중합시약을 첨가함으로써 그 구조가 무너져 커다란 섬유형상 구조체로서 검출되었다(도 15). 이 구조는 M 단백 그 자체가 응집된 것이거나 또는 탈중합된 미소관의 잔해에 M 단백이 결합되어 있을 가능성이 있지만, 어떠한 경우에도 도 13에 보이는 SeV18+SEAP/MtsHNts△F-GFP 감염 후 32℃에서 배양한 경우의 M 단백은 미소관을 따라 국재하고 있을 가능성이 높은 것으로 판단되었다.

상기 미소관으로의 M 단백의 국재가 온도감수성 바이러스 특유의 것인지의 여부를 조사하기 위해, SeV18+/△F-GFP 및 SeV18+/MtsHNts△F-GFP의 양쪽 바이러스에 대해, 감염 후의 M 단백(및 HN 단백)의 국재 변화에 대한 미소관 탈중합시약(colchicine)의 영향을 조사하였다. SeV18+/△F-GFP 또는 SeV18+/MtsHNts△F-GFP를 A-10에 m.o.i. 1에서 감염시킨 직후에, 탈중합시약인 콜히친을 최종농도 1 μM 첨가하여 32℃ 또는 37℃에서 배양하였다. 감염 2일 후에 상술한 것과 동일한 방법으로 M 단백(및 HN 단백)의 세포내 국재를 관찰하였다. 결과를 도 16에 나타내지만 양쪽 바이러스 감염세포 모두 유사한 현상을 나타내었다. 즉, 감염 후 32℃에서 배양한 경우는 도 15와 동일하게 커다란 섬유형상 구조체로서 관찰되었다. SeV18+/△F-GFP의 경우도 M 단백은 미소관과 공존하고 있을 가능성이 시사되었다. 더욱이, 37℃에 있어서는 특히 SeV18+/MtsHNts△F-GFP 감염세포에 있어서 골지체 부근으로 예상되는 부위에 국재하여 관찰되었다.

이상의 결과로부터 이하의 사항이 추론된다. M 단백은 골지체 부근에서 합성되어 주로 F 및 HN 단백 각각의 세포질측 말단에 결합한 상태(Sanderson, C. M. et al., J. Virology 68: 69-76(1994), Ali, A. et al., Virology 276: 289-303(2000))로 미소관을 따라(예를 들면 키네신(kinesin)과 같은 모터 단백에 결합해서) 세포내를 이동하여, 세포 표면으로 국재하여 입자 형성이 달성된다. 온도감수성 변이를 도입한 바이러스에 있어서는 32℃에 있어서는 미소관을 따른 세포내 이동까지는 정상이지만, 미소관에서 세포 표면으로 국재하는 단계에서 문제가 생겨, 미소관을 따른 국재가 관찰되고 있는 것으로 생각할 수 있다. 37℃에 있어서는 미소관을 따른 세포내 이동조차 문제가 생겨, 골지체 부근에서 국재가 관찰되고 있는 것으로 파악할 수 있다. M 단백질 합성의 장으로서는 골지체 부근으로 예상되는데, 응집이 관찰되는 것이 그 부근이라는 것으로, 합성의 장 그 자체는 별도일 가능성이 있다. 단, 과거의 보고예에 의하면 미소관의 성분인 튜불린(tubulin)은 SeV의 전사·복제활성에 관여하여 전사·복제를 촉진하는 것이 보고되어 있고(Moyer, S. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5405-5409(1986); Ogino, T. etal. J. Biol. Chem. 274, 35999-36008(1999)), 또한 골지체는 그 튜불린이 많이 존재할 것으로 예상되는 중심체 부근에 국재하기 때문에, 미소관의 중심체 부근(즉 골지체 부근)에서 합성되는 것으로 예상할 수 있다. 더욱이, SeV의 변이주인 F1-R strain은 M 유전자에 변이를 가지고 있지만, 감염 후 미소관을 변화시켜서 F1-R strain 세포의 극성에 의존하지 않는 입자 형성을 가능하게 하고 있는 것으로 생각되고 있다(Tashiro, M. et al., J. Virol. 67, 5902-5910(1993)). 즉, 튜불린을 따른 M 단백의 세포내 이동을 상정함으로써 본 실시예의 결과도 설명할 수 있다. 이와 같이 예상되는 메커니즘에 있어서, M 및 HN 유전자로 해당 온도감수성 변이를 도입함으로써 M 단백의 세포내 국재의 문제를 발생시켜, 결과적으로 2차 방출 입자의 감소가 달성되고 있는 것으로 판단되었다.

[실시예 9] EGFP 유전자를 갖는 M 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축

cDNA의 구축에는 M 유전자를 결실한 M 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△M: WO00/09700)를 이용하였다. 구축의 스킴을 도 17에 나타내었다. pSeV18+/△M의 M 결실부위를 포함하는 BstEII 단편(2098 bs)을 미리 SalI/XhoI로 소화한 후 라이게이션하여 EcoRV 인식부위를 결실시킨 pSE280(Invitrogen, Groningen, Netherlands)의 BstEII 사이트에 서브클로닝하였다(pSE-BstEIIfrg의 구축). GFP 유전자를 갖는 pEGFP(TOYOBO, Osaka, Japan)를 Acc65I 및 EcoRI로 소화하여 DNA blunting Kit(Takara, Kyoto, Japan)에서의 5'말단의 fill in에 의해 말단의 평활화를 행하고, EcoRV로 소화한 후 BAP(TOYOBO, Osaka, Japan) 처리를 행한 pSE-BstEIIfrg에 서브클로닝하였다. 이 EGFP 유전자를 포함하는 BstEII 단편을 원래의 pSeV18+/△M으로 되돌려 M 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 M 결실형 SeV 게놈 cDNA(pSeV18+/△M-GFP)를 구축하였다.

[실시예 10] M 결실 복제능 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축

M 및 F 유전자 양쪽을 결실하는 SeV 게놈 cDNA를 구축하였다. 하기 기재의 구축의 스킴을 도 18에 나타내었다. F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△F-GFP: Li, H.-O. et al., J. Virology 74, 6564-6569(2000), WOOO/70070)의 NaeI 단편(4922 bp)을 pBluescript II(Stratagene, La Jolla, CA)의 EcoRV 사이트에 서브클로닝하여 구축한 pBlueNaeIfrg-△FGFP를 사용하여 M 유전자의 결실을 행하였다. M 유전자 바로 뒤의 ApaLI 사이트를 이용하여 M 유전자를 절단하도록 디자인하였다. 즉, 절단되는 단편이 6 n이 되도록 P 유전자 바로 뒤에 ApaLI 인식서열을 도입하였다. 변이 도입은 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은 5'-agagtcactgaccaactagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3'/서열번호:24, 5'-tgaggatggtaggatgcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct-3'/서열번호:25이다. 변이 도입 후, ApaLI로 부분소화하여(37℃, 5분) QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN, Bothell, WA)로 회수한 후 그대로 라이게이션을 행하였다. 다시, QIAquick PCR Purification Kit로 DNA를 회수하여, BsmI 및 StuI로 소화한 후 DH5α로 형질전환하여 M 유전자(및 F 유전자)를 결실한 DNA(pBlueNaeIfrg-△M△FGFP)를 조제하였다.

M(및 F 유전자)을 결실한 pBlueNaeIfrg-△M△FGFP를 SalI 및 ApaLI로 소화를행하여 M 결실부위를 포함하는 단편(1480 bp)을 회수하였다. 한편으로 pSeV18+/△F-GFP를 ApaLI/NheI로 소화하여 HN 유전자를 포함하는 단편(6287 bp)을 회수하여, 이 2종류의 단편을 Litmus38(New England Biolabs, Beverly, MA)의 SalI/NheI 사이트에 서브클로닝하였다(LitmusSalI/NheIfrg-△M△FGFP의 구축). LitmusSalI/NheIfrg-△M△FGFP를 SalI/NheI로 소화하여 회수한 단편(7767 bp)과, 또 pSeV18+/△F-GFP를 SalI/NheI로 소화하여 회수한 M 및 HN 유전자를 포함하지 않는 단편(8294 bp)을 라이게이션하여, M 및 F 유전자를 결실하고 그 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 M 및 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△M△F-GFP)를 구축하였다. 구축한 M 결실형(및 M 및 F 결실형) 바이러스의 구조를 도 19에 나타내었다. 이 게놈 cDNA는 목적으로 하는 개변 F 단백질을 포함하는 M 및 F 결실형 SeV의 제작에 유용하다.

[실시예 11] SeV-M 단백을 발현하는 헬퍼 세포의 제작

M 단백을 발현하는 헬퍼 세포 제작을 위해 Cre/loxP 발현 유도 시스템을 이용하였다. 해당 시스템 구축을 위해, F 단백의 헬퍼 세포(LLC-MK2/F7 세포)의 제작(Li, H. -O. et al., J. Virology 74, 6564-6569 (2000), WO00/70070)에 있어서 채용한 Cre DNA 리콤비나아제에 의해 유전자산물을 유도 발현하도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121(1988))를 이용하였다.

<1> M 발현 플라스미드의 구축

M 단백을 발현 유도하는 헬퍼 세포의 제조를 위해, 이미 제작되어 있는 상기 LLC-MK2/F7 세포를 이용하여 이 세포에 동일 시스템으로의 M 유전자 도입을 행하는것으로 하였다. 단, F 유전자 도입시에 사용한 pCALNdLw/F는 네오마이신(neomycin) 내성 유전자를 가지고 있기 때문에, 동일 세포를 이용하기 위해서는 별도의 내성 유전자의 도입이 필수로, 먼저 도 20에 기재된 스킴에서 M 유전자 탑재 플라스미드(pCALNdLw/M: pCALNdLw의 SwaI 사이트에 M 유전자 도입)의 네오마이신 내성 유전자를 하이그로마이신 내성 유전자로 치환하였다. 즉, pCALNdLw/M을 HincII 및 EcoT22I로 소화하여 M 유전자를 포함하는 단편(4737 bp)을 아가로오스 전기영동으로 분리하고, 해당하는 밴드를 잘라내어 QIAEXII Gel Extraction System으로 회수하였다. 동시에, 동일 pCALNdLw/M을 XhoI로 절단하여 네오마이신 내성 유전자를 포함하지 않는 단편(5941 bp)을 회수한 후, 더욱이 HincII로 절단하여 1779 bp의 단편을 회수하였다. 하이그로마이신 내성 유전자는 pcDNA3.1hygro(+)(Invitrogen, Groningen, Netherlands)를 주형으로 hygro-5'(5'-tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgag-3'/서열번호:26) 및 hygro-3'(5'-aatgcatgatcagtaaattacaatgaacatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3'/서열번호:27)의 2종류의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, QIAquick PCR Purification Kit로 회수한 후 XhoI 및 EcoT221로 소화하여 조제하였다. 이들 3종류의 단편을 라이게이션하여 pCALNdLw-hygroM을 제작하였다.

<2> SeV-M 및 F 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포의 클로닝

트랜스펙션에는 Superfect Transfection Reagent를 사용하여 프로토콜에 기재된 방법으로 행하였다. 즉 이하의 방법을 취하였다. LLC-MK2/F7 세포를 5×10⁵cells/dish로 60 mm 샬레에 뿌려, 10% FBS를 포함하는 D-MEM에서 24시간 배양하였다. pCALNdLw-hygroM의 5 ㎍을 FBS 및 항생물질을 포함하지 않는 D-MEM에 희석하여(총량으로 150 μL) 교반한 후, Superfect Transfection Reagent 30 μL를 첨가하고 다시 교반하여 실온에서 10분간 방치하였다. 방치한 후, 10% FBS를 포함하는 D-MEM을 1 mL 첨가하여 교반한 후, PBS로 1회 세정한 LLC-MK2/F7 세포로 이 트랜스펙션 혼합액을 첨가하였다. 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 3시간 배양한 후, 트랜스펙션 혼합액을 제거하여 PBS로 3회 세정하고, 10% FBS를 포함하는 D-MEM을 5 mL 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양한 후, 트립신으로 세포를 벗기고 96웰 플레이트에 약 5 cells/well의 비율로 희석하여, 150 ㎍/mL의 하이그로마이신(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 10% FBS가 든 D-MEM에서 약 2주간 배양하였다. 단일 세포로부터 증식된 클론을 6웰 플레이트까지 확대 배양하였다. 이와 같이 하여 조제한 합계 130클론에 대해서 이하 해석을 행하였다.

<3> SeV-M 및 F 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포 클론의 해석

얻어진 130종류의 클론에 대해서 M 단백의 발현량을 웨스턴 블롯팅으로 반정량적으로 해석하였다. 각 클론을 6웰 플레이트에 뿌려 거의 컨플루언트의 상태에서 5% FBS를 포함하는 MEM으로 희석한 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 사이토 등의 방법(Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821(1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121(1998))으로m.o.i. 5에서 감염시켰다. 32℃에서 2일간 배양한 후, 배양상청을 제거하여 PBS로 1회 세정하고, 셀 스크래퍼로 세포를 벗겨 세포를 회수하였다. 1레인당 1/10양을 적용하여 SDS-PAGE를 행한 후, 항M 항체를 이용하여 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯팅을 행하였다. 130클론 중에서 비교적 M 단백의 발현량이 많았던 것에 관하여, 항F 항체(f236: Segawa, H. et al., J. Biochem. 123, 1064-1072(1998))를 이용한 웨스턴 블롯팅의 결과와 함께 도 21에 기재하였다.

[실시예 12] SeV-M 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포의 평가

실시예 11에서 클로닝한 SeV-M 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포를 사용하여 M 결실형 SeV(SeV18+/△M-GFP)의 바이러스 재구성을 실시하여, 이들 세포 클론의 바이러스 생산능을 평가하였다. SeV18+/△M-GFP의 P0 용해질을 각 클론에 첨가하여, GFP 단백 확산이 관측되는지(M 단백의 트랜스 공급이 달성되는지)의 여부에 대해서 검증하였다. P0 용해질의 조제는 이하와 같이 행하였다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 100 mm의 샬레에 뿌려 24시간 배양한 후, PLWUV-VacT7을 실온에서 1시간 감염시켰다(m.o.i. 2). 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 세정한 후, 플라스미드 pSeV18+/△M-GFP, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/F-HN 및 pGEM/M을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM에 현탁하여, 1 ㎍ DNA/5 μL 상당의 SuperFect transfection reagent를 넣고 혼합해서 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 3 mL에 넣고 세포에 첨가하여 배양하였다. 5시간 배양한 후 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 2회 세정하고, 40㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 배양하였다. 24시간 배양한 후, 8.5×10⁶cells/dish당 LLC-MK2/F7/A를 중층하여 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 추가로 2일간 37℃로 배양하였다(P0). 이들 세포를 회수하여 펠릿을 2 mL/dish당 Opti-MEM에 현탁하고, 동결 융해를 3회 반복하여 P0 용해질을 조제하였다. 한편으로 10종류의 클론을 24웰 플레이트에 뿌려 거의 컨플루언트가 되었을 때 AxCANCre를 m.o.i. 5에서 감염시킨 후, 32℃에서 2일간 배양한 세포를 준비하였다. 이 세포에 SeV18+/△M-GFP의 P0 용해질을 각 200 μL/well로 트랜스펙션하여 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다. #18 및 #62의 클론에서 SeV18+/△M-GFP에 의한 GFP 단백의 확산이 관찰되었다(도 22). 특히, #62 쪽에서 확산이 빨라, 이하의 실험에는 이 #62를 사용하였다. 해당 세포에 대해서 AxCANCre 유도 전의 것을 LLC-MK2/F7/M62로 기재하고, 유도 후의 것에서 F 및 M 단백을 지속 발현하고 있는 것을 LLC-MK2/F7/M62/A로 기재하기로 한다. LLC-MK2/F7/M62/A를 이용해서 SeV18+/△M-GFP의 조제를 계속하여, P2의 감염 6일 후에 9.5×10⁷, P4의 감염 5일 후에 3.7×10⁷GFP-CIU의 바이러스를 조제하였다.

본 실험에 있어서, 실시예 3에 나타내는 바와 같이 P1 이후를 32℃ 등의 저온에서 배양하는 것이 SeV18+/△M-GFP의 바이러스 회수에 있어서 매우 중요하다고 생각되었다. SeV18+/△M-GFP에 있어서 M 단백을 발현세포(LLC-MK2/F7/M62/A)로부터 트랜스에 공급하고 있는 것이 원인으로 생각되지만, 감염의 확산이 매우 느려 P1의감염 7일 후에서 겨우 확산이 보였다(도 22). 즉, 해당 바이러스의 재구성 실험에 있어서도, 「P1 이후를 32℃에서 배양하는」것이 전사복제 효율이 좋지 않거나 또는 감염성 비리온 형성 효율이 좋지 않은 SeV를 재구성하는 경우에 매우 유효한 것을 지지하고 있다.

[실시예 13] SeV-M 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포를 사용한 바이러스 생산조건의 검토

상기 바이러스의 생산성 면에서의 검토도 행하였다. LLC-MK2/F7/M62/A를 6웰 플레이트에 뿌려 37℃에서 배양하였다. 거의 컨플루언트의 상태에서 32℃로 이행시키고 1일 후에 SeV18+/△M-GFP를 m.o.i. 0.5에서 감염시켜, 경시적으로 배양상청을 회수하여 새로운 배지를 첨가하였다. 회수한 상청에 대해서 CIU와 HAU를 구하였다. 감염 4~6일 후에서 가장 많은 바이러스가 회수되었다(도 23). HAU는 감염 6일 이후에도 유지되고 있지만, 이 시점에서는 세포장해성이 강하게 나오고 있어 바이러스 입자 유래가 아니라, 세포 단편에 결합되어 있거나 또는 유리(遊離)되어 있는 HA 단백에 의한 활성이 나오고 있는 것으로 예상되었다. 즉, 바이러스를 회수하기 위해서는 감염 5일 후까지의 배양상청을 회수하는 것이 바람직하다고 생각된다.

[실시예 14] M 결실형 SeV의 바이러스의 구조 확인

SeV18+/△M-GFP의 바이러스 유전자를 RT-PCR로, 바이러스 단백을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. RT-PCR은 P2의 감염 6일 후의 바이러스를 이용하였다. 바이러스용액으로부터의 RNA의 회수는 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN, Bothell, WA)를 이용하고, 또 cDNA 조제는 Thermoscript RT-PCR System(Gibco-BRL,Rockville, MD)을 이용하여, 양 시스템 모두 첨부된 프로토콜에 기재된 방법으로 행하였다. cDNA 조제시의 프라이머에는 키트에 첨부된 랜덤 헥사머(random hexamer)를 사용하였다. 또한, RNA로부터의 산물인 것의 확인으로서 reverse transcriptase의 유무로 동일 반응을 행하였다. 조제한 cDNA를 주형으로 하여 P 유전자 상의 F3593(5'-ccaatctaccatcagcatcagc-3'/서열번호:28)과 F 유전자 상의 R4993(5'-ttcccttcatcgactatgacc-3'/서열번호:29)의 조합과, 마찬가지로 P 유전자 상의 F3208(5'-agagaacaagactaaggctacc-3'/서열번호:30)과 R4993의 조합 2종류로 PCR을 행하였다. SeV18+/△M-GFP의 유전자구조로부터 예상된 바와 같이, 전자 및 후자로부터 각각 1073 bp 및 1458 bp의 증폭이 관찰되었다(도 24). reverse transcriptase 없음(RT)의 경우는 해당 유전자의 증폭은 없고, 또 GFP 유전자가 아니라 M 유전자가 삽입되어 있는 경우(pSeV18+GFP)는 각각 1400 bp 및 1785 bp이기 때문에 명백히 크기가 상이하여, 본 바이러스는 M 결실형 유전자구조인 것을 지지하였다.

웨스턴 블롯팅에 의해 단백측으로부터의 확인을 행하였다. SeV18+/△M-GFP(도면 중 △M), SeV18+/△F-GFP(도면 중 △F) 및 SeV18+GFP(도면 중 18+)를 m.o.i. 3에서 LLC-MK2에 감염시켜, 감염 3일 후에 배양상청과 세포를 회수하여 배양상청은 48,000 g으로 45분간 원심하여 바이러스 단백을 회수하였다. SDS-PAGE 후, 웨스턴 블롯팅을 행하여 항M 항체, 항F 항체 및 주로 NP 단백을 인식하는 DN-1 항체(토끼 다중클론)로 검출하였다. 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법으로 행하였다. SeV18+/△M-GFP 감염세포에서는 M 단백이 관측되지 않고 F 또는 NP는 관측되었기때문에, 단백측으로부터도 SeV18+/△M-GFP의 구조인 것이 확인되었다(도 25). 이 때, SeV18+/△F-GFP 감염세포에서는 F 단백이 관측되지 않고, SeV18+GFP에서는 조사한 모든 바이러스 단백질이 관측되었다. 또한, 배양상청의 바이러스 단백에 관해서는 SeV18+/△M-GFP에 있어서는 NP의 관측량이 매우 적어, 2차 방출 입자가 없거나 또는 매우 적을 것으로 예상되었다.

[실시예 15] M 결실형 SeV의 2차 방출 입자의 유무에 관한 정량적 해석

실시예 14에 기재된 바와 같이 SeV18+/△M-GFP를 m.o.i. 3에서 LLC-MK2에 감염시켜, 감염 3일 후에 배양상청을 회수하여 직경 0.45 ㎛의 필터를 통과시킨 후 48,000 g으로 45분간 원심하여, 회수한 바이러스 단백을 사용해서 웨스턴 블롯팅을 행하여 반정량적으로 배양상청 중의 바이러스 단백을 검출하였다. 대조로서 SeV18+/△F-GFP를 동일하게 감염시켜 조제한 샘플을 사용하였다. 각각의 희석계열을 제작하여 웨스턴 블롯팅을 행하여 DN-1 항체(주로 NP 단백 인식)로 검출하였다. SeV18+/△M-GFP 감염세포 상청 중의 바이러스 단백은 SeV18+/△F-GFP 감염세포의 약 1/100인 것으로 판단되었다(도 26). 또한, 동일 샘플의 HA 활성은 SeV18+/△F-GFP(64 HAU)인 것에 대해 SeV18+/△M-GFP(<2 HAU)였다.

동일 실험을 다시 경시적으로 행하였다. 즉, SeV18+/△M-GFP를 m.o.i. 3에서 LLC-MK2에 감염시키고, 경시적으로(1일 마다) 배양상청을 회수하여 HA 활성을 측정하였다(도 27). 감염 4일 이후에 적지만 HA 활성이 관측되었다. 단, 동일 샘플에 대해서 세포장해성의 지표가 되는 LDH 활성을 측정한 바, SeV18+/△M-GFP 감염세포에서는 감염 4일 이후 명확한 세포장해성이 야기되고 있어(도 28), HA 활성의 상승은 바이러스 유사 입자에 기인하는 것이 아니라, 세포 단편에 결합되어 있거나 또는 유리되어 있는 HA 단백에 의한 활성이 나오고 있을 가능성이 높은 것으로 예상되었다. 더욱이, 감염 5일 후의 배양상청에 대해서 양이온성 리포좀인 Dosper Liposomal Transfection Reagent(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 검증하였다. 즉, 배양상청 100 μL와 Dosper 12.5 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 방치한 후, 6웰 플레이트에 컨플루언트로 배양한 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하였다. 2일 후에 형광현미경 하에서 관찰한 바, 2차 방출 입자가 존재하는 SeV18+/△F-GFP 감염세포의 배양상청에서는 많은 GFP 양성 세포가 관찰되는 것에 대해, SeV18+/△M-GFP 감염세포의 배양상청에서는 GFP 양성 세포는 약간은 존재하였지만 거의 관찰되지 않았다(도 29). 이상의 결과로부터, M 단백을 결실함으로써 2차 방출 입자는 거의 억제 가능한 것으로 결론낼 수 있었다.

2. 프로테아제 의존성 트로피즘을 변환한 입자 형성능을 저하 또는 결손시킨 SeV 벡터의 구축

상기에서 구축한 M 결손 SeV의 재구성계를 이용하여, 이하와 같이 F 단백질의 개열부위를 개변한 SeV의 구축을 행하였다.

[실시예 16] F 단백질의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축

F의 F1/F2의 개열부위(F의 활성화부위)에 암세포에서 고발현하고 있는 프로테아제의 인식서열을 도입한 M 결실형 SeV 게놈 cDNA를 구축하였다. MMP-2 및 MMP-9의 합성기질로서 이용되고 있는 서열을 토대로 한 여러 서열 및 uPA의 기질을 토대로 한 서열을 디자인하였다. 도 30에는 MMP-2 및 MMP-9의 기질로서 이용되고 있는 합성기질의 서열(Netzel-Arnett, S. et al., Anal. Biochem. 195, 86-92(1991))을 토대로 하고, 또는 새롭게 수정을 가하여 디자인한 2종류의 서열[PLG↓MTS(서열번호:3) 및 PLG↓LGL(서열번호:31); 이하, 이들 서열을 갖는 F 단백을 각각 F(MMP#2) 및 F(MMP#3)로 나타낸다], MMP의 합성기질에 공통의 3 아미노산서열 PLG만을 도입한 서열(이하, 동일 서열을 갖는 F 단백을 F(MMP#4)로 나타낸다) 및 uPA의 기질 VGR(서열번호:6)을 토대로 한 서열(이하, 동일 서열을 갖는 F 단백을 F(uPA)로 나타낸다)의 4종류 서열의 디자인이 나타내어져 있다.

주목하고 있는 MMP(MMP-2 및 MMP-9)에 보다 선택적으로 작용하도록 실제의 디자인을 행하는 경우, 시판되고 있는 합성기질의 서열과 함께 기질 특이성을 상세하게 검토한 보고(Turk, B. E. et al., Nature Biotech. 19(7) 661-667(2001); Chen, E. I. et al., J. Biol. Chem. 277(6) 4485-4491(2002))를 참고로 할 수 있다. 특히 MMP-9에 관해서는, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)의 P3에서 P2'까지의 콘센서스 서열(X=모든 잔기, Hy=소수성 잔기)이 제창되어 있다(Kridel, S. J. et al., J. Biol. Chem. 276(23) 20572-20578(2001)). 따라서, F(MMP#2)에 대해서는 이 콘센서스 서열에 합치하도록, 원래 합성기질의 서열 PLG↓MWS로부터 본 디자인의 PLG↓MTS에 새롭게 디자인을 행하고 있다.

유전자 구축의 스킴을 도 31에 나타내었다. M 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 M 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△M-GFP)를 SalI 및 NheI로 소화하여, F 유전자를 포함하는 단편(9634 bp)을 아가로오스 전기영동으로 분리하고, 해당하는 밴드를 잘라내어 QIAEXII Gel Extraction System(QIAGEN, Bothell, WA)으로 회수하여, LITMUS38(New England Biolabs, Beverly, MA)의 SalI/NheI 사이트에 서브클로닝하였다(LitmusSalI/NheIfrg△M-GFP의 구축). F 유전자로의 변이 도입은 이 LitmusSalI/NheIfrg△M-GFP 상에서, QuikChange™ Site-Directed Mutagensis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은 F(MMP#2)로의 변환을 위해서는 5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'(서열번호:32) 및 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'(서열번호:33), F(MMP#3)로의 변환에는 5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3'(서열번호:34) 및 5'-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'(서열번호:35), F(MMP#4)로의 변환에는 5'-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3'(서열번호:36) 및 5'-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3'(서열번호:37) 및 F(uPA)로의 변환에는 5'-GACACAAAATGCCGGTGCTCCCgtGggGAGATTCTTCGGTGCTGTGATTG-3'(서열번호:38) 및 5'-CAATCACAGCACCGAAGAATCTCccCacGGGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3'(서열번호 39)이다. 소문자 표기가 변이 도입 염기를 나타내고 있다.

F 유전자 상에 목적의 변이를 갖는 LitmusSalI/NheIfrg△M-GFP를 SalI/NheI로 소화하여, F 유전자를 포함하는 단편(9634 bp)을 회수하였다. 한편으로, F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV18+/△F-GFP: Li, H.-O. et al., J. Virology 74, 6564-6569(2000), WO00/70070)를 SalI 및 NheI로 소화하여 NP 유전자를 포함하는 단편(8294 bp)에, 합성 올리고 DNA를 이용하여 멀티클로닝 사이트를 도입한 플라스미드(pSeV/△SalINheIfrg-MCS:PCT/JP00/06051)를 SalI 및 NheI로 소화하여 단편(8294 bp)을 회수하였다. 이 양쪽 단편을 라이게이션하여 F(MMP#2), F(MMP#3) 또는 F(MMP#4)의 유전자(MMP에서 활성화되도록 디자인한 F 유전자)를 갖는 M 결실형 SeV cDNA(pSeV18+/F(MMP#2)△M-GFP, pSeV18+/F(MMP#3)△M-GFP 또는 pSeV18+/F(MMP#4)△M-GFP) 및 F(uPA)의 유전자(uPA에서 활성화되도록 디자인한 F 유전자)를 갖는 M 결실형 SeV cDNA(pSeV18+/F(uPA)△M-GFP)를 구축하였다.

[실시예 17] F의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV 벡터의 재구성과 증폭

바이러스의 재구성은 Li 등의 보고(Li, H.-O. et al., J. Virol. 74. 6564-6569(2000), WO00/70070)에 따라 행하였다. M 결실형이기 때문에 M 단백을 트랜스에 공급하는 것이 가능한 상기 헬퍼 세포(실시예 11)를 이용하였다. 해당 헬퍼 세포 제작에는 Cre/loxP 발현유도 시스템을 이용하고 있다. 해당 시스템은 Cre DNA 리콤비나아제에 의해 유전자산물을 유도 발현하도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121(1988))를 이용한 것으로, 동일 플라스미드의 형질전환체에 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 사이토 등의 방법(Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821(1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121(1998))으로 감염시켜서 삽입유전자를 발현시켰다(실시예 11 및 12 참조).

F의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV의 재구성은 이하와 같이 행하였다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 100 mm의 샬레에 뿌려 24시간 배양한 후, 소랄렌(psoralen)과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(PLWUV-VacT7:Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))를 실온에서 1시간 감염시켰다(MOI 2). 세포를 무혈청의 MEM으로 세정한 후, 플라스미드 pSeV18+/F(MMP#2)△M-GFP(또는 pSeV18+/F(MMP#3)△M-GFP, pSeV18+/F(MMP#4)△M-GFP, 또는 pSeV18+/F(uPA)△M-GFP), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996)) 및 pGEM/F-HN(Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569(2000), WO00/70070)을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM(Gibco-BRL, Rockville, MD)에 현탁하여, 1 ㎍ DNA/5 μL 상당의 SuperFect transfection reagent(Qiagen, Bothell, WA)를 넣고 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 3 mL에 넣고 세포에 첨가하여 배양하였다. 5시간 배양한 후 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 2회 세정하여, 40 ㎍/mL의 시토신 β-D-아라비노후라노시드(AraC:Sigma, St. Louis, MO) 및 7.5 ㎍/mL의 트립신(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 MEM에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 8.5×10⁶cells/dish당 M 단백질을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/M62/A)를 중층하여, 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 추가로 2일간 37℃로 배양하였다(P0). 이들 세포를 회수하여 펠릿을 2 mL/dish당 Opti-MEM에 현탁하였다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 용해질을 그대로 LLC-MK2/F7/M62/A에 트랜스펙션하여 40 ㎍/mL의 AraC, 7.5 ㎍/mL의 트립신 및 50 U/mL의 collagenase type IV(ICN, Aurola, OH)를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P1). 3~14일 후 배양상청의 일부를 취하여 새롭게 조제한 LLC-MK2/F7/A에 감염시켜, 40 ㎍/mL의 AraC, 7.5 ㎍/mL의 트립신 및 50 U/mL의 collagenase type IV를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P2). 3~14일 후에 새롭게 조제한 LLC-MK2/F7/M62/A에 재감염시켜, 7.5 ㎍/mL의 트립신 및 50 U/mL의 collagenase type IV를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 3~7일간 배양하였다(P3). 회수한 배양상청에 최종농도 1%가 되도록 BSA를 첨가하여 -80℃에서 보존하였다. 보존 바이러스액을 해동하여 그 다음 생산 및 in vitro 실험에 제공하였다.

또한, M 단백을 트랜스에 공급하는 헬퍼 세포로서 LLC-MK2/F7/M62에 추가로 동일 시스템(pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121(1988))의 SeV-M 유전자(및 SeV-F 유전자)를 도입하여 세포의 클로닝을 계속함으로써, 보다 높은 역가로의 M 결실형 SeV 벡터를 조제 가능한 헬퍼 세포(LLC-MK2/F7/M62-#33)의 제조에성공하였다. 이 세포를 사용하여 조제한 경우, F 유전자에 변이를 도입하지 않은 M 결실형 SeV 벡터(pSeV18+/△M-GFP)를 1×10⁸GFP-CIU/mL(GFP-CIU의 정의는 WO00/70070에 기재) 이상의 역가로 조제하는 것이 가능해졌다. 또한, 동일 세포를 이용한 경우, SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP 및 SeV18+/F(uPA)△M-GFP의 경우도 모두 1×10⁸GFP-CIU/mL 이상의 역가로의 조제가 가능하였다.

동일한 방법으로 재구성을 행한 경우, SeV18+/F(MMP#3)△M-GFP 및 SeV18+/F(MMP#4)△M-GFP에 대해서는 바이러스 입자를 회수할 수 없었다. 이들 것에 대해서도 바이러스 입자를 회수하기 위해서는, 추가로 재구성의 조건을 검토해야만 하지만, 동일 조건으로 회수할 수 없었기 때문에 F(MMP#3) 및 F(MMP#4)에 있어서는, F1/F2 개열부위(F 단백의 활성화부위)의 디자인 상에 문제가 있어, 예를 들면 개열효율이 나쁘거나, 또는 개열 후의 F 단백의 활성이 약한 등의 영향이 나와 있을 가능성이 있다. 반대로, F(MMP#2)의 디자인으로 고역가의 바이러스 입자를 회수할 수 있었기 때문에, 이 디자인이라면 개열효율이 좋아, 개열 후의 F 단백의 활성에도 영향을 미치지 않는 좋은 디자인이라고 생각되었다.

[실시예 18] F의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV 벡터의 in vivo용 샘플 조제

in vivo 검토용 각종 M 결실형 SeV 벡터의 조제는, 초원심으로 바이러스 입자를 pellet down하는 간이 정제법으로 행하였다. LLC-MK2/F7/M62-#33을 6웰 플레이트에서 거의 컨플루언트로 증식한 후, AxCANCre를 MOI 5에서 감염시킨 후, 32℃에서 2일간 배양하였다. 이 세포에 SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP 또는 SeV18+/△M-GFP를 MOI 0.5에서 감염시켜, SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP의 경우는 7.5 ㎍/mL의 트립신 및 50 U/mL의 collagenase type IV를 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(1 mL/well)에서, SeV18+/△M-GFP의 경우는 7.5 ㎍/mL의 트립신만을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM(1 mL/well) 중에서, 3일간 32℃에서 배양하였다. 각 6웰 분량을 합하여 상청을 회수 후, 2,190 g으로 15분간 원심하여 회수한 상청을 내경 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 추가로 40,000 g으로 30분간 원심하였다. 펠릿을 PBS 500 μL로 현탁하여 정제 바이러스 용액으로 하였다. 이와 같이 하여 조제한 M 결실형 SeV 벡터의 역가는 SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP 및 SeV18+/△M-GFP에서 각각 1.3×10⁹및 4.5×10⁹GFP-CIU/mL였다. 실시예 17 및 18에서 제작한 바이러스는 F 단백질이 개열되어 있어 감염성을 갖는다. 이러한 SeV를 F 개열형 SeV 또는 감염형 SeV라 부른다. 또한, 이하 SeV18+/△M-GFP, SeV18+/F(MMP#2)△M-GFP 및 SeV18+/F(uPA)△M-GFP를 각각 SeV/△M-GFP, SeV/F(MMP#2)△M-GFP, SeV/F(uPA)△M-GFP로도 약기한다.

[실시예 19] F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 프로테아제 의존적 감염 및 세포융합형 감염의 평가방법

외인성 실험(Exogenous experiment)

세포계에 바깥으로부터 프로테아제를 첨가하는 감염 순서를 외인성 실험이라 부른다. 이하의 실시예에 있어서 행한 외인성 실험의 기본적인 순서를 나타낸다. 이것과 상이한 조건으로 행한 경우는 각각의 실시예에 있어서 기재하였다. 96웰 플레이트에 LLC-MK2를 컨플루언트(5×10⁵cell/well)가 되도록 배양하였다. MEM으로 2회 세정 후, SeV[F 개열형: 1×10⁵CIU/ml 또는 F 비개열형: 1×10⁷particles/ml (HA 환산; 실시예 25 참조)] 함유 MEM을 50 ㎕ 가하여 감염시켰다. 동시에 동량 50㎕의 프로테아제 함유 MEM을 가하여 37℃에서 배양하였다. 4일 후, 형광현미경으로 감염의 확산을 관찰하였다. 또한, 1 ㎟의 세포당 GFP가 발현하고 있는 세포를 카운트하였다. 프로테아제는 콜라게나아제(collagenase type IV)는 ICN Biomedicals Inc사, MMP2(active MMP2), MMP3, MMP7, MMP9(active MMP9) 및 플라스민은 코스모바이오사로부터 구입하여 사용하였다.

내인성 실험(Endogenous experiment)

세포계에 바깥으로부터 프로테아제를 첨가하지 않고, 세포가 발현하는 프로테아제에 의해 감염을 성립시키는 감염 순서를 내인성 실험이라 부른다. 이하의 실시예에 있어서 행한 내인성 실험의 기본적인 순서를 나타낸다. 이것과 상이한 조건으로 행한 경우는 각각의 실시예에 있어서 기재하였다. 96웰 플레이트에 각 암세포를 컨플루언트(5×10⁵cell/well)가 되도록 배양하였다. MEM으로 2회 세정 후, SeV[F 개열형: 1×10⁵CIU/ml 또는 F 비개열형: 1×10⁷HAU/ml(실시예 25 참조)] 함유 MEM을 50 ㎕ 가하여 감염시켰다. 이 때, 배지에는 최종농도 1%가 되도록 FBS를 첨가하였다. 4일 후, 형광현미경으로 감염의 확산을 관찰하였다. 또한, 1 ㎟의 세포당 GFP가 발현하고 있는 세포를 카운트하였다.

[실시예 20] F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터에 의한 프로테아제 의존적 세포융합형 감염(Exogenous experiment)

프로테아제를 거의 발현하고 있지 않은 LLC-MK2 세포를 사용하여, F의 개변에 의해 그 프로테아제 의존적으로 세포융합형 감염이 성립되어 있는지를 상기의 외인성 실험에 의해 확인하였다(도 32). SeV/△M-GFP, SeV/F(MMP#2)△M-GFP, SeV/F(uPA)△M-GFP의 3종류의 M 결실형 SeV(실시예 17)를 세포에 감염시키는 동시에, 각각 0.1 ㎍/ml의 collagenase type IV(Clostridium histolyticum), active MMP2, active MMP9, 또는 uPA, 또는 7.5 ㎍/ml 트립신을 가하였다. 4일 후, 형광현미경으로 관찰하였다. F를 개변하지 않은 SeV/△M-GFP는 트립신을 가한 LLC-MK2에서만, 감염된 세포의 주위의 세포와 세포융합을 일으켜 세포융합형 감염이 보이고, 다핵세포인 신시티움을 형성하였다(도 32 L). MMP 분해서열을 F 단백질에 삽입한 SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 콜라게나아제, active MMP2, active MMP9를 가한 LLC-MK2에서 세포융합형 감염이 보이고, 다핵세포인 신티티움을 형성하였다(도 32 E, F, M). 한편, 우로키나아제형 플라스미노겐 활성제(urokinase-type plasminogen activator(uPA), 조직형(tissue-type) PA(tPA) 분해서열을 F 단백질에 삽입한 SeV/F(uPA)△M-GFP에서는 트립신 존재하에서 세포융합형 감염이 보이고, 추가로 F 단백질을 개변한 것으로 인해 uPA에서 다핵세포인 신시티움을 형성하였다(도 32 Q, R). 이것은, 각각의 프로테아제 분해기질 서열을 F 단백질에 삽입함으로써, M 결실형 SeV는 그 분해기질 서열 의존적으로 세포융합형 감염시켜 접해 있는 세포에 감염이 확산되어 가는 것을 나타내고 있다.

[실시예 21] 암세포주의 MMP 발현 특이적인 세포융합형 감염(Endogenous experiment)

MMP 발현 암세포주인 HT1080(인간 섬유아육종)(Morodomi, T. et al., (1992) Biochem. J. 285(Pt 2), 603-611), tPA 발현주인 MKN28(인간 위암세포주)(Koshikawa, N. et al. (1992) Cancer Res. 52, 5046-5053), 어느쪽 프로테아제도 발현하고 있지 않은 세포주 SW620(인간 대장암주)을 사용하여, 내재성 프로테아제 선택적으로 세포융합형 감염이 보이는지의 여부를, 실시예 17에서 제작한 SeV를 사용하여 내인성 실험에 의해 실험을 행하였다. 이들 암세포 중 MKN28은 리가가쿠겐큐쇼(Cell No. RCB1000)로부터, 또한 HT1080(ATCC No. CCL-121), SW620(ATCC No. CCL-227) 및 이하의 실시예에서 사용하는 SW480(ATCC No. CCL-228), WiDr(ATCC No. CCL-218), Panc-1(ATCC No. CRL-1469)은 ATCC(American type culture collection)로부터 분여(分與)된 것을 사용하였다. 배지는 각각 분여처에서 사용되고 있는 배지를 사용하였다. 이 때, 모든 배지에 최종농도 1%가 되도록 FBS를 첨가하였다. 도 33에서 나타내는 바와 같이, MMP 발현주 HT1080에서는 SeV/F(MMP#2)△M-GFP만 10배 이상 그 감염이 확산되어 있고, tPA 발현주 MKN28에서는 SeV/F(uPA)△M-GFP만이 세포융합형 감염의 확산이 보인다. 어느쪽 프로테아제의 발현도 없는 SW620에서는 감염의 확산은 전혀 보이지 않는다.

[실시예 22] Phorbol Ester로의 MMP 유도에 의한 세포융합형 감염

암세포는 그 주위에 존재하는 증식인자 등에 의해 생체내에서는 MMP가 유도되고 있는 것이 보고되어 있다. 그 현상은 Phorbol Ester인 phorbol 12-myristate13-acetate(PMA)에 의해 in vitro에서 재현함으로써 가능하다. 이 MMP 발현의 유도가 재현된 조건에 있어서의 감염을 조사하기 위해, PMA에 의해 MMP2의 활성화와 MMP9의 유도가 알려져 있는 Panc I(췌장암주)를 사용하여, F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 세포융합형 감염의 유무를 조사하였다(Zervos, E. E. et al. (1999) J. Surg. Res. 84, 162-167). 96웰 플레이트에 Panc I 및 다른 암세포주를 컨플루언트(5×10⁵cell/well)가 되도록 배양하였다. 실시예 17에서 제작한 SeV를 사용하여 내인성 실험에 의해 실험을 행하였다. MEM으로 2회 세정 후, Moi=0.01이 되도록 1×10⁵CIU/ml의 SeV 함유 MEM을 50 ㎕ 가하여 감염시켰다. 동량 50 ㎕의 40 nM phorbol 12-myristate 13-acetate(Sigma)를 포함하는 MEM을 가하였다. 이 때, 배지에 최종농도 1%가 되도록 FBS를 첨가하였다.

MMP2, 9의 유도 발현은 젤라틴 분해활성이 있는 부분이 깨끗하게 제거되는 젤라틴 자이모그래피법(Johansson, S., and Smedsrod, B. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4363-4366)에 의해 확인하였다. 구체적으로는, 각각의 배양 상등액을 취해 샘플 버퍼(Sample buffer)로 용해하였다. 최종농도가 1 mg/ml 젤라틴이 되도록 아크릴아미드에 혼합하여, 8% 아크릴아미드 겔을 제작하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔전기영동 후, 10 mM Tris pH 8.0, 2.5% Triton X-100으로 세정하였다. 젤라티나아제 활성화 버퍼(50 mM Tris, 0.5 mM CaCl₂, 10^-6M ZnCl₂)로 37℃에서 1일 배양한 후, 1% 쿠마지 블루(Coomassie Blue) R-250, 5% 초산, 10% 메탄올로 염색하였다(도34 위 패널). C가 대조(control), T가 20 nM PMA에 의해 유도된 상등액을 사용한 것으로, HT1080과 Panc I에서 MMP9가 유도되어 있는 것을 알 수 있다. Panc I에서 유도 전에 잠재형 MMP2가 검출되어 있지만 그것은 잠재형으로 젤라틴 분해활성은 거의 없는 것이 알려져 있다. 도 34(아래 패널)가 나타내는 바와 같이, SeV/F(MMP#2)△M-GFP에 감염시킨 Panc I는 MMP 유도에 의해 세포융합형 감염이 보이게 되는 것이 나타내어졌다.

[실시예 23] In vivo에 있어서의 HT1080 세포주 감염 SeV/F(MMP#2)△M-GFP의 확산

HT1080의 담암 누드 마우스를 제작하였다. BALB/c nude mouse(charles river)의 오른쪽 등부위의 피하에 인간 섬유아종 HT1080을 5×10⁶cell(1×10⁸cell/ml를 50 ㎕) 주입하였다. 7~9일 후에 장경이 3 mm를 초과한 개체를 사용하였다. 암을 타원형으로 간주한 체적은 30~100 ㎣가 되고, 거기에 이하의 F 개열형 SeV를 50 ㎕ 암부위에 한번만 주입하였다: MEM(대조)(N=5), SeV-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=5), SeV/△M-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=7), SeV/F(MMP#2)△M-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=7). 2일 후, 형광현미경으로 관찰하였다(도 35). SeV-GFP, SeV/△M-GFP는 주입한 주변에만 형광이 보이는 것을 확인할 수 있다(도 35 E, H). 그것에 대해 SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 암 전체로 확산되는 것이 관찰되었다(도 35 K). 확대한 것에서는 SeV-GFP, SeV/△M-GFP가 세포 하나 하나의 형광이 확인되는 것에 대해, SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 세포의 형태가 선명하지 않아 세포융합하고 있는 것을 시사하고 있다. 또한, 상부로부터 사진의 상에 있어서의 암 전체 및 GFP의 발현 면적을 NIH image로도 구하였다. 암 전체에 대한 GFP 발현영역의 비율은 SeV-GFP가 10%, SeV/△M-GFP가 20%인 것에 대해 SeV/F(MMP#2)△M-GFP 투여에서는 90%의 감염이 보여, 명확한 감염의 확산이 확인되었다(도 36). 암 이외의 조직에 관해서는, 암조직과의 경계에 존재하는 근막(筋膜) 및 피하의 결합조직에 대해 세포융합형 감염은 거의 관찰되지 않아, 이 조건에서는 암 이외의 정상 조직에는 감염은 확산되지 않는 것으로 판단되었다.

[실시예 24] 담암 누드 마우스에 의한 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 항종양효과

도 35와 동일하게 HT1080 담암 마우스를 제작하였다. 8 또는 9일 후, 종양지름이 3 mm 이상인 개체를 선택하여, 이하의 4군의 F 개열형 SeV를 50 ㎕ 암부위에 주입하였다: MEM(N=5), SeV-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=5), SeV/△M-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=7), SeV/F(MMP#2)△M-GFP(1×10⁸CIU/ml)를 포함하는 MEM(N=7). 2일 후, 한번 더 동량의 SeV를 암부위에 주입하였다. 암부위 크기의 장경(a), 단경(b), 두께(c)를 하루 간격으로 계측하였다. 종양 체적은 타원형으로 간주하여, 종양 체적 V=π/6×abc로 계산하였다. PBS, SeV-GFP, SeV/△M-GFP는 급속히 암이 커지는 것에 대해, 도 37에서 나타낸 바와 같이 벡터가 암 전체에 확산되어 있었던 SeV/F(MMP#2)△M-GFP 투여 암은 명확히 증식하지 않고 작은 그대로였다. t검정에 의한 유의차 검정에서도 P<0.05에서 유의하게 다른 3군과 비교하여 작은 것이 판명되었다. 이것은 치료 유전자를 탑재하고 있지 않음에도 불구하고, 그 항암효과가 있는 것을 나타내고 있다.

[실시예 25] F 비개열/F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 제작과 선택적 감염

상기에서 사용한 통상의 SeV 벡터의 제작에는 F의 개열을 일으키기 위해 7.5 ㎍/ml의 높은 농도의 트립신 및 50 U/ml의 콜라게나아제가 든 배지에서 배양하고 회수하여, F 개열형 SeV 벡터로 하였다(실시예 17 및 18 참조). 여기에서는, 감염시의 프로테아제 의존적인 선택을 실현하기 위해, 제작시에 프로테아제를 가하지 않고 SeV를 회수하여, F 비개열형 SeV를 제작하였다.

구체적으로는, 10 cm dish에 LLC-MK2/F7/M62/A 세포를 컨플루언트로 배양하였다. 실시예 17에서 조제한 각 F 개변 M 결실형 SeV를 Moi=5가 되도록 감염시켰다. 1시간 후, 상등액을 취하여 2회 MEM 배지로 세정하였다. 4 ml MEM을 가하여 32℃에서 배양하였다. 5일 후, 상등액을 회수하여 최종농도가 1%가 되도록 Bovine Serum Albumin(BSA)을 가하였다. HAU 역가를 측정 후, 사용할 때까지 -70℃에서 보존하였다. 각각의 F 개변 M 결실형 SeV는 2⁷~2¹⁰HAU/ml(1 HAU=1×10⁶particles/ml의 바이러스 입자로 환산되기 때문에, 1×10⁸~1×10⁹particles/ml에 상당한다) 사이에서 회수되어, 희석에 의해 1×10⁸particles/ml에 맞추었다.

Exogeneous experiment 결과, LLC-MK2로의 감염이 SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 MMP 의존적으로, SeV/F(uPA)△M-GFP는 uPA 또는 tPA 의존적으로 감염시키는 벡터를제작할 수 있었던 것이 확인되었다(exogeneous protease의 데이터는 나타내지 않는다). MMP 발현주 HT1080, tPA 발현주 MKN28, 프로테아제를 거의 발현하고 있지 않은 SW620에서, 프로테아제 발현에 의한 선택적 감염의 가능 여부를 내인성 실험에 의해 시도하였다(도 38). SeV/F(MMP#2)△M-GFP는 MMP 발현주 HT1080에서 감염이 보이지만, tPA 발현주 MKN28에서는 감염이 보이지 않는다. SeV/F(uPA)△M-GFP는 tPA 발현주 MKN28에서는 감염이 보이지만, MMP 발현주 HT1080에서는 감염이 보이지 않는다. 이와 같이 프로테아제 발현 의존적으로 각각의 SeV가 감염의 선택성이 나타내어졌다.

[실시예 26] 인간 섬유모세포(human fibroblast)에 의한 MMP3, MMP7 유도에 의한 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 감염

SW480 및 WiDr은 섬유모세포와 공배양, 또는 in vivo에서의 배양에 의해 각각 MMP3, MMP7이 유도되는 것이 나타내어져 있다(Kataoka, H. et al. (1997) Oncol. Res. 9, 101-109; Mc Donnell, S. et al. (1999) Clin. Exp. Metastasis. 17, 341-349). 이들 세포를 사용하여 in vivo에서 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 감염이 변화되는지 여부를 조사하였다. 96웰 플레이트에 각각의 암세포주를 컨플루언트(5×10⁴cell/well)가 되도록 배양하였다. MEM으로 2회 세정 후, 1 HAU/ml(1 HAU=1×10⁶particles/ml의 바이러스 입자로 환산하여 1×10⁶particles/ml)의 F 비개열형 SeV 함유 MEM을 50 ㎕ 가하여 감염시켰다. 5×10⁴cell/well이 되도록 Normal human lung fibroblast(TAKARA)를 가하여, 4일간 37℃에서 배양하였다(도39). SW480 및 WiDr은 모두 인간 섬유모세포를 공배양함으로써, SeV/F(MMP#2)△M-GFP가 감염되게 되었다. 유도되지 않는 SW620에서는 그 현상은 보이지 않는다.

[실시예 27] 인간 대동맥 평활근세포로의 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 MMP 선택적 감염

MMP의 발현 이상의 질병은 암 이외에도 동맥경화, 류머티스, 창상(創傷)치유 등에서 보고되어 있다(Galis, Z. S., and Khatri, J. J. (2002) Circ. Res. 90, 251-262; Martel-Pelletier, J. et al. (2001) Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. 15, 805-829).

이들 질환으로의 응용 가능성을 나타내기 위하여, 인간 대동맥 평활근세포로의 F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 MMP 선택적 감염을 시도하였다. 96웰 플레이트에 인간 평활근 세포(human smooth muscle cell)(TAKARA)를 컨플루언트(5×10⁵cell/well)가 되도록 배양하였다. MEM으로 2회 세정 후, SeV[F 비개열형: 1 HAU/ml(1×10⁶particles/ml)] 함유 MEM을 50 ㎕ 가하여 감염시켰다. 동량 50㎕의 프로테아제 함유 MEM을 가하여 4일간 37℃에서 배양하였다. 1 ㎟의 세포당 GFP가 발현하고 있는 세포를 카운트하였다(도 40). SeV/△M-GFP에서는 트립신을 가함으로써만 감염이 항진된 것에 대해, SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 콜라게나아제, MMP2, MMP3, MMP9로 그 감염이 항진되었다.

[실시예 28] F 개변 M 결실형 SeV 벡터의 프로테아제 의존적 F의 개열

실시예 20에서 F 개변 M 결실형 SeV 벡터는 각각의 프로테아제 분해서열을 F단백질에 삽입함으로써, M 결실형 SeV는 그 분해서열 의존적으로 세포융합형 감염을 하는 것을 나타내었다. 추가로 개변 후에 프로테아제 의존적으로 F0의 개열이 일어나고 있는지의 여부를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 바이러스의 샘플링은 이하의 방법으로 행하였다. SeV/△M, SeV/F(MMP#2)△M, SeV/F(uPA)△M의 3종류의 바이러스 입자를 MOI=3에서 M 단백 유도한 헬퍼 세포에 감염시켰다. 감염 2일 후, 상등액을 회수하여 x18500 g으로 3시간 원심하고, 그 침전물을 PBS로 재현탁하였다. 각각의 바이러스 현탁액에 7.5 ㎍/ml 트립신, 0.1 ng/ml MMP9, 0.1 ng/ml uPA의 최종농도가 되도록 프로테아제를 첨가하여, 37℃에서 30분간 처리한 후, 샘플 버퍼를 가하여 SDS-PAGE 샘플로 하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅은 정법(定法)에 따라 행하였다(Kido, H. et al. Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells. A possible activator of the viral fusion glycoprotein.J Biol Chem267, 13573-9(1992)). 항F1 토끼 항체는 3개의 혼합 합성 펩티드(FFGAVIGT+Cys: 117-124, EAREAKRDIALIK: 143-155, CGTGRRPISQDRS: 401-413; 각각 서열번호: 46, 47, 48)를 면역하여 항혈청을 얻었다. 2차 항체에는 HRP 표지 항토끼 IgG 항체(ICN, Aurola, OH)를 사용하고, 발색(發色)의 검출에는 화학형광법(ECL Western blotting detection reagents; Amersham Biosciences. Uppsala, Sweden)을 사용하였다. 도 41에는, F를 개변하지 않은 M 결실형 SeV 벡터(1, 4, 7, 10), F에 MMP#2 서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터(2, 5, 8, 11), F에 uPA 서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터(3, 6, 9, 12)를 상기의 프로테아제로 37℃에서 30분간 처리했을 때의 결과가 나타내어져 있다.

도 41로부터 알 수 있는 바와 같이, 트립신 존재하에서는 F를 개변하지 않은 M 결실형 SeV 벡터이고, MMP 존재하에서는 F에 MMP#2 서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터이며, uPA 존재하에서는 F에 uPA 서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터로, 각각 삽입한 프로테아제 기질에 따라 F1으로의 개열이 일어나고 있었다. 여기에는 나타내지 않지만 uPA 서열을 삽입한 M 결실형 SeV 벡터에 있어서는 트립신 존재하에서, 그 분해시간을 4시간으로 하자 F1으로의 개열이 보였다. 이것은 실시예 20의 결과와 합치하여, F의 개열 의존적으로 신시티움의 형성이 일어나고 있는 것이 나타내어졌다.

[실시예 29] F의 세포질 도메인 결실에 의한 융합능의 상승

파라믹소바이러스에 의한 숙주로의 침입은 바이러스의 막과 숙주측의 세포막의 융합에 의해 성립된다. 그 침입기구는 센다이 바이러스의 HN 단백이 숙주측의 시알산(sialic acid)에 결합하여, F 단백이 세포막의 융합을 일으킨다. 그 때, HN의 결합에 의해 F의 구조가 바뀌는 것이 중요한 것으로 되어 있다(Russell, C. J., Jardetzky, T. S. & Lamb, R. A. Membrane fusion machines of paramyxoviruses: capture of intermediates of fusion. Embo J 20, 4024-34(2001)). 그렇게 때문에, 대부분의 파라믹소바이러스의 F 단백은 단독으로 세포에 발현시켜도 세포끼리의 융합능이 없고, HN을 동시에 발현한 세포만 융합능을 갖는다. 파라믹소바이러스에 있어서 F 및 HN의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)의 결실은 그 융합능을 상승시키는 것으로 알려져 있다(Cathomen, T., Naim. H. Y. & Cattaneo, R. Measles viruses with altered envelope protein cytoplasmic tails gain cell fusioncompetence. J Virol 72, 1224-34(1998)). 센다이 바이러스에 있어서, 어느 F의 세포질 도메인의 결실 변이체가 융합능을 가장 잘 상승시키는지를, 결실 변이체를 제작하여 pCAGGS 발현 벡터(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199)에 탑재한 후, pCAGGS 탑재 HN을 동시에 트랜스펙션하여 그 융합능을 신시티움 수로 확인하였다.

F의 세포질 도메인이 결실된 변이체 유전자는 이하의 프라이머에 의해 각각 PCR을 행하여, 단편을 Xho I, Not I 처리 후, pCAGGS 벡터에 라이게이션하였다. Fct27 프라이머(5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3'/서열번호:49, 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3'/서열번호:50), Fct14 프라이머(5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3'/서열번호:51, 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3'/서열번호:52), Fct4 프라이머(5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3'/서열번호:53, 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3'/서열번호:54)(Kobayashi M et al. J. Virol., vol 77: 2607, 2003).

세포융합능의 측정을 위해, LLCMK2 또는 HT1080 세포를 24웰 플레이트로 컨플루언트가 되도록 뿌렸다. 50 ㎕ Opti-MEM에 대해 3 ㎕ Fugene6을 혼합하였다. 각 pCAGGS 발현 플라스미드를 2 ㎍과 등량의 pCAGGS/EGFP를 혼합 후, Opti-MEM과 Fugen6의 혼합액에 가하였다. 실온에서 15분간 방치 후, 500 ㎕ MEM 배지로 배지 교환한 24웰 플레이트로 첨가하였다. 37℃, 5% CO₂로 3시간 배양 후, HT1080의 경우1% FBS 첨가 MEM, LLCMK2의 경우 7.5 ㎍/ml의 트립신 또는 지정된 농도의 collagenase type IV(Clostridium)를 첨가한 MEM 배지로 치환하였다. 48시간 배양 후, 도립현미경(inverted microscope)의 100배 시야당(0.3 ㎠) 융합한 신시티움 수를 카운트하였다. 또는 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde) 고정 2시간 후, 70% 에탄올, 증류수 치환 하여 5분간 헤마톡실린 염색을 행한 후, 수세(水洗)하여 신시티움을 형성하고 있는 0.3 ㎠당 핵수를 카운트하였다.

3종류의 F의 세포질 도메인을 결실시킨 아미노산서열을 도 42(A)에, 그 융합활성을 도 42(B)에 나타낸다. 도 42(B)에 나타내는 바와 같이, F 단독에서는 융합한 세포는 없지만, HN을 공트랜스펙션함으로써 융합능을 나타내었다. 또한, 세포질 도메인이 14 아미노산이 되도록 28 아미노산이 결실된 서열의 F 단백질(Fct14)이 가장 그 융합능이 높은 것이 명확해졌다.

[실시예 30] F/HN 키메라 단백은 융합능을 비약적으로 상승시킨다

파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백은 세포막 상에서 F는 3량체이고, HN은 4량체를 형성하고 있어, 서로의 외부 도메인(Ectodomain) 및 M 단백질을 매개로 하여 상호 작용하고 있는 것이 명확해져 있다(Plemper, R. K., Hammond, A. L. & Cattaneo, R. Measles virus envelope glycoproteins hetero-oligomerize in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 276, 44239-46(2001)). 도 42에서 나타낸 바와 같이, F 단독에서는 융합능을 갖지 않아 HN이 필수이다. 이러한 사실로부터 F와 HN의 키메라 단백을 제작하여 동일한 세포막 상에 동시에 융합 단백으로서 F와 HN을 발현시킴으로써, 보다 융합능이 높은 벡터의 제작을 시도하였다. F는 II형 막단백이고, HN은 I형 막단백인 것으로 인해, 도 43(A)로 나타내는 바와 같이, 2개의 막관통 도메인을 갖는 세포막 상에서 U자형을 형성하는 키메라 단백을 제작하였다(Fct14/HN). F 단백은 융합능이 높았던 Fct14를 사용하였다. 동시에 그 2개의 단백 사이에 50 아미노산으로 되는 링커 서열을 삽입하였다(Fct14/Linker/HN). 이 링커 서열은 현재의 검색에서는 어느 단백에도 상동성을 갖지 않는 서열이다(Simian immunodeficiency virus(SIVagm)의 env의 세포질 도메인의 아미노산서열의 N 말단과 C 말단을 반대로 하여 합성한 non-sense 서열을 사용하였다).

F/HN 키메라 단백 유전자의 발현 플라스미드의 조제방법의 상세를 이하에 나타낸다. F/HN 키메라 단백 유전자를 pCAGGS 벡터에 탑재하였다. F 유전자 및 HN 유전자에 대해 각각 PCR을 행하여, 2개의 단편을 pCAGGS에 라이게이션하였다. 이 때, F/HN 유전자 사이에 150 bp의 링커 유전자(50 아미노산)를 삽입한 것, 하지 않는 것을 제작하였다. 이하에 프라이머의 서열을 나타낸다. F 유전자 프라이머(F-F:5'-ATCCGAATTCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG-3'/서열번호:55, Fct14-R:5'-ATCCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3'/서열번호:56), Linker/HN 유전자 프라이머(Linker-HN-F: 5'-ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3'/서열번호:57, HN-R: 5'-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCATAA-3'/서열번호:58), HN 유전자 프라이머(5'-ATCCGCGGCCGCAATGGATGGTGATAGGGGCA-3'/서열번호:59, 5'-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3'/서열번호:60).

도 43(B)에서 나타내는 바와 같이 링커 서열이 없는 키메라 단백에서는 낮은 융합능을 나타내는 것에 대해, 링커를 삽입함으로써 F와 HN을 동시에 트랜스펙션하는 것에 비해 약 5배 그 융합활성이 비약적으로 상승하는 것이 판명되었다.

[실시예 31] 융합능의 기능유지와 기질 특이성

F 단백질이 융합능을 획득하기 위해서는, HN이 동시에 발현할 뿐 아니라, 프로테아제에 의해 F 단백질이 2개의 서브 유닛(F1, F2)으로 개열하는 것이 불가결하다. 도 42 및 43에서는 트립신 존재하에서의 융합능을 측정하고 있어, 트립신이 없는 상태에서는 전혀 융합능이 없다. 도 43에서 나타낸 Fct14/Linker/HN 키메라 단백이 MMP 의존적으로 융합능을 획득하도록, F의 개열서열의 개변을 시도하였다. MMP의 분해기질의 서열에 대해서는 많은 보고가 있어, 그 중에서 8종류의 서열에 대해 개변을 시도하였다. QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)에 의해 도 44(A)와 같이 개열부위의 아미노산서열을 개변하였다. 이 개변에서 고려한 것은, 프로테아제에 의한 절단 후의 퓨전 펩티드(Fusion peptide)의 서열이다. 파라믹소바이러스의 F 단백질의 F1의 N 말단영역은 퓨전 펩티드라 불리고, 그 융합활성에 중요하여, 그 영역의 아미노산의 변이가 F 단백질의 융합능을 소실하는 경우가 있는 것이 보고되어 있다(Bagai, S. & Lamb, R. A. A glycine to alanine substitution in the paramyxovirus SV5 fusion peptide increases the initial rate of fusion. Virology 238, 283-90(1997)). 그 때문에 중요성이 지적되고 있는 F1의 N 말단영역 서열은 그대로 잔존시키기로 하였다. 그 경우도, MMP의 분해기질로서 일반적인 6 잔기서열을 도입하는 경우에는,MMP에 의한 분해 후에 F1의 N 말단에 3 잔기가 부가되는 디자인으로 되어, MMP에 의한 분해는 일어났다고 해도, F 단백의 융합능에 영향을 줄 가능성이 있는 것으로 추측되었다. 즉, MMP 의존적으로 개열하여 활성화하는 F 단백의 디자인을 행하기 위해서는, MMP에 의한 기질 특이성과 함께 개열 후의 F 단백의 융합능의 보유라고 하는 2점을 고려하여 디자인을 행하는 것이 필수이다.

MMP#1은 MMP의 합성기질로서 가장 잘 알려져 있는 서열이다. 이 서열은 그 밖의 MMP에 의한 타겟팅에도 사용되고 있는 서열이다. MMP#3 및 #8도 합성기질로서 시판되고 있는 서열이다. MMP#2, 6은 MMP2, 9의 분해기질 PLGMWS의 서열을 파지 디스플레이(phage display)로 명확해진 MMP9에 대한 콘센서스 서열 Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)에 따라 PLGMTS, PQGMTS로 개변하였다(각각 서열번호: 61 및 62). MMP#5는 슈나이더(Shneider) 등의 보고(American Society of Gene therapy, Annual meeting No.. 1163, 2002, Boston)에 의해 PQGLYA(서열번호:63)로 하였다. MMP#4는 분해 후의 Fusion peptide의 서열이 개변되지 않는다. MMP#7은 MMP2에 대한 파지 디스플레이로 명확해진 서열이다.

이하에, F/HN 융합유전자의 F의 활성화부위를 개변한 발현 플라스미드 조제의 상세를 나타내었다. F/HN 융합유전자를 구축 후, pBluscript F/HN 상에서 F의 활성화부위의 변이를 도입하였다. 변이의 도입에는 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은,

F(MMP#1):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3'/서열번호:64, 5'-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaa CccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:65),

F(MMP#2):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/서열번호:32, 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:33),

F(MMP#3):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3'/서열번호:34, 5'-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:35),

F(MMP#4):(5'-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3'/서열번호:36, 5'-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3'/서열번호:37),

F(MMP#5):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcagggCttGtatgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'서열번호:66, 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcataCaaGccctgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:67),

F(MMP#6):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcaaggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/서열번호:68, 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAA aCTCGtCatGccttgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:69),

F(MMP#7):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCctTgcTtaCtataCGgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3/'서열번호:70, 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcCGtataGtaAgcAagGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:71),

F(MMP#8):(5'-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCttGgCGAGaTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/서열번호:72, 5'-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAtCTCGcCaaGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/서열번호:73)

소문자 표기가 변이 도입 염기를 나타내고 있다. 개변 후, EcoRI로 잘라내어 pCAGGS로 라이게이션을 행하였다.

각각의 서열을 갖는 벡터와 EGFP 유전자를 갖는 벡터(pCAGGS/EGFP)를 등량 혼합하여, MMP를 고발현하고 있는 HT1080에 트랜스펙션하였다. 그 결과, MMP#2 및 #6의 서열의 유전자를 도입했을 때만 세포융합이 생겨 신시티움을 형성하였다(도 4(B)). 이들 서열에 공통인 것은, 프로테아제에 의한 절단 후, F1 단백의 N 말단에 Hy-S/T-S/T 서열(MTS)이 부가되는 것이다. 이것에 의해 Hy-S/T-S/T 서열(특히 MTS서열)의 부가라면, HT1080 유래의 MMP에 의한 F 단백의 절단과 함께, 개열 후의 F 단백의 융합능이 유지되어 있어, 이들 양자의 필요조건을 만족하고 있을 가능성이 높은 것으로 생각된다. 한편, MMP#1, #3, #4, #5, #7 및 #8의 경우, 세포융합이 전혀 보이지 않았다. MMP#4를 제외한 모든 서열은 MMP의 합성기질 유래의 서열이기 때문에 프로테아제에 의한 절단은 생겨 있을 것으로 예상되기 때문에, F1에 부가된 3 아미노산의 펩티드가 절단 후의 F 단백의 활성을 한정하고 있을 가능성이 시사되었다. 또한, MMP#4에 대해서는 이 조건에서는 프로테아제에 의한 절단 그 자체가 생겨 있지 않을 가능성이 높다. 그 근거로서, 데이터는 나타내지 않지만, HT1080에서 포오볼 에스테르(Phorbol ester)에 의한 MMP의 유도에 의해 MMP#4와 함께 신시티움의 형성이 보이게 되는 것으로도 명확하다.

더욱이 이 MMP#2, #6의 서열의 융합능의 비교와 함께 #6의 퓨전 펩티드 서열의 N 말단측으로부터 7번째와 12번째의 서열을 G에서 A로 개변한 서열에 대해서 MMP 농도 의존적인 세포융합능을 측정하였다(도 45). 이 F/HN 융합유전자의 변이 도입에 사용한 합성 올리고의 서열은 5'-CTTCGGTGCTGTGATTGcTACTATCGCACTTGcAGTGGCGACATCAGCAC-3'(서열번호:74) 및 5'-GTGCTGATGTCGCCACTgCAAGTGCGATAGTAgCAATCACAGCACCGAAG-3'(서열번호:75)이다. 소문자 표기가 변이 도입 염기를 나타내고 있다. 발현 플라스미드의 조제는 상기와 마찬가지로, 변이를 도입한 후에 EcoRI로 잘라내 pCAGGS로 라이게이션함으로써 행하였다.

그 결과, MMP#6 쪽이 MMP#2와 비교하여 2-3배 융합능이 높은 것을 알 수 있었다. 중요한 점은 MMP#6의 경우, 저농도의 프로테아제 농도 조건하에서도 세포융합이 일어나, 저농도에서의 F 단백의 활성화가 실현되고 있는 것이다. 그러나, F 단백의 융합능이 상승하는 변이로서 보고되어 있는 G에서 A로의 변이(Peisajovich, S. G., Epand, R. F., Epand, R. M. & Shai, Y. Sendai virus N-terminal fusion peptide consists of two similar repeats, both of which contribute to membrane fusion. Eur J Biochem 269, 4342-50(2002))를 추가로 도입한 경우(#6G12A), 융합능이 10분의 1 이하로 감소되어 버렸다. 이들 결과로부터, 프로테아제에 의한 트로피즘의 개변 때문에 프로테아제 분해서열을 단순히 삽입하는 것만으로는 F 단백의 활성을 유지할 수 없어 융합능을 잃는 경우가 많은 것이 명확해졌다. 목적으로 하는 분해서열을 도입하는 경우, 이 계를 사용하여 융합능의 확인을 행하여 바이러스를 구축하는 것이 가능하다. 또한, 이 pCAGGS에 탑재한 Fct14/Linker/HN의 키메라 유전자에서만 현저한 융합활성을 나타내는 것으로부터, 이 플라스미드 도입에 의한 항암효과가 있는 것으로 추측된다. 더욱이, 이 키메라 단백을 M 결실형 센다이 바이러스로 탑재함으로써 더욱 항암효과의 상승을 기대할 수 있다.

[실시예 32] 융합능을 상승시킨 개량형 F 개변 M 결실형 SeV 게놈 cDNA의 구축

실시예 29 및 30에 있어서 pCAGGS 벡터에 탑재한 F를 개변함으로써 융합능이 상승하는 것을 나타내었지만, 동일한 개변을 M 결실형 센다이 바이러스 벡터에 행함으로써, 융합능을 상승시킨 개량형 F 개변 △M SeV의 제작을 시도하였다. 개변형 F 개변 M 결실형 SeV 게놈 cDNA의 유전자 구축을 이하의 방법으로 행하였다.SeV/F(MMP#6)△M-GFP에 관해서는, 실시예 16과 동일한 방법으로 행하였다. F 유전자로의 변이 도입은 서열번호:69의 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 LITMUSSalI/NheIfrg△M-GFP 상에서 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. 변이를 도입한 LITMUSSalI/NheIfrg△M-GFP의 Sal I, Nhe I 소화 후의 단편과 F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 F 결실형 센다이 바이러스 전장 게놈 cDNA(pSeV+18/F-GFP:Li, H et al J. Viol. 74, 6564-6569(2000), WOOO/70070)의 Sal I 및 Nhe I로 소화한 NP 유전자를 포함하는 단편을 라이게이션하여, SeV/F(MMP#6)△M-GFP의 cDNA를 구축하였다(도 46). F 단백질의 세포질 도메인의 28 아미노산을 결실시킨 M 결실형 센다이 바이러스(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP) 및 F/HN 키메라 단백을 탑재한 M 결실형 센다이 바이러스(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP)의 구축은 멀티클로닝 사이트 센다이 바이러스 cDNA(pSeV(TDK)라 칭한다)(일본국 특허공개 제2002-272465)를 기본 골격으로 하였다. F 단백질의 세포질 도메인을 절단한(truncate) M 결실형 센다이 바이러스 SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP는 이하와 같이 구축하였다. TDK를 골격으로 하기 위해, 먼저 pSeV(TDK)/△M-GFP를 제작하였다. LITMUSSalI/NheIfrg△M-GFP를 주형으로 하여 합성 프라이머(Nhe-GFP-F: ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(서열번호:94)와 GFP-EIS-BssHII: ATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(서열번호:95))를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 GFP/EIS(전사개시 종결시그날을 코드하는EIS 서열을 부가한 GFP)와 멀티클로닝 사이트 센다이 바이러스 cDNA를 NheI, BssHII 처리하여, 단편을 라이게이션함으로써 M 단백을 GFP로 치환하여 pSeV(TDK)/△M-GFP를 제작하였다.

추가로 실시예 31에서 제작한 pCAGGS/Fct14(MMP#6)/Linker/HN을 주형으로 하여 합성 프라이머 Mlv-F: ATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG(서열번호:96) 및 Fct14-EIS-Sal I: ATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTAACGGTCATCT GGATTACC(서열번호:97)를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 Fct14(MMP#6)를 F 유전자 대신에 F의 위치에 삽입, 치환하여, pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP를 구축하였다(도 46). 이어서, F/HN 키메라 단백을 탑재한 M 결실형 센다이 바이러스(pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP)의 구축을 행하였다. GFP를 주형으로 하여 합성 프라이머(Nhe-GFP-F: ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(서열번호:98)와 GFP-EIS-SalI: ATCCGCTAGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(서열번호:99))를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 GFP/EIS와 멀티클로닝 사이트 센다이 바이러스 cDNA를 Nhe I, Sal I 처리하여, 단편을 라이게이션함으로써 M 유전자 및 F 유전자를 결실시켜 GFP로 치환한, pSeV(TDK)/△M△F-GFP를 제작하였다. 추가로 실시예 31에서 제작한 Fct14(MMP#6)/Linker/HN을 주형으로 하여, 합성 프라이머(F/HN5' Nhe-F: ATCCGCTAGCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG(서열번호:100), F/HN3' Nhe-EIS-R: ATCCGCTAGCACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA(서열번호:101))를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 Fct14(MMP#6)/Linker/HN을 상기의 pSeV(TDK)/△M△F-GFP의 Nhe I 부위에 라이게이션함으로써 pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN△M-GFP를 구축하였다.

[실시예 33] 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스의 재구성과 증폭

실시예 32에서 구축한 cDNA로부터의 바이러스의 재구성은 Li 등의 보고(Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569(2000). WO00/70070)에 따라 행하였다. 그러나, 실시예 17과 마찬가지로 M 결실형이기 때문에, M 단백을 트랜스에 공급하는 것이 가능한 헬퍼 세포(실시예 11)를 이용하였다. 헬퍼 세포 제작에는 Cre/loxP 발현 유도 시스템을 이용하고 있다. 해당 시스템은 Cre DNA 리콤비나아제에 의해 유전자산물을 유도 발현하도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121(1988))를 이용한 것으로, 동일 플라스미드의 형질전환체에 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 사이토 등의 방법(Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821(1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121(1998))으로 감염시켜 삽입유전자를 발현시킨다. F의 활성화부위를 변환한 M 결실형 SeV의 재구성은 이하와 같이 행하였다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶cells/dish로 100 mm 샬레에 뿌려 24시간 배양 후, 소랄렌(psoralen)과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(PLWUV-VacT7: Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))를 실온에서 1시간 감염시켰다(MOI 2). 세포를 무혈청의 MEM으로세정한 후, 플라스미드 pSeV/F(MMP#6)△M-GFP(또는 pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP, pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579(1996)), pGEM/M 및 pGEM/F-HN(Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569(2000), WO00/70070)을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM(Gibco-BRL, Rockville, MD)에 현탁하여, 1 ㎍ DNA/5 μL 상당의 SuperFect transfection reagent(Qiagen, Bothell, WA)를 넣고 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 3 mL에 넣고 세포에 첨가하여 배양하였다. 5시간 배양한 후 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 2회 세정하여, 40 ㎍/mL의 시토신 β-D-아라비노후라노시드(AraC:Sigma, St. Louis, MO) 및 7.5 ㎍/mL의 트립신(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 MEM에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 8.5×10⁶cells/dish당 F 단백을 지속 발현하는 세포(LLC-MK2/F7/M62/A: 실시예 12)를 중층하여, 40 ㎍/mL의 AraC 및 7.5 ㎍/mL의 트립신을 포함하는 MEM에서 추가로 2일간 37℃로 배양하였다(P0). 이들 세포를 회수하여 펠릿을 2 mL/dish당 Opti-MEM에 현탁하였다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 용해질을 그대로 LLC-MK2/F7/M62/A에 트랜스펙션하여 40 ㎍/mL의 AraC, 7.5 ㎍/mL의 트립신 및 50 U/mL의 type IV collagenase(ICN, Aurola, OH)를 포함하고(pSeV(TDK)Fct14(MMP#6) /Linker/HN △M-GFP의 경우 트립신만) 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P1). 3~14일 후에 배양상청의 일부를 취해, 새롭게 조정한 LLC-MK2/F7/M62/A에 감염시켜, 40 ㎍/mL의 AraC, 7.5 ㎍/mL의트립신 및 50 U/mL의 type IV collagenase를 포함하고 (pSeV(TDK)Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP의 경우 트립신만) 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 배양하였다(P2). 3~14일 후에 새롭게 조정한 LLC-MK2/F7/M62/A에 재감염시켜, 7.5 ㎍/mL 트립신 및 50 U/mL의 type IV collagenase를 포함하고(pSeV(TDK)Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP의 경우 트립신만) 혈청을 포함하지 않는 MEM을 사용하여 32℃에서 3~7일간 배양하였다(P3). 회수한 배양상청에 최종농도 1%가 되도록 BSA를 첨가하여 -80℃에서 보존하였다. 보존 바이러스액을 해동하여 그 다음의 생산 및 in vitro 실험에 제공하였다.

이상과 같이, F 단백질 개열부위를 PLGMTS(서열번호:61)에서 PQGMTS(서열번호:62)로 한 SeV/F(MMP#6)△M-GFP, 세포질 도메인을 28 아미노산이 결실된 SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)△M-GFP 및 F/HN의 키메라 단백을 탑재한 SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP의 제작에 성공하였다.

[실시예 34] 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터의 융합활성의 상승

실시예 33에서 제조한 바이러스의 성능을 조사하기 위해, 이하와 같이 MMP2 및 MMP9의 발현량이 다른 여러 암세포주와 MMP의 발현이 검출되지 않는 LLCMK2로 감염시켜 세포융합능을 측정하였다(도 47). 각종 암세포(HT1080, U87MG, A172, U251, SW480, LLCMK2)를 공여처(供與先)로부터 제시된 배지에서 24웰 플레이트로 컨플루언트가 되도록 뿌렸다. U87MG(ATCC NO. HTB-14), A172(ATCC No. CRL-1620)는 ATCC로부터 구입하였다. U251(IF050288)은 JCRB cell bank로부터 구입하였다. MEM배지에서 2회 세정 후, 각각의 M 결실형 센다이 바이러스 벡터(SeV/△M-GFP)를 MOI=0.1에서 감염시켰다. 실온에서 1시간 방치 후, MEM 배지로 세정하여 0.5 ml의 1% FBS 첨가 MEM을 24웰 플레이트에 가하였다. 48시간 배양 후, 도립현미경의 100배 시야당(0.3 ㎠) 융합한 신시티움의 수를 카운트하였다. 또는 4% 파라포름알데히드를 사용하여 2시간 고정 처리를 행한 후, 70% 에탄올, 증류수 치환 후, 5분간 헤마톡실린 염색을 행하여 수세 후, 신시티움을 형성하고 있는 0.3 ㎠당 핵수를 카운트하였다. 결과를 도 49에 나타내었다.

MMP2, 9의 발현은 실시예 22에서 행한 젤라틴 자이모그래피에 의해 확인하였다(도 48). 그 결과, HT1080, U87MG, A172에서 MMP2의 발현이 확인되었다. 또 U251과 SW480에서 낮은 MMP9의 발현이 확인되었다. LLCMK2에서 MMP2의 발현이 있는 것처럼 보이는 것은 1% 혈청을 포함하고 있기 때문에, 혈청 중의 MMP2의 활성이 보이고 있다. 각각의 암세포주에 감염 2일 후, GFP의 확산을 관찰하였다. 그 결과, 종래형 SeV/F(MMP#2)△M-GFP에서는 확산되지 않은 U251, SW480에 있어서 개량형 F 개변 M 결실형 센다이 바이러스 벡터에 있어서, 특히 F/HN 키메라 단백을 탑재한 M 결실형 센다이 바이러스 벡터(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/Linker/HN △M-GFP)에서 융합활성이 보이게 되었다. 데이터로는 나타내지 않지만, 마우스 폐암 Lewis lung carcinoma 및 마우스 대장암 colon 26에 있어서도, 마찬가지로 개량형으로 함으로써 M 결실형 센다이 바이러스 벡터 감염 후 융합활성이 보이게 되어, 개량형으로 함으로써 더욱 효과의 증대와 낮은 농도의 MMP량의 암에도 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 의해, 목적으로 하는 프로테아제 존재하에서 특이적으로 감염을 확산하는 벡터가 제공되었다. 본 발명의 벡터는 바이러스 유사 입자를 유의하게 생산하지 않고, 세포융합에 의해 인접하는 주위의 세포에 벡터를 전달한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 목적으로 하는 조직의 국재에 국한하여 벡터를 감염시키기 때문에 유용하다. 특히 본 발명에 의해 암 특이적으로 감염을 확산하는 벡터가 제공되었다. 이 벡터는 종양 증식에 대한 강한 억제작용을 가지고 있다. 본 발명의 벡터를 사용한 암의 유전자치료는 부작용이 적은 새로운 암치료로서 높은 가능성을 가지고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC RESEARCH INC. <120> A vector with an altered tropism of protease dependency <130> D3-A0202P <150> JP 2002-129351 <151> 2002-04-30 <160> 101 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence proteolytic cleavage <400> 1 Met Thr Ser 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for proteolytic cleavage <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for Leu or Gln. <400> 2 Pro Xaa Gly 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for proteolytic cleavage <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for Leu or Gln. <400> 3 Pro Xaa Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for proteolytic cleavage <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for Leu or Gln. <400> 4 Pro Xaa Gly Met Thr 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 5 Pro Gln Ser Arg 1 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for proteolytic cleavage <400> 6 Val Gly Arg 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 7 Gln Ser Arg 1 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 8 ctttcaccct 10 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 9 tttttcttac tacgg 15 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence containing Not I site <400> 10 cggccgcaga tcttcacg 18 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 11 gaaacaaaca accaatctag agagcgtatc tgacttgac 39 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 12 gtcaagtcag atacgctctc tagattggtt gtttgtttc 39 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 13 attacggtga ggagggctgt tcgagcagga g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 14 ctcctgctcg aacagccctc ctcaccgtaa t 31 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 15 ggggcaatca ccatatccaa gatcccaaag acc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 16 ggtctttggg atcttggata tggtgattgc ccc 33 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 17 catgctctgt ggtgacaacc cggactaggg gttatca 37 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 18 tgataacccc tagtccgggt tgtcaccaca gagcatg 37 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 19 cttgtctaga ccaggaaatg aagagtgcaa ttggtacaat a 41 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 20 tattgtacca attgcactct tcatttcctg gtctagacaa g 41 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for immunization <400> 21 Met Ala Asp Ile Tyr Arg Phe Pro Lys Phe Ser Tyr Glu Cys 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for immunization <400> 22 Leu Arg Thr Gly Pro Asp Lys Lys Ala Ile Pro His Cys 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for immunization <400> 23 Cys Asn Val Val Ala Lys Asn Ile Gly Arg Ile Arg Lys Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 24 agagtcactg accaactaga tcgtgcacga ggcatcctac catcctca 48 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 25 tgaggatggt aggatgcctc gtgcacgatc tagttggtca gtgactct 48 <210> 26 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for amplifing hygromycin resistant gene <400> 26 tctcgagtcg ctcggtacga tgaaaaagcc tgaactcacc gcgacgtctg tcgag 55 <210> 27 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for amplifing hygromycin resistant gene <400> 27 aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgcct attcctttgc 60 cctcggacga gtgctggggc gtc 83 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 28 ccaatctacc atcagcatca gc 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 29 ttcccttcat cgactatgac c 21 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from Sendai virus <400> 30 agagaacaag actaaggcta cc 22 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence for proteolotic cleavage <400> 31 Pro Leu Gly Leu Gly Leu 1 5 <210> 32 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 32 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcat gacgagtttc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatc 74 <210> 33 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 33 gatagtacca atcacagcac cgaagaaact cgtcatgcca agaggggcat tttgtgtcgt 60 atcattggtg acag 74 <210> 34 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 34 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcct ggggttattc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatcg 75 <210> 35 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 35 cgatagtacc aatcacagca ccgaagaata accccaggcc aagaggggca ttttgtgtcg 60 tatcattggt gacag 75 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 36 caaaatgccg gtgctccccc gttgggattc ttcggtgctg tgatt 45 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 37 aatcacagca ccgaagaatc ccaacggggg agcaccggca ttttg 45 <210> 38 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 38 gacacaaaat gccggtgctc ccgtggggag attcttcggt gctgtgattg 50 <210> 39 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence used in site directed mutagenesis of the Sendai virus <400> 39 caatcacagc accgaagaat ctccccacgg gagcaccggc attttgtgtc 50 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from F protein of Sendai virus <400> 40 Gly Val Pro Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from mutagenized F protein of Sendai virus <400> 41 Gly Val Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from mutagenized F protein of Sendai virus <400> 42 Gly Val Pro Leu Gly Leu Gly Leu Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from mutagenized F protein of Sendai virus <400> 43 Gly Val Pro Leu Gly Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificially synthesized sequence derived from mutagenized F protein of Sendai virus <400> 44 Gly Val Pro Val Gly Arg Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amphiphilic alpha-helix domain of Sendai virus <400> 45 Lys Ala Cys Thr Asp Leu Arg Ile Thr Val Arg Arg Thr Val Arg Ala 1 5 10 15 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a synthetic polypeptide <400> 46 Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr 1 5 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a synthetic polypeptide <400> 47 Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a synthetic polypeptide <400> 48 Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 49 ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a 31 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 50 atagtttagc ggccgctcat ctgatcttcg gctctaatgt 40 <210> 51 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 51 ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a 31 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 52 atagtttagc ggccgctcac cttctgagtc tataaagcac 40 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 53 ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a 31 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 54 atagtttagc ggccgctcac cttctgagtc tataaagcac 40 <210> 55 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer, F-F <400> 55 atccgaattc agttcaatga cagcatatat ccagag 36 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fct14-a synthetic primer, Fct14-R <400> 56 atccgcggcc gccggtcatc tggattaccc attagc 36 <210> 57 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer, Linker-HN-F <400> 57 atccgcggcc gcaatcgagg gaaggtggtc tgagttaaaa atcaggagca acgacggagg 60 tgaaggacca gaggacgcca acgacccacg gggaaagggg tgaacacatc catatccagc 120 catctctacc tgtttatgga cagagggtta gg 152 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer, HN-R <400> 58 atccgcggcc gcttaagact cggccttgca taa 33 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 59 atccgcggcc gcaatggatg gtgatagggg ca 32 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic primer <400> 60 atccgcggcc gcttaagact cggccttgca 30 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MMP cleavage sequence <400> 61 Pro Leu Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MMP cleavage sequence <400> 62 Pro Gln Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MMP cleavage sequence <400> 63 Pro Gln Gly Leu Tyr Ala 1 5 <210> 64 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 64 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcct ggggttattc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatcg 75 <210> 65 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 65 cgatagtacc aatcacagca ccgaagaata accccaggcc aagaggggca ttttgtgtcg 60 tatcattggt gacag 75 <210> 66 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 66 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcagggctt gtatgctttc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatc 74 <210> 67 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 67 gatagtacca atcacagcac cgaagaaagc atacaagccc tgaggggcat tttgtgtcgt 60 atcattggtg acag 74 <210> 68 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 68 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcaaggcat gacgagtttc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatc 74 <210> 69 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 69 gatagtacca atcacagcac cgaagaaact cgtcatgcct tgaggggcat tttgtgtcgt 60 atcattggtg acag 74 <210> 70 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 70 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ttgcttacta tacggctttc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatc 74 <210> 71 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 71 gatagtacca atcacagcac cgaagaaagc cgtatagtaa gcaagggcat tttgtgtcgt 60 atcattggtg acag 74 <210> 72 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 72 ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggctt ggcgagattc ttcggtgctg 60 tgattggtac tatc 74 <210> 73 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 73 gatagtacca atcacagcac cgaagaatct cgccaagcca agaggggcat tttgtgtcgt 60 atcattggtg acag 74 <210> 74 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 74 cttcggtgct gtgattgcta ctatcgcact tgcagtggcg acatcagcac 50 <210> 75 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a synthetic oligonucleotide used for mutagenesis <400> 75 gtgctgatgt cgccactgca agtgcgatag tagcaatcac agcaccgaag 50 <210> 76 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a partial sequence of Sendai virus F protein <400> 76 Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly 1 5 10 15 Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys 20 25 30 Ile Arg His Met Tyr Thr Lys Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu Lys 35 40 45 Arg <210> 77 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a partial sequence of Sendai virus F protein <400> 77 Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly 1 5 10 15 Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys 20 25 30 Ile Arg <210> 78 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a partial sequence of Sendai virus F protein <400> 78 Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly 1 5 10 15 Asn Pro Asp Asp Arg 20 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a partial sequence of Sendai virus F protein <400> 79 Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 80 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> a linker sequence <400> 80 Ala Ala Ala Ile Glu Gly Arg Trp Ser Glu Leu Lys Ile Arg Ser Asn 1 5 10 15 Asp Gly Gly Glu Gly Pro Glu Asp Ala Asn Asp Pro Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Val Gln His Ile His Ile Gln Pro Ser Leu Pro Val Tyr Gly Gln Arg 35 40 45 Val Arg 50 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 81 Ala Gly Val Pro Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 82 Ala Pro Leu Gly Leu Trp Ala Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 83 Ala Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 84 Ala Pro Leu Gly Leu Gly Leu Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 85 Ala Gly Val Pro Pro Leu Gly Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 86 Ala Pro Gln Gly Leu Tyr Ala Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 87 Ala Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 88 Ala Leu Ala Tyr Tyr Thr Arg Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 89 Ala Pro Leu Gly Leu Ala Arg Phe Phe Gly Ala Val 1 5 10 <210> 90 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 90 Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val 1 5 10 15 Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr 20 <210> 91 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 91 Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr 20 25 <210> 92 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 92 Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala 1 5 10 15 Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr 20 25 <210> 93 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> F protein cleavage site <400> 93 Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Ala Thr Ile Ala 1 5 10 15 Leu Ala Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr 20 25 <210> 94 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 94 atccgctagc ccgtacggcc atggtgagca ag 32 <210> 95 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 95 atccgcgcgc ccgtacgatg aactttcacc ctaagttttt cttactacgg agctttactt 60 gtacagctcg tc 72 <210> 96 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 96 atccacgcgt catgacagca tatatccaga g 31 <210> 97 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 97 atccgtcgac acgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctactttaac ggtcatctgg 60 attacc 66 <210> 98 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 98 atccgctagc ccgtacggcc atggtgagca ag 32 <210> 99 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 99 atccgctagc ccgtacgatg aactttcacc ctaagttttt cttactacgg agctttactt 60 gtacagctcg tc 72 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 100 atccgctagc agttcaatga cagcatatat ccagag 36 <210> 101 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized oligonucleotide <400> 101 atccgctagc acgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacttttaa gactcggcct 60 tgcataa 67

Claims (23)

1. 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이, 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 포함하는 복합체로, 이하의 성질을 갖는 복합체,

   (1) 상기 복합체가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고,

   (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며,

   (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 복합체가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 RNA를 도입하는 능력을 갖는다.
2. 제1항에 있어서, 바이러스 입자인 복합체.
3. 제2항에 있어서, 야생형 F 단백질을 추가로 포함하는 복합체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 복합체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 암에서 활성이 항진하는 프로테아제인 복합체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 매트릭스 메탈로프로테아제 또는 플라스미노겐 활성제인 복합체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제에 의해 개열되는 서열이 Pro-Leu-Gly, Pro-Gln-Gly, 또는 Val-Gly-Arg를 포함하는 복합체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개변 F 단백질에 있어서, 야생형 F 단백질이 갖는 세포질 도메인의 일부가 결실되어 있는 복합체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개변 F 단백질이 HN 단백질과 융합하고 있는 복합체.
10. 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) M 단백질을 코드하는 핵산이 변이 또는 결실되어 있고, 또 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자로서, (1) 상기 바이러스 입자가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고, (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며, (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 게놈 RNA를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자의 제조방법으로서,

    (i) 파라믹소바이러스의 야생형 M 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 상기 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정,

    (ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법.
11. 파라믹소바이러스의 게놈 RNA로서, (a) 조건적 변이를 갖는 M 단백질을 코드하고, 또한 (b) 개변 F 단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질을 코드하는 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자로서, (1) 상기 바이러스 입자가 도입된 세포내에서 상기 게놈 RNA를 복제하는 능력을 갖고, (2) 숙주내 환경에 있어서 바이러스 입자의 생산이 유의하게 저하 또는 상실되어 있으며, (3) 상기 프로테아제의 존재에 의존하여, 상기 게놈 RNA를 갖는 바이러스 입자가 도입된 세포와 접촉하는 세포에 상기 게놈 RNA를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자의 제조방법으로서,

    (i) 상기 M 변이 단백질의 허용 조건하, 세포내에서 상기 파라믹소바이러스의 N, P 및 L 단백질 및 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 증폭시키는 공정,

    (ii) 상기 세포의 배양상청에 방출된 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 공정 (i)를 35℃ 이하에서 행하는 방법.
13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 공정 (i)~(ii) 중 적어도 어느 하나의 시기에 있어서 상기 개변 F 단백질을 개열시키는 프로테아제를 존재시키거나, 또는 공정 (ii)에 있어서 회수된 바이러스 입자를 상기 프로테아제로 처리하는 공정을 포함하는 제조방법.
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 공정 (i)에 있어서 상기 세포내에서 파라믹소바이러스의 야생형 F 단백질을 발현시키고, 공정 (i)~(ii) 중 적어도 어느 하나의 시기에 있어서 상기 야생형 F 단백질을 개열시키는 프로테아제를 존재시키거나, 또는 공정 (ii)에 있어서 회수된 바이러스 입자를 상기 프로테아제로 처리하는 공정을 포함하는 제조방법.
15. 제5항의 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료조성물.
16. 파라믹소바이러스 F 단백질의 개변 단백질로서, 개열부위에 Pro-Leu-Gly, Pro-Gln-Gly, 또는 Val-Gly-Arg를 포함하고, 매트릭스 메탈로프로테아제 또는 플라스미노겐 활성제의 존재하에서 세포융합능을 나타내는 재조합 단백질.
17. 제16항의 단백질을 코드하는 핵산.
18. 제16항의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자.
19. 파라믹소바이러스 F 단백질 및 HN 단백질의 막관통영역을 가지고, 세포질측에 있어서 서로의 단백질이 결합하고 있는 융합단백질로서, 세포융합 활성을 갖는 단백질.
20. 제19항의 융합단백질로서, 상기 단백질의 개열부위의 서열이 야생형 F 단백질을 개열하지 않는 프로테아제에 의해 개열되는 서열로 치환된 단백질.
21. 제19항의 단백질을 코드하는 핵산.
22. 제21항의 핵산을 포함하는 벡터.
23. 제19항의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자.