WO2002100431A1 - Kit pharmaceutique comprenant une proteine de fusion carboxypeptidase humaine dirigee contre un anticorps a chaine simple de proteine plasmatique seminale et promedicament - Google Patents

Kit pharmaceutique comprenant une proteine de fusion carboxypeptidase humaine dirigee contre un anticorps a chaine simple de proteine plasmatique seminale et promedicament Download PDF

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fusion protein
carboxypeptidase
chain antibody
prodrug
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Xiaoke Hao
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The Forth Military Medical University
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Definitions

  • the present invention relates to the field of antibody-directed enzyme-prodrug therapy (ADEPT). More specifically, the present invention relates to an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein and a prodrug methotrexate- OC-peptide derivative kit, which is suitable for treating prostate cancer by ADEPT therapy. The invention also relates to an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein.
  • ADEPT antibody-directed enzyme-prodrug therapy
  • chemotherapeutic drugs lack high selectivity to tumor tissues, and often have toxic and side effects on the normal tissues of the body while acting on tumor tissues.
  • the proposal of monoclonal antibodies provides a basis for tumor-directed therapy. It is hoped that monoclonal antibodies can specifically bring toxic drugs directly to tumor tissue sites, but in practice, it is found that toxic drugs cannot reach tumor sites very effectively. This is because : (1) an antibody can only carry a certain number of drugs, (2) the amount of antigens in tumor tissues varies, (3) large antibody-drug cross-linkers are difficult to reach the substantial tumor site, and (4) it is easy to cause immunity reaction.
  • ADPT antibody-directed enzyme-prodrug therapy
  • mol carboxypeptidase G2 can degrade 800 mol benzoic acid nitrogen mustard substrate in one second, and produce a high concentration of active drug at the tumor site, which can make up for the shortcoming of the low binding power of immunoconjugates in clinical applications. There is also evidence that It is more effective to produce high concentrations of drugs on the surface of tumor cells than to apply the same concentration of active drugs throughout the body.
  • Methotrexate is an anti-metabolic tumor chemotherapy drug, which is widely used, but MTX not only kills tumor cells, but also inhibits normal cells, causing severe toxic reactions and limiting clinical high Concentration and large-dose use affect the treatment effect. If any ⁇ -amino acid is connected to the ⁇ -carboxyl group of carboxyl-terminal glutamic acid of MTX, it becomes an MTX- ⁇ -peptide. This compound is not toxic to all cells. When it encounters a suitable carboxypeptidase to hydrolyze carboxypeptide bonds, it can release cytotoxic MTX, which is an antibody-directed enzyme-prodrug therapy ( ADEPT) provides favorable conditions.
  • ADEPT antibody-directed enzyme-prodrug therapy
  • ADEPT Since the concept of ADEPT was proposed by Bagshawe in 1987, it has developed rapidly, and part of it has entered the phase I clinical experiment. However, the heterogeneity of mouse-derived monoclonal antibodies and activating enzymes is the biggest obstacle that limits the in vivo application of ADEPT therapy. Cross-linking of antibody / human-derived activating enzyme is the development direction of ADEPT. Genetic engineering of single-chain antibodies in place of murine monoclonal antibodies should solve the problem of antibody heterogeneity. This is because the genetically engineered single-chain antibody retains only the variable region of the antibody with specific antigen binding, and removes the constant region of the antibody, which differs greatly in species. It is only 1/6 of the intact antibody and has good affinity and stability.
  • the fusion protein constructed by genetically engineered single-chain antibody and activating enzyme gene can both specifically bind tumor cells and hydrolyze prodrugs, and avoid enzyme inactivation and antibody inactivation during chemical coupling.
  • its biggest advantage is that it is easy to prepare in large quantities, which is convenient for future clinical use.
  • ⁇ -Seminoprotein is a prostate-specific antigen secreted by prostate epithelial cells in semen, with a molecular weight of 23,000-33,000. It was used for forensic identification in the early years. In recent years, people have used anti- ⁇ -Sm Serum was localized by histochemical staining and found to be found in prostate cancer cells and metastatic cells (hara Saburo, ⁇ -Seminoprotein ⁇ !: (i 'Hoichio immunochemical traits. Clinicopathology, 1986; Special (68): 50), while it is not found in other human tissues and malignancies. It is currently associated with prostate specific antigen (prostatic specific antigen, PSA) -likely recognized as a specific marker for prostate cancer.
  • PSA prostate specific antigen
  • Carboxypeptidase A is a carboxypeptidase secreted by a portion of mammalian tissues, with a gene length of 1251 bp and a total of 417 amino acids. It can hydrolyze aliphatic and aromatic amino acids in sequence from the C-terminus of the polypeptide chain. Using this property, carboxypeptidase A was first applied to ADEPT therapy research.
  • the inventors proceeded from the self-constructed anti-human seminal plasma single chain antibody, combined with human carboxypeptidase and the prodrug methotrexate- ⁇ -peptide derivative, and conducted in-depth research on the treatment of prostate cancer, thus completing This invention.
  • an object of the present invention is to provide a kit for treating prostate cancer via antibody-directed enzyme-prodrug therapy.
  • the kit includes an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein and a precursor. Drug methotrexate- ⁇ -peptide derivative.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein and a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a kit for treating prostate cancer via antibody-directed enzyme-prodrug therapy.
  • the kit includes a plurality of containers, each containing an anti-human seminal plasma single-chain antibody / human carboxylate.
  • Peptidase A fusion protein, prodrug methotrexate- ⁇ -peptide derivative, and pharmacologically acceptable auxiliary agent for administration wherein the anti-human seminal plasma single chain antibody / The human carboxypeptidase A fusion protein was administered at least 72 hours before the prodrug administration.
  • the prodrug is methotrexate-alpha-phenylalanine.
  • the sequence of the anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein is shown in FIG. 4.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-human seminal plasma single-chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein and a polynucleotide encoding the same, wherein the amino acid sequence of the fusion protein is shown in FIG. 4. The sequence is shown in Figure 3.
  • first seminoprotein E4B7 from the anti-human hybridoma cell lines (the present invention to save) starting anti-human seminal plasma protein construct single chain antibody, and by RT _ PGR Methods
  • the human carboxypeptidase A gene was amplified from human lung tissue. Based on this, an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion gene was constructed by using end-PCR and overlapping extension splicing method. See the description of the examples.
  • the inventors designed the single-chain anti-human seminal plasma protein by computer design.
  • a linker of 6 amino acid sequences was added between the antibody and the sequence of the human carboxypeptidase A coding region, and the fusion protein of the present invention was constructed by the overlapping extension splicing method.
  • this method does not require the use of restriction enzymes and ligases, can avoid the introduction of nucleotide sequences of restriction sites, and can accurately link two gene fragments together. Is a fast and effective means of constructing fusion genes.
  • the biological activity of the expressed fusion protein showed that it had human seminal plasma protein single chain antibody and human carboxypeptidase A activity ( Figure 5 and Figure 6).
  • the experiment of the kit of the present invention shows that the kit of the present invention has a significant effect on treating prostate cancer.
  • the fusion protein in the kit of the present invention is administered at least 72 hours before the administration of the prodrug.
  • the dosage and route of administration can be easily determined experimentally by those skilled in the art or clinicians according to the symptoms of the patient.
  • Figure 1 shows the construction strategy of the anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion gene of the present invention.
  • Fig. 2 is an agarose gel electrophoresis photograph showing the results of the fusion gene construction of the present invention.
  • Figure 3 is the nucleotide sequence of the fusion gene of the present invention.
  • Figure 4 shows the amino acid sequence of the fusion protein of the present invention.
  • Figure 5 shows the expression of the fusion protein of the present invention.
  • Figure 6 shows the activity of the fusion protein of the present invention in binding to prostate cancer cell lines.
  • FIG. 8 is a killing curve of a prodrug on prostate cancer cells, and the experiment is as described in Example 2.
  • FIG. 9 shows the effect of different drug treatment groups on the cell cycle of prostate cancer cells. The experiment is as described in Example 2.
  • Fig. 10 shows the tumor growth curves of different treatment groups. The experiment is as described in Example 2.
  • FIG. 11 shows a control map of tumor growth in nude mice of the ADEPT treatment group and the control group. The experiment is as described in Example 2.
  • an anti-human seminal plasma single-chain antibody / human carboxypeptidase A fusion gene Construction and expression of an anti-human seminal plasma single-chain antibody / human carboxypeptidase A fusion gene.
  • an anti-human seminavidin single-chain antibody was constructed and expanded it from 'human lung tissue' by RT-PCR.
  • an anti-human sphingoprotein / carboxypeptidase A fusion gene was constructed using end-PCR and overlapping extension splicing method, and the fusion gene was subjected to prokaryotic expression and activity determination.
  • the anti-human seminal plasma protein hybridoma cell line E 4 B 7 was prepared by the present inventors, and the cell secreted an anti-human seminal plasma protein monoclonal antibody ( Y- Sm-McAb).
  • E. coli JM109 and pUC19 plasmids were preserved by the inventors; restriction enzymes, TaqDNA polymerase, reverse transcription kit (Reverse Transcription System), plasmid extraction purification kit (Wizard TM Plus Minipreps DNA Purification System) GST fusion protein
  • the expression vector pGEX-4T-l is a product of Promega; the Rapid Ligation Kit was purchased from Boeringer Mannheim; the Advantage TM PCR-Pure Kit was a product of Clontech; IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thioxo Galactoside) was purchased from Huamei Company. The remaining reagents are Sigma products.
  • Total cell RA extraction and reverse transcription Total RNA extraction was performed by conventional methods. Total RNA extracted from 2 X 10 7 anti-human seminal plasma protein hybridoma cell lines E 4 B 7 cells was dissolved in 30 ⁇ 1 RNase-free water, and 5 ⁇ 1 was taken according to the Reverse Transcriptian System (Promega, USA) Instructions for reverse transcription.
  • the Linker sequence is a 15-peptide sequence (Giy 4 Ser) 3 that Huston analyzes the structure of the variable region of an antibody based on X-ray crystal diffraction. Design two primers based on the Linker sequence:
  • V n V H gene in the PCR product was cloned into the pUC19 -Linker plasmid in order to construct an E 4 B 7 single chain antibody. After transformation, positive colonies containing single-chain antibody genes were extracted from the recombinant plasmids and sequenced.
  • PA primer design and synthesis Search the entire gene sequence of Genbank human carboxypeptidase A, and design a pair of primers on both sides of the mature protein coding region. The synthesis of the primers was completed by Beijing Saibaisheng (USA) Bioengineering Co., Ltd. as follows:
  • the PCR reaction conditions were: denaturation at 94 ° C for 1 min, annealing at 50 ° C for 1.5 min, extension at 72 ° C for 2 min, after 30 cycles, and extension at 72 ° C for 10 min.
  • the PCR product was subjected to 15g / L agarose gel electrophoresis to identify the effect of amplification.
  • Human carboxypeptidase A For: 3 'primer for amplifying the human carboxypeptidase A gene;
  • a fusion protein Take 100ml of induced expression bacterial solution, and perform preliminary purification, denaturation and renaturation according to conventional methods, and then use GST The affinity chromatography column was further purified and lyophilized after digestion with thrombin. The antibody binding activity was measured using a competitive cytometry inhibition test using a flow cytometer. The fusion protein was added to a culture medium containing 1 ⁇ 10 6 prostate cancer cells for 45 minutes, and then the parent antibody (anti-human seminal plasma monoclonal antibody) was added.
  • VH Back V H For and V L Back, V L For primers designed for the 5 'end and 3' J region conserved sequences of murine antibody heavy and light chain variable region genes were amplified from B 4 B 7 McAb
  • E 4 B 7 V H and V L genes were digested and identified by EcoR 1 and Hindlll, and DNA fragments of about 360bp and 330bp were obtained, respectively. Consistent with the expected murine antibody variable region gene size.
  • the nucleotide sequence of E 4 B 7 V H and V L was determined by a full-automatic fluorescent sequence analyzer. As a result, the V H gene was an open reading frame, consisting of 358 bp, encoding 119 amino acids, and the amino acids at positions 22 and 95 were antibodies.
  • the ligated product of E 4 B 7 V H and VL genes was identified by PCR amplification, and an insert of about 750 bp in size was visible.
  • the E 4 B 7 single-chain antibody was sequenced using a full-automatic fluorescent DNA sequencer, and the sequences of V H , VL and Linker were all correct.
  • the anti-human seminal plasma single-chain antibody gene and human carboxypeptidase A gene were respectively subjected to a terminal PCR reaction, and complementarity was introduced at the 3, terminal of the anti-human seminal plasma protein single-chain antibody gene and the 5, terminal of the human carboxypeptidase A gene. Nucleotide sequence. Then, the two PCR products mentioned above were mixed, and the two were ligated into an anti-human seminal plasma single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion gene by SOE reaction. After 15g / L agarose gel electrophoresis analysis, the full length of the anti-human seminal plasma antibody / human carboxypeptidase A fusion gene was about 1980 bp ( Figure 2).
  • the induced GST-single-chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and a nascent protein band of about 94,000 Mr was seen (Figure 5).
  • the expression level measured by thin-layer scanner accounted for about 34% of the total bacterial protein.
  • the fusion protein is in the form of an inclusion body. Purified by conventional denaturation, renaturation, and affinity chromatography, purified single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein can be obtained. The sequencing results of the fusion protein are shown in Figure 4.
  • Methotrexate is a product of Shanghai Twelfth Pharmaceutical Factory.
  • Methotrexine- ⁇ -peptide derivative Methotrexate- ⁇ -phenylalanine (MTX- ⁇ - Phe) and methotrexate-a-arginine (MTX-a-Arg) were synthesized by the inventors, and were determined to be a single peak by high performance liquid chromatography. The molecular weight determined by laser mass spectrometry was consistent with the theoretical value.
  • -A carboxypeptidase Products as Si g ma.
  • Anti-human seminal protein monoclonal antibody-carboxypeptidase A conjugate-SmMcAb-CP-A) was prepared by the present inventors according to the thioether method (Melton R'G. LImmunoL Methods, 1993, 158: 49), anti-human sperm A plasma protein single chain antibody / human carboxypeptidase A fusion protein was prepared as in Example 1 .
  • the CP-A enzyme activity of the conjugate was 20 U / mg (CP-A: McAb).
  • the biological activity of the fusion protein showed that it had human seminal plasma protein single chain antibody and human carboxypeptidase A activity (see Examples).
  • Tumor model 4-6 week old BALB / C nude mice (provided by Animal Center, Fourth Military Medical University), weight
  • MTT test PC-3, PC-3m cells were added to 96-well culture plate, each well 1 ⁇ 104 C ell / ml, while adding various concentrations of MTX, MTX- a _Phe, MTX- a -Phe + CP- A, MTX- a -Phe + fusion protein and MTX- a -Arg, MTX- a -Arg + fusion protein, each concentration was set in 3 parallel wells, and incubated in a 37 ′ C CO 2 incubator for 48 h.
  • Colony formation test Divided into 9 groups by soft agar culture method: 1 MTX + tumor cells; 2 MTX- a -Phe + tumor cells; 3 fusion protein + tumor cells; 4 MTX- a -Phe + CP-A + Tumor cells; 5 MTX-a-Phe + fusion protein + tumor cells; 6 MTX- ⁇ -Arg + tumor cells; 7 MTX- a -Arg + CP-A + tumor cells; 8 MTX- a -Arg + fusion protein + tumor cells 9 Control group (tumor cells).
  • test drugs MTX, MTX-a-Phe, MTX-a-Arg are divided into three concentrations (0.4, 4, 40ug / ml), CP-AlOul (2.5mU / ul), and fusion protein 10ul (lmg / ml) ), 200 tumor cells / well. Incubate at 37 ° C, 50ml / L C0 2 for 2wk, fix with acetic acid and ethanol mixed solution (1: 3) for 2h, and calculate the colony formation rate under the microscope.
  • Grouping and treatment 56 tumor-bearing nude mice were randomly divided into groups according to tumor size: 1 control group, 0.5ml saline, intravenous administration; 2 treatment group I, MTX 5mg / kg, intravenous administration; 3 treatment Group II, MTX-a-Phe5.32mg / kg, intravenously administered; 4 Treatment group III, seminal plasma monoclonal antibody-carboxypeptidase A conjugate (Y-SmMcAb-CP-A) 0.5ml, intravenously administered 5 In the treatment group IV, 0.5ml of fusion protein was administered intravenously; 6 In the treatment group V, 0.5ml of the conjugate was administered intravenously, and MTX-a-Phe5.32mg / kg (ADEPT-1) was administered intravenously 72 hours later. 7 In treatment group VI, 0.5 ml of fusion protein was administered intravenously, and MTX-a-Phe 5.32 mg / kg (ADEPT-2) was administered intravenously 72
  • Fusion protein was labeled with 125 1 and ECT imaging was performed at 12h, 24h, 48h, 72h, and 96h after intravenous injection, and the localization of the antibody was observed.
  • Two nude mice were killed and swollen. Tumor, brain, heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, small intestine, mesentery lymph node, skeletal muscle, ovary, testis, one part is directly measured for radioactivity in blood and various organs after weighing.
  • Tissue homogenate take a certain amount of tissue homogenate, add an equal amount of 200ml / L trichloroacetic acid to precipitate, measure the radioactivity of the precipitated part, and calculate the content of fusion protein in the tissue.
  • Tumor cell growth cycle time [lg (1 + G) / lg] ⁇
  • G is the tumor growth component
  • mm x is the tumor mass at different observation times in a component
  • t is the observation interval time.
  • Nude mouse survival time refers to the time from treatment to natural death.
  • MTX, MTX- ⁇ - Phe + CP-A, MTX- ⁇ - Phe + fusion proteins have a strong inhibitory effect, and no colony formation (P ⁇ 0 ⁇ ⁇ ) ; the fusion protein has a certain effect on the growth of prostate cancer cells Inhibition effect, colony formation rate was 68% , which was different from the control group (? ⁇ 1 ).
  • Distribution of fusion protein in the body The distribution of markers in blood, tumor and various organs is shown in Table ECT at 12h , 24h , 48h , 72h and 96h after injection of 125 1 marker. Aggregation was best at 72 h with a T / NT value of 12.65. It shows that the antibody can carry the fusion protein and locate at the tumor site very well.
  • tumor cell cycle time comparing survival time of nude mice: each group of nude mouse tumor cell growth and survival cycle time, rapid tumor growth in the control group, the cell cycle time of a 0 ⁇ 1 ⁇ 5 persons 3 of them had extensive metastasis of the abdominal cavity, severe ascites, severe malignant heterogeneity, and an average survival of 28 ⁇ 11.7 days. There was no significant change in ⁇ , III, IV between the treatment group and the control group (P ⁇ 0.05), and the cell growth cycle time was 1 ⁇ 7 ⁇ 0.2, 2 ⁇ 7 ⁇ 0 ⁇ 2, and 1 ⁇ 9 ⁇ 0 ⁇ 1, and the average survival times were respectively It was 31 ⁇ 12.2 days, 39 ⁇ 15 ⁇ 8 days, and 34 ⁇ 14.1 days.

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Description

包含抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白
及前体药物的药盒 发明领域
本发明涉及抗体导向的酶一前体药物疗法（ADEPT)领域， 更具体地， 本发明涉及包含抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A 融合蛋白及前体药物 甲氨喋呤一 oc—肽衍生物的药盒， 该药盒适用于经 ADEPT疗法治疗前列 腺癌。 本发明还涉及抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白。
发明背景
高选择性肿瘤化疗是目前肿瘤研究的重要课题之一， 大多数化疗药 物缺乏对肿瘤组织的高选择性， 往往在对肿瘤组织发挥作用的同时也对身 体的正常组织产生毒副作用。 单克隆抗体的提出为肿瘤的导向治疗提供了 基础， 人们希望通过单克隆抗体直接将毒性药物特异地带到肿瘤组织部 位， 但在实践中发现毒性药物并不能非常有效地到达肿瘤部位， 这是因为： ( 1 ) 一个抗体只能携带一定数量的药物， （2 ) 肿瘤组织的抗原数量多少 不一， （3 ) 大的抗体一药物交联物难以达到实质性肿瘤部位， （4) 易于引 起免疫反应。 鉴于此， 最早由 Bagshawoe (Br J Cancer, 1987,56(5):531-532) 提出的抗体导向的酶一前体药物疗法 （ADEPT) 引起了人们广泛的关注。 其设想利用抗体作为载体携带前体药物的专一性活化酶， 可以选择性地结 合于肿瘤部位， 使前体药物区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒 分子， 这种设想克服了以往化学偶联物和免疫毒素存在的许多问题， 只需 要少量的酶一抗体交联物就可以在肿瘤部位催化大量的前体药物变为有毒 性作用的活性药物。 Bagshawoe在 1987年提出的最早的 ADEPT方案是， 从绿脓杆菌中分离羧肽酶 G2， 并且克隆入大肠杆菌， 最初是用来水解甲 氨喋呤， 后来用于切除苯甲酸氮芥衍生物上的谷氨酸部分使之活化。 这是 目前最具代表性的一套 ADEPT系统， 而且己进入小规模临床试验阶段。 ADEPT 方案的优势在于一个分子酶可以转化很多个分子的前体药物， 每 mol羧肽酶 G2在一秒种可降解 800mol苯甲酸氮芥底物， 在肿瘤部位产生 高浓度的活性药物， 这样可以弥补临床应用中免疫联物结合力较低的缺 点， 另有证据表明， 在肿瘤细胞表面产生高浓度药物比全身应用同等浓度 的活性药物更加有效。
甲氨喋呤 （Methtrexate, MTX) 是一种抗代谢类肿瘤化疗药物， 应用 相当广泛， 但 MTX 不仅能杀伤死肿瘤细胞， 而且同时也抑制正常细胞， 造成较严重的毒性反应， 限制了临床高浓度、 大剂量使用， 影响治疗效果。 如果在 MTX羧端谷氨酸的 α -羧基上连接任何一个 α -氨基酸，即成为 ΜΤΧ- α -肽。 这种化合物对所有的细胞均没有毒性， 当它遇到合适的羧肽酶将羧 端肽键水解后， 就能释放出具有细胞毒性的 ΜΤΧ， 这就为抗体导向酶-前 体药物疗法 （ADEPT) 提供了有利的条件。
自 1987年 Bagshawe提出 ADEPT概念以来发展很快， 现己有部份进 入 I期临床实验阶段， 但是鼠源性单抗和活化酶的异源性是限制 ADEPT 疗法体内应用的最大障碍， 所以制备人源化抗体 /人源性活化酶的交联物是 ADEPT 的发展方向。 基因工程单链抗体代替鼠源性单抗应能解决抗体异 源性问题。 这是因为基因工程单链抗体只保留有抗原结合特异性的抗体可 变区， 而去除了种属差异较大的抗体恒定区。 它仅为完整抗体的 1/6， 具 有良好的亲和活性和稳定性。 基因工程单链抗体与活化酶基因构建的融合 蛋白， 既能特异结合肿瘤细胞， 又能水解前体药物， 并且避免了化学偶联 时的酶失活和抗体失活。 另外其最大的优点是易大量制备， 便于今后临床 使用。
精浆蛋白（ γ -Seminoprotein， γ -Sm)是前列腺上皮细胞分泌于精液中的 一种前列腺特异性抗原， 分子量 23， 000-33 , 000 早年用于法医学鉴定， 近年来人们使用抗 γ -Sm血清， 进行组织化学染色定位， 发现在前列腺癌 细胞及其转移的细胞中均可以见到 （原三郎， γ -Seminoprotein <!： (i'何一 o免疫化学的性状。 临床病理， 1986; 特 （68 ): 50), 而其它人体组织 和恶性肿瘤中均未发现。 目前与前列腺特异抗原 （prostatic specific antigen , PSA) —样被公认为是前列腺癌的特异性标志物。
羧肽酶 A (Carboxypeptidase A， CPA) 是一部分哺乳动物组织分泌的 羧基肽酶， 基因全长 l251bp， 共编码 417个氨基酸。 它可以从多肽链的 C 末端将脂肪族和芳香族氨基酸依次水解下来， 利用这一特性， 羧肽酶 A是 最早应用于 ADEPT治疗研究的。
鉴于此， 本发明人从自行构建的抗人精浆蛋白单链抗体出发， 结合人 羧肽酶及前体药物甲氨喋呤一 α—肽衍生物进行了治疗前列腺癌的深入研 究， 从而完成了本发明。
因此， 本发明的一个目的在于提供一种经抗体导向酶一前体药物疗法 治疗前列腺癌的药盒， 该药盒包含抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 Α 融 合蛋白及前体药物甲氨喋呤一 α—肽衍生物。
本发明的另一目的在于提供抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 Α 融合 蛋白及编码其的多核苷酸。
发明概述
根据本发明的一个方面， 本发明提供了一种经抗体导向酶一前体药物 疗法治疗前列腺癌的药盒， 该药盒包含多个容器， 分别含抗人精浆蛋白单 链抗体 /人羧肽酶 A 融合蛋白， 前体药物甲氨喋呤一 α—肽衍生物以及用 于给药的药物学可接受的辅助试剂， 其中本发明药盒中包含的抗人精浆蛋 白单链抗体 /人羧肽酶 Α融合蛋白在前体药物给药前至少 72小时给药。 优 选地， 前体药物为甲氨喋呤一 α—苯丙氨酸。 所述的抗人精浆蛋白单链抗 体 /人羧肽酶 Α融合蛋白的序列见图 4。
本发明的另一方面提供了抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A 融合蛋 白及编码其的多核苷酸， 其中该融合蛋白的氨基酸序列如图 4所示， 该多 核苷酸的序列如图 3所示。
发明的详细描述
为了获得本发明的融合蛋白， 首先从抗人精浆蛋白杂交瘤细胞株 E4B7 (本发明人保存） 出发， 构建了抗人精浆蛋白单链抗体， 并通过 RT_PGR 方法从人肺组织中扩增了人羧肽酶 A基因， 在此基础上， 利用加端 PCR 和重叠延伸拼接法构建了抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A 融合基因， 详见实施例的描述。 为了使融合蛋白中的抗人精浆蛋白单链抗体和人羧肽 酶 A各自形成尽可能正确的空间结构及分别具有生物学功能， 本发明人通 过计算机设计， 在抗人精浆蛋白单链抗体和人羧肽酶 A编码区序列之间加 入了 6 个氨基酸序列的接头， 并采用重叠延伸拼接法构建了本发明的融合 蛋白。 此方法与传统的重组 DNA技术相比， 它不需要使用限制性内切酶 和连接酶， 可以避免引入限制性酶切位点的核苷酸序列， 可以将两个基因 片段精确的连接在一起， 是构建融合基因的一种快速有效的手段。 表达的 融合蛋白经生物学活性测定表明分别具有人精浆蛋白单链抗体和人羧肽酶 A活性 （图 5和图 6)。
本发明人以本领域公认的前列腺癌细胞株 PC— 3 (低转移性） 和 PC —3m (高转移性） 以及接种 PC— 3m的 4—6周龄 BALB/C裸鼠为模型， 测试了本发明的药盒， 实验表明本发明的药盒具有明显的治疗前列腺癌的 效果。 为了实现最佳治疗效果， 优选地， 本发明的药盒中融合蛋白在前体 药物给药前至少 72 小时给药。 本领域技术人员应理解的是给药量、 给药 途径根据患者的症状可以很容易由本领域技术人员或临床医生经实验确 定。
以下参照实施例和附图对本发明进行进一步的描述， 其中：
图 1 示出本发明的抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的构 建策略。
图 2为示出本发明融合基因构建结果的琼脂糖凝胶电泳照片。
图 3为本发明的融合基因的核苷酸序列。
图 4 为本发明的融合蛋白的氨基酸序列。
图 5示出本发明的融合蛋白的表达。
图 6示出本发明的融合蛋白结合前列腺癌细胞株的活性。
图 7本发明的融合蛋白水解前体药物 MTX— a -Phe的活性。 图 8为前体药物对前列腺癌细胞的杀伤曲线， 实验如实施例 2所述。 图 9示出不同药物处理组对前列腺癌细胞的细胞周期的影响， 实验如 实施例 2所述。
图 10示出不同处理组肿瘤生长曲线， 实验如实施例 2所述。
图 11示出 ADEPT治疗组和对照组裸鼠肿瘤生长的对照图， 实验如实 施例 2所述。
实施例 1
抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的构建和表达 本例中， 我们构建了抗人精桨蛋白单链抗体， 并在经 RT-PCR方法从 '人肺组织中扩增人羧肽酶 A基因的基础上， 利用加端 PCR和重叠延伸拼 接法构建了抗人精桨蛋白 /羧肽酶 A融合基因， 并且对该融合基因进行了 原核表达和活性测定。 材料与方法
1、 材料：
抗人精浆蛋白杂交瘤细胞株 E4B7由本发明人制备， 该细胞分泌抗人 精浆蛋白单克隆抗体（Y -Sm-McAb)。 E.coli JM109、 pUC19 质粒由本发明 人保存； 限制性内切酶、 TaqDNA 聚合酶、 反转录试剂盒 （Reverse Transcription System )、质粒提取纯化试剂盒（ Wizard™ Plus Minipreps DNA Purification System ) GST融合蛋白表达载体 pGEX-4T-l为 Promega公司 产品； 快速连接试剂盒 ( Rapid Ligation Kit) 购自 Boeringer Mannheim公 司； Advantage™ PCR-Pure Kit为 Clontech公司产品； IPTG (异丙基 - β -D- 硫代半乳糖苷） 等购自华美公司。 其余试剂均为 Sigma公司产品。
2、 人精桨蛋白 E4 B7 ScFv基因的构建、 克隆及序列分析：
(1)细胞总 R A提取和逆转录： 总 RNA提取按常规方法进行。将从 2 X 107 个抗人精浆蛋白杂交瘤细胞株 E4B7细胞中提取的总 RNA溶于 30 μ 1 无 RNase的水中， 取 5 μ 1按 Reverse Transcriptian System ( Promega, USA ) 说明书进行逆转录。
(2) E4B7 McAb 可变区基因的扩增、 克隆、 鉴定及序列分析： 用于扩增重 链、 轻链可变区基因的引物分别为：
VHBack5 ' -AGGT(CG)(AC)A(AG)CTGCAG(CG)AGTC(AT)GG-3 '
VHFor5 ' -TGAGGAAACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3 '
VLBack-5 ' -GTGAATTCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC-3 ' ；
VLFor5 ' -CAGTCGACTAACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3 '
分别取以上合成的 cDNA 5 μ 1， 用 VHBack、 VHFor引物扩增 VH基因， 用 VJBack、 VJFor引物扩增 VL基因。 反应条件： 94 °C变性 60s， 55°C退火 90s, 72°C延伸 120s， 进行 30个循环。 各取出 5 μ 1进行 1.5%琼脂糖凝胶 电泳， 其余部分用 Advantage™ PCR-Pure Kit 回收， 取 2 μ 1回收物进行 第二轮 PCR。 上述 PCR产物经 Klenow多聚酶催化补平， 其中 VH基因经 Pst I酶切， VL基因经 EcoRI和 Sd I酶切， 分别与 pUC19用 Rapid DNA Ligation Kit连接， 转化处于感受态的 E.coli JM109细胞， 在 X-gal和 IPTG 显色性标志下，筛选白色菌落，用 Wizard™ Plus Minipreps DNA Purilication System提取重组质粒， 酶切鉴定。 将含有目的片段的重组 pUC19 质粒定 量后， 用 PE 373-A型 DNA序列分析仪进行 DNA序列分析。
(3) ScFv基因的构建、 克隆及序列分析：
Linker序列是 Huston根据 X线晶体衍射分析抗体可变区结构的 15肽 序列 （Giy4Ser) 3。 根据 Linker序列设计两条引物：
5 ' -GAGCTCGGTGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGA-
3 '
5， -GGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCGCCACCGAG-
3 '
经 94°C变性 10min， 50°C退火 7min， 形成带有 Sac I和 BamH I酶切 位点粘端的 Linker序列。 与经 Sac I和 BamH I酶切的 pUC19连接， 构建 pUC19 -Linker重组质粒的构建经转化后提取重组质粒， 进行序列分析。 再 根据 VH和 VL基因序列设计引物， 将重链的酶切位点更换为 5， 端 EcoR I 和 3， 端 Sac l， 轻链酶切位点更换为 5， 端 BamH l和 3， 端 Sal I， 扩增 出 V l] VH。 将 PCR产物中的 V n VH基因依次克隆入 pUC19 -Linker 质粒中， 构建 E4 B7 单链抗体。 经转化后将含有单链抗体基因的阳性菌落 提取重组质粒， 进行序列分析。
3、 人羧肽酶 A基因的克隆和序列分析：
(1) PA引物设计和合成： 搜索 Genbank人羧肽酶 A全基因序列， 在成熟 蛋白编码区两侧设计了一对引物， 引物的合成在北京赛白盛 (美国)生物工 程公司完成， 序列如下：
5 ' 弓 I物： 5 ' - TCGAATTCATGAGGCTCATCCTGCCT GTGGGTTT-3 ' ；
EcoRI
3 , 弓 I物： 5 ' - GATGTCGACCAGTTCTTTAGGAAGTATGCTTGAG -3 '
Sail
(2) RT-PCR扩增人羧肽酶 A基因： 取肺癌患者手术病人正常肺组织标本 50mg， 用硫氰酸胍一酚一氯仿 (AGPC)—步抽提法分离组织总 R A。 按 Reverse Transcription System, Promega说明书进行逆转录。 以 2 μ ΐ逆 转录反应产物为模板进行 PCR扩增， PCR反应体系的组成： 引物各 100 pmol, 8 μ 1 2.5 mmol/L dNTPs, 6 μ 1 25 mmol/L MgCI2, 10 X PCR缓冲液 5 w l, Taq DNA聚合酶 5 μ， 用消毒去离子水补至 100 μ 1。 PCR反应条 件为： 94°C变性 lmin, 50°C退火 1.5 min, 72°C延坤 2 min， 经过 30个 循环， 最后于 72°C延坤 10 min。 PCR产物经 15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩 增的效果。
(3)人羧肽酶 A基因的克隆和序列测定： 将人羧肽酶 A基因的 PCR扩增 产物克隆入 pUC19质粒中， 用 EcoRI和 Sail双酶切鉴定， 筛选阳性克隆。 培养含有人 CPA 基因的阳性菌株， 用 Wizard™ Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, USA) 提取重组质粒， 用全自动荧光 DNA 测序仪 (美国 PE 373-A型测序仪)测定 DNA序列。 4、 抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的构建、 克隆及序列分析:
(1)拼接引物的设计： 根据抗人精浆蛋白单链抗体基因、 人羧肽酶 A基因 及接头的核苷酸序列， 结合引物设计原则， 设计并合成了用于单链抗体基 因、 人羧肽酶 A基因扩增和拼接的引物。 引物在北京赛白盛 (美国)生物工 程公司合成。 序列如下：
单链抗体 Back: 5 ' -GCGAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3 ' ；
EcoRI
人羧肽酶 A For: 同上述扩增人羧肽酶 A基因的 3 ' 引物；
—单链抗体 For
3 ' -GTTCGACCTCTAGTTTGCACCATCGCCGCCAAGA-5 '
AGCGGCGGTTCTGGTAGGCTCATCCTGCCTGTG-3 '
人羧肽酶 A Back—
(2)加端 PCR及重叠延伸： 分别对抗人精桨蛋白单链抗体基因、 人羧肽酶 基因进行加端 PCR反应， 产物用重叠延伸拼接法 （gene splicing by overlap extension, SOE) 重组为抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因 （如 图 1所示）。 反应条件为： 94°C变性 lmin, 50°C退火 1 min， 72 °C延坤 1.5 min， 循环次数为 30— 35次。
(3)抗人精浆蛋白单链抗体 I人羧肽酶 A融合基因的克隆及序列分析： 回 收拼接反应产物，用 EcoRI, Sail双酶切，然后与同样酶切开的质粒 pUC19 连接， 转化 JM109宿主菌， 筛选阳性克隆。 用全自动荧光 DNA测序仪测 定 DNA序列。
(4)抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的表达： 将已测序抗人精 浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因克隆入 pGEX-4T-l载体， 转化感受 态的 E. Coli. JM109, 用终浓度为 0.1 mM的 IPTG诱导表达 5 h。 诱导表达 的重组蛋白进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 用岛津公司 Dual-wavelength Flying-Spot Scanner CS-9000薄层扫描仪， 扫描 SDS-PAGE后的蛋白条 s 带。
(5)抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白的抗体活性及酶活性的测 定： 取 100ml诱导表达菌液， 按常规方法进行初步纯化、 变性和复性， 再 用 GST亲合色谱柱进一步纯化， 经凝血酶酶切后冻干保存。 抗体结合活性 的测定采用流式细胞仪竞争结合抑制试验， 将融合蛋白加入到含 1 X 106前 列腺癌细胞的培养液中作用 45min ， 再加入亲本抗体 （抗人精浆蛋白单克 隆抗体） 作用 45 min, 加荧光素标记的羊抗鼠抗体后用流式细胞仪检测标 记荧光细胞的百分率和荧光强度， 同时设立亲本抗体阳性对照和无关抗体 对照。 酶活性测定采用高效液相色谱分析。 结 果
1、 人精浆蛋白 E4B7单链抗体基因的构建、 克隆及序列分析：
应用针对鼠抗体重链和轻链可变区基因 5 ' 端及 3 ' J区保守序列设计 的 VH Back, VHFor和 VL Back, VLFor引物，从 B4B7 McAb扩增出 E4B7 VH 和 VL基因， 经 EcoR l、 Hindlll酶切鉴定， 分别得到约 360bp和 330bp 的 DNA 片段。 与预期鼠抗体可变区基因大小一致。 用全自动荧光序列分析 仪对 E4B7 VH、 VL进行核甘酸序列测定，结果 VH基因为开放读框， 由 358bp 组成， 编码 119 个氨基酸， 第 22、 95 位的氨基酸为抗体可变区特征性的 半胱氨酸残基； VL基因也为开放读框， 由 326bp组成， 编码 108个氨基酸， 第 23、 88位为半胱氨酸残基。 将 E4 B7 VH和 VL基因连接产物进行 PCR扩 增鉴定，可见约 750 bp大小的插入片断。用全自动荧光 DNA测序仪对 E4B7 单链抗体进行测序， 结果 VH、 VL和 Linker的序列均正确。
2、 人羧肽酶 A基因的扩增、 克隆和序列测定- 用 RT-PCR方法从人正常肺组织中扩增了人羧肽酶 A cDNA基因。 扩 增产物经 15g/L 琼脂糖凝胶电泳观察， 结果出现一条约 1250bp 的特异带, 与预期的分子量相符。 pUC19 /CPA重组质粒转化感受态细胞后， 随机挑 取菌落，提取质粒 DNA用酶切鉴定。 用全自动荧光 DNA测序仪对人羧肽 酶 A基因进行了测序， 序列分析表明其核苷酸序列及推导的氨基酸序列与 文献报道的完全一致。
3、 加端 PCR及重叠延伸反应：
对抗人精浆蛋白单链抗体基因、 人羧肽酶 A基因分别进行加端 PCR 反应， 在抗人精浆蛋白单链抗体基因的 3， 端和人羧肽酶 A基因的 5， 端 引入互补的核苷酸序列。 然后， 将上述两种 PCR产物混合， 用 SOE反应 将二者连接为抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因。 经 15g/L琼脂 糖凝胶电泳分析，抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因全长约 1980 bp (图 2)。
4、 抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的序列分析：
选取一株酶切鉴定正确的克隆进行测序， 序列分析结果表明： 单链抗 体、 人羧肽酶 A序列与发表的一致， 单链抗体 /人羧肽酶 A融合基因的 两侧有预先设计的 EcoRI和 Sail酶切位点及起始码和终止码。 单链抗体和 人羧肽酶 A之间有 18 bp的接头序列， 其氨基酸序列为 GSGGSG。 融合基 因的核苷酸序列如图 3所示。 -
5、 抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白的表达：
诱导表达的 GST—单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白进行 SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳， 可见一条 Mr约 94, 000的新生蛋白带 （图 5 )。 用薄层扫描 仪测得表达量约占菌体总蛋白的 34%。 融合蛋白为包涵体形式。 经常规变 性、 复性、 亲和色谱纯化， 可得到纯化的单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白。 融合蛋白的测序结果如图 4所示。
6、 融合基因的抗体活性及酶活性的测定：
流式细胞仪竞争结合抑制实验证实， 该单链抗体 /人羧肽酶 A 融合蛋 白具有与人前列腺癌细胞 （PC-3 和 PC-3m) 结合的活性 （图 6 )。 高效液 相色谱分析， 融合蛋白可以完全水解前体药物 ΜΤΧ- α -Phe (图 7)。 实施例 2 抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白-前体药物 甲氨喋呤- α -苯丙氨酸对前列腺癌体内外作用的研究
本例中测试了本发明的药盒对前列腺的癌体内和体外作用。
材料与方法
1、 主要试剂及细胞： 甲氨喋呤 （ΜΤΧ) 为上海第十二制药厂产品， 甲氨 喋吟 - α -肽衍生物： 甲氨喋呤 - α -苯丙氨酸 （ΜΤΧ- α -Phe) 和甲氨喋呤 - a - 精氨酸 （MTX- a -Arg ) 由本发明人合成， 经高效液相色谱测定为单峰， 激光质谱仪测定其分子量与理论值一致。 羧肽酶 -A为 Sigma公司产品。 抗 人精浆蛋白单克隆抗体一羧肽酶 A偶联物 -SmMcAb-CP-A)由本发明人 根据硫醚法 （Melton R'G. LImmunoL Methods, 1993，158:49) 制备， 抗人精 浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白如实施例 1制备。 其中偶联物的 CP- A的酶活性是 20U/mg (CP- A： McAb) 。 融合蛋白经生物学活性测定表明 分别具有人精浆蛋白单链抗体和人羧肽酶 A活性 （见实施例 。
人前列腺癌细胞株 pC-3 (低转移性） 和 PC-3m (高转移性） （得自北 京医科大学病理教研室）， 在 RPM11640完全培养基 （内含 150ml/LCO2条 件下） 培养， 2，5ml/L胰酶消化转代。
肿瘤模型： 4-6周龄 BALB/C裸鼠 (第四军医大学动物中心提供)， 体重
16-20g, 无菌隔离器内饲养。 于臀部皮下接种人前列腺癌细胞 PC-3m悬液 -lml ( Ι χ ΙΟ7细胞） ， 至瘤体大约 5cm3时开始给药。
2、 融合蛋白 /前体药物对肿瘤细胞的体外细胞毒性试验
(1) MTT试验： 将 PC-3、 PC-3m细胞分别加至 96 孔培养板， 每孔 1 χ 104Cell/ml, 同时加入不同浓度的 MTX、 MTX- a _Phe、 MTX- a -Phe + CP- A、 MTX- a -Phe + 融合蛋白及 MTX- a -Arg、 MTX- a -Arg +融合蛋白， 每个浓度设 3个平行孔， 于 37'CC02培养箱内孵育 48h。 加噻唑蓝 PBS溶 液 （5mg/ml) 每孔 20iil， 37 C反应 4h， 弃培养液及未反应的噻唑蓝， 再加 入 ( ml二甲基亚砜， 测 405nm吸收值， 取平均值， 计算其杀伤率。 (2)集落形成试验： 用软琼脂培养法分为 9组： ① MTX +肿瘤细胞； ② MTX- a -Phe +肿瘤细胞； ③ 融合蛋白 + 肿瘤细胞； ④ MTX- a -Phe + CP-A+肿瘤细胞； ⑤ MTX-a-Phe+融合蛋白 +肿瘤细胞； ⑥ MTX- α - Arg+肿瘤细胞； ⑦ MTX- a -Arg + CP-A +肿瘤细胞； ⑧ MTX- a -Arg + 融合蛋白 +肿瘤细胞； ⑨对照组（肿瘤细胞)。 其中各种试验药物 MTX、 MTX- a -Phe, MTX- a -Arg分为三个浓度 （0.4、 4、 40ug/ml)、 CP-AlOul (2.5mU/ul), 融合蛋白 10ul(lmg/ml)， 肿瘤细胞 200个 /孔。 37°C、 50ml/L C02培养 2wk， 用乙酸、 乙醇混合液 （1 : 3) 固定 2h， 显微镜下计算克隆 形成率。
(3) 融合蛋白 /前体药物对肿瘤细胞生长周期动力学影响： 将细胞 （PC-3、 PC-3m) 分别加入 10ml 培养瓶中 （细胞数 106/ ml), 同时加入不同浓度 的 MTX、 MTX-a-Phe、 MTX- a -Phe + CP- A、 MTX- a -Phe +融合蛋白， 于加药后 6h、 16h、 24h分别收集， 用冷生理盐水洗 2次， 用 950ml/L冷 乙醇固定。 按常规方法对细胞进行 DNA染色 （DNA染液由 Coulter公司 提供试剂盒）， 应用流式细胞仪 （FASS, Profile II型， 激光功率 15mW， 绿光带道滤片 488nm) 进行分析。
3、 动物模型体内抑瘤试验：
(1)分组与治疗： 56只荷瘤裸鼠按瘤体大小随机分组:①对照组， 给予生理 盐水 0.5ml， 静脉给药； ②治疗组 I， MTX 5mg/kg ， 静脉给药； ③治疗组 II， MTX-a-Phe5.32mg/kg ， 静脉给药； ④治疗组 III， 精浆蛋白单抗一 羧肽酶 A偶联物（Y- SmMcAb-CP-A)0.5ml， 静脉给药； ⑤治疗组 IV， 融合 蛋白 0.5ml， 静脉给药； ⑥治疗组 V， 先静脉给于偶联物 0.5ml， 72h后再静 脉给予 MTX-a-Phe5.32mg/kg(ADEPT-l)。 ⑦治疗组 VI， 先静脉给予融 合蛋白 0.5ml， 72h后再静脉给予 MTX- a -Phe 5.32 mg/kg ( ADEPT-2 )。
(2)观察指标：
①融合蛋白在体内的分布： 用1251标记融合蛋白， 静脉注射后第 12h、 24h、 48h、 72h和 96h行 ECT显像， 观察抗体的定位情况， 并各处死 2只裸鼠取肿 瘤、 脑、 心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃、 小肠、 肠系膜淋巴结、 骨骼肌、 卵巢、 睾丸，称重后一部分直接测定血液及各脏器的放射性，另一部分用 9g/LNaCl 溶液制成组织匀浆， 取一定量的组织匀浆， 加等量 200ml/L三氯醋酸沉淀， 测沉淀部分的放射性， 计算组织中融合蛋白的含量。
②抑瘤率： 给药后每周测定瘤体长径与短径， 计算瘤质量（ = 1/2 X长径 X短径 2)， 并计算肿瘤生长抑制率 (抑瘤率)。 对照组瘤质量 - 实验组瘤质量
抑瘤率 = X 100%
对照组瘤质量
③肿瘤细胞生长周期时间： =[lg (1+G) /lg ] Χί， G 为肿 瘤生长组分， m mx为某组分中不同观察时间的肿瘤质量， t为观察间隔 时间。
④裸鼠生存时间： 指从接受治疗到自然死亡的时间。
⑤病理组织学观察： 包括大体标本检查及镜检， 取肿瘤组织及重要脏器的 组织， 100ml/L福尔马林固定， 石蜡包理切片， HE染色， 光镜下观察。 结 果
1、 体外毒性试验：
(1)、 细胞毒性试验： 从不同浓度的 MTX、 MTX- a -Phe > MTX- a -Phe + CP-A、 MTX- a -Phe + 融合蛋白和 MTX- a -Arg对肿瘤细胞杀伤曲线可以 看出 （图 8)， 前体药物 MTX- a -Phe和 MTX- a -Arg对前列腺癌细胞均无 杀伤作用， 而 MTX- a -Phe + CP-A和 MTX- a -Phe +融合蛋白则有很强的 细胞毒作用， 与 MTX活性相当， 而与前体药物活性差异约 1000倍。 融合 蛋白作用后游离 MTX对肿瘤细胞的 1(：5()为 4.5X10 mol I L， 而前体药物 的无明显毒性， IC5Q为 7.2X 10'2mol/L 。 (2)、 集落形成试验结果： MTX_ -Phe和 ΜΤΧ- α -Arg均无抑制前列腺癌 细胞生长的作用， 集落形成率分别为 88%和 91% 与对照组无差异 (P>0.05). MTX, MTX- α -Phe + CP-A, ΜΤΧ- α -Phe + 融合蛋白则有很 强的抑制作用， 均无集落形成 （Ρ<Ο·ΟΟΙ); 融合蛋白对前列腺癌细胞生长 有一定的抑制作用， 集落形成率为 68%， 与对照组有差异 (？^ 1)。
(3)、 细胞周期分析： 经 MTX- a -Phe +融合蛋白处理的细胞， 其 G/GQ期、 + Μ期细胞比率 （％) 明显增高 （t =15 )4和 2·76， Ρ<0·01和 Ρ<0·05 )， 而 S期则显著下降 （ί =17·85， Ρ<0.01 ), 细胞增殖指数明显降低， 并出现 凋亡细胞， 与 MTX- a -Phe + CP-A和 MTX处理的细胞相似 （Ρ<0·05 )。 而经前体药物 ΜΤΧ- α -Phe处理的细胞其动力学无明显变化 （图 9)。
2、 动物模型体内试验：
(1)、融合蛋白在体内的分布： 注射 125 1标记物后第 12h、 24h、 48h、 72h和 96h， 血液、 肿瘤及各脏器标记物的分布见表 ECT扫描见肿瘤部位有明显核素 聚集， 以 72h最佳， T/NT值 12·65。 说明抗体可以很好的携带融合蛋白定位 于肿瘤部位。
表 1. 静脉注射1251-标记物后不同时间点的脏器分布比较 时间 % ID I g
(h) 肝 胃 肾 肺 心脏 肌肉 脑 淋巴结 肠 膀胱 甲状腺 睾丸 卵巢 血液 肿瘤
12 5.06 5.00 4.94 5.78 4.82 2.28 0.82 2.57 2.38 4.15 5.01 0.78 0.73 14.29 5.78
24 7.06 7.74 6.58 8.26 5.67 2.34 1.09 2.41 2.13 4.62 4.71 0.95 0.97 12.12 9.42
48 7.51 7.56 6.84 8.79 6.21 2.41 1.13 2.32 1.87 4.81 4.12 1.32 1.27 9.53 12.89
72 9.21 8.54 7.1 1 8.02 6.85 2.52 1.23 2.30 1.50 4.88 3.01 1.59 1.56 7.73 15.56
96 8.83 8.72 7.14 9.27 7.17 2.78 1.28 2.27 1.43 5.02 2.36 1.75 1.69 7.07 14.08
(2)、 肿瘤体积的动态观察： 第 1周内， 各组肿瘤体积无明显差异。 从第 2周 起， 治疗组 I、 V、 VI肿瘤生长开始减慢， 生长受到抑制。 第 6周时， 治 疗组 I、 V和 VI的肿瘤体积明显小于其它组， 其中 V、 VI组 (ADEPT组)有 12 只肿瘤明显縮小， 4只基本消失。 肿瘤抑制率明显高于其它组 (P <0.001), V、 VI组之间无明显差异 （尸 >0·05) 。 治疗组 Π、 III、 IV与对照组相比虽 有缩小， 但无差异 >0·05)， 对照组肿瘤生长很快， 部份肿瘤到后期发生 溃破 (图 u)。
(3)、 肿瘤细胞生长周期时间、 裸鼠生存时间的比较： 各组荷瘤裸鼠肿瘤细 胞生长周期时间和生存期， 对照组肿瘤生长快， 细胞生长周期时间为 1·5士 0·1 , 其中 3只发生腹腔脏器广泛转移， 严重腹水， 恶异质严重， 平均生存 期为 28± 11·7天。 治疗组 Π、 III、 IV与对照组无明显变化 (Ρ <0.05)， 细胞 生长周期时间为1 ·7±0.2、 2·7±0·2和 1·9±0·1， 平均生存期分别为 31 ± 12.2 天， 39± 15·8天和 34± 14·1天。单用 ΜΤΧ (治疗组 J )虽然肿瘤生长受到抑制， 但荷瘤裸鼠生活质量较差， 全血细胞数明显低于 ADEPT组 p<0.01)， 细胞 生长周期时间为 2.5 ±0·2， 生存期为 67± 13.8天。 而 ADEPT组 （V、 VI组） 治疗的细胞生长周期时间最长， 为 3·7土 0·2和 3·4±0·5， 生存期平均为 91 ± 13.9天和 89± 12.6天。
(4)、 组织病理学检查： 经过 5周治疗后， 治疗组 I、 V、 VI大体标本检査 见肿瘤大面积坏死， 切面呈黄白色， 组织松脆， 仅在周边部残留包膜及少 量瘤组织， 镜下见坏死瘤组织内散在片状钙化， 癌组胞仅残留轮廓。 而对 照组及治疗组 II、 III、 IV呈腺癌典型表现， 癌细胞生长活跃， 有转移的裸 鼠腹腔脏器发生广泛癌组织浸润。

Claims

权利要求 '
、 一种经抗体导向酶一前体药物疗法治疗前列腺癌的药盒， 该药盒包含 多个容器， 分别含抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 A融合蛋白， 前体 药物甲氨喋呤一 α—肽衍生物以及用于给药的药物学可接受的辅助试 剂， 其中抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 Α融合蛋白在前体药物给药 前至少 72小时给药。
、 权利要求 1的药盒， 其中前体药物为甲氨喋呤一 α—苯丙氨酸。
、 抗人精浆蛋白单链抗体 /人羧肽酶 Α融合蛋白， 其具有图 4所示的氨基 酸序列。
、 编码权利要求 3 的融合蛋白的融合基因， 其具有图 3所示的核苷酸序 列。
、 权利要求 1的药盒在治疗前列腺癌中的应用。
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