WO2003070954A1 - Facteur transcriptionnel, gene de facteur transcriptionnel vecteur recombinant contenant un gene de facteur transcriptionnel, moisissure koji transformee par le vecteur et procede d'utilisation de la moisissure koji - Google Patents

Description

明 細 書 転写因子、 転写因子遺伝子、 転写因子遺伝子を含む組み換えべクタ一、

該ベクターによって形質転換された麹菌及び麹菌の使用法 技術 分 野

本発明は、 硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する転写因子、 該転写 因子をコードする遺伝子、 該転写因子遺伝子を含む組み換えベクター、 該ベクタ —によって形質転換された硫黄同化系遺伝子発現の抑制が解除された麹菌及び麹 菌の使用法に関する。 背 景 技 術

生物は、 栄養源等の環境又はその他の様々な要因に応じて遺伝子の発現を制御 する機構を有している。 発現の制御は、 転写の開始、 転写の続行、 mRNAの安定性 、 翻訳の開始、 翻訳の続行といった様々なレベルで行なわれている。

硫黄は、 含硫アミノ酸の構成成分であることをはじめとして、 生物にとって重 要な栄養素である。 真核微生物の、 硫黄同化に関わる遺伝子 （硫黄同化系遺伝子 ) の制御については、 多くの研究がなされてきた。 特に、 ァカパンカビ （Neuros pora crassa) の変異株の解析、 遺伝子の単離等による研究からは、 抑制因子及 び活性化因子について多くのことが明らかにされている （総説： Marz l ui等、 An u. Rev. Microbiol. 51 : 73-96, 1997)。

ァカパンカビの硫黄同化関連転写因子としては、 転写活性化因子の Cys3、 抑制 因子の Sconl及び Scon2が知られている。 Cys3は、 cys- 3遺伝子上流又は scon- 2遺 伝子上流に結合し、 これらの遺伝子の発現を活性化させると共に、 ars遺伝子、 c ys - 14遺伝子等の硫黄の取り込みあるいは同化に関わる遺伝子の上流に結合し、 これらの遺伝子の発現を活性化させる機能を有する。

ァスペルギルス 'ニドランスの硫黄同化に関わる遺伝子の制御についても、 多 くの研究がなされてきた。 ァカパンカビの Cys3にあたる転写因子は、 多くの努力 にも関わらず、 同定されずに来た。 しかし、 1 9 9 9年に、 Me tRという転写因子 が報告された。 metR変異株は、 硫黄源としてメチォニンのみを利用することがで きた。 MetRは、 Cys3と、 DNA結合領域においては高い相同性を示したが、 それ以 外の部分ではほとんど相同性を示さなかった。 また、 cys_3遺伝子は metR変異株 の表現型を相補することができなかった （Naori f等、 Fungal Genet. News l. 46 (Suppl) : 59, 1999)。 また、 4種の転写抑制因子の存在が示唆されている （Nator ίί等、 Molec. Gen. Gene t. 238 : 185-192, 1993)。 これらのうち、 SconB及び Scon Cについてはその遺伝子が単離されている。

黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ、 ァスペルギルス ·ソ一ャ、 ァスペルギルス · タマリ、 黒麹菌ァスペルギルス ·二ガー、 ァスペルギルス ·ァヮモリ、 ァスペル ギルス ·ゥサミ、 ァスペルギルス ·サイトイ、 白麹菌ァスペルギルス ·力ヮチ等 の麹菌は、 長年、 発酵，醸造 ·酵素生産等に利用されており、 安全性の高い微生 物としての利用価値が極めて高い。 しかし、 これらの微生物の硫黄同化に関わる 遺伝子の制御については、 ほとんど明らかにされていない。 また、 これらの有用 麴菌は、 有性世代が確認されていない等 （米国特許 6, 090， 607)、 上記のァスペル ギルス ·二ドランス （有性世代を持つ子嚢菌ェメリセラ属のェメリセラ ·二ドラ ンスの不完全世代の別名である） とは異なる特徴を有しており、 必ずしもァスぺ ルギルス ·ニドランスにおける知見がそのまま適用できるわけではない。

黄齄菌ァスペルギルス ·ォリゼ及びァスペルギルス ·ソーャは、 蛋白質分解酵 素を含む多くの加水分解酵素を分泌することから、 醤油あるいは味噌等の、 蛋白 質分解に基づく調味料生産に用いられてきた。 ァスペルギルス ·ォリゼにおいて

、 菌体外プロテアーゼが、 炭素源 ·窒素源 ·硫黄源のいずれかの欠乏により誘導 又は脱抑制されて生産されることが知られている。 ァスペルギルス ·ォリゼにお ける炭素源及び窒素源の欠乏によるプロテアーゼの発現については、 その遺伝子 的な機構について報告がなされているのに対し、 硫黄源の欠乏によるプロテア一 ゼの発現の機構については明らかにされていない。 硫黄源の欠乏によるプロテア

—ゼ発現について、 ァスペルギルス ·ニドランスではいくつかの解析が行なわれ ているが、 その機構については報告されていない。 また、 黄麹菌のアミノぺプチ ダーゼ、 力ルポキシぺプチダーゼ等の菌体外ェキソぺプチダーゼの発現制御につ いては硫黄源の関与については知られていない。 発 明 の 開 示

本発明は、 培養時に麹菌の硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する転 写因子及び該蛋白質をコードする遺伝子を提供することを目的とするものである 。 また、 麹菌を用いた蛋白質分解酵素の有利な生産方法を提供することを目的と するものである。 更には、 そのような生産方法を利用する、 食品の有利な製造方 法を提供することを目的とするものである。

本発明者等は、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 硫黄同化系遺伝 子の発現を制御する機能を有する転写因子遺伝子を黄麹菌よりクローニングする ことに成功し、 本発明を完成した。

すなわち、 本発明は以下の通りである。

[ 1 ] 以下の（a)又は (b)の蛋白質。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

(b) 配列番号 3で表されるァミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ転写因子の機能を有 する蛋白質

[ 2 ] 配列番号 3で表されるァミノ酸配列と 70%以上の配列相同性を示すアミノ 酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、 かつ転写因子の機能を有する蛋 白質。

[ 3 ] 以下の（a)又は（b)の蛋白質をコードする転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

(b) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ転写因子の機能を有 する蛋白質

[ 4 ] 以下の（a)又は (Wの DNAからなる転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA

(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつ転写因子の機能を有する 蛋白質をコードする DNA

[ 5 ] 上記 [ 2 ]に記載の蛋白質をコードする遺伝子。 [6] 以下の（a)又は（b)の DNAからなる転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる DNA

(b) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる爾 Aと相補的 な核酸からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ硫黄 同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する蛋白質をコードする DNA

[7] 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAと 80%以上の配列相同性を示し 、 かつ転写因子の機能を有する蛋白質をコードする DNAからなる転写因子遺伝子

[8] 上記の [3]、 [4]、 [5]、 [6]又は [7]に記載の遺伝子を含有する組み換 えベクター。

[9] 上記 [8]に記載の組み換えベクターを含む麹菌。

[1 0] 上記の [3]、 [4]、 [5]、 [6]又は [7]に記載の遺伝子が低分子含硫物 質の存在下で発現する麹菌。

[1 1] 低分子含硫物質の存在下で菌体外プロテアーゼ生産能を有する上記 [9] 又は [1 0]に記載の麹菌。

[1 2] 低分子含硫物質の存在下で菌体外プロテアーゼ及び菌体外ェキソぺプチ ダーゼ生産能を有する上記 [ 9 ]又は [ 10 ]に記載の麹菌。

[1 3] 硫黄同化系遺伝子発現の抑制が解除された麹菌。

[14] 硫黄同化系遺伝子発現の抑制が解除されていることを特徴とする上記の [9]〜[12]のいずれか 1項に記載の麹菌。

[1 5] 上記 [9]〜[14]のいずれか 1項に記載の麹菌を培地中で培養し、 得ら れる培養物からプロテアーゼ及び 又はェキソぺプチダ一ゼを必要により採取す ることを特徴とするプロテア一ゼ及び/又はェキソぺプチダーゼの生産方法。

[1 6] 上記 [9]〜[14]のいずれか 1項に記載の麹菌を用いて蛋白質含有物を 分解することを特徴とする、 蛋白質含有物の分解方法。

[1 7] 上記 [9]〜[14]のいずれか 1項に記載の麹菌を培養し、 得られる培養 物により蛋白質含有物を分解させ、 該分解物から蛋白質含有物分解産物を必要に より採取することを特徴とする、 蛋白質含有物分解産物の製造方法。

[1 8] 培地が 0.5mM以上の低分子含硫物質を含むことを特徴とする上記 [1 5] に記載の生産方法。 以下、 本発明を詳細に説明する。

本出願は、 本願の優先権主張の基礎出願である特願 J P 2 0 0 2 - 0 4 5 0 9 0号に記載された全ての内容を包含する。

本発明は、 発酵 ·醸造 ·酵素生産等に利用されるァスペルギルス属の微生物 （ 麹菌） において、 硫黄同化系遺伝子の転写制御因子 （転写因子） 及び該蛋白質を コードする遺伝子を同定し、 その機能を解明し、 さらに、 菌体外プロテアーゼぁ るいはェキソぺプチダ一ゼ生産能に対する該転写因子の関与について明らかにす ることによって、 低分子含硫物質の存在下で硫黄同化系遺伝子発現の抑制を解除 しそれにより宿主麹菌の菌体外プロテアーゼ又はェキソぺプチダーゼ生産能を増 強し得る転写因子、 及びそれをコードする遺伝子を取得することに成功したもの である。 本発明の転写因子及び Z又はそれをコードする遺伝子は、 麹菌を利用し た発酵，醸造 ·酵素生産等を有利に行なうために使用できると考えられる。

本発明では、 麹菌とは、 食品の製造に用いられる麹菌を指し、 例えば、 黄麹菌 ァスペルギルス ·ォリゼ、 ァスペルギルス ·ゾーヤ、 ァスペルギルス ·タマリ、 黒麹菌ァスペルギルス ·二ガー、 ァスペルギルス ·ァヮモリ、 ァスペルギルス · ゥサミ、 ァスペルギルス ·サイトイ、 白麹菌ァスペルギルス ·カヮチ等が例示さ れるが、 これらに限定されるものではない。 本発明において用いられる麹菌は、 望ましくは、 黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ、 ァスペルギルス ·ソーャ又はァス ペルギルス ·タマリであり、 更に望ましくは黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ又は ァスペルギルス ·ゾーヤであり、 最も望ましくはァスペルギルス ·ォリゼである

1 . 本発明の転写因子及び転写因子遺伝子

「本発明の転写因子」 とは、 硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する 転写因子蛋白質を指す。 本明細書において、 「硫黄同化系遺伝子」 とは硫黄同化 に関わる遺伝子を指すが、 これは具体的には、 低分子含硫物質の培地中から細胞 内への取り込みや、 分解、 含硫アミノ酸合成経路への硫黄の供給に関わる蛋白質 をコードする遺伝子であり、 例えば、 ァリルサルファターゼ遺伝子、 コリンサル ファターゼ遺伝子、 サルフェートパーミア一ゼ遺伝子、 サルフェートリダクタ一 ゼ遺伝子等が挙げられる。 本発明において使用する硫黄同化系遺伝子としては、 ァリルサルファ夕ーゼ遗伝子、 コリンサルファターゼ遺伝子が好ましく、 ァリル サルファターゼ遺伝子が特に好ましい。 本明細書において 「硫黄同化系遺伝子の 発現を制御する機能」 とは、 転写因子として機能することによって硫黄同化系遺 伝子の発現様式を変更する能力を指し、 具体的には例えば、 その発現を増強する こと、 その発現に対する抑制を解除すること、 その発現を低減すること、 その発 現を抑制すること、 及びその発現時期を変化させることが挙げられる。 本発明の 転写因子が、 「硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能」 を有することは、 例え ば、 本発明の転写因子の存在下で特定の硫黄同化系遺伝子の発現様式が本発明の 転写因子の不在下と比較して変化することが観察されることによって判断できる 。 より具体的には、 そのような硫黄同化系遺伝子の発現様式の変化は、 該遺伝子 の mRNAもしくは該遺伝子にコードされる蛋白質等の存在量又は活性の変化、 ある いは発現時期の変化等を、 常法により測定することに基づいて観察できる。 その 測定対象としては、 例えばァリルサルファターゼ遺伝子にコードされるァリルサ ルファタ一ゼの酵素活性を挙げることができる。

本発明の転写因子は、 さらに、 転写因子として機能することによって宿主麹菌 にプロテア一ゼ又はェキソぺプチダーゼ生産能をもたらすものであることが好ま しい。 このプロテアーゼ又はェキソぺプチダーゼは、 好ましくは菌体外プロテア ーゼ又はェキソぺプチダーゼである。 本明細書において 「転写因子として機能す る」 「転写因子の機能を有する」 とは、 特定の塩基配列を有する DNAに結合し、 対 応する遺伝子の発現を制御することができる蛋白質を指す。 具体的には、 本発明 の蛋白質が 「転写因子の機能を有する」 ことは、 例えば、 ァカパンカピにおける Cys3蛋白質の scon- 2遺伝子上流の配列への結合の研究 （Pro Nat l. Acad. Sc i. U S A, 92 (8)： 3343-3347, 1995) から Me 蛋白質に結合することが予想される 、 sconB遺伝子上流の塩基配列 （配列番号 25で表す） 又はその相補鎖である塩基 配列 （配列番号 26で表す） からなる DNAに、 本発明の蛋白質が結合することを示 すことによって、 確認することができる。 特定の DNAに蛋白質が結合することは 、 例えばゲルシフト解析によって示すことができる。

特定の実施形態においては、 本発明の転写因子は、 配列番号 3に表されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質である。 しかしながら、 本発明の転写因子は、 上記のよ うな転写因子の機能を有する限り、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなる 蛋白質に限定されるものではない。 本発明の転写因子は、 配列番号 3で表される アミノ酸配列において 1若しくは複数個 （好ましくは 2〜5 0個、 より好ましく は 2〜 1 0個、 より好ましくは数個） のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたァ ミノ酸配列からなり、 かつ転写因子の機能を有する蛋白質であり得る。 さらに本 発明の転写因子は、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と 70 %以上の配列相同性 を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、 かつ転写因子の機 能を有する蛋白質であり得る。 さらに本発明の転写因子は、 硫黄同化系遺伝子の 発現を制御する機能を有する蛋白質であり得る。

一方、 「本発明の転写因子遺伝子」 とは、 上記の本発明の転写因子蛋白質をコ ードする遺伝子を指す。 特定の実施形態においては、 本発明の転写因子遺伝子は

、 配列番号 2に表される塩基配列からなる DNAからなる遺伝子である。 しかしな がら、 本発明の転写因子遺伝子は、 上記の本発明の転写因子蛋白質をコードする 遺伝子である限り、 配列番号 2に表される塩基配列からなる DNAからなる遺伝子 に限定されるものではない。 本発明の転写因子遺伝子は、 配列番号 3で表される アミノ酸配列からなる蛋白質、 あるいは、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列に おいて 1若しくは複数個 （好ましくは 2〜 5 0個、 より好ましくは 2〜1 0個、 より好ましくは数個） のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列から なり、 かつ転写因子の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子であり得る。 さら に本発明の転写因子遺伝子は、 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA、 あ るいは、 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からな る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ転写因子の機能を 有する蛋白質をコードする DNAからなる遺伝子であり得る。 また本発明の転写因 子遺伝子は、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と 70 %以上の配列相同性を示す アミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、 かつ転写因子の機能を有 する蛋白質をコードする遺伝子であり得る。 さらに、 本発明の転写因子遺伝子は 、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる DNA、 あるいは 、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる DNAと相補的な 塩基配列を有する核酸からなる MAとストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズし、 かつ硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する蛋白質をコードする DNAからなる遺伝子であり得る。

本発明の転写因子遺伝子は、 当業者に公知の遺伝子発現技術を用いて発現させ ることにより、 本発明の転写因子を産生させることができるものである。

2 . 本発明の転写因子遺伝子の取得

本発明の転写因子遺伝子の例を配列番号 1及び配列番号 2に示す。 本発明の転 写因子遺伝子は、 限定するものではないが、 例えば、 麹菌から単離することがで きる。 麴菌から本発明の転写因子遺伝子を単離するための方法としては、 例えば.

、 まず、 常法により麹菌から調製したゲノム DNA又は cDNAを鍀型として、 転写因 子遺伝子の一部の領域を PCRで増幅し、 その塩基配列を決定し、 プライマ一ゥォ ークにより周辺の塩基配列を決定することにより、 転写因子遺伝子の全長の塩基 配列を取得する。 その後、 その塩基配列に基づいて、 転写因子遺伝子の全長を増 幅することが可能な位置にプライマ一を設計し、 そのプライマーを用いて常法に より麹菌から調製したゲノム DNA又は cDNAを铸型とした PCRを行ない、 その増幅産 物を回収し、 精製することによって、 本発明の転写因子遺伝子を取得することが できる。 最初の PCRで増幅する一部領域は、 該遺伝子内の適切な位置に設計した P

CRプライマーに挟まれた領域として定められる。 この PCRプライマ一は、 本発明 の転写因子遺伝子について保存性の高い領域を同定して、 その領域内に設計する ことが好ましい。 本発明の転写因子遺伝子について保存性の高い領域の同定は、 配列番号 1及び 2で表される塩基配列に加え、 本発明の転写因子遺伝子の他の塩 基配列、 並びに他の転写因子遺伝子の塩基配列等を用いて、 それらの配列を比較 することにより求めることができる。 このように保存性の高い領域の同定は、 当 業者に公知の方法を用いて容易に行なうことができ、 具体的には例えばマルチプ ルアラインメントを行なうプログラム （CLASTAL V、 CLASTAL W等；例えば CLASTA

L Wは、 国立遺伝学研究所のホームページ [ht tp ://www. ddbj . nig. ac. j ]を始めと するインターネッ卜上のウェブサイ卜からも利用できる） を利用することにより 行なうことができる。 また、 目的の遺伝子を取得すべき生物から初めにゲノムク 口一ンを取得した場合には、 次いで RT- PCRにより取得できる cDNAクローンを用い ることにより、 そのゲノム中の該遺伝子のコード領域を特定することが可能とな る。

本発明の転写因子遺伝子を単離するための別の方法としては、 配列番号 1若し くは 2に記載の塩基配列又はその相補配列からなる DNA又は RNAを標識したものを プローブとし、 ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズするクロ一ン を、 常法により調製した上記麹菌のゲノム DNAライブラリ一又は cDNAライブラリ 一から選択することが挙げられる。 この際、 プローブとしては、 上記配列の全長 であってもよいが、 部分配列を用いてもよい。 更に、 プローブとしては、 当該生 物のゲノム DNA又は cDNAを錶型として上述のように保存性の高い配列を PCRで増幅 した断片を用いることもできる。 ストリンジェン卜な条件とは、 特異的なハイブ リッドのシグナルが非特異的な八イブリッドのシグナルと明確に識別される条件 であり、 使用するハイブリダィゼーシヨンの系と、 プローブの種類、 配列及び長 さによって異なる。 そのような条件は、 ハイブリダィゼーシヨンの温度を変える こと、 洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。 例えば、 非特 異的なハイプリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、 ハイブリダ ィゼーシヨン及び洗浄の温度を上げると共に、 必要により洗浄の塩濃度を下げる ことによって、 ハイブリダィゼ一シヨンの特異性を高めることができる。 また、 特異的なハイブリツドのシグナルも検出されない場合には、 ハイブリダィゼーシ ヨン及び洗浄の温度を下げると共に、 必要により洗浄の塩濃度を上げることによ り、 ハイブリッドを安定化させることができる。 このような最適化は、 本技術分 野の研究者が容易に行ないうるものである。

ストリンジェン卜な条件の具体例としては、 例えば、 プローブとして DNAプロ

—ブを用い、 ハイブリダィゼーシヨンは、 5 X SSC 、 1. 0 % (W/V)核酸ハイブリダ ィゼ一シヨン用ブロッキング試薬 （ベ一リンガ 'マンハイム社製）、 0. 1 % (W/V)

N -ラウロイルサルコシン、 0. 02 % (W/V) SDSを用いー晚 （8〜1 6時間程度） で行 なう。 洗浄は、 0.ト 0. 5 X SSCゝ 0. 1% (W/V) SDS, 好ましくは 0. 1 X SSC 、 0. 1% (W/V ) SDSを用い、 15分間、 2回行なう。 ハイブリダィゼーシヨン及び洗浄を行なう温 度は、 55で以上、 好ましくは 60 以上、 更に好ましくは 65で以上、 最も好ましく は 68°C以上である。

また、 本発明の転写因子遺伝子に含まれる、 配列番号 3で表されるアミノ酸配 列と少なくとも 60%、 好ましくは 70%、 更に好ましくは 80%以上、 最も好ましく は 90%以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片で あり、 かつ本発明の転写因子の機能を有する蛋白質をコードする DNA、 及び、 配 列番号 2で表される塩基配列の DNAと少なくとも 60%、 好ましくは 70 %、 更に好 ましくは 80%以上、 最も好ましくは 90%以上の配列相同性を示し、 かつ転写因子 の機能を有する蛋白質をコードする DNAは、 上記の様にハイブリダィゼ一シヨン を指標に同定することもできるが、 ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能 未知の DNA群や公共データベースに蓄積された塩基配列情報の中から、 例えば、 B LASTソフトウェアを用いた類似性検索により容易に発見することもできる。 この ようなハイブリダイゼーション又は配列解析によつて同定された DNAは、 該 DNAを 含むプラスミドクローンから適当な制限酵素によって切り出したり、 該 DNAを含 む領域を PCRにより増幅したりすることによって、 本発明の転写因子遺伝子を含 む DNA断片として単離することができる。 さらに、 上述のようにして単離した本 発明の転写因子遺伝子について、 種々の公知の変異導入法 （例えば部位特異的突 然変異誘発） を用いることにより塩基配列を改変することもできる。 このような 改変を加えた本発明の転写因子遺伝子も、 転写因子の機能を有する蛋白質をコー ドする限り、 本発明に含まれる。

上記のような配列解析において、 2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配 列相同性を決定するために、 まず配列は、 比較に最適な状態に前処理される。 例 えば、 一方の配列にギャップを入れることにより、 他方の配列とのァラインメン トの最適化を行なう。 その後、 各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較され る。 第一の配列において、 ある部位に、 第二の配列の対応する部位と同じアミノ 酸残基又は塩基が存在する場合には、 それらの配列は、 その部位において同一で ある。 2つの配列における配列相同性は、 配列間で同一である部位数の全部位 （ 全アミノ酸又は全塩基） 数に対する百分率で示される。 上記の原理に従い、 2つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、 Karlin 及び Altsclml のアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2 268, 1990及び Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定さ れる。 このようなアルゴリズムを用いた BLASTプログラムが AUschulらによって 開発されたけ. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。 更に、 Gapped BLASTは BLASTよ り感度よく配列相同性を決定するプログラムである（Nucleic Acids Res. 25:338 9-3402, 1997)。 上記のプログラムは、 主に、 与えられた配列に対して高い配列 相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。 これらのプ ログラムにおいて、 パラメ一夕一は通常はデフォルト値を用いる。 これらのプロ グラムは、 例えば、 米国 National Center for Biotechnology Informationのィ ン夕ーネッ卜上のウェブサイ卜において利用可能である。

ただし、 上記 BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからな い場合には、 更に高感度な FASTAソフトウェア (W. R. Pearson and D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988) を用いて配列相同性を示す配 列をデータベースから検索することもできる。 FASTAソフトウェアは、 例えば、 ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。 この場合も、 パラメ一夕一は、 デフ オルト値を用いる。 例えば、 塩基配列についての検索を行なう場合は、 データべ —スに nr- ntを用い、 ktup値は 6を用いる。

上記の各方法は、 主にデータベース中から配列相同性を示す配列を検索するた めに用いられるが、 個々の配列の組み合わせについて配列相同性を決定する手段 として、 本発明では、 Gene tyx Mac Ver.11.1 (ソフトウェア開発社） によるホモ ロジー解析を用いることができる。 このプログラムは、 高速、 かつ高感度な方法 として多用されている Lipman- Pearson法（Science, 227:1435-1441, 1985)に基づ く方法を用いるものである。 塩基配列の配列相同性を解析する際は、 可能であれ ば蛋白質をコードしている領域 （CDS又は 0RF) を用いる。 パラメ一夕一としては

、 Unit Size to compare = 2 ， Pick up Location = 5とし、 結果を％表示させ る。 最も高いポイントを示したアラインメントにおける配列相同性を結果として 用いるが、 問い合わせ配列とアラインメントされた配列との間で 30%以上、 50%以 上、 又は 70%以上のオーバ一ラップが示されない場合は、 その配列同士が必ずし も機能的に相関しているとは推定されないため、 その 2つの配列間の配列相同性 を示す値としては用いない。 例えば、 2つの配列間で数塩基又は数アミノ酸残基 程度の完全一致領域が示されたとしても、 それは偶然の結果に過ぎない可能性が 高い。 また、 2つの配列間の一致領域が全体の数％程度の長さである場合には、 その領域に特定の機能モチーフが含まれていたとしても、 それらの配列が全体と して同じ機能を果たすと考えることは困難である。

以上のようにして取得される本発明の転写因子遺伝子は、 該遺伝子にコードさ れる蛋白質について、 転写因子の機能を有すること及び硫黄同化系遺伝子の発現 を制御する機能を有することを、 後述する説明に従って確認することができる。 本発明の転写因子は、 本発明の転写因子遺伝子を発現させて産生することがで きる。 本発明の転写因子遺伝子の遺伝子発現及び蛋白質の回収 ·精製は、 当業者 に公知の方法を用いて行なうことができる。 本発明の転写因子遺伝子を発現させ るための一般的な方法としては、 まず、 該遺伝子を組み込んだ組み換えベクター を作製する。 さらに、 以下記載のようにして作製される本発明の転写因子遺伝子 を組み込んだ組み換えベクターも、 本発明に含まれる。

3 . 組み換えベクターの作製

本発明の組み換えベクターは、 本発明の転写因子遺伝子を適当なベクター上に 連結することにより得ることができる。 ベクターとしては、 形質転換する宿主中 で本発明の転写因子を生産させうるものであれば如何なるものでも用いることが できる。 例えば、 プラスミド、 コスミド、 ファージ、 ウィルス、 染色体組み込み 型、 人工染色体等のベクターを用いることができる。

上記べクタ一には、 形質転換された細胞を選択することを可能にするマーカー 遺伝子が含まれていてもよい。 マ一力一遺伝子としては、 例えば、 URA3、 niaDの ような、 宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、 アンピシリン、 カナマイシンある いはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が上げられる。 また、 組み換 えベクターは、 宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモータ 一又はその他の制御配列 （例えば、 ェンハンサ一配列、 夕一ミネ一夕一配列、 ポ リアデニル化配列等） を含むことが望ましい。 プロモーターとしては、 具体的に は、 例えば、 GAL1プロモーター、 amyBプロモータ一、 lacプロモーター等が挙げ られる。 ただし、 本発明の組み換えベクターは、 それを in vi tro蛋白質合成をす るために用いる場合は、 宿主内で本発明の転写因子を生産させ得る能力を有する 必要はなく、 使用する in vi tro蛋白質合成系に合った転写及び翻訳の開始点を含 むものを用いればよい。 そのようなベクターとしては、 例えば、 PIVEX2. 3- MCS ( ロシュ.ダイァグノスティックス社）等を用いることができる。

4 . in vi tro蛋白質合成

本発明の転写因子は、 例えば、 上記のような in vi tro蛋白質合成用のベクター に本発明の転写因子遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを使用し、 in vi tro蛋 白合成法の常法により in vi troで合成することができる。 このような in vi tro合 成は、 例えば、 ラピッドトランスレーションシステム RTS100 E. col iHYキット（ ロシュ.ダイァグノスティックス社）等を用い、 キットに添付の方法に基づいて行 なうことができる。

5 . ゲルシフト解析

本発明の転写因子は、 例えばゲルシフト解析を用いて、 転写因子の機能を有す る蛋白質であることを確認することができる。 そのようなゲルシフト解析は、 精 製した本発明の転写因子又は in vi troで合成した本発明の転写因子を用いて、 常 法により行なうことができる。 プローブ DNAとしては、 本発明の転写因子が結合 する塩基配列を含む、 用いる方法に適した長さの標識 2本鎖 DNAであればよく、 合成 DNAをアニーリングさせたもの、 PCRによって増幅したもの又はプラスミドょ り切り出したもの等を用いることができる。 本発明の転写因子が結合する配列と しては、 例えば、 アカバンカビにおいて Me 蛋白質に結合することが知られてい る sconB遺伝子上流領域の配列である配列番号 25で表される塩基配列及びその相 補配列である配列番号 26で表される塩基配列が挙げられる。

ゲルシフト解析では、 例えば、 本発明の転写因子が結合する塩基配列を有する

DNAの 5'末端を蛍光標識し、 それを加熱変性し、 その後徐々に冷却してァニーリ ングさせたものと、 in vi troで合成した本発明の転写因子とを、 バインディング 反応液中に加え、 室温で 2 0分間反応させた後、 8%ポリアクリルアミドゲルで電 気泳動し、 蛍光を検出する機能を持った検出器、 例えば、 Model 4200L Seauence r (LI- COR社）を用いてバンドの観察を行なう。 本発明の転写因子の存在下で配列 特異的にシフトするシフトバンドの存在が確認されれば、 本発明の転写因子は、 その配列の DNAに特異的に結合することがわかる。

6 . 形質転換体の取得

本発明の転写因子遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを用いて、 宿主を形質 転換することにより、 本発明の形質転換体を得ることができる。 宿主としては、 麹菌を用いることができ、 麹菌としては、 例えば、 黄麹菌ァスペルギルス ·オリ ゼ、 ァスペルギルス ·ゾーヤ、 ァスペルギルス ·タマリ、 黒麹菌ァスペルギルス •二ガー、 ァスペルギルス ·ァヮモリ、 ァスペルギルス ·ゥサミ、 ァスペルギル ス ·サイトイ、 白麹菌ァスペルギルス ·カヮチ等が例示される。 本発明において 用いられる上記麹菌は、 望ましくは、 黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ、 ァスペル ギルス ·ソ一ャ、 又はァスペルギルス ·タマリ、 更に望ましくは黄麹菌ァスペル ギルス ·ォリゼ又はァスペルギルス ·ソーャ、 最も望ましくはァスペルギルス · ォリゼである。

形質転換は、 麹菌の形質転換法として公知である方法により行なうことができ る。 例えば、 プロトプラスト化した後ポリエチレングリコ一ル及び塩化カルシゥ ムを用いる方法 （Mol. Gen. Genet. , 218 : 99-104, 1989) により行なうことがで きる。

以上のようにして得られる麹菌は、 麹菌内で本発明の転写因子遺伝子を発現す ることのできる組み換えべクタ一を使用することによって、 該遺伝子の発現を増 強させることができる。 この場合、 麹菌内で本発明の転写因子遺伝子の発現を増 強することのできる組み換えベクターは、 組み換えベクター中の遺伝子の発現を 誘導し得る、 プロモーター等の配列エレメントを含むものであり得る。

なお、 本発明の転写因子遺伝子の発現が増強された麹菌は、 上述の説明のよう な本発明の転写因子遺伝子を組み込んだ組み換えべクタ一を用いる形質転換法と は異なる方法で、 作製してもよい。 すなわち、 本発明の転写因子遺伝子の発現が 増強された麹菌は、 例えば、 麹菌に対する紫外線照射、 放射線照射、 ニトロソグ ァニジンやェチル -メタン-スルホン酸等の変異剤処理によっても得ることができ る。

上述したような、 本発明の転写因子遺伝子を組み込んだ組み換えベクターを用 いた形質転換体、 及び本発明の転写因子遺伝子の発現が増強された麹菌は、 本発 明に含まれる。

7 . 硫黄代謝系遺伝子発現の抑制の解除

上記項目 6で取得される麹菌では、 硫黄同化系遺伝子の発現様式が変化してい る。 特定の実施形態においては、 本発明の麹菌は、 低分子含硫物質の存在下で、 硫黄同化系遺伝子の発現の低分子含硫物質による抑制が本発明の転写因子によつ て解除されるものである。 このことは以下の方法により確認することができる。 試験すべき菌株及び野生株 （宿主株） を、 夫々低分子含硫物質を含む培地で前 培養した後、 低分子含硫物質を含む培地及び含まない培地に移して更に培養する

。 低分子含硫物質としては、 野生株において硫黄同化系遺伝子の発現を抑制する ものであればよく、 例えば、 メチォニン、 硫酸塩等を用いることができる。 低分 子含硫物質の濃度は、 例えば、 0. 5mM以上、 好ましくは ImM以上、 更に好ましくは

5mM以上、 最も好ましくは 10mM以上である。 これらの培養液から菌体を回収し、 破砕する。 破砕は、 例えば、 液体窒素を満たした乳鉢に菌体を入れ、 乳棒ですり つぶし、 バッファー、 ガラスビーズと共にマイクロチューブに入れ、 マルチビー ズショッカー MB-200 (安井器械製） で破碎することにより行なうことができる。 次いで、 菌体破碎液、 又はその遠心分離上清の硫黄同化系遺伝子産物の酵素活性 を測定する。 試験すべき菌株が、 低分子含硫物質の存在下で野生株と比較して少 なくとも 1. 5倍以上、 好ましくは、 2倍以上、 更に好ましくは 3倍以上、 更に好 ましくは 5倍以上、 最も好ましくは 10倍以上の活性を示せば、 硫黄同化系遺伝子 の発現の低分子含硫物質による抑制が解除されていると言える。 また、 低分子含 硫物質の存在下で培養した場合の硫黄同化系遺伝子産物の酵素活性が、 非存在下 で培養した場合の活性の少なくとも 10%以上、 好ましくは 20 %以上、 最も好まし くは 30%以上であれば、 抑制が解除されていると言える。 ただし、 条件によって は増殖の過程で、 野生株でも一時的に見掛け上抑制が解除される酵素も知られて おり （Biochem. J. , 166 :415-420, 1977)、 そのような条件での測定結果は用い ない。 その検定のために、 野生株を用いた対照実験で活性を確認する必要がある 。 測定する硫黄同化系遺伝子産物の酵素活性としては、 例えば、 ァリルサルファ 夕一ゼ活性が挙げられる。 ァリルサルファタ一ゼ活性は、 p -二トロフエノールサ ルフェートを基質とした方法（Biochem. J. , 166 :411-413, 1977)によって測定で きる。

8 . 親株に比べて高い菌体外プロテアーゼ及び菌体外ェキソぺプチダーゼ生産能 を有する麹菌

本発明の麹菌は、 低分子含硫物質の存在下において菌体外プロテアーゼ及び菌 体外ェキソぺプチダーゼ生産能を有する。 特に、 低分子含硫物質の存在下におけ る硫黄同化系遺伝子の発現の抑制が本発明の転写因子によって解除されている麹 菌について、 宿主に上述の遺伝的改変を加えるために使用した親株に比べ、 高い 菌体外プロテァーゼ及び菌体外ェキソぺプチダーゼ生産能を有することが本発明 にて明らかになった。 従って、 例えば、 前述の方法で本発明の麹菌を取得するこ とにより、 親株に比べ高い菌体外プロテアーゼ生産能及び菌体外ェキソぺプチダ ーゼを有する麹菌を得ることができる。 これらの酵素の生産能は、 例えば、 後述 のような酵素の生産法に従つて麹菌を培養し、 培地中のプロテァーゼ及びェキソ ぺプチダーゼ活性を常法により測定することにより検定できる。 プロテアーゼ活 性は、 例えば、 ァゾカゼインを基質とした方法 （日本醤油研究所雑誌、 16 : 86-89 , 1990) によって測定できる。 ェキソぺプチダーゼ、 例えば、 アミノぺプチダ一 ゼの活性は、 例えば、 ロイシン- P-ニトリアニリド又はロイシルグリシルグリシ ンを基質とした、 特開平 1 1一 3 4 6 7 7 7号公報記載の方法によって測定でき る。

9 . 本発明の酵素の生産法

本発明の酵素の生産法は、 本発明の麹菌を培地中で培養し、 その培養物から必 要により酵素 （例えば、 プロテアーゼ、 ェキソぺプチダーゼ） を採取することを 含む。 培養法は、 液体培養であっても良く、 固体培養であってもよい。 用いる培 地は、 低分子含硫物質、 すなわち低分子又は容易に低分子化しうる含硫物質を含 むものであってもよい。 このような培地において、 野生型の麹菌は、 硫黄同化系 遺伝子の発現が抑制されるのに対し、 本発明の麹菌は、 この抑制が解除され、 菌 体外プロテアーゼあるいは菌体外ェキソぺプチダーゼの生産能が高くなるもので あり得るためである。 この効果は、 培地中の低分子含硫物質の濃度が少なくとも

0. 5mM以上、 好ましくは ImM以上、 更に好ましくは 2mM以上、 更に好ましくは 3mM以 上、 更に好ましくは 5mM以上、 最も好ましくは lOmM以上の場合に特に顕著である 。 また、 本発明の転写因子の発現を本発明の組み換えべクタ一により増強した麹 菌においては、 本発明の転写因子遺伝子の発現を制御するために用いたプロモー ターによっては、 必要によりその誘導基質が培地中に存在することが望ましく、 また、 その抑制物質の培地中の濃度は低いことが望ましい。 そのようなプロモー 夕一としては、 例えばアミラーゼ遺伝子のプロモー夕一を用いることができる。 このような場合は、 澱粉、 デキストリン、 マルトース等の誘導基質が少ないと考 えられる場合には、 いずれかを添加することにより、 本発明の転写因子の発現が 促進されると考えられる。 また、 この場合、 グルコースの濃度は低いことが望ま しい。

培養温度、 培養時間は、 目的とする酵素が生産される温度 ·時間であればよい 。 生産した酵素は、 用途に応じて、 培養物中に含まれる状態でそのまま用いても よいし、 必要により培養物から常法に従って採取し、 さらに粗精製又は精製して 用いてもよい。

1 0 . 本発明の麹菌の蛋白質含有物分解への利用

本発明の麹菌は、 蛋白質含有物分解に利用することができる。 すなわち、 本発 明の麹菌は、 菌体外プ口テァーゼ及び菌体外ェキソぺプチダーゼを生産する能力 が高いため、 これを用いることにより、 蛋白質含有物を効率良く分解することが 可能となる。 本明細書において 「蛋白質含有物」 とは、 成分として蛋白質を含有 する物質を指し、 例えば、 大豆、 脱脂加工大豆、 小麦、 小麦ダルテン等の植物性 蛋白質含有物、 牛乳、 スキムミルク、 ミルクカゼイン、 畜肉、 ゼラチン等の動物 蛋白質含有物、 魚肉、 魚肉蛋白質等の魚類由来蛋白質含有物、 酵母、 クロレラ等 の微生物由来蛋白質含有物、 又はこれらの加工品が挙げられる。 本発明の蛋白質 含有物の分解方法においては、 まずは上記項目 9の酵素生産法に従って本発明の 麹菌を培養し、 生産された酵素を蛋白質含有物と混合して、 分解反応を進めるこ とができる。 その反対に、 蛋白質含有物に本発明の麹菌を接種し、 該蛋白質含有 物中で増殖せしめることにより蛋白質含有物中に酵素を生産させることもできる 。 この場合、 麹菌の増殖後、 例えば、 食塩水に混合する等の適当な処置をして更 に反応を進めることもできる。 このような例は、 例えば、 醤油あるいは味噌の製 造の工程における製麹及び仕込みに当たる。 特に、 このような醤油あるいは味噌 の製造の場合、 培地に当たる蛋白質含有物には低分子及び容易に低分子化しうる 含硫物質が豊富に含まれることが多いため、 野生型麹菌では低分子含硫物質によ る発現抑制が生ずる。 この点で、 低分子含硫物質の存在下での硫黄同化酵素系の 抑制が解除された本発明の麹菌は、 上記のような醤油又は味噌等の製造を含む蛋 白質含有物の分解を伴う製法において、 プロテアーゼ等の蛋白質分解酵素を効率 良く生産できるため、 非常に有用である。 このような本発明の麹菌を用いる蛋白 質含有物の分解方法も、 本発明に包含される。 このような本発明の麹菌を用いる 蛋白質含有物の分解方法により、 まず蛋白質含有物の分解物の状態で、 蛋白質含 有物分解産物を製造することができる。 得られる蛋白質含有物分解産物は、 その 用途により、 分解物の状態のまま使用してもよいし、 必要であれば該分解物から 目的の蛋白質含有物分解産物を採取して用いてもよい。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を示し、 本説明をより具体的に説明する。 これらの実施例は、 本 発明の範囲を限定するものではない。

[実施例 1 ]

黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼの硫黄同化系遺伝子を制御する転写因子遺伝子の 取得

黄麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ RIB40株 (ATCC 42149)の胞子を YPD培地 100 ml に植菌し、 温度 30°Cで一晩振盪培養した。 その後、 飯村 〔Argric. Biol. Chem. 323-328, 51 (1987)〕 の方法に従ってゲノム DNAを抽出し、 このゲノム DNA断片 を铸型として、 ァスペルギルス ·ニドランスの硫黄同化系遺伝子の制御因子遺伝 子 metR及びァカパンカビの硫黄同化系遺伝子の制御因子遺伝子 cys- 3の塩基配列 に基づいて合成した下記のプライマーを用いて PCRを行なった。

5' -ACCGC (T/C) GC (T/C) AGCGC (T/C) CG (A/G) TT-3' (配列番号 7 )

5' - (G/C) GA (G/T) CC (A/G) TG (T/C) TTCTC (A/G) GT - 3' (配列番号 8)

PCR反応は、 Expand HF (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製）を使用し、 DNA Thermal Cycler (宝酒造社）により行なった。 反応液の組成は以下の通りである

(試薬：使用量：終濃度）

H₂0： 36 ^ 1

lO XReact ion Buf fer : 5 ^ 1 : l x

dNTP, Mix 2. 5 mM : 5 1： 250

プライマー： 種類： 20

铸型 （DNA 0. 5 , g) ： 1 ^ 1

Expand HF DNAポリメラーゼミックス l l： 1試験当たり 3. 5U

合計液量： 上記の反応液 50 1を 0. 2 ml反応チューブ中で混合して DNAサーマルサイクラ一 にセットし、 以下のような温度設定により PCRを行なった。

94°C、 3分 ： 1サイクル

94°C、 1分 50°C、 1分 72°C、 1分 ： 30サイクル

72で、 7分 ： 1サイクル。

増幅産物を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動で確認し、 その目的の DNA断片を単離 し、 精製し、 TAクローニングベクタ一 pT7Blue T- Vector (Novagen社製）に連結し て、 大腸菌 JM109 (ATCC 53323) の形質転換及びクロ一ニングを行なった。 目的 の DNA断片を有する大腸菌クローンからプラスミドを調製し、 クローニングした D

NA断片の塩基配列を解析し、 NCBI blas tx (ht tp ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST

/) を用いて相同性解析を行なったところァスペルギルス ·ニドランスの MetRに 相同性を示した。

そこで、 Cliencliik等の方法（Bioteclmidues, 21:526-534, 1996)に従って遺伝子 全長を含むゲノム DNAクローンを取得した。

抽出したゲノム DNAを、 EcoRV, Seal, DraI，PvuII及び Sspl等の 6 bpを認識して平 滑に切断する夫々の制限酵素で完全消化した後、 そのゲノム DNA断片の両端に、 (P) 5' -ACCTGCCC-3' (NH₂) (配列番号 9)

及び

5' -CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' (配列番号 10) からなるアダプターを連結した。 このゲノム DNA断片を錶型として、 上で決定し た塩基配列をもとに合成したプライマー及びアダプターの部分の配列を有するプ ライマー：

5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (配列番号 11)

を用いて PCRを行なった。 5'側領域を取得時には次の 2つの配列のプライマーを用 いた。

5'-TTTTCCATCTCCAGCTGGGCTACGCG-3' (配列番号 12) '

5' -AGGGATCTGCGTGCTGTACTTGGTGTGT-3' (配列番号 13)

3 '側領域を取得する場合には次の配列のプライマ一を用いた。

5' -TGGAACGGACAGTGCGAGAGACTA-3' (配列番号 14)

PCR反応は Expand HFを使用し、 DNAサーマルサイクラ一により行なった。 5'側 、 3'側取得時には Dralを使用した。 反応液の組成は以下の通りである。

(試薬：使用量：終濃度）

H₂0： 18.25 l

lOXReaction Buffer： 2.5^1： IX

dNTP, Mix： 2.5 mM： 2.5 1： 250 ^M

プライマ一： 0.25 1X2種類：

錶型（DNA 0. ：

Expand HF MAポリメラーゼミックス ： 0· 25 1： 1試験当たり 1. 5U

合計液量： 25 1 上記の反応液 25 1を 0. 2 ml反応チューブ中で混合して DNAサ一マルサイクラ' にセットし、 以下の様な温度設定によりステツプダウン PCRを行なった。

95°C、 1分 ： 1サイクル

95°C、 30秒 74° (：、 15秒 70°C、 3分 ： 3サイクル

95°C、 30秒 70°C、 15秒 70° (：、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 66°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 62°C、 15秒 70° ( 、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 58°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 54°C、 15秒 70° (：、 3分 20サイクル。

増幅産物を 1%ァガロースゲル電気泳動で確;！ 認し、 その目的の DNA断片を単離し 、 精製し、 TAクローニングベクター pT7Blue T- Vectorに連結して大腸菌 JM109の 形質転換及びクロ一ニングを行なった。 目的の DNA断片を有する大腸菌クローン からプラスミドを調製し、 クローニングした DNA断片の塩基配列を解析した。 こ の塩基配列を配列番号 1に示す。 この配列を、 NCBI blastx (ht tp ://www. ncbi. n lni. iiih. gov/BLAST/) を用いて相同性解析を行なったところァスペルギルス ·二 ドランスの MetRに相同性を示した。

本遺伝子の cDNAの塩基配列を決定するために RT-PCRによる cDNAの増幅を試みた 。 ァスペルギルス ·ォリゼ RIB40株の胞子を YPD培地 100 mlに植菌し、 温度 30°Cで 20時間培養した。 その後、 菌体を回収し Chigwin等の方法 OBiocliemistry 18 529 4-8299, (1979)〕 に従って total RNAを得、 その後オリゴ（dT)セルロースカラム（ アマシャム社製）を使用して mRNAを取得した。 その後 Ready- To- Go RT-PC Beads ( アマシャム社製）を使用して cDNAを合成した。 プライマーは次の 2つの配列のもの を用いた。

5 ' -ATGTCAGATGAGCACATCGCTCGTCAG-3 ' (配列番号 15)

5' -CTAGTTATCGGTGCCCACACCCTTC-3' (配列番号 16)

反応液の組成は、 キットの標準組成にしたがった。 反応条件は以下のようにし て行なった。

42。C、 30分 95°C、 5分

95°C , 30秒 55°C、 1分 72°C、 1分 ： 32サイクル。

増幅産物を ί¾ァガロースゲル電気泳動で確認し、 その目的の DNA断片を単離し 、 精製し、 ΤΑクロ一ニングベクタ一 pT7Blue T- Vector (Novagen社製）に連結して 大腸菌 JM109の形質転換及びクロ一ニングを行なった。 目的の DNA断片を有する大 腸菌クローンからプラスミドを調製してクローニングした DNAの塩基配列を解析 し、 上記で決定した染色体上の本遺伝子の配列と比較して抜けている部分をィン トロンとして決定した。 この cDNAの塩基配列を解析した結果、 831 bpからなるォ ープンリーディングフレーム （以下 0RFと略す） の存在が明らかとなった。 この 0 RFの塩基配列を配列番号 2に記載した。 上記塩基配列の決定により得られた染色 体 DNA由来の本蛋白質遺伝子及び cDNAを比較した結果、 染色体簡 A上には 732 bpか らなるイントロンが一つ存在することが確認された。 また、 cDNAの塩基配列から 推定されるァミノ酸配列を配列番号 3に記載した。 このアミノ酸配列を解析した 結果、 本蛋白質の C末端付近には本蛋白質が DNA結合蛋白質であることを示唆する ロイシンジッパー構造をとりうる配列が存在していた。 また、 このアミノ酸配列 と配列同一性の高い配列を、 公知のアミノ酸配列データベースに対して検索した 。 検索には、 NCBI bl as tp (ht tp ://www. ncbi. nlm. ni . gov/BLAST/) を用い、 デ 一夕べ一スとしては、 nrを指定した。 その結果、 一致する配列はなく、 最も高い 配列相同性を示したのは、 ァスペルギルス ·ニドランスの MetR蛋白質 （ACCESSI0 N AAD38380) であった。 そこで、 Genetyx Mac Ver l l. 1のホモロジ一検索を用い て解析したところ、 これらの配列間の配列相同性は、 257残基のオーバ一ラップ で 28. 8 %であった。 従って、 得られた遺伝子によりコードされる蛋白質は、 配列 相同性が 28. 8%では、 配列のみをもって MetRと類似の機能を有すると想定するこ とは困難であった。

配列番号 2に記載の塩基配列について、 配列相同性の高い配列を検索した。 検 索には、 NCBI blas tn (ht tp :〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を用い、 データべ ースとしては、 nrを指定した。 その結果、 最も高い配列相同性を示したのは、 ァ 力パンカビの cys- 3遺伝子であつたが、 その一致範囲は限られており、 また、 ァ スペルギルス 'ニドランスの inetR遺伝子は検索結果に入っていなかった。 そこで 、 より感度の高い FASTAによる検索を行なった。 ゲノムネット （http：〃 www. geno me. ad. jp) の FASTA検索サービスを用い、 データベースには nr-ntを使用した。 そ の結果、 ァスペルギルス ·ニドランスの metR遺伝子 (ACCESSION AF148535)が最 も高い配列相同性を示した。 そこで、 この配列から CDS部分 （0RF部分） を抽出し 、 Genetyx Mac Verll.1のホモロジ一検索を用いて解析したところ、 793塩基のォ 一バーラップで 50%の相同性を示した。

更に、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列と配列相同性を示すアミノ酸配列をコ ードする DNAを検索した。 検索には、 NCBI tblastn(http://www. ncbi.nlm.nih. go v/BLAST/)を用い、 データベースとしては、 nrを指定した。 その結果、 最も配列 相同性を示したのは、 ァスペルギルス 'ニドランスの metR遺伝子（ACCESSION A F148535)であり、 そのアミノ酸レベルでの配列相同性は上に述べた通りであった

[実施例 2 ]

黄麹菌の sconB遺伝子の部分配列の決定

糸状菌ァスペルギルス ·ォリゼ RIB40株（ATCC 42149)の胞子を YPD培地 100 ml に植菌し、 温度 30°Cで一晩振盪培養した。 その後、 飯村の方法に従ってゲノム DN Aを抽出し、 このゲノム丽 A断片を铸型として、 ァスペルギルス ·ニドランス及び ァカパンカビの meaB遺伝子の塩基配列に基づいて合成した次の 2つの配列のブラ イマ一を用いて、 PCRを行なった。

5 ' -CG (G/A) ATGTG (T/C) GAACAACAC-3 ' (配列番号 17)

5' - CAA (A/C) CCCTC (G/C) AGGTG (A/C) CCGAA-3' (配列番号 18)

PCR反応は Expand HFを使用し、 DNA Thermal Cyclerにより行なった。 反応液の 組成は以下の通りである。

(試薬：使用量：終濃度）

¾0： 36^1

lOXReaction Buffer： 5 \ \x

dNTP, Mix 2. 5 mM： 5 1： 250 M プライマー： 1 1 X 2種類：

铸型 (DNA 0. 5 g) ： \ \

Expand HF DNAポリメラーゼミックス ： 1 1： 1試験当たり 3. 5U

合計液量： 50 l 上記の反応液 50 1を 0. 2 ml反応チューブ中で混合して DNAサーマルサイクラ一 にセッ卜し、 以下のような温度設定により PCRを行なった。

94°C、 3分 ： 1サイクル

94°C、 1分 55°C、 1分 72 、 1分 ： 30サイクル

72°C、 7分 ： 1サイクル

増幅産物を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動で確認し、 その目的の DNA断片を単離 し、 精製し、 TAクローニングベクタ一 pT7Blue T-Vectorに連結して大腸菌 JM109 の形質転換及びクローニングを行なった。 目的の DNA断片を有する大腸菌クロー ンからプラスミドを調製してクローニングした DNA断片の塩基配列を解析し、 NCB I blastx (ht tp：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/) を用いて相同性解析を行なつ たところァスペルギルス ·二ドランスの S c 0 n Bに高い相同性を示した。

そこで、 Chenchik等の方法 (Biotechniaues, 21 : 526-534, 1996)に従って遺伝子 全長を含むゲノム DNAクローンを取得した。

抽出したゲノム DMを、 EcoRV, Seal, Dral, PvuIIあるいは Sspl等の 6 bpを認識し て平滑に切断する夫々の制限酵素で完全消化した後、 そのゲノム DNA断片の両端 に

(P) 5' -ACCTGCCC-3' (NH₂) (配列番号 9)

及び

5' -CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' (配列番号 10) からなるアダプターを連結した。 このゲノム DNA断片を铸型として、 上で決定し た塩基配列をもとに合成したプライマー及びアダプターの配列を有するプライマ

5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (配列番号 11)

を用いて PCRを行なった。 5 '側領域を取得時には次の配列のプライマーを用いた 5' -AGGAAGCCCCCAGCCACATTTCTTGC-3' (配列番号 19)

3'側領域を取得する場合には次の配列のプライマーを用いた。

5' -ACGATTCTTGCCTCAGCCTCCG-3' (配列番号 20)

PCR反応は Expand HFを使用し、 DNAサーマルサイクラ一により行ない、 5'側、 3' 側取得時には Dralを使用した。 反応液の組成は以下の通りである。

(試薬：使用量：終濃度）

H₂0： 18.25 l

lOXReaction Buffer： 2.5 1： 1 x

dNTP, Mix： 2.5 mM： 2.5^1： 250 M

プライマー： 0.25 1X2種類： 5^M

铸型（DNA 0. l g) ： \ \

Expand HF DNAポリメラーゼミックス： 0.25 1： 1試験当たり 1.25U

合計液量： 25 zl 上記の反応液 25 Ailを 0.2 ml反応チューブ中で混合して DNAサーマルサイクラ- にセッ卜し、 以下のような温度設定によりステップダウン PCRを行なった。

95で、 1分 ： 1サイクル

95°C、 30秒 74°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 70°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95°C、 30秒 66°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95で、 30秒 62°C、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

95° (：、 30秒 58° ( 、 15秒 70°C、 3分 3サイクル

%° , 30秒 54°C、 15秒 70で、 3分 20サイクル

増幅産物を 1%ァガロースゲル電気泳動で確認して 1-2 kb程度の長さを有する DN

A断片を単離し、 精製し、 TAクローニングベクタ一 pT7Blue T_Vectorに連結して 大腸菌 JM109の形質転換及びクロ一ニングを行なった。 目的の DNA断片を有する大 腸菌クローンからプラスミドを調製してクローニングした DNA断片の塩基配列を 解析した。 この塩基配列を配列番号 4に示す。 この配列を、 NCBI blas tx ( t tp : 〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/) を用いて相同性解析を行なったところァスぺ ルギルス ·ニドランスの SconBに相同性を示した。

本遺伝子の cDNAの塩基配列を決定するために RT-PCRによる cDNAの増幅を試みた 。 RIB40株の胞子を YPD培地 100 mlに植菌し、 30°Cで 20時間培養をした。 その後、 菌体を回収し Chigwinらの方法に従って total RNAを得、 その後オリゴ（dT)セル口 —スカラムを使用して mRNAを取得した。 その後 Ready- To- Go RT-PCR Beadsを使用 して c丽 Aを合成した。 プライマーは次の 2つの配列のものを用いた。

5' -ATGGCCCAACCGACCGGAGAACTTAC-3' (配列番号 21)

5' -TTAATTGCGGAAACTGTACATGCGCA-3 ' (配列番号 22)

反応液の組成は、 キットの標準組成に従った。 反応条件は以下のようにして行 なった。

42°C、 30分

95°C、 5分

95 、 30秒 55で、 1分 72°C、 1分 ： 32サイクル。

増幅産物を 1%ァガロースゲル電気泳動で確認し、 その目的の DNA断片を単離し

、 精製し、 TAクローニングベクター pT7Blue T- Vectorに連結して大腸菌 JM109の 形質転換及びクローニングを行なった。 目的の DNA断片を有する大腸菌クローン からプラスミドを調製してクローニングした DNAの塩基配列を解析し、 上記で決 定した染色体 DNA由来の塩基配列と比較して抜けている部分をィントロンとして 決定した。 この cDNAの塩基配列を解析した結果、 2055 bpからなるオープンリー ディングフレームの存在が明らかとなった。 この塩基配列を配列番号 5に示す。 上記塩基配列の決定により得られた染色体 DNA由来の本蛋白質遺伝子及び cDNAを 比較した結果、 染色体 DNA上には 48 bpからなるイントロンが一つ存在することが 確認された。 上記塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 6に示す。 こ のアミノ酸配列と配列同一性の高い配列を、 公知のアミノ酸配列データベースに 対して検索した。 検索には、 NCBI blas tp (ht tp ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST

/) を用い、 データベースとしては、 nrを指定した。 その結果、 一致する配列は 無く、 最も高い配列相同性を示したのは、 ァスペルギルス ·ニドランスの SconB 蛋白質 （ACCESSION Q00659) であった。 そこで、 Genetyx Mac Verl l. 1のホモ口 ジ一検索を用いて解析したところ、 これらの配列間の配列相同性は、 677残基の オーバーラップで 80. 1 %であった。 従って、 得られた遺伝子によりコードされる 蛋白質は全長の約 99%のオーバーラップでァスペルギルス ·ニドランスの SconB と高い配列相同性を示したので、 ほぼ同一の機能を有すると考えられた。

配列番号 4に記載の塩基配列に対して、 配列相同性の高い配列を検索した。 検 索には、 NCBI bl as tn (lit tp :〃冊 w. ncbi. nlm. nili. gov/BLAST/)を用い、 データべ ースとしては、 nrを指定した。 その結果、 最も高い配列相同性を示したのは、 ァ スペルギルス ·ニドランス sconB遺伝子（ACCESSION U21220)が最も高い配列相同 性を示した。 そこで、 この配列から CDS部分 （0RF部分） を抽出し、 Genetyx Mac Ver l l. 1のホモロジ一検索を用いて解析したところ、 2036塩基のオーバーラップ で 73. 2%の相同性を示した。

さらに、 配列番号 6に記載のァミノ酸配列と配列相同性を示すァミノ酸配列を コードする MAを検索した。 検索には、 NCBI tbl as tn (ht tp ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)を用い、 データベースとしては、 nrを指定した。 その結果、 最も配 列相同性を示したのは、 ァスペルギルス ·ニドランスの sconB遺伝子（ACCESSION U21220)であり、 そのアミノ酸レベルでの配列相同性は上に述べた通りであった

[実施例 3 ]

in vi t ro蛋白質合成

上記実施例 1で作製した cDNAをテンプレートとして次の 2つの配列のプライマ 一を用いて PCRを行なった。

5' -GAAGGAGATATACATATGGATTACGACCAG-3' (配列番号 23)

5' -CCCCCGGGAGCTCCTAGTTATCGGTGCCCA-3' (配列番号 24)

増幅断片を、 発現用ベクター PIVEX2. 3- MCS (ロシュ ·ダイァグノスティックス 社製）の Ndel, Sacl部位に挿入し、 ラビッドトランスレーションシステム RTS 100 E

. col iHYキット（ロシュ 'ダイァグノスティックス社製）を使用して、 30°Cで 4時 間反応を行なうことにより、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を 発現させた。

反応系は次のとおりである。

12 1 E. col iライセート

lO i l 反応系ミックス

U n \ アミノ酸

\ H \ メチォニン

5 a 1 再懸濁バッファ一

1 1 铸型 DNA

これらを最終的に DNase及び RNaseフリ一蒸留水で 50 1に調整した。

このようにして in vi tro蛋白質合成系で発現させた蛋白質を以下のゲルシフ卜 解析に用いた。

[実施例 4 ]

ト解析

配列番号 3に記載のァミノ酸配列中にはロイシンジッパー構造が C末端側に存 在するが、 本蛋白質が転写因子の機能を有すること、 すなわち DNA結合蛋白質と して機能することを確認するために、 sconB遺伝子のプロモータ一領域をプロ一 ブとしてゲルシフト解析を行なった。

ゲルシフ卜に使用したプロ一ブは、 5側を IRDye-800で標識した

5' -GGACGACTGCTACCACGGTAGCGCGCGGGC-3' (配列番号 25)

と未標識の

5' -GCCCGCGCGCTACCGTGGTAGCAGTCGTCC-3' (配列番号 26)

を 94°Cで 5分加熱した後ゆつくりと冷却することによりァニ一リングした二本鎖 を使用した。 パインデイング反応は、 上記反応で作製したプローブ 160 fmoK 実 施例 3で作製した蛋白質 1 /z lにバインディング反応液 〔10niM Tris-HCl (pH 7. 5)

, 50 mM NaCl, 0. 5 ΈΜ DTT, 0. 5 mM EDTA, 2 mM MgCl₂, 4%グリセロール及び 0. 2 rag/ml BSA〕 を加え室温で 20分反応させた後、 8%ポリアクリルアミドゲル（79： 1) で泳動を行ない、 検出には LI- COR 4200L Sequencer (LI- C0R社製）を使用してシ フトバンドの観察を行なった。 その結果、 本配列で配列特異的にシフトするシフ トバンドが確認された。 このことから、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列を持つ 蛋白質が sconB遺伝子のプロモーター領域に結合し、 その転写調節に関与してい ることを強く示唆している。 本実験結果より、 配列番号 3に記載のアミノ酸配列 を有する蛋白質は DNA結合蛋白質として機能していることが確認された。

[実施例 5 ]

麹菌発現べクタ一の構築

ァスペルギルス ·ォリゼのアミラーゼプロモーターを有する発現ベクタープラ スミド PMAR5 (B iosc i. Biotech. Biochem. , 56 : 1674-1675, 1992)のマーカー遺伝 子である argB遺伝子を、 ァスペルギルス ·ォリゼの pyrG遺伝子と交換したプラス ミドを作成した。 PMAR5を Sphlで消化し、 末端平滑化処理後、 更に Sai lで消化し 、 0. 7 ァガロースゲルで電気泳動し、 約 4 kbの断片を回収した。 一方、 ppyrG - 26 (特開 2001- 46053号公報記載）を BamHIで消化し、 末端平滑化処理後、 更に、 Sai l で消化し、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、 pyrG遺伝子を含む約 2. 2kbの]) NA断 片を回収した。 これらの断片をライゲーシヨンし、 そのベクターにより大腸菌 JM 109株を形質転換した。 得られたプラスミドを pAPとした。 このプラスミドは、 py rG遺伝子を選択マーカーとして有し、 アミラーゼ遺伝子のプロモータ一と夕ーミ ネーターの間に Smalサイトを有する発現べクタ一であり、 Smalサイ卜にプロモー ターと同じ方向で遺伝子の 0RFを組み込み、 麹菌を形質転換することにより、 ァ ミラーゼ遺伝子プロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現することができる。 実施例 1で得られた RNAを錶型として、 RNA LA- PCRキット （宝酒造社製） を用 いて RT-PCRを行ない、 配列番号 2の塩基配列を有する 0RFを含む DNA断片を得た。 逆転写反応のプライマーは、 オリゴ dTの 3'側にアダプター配列の付いた、 キッ トに付属のものを用い、 反応液の組成はキットの標準組成に従った。

逆転写の温度条件は、 30°C 10分、 50°C 30分、 99°C 5分、 5°C 5分で行なった。

次いで、 上記逆転写反応産物に、 キットに添付の説明書に従い、 プライマー、 耐熱性ポリメラーゼ等を加え、 PCRを行なった。 プライマーとしては、 キットに 付属のアダプタ一プライマ一及び下記のものを用いて、 5'側は開始コドンの直前 から、 3'側はポリ A部分から増幅した。 5' - CAAGCT TCCAATATGTCAGATGAGCA-3' (配列番号 27)

PCR反応は、 94°C 2分の後、 94°C 10秒、 53°C 20秒、 72°C 1分 20秒を 15サイクル行 ない、 72°C 5分を行なった。 なお、 サ一マルサイクラ一としては、 腿 A Engine PC T-200 (MJ Research製） を用い、 温度コントロール法はカリキュレートコント口 —ルによった。

次いで、 上記 RT- PCRの増幅産物を铸型として、 上記 （配列番号 28) のプライマ —及び下記のプライマーを用いて PCRを行ない、 5'側は開始コドンの直前から、 3 '側は終止コドン直後から増幅した。

5' -AAGCTCTAGATACACAAGGTAACAGA-3' (配列番号 28)

各プライマーには、 増幅後の配列の 5'側に HindI I I、 3'側には Xbalの制限酵素 認識配列を含むような改変を加えてある。 耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、 Tb r EXT DNAポリメラーゼ （Fynnzymes製） を用い、 反応液の組成はポリメラーゼに 添付の説明書に従った。

PCR反応は、 94°C 2分の後、 94°C 10秒、 53°C 20秒、 72°C 1分を 30サイクル行ない 、 72°C 5分を行なった。 増幅産物の一部を 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動したと ころ、 約 0. 9kbのバンドが確認された。

次いで、 T0P0 TA Cloning Ki t wi th TOP 10 Ce l l (Invi t rogen製） を用いて、 上記増幅産物を PCR2.卜 T0P0ベクター上に組み込み、 キッ卜に付属の大腸菌 T0P 10 株を形質転換し、 形質転換体 8クローンを得た。 各形質転換体よりプラスミドを 抽出し、 制限酵素 Hindl l l及び Xbalで切断し、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し たところ、 全てのクローンで約 0. 9kbの断片が確認され、 この 8クローンについて 塩基配列を確認し、 PCRによるエラーを含まない 1クローンを取得した。

このプラスミドを Hindl l l及び Xbalで消化し、 末端平滑化処理後、 0. 7%ァガロ ースゲルで電気泳動し、 約 0. 9kbの断片を回収した。 この断片を、 Smalで消化し た MPとライゲーシヨンし、 そのベクターにより大腸菌 JM109を形質転換した。 大 腸菌形質転換体 6クローンよりプラスミドを調製し、 挿入方向の確認を行なった ところ、 うち 2つのクローンでアミラーゼプロモーターに対して正しい方向で挿 入されていることが確認され、 一方を pAMlとした。 pAMlは、 独立行政法人 産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に FE腹 BP- 7907として 2002年 2月 1 9日付けで寄託されている。 [実施例 6 ]

麹菌形質転換体の取得

ァスペルギルス ·ォリゼ 1764株 (IF04206, IAM2636) から特開 2001 - 46053号公 報記載方法で取得した pyrG欠損株を pAMlで形質転換した。 形質転換法は、 プロト プラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法 （Mo 1. Gen. Genet. , 218 : 99-104, 1989) によって行なった。 pAMlを 5 < g用いて形質 転換し、 最少培地で形質転換体を選択したところ、 約 1000個のコロニーが得られ た。 このうち、 12コロニーについて最少培地で単分生子分離を繰り返し、 形質の 安定化を行なった。 これらの株の分生子を寒天培地上よりかき取り、 0. 05% Tri t on X100を含む TEバッファ一 100 i lに懸濁し、 - 80°Cの超低温槽で凍結させ、 室温 で再融解させることを 3回繰り返すことにより、 PCRの铸型として使える染色体丽 Aを得た。 これらの染色体 DNAを鐯型とし、 アミラーゼプロモ一夕一の上流側のベ クタ一部分の下記配列と、 組込んだ遺伝子の 3'端から上流に向けた配列番号 28の 配列のプライマーを用いて PCRを行なった。

5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3' (配列番号 29)

耐熱性 DNAポリメラ一ゼとしては、 Tbr EXT DNAポリメラーゼ （Fynnzymes製） を用い、 反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従つた。

PCR反応は、 94°C2分の後、 94°C 10秒、 60°C20秒、 72°C 2分を 45サイクル行なつ た。 増幅産物の一部を 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動したところ、 10サンプルで 約 2kbのバンドが確認された。 従って、 これらの株では、 アミラーゼプロモータ 一から組み込んだ遺伝子の 3'末端までが分断されることなく組み込まれているこ とがわかった。 このうちの一株を TFM1とした。

[実施例 7 ]

麹菌硫黄同化系遺伝子の脱抑制

TFM1株及び親株 （硫黄同化系遺伝子の制御系に関しては野生型） のァスペルギ ルス ·ォリゼ 1764株の分生子約 1 0の 6乗個を 40mlのペプトン ·デキストリン培 地 （10mM メチォニン添加) に接種し、 温度 30°Cで 24時間、 150rpmで回転振盪培 養した。 遠心分離により菌体を沈殿させ、 上清を捨てた。 40mlの氷冷した滅菌超 純水に懸濁し、 再び遠心分離することにより菌体を洗浄した。 洗浄を 3回繰り返 した後、 50mlの抑制培地：硫黄源を含まない最少培地に 10mMのメチォニンを添加 したもの及び脱抑制培地：硫黄源を含まない最少培地に夫々懸濁し、 三角フラス コに移して温度 30° (：、 150rpmで回転振盪培養した。 14時間後に菌体を遠心分離し 、 上記と同様に氷冷した滅菌超純水 40mlで 3回洗浄した。 洗浄後の菌体を紙夕ォ ルでよく水切りし、 液体窒素の入った乳鉢に移し、 乳棒で粉碎した。 粉砕された 菌体の約半量を、 0. 7mlのトリス マレイン酸バッファー （ 0. 2M Trisに 0. 2M マ レイン酸を加えて pH6. 9にしたもの） の入ったマイクロチューブに移し、 0. 35gの ガラスビーズを加え、 マルチビーズショッカー MB-200 (安井器械社製） を用いて 80%出力、 10分間で破枠した。 10， 000 X g、 2分間の遠心分離により、 ガラスビー ズ及び不溶物を沈殿させ、 菌体破砕液上清を回収した。 菌体破砕液上清の蛋白質 濃度をプロテインアツセィキット I I (バイオ ·ラッド社製） を用いて測定し、 ト リス マレイン酸バッファーで 0. 4nig/nilになるように希釈した。 の菌体破 砕液上清に 20mMの P-ニトロフエノールサルフェートを含むトリス マレイン酸バ ッファー 150 lを加え、 温度 37°Cで 15分間保温後、 150 1の 0. 5M水酸化ナトリ ゥム水溶液を加えて撹拌し、 反応を停止した。 盲検としては、 菌体破砕液を先に 加えず、 水酸化ナトリゥム水溶液を加えた後に加えた。 夫々のサンプル及び盲検 の 402nmにおける吸光度を測定し、 サンプルと盲検の吸光度の差をァリルサルフ ァターゼの活性値 （任意単位） とした。 測定結果を下の表 1に示す。 表 1

1764株では抑制培地での活性が脱抑制培地での活性の 2. 5%であったのに対し. TFM1株においては、 抑制培地でも脱抑制培地での活性の 36. 9 の活性を示した。 また、 親株に比べて、 TFM1株では、 抑制培地の場合、 約 19倍、 脱抑制培地の場合 、 約 1. 3倍の活性を示した。 これらのことから、 この麹菌において、 低分子含硫 化合物による硫黄同化系遺伝子の発現抑制が脱抑制されていることがわかった。

[実施例 8 ]

麹菌の培養及び菌体外酵素活性の測定

TFM1株及びァスペルギルス ·ォリゼ 1764株を各種培地で培養し、 菌体外の酵素 活性を測定した。

a. 小麦ふすま培地における固体培養

小麦ふすま 2. 78gに水又は 20mM メチォニン水溶液を 2. 22ml加え、 良く混合した 後、 150ml容の三角フラスコに入れて温度 120°Cで 60分間オートクレープ滅菌した 。 ここに上記麹菌の分生子約 10の 6乗個を接種し、 温度 30°Cで静置培養した。 20 時間後に容器を振って培地を細かく分散させ、 更に 32時間培養した。 培養終了後 、 50mlの蒸留水を加え、 温度 5 :で 12時間放置した後、 #2濾紙 （東洋濾紙社製） により培地及び菌体を除き、 酵素抽出液とした。 酵素抽出液のプロテアーゼ活性 及びにアミノぺプチダーゼ活性を夫々ァゾカゼィン及び L-口イシン- P-二トロア 二リドを基質として用いて測定した。 その結果、 メチォニンの添加によりいずれ の菌株でも両酵素活性の低下が見られたが、 いずれの条件でも TFM 朱の方が高い 活性を示した。

b. 大豆粉培地による液体培養

1. 5%の加熱 ·加圧膨化処理した脱脂大豆粉末、 1. 5% リン酸 2水素 1カリウムの 大豆粉液体培地及び、 それに 10mM メチォニン、 20mM グルタミン酸、 1. 5% マル トース 1水和物を添加した培地を用いて液体培養を行なった。 上記培地に約 10の

6乗個の上記麹菌の分生子を接種し、 温度 30°C、 130rpmで 48時間、 回転振盪培養 した。 #2濾紙 （東洋濾紙社製） により菌体及び培地中の不溶成分の一部を取り除 き、 培養上清を得た。 この培養上清について、 プロテアーゼ活性及びにアミノぺ プチダーゼ活性を夫々ァゾカゼイン及び L-ロイシン- P-ニトロァニリドを基質と して用いて測定した。 その結果、 メチォニン、 グルタミン、 マルトースを添加し た場合、 いずれの菌株でも両酵素活性の低下が見られたが、 いずれの条件でも TF Ml株の方が高い活性を示した。 特に、 メチォニン、 グルタミン、 マルトースを添 加した場合、 1764株では両酵素活性ともほとんど観察できない程度まで低下した のに対し、 TFM 朱では、 添加しない場合と比べて約半分程度の活性を示した。 以上の a.及び から、 TFM1株においては、 菌体外プロテアーゼ及び菌体外アミ ノぺプチダ一ゼの生産能が向上していることが明らかとなつた。 本明細書に引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 その全文を参照する ことにより本明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性

本発明において、 麹菌の硫黄同化系遺伝子の発現を制御する転写制御因子及び その遺伝子が明らかにされた。 これにより、 麹菌の硫黄同化系遺伝子の発現制御 を改変することが可能になった。 また、 硫黄同化系遺伝子の発現を増強すること により菌体外プロテァーゼ活性及び菌体外ェキソぺプチダーゼ活性が上昇してい る麹菌が得られることが示された。 本発明の麹菌を用いることによって蛋白質含 有物の分解の効率を向上させることができる。 従って、 本発明は産業上極めて有 用なものである。 配列表フリーテキス卜

配列番号 7、 8、 11、 12〜24、 27〜29は、 一 DNAである,

配列番号 9及び 10は、 アダプター DNAである。

配列番号 25及び 26は、 プローブ DNAである。

Claims

請 求 の 範 囲 以下の（a)又は (b)の蛋白質。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

(b) 配列番号 3で表されるァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ転写因子 の機能を有する蛋白質

配列番号 3で表されるァミノ酸配列と 70%以上の配列相同性を示すアミノ 酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、 かつ転写因子の機能を有 する蛋白質。

以下の（a)又は（b)の蛋白質をコ一ドする転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

(b) 配列番号 3で表されるァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ転写因子 の機能を有する蛋白質

以下の（a)又は（b)の丽 Aからなる転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA

(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からな る MAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ転写因子の機 能を有する蛋白質をコードする DNA

請求項 2に記載の蛋白質をコ一ドする遺伝子。

以下の（a)又は（b)の DNAからなる転写因子遺伝子。

(a) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる DNA

(b) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列をコードする核酸からなる DNAと相 補的な核酸からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ硫黄同化系遺伝子の発現を制御する機能を有する蛋白質をコードする DNA

配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAと 80%以上の配列相同性を示し

、 かつ転写因子の機能を有する蛋白質をコードする DNAからなる転写因子遺 伝子。

請求項 3、 4、 5、 6又は 7に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター 請求項 8に記載の組み換えベクターを含む麹菌。

. 請求項 3、 4、 5、 6又は 7に記載の遺伝子が低分子含硫物質の存在下 で発現する麹菌。

. 低分子含硫物質の存在下で菌体外プロテアーゼ生産能を有する請求項 9 又は 1 0に記載の麹菌。

. 低分子含硫物質の存在下で菌体外プロテアーゼ及び菌体外ェキソぺプチ ダーゼ生産能を有する請求項 9又は 1 0に記載の麹菌。

. 硫黄同化系遺伝子発現の抑制が解除された麹菌。

. 硫黄同化系遺伝子発現の抑制が解除されていることを特徴とする請求項 9、 1 0、 1 1又は 1 2に記載の麹菌。

. 請求項 9から 1 4に記載の麹菌を培地中で培養し、 得られる培養物から プロテアーゼ及び/又はェキソぺプチダーゼを必要により採取することを 特徴とするプロテァーゼ及ぴン又はェキソぺプチダーゼの生産方法。

. 請求項 9から 1 4に記載の麹菌を用いて蛋白質含有物を分解することを 特徴とする、 蛋白質含有物の分解方法。

. 請求項 9から 1 4に記載の麹菌を培養し、 得られる培養物により蛋白質 含有物を分解させ、 該分解物から蛋白質含有物分解産物を必要により採取 することを特徴とする、 蛋白質含有物分解産物の製造方法。

. 培地が 0. 5mM以上の低分子含硫物質を含むことを特徴とする請求項 1 5 に記載の生産方法。