WO2003038089A1

WO2003038089A1 - Compositions de solution de sonde, puce reactive faisant appel auxdites compositions et son procede de production

Info

Publication number: WO2003038089A1
Application number: PCT/JP2002/011454
Authority: WO
Inventors: Yasuko Yoshida; Naoko Tanaka; Saichi Yamada
Original assignee: Ngk Insulators, Ltd.
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2002-11-01
Publication date: 2003-05-08
Also published as: EP1447445A1; DE60218884D1; JP4326334B2; DE60218884T2; JPWO2003038089A1; US20040248976A1; EP1447445B1; EP1447445A4

Description

明細害プローブ溶液組成物と、これを用いた反応性チップおよびその製造方法

技術分野この出願の発明は、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上に高密度で整列固定した反応性チップを製造する際に用いるプローブ溶液組成物と、この組成物を用いて製造した反応性チップ、並びにこの反応性チップの製造方法に関するものである。

背景技術遺伝子の構造や遺伝子発現様式の大量かつ迅速な解析を目的として、様々な反応性チップが用いられている。この反応性チップは、スライドガラス等の基板上に数千から数万種以上の異なるプローブがスポッ卜として整列固定されており、蛍光等によって標識した標的物質のプローブへの結合の有無を指標として、標的物質の特定やサンプル中における標的物質の量を定量することがで-きるようになつている。チップ上に固定されるプローブは、解析する標的物質の種類によって異なる。例えば DNA や RNA が標的物質となる場合は、それらと相補性結合 (ハイプリダイゼーシヨン）が可能な 2本鎖および 1本鎖 DNA 断片やポリヌクレオチド鎖、オリゴヌクレオチド鎖等がプローブとして採用され、これらは DNAチップ（または DNAアレイ）と呼ばれている。また、プローブのスポッ卜は、例えば DNA断片等をプローブとする場合、 DNA断片それ自体を基板上に固定化する方法か、あるいは基板上で所定塩基配列の DMA 断片を合成する方法によって形成される。いずれの方法の場合も、それらのプローブ材料を所定位置に —定量、正確にスポッティングする必要がある。基板上にプローブ材料をスポッティングする方法としては、 QLMLL 方式、ピン&リング方式、スプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのプローブ溶液の供給（打ち込み）を行う方法が知られている。これに対して、この出願の出願人は、ジェットノズルを使用することによって、極微量のプローブ溶液を迅速かつ正確に基板所定位置にスポッティングする方法を発明し、特許出願している（特開 2001 -1 16750 号公報）。また、この出願人は、 DNA プローブ溶液を複数回スポッティングすること（重ね打ちスポッティング）によって、プローブ溶液の使用効率の向上と、スポット径の均一化を可能とする DNAチップの製造法を特許出願している（特開 2001 -186880号公報）。一方、プローブ溶液には、プローブスポットを基板上に安定的に固定するためにカルボキシルメチルセルロース等を含有されているが、さらなる検出感度の向上やスポッ卜の高密度化を目的としたプローブ溶液組成の改良も行われている。例えば、特開 2000-295990 号公報には、親水性ポリマーを含有するプローブ溶液（DNA 溶液）が開示されている。また、特開 2001 -66305 号公報には、インクジエツ卜法のプローブ溶液として、プローブ、尿素、グリセリン、チォジダリコールおよびアセチレンアルコールからなる液体組成物が開示されている。ボス卜ゲノム時代を迎え、膨大な数の未知遺伝子の特定やその機能解析が急務となっている現状において、 DNA チップをはじめとする各種の反応性チップへの期待はますます高まっている。このような要請に対して、高精度に標的物質の特定や定量を可能とする反応性チップを効率よく大量製造し、安価に提供するためには、さらに解決すべき課題が存在する。 1つには、極微量の標的物質をも測定可能なように検出感度をさらに向上させることであり、そのためにはスポット形状をさらに安定化させることが必要である。また、スポッティング形状をさらに安定化させることは、プロ一プスポットの高密度化を可能とするとともに、異なる種類の生体分子プローブを画一条件でスポッティングすることをも可能とする。しかしながら、従来のプローブ溶液組成物では、良好なスポッ卜形状を安定的に得るには限界があった。また従来のプローブ溶液組成物では、プローブ溶液の粘度を上げるため、 SSC バッファー、炭酸ナ卜リウ厶バッファー、酢酸ナ卜リウ厶バッファ一等の塩含有バッファーが通常用いられている。また、エポキシ被覆基板とプローブ側修飾ァミノ基との共有結合によってプローブを固定する場合にも、共有結合の効率を向上させるなどの目的で、塩含有バッファー（特に SSC バッファ一等）が好ましく使用されている。しかしながら、この塩含有バッファーを使用した場合には、塩の析出によってスポット形状が不良化するという問題が存在した。さらに、通常の反応性チップの製造工程は、スポッティングの後に、スポットの乾燥を防ぐための水分付加工程、ベーキング工程、固定化処理工程等を必要とするが、これらの工程の省略化もまた、反応性チップの低コストによる大量製造のためには解決すべき課題である。特に、特開 2001 -186880 号公報に開示されている重ね打ちスポッティングにおいては、工程の省略化は製造の効率化と低コスト化に対してより大きな効果をもたらすものと期待させる。しかしながら、従来の反応性チップの製造方法や、あるいはプローブ試料溶液の組成改良は、これらの課題を全て解決するものではなかった。この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、検出感度の向上、スポッ卜形状の安定化、および製造工程の省略化を全て可能とする新しいプローブ溶液組成物を提供することを課題としている。また、この出願の発明は、前記の組成物を用いて製造された反応性チップと、この反応性チップの製造方法を提供することを課題としてもいる。

発明の開示この出願は、前記の課題を解決するための発明として、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、プローブと保湿性物質とを含有することを特徴とするプローブ溶液組成物を提供する。この溶液組成物においては、保湿性物質が、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩からなる群より選択される 1 種または 2種以上であること、保湿性物質の含有量が 1 ~ 15重量％であること、並びにプローブが、 DNA断片、 RNA断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ペプチド、またはそれらの任意の複合物であることを好ましい態様としている。さらにこのプローブ溶液は、少なくとも 10-3 mol/lの塩を含有することを別の好ましい態様としている。この出願の発明はまた、前記のプローブ溶液組成物がスポッ卜として基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップを提供する。さらにこの出願の発明は、前記のプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポッ卜を基板上で固定化することを特徵とする反応性チップの製造方法を提供する。この製造方法においては、インクジエツ卜方式でスポッティングを行うこと、プローブ溶液組成物スポットを、水分付加を行わずに固定化すること、並びにスポッティングを 2回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化することを好ましい態様としている。

図面の簡単な説明図 1 は、様々な濃度のシアル酸ナトリウム水溶液を含むプローブ溶液組成物を用いて作成した DNAチップにおけるシグナル強度の測定結果を示す。発明を実施するための最良の形態この発明のプローブ溶液組成物は、標的物質に特異的に結合するプローブと保湿性物質とを含有することを特徴としている。保湿性物質は、例えば、それを含有する水溶液を濾紙に 1 ml 滴下して 25°C、相対湿度 40%雰囲気下で 10分間放置した場合の水分残存量が、滴下時水分量と比較して 90%以上となるような物貿である。このような保湿性物質としては、分子量が 300~2000、粘度が 1 ~20cp 程度のものであり、例えば化粧品等に使用されているグリセリン、ホエイ、ヤシ脂肪酸、スクロース、ソルビトール等を使用することができるが、この発明のプローブ溶液組成物においては、特に、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸オリゴマー塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩（以下、これらを Γシアル酸類 _| と記載することがある）の

1種または 2種以上を使用することが好ましい。なお、シアル酸（塩）のオリゴマーは、シアル酸（塩）の 2〜 6量体を、コロミン酸（塩）はシアル酸（塩）の

7量体以上のものである。これらのシアル酸類は市販の乾燥品等を適宜に使用することができる。この発明の溶液組成物に使用するプローブは、標的物質と特異的に結合する生体分子である。例えば、標的物質がゲノム DNA由来の DNA断片（例えば cDNA 等）の場合には、プローブば、相補性に基づいてこれら DNA 断片とハイブリダィズする 1本鎖の DNA断片、 RNA断片、ヌクレオチド鎖（100塩基以上のポリヌクレオチドまたは 1 00 塩基未満のオリゴヌクレオチド）等である。また、標的物質が夕ンパク質の場合は、そのアミノ酸配列の一部に特異的に結合するタンパク質やペプチド等である。また、タンパク質のェピ卜ープに結合することができる抗体またはその Fab、 F(ab') ₂、 Fv断片等をプローブとすることもできる。このプローブ溶液組成物におけるプローブの濃度は、プローブの種類や分子量等に応じて適宜とすることができるが、例えば DNA 断片やヌクレオチド鎖の場合には 0."！〜 5 g 程度とすることができる。また、保湿性物質の濃度は、その保湿性能や粘度等に応じて適宜とすることができるが、シアル酸類の場合には、 1〜15重量％の範囲とすることが好ましい。この発明の溶液組成物におけるプローブおよび保湿性物質以外の成分は、通常の反応性チップ製造に用いられるプローブ溶液のそれと同一とすることができる- 例えば、プローブおよび保湿性物質を pH7〜8程度のバッファーに混合してプローブ溶液組成物を調製することができる。バッファ一は、塩非含有バッファーであってもよいが、 SSC バッファー、炭酸ナトリウムバッファ一、酢酸ナ卜リウ厶バッファ一等の塩含有バッファーが好ましい。また、塩非含有バッファーに、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息硝酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コ八ク酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩、シユウ酸塩、メタンスルホン酸塩、卜レエンスルホン酸塩、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等を使用することができる。なお、塩の濃度は、後記の試験例にて確信したように、少なくとも 10'³ mol/l、好ましくは 10—²〜1 mol/l程度とすることができる。この発明のプローブ溶液組成物の具体例としては、例えば、プローブとして DNA 断片を用いた場合の溶液組成物の組成例は、最終濃度が、シアル酸ナ卜リゥ厶類水溶液 10%(w/v)、 DNA 断片 0.01 %(w/v)になるように、 TE バッファ一 ( pH 8、 0.01 Tris-HCU 0.001 M EDTA) に溶解したものである。また、実施例に示したように、シアル酸類を含む溶液とプローブを含む液とを別途に調製し、それらを混合してプローブ溶液組成物を作成するようにしてもよい。この場合、シアル酸類の溶液を大量に準備し、複数種のプローブ溶液と個々に混合することによって、反応性チップにスポッティングする全種類のプロ一ブ溶液組成物を効率よく作成することができる。次に、この発明の反応性チップとその製造方法について説明する。この発明の反応性チップは、前記のプローブ溶液組成物がスポッ卜として基板上に固定化されていることを特徴とする。基板は、通常の反応性チップに用いられるスライドグラス等であり、特に、特開 2001 -186880 号公報に開示されているポリ L—リジンを被覆した基板が好ましい。この基板では、 DNA 自体のマイナスチャージとァミノ基のプラスチャージの静電結合によりプローブが基板に固定する。また、エポキシ被覆基板を用いる場合には、塩を含有させたプローブ溶液組成物の使用が好ましい。スポッティングされるプローブ溶液組成物は、例えば 100〜20，000 種の異なつたプローブを含む溶液組成物であリ、スポッティングされたこれらの組成物が 100〜1000 ii m程度の距離をもって、それぞれ直径 50〜500 mの大きさのスポッ卜を形成する。このような反応性チップを製造する場合のスポッティング方法は、従来のピン方式によって行うこともできるが、好ましくは、特開 2001 -1 1 6750 号公報ゃ特開 2001 -1 86881 号公報に開示されているインクジェット方式を採用することが好ましい。これらの方法でスポッティングされたプロ一プは、保湿性物質の効果によって良好な形状で基板に固定される。また塩含有バッファーを使用した場合も、塩析出が抑えられ良好なスポット形状が得られる。そして、このような良好なスポット形状により、検出感度の向上と、スポットの高密度化が達成される。スポッティングの後は、通常の反応性チップ製造と同様にして、冷却、スポッ卜に対する水分付加（湿度〜 80<½程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを基板上に固定する。ただし、この発明の製造方法では、スポッティングされたプロ一ブ溶液組成物が保湿性を有しているために、前記の水分付加工程を省略しても、スポット形状が不良化すること (例えばドーナツ状スポッ卜の形成）はない。さらに、この発明の製造方法では、特開 2001 -186880 号公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うことを好ましい態様としている。この場合も、個々のスポッティングにおいてスポット形状が良好に保たれるため、より一層の重ね打ち効果が得られる。また、重ね打ちにおける水分付加も必要としないため、より少ない工程で反応性チップを製造することもできる。以下、実施例および試験例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない <

実施例実施例 1 (1 ) 液体組成物の作成

シアル酸ナ卜リウ厶（Na) 凍結乾燥品を、表 1 に示した組成で溶解し、 pH 調製し、最終濃度が 9〜48%のシアル酸 Na溶液を調製した。表 1

また、酵母 (サッカロマイセスセルビジェ）由来の DNA ( Y1 -10B および Y53-1 A) を精製し、それぞれ TEバッファー 200 At Iに溶解して DMA溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液の DNA濃度は 3 g/mlであった。

DNA 溶液（20 l) 、各濃度のシアル酸 Na 溶液（20 M I) および純水（20 I) を混合し、表 2に示した液体組成物（DNAノシアル酸 Na 溶液）を作成した < 表 2

(2) DNAチップの作成

前記（1 )で作成した各々の液体組成物（DNA シアル酸 Na 溶液）をインクジエツ卜ノズルのマイクロピペット（例えば、特開 2001 -186881 号公報記載の装置）に充填し、ポリ L リジンでコーティングしたスライドガラスに 200pl づっスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約 80°Cで 1 時間焼成し、固定化処理を行って、 DNAプローブを固定した 16種類の DMAチップを作成した。

(3) 測定

(3-1 ) 標識 cDNAの調製

DNAチップ 5枚当たりの試料として、酵母 mRNA5 I、 DEPC処理水 1 I、 oligo primer 1 Iを混合し、 70°Cで 5分間、 42°Cで 3分間加熱した。これに、 5 X reaction buffer 4 k dNTP mixture 2 μ k 100 mM DTT 2 μ. \ , 1 mM fruoriLink dUTP 2 し 40 unit Rnase inhibitor 2.5 卜を混合した。これに、 Super Script II 1 jti Iを添カロし 42°Cで 40分間カロ熱、さらに Super Script II 0.5 t I を添加して 42°Cで 40分間加熱した後、滅菌水 20 1、 0.5 M EDTA 5 1、 1 NaOH を添加して 65°Cで 60分間加熱した。卜リス（1 M, pH7.5) を 25 I添加して中和した後、 Microcon30を用いて 8000rpmで 5分間遠心濾過し、滅菌水 250 1 を添加し 8000rpm で 10 分間の遠心濾過を 2回実施した後、 3000rpm、 45秒間の遠心分離によって標識 cDNAを回収した。

(3-2) ハイブリダィゼーシヨン

標識 cDNA 24.5 ii l、 20 X SSC 8.75 k 1 0% SDS 1 ·75 Iを混合し、 95°Cで 3 分間加熱、室温に 1 5分間放置した後、 DNAチップ 1枚につき 17.5 Iづっ 2回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、 65°Cの湿潤環境下で 16時間放置した。

次いで、 2XSSC-0.1% SDS 中で静かにカバ一ガラスを外し、 2XSSC-0,1% SDS で 2回洗浄、 55°Cに加熱した 2XSSC-0.1% SDS で 2回洗浄、 0.2XSSC- 0.1%SDS、 0.2XSSC、 0.05XSSCでリンスし、遠心 '乾燥した。

(3-3) 蛍光測定

ハイプリダイゼーション処理後の DNAチップを Scan Array (B 機器スキヤナー）にセットし、 Laser Power 80%、 PMT 80%、解像度 10 Aimで測定した。

(3-4) 結果

結果は図 1 に示したとおりである。この図 1 に示したように、シアル酸ナ卜リゥ厶を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成した DNA チップは、特に 3 〜 14 %濃度において高いシグナル強度が得られることが確認された。

実施例 2

(1) 液体組成物の作成

シアル酸ナトリウム（Na) 凍結乾燥品と、そのオリゴマー乾燥品（ダイマー、卜リマ一、テ卜ラマー、ペンタマ一、へキサマー）を、実施例 1 と同様に溶解し、 pH調製し、最終濃度が 30%のシアル酸 Na溶液を調製した。

また、酵母 (サッカロマイセスセルビジェ）由来の DNA (Y1-10B および Y53-1A) を精製し、それぞれ TEバッファ一 100AU ίこ溶解して DNA溶液を調製した。吸光度法により測定したこの溶液の D N A濃度は 3.03 g/m Iであった。

DNA 溶液（20/il) 、各シアル酸 Na 溶液（20 il) および純水（20/il) を混合し、表 3に示した液体組成物（DNAZシアル酸 Na溶液）を作成した。表 3

(2) DNAチップの作成

前記 (1)で作成した各々の液体組成物（DNAメシアル酸 Na 溶液）をインクジエツ卜ノズルのマイクロピペット（例えば、特開 2001-186881 号公報記載の装置）に充填し、ポリ L リジンでコーティングしたスライドガラスに 200pl づっスポッティングした。次いで、各スポットに水分付加を行い、約 80°Cで 1 時間焼成し、固定化処理することによって、 DNA プローブを固定化した 7種類の DNAチップを作成した。

(3) 測定

(3-1) 標識 cDNAの調製

- DNAチップ 5枚当たりの試料として、酵母 mRNA5 l、 DEPC 処理水 1 il、 oligo primer 1 Iを混合し、 70°Cで 5分間、 42°Cで 3分間加熱した。これに、 5 X reaction buffer 4/x l、 dNTP mixture 2 At L 100 mM DTT 2 し 1 mM fruoriLink dUTP 2μ.\, 40 unit Rnase inhibitor 2.5 μ.\ を混合した。これに、 Super Script II 1 Iを添加し 42°Cで 40分間加熱、さらに Super Script II 0.5/ l を添加して 42°Cで 40分間加熱した後、滅菌水 20 し 0.5 M EDTA 5 I、 1 NaOH を添加して 65°Cで 60分間加熱した。卜リス（1 Μ， ρΗ7·5) を 25

I添加して中和した後、 Microcon30を用いて 8000rpmで 5分間遠心濾過し、滅菌水 250 I を添加し 8000rpm で 10 分間の遠心濾過を 2回実施した後、 3000rpm、 45秒間の遠心分離によって標識 cDNAを回収した。

(3-2) ハイプリダイゼーシヨン標識 CDNA 24.5 I、 20XSSC 8.75μ.\. 10% SDS 1.75 Iを混合し、 95°Cで 3 分間加熱、室温に 15分間放置した後、 DNAチップ 1枚につき 17.5 Iづっ 2回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、 65°Cの湿潤環境下で 16時間放置した。

次いで、 2XSSC-0.1% SDS 中で静かにカバーガラスを外し、 2XSSC-0.1% SDS で 2回洗浄、 55°Cに加熱した 2XSSC-0.1% SDS で 2回洗浄、 0.2XSSC- 0.1% SDS、 0.2XSSC、 0.05XSSCでリンスし、遠心 '乾燥した。

(3-3) 蛍光測定

ハイブリダイゼーション処理後の DNAチップを Scan Array (BM機器スキヤナー）にセットし、 Laser Power 80%、 PMT 80%、解像度 10 mで測定した。

(3-4) 形状判定

ガラス上に固定された DNA プローブを含むスポットの形状を、実体顕微鏡を用いた目視により判定し、サテライト出現率を計上した。また、八イブリダィゼ —ション処理後の蛍光画像から、目視で確認できなかったサテライ卜を判定し、出現率を計上した。

(3-5) 結果

結果は表 4に示したとおりである。この表 4に示したように、シアル酸類水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成した DNA チップは、純水を含むプローブ溶液組成物を使用した DNAチップに比較して、サテライト形状不良の出現率が明らかに低く、良好なスポット形状が形成されることが確認された。表 4

No. 添加剤実体顕微鏡判定 Λィフ'リダイセ' -シヨン判定出現率合計

1 シアル酸ナトリウム水溶液 0.3% 0.2% 0.5%

2 シアル酸ダイマー水溶液 0.3% 0.4% 0.7%

3 シアル酸トリマー水溶液 0.4% 0.3% 0.7%

4 シアル酸亍トラマー水溶液 0.4% 0.2% 0.6%

5 シアル酸ペンタマ一水溶液 0.3% 0.2% 0.5%

6 シアル酸へキサマー水溶液 0.2% 0.4% 0.6%

7 純水 15% 10% 25% 実施例 3

(1) 液体組成物の作成

シアル酸ナトリウム（Na) 凍結乾燥品、およびカルボキシルメチルセルロース（CMC) を、表 5に示した組成で溶解し、 pH 調製し、シアル酸 Na の最終濃度が 6~42%のシアル酸 Na溶液と、 2% CMC溶液を調製した。表 5

また、酵母 (サッカロマイセスセルビジェ）由来の DNA (Y1-10B および Y53-1A) を精製し、それぞれ TEバッファー 120 ' Iに溶解して DNA溶液を調製した。吸光度法にょリ測定したこの溶液の DNA濃度は 3.2 tg/mlであった。

DNA 溶液（20 μΙ) 、各濃度のシアル酸 Na 溶液（20 /il) および純水（20 I) を混合し、シアル酸 Na濃度が 2、 7、 10および 14の液体組成物（DNAZシアル酸 Na 溶液）を作成した。また、 0.5% CMC 濃度の液体組成物（DNAZ CMC溶液）を作成した。

(2) DNAチップの作成

前記（1)で作成した各々の液体組成物をインクジヱッ卜ノズルのマイクロピぺッ卜（例えば、特開 2001-186881 号公報記載の装置）に充填し、ポリしリジンでコーティングしたスライドガラスに 200plづっスポッティングした。次いで、各液体組成物をスポットしたガラスの半数（3枚）には、スポット部分に水分付加を行い、約 80°Cで 1 時間焼成し、固定化処理することによって、 DNAプロ一ブを固定化した DNA チップを作成した。また、残りの半数（3枚）は、水分付加を行わずにベーキングし、固定化処理して DNA チップを作成した（表 6 7 ) o

(3) 測定

(3-1) 標識 CDNAの調製

DNAチップ 5枚当たりの試料として、酵母 mRNA5j l、 DEPC 処理水 1 xl、 oligo primer 1 lを混合し、 70°Cで 5分間、 42°Cで 3分間加熱した。これに、 5 X reaction buffer 4 U dNTP mixture 2ii l、 100 mM DTT 2 し 1 mM fruoriLink dUTP 2 I、 40 unit Rnase inhibitor 2.5μ.\ を混合した。これに、 Super Script II 1 を添加し 42°Cで 40分間加熱、さらに Super Script II 0.5 \ を添加して 42°Cで 40分間加熱した後、滅菌水 20 t I、 0.5 M EDTA 5 I、 1 N NaOH 10WIを添加して 65°Cで 60分間加熱した。卜リス（1 M， pH7.5) を 25 t I添加して中和した後、 Microcon30を用いて 8000rpmで 5分間遠心濾過し、滅菌水 250 | を添加し 8000rpm で 10 分間の遠心濾過を 2回実施した後、 3000rpm、 45秒間の遠心分離によって標識 cDN Aを回収した。

(3-2) ハイブリダィゼーシヨン

標識 cDNA 24.5 I、 20XSSC 8.75 i I、 10% SDS 1 ·75 χ Iを混合し、 95°Cで 3 分間加熱、室温に 15分間放置した後、 DNAチップ 1枚につき 17.5 づっ 2回スポットし、気泡が入らないよう静かにカバーガラスを被せ、 65°Cの湿潤環境下で 16時間放置した。

(3-3) 蛍光測定による形状判定

ハイブリダィゼーシヨン処理後の DNAチップを Scan Array (BlI機器スキヤナー）にセットし、 Laser Power 80%、 PMT 80%、解像度 10iimで、固定スポッ卜の形状を判定した。すなわち、スポット内で明るさが均一でなく、蛍光強度が一定でない形状スポッ卜数をカウン卜した。

(3-4) 結果

結果は表 8に示したとおりである。従来の CMC を使用して水分付加を行わない場合には、 100%の割合で不良スポットが出現するのに対し、シアル酸ナトリゥ厶水溶液を含有するプローブ溶液組成物を使用して作成した DNA チップは、特に 2~14%濃度において、水分付加を行わない場合であっても不良スポットの出現をほぼ完全に防止することが可能であることが確認された。表 8

シァリウ離 09 CMC

0 2 7 10 14 20 2 水細 t03¾« 有有有有有有有不 ·¾ τッ卜 Y1-B10 10 80 5 1 4 0 4 0 5 0 6 3 5 100 fctp藤 06) Y53-1A 12 100 7 1 6 0 5 0 5 0 8 4 8 100 実施例 4

(1) 液体組成物の作成

塩化ナトリウム 3 Mとクェン酸ナトリウム 0.3 Mを混合し、 pH 7.0に調整することにより 20XSSC 液を調製した。次いで、シアル酸を水で溶解し、 10%のシアル酸溶液を調製した。またオリゴ DMA (50 塩基長）凍結乾燥品を 100 pmol/ tl (1.65/ g/ tl) となるように純水に溶解した。以上の溶液を、 DNA 溶液： 50 pmol/ し 1 XSSC (塩化ナトリウム 0.3 M+クェン酸ナトリウム 0,03 M) 、シアル酸溶液： 1%の割合で混合し、液体組成物（DNAZSSC シアル酸溶液）を調製した。対照として、シアル酸を含まない液体組成物（DNAZ SSC) も調製した。

(2) DNAチップの作成

前記（1)で作成した液体組成物（DNAZSSCノシアル酸溶液）をインクジエツ卜のマイクロピペットに充填し、エポキシランを被覆したスライドガラスに 200 pi ずつスポッティングした。次いで、湿度 50%下で、 42°Cインキュベータ内で 8時間反応させることにより共有結合反応を進行させ、固定化処理を行って、才リゴヌクレオチド DNA プローブを固定した DNA チップを作成した。また、対照液体組成物を用いて同様に DNAチップを作成した。

(3) 測定

(3-1) 標識 cDNAの調製

ラッ卜 mRNA (ク口ンテック社製、 5 g/ l) 5 L DEPC処理水 1 μΙ、 oligo (dt) Primer 1 lを混合し、 70°Cで 5分間、 42°Cで 3分間加熱した。これに、 5X reaction buffer 4 Ι. dNTP mixture 2j L 100 mM DTT n 1 Mm Fluorolink dUTP 2wU 40 unit RNase inhibiot 2.5 il を混合した。これに、逆転写酵素 (Super Script II) 1AUを添加し、 42°Cで 40分間加熱、さらに Super Script II 1 tlを添加し、 42°Cで 40分間加熱した後、滅菌水 20 I、 0.5 M EDTA(pH 8) 5fi I、 1 N 卜リス塩酸（pH 7.5) を 25 I添加して中和した後、 QIAGEN™カラムを用いて精製し、純水により標識 cDNAを回収した。 (3-2) 八イブリダィゼーシヨン

標識 cDNA 11.25 il、 20XSSC 8 . 10% SDS 0.7 Iを混合し、 95°Cで 3分間加熱、室温に 5分間放置した後、 DNAチップ 1枚に 15 I スポッ卜し、カバ一ガラス（24X32 mmサイズ）をかぶせ、 65°Cの温度環境下で 16時間放置した。次いで、 2XSSC— 0.1%SDS液中に DNAチップを浸して静かにカバーガラスを外し、 2XSSC— 0.1%SDS 液中で 5 分間放置、 1 XSSC 液中で洗浄、 0.5X SSC液中で洗浄後、 900rpm、 2分間遠心、乾燥した。

(3-3) 蛍光測定

ハイブリダィゼーシヨン処理後の DMA チップを Scan Array にセッ卜し、 Laser Power 70%、 PMT 60%、解像度 5/^ mで測定した。

(3-4) 結果

結果は表 9 に示したとおりである。従来のプローブ溶液組成物（DNA SSC) を用いて作成した DNA チップに比べ、この発明のプローブ溶液組成物 (DNAZSSC/シアル酸溶液）を用いて作成した DNAチップでは、測定した全ての遺伝子 cDNAについて高いシグナル強度が得られた。表 9

遺伝子名

ホ。リュビキ -チューリホ'ソー厶ミオシ GAPDH 液体組成物チンプン蛋白 L8 ン重鎖

シグナル強度

DNA/SSC DNA: 50 (pmol/jUl)

SSC: 2χ1(Γ' (mol/l) 25071 11976 14275 31348 5302

DNA/SSG/シアル酸 DNA: 50 (pmol i)

SSC: 2x1CT' (mol/l) 30121 23270 35123 50361 14272 シアル酸： 1 ( (W/V)) 試験例プローブ溶液組成物に塩を含有させる場合の好ましい塩濃度範囲を探索した <

(1 ) 方法

SSC バッファ一の塩濃度を変更した以外は、実施例 4と同様に溶液組成物 ( DNA/SSCZシアル酸溶液）を調製し、 DNA チップを作成した。また、実施例 4と同様に標識 cDNA を調製し、ハイブリダィゼーシヨンを行い、蛍光測定行つた。

(2) 結果

心筋ァクチン cDNAの検出結果を表 10 に示す。この結果から明らかなように，少なくとも 10·³ mol/l, 好ましくは 10·²~ 1 mol/l程度の塩を含有させることによつて、高いシグナル強度を得ることが可能となる。表 10

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願によって、標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための新しいプロ一ブ溶液組成物が提供される。これによつて、反応性チップにおける検出感度の向上、高密度化、製造工程の省略化が実現され、高精度の反応性チップを低価格で大量に提供することが可能となる。

Claims

請求の範囲

1 - 標的物質に特異的に結合するプローブを基板上にスポッティング固定するための液体組成物であって、プローブと保湿性物質とを含有することを特徴とするプローブ溶液組成物。

2 . 保湿性物質が、シアル酸、シアル酸塩、シアル酸オリゴマー、シアル酸才リゴマ一塩、コロミン酸、およびコロミン酸塩からなる群より選択される 1種または 2種以上である請求項 1 のプローブ溶液組成物。

3 . 保湿性物質の含有量が 1 〜15 重量％である請求項 1 または 2のプローブ溶液組成物。

4 . プローブが、 DNA 断片、 RNA 断片、ヌクレオチド鎖、タンパク質、ぺプチド、またはそれらの任意の複合物である請求項 1のプローブ溶液組成物。

5 . さらに、少なくとも 1 0·³ mol/lの塩を含有する請求項 1から 4のいずれかのプローブ溶液。

6 . 請求項 1から 5のいずれかのプローブ溶液組成物がスポットとして基板上に固定化されていることを特徴とする反応性チップ。

7 . 請求項 1から 5のいずれかのプローブ溶液組成物を基板上にスポッティングし、この液体組成物のスポッ卜を基板上で固定化することを特徴とする反応性チップの製造方法。

8 . インクジエツ卜方式でスポッティングを行う請求項 7の製造法。

9 . プローブ溶液組成物スポッ卜を、水分付加を行わずに固定化する請求項 7 または 8の製造方法。

1 0. スポッティングを 2回以上繰り返して、プローブ溶液組成物を積層化して固定化する請求項 7、 8または 9の製造方法。