WO2002102429A1 - Biomateriaux utilises pour la reconstruction nerveuse et procede de fabrication de ceux-ci - Google Patents

Biomateriaux utilises pour la reconstruction nerveuse et procede de fabrication de ceux-ci Download PDF

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chitin
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fragment
nerve
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Inventor
Isamu Yamaguchi
Tetsushi Taguchi
Junzo Tanaka
Kenichi Shinomiya
Soichiro Itoh
Hironobu Fukuzaki
Yoichi Oka
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
National Institute For Materials Science
Taki Chemical Co., Ltd
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Definitions

  • the present invention relates to a nerve-reconstructing biomaterial in which the surface of chitin or chitosan is modified with a lamien fragment, and a method for producing the same.
  • PGA polyglycolic acid
  • this PGA tube is the only artificial nerve used in the clinic, but there are problems with biocompatibility and affinity, and no clinical cases have been reported in Japan.
  • the crosslinkable length is less than 10 cm.
  • functional regeneration can be obtained by artificial nerve transplantation.
  • a group at Kyoto University has developed an artificial nerve in which collagen fibers coated with laminin are inserted into a PGA collagen tube.
  • ramien a glycoprotein
  • a glycoprotein is flexible with a molecular weight of about 900,000. It has a simple cross-shaped molecular structure, has the function of adhering epithelial cells to connective tissue, and has the effect of promoting the elongation of neurites, which is expected to be useful for nerve reconstruction.
  • laminin used in the above-mentioned conventional technology is an SHS-derived product derived from EHS rats and cannot be used in humans. In addition, it is difficult to synthesize laminin due to its high molecular weight. Disclosure of the invention
  • the present inventors have made intensive research and development on a clinically applicable human nerve reconstruction biomaterial having an action of inducing regenerative nerves comparable to laminin, and by binding a laminin fragment to chitin or chitosan side chains to achieve the object. Found that it could be achieved.
  • the present invention is a nerve-reconstructing biomaterial obtained by modifying a laminin fragment containing the amino acid sequence of YIGSR or IKVAV on the surface of chitin or chitosan.
  • the present invention introduces a carboxyl group on the surface of chitin or chitosan, and then immerses it in a phosphate buffer containing a laminin fragment containing the amino acid sequence of YIGSR or IKVAV, and then negatively charges the carboxyl group.
  • the laminin fragment is electrostatically adsorbed on the surface of chitin or chitosan by the above method.
  • the present invention provides a method for binding calcium phosphate to the surface of chitin or chitosan or chitin or carboxyl-introduced chitin or chitosan into which a lipoxyl group has been introduced, and then comprises a Lamien fragment comprising the amino acid sequence of YI31 or 1 KVAV.
  • a Lamien fragment comprising the amino acid sequence of YI31 or 1 KVAV.
  • the present invention provides a method for introducing a carboxyl group into chitin or chitosan surface, and then immersing the carboxyl group in an aqueous solution of a revoxyl group activating reagent to activate the introduced carboxyl group.
  • the carboxyl group on the surface of chitin or chitosan reacts with the hydroxyl group and amino group of the laminin fragment to form a covalent bond by immersion in a phosphate buffer containing a laminin fragment containing the sequence. It is a method of manufacturing a material.
  • the present invention provides a method for introducing a lipoxyl group to the surface of chitin or chitosan, and then immersing the lipoxyl group in a lipoxyl group-activating reagent aqueous solution to activate the introduced carboxyl group, followed by a molecule having a thiol group.
  • the thiol group immobilized on the carboxyl group is activated by reacting the introduced thiol group with a thiol group activating reagent to form an S--S bond, followed by YIGSR or IKVAV
  • the active site of the Lamiene fragment was protected by disulfide exchange reaction between the thiol group at the terminal of the laminin fragment and the previously formed S--S bond by immersion in a phosphate buffer containing a laminin fragment containing the amino acid sequence of
  • the method for producing a nerve reconstruction biomaterial as described above, which is immobilized in a state is immobilized in a state.
  • the nerve-reconstructing biomaterial of the present invention as a nerve-reconstructing material, has an action of promoting elongation of nerve cells and an action of cell adhesion, and has excellent biocompatibility and biodegradability.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the molecular structure of laminin. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides a laminin fragment having an amino acid sequence such as YIGSR (tyrosine-isoleucine-glycine-serine-anoreginin) or IKVAV (isoleucine-lysine-valine-alanine-valine) on chitin or chitosan.
  • YIGSR tyrosine-isoleucine-glycine-serine-anoreginin
  • IKVAV isoleucine-lysine-valine-alanine-valine
  • Carboxyl groups are introduced into chitin or chitosan using monochloroacetic acid or the like.
  • a film or tube of chitin or chitosan is immersed in an aqueous solution of sodium hydroxide, and acetic acid or the like is added dropwise to this.
  • the concentration of sodium hydroxide is 5 to 20 M. If this concentration is too high (more than 25 M), the reaction proceeds too much and chitin or chitosan is dissolved.
  • Chitosan (C-chitosan) into which a lipoxyl group is introduced is soluble ⁇ fe.
  • acetic acid at a monochrome mouth is added dropwise to a certain extent (for example, up to pHIO), followed by neutralization with an acid such as hydrochloric acid.
  • the laminin fragment used is a Lamiyun fragment containing the amino acid sequence of YIGSR or IKVAV.
  • Lamiyun fragments are electrostatically adsorbed on the surface of chitin or i-chitosan due to the negative charge of the carboxyl group.
  • Bind calcium phosphate to chitin or chitosan or chitin or carboxyl group-introduced chitosan surface For example, a film or tube of chitin or chitosan is immersed in an aqueous solution of calcium chloride, calcium acetate or calcium lactate. The longer the immersion time, the greater the production of calcium-bound chitin or chitosan. Then, it is washed with saline or distilled water.
  • aqueous solution containing phosphoric acid for example, an aqueous solution of sodium hydrogen phosphate, an aqueous solution of sodium dihydrogen phosphate, or an aqueous solution of diammonium hydrogen phosphate.
  • This is then washed with saline or distilled water. Repeat the above series of operations several times, for example, about five times. The larger the number, the greater the amount of generation.
  • This is followed by immersion in a phosphate buffer solution containing the laminin fragment.
  • the laminin fragment is electrostatically adsorbed to the chitin or chitosan surface via calcium phosphate due to the negative charge of calcium phosphate.
  • the activity of the modified laminant is easily maintained, but the adhesion to the surface is weaker than that of the covalent bond.
  • the activated carboxyl group is activated as shown in Equation 2 below by immersing in a water-soluble carboxy group activating reagent (WSC: Water Soluble Carbodiimide. N-liydroxysccinimide) shown in (2).
  • WSC Water Soluble Carbodiimide. N-liydroxysccinimide
  • the WSC concentration is, for example, about 30 mM, and the immersion time is about 30 minutes. The higher the concentration of WSC, the greater the amount of modification. However, if the concentration is too high, intermolecular cross-linking in chitosan proceeds, so the introduced carboxyl groups decrease and the effect becomes worse.
  • the intramolecular cross-linking between the lipoxyl group introduced into the chitosan and the hydroxyl group or amino group in the chitosan proceeds, so that the introduced carboxyl group decreases and the efficiency becomes poor.
  • the immersion time is too short, the carbohydrate introduced into chitosan The xyl group may not be fully activated. Therefore, it is necessary to set an appropriate activation time.
  • the temperature condition the activity is lowered at an extremely high temperature, so that the temperature is preferably about 50 ° C or less. There is no problem if the temperature is about room temperature, and it is more preferable if the temperature is about 4 ° C.
  • This method has a stronger fixation force than the methods 1) and 2) above.
  • OH and NH 2 are present in the active site of the laminin fragment.
  • the reaction may result in loss of the activity of the lamien fragment, and the binding site for the laminin fragment cannot be specified, resulting in a decrease in the activity (for example, CDPG GY IGSR that reacts with CDPG) Keeps activity, but those that have reacted with YI GSR are inactivated).
  • C-chitin or chitosan (C-chitosan) is immersed to immobilize a molecule having a thiol group such as cysteine in the carboxyl group.
  • the cysteine-immobilized C-chitosan contains 5,5'-ditliiobis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), which is in excess of the expected amount of cysteine immobilized.
  • DTNB 5,5'-ditliiobis- (2-nitrobenzoic acid)
  • C-chitin or C-chitosan on which cysteine is immobilized is immersed in a phosphate buffer, and the introduced thiol group is reacted with a thiol group activating reagent to form an S_S bond, thereby forming a lipoxyl group.
  • a thiol group activating reagent to form an S_S bond, thereby forming a lipoxyl group.
  • the reaction between cysteine and DTNB ends immediately after mixing, but the immersion time is about 30 minutes in consideration of the diffusion of DTNB to the fixed surface.
  • This method makes the modification process complicated, but has a stronger fixation force than the above methods 1) and 2), and can specify the binding site to the laminin fragment. As a result, the activity can be maintained (reaction with C of the CDPGY I GSR maintains the activity of the YI GSR).
  • a chitosan tube having a diameter of 2 mm, a length of 15 mm, and a thickness of 0.1 mm was immersed in 2 Om1 of a 10 M aqueous sodium hydroxide solution. To this, 2.5 M monochloroacetic acid was added dropwise until the pH reached 7. By this operation, lipoxyl groups were introduced on the chitosan surface.
  • the obtained carboxymethylated chitosan (C-chitosan) was washed well with water to remove by-products. The confirmation of carboxylation was confirmed by detecting a carboxyl group in the analysis by FT-IR (Spectrum 2000, Perkin-Elmer).
  • a chitosan tube with a diameter of 2 ⁇ , a length of 15 mm, and a thickness of 0.1 mm is immersed in a 2.2% aqueous solution of calcium chloride for 5 minutes, then taken out and immersed in physiological saline for 30 seconds. To clean the material surface. Then, the material was immersed in a 4.3% aqueous solution of disodium hydrogen phosphate for 5 minutes, then taken out, and immersed in physiological saline for 30 seconds to wash the material surface. The above series of operations was repeated five times. By performing such an operation, a calcium phosphate compound was bound to the chitosan surface.
  • a chitosan tube having a diameter of 2 mm, a length of 15 mm, and a thickness of 0.1 mm was immersed in 2 Om1 of a 10 M aqueous sodium hydroxide solution. Add 2.5 M mono-acetic acid to this It was added dropwise until the pH reached 7. By this operation, a lipoxyl group was introduced into the chitosan surface ffi. The obtained carboxymethylated chitosan (C-chitosan) was thoroughly washed with water to remove by-products.
  • C-chitosan carboxymethylated chitosan
  • a chitosan tube having a diameter of 2 mm, a length of 15 mm, and a thickness of 0.1 ram was immersed in 2 Om 1 of a 10 M aqueous sodium hydroxide solution. To this was added dropwise 2.5 M monochloroacetic acid until the pH became 7. This operation introduced a carboxyl group on the chitosan surface. The obtained carboxymethylated chitosan (C-chitosan) was thoroughly washed with water to remove by-products.
  • Cysteine immobilized C-chitosan is immersed in 1 OmM 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) phosphate buffer (pH 8) for 30 minutes, and the cysteine is immobilized by the S—S bond formation reaction. The thiol group was activated. After that, Sigma 1668 CDPGY I GSR (laminin fragment) was immobilized at the end of the laminin fragment by diso-nolide exchange reaction by immersion in 100 g Zm1 aqueous phosphate buffer solution (pH 7.4) for 1 to 20 hours. .
  • the amount of immobilized lamiyun fragment was determined by measuring the absorbance at 412 nm of 5-thio- (2-nitrobenzoic acid) (TNB) released by the disulfide exchange reaction and determining the molar extinction coefficient of TNB (E ⁇ 13, 600). As a result, it was confirmed that a laminin fragment of 19 gZ cm 2 was immobilized.

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Description

明 細 書 神経再建生体材料およびその製造方法 技術分野
本発明は、 キチンまたはキトサン表面にラミエンフラグメントを修飾した神経 再建生体材料およびその製造方法に関する。 背景技術
1 9 9 0年にマッキノン （Mackinnon)はポリグリコール酸 （ P G A) 生体吸 収性チューブを神経損傷部位に管腔移植している。 現在、 臨床で使用されている 人工神経はこの P G Aチューブだけであるが、 生体適合性、 親和性等に問題があ り、 いまだ、 わが国における臨床症例は報告されていない。 現在の人工神経では、 架橋できる長さが 1 0 c mにも満たない。 し力 し、 通常行われる末梢神経欠損部 への移植であれば、 人工神経移植で機能的再生が得られる。 例えば、 京大のグル ープは、 P G Aコラーゲンチューブにラミニンを被覆したコラーゲンファイバー を挿入した人工神経を開発した。
また、 チューブ内壁あるいはファイバーにラミエンを被覆したり、 ラミニンゃ 神経栄養因子を混ぜたコラーゲンゲルをチューブに注入する方法などが試みられ 特許出願もされている （例えば、 特開平 5— 2 3 7 1 3 9号公報、 特表平 9一 5 0 1 9 3 2号公報、 再公表特許 WO 9 8 / 2 2 1 5 5号公報） 。
糖たんぱく質であるラミエンは、 第 1図に示すように、 分子量約 9 0万の柔軟 な十字架状分子構造を有し、 上皮細胞を結合組織に接着させる働きや、 神経細胞 の突起伸長促進作用があり、 神経再建に有用と期待される。 しカゝし、 上記の従来 技術で用いられるラミニンは、 E H S r a t由来の S重瘍性産物なので、 人体には 使えない。 また、 ラミニンの分子量は大きいので合成することも困難である。 発明の開示
本発明者は、 ラミニンに匹敵する再生神経の誘導作用を持つ臨床応用可能な人 ェ神経再建生体材料についての研究開発を鋭意行い、 キチン たはキトサン側鎖 にラミニンフラグメントを結合させることによりその目的が達成できることを見 出した。
すなわち、 本発明は、 キチンまたはキトサン表面に Y I G S Rまたは I KVA Vのァミノ酸配列を含むラミニンフラグメントを修飾した神経再建生体材料であ る。
また、 本発明は、 キチンまたはキトサン表面にカルボキシル基を導入し、 次い で、 Y I G S Rまたは I KVA Vのアミノ酸配列を含むラミニンフラグメントを 含んだリン酸緩衝液中に浸漬してカルボキシル基の負電荷によりキチンまたはキ トサン表面にラミニンフラグメントを静電吸着させることを特徴とする上記の神 経再建生体材料の製造方法である。
また、 本発明は、 キチンまたはキトサンあるいはカルボキシル基を導入したキ チンまたは力ルポキシル基を導入したキトサン表面にリン酸カルシウムを結着し、 次いで、 Y I 0 3 1 または1 KVAVのアミノ酸配列を含むラミエンフラグメン トを含んだリン酸緩衝液中に浸漬してリン酸カルシウムの負電荷によりキチンま たはキトサン表面にラミニンフラグメントを静電吸着させることを特徴とする上 記の神経再建生体材料の製造方法である。
また、 本発明は、 キチンまたはキトサン表面にカルボキシル基を導入し、 次い で、 力ルポキシル基活性化試薬水溶液に浸漬して、 導入したカルボキシル基を活 性化し、 次いで、 Y I G S Rまたは I KVAVのアミノ酸配列を含むラミニンフ ラグメントを含んだリン酸緩衝液中に浸漬してキチンまたはキトサン表面のカル ポキシル基とラミニンフラグメントの水酸基およびアミノ基を反応させ共有結合 させることを特徴とす ¾上記の神経再建生体材料の製造方法である。
また、 本発明は、 キチンまたはキトサン表面に力ルポキシル基を導入し、 次い で、 力ルポキシル基活性化試薬水溶液に浸漬して、 導入したカルボキシル基を活 性化し、 次いで、 チオール基を持つ分子を固定化し、 次いで、 導入されたチォー ル基をチオール基活性化試薬と反応させ S— S結合を形成させることによりカル ポキシル基に固定化されたチオール基を活性化し、 次いで、 Y I G S Rまたは I KVAVのアミノ酸配列を含むラミニンフラグメントを含んだリン酸緩衝液中に 浸漬してラミニンフラグメント末端のチオール基と予め形成していた S—S結合 とのジスルフィド交換反応によりラミエンフラグメントの活性部位を保護した状 態形で固定化することを特徴とする上記の神経再建生体材料の製造方法である。 本発明の神経再建生体材料は、 神経再建材料として、 神経細胞の突起伸長促進 作用や細胞接着作用を有し、 優れた生体親和性と生分解性を有している。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ラミニンの分子構造を示す模式図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 キチンまたはキトサン表面にラミエンフラグメント、 例えば、 Y I G S R (チロシン一イソロイシン一グリシンーセリンーァノレギニン） 、 I K V A V (イソロイシン一リシンーバリン一ァラニン一バリン） などのアミノ酸配列を 有するラミニンフラグメントを修飾することによつて得られた神経再建生体材料 である。 この材料は、 神経架橋用キトサンチューブの壁面に該ラミエンフラグメ ントを直接修飾して用いる方法、 キトサン繊維表面に該ラミニンフラグメントを 修飾し、 神経架橋用チューブ内に充填する方法、 該ラミニンフラグメントを修飾 したキトサンゲルを充填する方法などにより使用される。 Y I: G S Rは細胞接着 性を有し、 I KV AVは細胞接着性と神経細胞突起伸長促進作用を有するが、 コ ラーゲン充填シリコンチューブ （vivo) では効果がない。
以下に、 本発明の神経再建生体材料の製造方法を具体的に説明する。
1 ) キチンまたはキトサン表面にモノクロロ酢酸等を使用してカルボキシル基を 導入する。 例えば、 キチンまたはキトサンのフィルムやチューブを水酸化ナトリ ゥム水溶液に浸漬し、 これにモノクロ口酢酸等を滴下する。 水酸化ナトリウムの 濃度は 5〜2 0 Mであり、 この濃度が高すぎる （2 5 M以上） と、 反応が進みす ぎるためキチンまたはキトサンが溶解してしまう。 力ルポキシル基が導入された キトサン （C一キトサン） は水溶 ^feである。 反応が進みすぎて水溶性になるのを 防ぐために、 ある程度まで （例えば、 p H I Oまで） モノクロ口酢酸を滴下し、 その後に塩酸などの酸で中和する方法もある。
次いで、 Cーキトサンをラミニンフラグメントを含んだリン酸緩衝液中に浸漬 する。 使用するラミニンフラグメントは、 Y I GSRまたは IKVAVのァミノ 酸配列を含むラミユンフラグメントである。
このようなラミエンフラグメントとしては、 シグマ C 1668 CDPGY I GSRまたはシグマ C 61 71 C SRARKQAAS I KyAVSADRのい ずれかである。 カルボキシル基の負電荷により、 キチンまた i キトサン表面にラ ミユンフラグメントが静電吸着する。 リン酸緩衝液濃度が高いほど吸着量が多く なる。 また、 浸漬時間は長いほど吸着量が多くなるが、 5時間以上ではあまり変 化が無い。 ：
この方法は、 修飾に使用したラミニンフラグメントの活性が維持されやすいが、 表面への固着力が共有結合よりも弱い。
2) キチンもしくはキトサンまたはカルボキシル基を導入しだキチンもしくは力 ルポキシル基を導入したキトサン表面にリン酸カルシウムを結着する。 例えば、 キチンまたはキトサンのフィルムやチューブを塩化カルシウム、 酢酸カルシウム、 乳酸カルシウムなどの水溶液に浸漬する。 浸漬時間が長いほどカルシウムを結合 したキチンまたはキトサンの生成量は多い。 次いで、 これを^理食塩水または蒸 留水で洗浄する。 次いで、 これをリン酸を含む水溶液、 例えば、 リン酸水素ナト リウム水溶液、 リン酸二水素ナトリウム水溶液、 またはリン酸水素二アンモユウ ム水溶液に浸漬する。 次いで、 これを生理食塩水または蒸留水で洗浄する。 以上 の一連の操作を数回、 例えば 5回程度操り返す。 回数が多いほど生成量が多い。 この後、 ラミニンフラグメントを含んだリン酸緩衝溶液中に浸潰する。 リン酸 カルシウムの負電荷により、 キチンまたはキトサン表面に燐酸カルシウムを介し てラミニンフラグメントが静電吸着する。 i .の方法は、 修飾されたラミニ ントの活性が維持されやすいが、 表 面への固着力が共有結合よりも弱い
3 ) 上記の 1 ) と同様に、 キチンまたはキトサン表面にモノクロ口酢酸等を使用 して力ルポキシル基を導入する。 次いで、 下記の式 1、
(式 1 )
Figure imgf000008_0001
に示す力ルポキシル基活性化試薬 （WSC:Water Soluble Carbodiimide.N-liydro xysccinimideなど） 水溶液に浸漬して、 下記の式 2に示すように、 導入したカル ポキシル基を活性化する。 W S C濃度は、 例えば、 3 0 mM程度とし、 浸漬時間 は 3 0分程度とする。 W S C濃度が高いほど、 修飾量は多くなるが、 高すぎると、 キトサン内の分子間架橋が進むため、 導入したカルボキシル基が減少し効果が悪 くなる。
(式 2 )
CM -
Figure imgf000008_0002
浸漬時間が長すぎてもキトサンに導入された力ルポキシル基とキトサン中の水 酸基あるいはァミノ基との分子内架橋が進むため導入したカルボキシル基が減少 し効率が悪くなる。 また、 浸漬時間が短かすぎるとキトサンに導入されたカルボ キシル基が十分に活性化されない可能性がある。 そのため、 录適な活性化時間の 設定が必要である。 また、 温度条件はあまり高い温度では活性が落ちるので 50 °C程度以下が望ましい。 室温程度であれば問題はなく、 4°C程度であればより望 ましい。 この後、 ラミ ンフラグメントを含んだリン酸緩衝液中に浸漬する。 こ の処理により、 キトサン表面のカルボキシル基とラミニンフラグメントの水酸基 およびァミノ基が反応し、 共有結合で結合する。
この方法は、 上記 1) 、 2) の方法より固着力が強いが、 ラミニンフラグメン トにおいては、 下記の式 3に示すように、 ラミニンフラグメントの活性部位に O H、 NH2があるため、 固定化反応によりラミエンフラグメントの活性がなくなつ てしまう可能性があり、 ラミニンフラグメントとの結合部位も指定できないこと から、 活性の低下が起こる （例えば、 CD P GY I G S Rのうち、 CDPGと反 応したものは活性が維持されるが、 Y I GSRと反応したものは失活する） 。
(式 3) 活性部位
Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser~Arg 側鎖の官能基 (HS,NH2) (OH) (OH) ( H2)
4) 上記の 3) と同様に、 キチンまたはキトサン表面にモノクロ口酢酸等を使用 して力ルポキシル基を導入した後、 力ルポキシル基活性化試薬を用いて導入した カルボキシル基を活性化する。 上記の 3) と同様に、 WSC濃度が高いほど、 固 定化量は多くなるが、 高すぎると、 キトサン内の分子間架橋が進むため、 導入し た力ルポキシル基が減少し効率が悪くなる。
また、 浸漬時間が長すぎてもキトサンに導入された力ルポキシル甚とキトサン 中の水酸基あるいはァミノ基との分子内架橋が進むためシスティンの固定化効率 が低くなる。 また、 浸漬時間が短かすぎるとキトサンに導入された力ルポキシル 基が十分に活性化されない可能性がある。 そのため、 最適な活性化時間の設定が 必要である。
次いで、 含んだリン酸緩衝液にカルボキシル基を導入したキチン
( Cーキチン） またはキトサン （C一キトサン） を浸漬し、 カルボキシル基にシ スティン等のチオール基を持つ分子を固定化する。 濃度が高いほどシスティンの 吸着量が多くなる。 次いで、 下記の式 4に示すように、 システィン固定化 Cーキ トサンを予想されるシスティンの固定化量より大過剰の 5, 5'-ditliiobis- (2-nitrobe nzoic acid) (DTNB)を含んだリン酸緩衝液にシスティンを固定した Cーキチンま たは Cーキトサンを浸漬し、 導入されたチオール基をチオール基活性化試薬と反 応させ S _ S結合を形成させることにより、 力ルポキシル基に固定ィヒされたシス ティン等の分子内に存在するチオール基を活性化する。 システィンと D T N Bと の反応は、 混合後すぐに終了するが、 固定ィヒ表面への D T N Bの拡散を考慮して 浸漬時間は 3 0分程度とする。
(式 4 )
Figure imgf000010_0001
その後、 下記の式 5に示すように、 ラミニンフラグメント含有リン酸緩衝液中 に浸漬することによってラミニンフラグメント末端のチオール基 （活性部位以 外） と予め形成していた s— s結合とのジスルフィド交換反応によりラミニンフ ラグメントの活性部位を保護した状態形で固定化する。
(式 5)
Figure imgf000011_0001
この方法は、 修飾過程が煩雑になるが、 上記 1) 、 2) の方法より固着力が強 く、 ラミニンフラグメントとの結合部位を指定できる。 その結果、 活性を維持で きる （CDPGY I GSRのうち、 Cと反応するため、 Y I GSRの活性が維持 される） 。
(実施例）
実施例 1
以下、 製造方法を実施例を用いて詳細に説明する。
直径 2mm、 長さ 1 5mm、 厚さ 0. 1mmのキトサンチューブを 10Mの水 酸化ナトリウム水溶液 2 Om 1に浸漬した。 これに、 2. 5 Mのモノクロ口酢酸 を pHが 7になるまで滴下した。 この操作により、 キトサン表面に力ルポキシル 基が導入された。 得られたカルボキシメチル化キトサン （C一キトサン） は、 よ く水洗して副生成物を除去した。 カルボキシル化の確認は F T— I R (Spectru m2000, Perkin-Elmer)による分析において、 カルボキシル基が検出されること により確認した。
-れを、 シグマ 1668 CDPGY I GSR (ラミニンフラグメント） 10 0 gZm 1のリン酸緩衝液水溶液に 3時間浸潰した。 ラミニンフラグメントを吸 着した Cーキトサンを 4Mの塩酸水溶液中で 3時間加水分解した後、 4 Mの水酸 化ナトリウム水溶液で中和した。 この溶液を、 市販の BCAプロテイン アツセ ィ キット （PIERSE製） で分析したところ、 4. 7 gZcm2 のラミニンフラ グメントが吸着していることが確認された。
実施例 2
直径 2πιιη、 長さ 15mm、 厚さ 0. 1 mmのキトサンチューブを、 濃度 2. 2%の塩化カルシウム水溶液中に 5分間浸漬し、 次いで、 これを取り出した後、 生理食塩水に 30秒間浸漬させて材料表面を洗浄した。 次いで、 この材料を濃度 4. 3%のりん酸水素ニナトリウム水溶液に 5分間浸漬し、 次いで、 これを取り 出した後、 生理食塩水に 30秒間浸潰させて材料表面を洗浄した。 以上の一連の 操作を、 5回繰り返して行った。 このような操作を行うことにより、 キトサン表 面にりん酸カルシウム系化合物を結着させた。
これをシグマ 1668 CDPGY I GSR (ラミニンフラグメント） 100 g /m 1のリン酸緩衝液水溶液に 3時間浸漬した。 ラミニンフラグメントを吸着 した C一キトサンを 4Mの塩酸水溶液中で 3時間加水分解した後、 4Mの水酸化 ナトリウム水溶液で中和した。 この溶液を、 市販の BCAプロテイン アツセィ キット （PIEHSE製） で分析したところ、 3. 2 g/cm2 のラミニンフラグ メントが吸着していることが碓^ >された。
実施例 3
直径 2mm、 長さ 15 mm、 厚さ 0. 1mmのキトサンチューブを 10Mの水 酸化ナトリウム水溶液 2 Om 1に浸漬した。 これに 2. 5 Mのモノクロ口酢酸を pHが 7になるまで滴下した。 この操作により、 キトサン表 ffiに力ルポキシル基 が導入された。 得られたカルボキシメチル化キトサン （C—キトサン） は、 よく 水洗して副生成物を除去した。
これを、 3 OmMの WSC水溶液に 30分間浸漬し、 次いで、 これを取り出し た後、 シグマ 1 668 CDPGY I GSR (ラミニンフラグメント） 100 g Zm 1のリン酸緩衝液水溶液に 3時間浸漬した。 次いで、 これを取り出した後、 ラミニンフラグメントの静電吸着分を除去するため、 30 OmMの食塩水中に 3 時間浸漬して洗浄した。 吸着分を除去した後、 共有結合によりラミニンフラグメ ントで修飾された Cーキトサンを 4 Mの塩酸水溶液中で 3時間加水分解した。 カロ 水分解後、 4 Mの水酸化ナトリゥム水溶液で中和した。
この溶液を、 巿販の BC Aプロテイン アツセィ キット （PIERSE製） で分析 したところ、 1 0. 1 g/cm2 のラミニンフラグメントが修飾されていること が碓認された。
実施例 4
直径 2mm、 長さ 1 5mm、 厚さ 0. 1 ramのキトサンチューブを 10Mの水 酸化ナトリウム水溶液 2 Om 1に浸漬した。 これに 2. 5 Mのモノクロ口酢酸を pHが 7になるまで滴下した。 この操作により、 キトサン表面にカルボキシル基 が導入された。 得られたカルボキシメチル化キトサン (Cーキトサン) は、 よく 水洗して副生成物を除去した。
これを、 10 OmMの WS C水溶液に 30分間浸漬し、 次いで、 これを取り出 した後、 システィンのリン酸緩衝液 （pH5. 8) 水溶液に 3時間浸漬した。 こ れを取り出した後、 システィンの静電吸着分を除去するため、 30 OmMの食塩 水中で 3時間浸漬して洗浄した。 吸着分が除去され、 共有結合によりシスティン が固定化された C一キトサンを得た。 システィン固定化 Cーキトサンを 1 OmM の 5, 5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)リン酸緩衝液 （ p H 8 ) に 30分 間浸漬し、 S— S結合形成反応によってシスティンのチオール基を活性化させた。 その後、 シグマ 1668 CDPGY I GSR (ラミニンフラグメント） 10 0 g Zm 1のリン酸緩衝液水溶液 （pH7. 4) に 1〜20時間浸漬することに よるジスノレフィ ド交換反応によりラミニンフラグメントの末端で固定化した。 ラ ミユンフラグメントの固定化量は、 ジスルフィ ド交換反応によって遊離してくる 5-thio- (2-nitrobenzoic acid) (TNB) の 412 n mにおける吸光度を測定し、 T NBのモル吸光係数 （E^ ； 13, 600) を用いて算出した。 その結果、 19 gZ cm2 のラミニンフラグメントが固定化されていることが確認された。 産業上の利用可能性
ラミエンに匹敵する再生神経の誘導作用を持つ臨床応用可能な人工神経再建生 体材料を提供する。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . キチンまたはキトサン表面に Y I 0 3 1 または1 KV AVのアミノ酸配列を 含むラミ-ンフラグメントを修飾した神経再建生体材料。
2 . キチンまたはキトサン表面にカルボキシル基を導入し、 ついで、 Y I G S R または I KV AVのアミノ酸配列を含むラミニンフラグメントを含んだリン酸緩 衝液中に浸漬してカルボキシル基の負電荷によりキチンまたはキトサン表面にラ ミニンフラグメントを静電吸着させることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の 神経再建生体材料の製造方法。
3 . キチンもしくはキトサンまたはカルボキシル基を導入したキチンもしくは力 ルポキシル基を導入したキトサン表面にリン酸カルシウムを結着させ、 ついで、
Y I。3 1 または1 K VAVのアミノ酸配列を含むラミニンフラグメントを含ん だリン酸緩衝液中に浸漬してリン酸カルシウムの負電荷によりキチンまたはキト サン表面にラミエンフラグメントを静電吸着させることを特徼とする請求の範囲 第 1項記載の神経再建生体材料の製造方法。
4 . キチンまたはキトサン表面に力ルポキシル基を導入し、 ついで、 カルボキシ ル基活性化試薬水溶液に浸漬して、 導入したカルボキシル基を活性化し、 次いで、
Y I 0 3 1 または1 KV AVのアミノ酸配列を含むラミエンフラグメントを含ん だリン酸緩衝液中に浸漬してキチンまたはキトサン表面のカルボキシル基とラミ ニンフラグメントの水酸基およびアミノ基を反応させ共有結合させることを特徴 とする請求の範囲第 1項記載の神経再建生体材料の製造方法。
5 . キチンまたはキトサン表面に力ルポキシル基を導入し、 ついで、 カルボキシ ル基活性化試薬水溶液に浸漬して、 導入したカルボキシル基を活性化し、 次いで、 チオール基を持つ分子を固定化し、 次いで、 導入されたチオール基をチオール基 活性化試薬と反応させ S— S結合を形成させることによりカルボキシル基に固定 化されたチオール基を活十生化し、 次いで、 Y I G S Rまたは I KV AVのァミノ 酸配列を含むラミニンフラグメントを含んだリン酸緩衝液中に浸漬してラミエン フラグメント末端のチオール基と予め形成していた S— S結合とのジスルフィド 交換反応によりラミエンフラグメントの活性部位を保護した状態形で固定化する ことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の神経再建生体材料の製造方法。
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