CN105541969A - 一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用 - Google Patents
一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用，所述酶切序列肽是酶切序列的串联多肽，该串联多肽是由2-15个基质金属蛋白酶酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列，所述单体肽为Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的切割位点(Glu-Pro)连接起来。本发明的多核苷酸序列为编码本发明的串联多肽的核苷酸序列。本发明成功实现了小分子基质金属蛋白酶酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表达，制得的基质金属蛋白酶酶切序列肽为其在科学研究相关产品及药物等产品的市场化提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶酶切序列肽的串联多肽、编码该串联多肽的核苷酸序列、表达载体及所述多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产基质金属蛋白酶酶切序列中的应用。
背景技术
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一组含Zn2+的、参与降解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的最重要的蛋白酶。目前研究已经证实MMPs参与人体众多的生理和病理过程，因其能对基底膜和细胞外基质进行分解从而造成肿瘤的侵袭和转移成为肿瘤学研究的一个热点。MMP2是MMPs超家族中的能降解明胶的胶原酶。在很多肿瘤细胞中，MMP2都出现过表达的现象，如在乳腺癌细胞中，MMP2就出现过量表达的情况。
MMP2降解明胶是通过切割明胶中的特异性的氨基酸序列，即MMP2酶切序列肽，故我们可以把MMP2蛋白作为治疗肿瘤的靶蛋白，通过把抗肿瘤的化学小分子连接到MMP酶切序列肽上，可以定向的把抗肿瘤的小分子带到肿瘤细胞周围，MMP2蛋白切割MMP2酶切序列肽后，释放抗肿瘤小分子药物；一方面达到了抗肿瘤药物在肿瘤细胞上面的富集，另一方面可以把小分子释放出来更特异的作用于肿瘤细胞。但是现有技术中把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程载体上并把载体导入工程菌种，小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解，原料生产复杂而且成本高。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术中小分子肽在微生物工程菌中表达率低及易降解的问题，本发明提供一种MMP2酶切序列的串联多肽，通过生物学的方法，把MMP2酶切序列肽的基因克隆到工程载体上并把载体导入工程菌种，最后生产MMP2蛋白酶切割序列肽单体，小分子肽表达率提高，且不易降解，为以后的药物设计提供原料支持，也降低了成本。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种基质金属蛋白酶-MMP2酶切序列的串联多肽，该串联多肽是由2-15个MMP2酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列；所述单体肽序列为：Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的酶切割位点连接，所述切割位点为Glu-Pro。
优选的，所述串联多肽是由8个MMP2酶切序列单体肽通过甲酸的酶切位点首尾串联而成的串联多肽。
优选的，所述单体肽的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。
一种编码上述串联多肽的多核苷酸序列。
优选的，所述多核苷酸序列为SEQIDNO:2。
一种所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用。
优选的，所述表达生产MMP2酶切序列肽的微生物为原核微生物。
一种重组载体，所述重组载体含有多核苷酸序列所述的任一种多核苷酸序列。
(三)有益效果
本发明提供了一种基质金属蛋白酶酶切序列肽、表达载体、多核苷酸序列及应用，本发明相对于现有技术，其有益效果如下：
本发明构建了串联多肽及编码它的多核苷酸序列及重组载体，采用基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽，而且成功实现了小分子MMP2酶切序列肽在微生物工程菌中的高效表达，表达的融合蛋白经过特异性的甲酸酶切和近一步的分离纯化，制得了高产量的MMP2酶切序列肽单体。
本发明采用基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽，采用化学方法切割，即甲酸切割，简化了分离纯化工艺复杂，解决了产量低的问题，而且生产不受原料限制，能进行工厂化自动化大规模生产，降低了生产成本，为MMP2酶切序列在科学研究相关产品及药物等产品的市场化提供了技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中重组表达载体的构建过程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
将本发明的串联多肽的氨基酸序列按照偏爱密码子翻译成的多核苷酸序列定义为ACS-N，两个MMP2酶切序列肽单体串联的N为2，三个MMP2酶切序列单体串联的N为3，其余的依次类推。
将本发明的多核苷酸序列通过本领域熟知的基因工程技术，来表达生产MMP2酶切序列肽。
将本发明的串联多肽的氨基酸序列，按照偏爱密码子如大肠杆菌偏爱密码子、酵母菌偏爱密码子等翻译成多核苷酸序列。化学合成该多核苷酸序列后，通过本领域熟知的基因工程技术，可构建各种原核表达载体、真核表达载体和穿梭质粒载体，并转化原核、真核生物以得到表达。具体过程可如下所述：
化学合成双链目的基因ACS-N片段，根据选定的表达载体的多克隆位点，合成时在ACS-N序列的5'端和3'端加上可连接到载体上的限制性酶切位点和终止密码子，例如，在5'端加上BamH1位点，在3'端加上HindIII位点，并克隆至高拷贝质粒例如pMD19-T质粒中。转入宿主菌例如大肠杆菌DH5α中保存。
扩增培养并提取含目的基因的高拷贝质粒，同时扩增培养并提取表达载体；克隆质粒和表达载体分别经过双酶切，割胶分别回收目的基因片段和表达载体片段，将目的基因片段和表达载体片段用SolutionI快速连接酶连接，即构建了含有DNA序列ACS-N的重组载体，例如图1所示的重组质粒pET28a-his-sumo：：ACS-N。把获得的重组载体转化宿主菌，例如大肠杆菌BL21，获得用来表达ACS-N多肽的转化子。
将扩繁后的工程菌诱导，诱导产物用甲酸酸切割后，用反向高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，纯化得到的MMP2酶切序列肽单体经过氨基酸序列分析，其序列为Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，表明利用基因工程方法成功制备MMP2酶切序列肽。甲酸切割的最佳条件是50％甲酸终浓度70摄氏度切割30小时。RP-HPLC纯化MMP2酶切序列肽的最佳条件为：乙腈浓度15％，三氟乙酸浓度1％，洗脱速度1.5mL/min，发明人分别将2～11个MMP2酶切序列肽单体用甲酸的酶切位点Glu-Pro串联起来构成系列氨基酸序列，并全部化学合成了对应于这些串联多肽的系列多核苷酸序列，并依次构建了含有不同MMP2酶切序列肽串联数的系列工程菌BL21/pET-28a：：ACS-N,分别扩增这些工程菌后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导产物用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体肽ACS-1含量，结果表明8个MMP2酶切序列肽单体串联起来表达，表达量最大，达到500mg/L。
实施例1：2个MMP2酶切序列肽单体串联的ACS-2多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达。
将两个MMP2单体Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu用甲酸切割位点Glu-Pro连接构成2拷贝的串联多肽(14肽)，该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:3所述，具体如下：
Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
1714
选择pET28a-his-sumo(pET28a构自Novagen公司)，并自行改造成pET28a-his-sumo载体作为该串联十四肽的融合表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将十四肽的氨基酸序列转化成如序列表中SEQIDNO：4所述的多核苷酸序列，即ACS-2：
CCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGAT
并在该多核苷酸序列的5'端加上BamHI酶切位点GGATCC,在3'端加上终止密码子TGA和HindIII酶切位点AAGCTT，最终设计成如下多核苷酸序列：
GGATCCCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATAAGCTT
化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pMD19-T中，得到含目的基因的克隆载体pMD19-T：ACS-2，将该载体转化宿主菌DH5α种保存。
按图1所示构建重组表达载体pMD19-T：ACS-2。将重组表达载体pMD19-T：ACS-2转化大肠杆菌E.coliBL21，然后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pMD19-T：ACS-2。将构建的基因工程菌E.coliBL21(pMD19-T：ACS-2)液体培养至对数期OD值0.8，加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L诱导表达5h，诱导产物SUMO融合蛋白(SUMO-ACS-2)用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体ACS含量，结果表明2个MMP2酶切序列单体肽串联起来表达，表达量达到100mg/L。
实施例2：8个MMP2酶切序列肽单体串联的ACS-8多肽大肠杆菌表达系统的构建及表达。
将八个MMP2酶切序列单体Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu用甲酸酶酶切位点(Glu-Pro)连接构成8拷贝的串联多肽(56肽)该串联多肽的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：5所述，具体如下：
Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-
171421
Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
283542
Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu-Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu
4956
选择pET28a-his-sumo作为表达载体，根据大肠杆菌偏爱密码子，将56肽的氨基酸序列转化成序列表中SEQIDNO：6所述的多核苷酸序列，即ACS-8：
CCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGAT
并在该核苷酸序列的5'端加上BamHI酶切位点GGATCC,在3'端加上终止密码子TGA和HindIII酶切位点AAGCTT，最终设计成如下多核苷酸序列：
GGATCCCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATCCGCTTGGTATGACTTCAGATAAGCTT
化学合成双链该多核苷酸序列，并克隆到高拷贝质粒pMD19-T中，得到含目的基因的克隆载体Pmd19-T：ACS-8，将该载体转化宿主菌DH5α种保存。
按图1所示构建重组表达载体pMD19-T：ACS-8。将重组表达载体pMD19-T：ACS-8转化大肠杆菌E.coliBL21，然后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养，挑取单菌落进行重组质粒鉴定。双酶切、PCR以及基因测序结果均表明成功构建了重组表达载体pMD19-T：ACS-8。
将构建的基因工程菌E.coliBL21(pMD19-T：ACS-8)液体培养至对数期OD值0.8，加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L诱导表达5h，诱导产物SUMO融合蛋白(SUMO-ACS-2)用甲酸酶切后，用RP-HPLC纯化测定单体ACS含量，结果表明8个MMP2酶切序列单体肽串联起来表达，表达量达到500mg/L。
通过正交实验、电泳分析和HPLC方法，对MMP2酶切序列肽的分离纯化进行了优化研究。细胞破碎的最佳方法及条件为：每克湿菌体悬于3mL1×PBS(含5％甘油)，冰上放置20分钟，在冰水浴用超生法超生破碎，功率设置为40％功率破碎4秒，停2秒，40ml的菌悬液共破碎15分钟。12000g离心15分钟，，收集上清液。His-sumo-ACS-8亲和层析最佳条件：上柱量15mg/mL(凝胶体积)，上柱流速2ml/min，上柱1次，20mM，50mM，100mM，300mM，500mM咪唑浓度梯度洗脱，目的蛋白90％在300mM咪唑浓度下被洗脱下来，且蛋白纯度达到90％以上。洗脱体积为5倍的柱体积。在包含目的蛋白的300mM咪唑中缓慢滴加甲酸，直到甲酸的浓度为50％，密闭容器，与70摄氏度中恒温30，之后4摄氏度下12000g离心15分钟，得到含有ACS-8的上清液。在利用反向高效色谱纯化MMP2酶切序列肽，最佳的纯化条件：乙腈浓度15％，三氟乙酸浓度1％，洗脱速度1.5mL/min。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种基质金属蛋白酶-MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，该串联多肽是由2-15个MMP2酶切序列单体肽首尾串联而成的氨基酸序列；所述单体肽序列为：Pro-Leu-Gly-Met-Thr-Ser-Glu，单体肽之间由甲酸的酶切割位点连接，所述切割位点为Glu-Pro。
2.根据权利要求1所述的MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，所述串联多肽是由8个MMP2酶切序列单体肽通过甲酸的酶切位点首尾串联而成的串联多肽。
3.根据权利要求1所述的MMP2酶切序列的串联多肽，其特征在于，所述单体肽的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1所述串联多肽的多核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述编码串联多肽的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQIDNO:2。
6.一种如权利要求5所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸序列在基因工程重组技术表达生产MMP2酶切序列肽中的应用，其特征在于，所述表达生产MMP2酶切序列肽的微生物为原核微生物。
8.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述的任一种多核苷酸序列。
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