WO2003078700A1 - Vorrichtung zum aufbringen von flüssigen medien und verfahren dazu - Google Patents

Vorrichtung zum aufbringen von flüssigen medien und verfahren dazu Download PDF

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WO2003078700A1
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Winfried Kammer
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Alfred Nordheim
Winfried Kammer
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    • B01L9/523—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for multisample carriers, e.g. used for microtitration plates

Definitions

  • the invention relates to a device for applying liquid media, in particular culture and / or reaction media, and a method for generating suitable reaction and / or cultivation conditions.
  • embryoid bodies emerge from embryonic stem cells through cell aggregation and subsequent cell differentiation.
  • Cells of differentiated status eg neuronal cells, myocytes or blood stem cells
  • Affimetrix Arrayer which is to be used for the automated production of DNA arrays.
  • This Affimetrix Arrayer takes advantage of the so-called Pin-and-Ring TM technology.
  • a so-called pin metal pin
  • a certain amount of liquid can then be loaded onto the array with this pin.
  • this system can only be used to transfer small amounts of liquid.
  • microcrystallization robots are used in particular when the three-dimensional structure of proteins is to be examined with the aid of crystallography technology.
  • crystal structure analysis In order to understand the function of a protein, its tertiary structure must be elucidated. This is often done using crystal structure analysis.
  • crystal structure analysis the spatial arrangement of the atoms in crystalline solids is determined with the help of X-rays, electron beams or neutron beams, the wavelengths of which roughly correspond to the atomic distances in crystal lattices.
  • this technique is referred to as "protein-x-ray-cristallography”.
  • microtiter plates represent a further possibility of carrying out a large number of tests at the same time.
  • both the (liquid) media and the substances to be investigated are filled directly into so-called cavities, which ultimately correspond to reaction chambers, with a bottom and lateral boundaries. The actual reaction / cultivation then takes place in these chambers.
  • Such "hanging drops” have several advantages. On the one hand, the examined substances are completely washed around by the liquid, which allows an adequate supply with the required factors, such as ions, salts, differentiation factors, toxins, etc. On the other hand, allow “Hanging drops” the aggregation of embryonic stem cells into embryoid bodies, since the cells in the drop sink downwards, but there is no contact with a solid surface Find. In the absence of other attachment sites, the embryonic stem cells aggregate and form embryoid bodies. The surface tension of the drops prevents embryonic stem cells and embryoid bodies from escaping from the drops. The transfer of this principle to larger scales for the generation of suitable cultivation / reaction conditions for standardized investigation (s), as they are e.g.
  • the object of the invention is therefore to provide a device and a method which can be used universally to generate such suitable conditions and which help to overcome the disadvantages of the prior art described. It is also the object of this invention to provide an apparatus and a method which enable the generation of a large number of (identical) cultivation / reaction conditions with comparatively little preparative effort.
  • the invention thus relates to a device for applying liquid media, in particular culture and / or reaction media, the device having at least one essentially planar elevation consisting of a hydrophobic material / support material, and this planar elevation comprising at least one, in particular two sharp-edged boundaries, in particular edges, arranged parallel to one another.
  • a planar elevation should be understood to mean any elevation with an essentially flat upper boundary surface.
  • the elevation is preferably cubic or cuboid. Truncated pyramids or similar surveys are also possible.
  • the elevation can also have a slightly convex or concave configuration on its upper boundary surface. It is essential that the liquid media applied to the elevation consisting of a hydrophobic carrier material through the sharp-edged
  • Boundary (s) / boundary (s) of the upper boundary surface can be fixed as drops. Furthermore, it is also provided according to the invention to reverse the corresponding active principle.
  • a hydrophilic carrier material can be used, on which a hydrophobic liquid medium is then applied. The fixation also takes place via the sharp-edged ones
  • Boundary (s) / boundary (s) of the upper boundary surface Boundary (s) / boundary (s) of the upper boundary surface.
  • the dimension of a planar elevation in the longitudinal direction is between approximately 2 and approximately 7 mm, preferably between approximately 3 and approximately 5 mm. In a further preferred embodiment, the dimension of a planar elevation in the transverse direction is between approximately 3 and approximately 9 mm, preferably between about 4 and about 7 mm. In one embodiment, the elevations have a size of approximately 5 x 7 mm, in a further example a size of approximately 3 x 4 mm.
  • Other dimensions of the survey are also claimed according to the invention, provided that the survey has at least one sharp-edged boundary for stabilizing the liquid medium. If the dimensions of the elevations are relatively small, this can advantageously have the effect that the drop volume is also reduced as a result and the drops thereby gain stability.
  • the planar elevation is designed as a narrow, elongated elevation.
  • a liquid band can advantageously be applied to such an elongated elevation.
  • elongated preparations can be cultivated, for example in the field of tissue engineering, such as Vessels, especially blood vessels or fibers, especially nerve fibers or muscle fibers.
  • the dimensions of such elongated elevations naturally depend on the respective application.
  • the length can vary from a few mm, e.g. about 2 or about 3 mm, extend over the entire length of the device according to the invention, i.e. over several cm, e.g. up to 13 cm.
  • the width also depends on the application and can be, for example, between approximately 1 and approximately 5 mm.
  • the planar elevation is between 1 and 5 mm, preferably approximately 2 mm high.
  • the amount of the survey depends in particular on the hydrophobic carrier material used and the expedient method for producing suitable devices. So the amount of a survey z. B. in milling after the milling depth and the line width, which can vary depending on the design of the device.
  • the device has at least two, preferably a plurality of planar elevations. The number of planar elevations can be at least 18 in the longitudinal direction and at least 9 in the transverse direction. In another preferred embodiment, the number of planar elevations in the longitudinal direction is 12 and in the transverse direction 8.
  • This embodiment essentially corresponds to the arrangement and number of elevations to a conventional 96-well microtiter plate, which can be advantageous for some applications.
  • the number of elevations depends on the overall dimensions of the device, the intended use (e.g. cell culture) etc. If the device has several planar elevations, in a further preferred embodiment these are from 1 to 4 mm, preferably approximately 2 mm from one another mm away. Preferred distances of the surveys from one another are also between 0.5 and 1.5 mm.
  • the sharp-edged boundary is rectangular to acute.
  • an acute angle means an angle ⁇ 90 °.
  • plastics e.g. organic polymers.
  • the device consists at least partially, preferably completely, of at least one transparent material / carrier material.
  • a transparent material for this come z. B. polystyrene and / or plexiglass in question.
  • the use of a transparent carrier material has the advantage that the evaluation using suitable optical methods, eg. B. microscopy, Fluorescence measurement etc. can be done directly on the device itself.
  • the device is altogether between 10 and 30 mm, preferably between 10 and 23 mm, high.
  • the dimensions of the device can be between 100 and 150 mm, preferably approximately 130 mm, and in the transverse direction between 80 and 100 mm, preferably approximately 90 mm, which is claimed in a further preferred embodiment.
  • the dimensions of the device can depend on the desired location. So z. B. the device when used in a cell incubator, the dimensions in its interior can be adjusted accordingly. If the device according to the invention in z. B. a round vessel are fitted, the maximum longitudinal or transverse dimensions of the device correspond to the diameter of the round vessel.
  • the device has at least one, preferably two holding options for gripping, so that the handling and transportation of the device is facilitated.
  • the holding options are preferably, in particular, two handles which are attached to, in particular, opposite outer edges of the device. These can be designed, for example, as simple projections on the edges.
  • this device is designed such that it can be placed on a surface, in particular a support frame. It is preferably provided here that the device can be switched off in both orientations in such a way that in the switched-off state the side to be loaded with samples can point upwards, which makes loading very easy.
  • the Surface which is intended for loading, so that this would be the position for a cultivation or reaction in the hanging drop, for example.
  • lateral projections on two outer edges of the device can advantageously be provided, with which the device can be transported on the one hand and on the other hand can be placed on a corresponding base / frame in the desired orientation.
  • the device has at least one, preferably a plurality of standing surfaces, in particular feet.
  • Is z. B. uses the device according to the invention free-standing, then the device can have four feet to have a firm stand.
  • At least two devices can be releasably attached to one another or to one another. So it is z. B. possible according to the invention to connect several devices with each other by snap, plug or clamp closures.
  • the devices can be arranged side by side and / or one above the other (stacked on top of one another). These interconnected and / or stacked devices can then, for example, be transported and / or incubated together - e.g. B. in cell culture.
  • insertion devices can be used for one or more devices for transport and incubation.
  • between 10 and 80 ⁇ l, preferably 40 to 80 ⁇ l, of liquid medium can be applied per elevation.
  • the device according to the invention can be rotated by at least 90 °, preferably approximately 180 °, which is indicated in another embodiment is claimed. So-called “hanging drops” are then generated by rotating the device.
  • a corresponding frame for storing the device described is also included in the invention.
  • This is preferably designed in such a way that two to four spars which abut one another at approximately right angles and are fastened to one another form a frame as a base on which the device according to the invention, which has projections on at least two edges, is placed.
  • recesses can be provided on the upper edges at a corresponding point in order to ensure that the protrusions of the device to be placed are securely held.
  • the projections on the device to be placed, which can advantageously also be used as handles, as well as the corresponding recesses in the support frame are preferably located on opposite sides of the device to be placed or the support frame.
  • the support frame has three bars, which form an open rectangle, so to speak.
  • the carrier frame consists of two spars which abut and are attached to one another at approximately a right angle.
  • the support frame is formed by four bars, which form a closed rectangle, so to speak.
  • a method for generating suitable reaction and / or cultivation conditions after application of liquid media is also claimed, in which a device according to the invention is used.
  • the cultivation conditions can be suitable conditions for proliferation and / or
  • the eukaryotic cells are in particular human or animal cells or around cell groups, tissues, organoids or organs, which is claimed in a further preferred embodiment.
  • the method according to the invention can further be characterized in that the cultivation conditions are growth and / or differentiation conditions for eukaryotic cells for the purpose of tissue culture and in particular for the purpose of tissue engineering. Furthermore, the method can advantageously be used in such a way that the cultivation conditions are promoting and / or inhibiting and / or killing conditions for the cultivation of tumor cells and / or tumor tissues. Such a method can be used, for example, to test reagents that are to be used in chemotherapy. In this artificial system, it can be examined before the actual therapy whether certain chemotherapeutic agents have the desired effect for certain tumor cells and / or tissues or not.
  • the method according to the invention can be designed such that the cultivation conditions are growth and / or differentiation conditions for cell aggregates and / or tissues for influencing angiogenic processes in these aggregates or tissues. This could be used, for example, to investigate and test various factors that promote or inhibit such angiogenic processes, which can also be crucially involved in tumor development.
  • the human or animal cells are stem cells, in particular embryonic stem cells.
  • Embryonic stem cells are so-called totipotent cells, which means that they can enter all of them Differentiate cell types.
  • these embryonic stem cells aggregate and / or differentiate into embryoid bodies after application.
  • the reaction conditions can be suitable crystallization and / or X-ray structure analysis conditions.
  • the device according to the invention can be used, for. B. to produce crystallization chambers in drop form. After crystallization of the proteins z. B. with the help of X-rays, electron or neutron beams, the three-dimensional structure of the proteins can be determined.
  • the invention comprises a method for using drops as a reaction site, a liquid medium, for example a culture medium for cell culture, being applied (loaded) to a device described above and the device then being aligned with the loaded side downward.
  • a liquid medium for example a culture medium for cell culture
  • the underside can be substantially horizontal or else at an angle of, for example, 90 ° or less to the base.
  • the reaction site formed in this way can be used, for example, for the cultivation of biological material, in particular eukaryotic cells, cell aggregates and / or cell tissues.
  • the invention naturally also encompasses other possible uses in which a drop can be used as a reaction site.
  • the device can be approached with the loaded side downward to an essentially planar surface, so that the drops are on this surface drop.
  • the device and the surface are brought together so closely until the drops touch the surface and thus pass over to the surface.
  • Suitable surfaces for this aspect of the invention can for example consist at least partially of glass and / or plastic.
  • the droplets are removed with the aid of at least one spacer which is located on the surface and / or on the device with the droplets. This prevents the samples in the drops, for example cells or tissue, from being damaged by crushing.
  • the device for removing the drops is brought with the loaded side down to at least one depression in such a way that the drops come into contact with and run down at least one side wall of the depression.
  • Suitable wells are advantageously the wells of a microtiter plate or the like.
  • the pictures show:
  • Fig. 1 top and side view of a possible embodiment of the device according to the invention.
  • Fig. 2 supervision of a device according to the invention in the unloaded state.
  • Fig. 4 Top view of an unloaded device according to the invention standing on the side.
  • Fig. 5 Oblique view of a support frame according to the invention and a device according to the invention individually and in the assembled state.
  • Embodiment for removing the drops Embodiment for removing the drops.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a possible embodiment of the device (11) according to the invention.
  • the device (11) consists of a carrier material (12) and a plurality of elevations (13), with an essentially planar upper boundary surface. Furthermore, the sharp-edged borders (14) are shown.
  • the individual (planar) elevations (13) are each about 2 mm apart. The dimensions of an elevation are approximately 5 mm in the longitudinal direction and approximately 7.1 mm in the transverse direction. Overall, elevations are shown in the longitudinal direction 18 and in the transverse direction 9.
  • Fig. 1A shows a top view and perspective side view of the device 11.
  • a device can, for. B. from a Polystyrene plate (approx. 4 mm x 130 mm x 130 mm) or a plexiglass block. The elevations shown are milled out by means of a milling cutter, line-like depressions approximately 2 mm wide and approximately 2 mm deep being milled out of the plate or block. Depending on the dimensions of the device, it can then be processed. For example, protrusions on the polystyrene plate can serve as handles. Also z. B. the corners of the device (11) are rounded, as shown in Fig. 1 B, so that it can be used in a round vessel with the appropriate diameter. Furthermore, feet can also be attached to the device, e.g. B. by gluing, so that the device has a better stability.
  • FIG. 2 shows a top view of a device according to the invention.
  • This device was manufactured as described in FIG. 1.
  • the device 21 designed as a plate stands on four feet 22 and is still in the unloaded state.
  • On the two long sides of the device 21 there are projections 23 which can be used to transport and place the device on a corresponding frame.
  • the plate is loaded by applying a certain volume of a suitable solution, for example a culture medium, to each elevation, which is located here on the side facing away from the viewer.
  • a suitable solution for example a culture medium
  • FIG. 3 shows a device 31 loaded with culture medium and brought into the use position.
  • the device stands on four feet 32.
  • An oblique side view is shown.
  • the drops 33 can be seen on the underside of the device 31.
  • Fig. 4 shows a leaned device 41 standing on the side.
  • the feet 42 of the plate are approximately horizontal to the ground, while the plate is aligned essentially vertically to the ground.
  • the device is shown in the unloaded state. This position can also be used for cultivation if the slope is appropriate.
  • the support frame 51 shows a support frame 51 at the top, which is suitable for parking a device 52 according to the invention, as shown in the middle.
  • the support frame 51 consists of three spars 53, 54, 55 which abut one another at right angles on the narrow sides and form a rectangular frame.
  • the upper edge of the end face of the spar 54 is somewhat lower than the upper edges of the side spars 53 and 55, so that the drops on the device 52 cannot come into contact with the end spar 54 of the frame 51. This ensures a stable and secure hold of the device 52 according to the invention on the frame 51, as can be seen in the lower part of FIG.
  • the device 52 according to the invention can either face upwards or downwards with the surface to be loaded or the surface already loaded the support frame 51 are placed.
  • the carrier frame 51 can thus be used for loading or processing the samples and also for cultivating
  • FIG. 6 shows the removal of the drops from a device according to the invention.
  • the device 61 according to the invention with the droplet 62 attached to it is fed to an essentially planar surface 63 (a) until the droplet 62 touches the surface 63 and can be deposited on the surface 63 (b).
  • the device 61 is removed again (c).
  • 6 likewise shows two spacers 64 on the surface 63, which ensure that a minimum distance is maintained between the device 61 and the essentially planar surface 63, so that crushing of the preparation in the droplet 62 is avoided.
  • Fig. 7 shows a further advantageous embodiment of the removal of the drop.
  • the drop 72 located on the device 71 according to the invention is brought to a recess 73 (a).
  • the device 71 is then displaced such that the drop 72 touches a side wall of the recess 73 and runs down the side wall (b).
  • the device 71 is removed from the recess 73.
  • the drop 72 is now in the recess 73 (c).
  • the depression 73 is advantageously the cavity of a microtiter plate or the like.
  • the recess can also be a separate reaction vessel.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (31) zum Aufbringen von flüssigen Medien, insbesondere von Kultur- und/oder Reaktionsmedien sowie ein Verfahren zur Erzeugung geeigneter Reaktions- und/oder Kultivierungsbedingungen. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform steht die Vorrichtung auf vier Standfüssen (32). Die Tropfen (33) sind an der Unterseite der Vorrichtung (31) zu erkennen.

Description

Beschreibung
Vorrichtung zum Aufbringen von flüssigen Medien und Verfahren dazu
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Aufbringen von flüssigen Medien, insbesondere von Kultur- und/oder Reaktionsmedien sowie ein Verfahren zur Erzeugung geeigneter Reaktions- und/oder Kultivierungsbedingungen.
In der modernen Medizintechnik bzw. Biotechnologie und verwandten Bereichen besteht ein großer Bedarf an Vorrichtungen, mit deren Hilfe schnell, effizient und nach Möglichkeit mit einem geringen präparativen Aufwand Substanzen bzw. Substanzkombinationen auf z. B. ihre fruchtschädigende Eigenschaften, Toxizität (Toxizitätsprofil), Wirksamkeit, wirksame Konzentration etc., hin untersucht werden können. So wird z. B. bei einer Chemotherapie häufig vorher abgeklärt, ob die Chemostatika die Tumore abtöten können. Dies wird meistens in der Zellkultur getestet. Dabei werden Tumorzellen vom Patienten entnommen und kultiviert. Nachdem man eine ausreichende Dichte an Tumorzellen herangezüchtet hat, werden diese dann verschiedenen Chemostatika ausgesetzt. Diejenigen Chemostatika, die in der Zellkultur die besten Ergebnisse erzielen, d. h. die in der geringsten Konzentration die meisten Krebszellen abgetötet haben, werden dann bei der anschließenden Chemotherapie eingesetzt. Es stellt sich aber häufig heraus, daß die in vitro erzielten Ergebnisse in vivo nicht reproduzierbar sind. Das liegt unter anderem daran, daß die Bedingungen, die in einem Organismus herrschen, kaum in der Zellkultur imitiert werden können.
Schwierigkeiten macht auch die Untersuchung von Substanzen auf ihre fruchtschädigenden Eigenschaften. Ein Standard verfahren zur Durchführung solcher Untersuchungen ist die Inkubation von sogenannten embryoiden Körperchen. Embryoide Körperchen entstehen aus embryonalen Stammzellen durch Zell-Aggregation und nachfolgende Zeil-Differenzierung. Aus den Zellen embryoider Körperchen können mittels Inkubation unter geeigneten Kultivierungsbedingungen Zellen definierten Differenzierungsstatus gezüchtet werden (z.B. neuronale Zellen, Myozyten oder Blutstammzellen). Dabei ist es bis heute nicht gelungen, embryoide Körperchen in einer Form zur Aufzucht zu bringen, bei der sie a) zuverlässig (homogen und automatisierbar) angesät, b) in Voiumina von z.B. 40 μl und größer sicher gehandhabt (Robotik) und c) hoch- parallelisiert (automatisiert) analysiert werden können. Somit stehen bisher nur einzeln herangezüchtete embryoide Körperchen für dieses Standardverfahren zur Verfügung. Die Probleme bei der Kultivierung von embryoiden Körperchen liegen unter anderem darin, daß embryonale Stammzellen nur unter bestimmten Bedingungen zu embryoiden Körperchen aggregieren. So spielt z. B. die Konzentration an embryonalen Stammzellen sowie die Versorgung mit geeigneten Nährstoffen eine entscheidende Rolle. Außerdem darf den Zellen keine Möglichkeit gegeben werden, sich an eine Oberfläche anzuheften. Da nur mit hohem finanziellen und präparativen Aufwand einzeln kultivierte embryoide Körperchen für die Untersuchung auf fruchtschädigende Eigenschaften bereitgestellt werden können, und da die Kultivierungsbzw, die Reaktionsbedingungen bei jedem Test stark variieren, sind die erhaltenen Ergebnisse untereinander nicht verläßlich vergleichbar. Eine Reihe von Firmen hat daher Vorrichtungen bereitgestellt, die eine Lösung für diese Probleme versprechen. So hat z. B. die Firma MWG AG einen sogenannten Affimetrix Arrayer auf den Markt gebracht, der für die automatisierte Herstellung von DNA-Arrays genutzt werden soll. Dieser Affimetrix Arrayer macht sich die sogenannte Pin-and-Ring™- Technologie zunutze. Bei dieser Technologie wird ein sogenannter Pin (Metalldorn) durch eine Flüssigkeitsmembran durchgeführt, die von einem Ring gehalten wird. Dies ähnelt dem „Pustering" für die Erzeugung von Seifenblasen. Sobald der Pin durch die Flüssigkeitsmembran gestoßen wird, kann dann eine bestimmte Flüssigkeitsmenge mit diesem Pin auf das Array geladen werden. Dieses System kann aber nur zur Übertragung von geringen Flüssigkeitsmengen genutzt werden.
Eine andere Firma, die Berkeley Lab Inc., stellt sogenannte Mikrokristallisationsroboter her. Diese Vorrichtungen kommen insbesondere dann zum Einsatz, wenn die dreidimensionale Struktur von Proteinen mit Hilfe der Kristallographietechnik untersucht werden soll. Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, muß dessen Tertiärstruktur aufgeklärt werden. Dazu bedient man sich häufig der Kristallstrukturanalyse. Bei der Kristallstrukturanalyse wird die räumliche Anordnung der Atome in kristallinen Festkörpern mit Hilfe von Röntgen-, Elektronen- oder Neutronenstrahlen, deren Wellenlängen etwa den Atomabständen in Kristallgittern entsprechen, ermittelt. Bei der Ermittlung der Tertiärstruktur von Proteinen wird diese Technik als „protein-x-ray-cristallography" bezeichnet. Bei der Erzeugung der Kristalle kommt es aber häufig aufgrund unterschiedlicher Umgebungsbedingungen zu keinem gleichmäßigen Aufbau, was als Kristallbaufehler bezeichnet wird und zu falschen Ergebnissen bei der Kristallstrukturanalyse führen kann. Eine weitere Möglichkeit eine Vielzahl von Untersuchungen gleichzeitig durchzuführen, stellen die Mikrotiterplatten dar. Bei den Mikrotiterplatten werden sowohl die (flüssigen) Medien als auch die zu untersuchenden Substanzen direkt in sogenannte Kavitäten eingefüllt, die letztendlich Reaktionskammern entsprechen, mit einem Boden und seitlichen Begrenzungen. In diesen Kammern findet dann die eigentliche Reaktion/Kultivierung statt.
Weitere Vorrichtungen zum Aufbringen von Medien sind auf dem Markt oder werden in den Forschungsabteilungen bzw. an den Universitäten getestet. Alle weisen aber diverse Nachteile auf. So ist bei dem schon beschriebenen Verfahren zur Untersuchung von Substanzen auf ihre fruchtschädigenden Eigenschaften ein Problem, daß die embryonalen Stammzellen nicht kontrolliert reproduzierbar zu homogenen embryoiden Körperchen aggregieren. Beim Ausplattieren auf z. B. einer Mikrotiterplatte wachsen die Stammzellen auf der gesamten Bodenfläche der Mikrotiterplatte an, wodurch eine Aggregation zu embryoiden Körperchen unterbleibt. Auch die schon beschriebenen Vorrichtungen sind nicht geeignet, geeignetere Kultivierungs- /Reaktionsbedingungen bereitzustellen. Es wird daher im kleinen Maßstab versucht, durch Auftragen der Flüssigkeit (bei Stammzellen das Kultivierungsmedium) auf z. B. einem Objektträger, welcher im Anschluß gedreht wird, einen sogenannten „hängenden Tropfen" herzustellen.
Solche „hängende Tropfen" haben einige Vorteile. So werden zum einen die untersuchten Substanzen vollständig von der Flüssigkeit umspült, was eine ausreichende Versorgung mit den benötigten Faktoren, wie z. B. Ionen, Salzen, Differenzierungsfaktoren, Toxinen etc. erlaubt. Zum anderen erlauben „hängende Tropfen" die Aggregation von embryonalen Stammzellen zu embryoiden Körperchen, da die Zellen im Tropfen nach unten sinken, dort aber keinen Kontakt zu einer festen Oberfläche finden. Mangels anderer Anhaftungsstellen aggregieren die embryonalen Stammzellen und bilden embryoide Körperchen. Die Oberflächenspannung der Tropfen verhindert das Austreten von embryonalen Stammzellen und embryoiden Körperchen aus den Tropfen. Die Übertragung dieses Prinzips auf größere Maßstäbe zur Erzeugung geeigneter Kultivierungs-/Reaktionsbedingungen für standardisierte Untersuchung(en), wie sie z. B. bei der Evaluierung von Pharmazeutika benötigt werden, scheiterte aber bislang daran, daß für Probleme bezüglich der parallelisierten Handhabung solcher „hängender Tropfen" keine Lösungen gefunden wurden. So besteht beim Aufbringen mehrerer Tropfen auf eine Oberfläche immer die Gefahr, daß Tropfen ineinanderlaufen. Weiterhin können nur vergleichsweise geringe Volumina aufgebracht werden, da bei Überschreiten eines kritischen Volumens Tropfen bei Bewegung des Trägers unkontrollierbar werden. Schon bei einem Tropfenvolumen von 20 μl können sich Tropfen auf hydrophoben Untergründen bei der Handhabung deutlich bewegen. Um die Herstellung von homogenen hängenden Tropfen zu automatisieren, ist eine einfache und reproduzierbare Möglichkeit ein sogenanntes Toploading. Dabei wird ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen auf eine Unterlage von oben aufgebracht. Wird die Unterlage umgedreht, hängt der Tropfen nach unten. Beim Umdrehen können die Tropfen - abhängig von ihrer Größe - ihren Aufbringungsort verlassen. Es gilt aber die Regel, daß je größer der Tropfen ist, desto unkontrollierbarer ist er in der Handhabung. Andererseits erlauben größere Tropfen eine verlängerte Kultivierdauer ohne Mediumwechsel (das führt z.B. zu länger andauernden Differenzierungsprozessen), eine größere aufbringbare Zellmenge usw.. Außerdem wirken sich Verdunstungsprozesse bei größeren Tropfen nicht so stark aus wie bei kleineren, da das OberflächeΛ olumen-Verhältnis deutlich günstiger ist, als bei kleineren Tropfen. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit der ablaufenden Vorgänge im Tropfen deutlich erhöht. Daraus ergibt sich, daß die Tropfen als eigentliche Reaktionsgefäße
• möglichst groß sein sollten,
• reproduzierbar aufbringbar sein sollten,
• hochparallelisiert/automatisiert erzeugt und eingesetzt werden sollten.
Erwünscht ist daher eine Vorrichtung sowie ein Verfahren, mit deren Hilfe flüssige Medien aufgebracht werden können. Im Sinne der obigen Ausführungen sollen zum einen die aufbringbaren Volumina der Medien groß genug sein, um auch längerandauernde komplexe (bio)chemische und/oder biologische Reaktionen ablaufen zu lassen. Zum anderen sollen die Ergebnisse reproduzierbar sein.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren bereitzustellen, die universell zur Erzeugung solch geeigneter Bedingungen genutzt werden können und die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwinden helfen. Ferner ist es Ziel dieser Erfindung, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren bereitzustellen, die mit vergleichsweise geringem präparativen Aufwand die Erzeugung einer Vielzahl von (gleichen) Kultivierungs-/Reaktionsbedingungen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung bzw. das Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche 1 , 25, 27 und 35. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Anbringung von scharfkantigen Begrenzungen eine Stabilisierung von flüssigen Medien erfolgt, so daß auch bei größeren Volumina durch Drehen „hängende Tropfen" entstehen und die Tropfen nicht von der Oberfläche abreißen. Darüberhinaus kann hierdurch auch ein Verschieben der Tropfen vermieden werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Vorrichtung zum Aufbringen von flüssigen Medien, insbesondere von Kultur- und/oder Reaktionsmedien, wobei die Vorrichtung mindestens eine aus einem hydrophoben Material/Trägermaterial bestehende, im wesentlichen planare Erhebung aufweist, und diese planare Erhebung mindestens eine, insbesondere zwei parallel zueinander angeordnete scharfkantige Begrenzungen, insbesondere Kanten, hat. Unter planarer Erhebung soll dabei jede Erhebung mit im wesentlichen ebener oberer Begrenzungsfläche verstanden werden. Vorzugsweise ist die Erhebung dabei Würfel- oder quaderförmig. Auch pyramidenstumpfförmige oder ähnliche Erhebungen sind möglich. Die Erhebung kann an ihrer oberen Begrenzungsfläche auch eine leicht konvexe oder konkave Ausgestaltung haben. Wesentlich ist, daß die auf die aus einem hydrophoben Trägermaterial bestehende Erhebung aufgebrachten flüssigen Medien durch die scharfkantige
Begrenzung(en)/Abgrenzung(en) der oberen Begrenzungsfläche als Tropfen fixiert werden. Weiterhin ist es erfindungsgemäß auch vorgesehen, das entsprechende Wirkprinzip umzudrehen. Dabei kann ein hydrophiles Trägermaterial genutzt werden, auf dem dann ein hydrophobes flüssiges Medium aufgebracht wird. Dabei erfolgt die Fixierung ebenfalls über die scharfkantigen
Begrenzung(en)/Abgrenzung(en) der oberen Begrenzungsfläche.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Abmessung einer planaren Erhebung in Längsrichtung zwischen etwa 2 und etwa 7 mm, vorzugsweise zwischen etwa 3 und etwa 5 mm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Abmessung einer planaren Erhebung in Querrichtung zwischen etwa 3 und etwa 9 mm, vorzugsweise zwischen etwa 4 und etwa 7 mm. In einem Ausführungsbeispiel weisen die Erhebungen eine Grosse von etwa 5 x 7 mm auf, in einem weiteren Beispiel eine Grosse von etwa 3 x 4 mm. Auch andere Abmessungen der Erhebung werden erfindungsgemäß beansprucht, sofern die Erhebung mindestens eine scharfkantige Begrenzung zur Stabilisierung des flüssigen Mediums aufweist. Wenn die Abmessungen der Erhebungen relativ klein sind, kann das vorteilhafterweise bewirken, dass hierdurch auch das Tropfenvolumen verkleinert wird und die Tropfen dadurch an Stabilität gewinnen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die planare Erhebung als schmale, langgestreckte Erhebung ausgebildet. Auf eine derartige langgestreckte Erhebung kann vorteilhafterweise ein Flüssigkeitsband aufgebracht werden. In einem solchen Flüssigkeitsband können beispielsweise im Bereich des Tissue Engineering langgestreckte Präparate kultiviert werden, wie z.B. Gefäße, insbesondere Blutgefäße oder Fasern, insbesondere Nervenfasern oder Muskelfasern. Die Abmessungen solcher langgestreckten Erhebungen hängen selbstverständlich vom jeweiligen Anwendungsfall ab. Die Länge kann sich von einigen mm, z.B. etwa 2 oder etwa 3 mm, bis über die gesamte Länge der erfindungsgemäßen Vorrichtung erstrecken, also über mehrere cm, z.B. bis zu 13 cm. Die Breite hängt ebenfalls vom Anwendungsfall ab und kann beispielsweise zwischen etwa 1 und etwa 5 mm betragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die planare Erhebung zwischen 1 und 5 mm, vorzugsweise ca. 2 mm hoch. Die Höhe der Erhebung richtet sich dabei insbesondere nach dem verwendeten hydrophoben Trägermaterial sowie dem zweckdienlichen Verfahren zur Produktion geeigneter Vorrichtungen. So richtet sich die Höhe einer Erhebung z. B. bei Fräsung nach der Frästiefe sowie der Linienbreite, die je nach Ausgestaltung der Vorrichtung variieren kann. ln einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Vorrichtung mindestens zwei, vorzugsweise eine Vielzahl von planaren Erhebungen auf. Dabei kann die Anzahl der planaren Erhebungen in Längsrichtung mindestens 18 und in Querrichtung mindestens 9 betragen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl der planaren Erhebungen in Längsrichtung 12 und in Querrichtung 8. Diese Ausführungsform entspricht von der Anordnung und Anzahl der Erhebungen im wesentlichen einer üblichen 96well- Mikrotiterplatte, was für manche Anwendungen vorteilhaft sein kann. Die Anzahl der Erhebungen ist abhängig von den Gesamtabmessungen der Vorrichtung, dem Verwendungszweck (z. B. Zellkultur) etc.. Sofern die Vorrichtung mehrere planare Erhebungen aufweist, sind diese in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform voneinander zwischen 1 und 4 mm, vorzugsweise ca. 2 mm entfernt. Bevorzugte Abstände der Erhebungen voneinander liegen auch zwischen 0,5 bis 1 ,5 mm.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die scharfkantige Begrenzung recht- bis spitzwinklig. Unter spitzwinklig wird erfindungsgemäß ein Winkel < 90° verstanden.
Grundsätzlich können bei der Erfindung die verschiedensten Materialien/Trägermaterialien eingesetzt werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Kunststoffe, z.B. organische Polymere.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Vorrichtung mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, aus mindestens einem transparenten Material/Trägermaterial. Hierfür kommen z. B. Polystyrol und/oder Plexiglas in Frage. Die Verwendung eines transparenten Trägermaterials hat den Vorteil, daß die Auswertung mit Hilfe geeigneter optischer Verfahren, z. B. Mikroskopie, Fluoreszenzmessung etc. direkt auf der Vorrichtung selbst erfolgen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung insgesamt zwischen 10 und 30 mm, vorzugsweise zwischen 10 und 23 mm, hoch. In Längsrichtung können die Abmessungen der Vorrichtung zwischen 100 und 150 mm, vorzugsweise ca. 130 mm, und in Querrichtung zwischen 80 und 100 mm, vorzugsweise ca. 90 mm, betragen, was in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird. Die Abmessungen der Vorrichtung können sich dabei nach dem erwünschten Einsatzort richten. So wird z. B. die Vorrichtung bei Einsatz in einem Zellinkubator den Abmessungen in dessen Innenraum entsprechend angepaßt werden. Soll die erfindungsgemäße Vorrichtung in z. B. ein Rundgefäß eingepaßt werden, so entsprechen die maximalen Längs- bzw. Querabmessungen der Vorrichtung dem Durchmesser des Rundgefäßes.
Die Vorrichtung hat in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zum Angreifen mindestens eine, vorzugsweise zwei Haltemöglichkeiten, so daß die Handhabung und der Transport der Vorrichtung erleichtert wird. Bei den Haltemöglichkeiten handelt es sich vorzugsweise um insbesondere zwei Haltegriffe, die an insbesondere gegenüberliegenden äußeren Kanten der Vorrichtung angebracht sind. Diese können beispielsweise als einfache Vorsprünge an den Kanten ausgebildet sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist diese Vorrichtung derart ausgebildet, dass sie auf einem Untergrund, insbesondere einem Trägergestell, abgestellt werden kann. Vorzugsweise ist es hierbei vorgesehen, dass die Vorrichtung in beiden Orientierungen abstellbar ist derart, dass im abgestellten Zustand einmal die mit Proben zu beladende Seite nach oben weisen kann, was eine Beladung sehr einfach macht. Im anderen Fall weist dann die Oberfläche, die für die Beladung vorgesehen ist, nach unten, so dass dies beispielsweise die Position für eine Kultivierung oder Reaktion im hängenden Tropfen wäre. Vorteilhafterweise können für diesen Zweck seitliche Vorsprünge an zwei Außenkanten der Vorrichtung vorgesehen sein, mit denen die Vorrichtung zum einen transportiert werden kann und zum anderen auf einem entsprechenden Untergrund/Gestell in der jeweils gewünschten Orientierung abgestellt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung hat diese mindestens eine, vorzugsweise mehrere Standflächen, insbesondere Standfüße. Wird z. B. die erfindungsgemäße Vorrichtung freistehend benutzt, dann kann die Vorrichtung vier Standfüße aufweisen, um einen festen Stand zu haben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind mindestens zwei Vorrichtungen miteinander bzw. aneinander lösbar befestigbar. So ist es z. B. erfindungsgemäß möglich, mehrere Vorrichtungen durch Rast-, Steck- oder Klemmverschlüsse miteinander zu verbinden. Dabei können die Vorrichtungen nebeneinander und/oder übereinander (aufeinander gestapelt) angeordnet sein. Diese miteinander verbundenen und/oder aufeinander gestapelten Vorrichtungen können dann beispielsweise gemeinsam transportiert und/oder inkubiert - z. B. in der Zellkultur - werden. Alternativ können Einschubvorrichtungen für ein bis mehrere Vorrichtungen für Transport und Inkubation benutzt werden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind zwischen 10 und 80 μl, vorzugsweise 40 bis 80 μl, flüssiges Medium je Erhebung aufbringbar.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist nach Aufbringen der flüssigen Medien um mindestens 90°, vorzugsweise ca. 180°, drehbar, was in einer weiteren Ausführungsform beansprucht wird. Durch Drehen der Vorrichtung werden dann sogenannte „hängende Tropfen" erzeugt.
Ein entsprechendes Gestell zur Ablage der beschriebenen Vorrichtung wird gleichfalls von der Erfindung mit umfasst. Dieses ist vorzugsweise so ausgebildet, dass zwei bis vier in etwa rechtwinklig aufeinanderstoßende, und aneinander befestigte Holme einen Rahmen als Unterlage bilden, auf den die erfindungsgemäße Vorrichtung, die an mindestens zwei Kanten Vorsprünge aufweist, aufgelegt wird. An dem so gebildeten Trägergestell können an den Oberkanten an entsprechender Stelle Aussparungen vorgesehen sein, um den Vorsprüngen der aufzulegenden Vorrichtung einen sicheren Halt zu gewähren. Die Vorsprünge an der aufzulegenden Vorrichtung, die vorteilhafterweise auch als Tragegriffe eingesetzt werden können, sowie auch die entsprechenden Aussparungen im Trägergestell finden sich vorzugsweise an gegenüberliegenden Seiten der aufzulegenden Vorrichtung bzw. des Trägergestells. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Trägergestell drei Holme auf, die sozusagen ein offenes Rechteck bilden. Es kann jedoch auch bevorzugt sein, dass das Trägergestell aus zwei in etwa rechtem Winkel aufeinanderstoßende und aneinander befestigten Holmen besteht. Weiterhin kann es auch bevorzugt sein, dass das Trägergestell von vier Holmen gebildet wird, die sozusagen ein geschlossenes Rechteck bilden.
Weiterhin wird ein Verfahren zur Erzeugung geeigneter Reaktionsund/oder Kultivierungsbedingungen nach Aufbringung von flüssigen Medien beansprucht, in dem eine erfindungsgemäße Vorrichtung benutzt wird. Bei den Kultivierungsbedingungen kann es sich um geeignete Bedingungen für Proliferations- und/oder
Differenzierungsassays für eukaryotische Zellen handeln. Bei den eukaryotischen Zellen handelt es sich insbesondere um menschliche oder tierische Zellen bzw. um Zellverbände, Gewebe, Organoide oder Organe, was in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beansprucht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, dass es sich bei den Kultivierungsbedingungen um Wachstums- und/oder Differenzierungsbedingungen für eukaryotische Zellen zum Zweck der Gewebekultur und insbesondere zum Zweck des Tissue Engineerings handelt. Weiterhin kann das Verfahren vorteilhaft in der Weise eingesetzt werden, dass es sich bei den Kultivierungsbedingungen um fördernde und/oder hemmende und/oder abtötende Bedingungen für die Kultivierung von Tumorzellen und/oder Tumorgeweben handelt. Mit Hilfe eines solchen Verfahrens können beispielsweise Reagenzien getestet werden, die in einer Chemotherapie eingesetzt werden sollen. In diesem künstlichen System kann vor der eigentlichen Therapie untersucht werden, ob bestimmte Chemotherapeutika für bestimmte Tumorzellen und/oder -gewebe den gewünschten Effekt aufweisen oder nicht.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren so ausgestaltet sein, dass es sich bei den Kultivierungsbedingungen um Wachstumsund/oder Differenzierungsbedingungen für Zellaggregate und/oder Gewebe zur Beeinflussung angiogenetischer Prozesse in diesen Aggregaten oder Geweben handelt. Hiermit könnten beispielsweise verschiedene Faktoren untersucht und getestet werden, die derartige angiogenetische Prozesse, die auch bei der Tumorentwicklung entscheidend beteiligt sein können, fördern oder hemmen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um Stammzellen, insbesondere um embryonale Stammzellen. Embryonale Stammzellen sind sogenannte totipotente Zellen, d. h. sie können in alle Zelltypen differenzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform aggregieren und/oder differenzieren diese embryonalen Stammzellen nach Aufbringung zu embryoiden Körperchen.
Weiterhin kann es sich in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bei den Reaktionsbedingungen um geeignete Kristallisierungs- und/oder Röntgenstrukturanalysebedingungen handeln. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann genutzt werden, um z. B. Kristallisierungskammern in Tropfenform zu erzeugen. Nach Kristallisierung der Proteine kann so z. B. mit Hilfe von Röntgen-, Elektronen- oder Neutronenstrahlen die dreidimensionale Struktur der Proteine festgestellt werden.
Ferner umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Nutzung von Tropfen als Reaktionsstätte, wobei ein flüssiges Medium, beispielsweise ein Kulturmedium für die Zellkultur, auf eine oben beschriebene Vorrichtung aufgebracht (beladen) wird und die Vorrichtung anschließend mit der beladenen Seite nach unten ausgerichtet wird. Hierbei kann sich die Unterseite im wesentlichen horizontal oder aber auch in einem Winkel von beispielsweise 90° oder weniger zur Unterlage befinden. Die so gebildete Reaktionsstätte kann beispielsweise für die Kultivierung von biologischem Material, insbesondere von eukaryotischen Zellen, Zellaggregaten und/oder Zellgeweben genutzt werden. Andererseits ist es auch mit Vorteil möglich, derartige Reaktionsstätten für Kristallisierungsprozesse im Hinblick auf Strukturanalysen zu nutzen. Des weiteren umfasst die Erfindung selbstverständlich auch andere Einsatzmöglichkeiten, bei welchen ein Tropfen als Reaktionsstätte nutzbar ist.
Zum Abnehmen der Tropfen von der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Vorrichtung mit der beladenen Seite nach unten einer im wesentlichen planaren Oberfläche genähert werden, so dass sich die Tropfen auf dieser Oberfläche absetzen. Hierbei werden die Vorrichtung und die Oberfläche so nahe zusammengeführt, bis die Tropfen die Oberfläche berühren und so auf die Oberfläche übergehen. Geeignete Oberflächen für diesen Aspekt der Erfindung können beispielsweise zumindest teilweise aus Glas und/oder Kunststoff bestehen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird das Abnehmen der Tropfen mit Hilfe von mindestens einem Abstandshalter durchgeführt, der sich auf der Oberfläche und/oder auf der Vorrichtung mit den Tropfen befinden. Hierdurch wird vermieden, dass die Proben in den Tropfen, beispielsweise Zellen oder Gewebe, durch Quetschungen beschädigt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird die Vorrichtung zum Abnehmen der Tropfen mit der beladenen Seite nach unten an mindestens eine Vertiefung in der Weise herangeführt, dass die Tropfen mit mindestens einer Seitenwand der Vertiefung in Kontakt treten und daran herablaufen. Vorteilhafterweise handelt es sich bei geeigneten Vertiefungen um die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder ähnliches.
Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung von bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des Verfahrens in Verbindung mit den Ansprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Fig. 1 : Auf- und Seitenansicht einer möglichen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Fig. 2: Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung in unbeladenem Zustand.
Fig. 3: Seitenansicht auf eine mit Flüssigkeit beladene erfindungsgemäße Vorrichtung.
Fig. 4: Aufsicht auf eine auf der Seite stehende unbeladene erfindungsgemäße Vorrichtung.
Fig. 5: Schrägansicht eines erfindungsgemäßen Trägergestells und einer erfindungsgemäßen Vorrichtung einzeln und in zusammengesetztem Zustand.
Fig. 6: Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform zum
Abnehmen der Tropfen.
Fig. 7: Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße
Ausführungsform zum Abnehmen der Tropfen.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer möglichen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung (11 ). Die Vorrichtung (11 ) besteht aus einem Trägermaterial (12) und einer Vielzahl von Erhebungen (13), mit im wesentlichen planarer oberer Begrenzungsfläche. Weiterhin werden die scharfkantigen Begrenzungen (14) gezeigt. Die einzelnen (planaren) Erhebungen (13) sind voneinander jeweils ca. 2 mm entfernt. Die Abmessungen einer Erhebung betragen in Längsrichtung ca. 5 mm und in Querrichtung ca. 7,1 mm. Insgesamt sind in Längsrichtung 18 und in Querrichtung 9 Erhebungen dargestellt.
Fig. 1A zeigt eine Aufsicht und perspektivische Seitenansicht der Vorrichtung 11. Eine solche Vorrichtung kann z. B. aus einer Polystyrolplatte (ca. 4 mm x 130 mm x 130 mm) oder einem Plexiglasblock hergestellt werden. Dabei werden mittels einer Fräse die dargestellten Erhebungen herausgefräst, wobei linienartige Vertiefungen von ca. 2 mm Breite und ca. 2 mm Tiefe aus der Platte bzw. aus dem Block herausgefräst werden. Je nachdem, welche Abmessungen die Vorrichtung haben soll, kann diese danach bearbeitet werden. So können Ausstülpungen der Polystyrolplatte als Haltegriffe dienen. Auch können z. B. die Ecken der Vorrichtung (11 ) abgerundet werden, wie in Fig. 1 B dargestellt, so daß diese in ein Rundgefäß mit entsprechendem Durchmesser eingesetzt werden kann. Ferner können auch Standfüße an der Vorrichtung angebracht werden, z. B. durch Ankleben, damit die Vorrichtung eine bessere Standfestigkeit hat.
Fig. 2 zeigt eine Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung. Diese Vorrichtung wurde wie bei Fig. 1 beschrieben hergestellt. Die als Platte ausgebildete Vorrichtung 21 steht auf vier Standfüßen 22 und befindet sich noch im unbeladenen Zustand. An den beiden Längsseiten der Vorrichtung 21 sind Vorsprünge 23 angebracht, die zum Transportieren und Abstellen der Vorrichtung auf einem entsprechenden Gestell genutzt werden können. Die Beladung der Platte erfolgt, indem auf jede Erhebung, die sich hier auf der vom Betrachter abgewandten Seite befindet, ein gewisses Volumen einer geeigneten Lösung, beispielsweise eines Kulturmediums, aufgebracht wird. Für die Beladung der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt diese vorteilhafterweise auf dem Rücken, d. h. Standfüße 22 würden senkrecht nach oben zeigen. Bereits beim Beladen bildet sich die im wesentlichen rechteckige, an den Ecken abgerundete Form der aufgebrachten Tropfen. Nach dem Aufstellen der beladenen Platte auf die Standfüße zeigen sich auf der vom Betrachter abgewandten Seite abgerundete, klare Abgrenzungen der tropfenförmig an jeder Erhebung anhaftenden Lösung an den Rändern (Kanten) jeder Erhebung. Die Tropfen würden in Blickrichtung nach unten hängen. Jeder einzelne dieser Tropfen wird dabei durch die scharfkantigen Abgrenzungen bzw. Kanten an den Rändern jeder Erhebung stabilisiert, so dass ein Abreißen oder Verschieben des Tropfens verhindert wird. Dies ist in Fig. 3 dargestellt.
Fig. 3 zeigt eine mit Kulturmedium beladene und in Nutzposition gebrachte Vorrichtung 31. Auch hierbei steht die Vorrichtung auf vier Standfüßen 32. Es ist eine schräge Seitenansicht dargestellt. Die Tropfen 33 sind an der Unterseite der Vorrichtung 31 zu erkennen.
Fig. 4 zeigt eine angelehnte, auf der Seite stehende Vorrichtung 41. Die Standfüße 42 der Platte stehen dabei in etwa horizontal zum Untergrund, während die Platte im wesentlichen vertikal zum Untergrund ausgerichtet ist. Es ist die Vorrichtung im unbeladenen Zustand gezeigt. Diese Position kann bei entsprechender Schräge auch für die Kultivierung eingesetzt werden.
Fig. 5 zeigt oben ein Trägergestell 51 , welches für das Abstellen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 52, wie sie in der Mitte gezeigt ist, geeignet ist. Das Trägergestell 51 besteht aus drei im rechten Winkel an den Schmalseiten aufeinanderstoßenden Holmen 53, 54, 55, die einen rechtwinkligen Rahmen bilden. An den oberen Kanten der zwei sich, gegenüberliegenden Holme 53 und 55 befindet sich jeweils eine Aussparung, die für die Aufnahme von Vorsprüngen 56 an zwei sich gegenüberliegenden Kanten der Vorrichtung 52 vorgesehen ist. Weiterhin ist die obere Kante der Stirnseite des Holmes 54 etwas niedriger als die oberen Kanten der Seitenholme 53 und 55, damit die Tropfen an der Vorrichtung 52 nicht mit dem stirnseitigen Holm 54 des Gestells 51 in Kontakt treten können. Hierdurch wird ein stabiler und sicherer Halt der erfindungsgemäßen Vorrichtung 52 auf dem Gestell 51 gewährleistet, wie dem unteren Teil der Figur 5 zu entnehmen ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung 52 kann entweder mit der zu beladenden oder der bereits beladenen Oberfläche nach oben oder nach unten auf das Trägergestell 51 aufgelegt werden. So kann das Trägergestell 51 zum Beladen oder Bearbeiten der Proben sowie auch zum beispielsweise Kultivieren in den hängenden Tropfen genutzt werden.
Aus Fig. 6 geht das Abnehmen der Tropfen von einer erfindungsgemäßen Vorrichtung hervor. Die erfindungsgemäße Vorrichtung 61 mit dem daranhängenden Tropfen 62 wird einer im wesentlichen planaren Oberfläche 63 zugeführt (a), bis der Tropfen 62 die Oberfläche 63 berührt und an der Oberfläche 63 abgesetzt werden kann (b). Nach dem Absetzen des Tropfens 62 auf der Oberfläche 63 wird die Vorrichtung 61 wieder entfernt (c). Fig. 6 zeigt gleichfalls zwei Abstandshalter 64 an der Oberfläche 63, die dafür sorgen, dass ein Mindestabstand zwischen der Vorrichtung 61 und der im wesentlichen planaren Oberfläche 63 eingehalten wird, so dass Quetschungen des Präparates im Tropfen 62 vermieden werden.
Fig. 7 zeigt eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des Abnehmens des Tropfens. Hierbei wird der sich an der erfindungsgemäßen Vorrichtung 71 befindende Tropfen 72 an eine Vertiefung 73 herangeführt (a). Die Vorrichtung 71 wird dann so verschoben, dass der Tropfen 72 eine Seitenwand der Vertiefung 73 berührt und an der Seitenwand herabläuft (b). Schließlich wird die Vorrichtung 71 von der Vertiefung 73 entfernt. Der Tropfen 72 befindet sich nun in der Vertiefung 73 (c). Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Vertiefung 73 um die Kavität einer Mikrotiterplatte oder ähnliches. Selbstverständlich kann es sich bei der Vertiefung auch um ein separates Reaktionsgefäß handeln.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zum Aufbringen von flüssigen Medien, insbesondere von Kultur- und/oder Reaktionsmedien, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens eine aus einem hydrophoben Material bestehende Erhebung mit im wesentlichen planarer oberer Begrenzungsfläche aufweist, und diese planare Erhebung an der oberen planaren Begrenzungsfläche mindestens eine, insbesondere mindestens zwei parallel zueinander angeordnete scharfkantige Begrenzungen, insbesondere Kanten, hat.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Abmessung einer planaren Erhebung in einer ersten Richtung, vorzugsweise in Längsrichtung zwischen etwa 2 und etwa 7 mm, vorzugsweise zwischen etwa 3 und etwa 5 mm, beträgt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessung einer planaren Erhebung in einer ersten Richtung, vorzugsweise in Längsrichtung zwischen 4 und 7 mm, vorzugsweise ca. 5 mm, beträgt.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abmessung einer planaren Erhebung in einer zweiten Richtung, vorzugsweise in Querrichtung zwischen etwa 3 und etwa 9 mm, vorzugsweise zwischen etwa 4 und etwa 7 mm, beträgt.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessung einer planaren Erhebung in einer zweiten Richtung, vorzugsweise in Querrichtung zwischen 5 und 9 mm, vorzugsweise ca. 7 mm, beträgt.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Erhebung eine schmale, langgestreckte Erhebung ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die planare Erhebung zwischen 1 und 5 mm, vorzugsweise ca. 2 mm, hoch ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens zwei, vorzugsweise eine Vielzahl von planaren Erhebungen aufweist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der planaren Erhebungen in Längsrichtung mindestens 18 und in Querrichtung mindestens 9 beträgt.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der planaren Erhebungen in Längsrichtung 12 und in Querrichtung 8 beträgt.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen zwei benachbarten planaren Erhebungen zwischen 0,5 und 4 mm, vorzugsweise zwischen 1 und 2 mm, insbesondere ca. 2 mm, beträgt.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die scharfkantige Begrenzung spitzwinklig ausgebildet ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen vorzugsweise rechteckförmigen Grundkörper aufweist, an dem die planaren Erhebungen ausgebildet sind.
14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig aus mindestens einem transparentem Material besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Material Polystyrol und/oder Plexiglas ist.
16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abmessungen der Vorrichtung in einer ersten Richtung, vorzugsweise in Längsrichtung zwischen 100 und 150 mm, vorzugsweise ca. 130 mm, und in einer zweiten Richtung, vorzugsweise in Querrichtung zwischen 80 und 110 mm, vorzugsweise ca. 90 mm, betragen.
17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Gesamthöhe zwischen 10 und 30 mm, vorzugsweise zwischen 10 und 23 mm, aufweist.
18. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens einen, vorzugsweise zwei Haltegriffe hat.
19. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung auf einem Trägergestell abstellbar ausgebildet ist, wobei vorzugsweise die Vorrichtung mit der zu beladenden oder beladenen Oberfläche nach oben oder nach unten abstellbar ist.
20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens eine, vorzugsweise mehrere Standflächen, insbesondere Standfüße, hat.
21. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie stapelbar ausgebildet ist.
22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Vorrichtungen aneinander lösbar befestigbar sind.
23. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß je Erhebung zwischen 10 und 80 μl, vorzugsweise 40 bis 50 μl, flüssiges Medium aufbringbar ist.
24. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung nach Aufbringen der flüssigen Medien um mindestens 90°, vorzugsweise ca. 180°, drehbar ist.
25. Vorrichtung zur Ablage einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung aus 2 bis 4, insbesondere 3, Holmen besteht, die einen etwa rechtwinkligen Rahmen bilden.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie an den oberen Kanten mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei Aussparungen aufweist, die zur Aufnahme von entsprechenden Vorsprüngen an der abzulegenden Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 vorgesehen sind.
27. Verfahren zur Erzeugung geeigneter Reaktions- und/oder Kultivierungsbedingungen nach Aufbringung von flüssigen Medien, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Vorrichtung mit mindestens einem Merkmal eines der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 24.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Kultivierungsbedingungen um Proliferations- und/oder Differenzierungsbedingungen für eukaryotische Zellen, insbesondere menschliche oder tierische Zellen, handelt.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Zweck der Gewebekultur und/oder des Tissue Engineering eingesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kultivierungsbedingungen um fördernde und/oder hemmende und/oder abtötende Bedingungen für die Kultivierung von Tumorzellen und/oder Tumorgeweben handelt.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kultivierungsbedingungen um Wachstums- und/oder Differenzierungsbedingungen für Zellaggregate und/oder Gewebe zur Beeinflussung angiogenetischer Prozesse in diesen Zellaggregaten und/oder Geweben handelt.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um Stammzellen, insbesondere um embryonale Stammzellen, handelt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die embryonalen Stammzellen nach Aufbringung auf die Vorrichtung zu embryoiden Körperchen aggregieren und/oder differenzieren.
34. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Reaktionsbedingungen um Kristallisierungs- und/oder Röntgenstrukturanalysebedingungen handelt.
35. Verfahren zur Nutzung von Tropfen als Reaktionsstätte, dadurch gekennzeichnet, dass ein flüssiges Medium auf eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 24 aufgebracht wird und die Vorrichtung mit der beladenen Seite nach unten im wesentlichen horizontal oder in einem Winkel von etwa 90° oder weniger zu einer Unterlage ausgerichtet wird.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abnehmen des Tropfens die Vorrichtung mit der beladenen Seite nach unten einer im wesentlichen planaren Oberfläche derart zugeführt wird, dass sich der Tropfen auf der Oberfläche absetzt.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit mindestens einem Abstandshalter versehen ist.
38. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abnehmen des Tropfens die Vorrichtung mit der beladenen Seite nach unten an mindestens eine Vertiefung derart herangeführt wird, dass der Tropfen mindestens eine Seitenwand der Vertiefung berührt und daran herabläuft.
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist.
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