WO2003025207A1 - Dispositif et procede de concentration et de detection de germes pathogenes a partir de produits sanguins et/ou de leurs derives - Google Patents

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Isabelle Besson-Faure
Sébastien RIBAULT
Yann Godfrin
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Abstract

La présente invention a pour objet un dispositif et une méthode de concentration de germes pathogènes éventuellement présents dans les produits sanguins ou dérivés, ainsi que la détection desdits germes comprenant les étapes suivantes, (a) on soumet un échantillon dudit produit sanguin à un traitement d'agrégation des cellules sanguines, (b) on élimine les agrégats formés à l'étape (a) par passage de l'échantillon traité sur un premier filtre laissant passer les germes contaminants mais pas les agrégats de cellules, (c) on lyse sélectivement les cellules résiduelles du filtrat obtenu à l'étape (b), (d) on récupère les germes contaminants par passage du lysat de l'étape (c) sur un second filtre laissant passer les débris cellulaires, et (e) on analyse le second filtre pour détecter les germes contaminants éventuellement retenus.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE DE CONCENTRATION ET DE DETECTION DE GERMES PATHOGENES A PARTIR DE PRODUITS SANGUINS ET/OU DE LEURS DERIVES
La présente invention a pour objet une méthode de concentration de germes pathogènes éventuellement présents dans les produits sanguins ou dérivés, ainsi que la détection desdits germes ainsi concentrés pour effectuer un contrôle de la pathogénicité desdits produits sanguins.
On entend par produit sanguin tant le sang total, comme toute préparation issue du fractionnement de celui-ci, comprenant ou non des composants cellulaires, à titre d'exemple, on entend par produit sanguin les concentrés des globules rouges ou de plaquettes, mais aussi les préparations plasmatiques ou sériques.
La détection de contaminations des produits sanguins et dérivés par différents germes pathogènes, tels que des bactéries, des virus, des moisissures, des levures ou autres, est l'une des grandes difficultés auxquelles sont confrontées de nos jours les autorités responsables de la santé publique, ainsi que les industries de la transfusion sanguine.
Des tests de détection existent, mais ils ne sont pas utilisables en routine à ce jour.
Les principales difficultés présentées par la plupart des tests de détection de tels germes pathogènes, parmi une population ou une sous-population de cellules sanguines, réside dans le fait que la plupart de traitements censés extraire sélectivement les germes pathogènes, provoquent simultanément une élimination de ceux-ci . Cette élimination conduit presque systématiquement à une sous-évaluation de la présence desdits germes dans le produit sanguin testé, et donc à une augmentation du risque sanitaire. La demanderesse a donc conçu une nouvelle méthode rapide et sensible pour détecter une contamination d'un produit sanguin ou dérivé, par de tels germes pathogènes .
Le procédé selon l'invention est remarquable en ce qu' il est réalisé directement sur un échantillon issu d'un produit sanguin prélevé chez un sujet, sans traitement ou dilution préliminaire.
Le procédé de détection de germes pathogènes développée par la Demanderesse consiste essentiellement à concentrer sélectivement lesdits germes pathogènes, puis à les détecter, une fois concentrés, par des techniques connues de l'homme du métier.
La concentration sélective des germes pathogènes est effectuée par élimination séquentielle ou simultanée des différentes populations de cellules sanguines présentes dans un échantillon d'un produit sanguin.
Le procédé de concentration de germes pathogènes selon l'invention comporte une première étape de concentration des germes pathogènes consistant à réduire la concentration des populations des cellules sanguines au moyen d'une agrégation sélective de celles-ci, suivie d'une filtration afin de recueillir dans le filtrat les germes pathogènes concentrés non agrégés et de retenir sur le filtre les agrégats de cellules sanguines.
On entend par agrégation, au sens de la présente invention, toute action conduisant à la formation d'agrégats cellulaires, et on entend par agrégat cellulaire tout groupement de cellules comportant plus de deux cellules et dont la taille est supérieure à celle d'une cellule isolée. Au sens de la présente invention, un agrégat peut être obtenu soit par agrégation, telle que l'agrégation des plaquettes subséquente à leur activation, une agglutination, telle que l'agglutination des globules rouges obtenue lors que ceux-ci se trouvent en présence de molécules particulières, soit un rapprochement des cellules induit par un changement de la charge électrostatique de leurs membranes ou encore d'autres mécanismes d'adhésion ou de rapprochement cellulaire conduisant au regroupement de plus de deux cellules.
Selon des modes de mise en œuvre préférés, l'agrégation des différentes populations de cellules sanguines peut être effectuée à l'aide de composés induisant l'agrégation plaquettaire, ou bien à l'aide de composés induisant l'agglutination spécifique des globules rouges . On connaît par exemple que, en présence de certains composés, les plaquettes ont la capacité de s'agréger. Ces agrégats peuvent être facilement séparés des germes pathogènes par filtrat ion.
Les globules rouges présentent également quelques propriétés d'agglutination.
Le procédé de concentration de germes pathogènes selon l'invention comporte éventuellement une deuxième étape de réduction de la concentration des populations des cellules majoritaires dans le sang, à savoir les plaquettes et les globules rouges, consistant à lyser les cellules isolées non agrégées lors de la première étape d'agrégation. Cette deuxième étape de réduction de la concentration des populations des cellules sanguines permet une réduction de l'ordre de 4 log (depuis 109 à 105 cellules/ml) en ce qui concerne la concentration des plaquettes et de l'ordre de 5 log (depuis 1010 à 105) en ce qui concerne la concentration des globules rouges.
Plus précisément l'invention a pour objet un procédé de concentration de germes contaminants éventuellement présents dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on soumet un échantillon dudit produit sanguin à un traitement d'agrégation des cellules sanguines, b) on élimine les agrégats formés à l'étape (a) par passage de l'échantillon traité sur un premier filtre laissant passer les germes contaminants mais pas les agrégats de cellules, c) on lyse sélectivement les cellules résiduelles du filtrat obtenu à l'étape (b) , d) on récupère les germes contaminants par passage du lysat de l'étape (c) sur un second filtre laissant passer des débris cellulaires.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire d'analyse du second filtre pour détecter les germes contaminants éventuellement retenus.
Avantageusement le procédé de détection selon l'invention comprend l'addition d'un agent de marquage des germes contaminants, soit lors de l'agrégation de l'étape (a), soit lors de la lyse de l'étape (c) , soit directement sur le deuxième filtre lors de l'étape (e) d'analyse.
A titre d'exemple d'agent de marquage des germes pathogênes détectables par le procédé de l'invention, on peut citer une solution de marquage comprenant un substrat estérasique tel que le ChemChrome
V6.
Aussi, en tant d'agent de marquage des germes pathogènes détectables par le procédé de l'invention, on peut utiliser une solution de marquage comprenant un anticorps marqué ou un marqueur d'acides nucléiques.
Préférentiellement, le marqueur sera fluorescent ou couplé à un fluorochrome ou à un enzyme permettant la dégradation d'un substrat rendu ainsi fluorescent, éventuellement la fluorescence sera détectée par une excitation laser.
Le procédé de détection selon l'invention comprend également l'addition d'un agent de perméabilisation des germes contaminants, qui peut être ajouté à au moins l'une des étapes du procédé, soit lors de l'agrégation de l'étape (a) , soit lors de la lyse de l'étape (c) , soit directement sur le deuxième filtre lors de l'étape (e) d'analyse, soit à plusieurs d'entre elles.
A titre d'exemple d'agent de perméabilisation des germes contaminants, on peut citer le polyéthylènimine, le diacétate de chlorhexidine , le digluconate de chlorhexidine, l'acide d'éthylène diamine tetracétate (EDTA) seul ou en combinaison avec la nisine ainsi que les détergents de type N-Octyl β-D-glucopyranoside, SDS, T een, triton, Brij , etc.
Selon un mode particulier de mise en œuvre du procédé de l'invention, les cellules sanguines du produit sanguin sont des plaquettes ou des globules rouges ou un mélange de ceux-ci.
Selon un autre mode particulier de mise en œuvre du procédé de l'invention, les cellules sanguines du produit sanguin sont des plaquettes et le traitement d'agrégation de l'étape (a) comprend la mise en contact de l'échantillon avec une composition d'agrégation comprenant au moins l'un des agents d'agrégation choisis dans le groupe comprenant : un anticorps spécifique d'un antigène plaquettaire, un agoniste fort de l'activation plaquettaire, choisi parmi : la thrombine, le TRAP (thrombin receptor activating peptide) , la trypsine, le collagène, le thromboxane A2 , le PAF (platelet activating factor) , le ionophore A23187. un agoniste faible de l'activation plaquettaire, choisi parmi ADP, adrénaline, acide arachidonique, facteur Von Willebrand, sérotonine ou épinéphrine.
Avantageusement la concentration en anticorps de type CD9 spécifique d'un antigène plaquettaire dans la composition d'agrégation est comprise entre 0,5 μg/ml et
100 μg/ml, et de préférence elle est comprise entre 5 μg/ml et 40 μg/ml.
Encore avantageusement, la concentration en agoniste fort dans la composition d'agrégation est comprise entre :
- 0,5 Ul/ml et 100 UT/ml et de préférence entre 1 Ul/ml et 20 Ul/ml pour un agoniste de type thrombine, - 5 μM et 200 μM et de préférence entre 10 et 100 μM pour un agoniste de type TRAP,
- 1 nM et 500 nM et de préférence entre 10 nM et 300 nM pour un agoniste de type trypsine, - 0,05 μg/ml et 50 μg/ml et de préférence entre
1 μg/ml et 20 μg/ml pour un agoniste de type collagène,
- 0,01 μg/ml et 5 μg/ml et de préférence entre 0,1 et 1 μg/ml pour un agoniste du type thromboxane A2 ,
- 0,005 mg/ml et 1 mg/ml et de préférence entre 0,05 et 0,5 mg/ml pour un agoniste du type PAF,
- 0,1 μM et 100 μM et de préférence entre 1 μM et 20 μM pour un agoniste du type ionophore A23187.
Avantageusement la concentration en agoniste faible dans la composition d'agrégation est comprise entre :
- 0,5 μM et 100 μM et de préférence entre 1 μM et 20 μM pour un agoniste du type ADP,du type adrénaline ou du type épinéphrine . - 0,001 mM et 10 mM et de préférence entre 0,01 et 5 pour un agoniste du type acide arachidonique,
- 0,001 mg/ml et 1 mg/ml et de préférence entre 0,01 mg/ml et 0,5 mg/ml pour un agoniste du type facteur Von illebrand, - 0,05 μM et 100 μM et de préférence entre 0,01 μM et 50 μM pour un agoniste du type sérotonine.
D'une manière tout à fait préférentielle l'anticorps spécifique d'un antigène plaquettaire, est choisi parmi : un anticorps anti-CD9, CD32, anti-PTAl, CD42, anti-GpIIb/IIIa ou anti-GpIV.
Selon un autre mode particulier de mise en œuvre du procédé de l'invention, le produit sanguin comprend des globules rouges et le traitement d'agrégation de l'étape (a) comprend la mise en contact de l'échantillon avec une composition d'agglutination comprenant au moins un agent d'agglutination choisi parmi les lectines, le polyéthylènimine, le polyvinylpyrrolidone (PVP) , les gélatines, les dextrans ou les polyéthylènes glycols (PEG) .
Avantageusement lesdites lectines présentent une activité érythroagglutinine . Tout préf érentiellement les lectines sont choisies parmi les lectines de Phaseolus vulgaris , Vicia sativa, Vicia faba ou Erythrina corallodendron., Lens culinaris, Phytolacca Americana, Triticum vulgaris .
Avantageusement la concentration de lectine de type Phaseolus vulgaris dans la composition d'agglutination est comprise entre 10 μg/ml et 200 μg/ml.
Avantageusement la concentration de polyéthylènimine dans la composition d'agglutination, est comprise entre 0.1% (poids /volume) et 40% (poids/volume)
Tout préf érentiellement lesdits dextrans sont choisis parmi le Dextran 70, Dextran 100, Dextran 500, etc. Avantageusement la concentration de dextran dans la composition d'agglutination est comprise entre 0.1%
(poids/volume) et 40% (poids/volume) .
Tout préf érentiellement lesdits PEG sont choisis parmi les PEG35, PEG, etc. Avantageusement la concentration de PEG dans la composition d'agglutination est comprise entre 0.05% (poids /volume) et 40% (poids/volume) . Avantageusement la concentration de gélatine dans la composition d'agglutination est comprise entre 0.5% (poids/volume) et 40% (poids/volume) .
Tout préférentiellement lesdites PVP sont choisies parmi les PVP-40, PVP-360, etc.
Avantageusement la concentration de PVP dans la composition d'agglutination est comprise entre 0.05% (poids/volume) et 40% (poids/volume) .
Avantageusement, la lyse des cellules de l'étape (c) est réalisée avec une solution de lyse comprenant un ou plusieurs détergents choisis dans le groupe comprenant : saponine, SDS, Tween 20, Triton X100,
Brij 96, Polidocanol, N-Octyl β-D-glucopyranoside ou
Carbonate de sodium. De préférence, la solution de lyse est constituée d'un mélange de saponine, de Triton X100 et de
Tween 20, et tout préférentiellement la solution de lyse comprend de la saponine à une concentration (exprimée en % poids/volume) comprise entre 0,005% et 0,5%, du Triton X100 à une concentration (exprimée en % poids/volume) comprise entre 0,001% et 0,5% du Tween 20 à une concentration comprise entre 0,01% et 1%, du N-Octyl β-D-glucopyranoside à une concentration comprise entre 0,1% et 0,5%.
Avantageusement, la perméabilisation des bactéries est réalisée avec une solution comprenant un ou plusieurs réactifs choisis dans le groupe comprenant : Chlorhexidine (digluconate, diacétate) , Polyéthylènimine, N-Octyl β-D-glucopyranoside, Nisin seule ou en combinaison avec de l'EDTA.
De préférence , les agents perméabilisants sont ut i l i sés pour la chlorhexidine à une concentrat ion (poids/volume) comprise entre 0 , 0001% (poids/volume ) et 0 , 1 % (poids /volume ) , pour l e polyéthylènimine une concentration comprise entre 5 μg/ml et 120 μg/mL, pour le N-Octyl βD-glucopyranoside à une concentration comprise entre 0,1% (poids/volume) et 0,5% (poids/volume) et pour la Nisin entre 0.1 μg/mL et 0,5 μg/mL seule ou en combinaison avec de l'EDTA à une concentration comprise entre 1 mM et 10 mM.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour concentrer et détecter de nombreux germes contaminants des produits sanguins, parmi lesquels on peut citer des bactéries aérobies ou anaérobies, des moisissures, des levures, des spores de bactéries vivantes et/ou mortes.
Avantageusement la taille des pores du premier filtre mis en œuvre dans le procédé de l'invention est comprise entre 2 μm et 20 μm.
Avantageusement la taille des pores du second filtre mis en œuvre dans le procédé de l'invention est comprise entre 0,2 μm et 2 μm.
Avantageusement la détection des germes contaminants de l'étape (e) du procédé de l'invention est réalisée dans un dispositif clos.
Tout préf érent iel lement , les germes contaminants capables d'être concentrés selon le procédé de l'invention, sont choisis parmi le groupe des bactéries aérobies ou anaérobies, des moisissures, des levures ou des spores de bactéries vivantes et/ou mortes, la taille des pores du premier filtre est comprise entre 2 μm et 20 μm, et la taille des pores du second filtre est comprise entre 0,2 μm et 2 μm. L'invention a aussi pour objet un dispositif pour la concentration et le marquage des germes contaminants éventuellement présents dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, susceptible d'être mis en œuvre dans le procédé de détection de germes pathogènes de l'invention comprenant :
- un premier réservoir (1) étanche et stérile contenant au moins un agent d'agrégation de cellules sanguines et éventuellement au moins un agent de marquage de germes pathogènes,
- un deuxième réservoir (2) étanche et stérile contenant au moins un agent de lyse de cellules sanguines et éventuellement au moins un agent de marquage de germes pathogènes , - un premier filtre (3) placé entre le premier et le deuxième réservoir capable de retenir les agrégats formés dans ledit premier réservoir,
- un deuxième filtre (4) placé en aval du deuxième réservoir capable de retenir les éventuels germes pathogènes contaminants, des moyens de connexion (5) étanches et stériles placés, entre le premier réservoir (1) et le premier filtre (3), entre le premier filtre (3) et le deuxième réservoir (2) et entre le deuxième réservoir (2) et le deuxième filtre (4) .
Selon un mode de mise en œuvre préféré, le dispositif de l'invention comprend des moyens de connexion (6) étanches et stériles pour relier la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir (1) stérile.
Avantageusement, la connexion (6) étanche et stérile reliant la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir stérile est munie d'une valve anti-retour (7) .
Selon un autre mode de réalisation préférée, le dispositif de l'invention comprend des moyens d'échantillonnage d'un volume déterminé du produit sanguin directement à partir d'une poche de stockage dudit produit vers ledit premier réservoir (1) .
Avantageusement, le premier réservoir (1) étanche et stérile du dispositif de l'invention est muni d'un système d'aspiration (8) de l'échantillon, et de préférence ledit système d'aspiration est un piston.
Selon un autre mode de mise en œuvre préféré, le deuxième filtre (4) du dispositif de l'invention est inclus dans un support de membrane composé de deux parties pouvant être dissociées permettant de récupérer ledit filtre .
Avantageusement le dispositif de l'invention est clos et stérile.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et des figures en annexe dans lesquelles :
- la figure 1 illustre le dénombrement des plaquettes après avoir mis en contact les concentrés plaquettaires avec différentes concentrations de thrombine.
- La figure 2 illustre le dénombrement des plaquettes après agrégation en présence d'ADP pour 2échantillons plaquettaires. - La figure 3 montre le dénombrement des plaquettes en présence d'anticorps CD9 (clone SN4) pour 4 échantillons plaquettaires.
La figure 4 montre les résultats du dénombrement des plaquettes en présence de doses croissantes d'anticorps CD9 (clone 6B1) utilisé sur 3 L de concentré plaquettaire.
- La figure 5 montre la courbe dose réponse obtenue en présence de concentrations croissantes d'anticorps CD9 (clone SN4) .
- La figure 6 illustre l'agglutination de globules rouges en présence de la lectine Phaseolus vulgaris utilisée à une concentration de 200 μg/ml pour 3 échantillons de concentrés de globules rouges. - La figure 7 montre les effets de la solution de lyse sur la récupération de différents germes pathogènes dans des cultures pures.
- La figure 8 montre l'effet de la solution de lyse sur la numération plaquettaire de deux échantillons de plaquettes.
- La figure 9 illustre l'effet de la lyse sur la numération érythrocytaire de deux échantillons différents de concentrés de globules rouges.
- La figure 10 illustre le dénombrement des bactéries Escherichia coli au sein d'un échantillon plaquettaire en utilisant le polyethylene imine (PEI) en tant qu'agent perméabilisant pour augmenter la pénétration du marqueur.
La figure 11 illustre l'effet de la concentration en N-octyl β D-glucopyranoside dans la solution de lyse sur des cultures de bactéries pures.
- La figure 12 illustre une mise en œuvre particulière du dispositif de concentration des germes pathogènes de l'invention, comprenant: - un premier réservoir (1) étanche et stérile,
- un deuxième réservoir (2) étanche et stérile,
- un premier filtre stérile (3) placé entre le premier réservoir (1) et le deuxième réservoir (2) , - un deuxième filtre stérile (4) placé en aval du deuxième réservoir (2) des moyens de connexion (5) étanches et stériles placés, entre le premier réservoir (1) et le premier filtre (3), entre le premier filtre (3) et le deuxième réservoir (2) et entre le deuxième réservoir (2) et le deuxième filtre (4) . des moyens de connexion (6) étanches et stériles pour relier la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir (1) .
- une valve anti-retour (7) placée dans la connexion (6) reliant la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir 1.
- un système d'aspiration de l'échantillon (8) .
RESULTATS EXPERIMENTAUX
I. CONCENTRATION DE GERMES PATHOGENES AU MOYEN D'UNE ETAPE D'AGREGATION
I .1 Agrégation des plaquettes. Exemple 1 . Agrégation avec un agoniste fort: la thrombine .
La thrombine est un agoniste fort de l'agrégation plaquettaire.
Dans les travaux expérimentaux menés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention, des solutions de thrombine (référence T8885 Sigma) ont été préparées : à une concentration de 100 Ul/ml lorsqu'elle est utilisée à raison de 10 Ul/test et sous forme de solution diluée (100 μl de solution mère de thrombine additionnée de 900 μl de tampon PBS) , lorsqu'elle est utilisée à raison de 1 Ul/test.
L'agrégation des plaquettes par l'intermédiaire de la thrombine comporte les étapes suivantes : - On place dans un tube 160 μl de concentré plaquettaire auxquels on ajoute 20 μl de tampon PBS et 20 μl de thrombine
- On agite manuellement les tubes durant 5 minutes à température ambiante .
- On ajoute audits tubes 800 μl de tampon PBS.
- On filtre le contenu des tubes sur un filtre de porosité 11 μm.
- On effectue des dilutions en série 1/20 à 1/10 à partir des filtrats.
- On filtre 100 μl de chaque dilution du filtrat sur une membrane CB04.
- On effectue un marquage estérasique.
On compte les plaquettes éventuellement retenues sur la membrane .
Le tableau 1 ci-dessous illustre les résultats obtenus et représente le nombre d'agrégats plaquettaires obtenus en présence de thrombine utilisée à deux concentrations différentes et la figure 1 en annexe illustre graphiquement ces résultats.
Tableau 1
Contrôle Thrombine 1 UI Thrombine 10 UI
PC 6 1584 374
1535 490
PC 6 2622 1358 44
2737 1399 30
Exemple 2 : Agrégation des plaquettes avec de la thrombine en présence de germes pathogènes .
Les travaux expérimentaux mis en œuvre afin d'évaluer l'agrégation des germes pathogènes en présence de thrombine comportent les étapes suivantes : - Une cryosphêre de E. Coli est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 37 °C durant 18-24 heures.
- On ajoute à 160 μl de concentré plaquettaire 20 μl de la suspension de E. coli et 20μl de thrombine. on agite manuellement le tube durant 5 minutes à température ambiante .
- On ajoute 800 μl de tampon PBS,
- On filtre à travers un filtre de porosité 11 μm,
- on effectue des dilutions en série : 1/20 et 1/10 et 1/10,
- On filtre 100 μl de l'échantillon, sur une membrane CB04
- On effectue un marquage estérasique
- On effectue la détection.
Le tableau 2 ci-dessous montre l'agrégation des concentrés plaquettaires avec de la thrombine en présence de E . col i .
Tableau 2
Germes Préparation _. . . ,_., __ . Thrombine Résultats pathogènes Plaquettes Dénombrement
E. coli - 1921
- 1999
E. coli PC 6 657 763
E. coli PC 6 1 UI 140 167
E. coli PC 6 10 UI 109 122
Après addition de la thrombine , un caillot apparaît presque instantanément . Exemple 3 : Agrégation des plaquettes en présence d'un agoniste faible: l'ADP.
De l'ADP (SIGMA) est utilisé à une concentration de 200 μM dans de l'eau distillée.
Les travaux expérimentaux mis en œuvre afin d'évaluer l'agrégation des plaquettes en présence d'ADP comportent les étapes suivantes :
- On introduit dans un tube 400 μl de concentré plaquettaire, auxquels on additionne 50 μl de tampon PBS et
50 μl d'ADP,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante,
- On y ajoute 500 μl de tampons PBS, - On effectue des dilutions en série de 1/20 et
1/10 et 1/10
- On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04 ,
- On effectue un marquage estérasique, et - On effectue la détection.
Les résultats illustrés sur la figure 1 montrent que, en présence d'ADP, la concentration de plaquettes est réduite d'environ 50% à environ 90%.
Exemple 4 : Agrégation plaquettaire avec de l'ADP en présence de germes pathogènes.
L'agrégation des plaquettes en présence d'ADP comporte les étapes suivantes : - Une cryobille de Staph epidermidis est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 37°C durant 18-24 heures. Sur 400 μl de concentré plaquettaire on ajoute 50 μl de la suspension de Staph epidermidis et 50 μl d'ADP,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante
- On y ajoute 500 μl de tampon PBS,
- On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm,
- On effectue des dilutions en série de 1/20 et 1/10 et 1/10,
- On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04
- On effectue un marquage estérasique,
- On effectue la détection.
Les germes pathogènes sont ensemencés à une concentration élevée de manière à augmenter un possible effet de piegeage. L'ADP est ajouté aux plaquettes et aux bactéries à une concentration de 10 μM.
Tableau 3
Figure imgf000020_0001
Les résultats obtenus, représentés sur le Tableau 3 ci-dessus montrent que 74% de bactéries sont récupérées après l'étape d'agrégation Exemple 5 : Agrégation des plaquettes en présence d'un anticorps CD9.
Il est connu que l'anticorps CD9 induit l'activation des plaquettes et par conséquent leur agrégation. Les tests décrits ont été réalisés avec deux clones CD9, le clone SN4 (Ancel, ref 156-020, concentration
100 μg/ml) et le clone 6B1 (Hemosystem) .
Le procédé d'agrégation sélective mis en œuvre avec cet anticorps CD9 comporte les étapes suivantes :
Sur 400 μl de concentré plaquettaire on ajoute 50 μl de tampon PBS et 50 μl d'anticorps CD9,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante - On y ajoute 500 μl de tampon PBS,
- On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm
- On effectue des dilutions en série de 1/20 et 1/10 et 1/10, - On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04,
- On effectue un marquage estérasique,
- On effectue la détection.
L'anticorps CD9 (clone SN4) a été utilisé en présence des plaquettes à une concentration finale de 10 μg/ml .
La figure 2 en annexe illustre l'agrégation des plaquettes obtenue en présence d'anticorps CD9 (clone SN4) .
Afin d'évaluer la concentration optimale de l'anticorps CD9 nécessaire pour l'agrégation plaquettaire, une courbe dose-réponse a été établie. Méthode : - Sur 400 μl de concentré plaquettaire placés dans des tubes on ajoute différentes dilutions d'anticorps, avec des concentrations finales allant de 0 à 20 μg/ml en anticorps CD9. - Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante
- On y ajoute 500 μl de tampon PBS,
- On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm - On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10
- On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04
- On effectue un marquage estérasique, - On effectue la détection
Les figures 3 et 5 montrent respectivement les résultats du dénombrement des plaquettes agrégées en présence de doses croissantes d'anticorps CD9 (clone SN4) et la courbe dose-réponse ainsi obtenue.
Le dénombrement des plaquettes résiduelles est effectué avec l'Analyseur.
L'agrégation est dose-dépendante. Pour augmenter l'effet d'agrégation, la concentration en CD9 a été augmentée autant que possible. Cependant un compromis a été établi pour la détection des bactéries, et l'on a déterminé que la concentration plaquettaire peut être réduite de 1 à 2 Log en utilisant une concentration d'environ 10 μg/ml d'anticorps CD9.
Exemple 5 bis :
Afin d'évaluer la concentration optimale de l'anticorps CD9 (clone 6B1) nécessaire pour l'agrégation plaquettaire, une expérience du type dose-réponse a été établie
Méthode :
- Sur 3 mL de concentré plaquettaire placés dans des tubes on ajoute différentes dilutions d'anticorps, avec des concentrations finales allant de 2,5 μg/mL à 40 μg/mL en anticorps CD9.
- Les tubes sont agités durant 15 minutes à température ambiante - On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm
- On effectue la numération des plaquettes comme décrit ci-dessus.
La figure 4 en annexe montre les résultats du dénombrement des plaquettes agrégées en présence de doses croissantes d'anticorps CD9 (clone 6B1) .
Exemple 6 : Agrégation plaquettaire avec l'anticorps CD9 en présence de bactéries. Méthode :
Une cryobille de Staph epidermidis est introduite dans un tube de bouillon tryptone soja et incubée à 37°C durant 18-24 heures.
- Sur 400 μl de concentré plaquettaire placés dans des tubes on ajoute 50 μl de la suspension de Staph epidermidis et 50 μl de CD9,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante
- On y ajoute 500 μl de tampon PBS, - On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm
On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10 - On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04
- On effectue un marquage estérasique.
- On effectue la détection
Le tableau 4 ci -dessous illustre l'agrégation des plaquettes avec du CD9 en présence de bactéries .
Tableau 4
Figure imgf000024_0001
Ces résultats montrent que les bactéries Staph epidermidis ont été bien récupérées. Pour E.Coli le dénombrement est réduit de 36%.
1.2. Agglutination de globules rouges.
Les lectines sont des glycoprotéines d'origine non-immune qui agglutinent les cellules et/ou précipitent des complexes carbohydrates . Ces molécules se lient couramment à des carbohydrates spécifiques.
Dans le cadre de ces travaux expérimentaux, deux lectines ont été utilisées :
- Phaseoulus vulgaris PHA-E
- Vicia Sativa Exemple 1 : Agglutination de globules rouges avec des lectines.
La lectine Phaseolus vulgaris PHA-E (Sigma) a été utilisée à une concentration de 2 mg/ml dans du PBS. La lectine Vicia Activa (Sigma) a été utilisée à la concentration de 1 mg/ml .
Une évaluation rapide des deux lectines a permis de vérifier qu'il n'y a pas d'agglutination des globules rouges avec Vicia sativa. D'autre part Phaseolus vulgaris induit une agglutination rapide et efficace.
Méthode :
- 400 μl de globules rouges sont placés dans des tubes auxquels on ajoute 50 μl de PBS et 50 μl de Phaseolus vulgaris,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante
- On y ajoute 500 μl de tampon PBS,
- On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm,
On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10
- On effectue un marquage avec un anticorps anti-glycophorine-PE . - On effectue la détection
La figure 6 en annexe montre l'agglutination des globules rouges obtenue en présence de Phaseolus vulgaris . Dans ce test, Phaseolus vulgaris a été utilisée à une concentration de 200 μg/ml.
On observe une diminution reproductible de deux logs de la concentration en globules rouges en présence de Phaseolus vulgaris. Exemple 2 : Agglutination de globules rouges en présence de bactéries .
Les tests préliminaires ont montré qu ' il n ' y a pas d ' interact ion entre la lect ine Phaseolus et le s bactéries .
Méthode
Une cryobille de E.coli est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 37 °C durant 18-24 heures.
- On mélange dans des tubes, 400 μl de PBS, 50 μl de E.coli (culture pure) et 50 μl de Phaseolus vulgaris,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante
- On y ajoute 500 μl de tampon PBS,
- On effectue une filtration sur un filtre de 5 μm,
- On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10,
- On filtre 100 μl de l'échantillon sur une membrane CB04 ,
- On effectue un marquage estérasique,
- On effectue la détection.
Les résultats obtenus, en utilisant une concentration Phaseolus vulgaris de 200μg/ml sont illustrés dans le Tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Figure imgf000026_0001
Ces résultats montrent que 91% des bactéries sont détectées après l'étape d'agglutination et qu'après cette étape d'agglutination, la concentration en globules rouges est réduite de deux logs alors que la souche E. coli est encore bien récupérée.
II. CONCENTRATION DE GERMES PATHOGENES AU MOYEN D'UNE ETAPE DE LYSE.
Dans le cadre de la présente invention, la demanderesse a effectué une mise au point des différentes techniques de lyse sélective permettant l'élimination des cellules sanguines sans affecter la concentration des bactéries éventuellement présentes dans les échantillons à analyser. Suite à quelques études préalables, la
Demanderesse a constaté que certaines bactéries sont résistantes en présence de détergents tels que le Triton
XlOO et a déterminé la concentration optimale de détergents avec laquelle le pourcentage de récupération de bactéries est optimal.
Exemple 1 : Effet de la formulation de la solution de lyse sur des cultures de bactéries pures. Méthode - Les souches sont conservées dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubées à 37 °C durant 18- 24 heures.
Des dilutions en série (1/10) ont été effectuées dans du tampon PBS jusqu'à 10"5 - Un millilitre de la dernière dilution est traité avec 9 ml de la solution de lyse (0,01% (poids/volume) de saponine, 0,1% (poids/volume) de Tween et 0,001% (poids/volume) Triton X 100 durant 15 minutes - 100 μl de l'échantillon sont filtrés sur une membrane CB04
- Un marquage estérasique est effectué selon les indications figurant en annexe 1
- On effectue la détection.
Les résultats de ces différents essais sont illustrés dans le tableau 6 ci-dessous, dans lequel sont exprimés les différents pourcentages de récupération des bactéries obtenus .
Tableau 6
Figure imgf000028_0001
Ces résultats sont illustrés sur la figure 7 en annexe .
La plupart des souches ne sont pas affectées par la solution de lyse: les pourcentages de récupération sont cohérents avec les prévisions prédéfinies, entre 95 et 115%, sauf pour Ps . aeruginosa et Bacillus cereus .
Exemple 2 : Effet de la formulation de la solution de lyse sur les bactéries ensemencées dans des plaquettes .
De manière à simuler une contamination, deux souches ont été adaptées à la croissance dans des concentrés plaquettaires.
Méthode
- Les souches Bacillus cereus et Staph . aureus ont été ensemencées dans des plaquettes dans des tubes de 50 ml en utilisant une concentration de 105 cellules dans 20 ml de plaquettes. - Ces tubes de 50 ml sont conservés dans l'incubateur de plaquettes à 22 °C durant plusieurs jours,
- Un millilitre de plaquettes ensemencées est dilué avec 9 ml de la solution de lyse,
- La lyse est effectuée durant 15 minutes à température ambiante,
- 100 μl de l'échantillon sont filtrés sur une membrane CB047,
- Les bactéries sont marquées avec un substrat stéarique comme indiqué en annexe 1, - La membrane est balayée avec l'Analyseur.
Les résultats du dénombrement des bactéries après la lyse sont illustrés dans le tableau 7 ci -dessous. Tableau 7
Contrôle Lyses
Bacillus cereus 16 14
24 27 bactéries/ml 2,0E+06 2,lE+06
Staph. aureus 1966 1885
2046 1901 bactéries/ml 2,0E+08 l,9E+08
Les bactéries ont été ensemencées à une concentration initiale de 5 103 cellules/ml et sont détectées plusieurs jours plus tard à des concentrations de l'ordre de 10s à 109 cellules /ml.
Il en résulte de ces expériences, que les bactéries qui se sont développées dans les plaquettes n'ont pas été affectées par la solution de lyse.
Exemple 2b : Effet de la formulation de la solution de lyse sur des cultures de bactéries pures.
Méthode
- Les souches sont conservées dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubées à 37 °C durant 18- 24 heures.
- Après détermination du nombre de bactéries par marquage estérasique, 3000 bactéries sont inoculées dans 3 mL de PBS
- Les 3mL sont traités avec la solution de lyse (NOG 0.25% à 2%) pendant 20 minutes
- La totalité de l'échantillon est filtrée sur une membrane CB04
- Le dénombrement est effectué en cytométrie en phase solide Les résultats obtenus sont illustrés figure 11 en annexe .
Exemple 3 : Effet de la formulation de la composition de lyse sur les globules rouges.
Méthode
- Un millilitre de globules rouges est dilué dans 9 ml de solution de lyse ou 9 ml de PBS (contrôle) .
- la lyse est effectuée durant 15 minutes à température ambiante
- les échantillons lysés ou non sont analysés à l'aide d'un compteur cellulaire.
La figure 9 montre les résultats obtenus sur la préparation de globules rouges lysée par rapport à une préparation de globules rouges non lysée.
Exemple 4 : Effet de la formulation de la composition de lyse sur les plaquettes. La reproductibilité de l'efficacité de la solution de lyse a été testée. Des échantillons différents de plaquettes ont été lysés et analysés.
Méthode :
- Un millilitre de plaquettes est dilué dans 9 ml de solution de lyse
- la lyse est effectuée durant 15 minutes à température ambiante
Des dilutions en série (1/10) ont été effectuées dans du tampon PBS jusqu'à 10"5 - 100 μl de l'échantillon sont filtrés sur une membrane CB04. les microorganismes sont marqués avec un substrat estérasique
- la membrane est balayée avec l'analyseur. La figure 8 en annexe illustre les résultats de la lyse obtenue avec différents échantillons de plaquettes.
III. CONCENTRATION DE GERMES PATHOGENES AU MOYEN DE DEUX ETAPES D'AGREGATION ET DE LYSE.
La préparation de l'échantillon par concentration des germes pathogènes en deux étapes comprend :
1) L'Agrégation ou agglutination spécifique des cellules du produit sanguin.
2) La Lyse spécifique des cellules du produit sanguin.
Exemple 1 : Séparation spécifique des plaquettes Méthode :
- Une cryobille de E.coli est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 37 °C durant 18-24 heures.
La première étape d'agrégation est effectuée comme suit :
- On mélange dans des tubes, 1 ml de concentré plaquettaire, 50 μl de E.coli (culture pure) et 100 μl de CD 9,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante .
La deuxième étape de lyse est alors effectuée :
- On ajoute 900 μl de tampon de lyse à 100 μl du filtrat après agrégation,
On maintient l'ensemble 15 minutes à température ambiante,
- On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10
- On filtre 100 μl de l'échantillon ainsi obtenu sur une membrane CB04 , - On effectue un marquage des bactéries et des plaquettes avec un substrat estérasique (Annexe 1)
- On dénombre les bactéries et les plaquettes avec l'Analyseur.
Les résultats obtenus en effectuant le procédé de concentration des bactéries en deux étapes sont illustrés dans le tableau 8 ci-dessous.
Tableau 8
Figure imgf000033_0001
Exemple 2. Séparation spécifique des globules rouges .
Méthode :
- Une cryobille de E.coli est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 37 °C durant 18-24 heures.
L'étape d'agglutination est effectuée comme suit :
- On mélange dans des tubes, 1 ml de globules rouges, 50 μl de E.coli (culture pure) et 125 μl de lectine,
- Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante - On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 μm.
La deuxième étape de lyse est alors effectuée :
- On ajoute 900 μl de tampon de lyse à 100 μl du filtrat après agglutination,
On maintient l'ensemble 15 minutes à température ambiante,
On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10
On filtre 100 μl de l'échantillon ainsi obtenu sur une membrane CB04 ,
- On effectue un marquage des bactéries avec un substrat estérasique et des globules rouges avec un anticorps anti-Glycophorine-PE (Annexe 2)
- On dénombre les bactéries et les globules rouges avec l'Analyseur.
Le tableau 9 ci-dessous montre les résultats obtenus avec le dénombrement des bactéries effectué après l'étape d'agglutination des globules rouges avec la lectine suivie de l'étape de lyse.
Tableau 9
Figure imgf000034_0001
Après agglutination la concentration en globules rouges a été réduite de 1,5 log.
Soixante-huit (68) % des bactéries sont récupérées après ces deux étapes .
IV. AGENTS DE MARQUAGE
Exemple 1. Substrat estérasique ChemChrome V6
Des solutions de marquage peuvent être préparées à partir d'un substrat estérasique et utilisées dans le procédé de détection de l'invention selon le protocole suivant a) Préparation
- 10 μl du substrat estérasique ChemChrome V6 par millilitre de tampon ChemSol B16 (500 μl de solution de marquage par membrane)
- cette solution est conservée à 4°C à l'abri de la lumière au maximum 4 heures . b) Utilisation
Introduire un tampon de marquage dans une boîte de Pétri de 33 mm de diamètre.
Distribuer 500 μl de la solution de marquage sur le tampon.
Placer la membrane CB04 sur la rampe de filtration. Filtrer 100 μl de l'échantillon à analyser. Placer la membrane sur le tampon.
Incuber durant 15 minutes à 37 °C.
Exemple 2. Anticorps marqué.
Aussi, une solution de marquage comprenant un anticorps marqué peut être utilisée dans le procédé de détection de l'invention selon le protocole suivant
Prélever 90 μl d'une dilution de 1 ' échantillon, Ajouter 10 μl de l'anticorps anti- glycophorine-PE,
- Vortexer et incuber durant 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière, - Ajouter 900 μl de tampon PBS,
- Placer la membrane CB04 dans la rampe de filtration,
- Filtrer sous vide 100 μl de la solution à analyser, - Analyser la membrane dans l'Analyseur en inversant les câbles primaire et tertiaire de l'Analyseur.
Exemple 3 : Intérêt de l'ajout d'un agent de perméabilisation des bactéries pour améliorer la pénétration du marqueur. Méthode
- Les souches sont conservées dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubées à 37 °C durant 18- 24 heures.
- Après détermination du nombre de bactéries par marquage estérasique , 3000 bactéries sont inoculées dans 3 mL de concentré plaquettaire
- Les 3mL sont traités avec 1 ml de la solution d' agrégation (CD9 : clone 6B1 : 30μg/mL, Picogreen 1/2000 ,
PEI 40μg/mL à 80μg/mL) durant 40 minutes
L ' échantillon est f iltré au travers d' un filtre de porosité 5 μm
- L' échantillon est incubé dans la solution de lyse (Chlorhexidine 5 . 10-3 % , NOG 0 , 5% , Nisin 0 , 2 μg/mL,
EDTA 5 mM) ) pendant 20 minutes
- La totalité de l ' échantillon est filtrée sur une membrane CB04 - Le dénombrement est effectué au moyen d'un analyseur cytomètre en phase solide
V. CONCLUSIONS
Les options techniques pour atteindre les meilleures conditions de préparation des germes pathogènes ont été définies à l'aide de ses travaux expérimentaux.
En ce qui concerne les concentrés plaquettaires ces options techniques comportent :
1) Etape d'agrégation avec par exemple un anticorps activateur plaquettaire tel que CD9,
2) Etape de lyse cellulaire avec une combinaison des détergents tels que saponine, Tween 20 et
Triton X 100.
En ce qui concerne les concentrés de globules rouges : 1) Etape d'agglutination avec une lectine telle que par exemple Phaseolus vulgaris,
2) Etape de lyse cellulaire avec une combinaison de détergents tels que saponine, Tween 20 et Triton X 100.
Le marquage et la perméabilisation des germes pathogènes pouvant intervenir indistinctement lors de l'étape d'agrégation, lors de l'étape de lyse ou directement sur les germes concentrés sur le dernier filtre avant analyse.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de concentration de germes contaminants éventuellement présents dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on soumet un échantillon dudit produit sanguin à un traitement d'agrégation des cellules sanguines, b) on élimine les agrégats formés à l'étape (a) par passage de l'échantillon traité sur un premier filtre laissant passer les germes contaminants mais pas les agrégats de cellules, c) on lyse sélectivement les cellules résiduelles du filtrat obtenu à l'étape (b) , d) on récupère les germes contaminants par passage du lysat de l'étape (c) sur un second filtre laissant passer les débris cellulaires.
2) Procédé de détection de germes contaminants dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, caractérisé en ce que l'on concentre lesdits germes sur un filtre selon les étapes (a) à (d) du procédé selon la revendication 1, puis en ce que : (e) on analyse le second filtre pour détecter les germes contaminants éventuellement retenus .
3) Procédé de détection selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on ajoute un agent de marquage des germes contaminants, soit lors de l'agrégation de l'étape (a), soit lors de la lyse de l'étape (c) , soit directement sur le deuxième filtre lors de l'étape (e) d'analyse. 4) Procédé selon les revendications 2 ou 3 , caractérisé en ce qu'il comprend l'addition d'un agent de perméabilisation des germes contaminants, à au moins l'une des étapes (a) , (c) , ou (e) .
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agent de perméabilisation est choisi parmi le groupe comprenant : le polyéthylènimine, le diacétate de chlorhexidine, le digluconate de chlorhexidine, l'acide d'éthylène diamine tetracétate (EDTA) seul ou en combinaison avec la nisine, un détergent ou un mélange de ceux-ci.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le détergent est choisi parmi le groupe comprenant : N-Octyl β-D-glucopyranoside, SDS, Tween, triton, Brij, ou un mélange de ceux-ci.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que l'agent de marquage des germes pathogènes est une solution de marquage choisie parmi le groupe comprenant un substrat estérasique tel que le ChemChrome V6 , un anticorps marqué ou un marqueur d'acides nucléiques.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que l'agent de marquage comprend un marqueur fluorescent ou un agent couplé à un fluorochrome ou à un enzyme permettant la dégradation d'un substrat rendu ainsi fluorescent.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la fluorescence est détectée au moyen d'une excitation laser. 10) Procédé selon l'une des revendications 1 à
9, caractérisé en ce que les cellules sanguines du produit sanguin sont des plaquettes ou des globules rouges ou un mélange de ceux-ci.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à
10, caractérisé en ce que le produit sanguin comprend des plaquettes et en ce que le traitement d'agrégation de l'étape (a) comprend la mise en contact de l'échantillon avec une composition d'agrégation comprenant au moins l'un des agents d'agrégation choisis dans le groupe comprenant : un anticorps spécifique d'un antigène plaquettaire , - un agoniste fort de l'activation plaquettaire choisie parmi : la thrombine, le TRAP (thrombin receptor activating peptide) , la trypsine, le collagène, le thromboxane A2 , le PAF (platelet activating factor) , le ionophore A23187, les complexes immuns et facteurs du comp1ément , un agoni ste f aib l e de l ' act ivat i on plaquettaire choi s ie parmi ADP , adrénal ine , ac ide arachidonique , facteur Von Willebrand, sérotonine ou épinéphrine .
12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la concentration en anticorps de type CD9 dans la composition d'agrégation est comprise entre 0,5 μg/ml et 50 μg/ml, et de préférence entre 5 μg/ml et 40 μg/ml.
13 ) Procédé selon la revendi cat ion 11 , caractérisé en ce que la concentration en agoniste fort dans la composition d' agrégation est comprise entre : - 0,5 Ul/ml et 100 Ul/ml et de préférence entre 1 Ul/ml et 20 Ul/ml pour un agoniste de type thrombine,
- 5 μM et 200 μM et de préférence entre 10 μM et 100 μM pour un agoniste de type TRAP, - 1 nM et 500 nM et de préférence entre 10 nM et 300 nM pour un agoniste de type trypsine,
- 0,05 μg/ml et 50 μg/ml et de préférence entre 1 μg/ml et 20 μg/ml pour un agoniste de type collagène,
- 0,01 μg/ml et 5 μg/ml et de préférence entre 0,1 μg/ml et 1 μg/ml pour un agoniste du type thromboxane
A2,
- 0,005 mg/ml et 1 mg/ml et de préférence entre 0,05 mg/ml et 0,5 mg/ml pour un agoniste du type PAF,
- 0,1 μM et 100 μM et de préférence entre 1 μM et 20 μM pour un agoniste du type ionophore A23187.
14) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la concentration en agoniste faible dans la composition d'agrégation est comprise entre : - 0,5 μM et 100 μM et de préférence entre 1 μM et 20 μM pour un agoniste du type ADP, du type adrénaline ou du type épinéphrine .
- 0,001 mM et 10 mM et de préférence entre 0,01 mM et 5 M pour un agoniste du type acide arachidonique,
- 0,001 mg/ml et 1 mg/ml et de préférence entre 0,01 mg/ml et 0,5 mg/ml pour un agoniste du type facteur Von Willebrand, ou
- 0,05 μM et 100 μM et de préférence entre 0,01 μM et 50 μM pour un agoniste du type sérotonine.
15) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'anticorps est choisi parmi: un anticorps anti-CD9, anti-CD32, anti-PTAl, anti-D42, anti- GpIIb/IIIa ou anti-GpIV.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le produit sanguin comprend des globules rouges et en ce que le traitement d'agrégation de l'étape (a) comprend la mise en contact de l'échantillon avec une composition d'agglutination comprenant au moins un agent d'agglutination choisi parmi les lectines, le polyéthylènimine, la polyvinylpyrrolidone (PVP) , les gélatines, les dextrans ou les polyethylene glycols (PEG) .
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les lectines présentent une activité érythroagglutinine .
18) Procédé selon les revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que les lectines sont choisies parmi les lectines de Phaseolus vulgaris , Vicia sativa, Vicia faba ou
Erythrina corallodendron., Lens culinaris, Phytolacca Americana, Tritîcum vulgaris .
19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la concentration de lectine de
Phaseolus vulgaris dans la composition d'agglutination est comprise entre 10 μg/ml et 800 μg/ml.
20) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la concentration de polyéthylènimine dans la composition d'agglutination est comprise entre 0,1% '(poids/volume) et 40% (poids/volume)' de préférence entre 20% (poids/volume) et 40% (poids /volume) . 21) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la Polyvinylpyrrrolidone (PVP) est choisie parmi le groupe comprenant du PVP-40 et du PVP-360 et utilisée de préférence à une concentration comprise entre 0,1% (poids/volume) et 40% (poids/volume) , et tout préf érentiellement entre 4% (poids/volume) et 20% (poids /volume) .
22) Procédé selon la revendications 16, caractérisé en ce que la gélatine dans la composition d'agglutination est utilisée de préférence à une concentration comprise entre 0,5% (poids/volume) et 40% (poids/volume) , et tout préf érentiellement entre 40% (poids /volume) et 20% (poids/volume) .
23) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le dextran dans la composition d'agglutination est choisi parmi le groupe comprenant : Dextran 70, Dextran 100, et Dextran 500, utilisé de préférence à une concentration comprise entre 0,1%
(poids/volume) et 40% (poids/volume) , et tout préf érentiellement entre 4% (poids/volume) et 20% (poids /volume) .
24) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le polyethylene glycol est choisi parmi le groupe comprenant : PEG8 , PEG17, PEG35, utilisé de préférence à une concentration comprise entre 0,05%
(poids/volume) et 40% (poids/volume) et tout préf érentiellement entre 20% (poids/volume) et 40%
(poids /volume) .
25) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lyse des cellules de l'étape (c) est réalisée avec une solution de lyse comprenant un ou plusieurs détergents choisis dans le groupe comprenant : saponine, SDS, Tween 20, Triton XlOO, Brij 96, Polidocanol, N-octyl β-D-glucopyranoside ou Carbonate de sodium.
26) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les germes contaminants sont des bactéries aérobies ou anaérobies, des moisissures, des levures, des spores de bactéries vivantes et/ou mortes.
27) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille des pores du premier filtre est comprise entre 2 μm et
20 μm.
28) Procédé selon l'une . quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille des pores du second filtre est comprise entre 0,2 μm et 2 μm .
29) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les germes contaminants sont des bactéries aérobies ou anaérobies, des moisissures, des levures ou des spores de bactéries vivantes et/ou mortes, en ce que la taille des pores du premier filtre est comprise entre 2 μm et 20 μm, et en ce que la taille des pores du second filtre est comprise entre 0,2 μm et 2 μm.
30) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 29, caractérisé en ce que la détection des germes contaminants de l'étape (e) est réalisée dans un dispositif clos . 31) Dispositif pour la concentration de germes contaminants éventuellement présents dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un premier réservoir (1) étanche et stérile contenant au moins un agent d'agrégation de cellules sanguines et éventuellement au moins un agent de marquage de germes pathogènes,
- un deuxième réservoir (2) étanche et stérile contenant au moins un agent de lyse de cellules sanguines et éventuellement au moins un agent de marquage de germes pathogènes , - un premier filtre (3) placé entre le premier et le deuxième réservoir capable de retenir les agrégats formés dans ledit premier réservoir,
- un deuxième filtre (4) placé en aval du deuxième réservoir capable de retenir les éventuels germes contaminants , des moyens de connexion (5) étanches et stériles placés, entre le premier réservoir et le premier filtre, entre le premier filtre et le deuxième réservoir et entre le deuxième réservoir et le deuxième filtre.
32) Dispositif selon la revendication 31 caractérisé en ce qu'il comprend une connexion (6) étanche et stérile pour relier la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir stérile.
33) Dispositif selon la revendication 32, caractérisé en ce que ladite connexion étanche et stérile reliant la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir stérile est munie d'une valve (7) anti-retour. 34) Dispositif selon les revendications 31 ou 33 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'échantillonnage d'un volume déterminé du produit sanguin directement à partir d'une poche de stockage dudit produit vers ledit premier réservoir.
35) Dispositif selon les revendications 36 ou 34, caractérisé en ce que le premier réservoir stérile est muni d'un système d'aspiration de l'échantillon (8) .
36) Dispositif selon la revendication 35, caractérisé en ce que le système d'aspiration est un piston.
37) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 36, caractérisé en ce que le deuxième filtre est inclus dans un support de membrane composé de 2 parties pouvant être dissociées permettant de récupérer le filtre.
38) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 31 à 37, caractérisé en ce qu'il est clos et stérile.
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