WO2002079476A1 - Methode de detection de l'expression du gene d'aspergillus - Google Patents

Methode de detection de l'expression du gene d'aspergillus Download PDF

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WO2002079476A1
WO2002079476A1 PCT/IB2002/000890 IB0200890W WO02079476A1 WO 2002079476 A1 WO2002079476 A1 WO 2002079476A1 IB 0200890 W IB0200890 W IB 0200890W WO 02079476 A1 WO02079476 A1 WO 02079476A1
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dna
culture
nucleotide sequence
seq
expressed
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PCT/IB2002/000890
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Masayuki Machida
Osamu Akita
Yutaka Kashiwagi
Katsuhiko Kitamoto
Hiroyuki Horiuchi
Michio Takeuchi
Tetsuo Kobayashi
Noriyuki Kitamoto
Katsuya Gomi
Keietsu Abe
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
National Research Institute Of Brewing
National Food Research Institute
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting expression of a filamentous fungal gene, and a method for specifically measuring fermentation conditions of a filamentous fungus.
  • the fermentation production process does not necessarily depend on the function of a single microorganism, but may use multiple microorganisms that are evolutionarily related, and they are not artificially inoculated. In the course of fermentation production, it may be passively mixed in from the natural environment. In addition, these contaminated microorganisms are often essential for fermentation production, and since contaminants are originally expected, contaminants themselves cannot be prevented in many cases. On the other hand, there are many microorganisms in the natural environment that are not desirable for fermentation production.
  • the present invention provides a method for detecting gene expression of Aspergillus, and a DNA for specific measurement of fermentation conditions of Aspergillus. The purpose is to provide.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in detecting the growth state and the degree of fermentation of Aspergillus oryzae using many genes of Aspergillus, and completed the present invention. I came to.
  • the present invention provides the following DNA (a) or (b).
  • (b) Contains the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6006.Hybridizes under stringent conditions with A, and is rich in eutrophic culture, oligotrophic culture, solid culture, early germination culture, alkaline culture, and high temperature. DNA that can be expressed when a filamentous fungus is cultured under at least one culture condition selected from the group consisting of culture, low-temperature culture, and maltose culture
  • the present invention provides a method for producing a koji mold under at least one culture condition selected from the group consisting of eutrophic culture, oligotrophic culture, solid culture, early germination culture, alkali culture, high temperature culture, low temperature culture and maltose culture.
  • DNA that can be expressed when cultured.
  • the above DNA was obtained by culturing a koji mold under at least one culture condition selected from the group consisting of eutrophic culture, oligotrophic culture, solid culture, initial germination culture, alkaline culture, high temperature culture, low temperature culture and maltose culture. It can sometimes be expressed.
  • DNA that can be expressed when culturing Aspergillus under eutrophic culture conditions is shown in the first column of Table 1, and (b) DNA that is expressed when culturing Aspergillus under oligotrophic culture conditions.
  • DNAs that can be expressed are shown in the second column of Table 1.
  • the DNA that can be expressed when the koji mold is cultured under the initial germination culture conditions is shown in the fourth column of Table 1.
  • the DNA that can be expressed when the koji mold is cultured under alkaline culture conditions is as follows.
  • the present invention provides at least two primer sets for amplifying Aspergillus oryzae genes selected from the group consisting of nucleotide sequences prepared from all or a part of a plurality of DNAs selected from the aforementioned DNAs.
  • the present invention is a probe for detecting a filamentous fungal gene, comprising a nucleotide sequence prepared from all or a part of a plurality of DNAs selected from the DNAs. Furthermore, the present invention provides a filamentous fungus, which comprises synthesizing cMA from RNA extracted from a filamentous fungus, amplifying the cDNA using the primer set, and detecting a filamentous fungal gene from the resulting amplification product. Is a detection method.
  • the present invention is a method for detecting a filamentous fungus, which comprises hybridizing the probe to RNA extracted from a filamentous fungus and detecting a filamentous fungal gene from the obtained product.
  • the present invention is a method for estimating a growth state or a fermentation function of a filamentous fungus using the detection result obtained by the detection method as an index.
  • filamentous fungi examples include microorganisms belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Humicola, Trichoderma, Mucor, or Fusarium.
  • koji mold for example, Aspergillus oryzae
  • the present invention intends to solve the above-mentioned problems by utilizing the base sequences of many genes of Aspergillus. That is, by accurately measuring the DNA amount of Aspergillus oryzae and the expression level of Aspergillus gene using a large number of hybridization probes or PCR primers having the nucleotide sequence according to the present invention, a large number of microorganism species existing in the fermentation production process can be obtained. Thus, the growth state of the koji mold or the expression of the fermentation function of the koji mold can be measured directly and accurately.
  • the present invention covers almost all the nucleotide sequences of genes expressed under various typical fermentation production conditions, and comprises a koji mold fermentation machine in a fermentation production process.
  • Aspergillus is widely used in the fermentation industry, but in the present invention, detailed culture conditions are set in order to improve production efficiency.
  • the DNA derived from Aspergillus is cloned, and its nucleotide sequence is used for designing and producing a hybridization probe or PCR primer to monitor the fermentation state of Aspergillus in detail.
  • Preparation of Aspergillus-derived mRNA can be performed by a commonly used technique. For example, a fermented product of Aspergillus oryzae is treated with guanidinium thiosinate, a phenol reagent or the like to obtain total RNA, and then oligo-dT-cellulose or poly-Sepharose using Sepharose 2B as a carrier is used. Poly ( ⁇ +) RNA (mRNA) is obtained by affinity column method or batch method.
  • a single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the thus obtained double-stranded cDNA is inserted into an appropriate cloning vector to prepare a recombinant vector.
  • a cDNA library can be obtained by transforming Escherichia coli or the like using the obtained recombinant vector and selecting a transformant using tetracycline resistance and ampicillin resistance as indices.
  • Escherichia coli can be transformed by a method of adding a recombinant vector to competent cells prepared in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or rubidium chloride.
  • a plasmid When a plasmid is used as a vector, it is necessary to contain a drug resistance gene such as tetracycline or ampicillin.
  • cloning vectors other than plasmids, for example, ⁇ phage and the like can also be used. The nucleotide sequence of the obtained clone is determined.
  • the nucleotide sequence can be determined by a known method such as the Max-Gilbert chemical modification method or the dideoxynucleotide chain termination method using M13 phage, but usually an automatic nucleotide sequencer (for example, Applied Biosystems) Sequencing is performed using an auto sequencer (Model ABI 377) or the like.
  • the entire nucleotide sequence is shown in SEQ ID NOs: 1 to 6006.
  • the DNA of the present invention hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 6006 in addition to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 6006, and (a) It can be expressed when a filamentous fungus is cultured under at least one culture condition selected from the group consisting of eutrophic culture, oligotrophic culture, solid culture, early germination culture, alkaline culture, high temperature culture, low temperature culture and maltose culture.
  • the DNA of the present invention also includes DNA that can be obtained, or (b) a DNA that encodes a protein having the same function as an expression product of the DNA.
  • "Stringent conditions” refers to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, it refers to conditions under which DNA having high homology (homology is 60% or more, preferably 80% or more) is hybridized. More specifically, it refers to a condition where the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68.
  • the DNA of the present invention has different expression modes depending on culture conditions.
  • Table 1 summarizes the relationship between culture conditions and the expressed DNA, that is, which DNA is expressed under which culture conditions, and the culture conditions and SEQ ID NOs.
  • the nucleotide sequence of the DNA described above consists of the nucleotide sequence of a gene whose expression is regulated (promoted or suppressed) under the conditions of the filamentous fungi alone or in various combinations thereof.
  • the various culturing conditions include eutrophication, oligotrophic, solid culture, early germination, allergic culture, high temperature culture and low temperature culture.
  • the filamentous fungi to be cultured include microorganisms belonging to the genus Aspergillus (including the genus Emaricella), the genus Penicillium, the genus Humicola, the genus Trichoderma, the genus Mucor, or the genus Fusarium (see below).
  • Nissylium All species classified into the known genus Penicillimn.
  • Humicola All species classified into the known genus Humicola.
  • Trichoderma All species classified into the known genus Trichoderma.
  • Mucor All species classified into the known Mucor genus.
  • Fusarium All species classified into the known Fusarium genus.
  • Aspergillus Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Aspergilus flavus, Aspergillus sojae, Aspergillus soccer, Aspergillus spicia 'Nikka (Aspergillus niger), Aspergillus awamori (Aspergillus awamori), Aspergillus kawachi (Aspergillus kawachii).
  • Aspergillus oryzae it is preferable to use Aspergillus oryzae.
  • the Aspergillus oryzae RIB40 strain used in the determination of the nucleotide sequence of the present invention was obtained from FERM BP, an independent administrative corporation, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Suiai Research Institute, Patent Organism Depositary Center 1 (1-1-1, Higashi 1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). -Deposited as 7935 on March 4, 2002-
  • Eutrophic culture conditions refer to a complete medium containing polypeptone or yeast extract, containing 0.1% to ⁇ glucose, preferably 2% glucose, and a pH 5 to 7, preferably pH 6.3 medium.
  • the cultivation temperature is 25 ° C. to 33 ° C., preferably 30, and means the culture conditions under which the koji mold grows vigorously.
  • Typical culture conditions are culture at 30 ° C for 22 hours in the following YPD medium.
  • Yeast extract 1%
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the first column of Table 1.
  • Oligotrophic culture conditions refer to culture conditions that do not contain any carbon sources such as proteins and carbohydrates and do not allow Aspergillus to grow. Aspergillus oryzae are cultured in advance in culture conditions, preferably in the YPD liquid medium described above, and after collecting and washing the cells, they do not contain a carbon source such as glucose, pH 5 to 7, preferably pH 5.5. The culture is performed at 25 ° (: 3333, preferably 30 ° C., for 4 to 10 hours, preferably 8 hours.
  • Typical culture conditions are the following YPD liquid medium at 30 to 22 hours: After culturing, the cells are collected by filtration, washed with sterile water, and cultured in the following CD (Czapek-Dox) liquid medium at 30 ° C for 8 hours.
  • CD Codepek-Dox
  • Yeast extract 1%
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the second column of Table 1.
  • the solid culture conditions refer to a culture state in which koji mold is grown in a medium such as steamed rice, wheat, soybean or other solid carbohydrates or protein grains.
  • the same culturing conditions can also be realized by placing a membrane filter on an agar medium in close contact and allowing the cells to grow thereon.
  • a typical culture condition is to form conidia on wheat bran and culture for 30 to 27 hours.
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the third column of Table 1.
  • the initial germination culture conditions are as follows: inoculating conidia in a liquid or agar medium in which Aspergillus can grow, and culturing at 25 ° (: to 33 ° C, preferably 30 to 8 to 15 hours, preferably 12 hours; This means the culture condition immediately after the conidia germinate.
  • Typical culture condition is 30t for 12 hours in the following SP liquid medium.
  • the DNA expressed by culturing under these conditions is the DNA listed in the fourth column of Table 1. This is shown in the column number.
  • Alkaline culture conditions include inoculation of conidia of Aspergillus oryzae in a liquid or agar medium containing a carbon source and a nitrogen source necessary for the growth of Aspergillus and having a pH of 8 to 10, preferably adjusted to pHIO, and 25 to 33 ° C, preferably at 30 ° C. for 1 day to 1 week, preferably 3 days, and means the culture conditions under which the Aspergillus fungus grows in an environment of Arlichari. Typical culture conditions are 30 ° (:, 3 days) in CD liquid medium adjusted to the following pHIO.
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the fifth column of Table 1.
  • High-temperature culturing conditions are defined as a complete medium containing polypeptone or yeast extract, containing 0.5% to 5% glucose, preferably 2% glucose, and culturing using a ⁇ 5 to 7, preferably ⁇ 6.3 medium.
  • temperatures of 35 to 42 ° preferably at 37 ° C.
  • Typical culture conditions are as follows: Incubate in medium at 37 for 24 hours.
  • Yeast extract 1% Bactopeptone: 2%
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the sixth column of Table 1.
  • the low-temperature cultivation condition is defined as a culture temperature of 28 to 33 ° (preferably 30 for 1 to 3 days, preferably 30 to 1 day, using solid carbohydrates such as steamed rice, wheat, and soybeans or grains composed of protein as a medium. After culturing for 34 hours, the culturing temperature is lowered to 20 ° C. to 25, preferably to 25 ⁇ , and further culturing for 2 to 5 hours, preferably 3 hours. After absorbing water, defatted soybeans and roasted cracked wheat are heated and sterilized After inoculation of conidia of Aspergillus oryzae, they are cultured at 30 ° C for 34 hours to grow hyphae, cooled to 25 and further cultured for 3 hours. .
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the seventh column of Table 1.
  • the maltose culture condition is a complete medium containing polypeptone and the like, containing 0.1% to 5% maltose, preferably 2% maltose, and a pH5 to 7, preferably pH 6.3 medium. It means a culture condition under which a koji mold grows at a culture temperature of 25 to 33, preferably 30 ° C.
  • Typical culture conditions are as follows: Incubate in the following ACM liquid medium at 30 ° C for 24 hours, collect cells by filtration, wash with sterile water, and then use the following natural medium containing 2% maltose. 30 means the conditions for culturing the bacteria for 4 hours.
  • Glucose 2% Liquid medium containing 2% maltose
  • DNAs expressed by culturing under these conditions are those shown in the sequence numbers described in the eighth column of Table 1.
  • Each of the above culture conditions can be used alone, but can be combined as appropriate according to the purpose of detecting Aspergillus or the purpose of monitoring various culture conditions. For example, a combination of eutrophic culture conditions and low-temperature culture conditions, a combination of solid culture conditions and high-temperature culture conditions, a combination of solid culture conditions, high-temperature culture conditions and maltose culture conditions, eutrophic culture conditions and initial germination culture conditions And high-temperature culture conditions and alkaline culture conditions, and all combinations of the above (1) to (8) consistent conditions.
  • Primers for detection of Aspergillus that is, a PCR forward primer (also referred to as a sense primer) and a reverse primer (also referred to as an antisense primer) can be designed and synthesized from the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6006.
  • the type of DNA obtained as a result of culturing under one of the above culture conditions or a combination of these conditions varies depending on each culture condition (see Table 1). Since a plurality of Aspergillus oryzae DNAs obtained under each culture condition are contained, a plurality of kinds and a plurality of DNAs selected from such DNAs are used as a basis for designing the primer of the present invention.
  • a plurality of DNAs may be arbitrarily selected from Aspergillus oryzae DNA (sequence numbers described in the first column of Table 1) when cultured under eutrophic conditions, and primers may be selected from a partial region of the selected DNA. Design.
  • Aspergillus oryzae DNA sequence numbers described in the first column of Table 1
  • primers may be selected from a partial region of the selected DNA. Design.
  • Table 1 the koji mold when cultured under a combination of Express the DNA listed in the corresponding column.
  • a plurality of DNAs are arbitrarily selected from these DNAs, and a primer is designed from a partial region of the selected DNAs.
  • the number of primers is determined to be the minimum number necessary in consideration of the degree of closeness and the mixture of closely related species of Aspergillus, but is at least one (two), preferably two to four.
  • Primers can be designed from a region characteristic of Aspergillus or from other regions.
  • the length of the primer is 15 to 50 bases, preferably 24 to 30 bases, and the position of DNA for primer design is such that the fragment when amplified is 50 to 40,000 bp, preferably 300 to 1. Select as appropriate to be OOObp.
  • the primer of the present invention can be obtained by ordinary chemical synthesis, for example, chemical synthesis using an Applied 833 (0113 automatic synthesizer manufactured by 61113).
  • a koji mold detection probe can also be designed from the whole or partial region of the DNA in the same manner as when the koji mold detection primer was designed.
  • a probe can be prepared by amplifying a genomic DNA or cDNA as a type III by PCR using the above primers.
  • the length should be 14 to 3,000 bases, preferably 20 to 1,000 bases.
  • the primer set and / or probe are used as a kit for amplifying or detecting DM from Aspergillus.
  • the primer set is used together with DNA polymerase (Taa DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, etc.) and as a kit for amplifying NA) derived from Aspergillus.
  • the DNA of Aspergillus is amplified using the primer set and DNA polymerase prepared as described above.
  • the preparation of the cyclized MA is performed by a known method, for example, a method using a cell wall lysing enzyme such as karasease (Takara), or RNA is prepared using guanidinium isothioate, and then commercially available.
  • CDNA synthesis kit (such as GibcoBRL) It can be performed according to the method used.
  • Amplification is performed by the polymerase chain reaction (PCR).
  • a polymerase examples include AmpliTaa DNA polymerase (Perkin-Elmer), LA Ta DNA polymerase (Takara), Pfu DM polymerase (Stratagene) and the like.
  • the conditions for amplification are denaturation at 90-98 ° C for 5 seconds to 1 minute, preferably at 94 ° C for 10 seconds to 1 minute, and 37 ° C to 68 ° C for 5 seconds to 3 minutes, preferably 55%.
  • a denaturation step of 1 to 3 minutes at 94 may be added before the above amplification cycle, and the amplified DNA is completely extended.
  • an extension step at 72 ° C. for 2 to 10 minutes may be added after the amplification cycle.
  • step 4 when the amplification product is not detected immediately, it is preferable to add a step of storing the amplification product in step 4 in order to prevent non-specific amplification from occurring. Further, by performing the annealing step and the elongation step at the same temperature, the reaction time can be simplified and speeded up.
  • the amplifying product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with bromide reagent, SYB Green solution, and the like, and the presence of each koji mold can be determined by detecting the amplified product as a band.
  • Polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis may be performed instead of agarose gel electrophoresis.
  • amplification can be detected by performing PCR using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • a detection method that does not require electrophoresis such as binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and detecting by fluorescence or enzyme reaction, can also be adopted.
  • the probe labeled with a radioisotope such as 32 P or 35 S or digoxigenin (DIG) is hybridized with the sample DNA, and detected by autoradiography, image analyzer, etc. be able to.
  • a radioisotope such as 32 P or 35 S or digoxigenin (DIG)
  • koji molds have various mutants (substitution, deletion, insertion) depending on the purpose of production.
  • the details of the mutation are not usually elucidated. Therefore, in a certain kind of probe, a signal which should be detected is often not detected due to deletion of a corresponding gene. Therefore, by using a large number of probes for detection (with increased redundancy), exceptional detection results due to mutations are eliminated, and accurate detection is possible.
  • the number of probes used in this case is 1 to 100, preferably 2 to 5.
  • the detection method of the present invention it is possible to estimate the growth state or fermentation state of the koji mold using the detection result obtained by the detection method of the present invention as an index. For example, if a detection result of the initial stage of spore germination is obtained, it can be estimated that the growth state of the koji mold is insufficient for fermentation production, and if a detection result of the oligotrophic condition is obtained, It can be assumed that the growth state of the koji mold has already passed the best state. When the detection result of eutrophic condition is obtained, it can be estimated that the fermentation state of the koji mold is good and that efficient fermentation production can be sustained. Furthermore, when a detection result indicating that the culture is in a solid culture condition is obtained, it can be estimated that the fermentation of the solid matter is not sufficient, and that the fermentation must be advanced by maintaining the fermentation state of the koji mold.
  • FIG. 1 is a photograph showing a monitor of a koji mold growth state in steamed rice fermentation.
  • FIG. 2 is a photograph showing a monitor of nutrient status of koji cells in solid fermentation of soybean.
  • Aspergillus oryzae RIB40 strain was cultured in YPD medium (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 0.04% adenine sulfate, glucose) for 22 hours.
  • MRNA was prepared by the method using a guanate.
  • cDNA was synthesized using the reverse transcription primer of the Marathon cDNA synthesis kit from Clontech, and the EcoRI adapter from the Directional Cloning Tool Box from Pharmacia was used as the adapter.
  • the above cDNA was inserted into EcoRI and Notl sites in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction using pBluescript SKII +. This was transformed into Escherichia coli XL1-Blue, a plasmid was prepared by an alkaline method, and sequenced using an M13 universal primer.
  • RNA was extracted from the cells using IS0GEN of Nippon Gene, and then mRNA was prepared using a III RNA purification kit of Pharmacia.
  • cDNA synthesis the obtained cDNA was incorporated into the EcoRI ⁇ NotI site of pBluescript SKII + using the Pharmacia cDNA synthesis kit and the Notl / Oligo-dT18 primer of directional cloning to olbox.
  • the procedures for transformation, plasmid preparation, and sequencing are the same as those for the eutrophic library.
  • Conidia were obtained by culturing them on PD (potato dextroth agar) plates at 28 ° C for 8 days. Germination bacterial cells, conidia SP liquid medium (3.5% soluble starch, polypeptone, 0.53 ⁇ 4 KH 2 P0 4, 0.5 %, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0) were obtained by culturing 30 ° C, 12 hours. The conidia and germinating cells were disrupted with liquid nitrogen and sea sand, and mRNA was purified using the Amersham Pharmacia 8 ⁇ (6 (; 11 company ⁇ 1 ⁇ p Micro mRNA Purification Kit.
  • GIBC0 CDNA was synthesized using the Superscript TM Choice System for cDNA Synthesis Kit manufactured by BRL Inc.
  • the vector was inserted into EcoRI and Notl sites using pBluescript SKII +. did.
  • the procedures for transformation, plasmid preparation, and sequence are the same as those for the eutrophic library.
  • Sterile cellophane was placed on a CD (Czapek-Dox) agar medium adjusted to pHIO, conidia of A. ryzae RIB40 strain were inoculated, and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • the cells grown on cellophane were collected and prepared for total RNA using a total RNA purification kit (QIAGEN), and then mRNA was extracted using an mRNA purification kit (Pharmacia).
  • cDNA was synthesized using the BRL kit, and the vector was inserted into the Sail and Notl sites using pSPORTl. The procedures for transformation, plasmid preparation, and sequencing are the same as those for the eutrophic library.
  • the Aspergillus was shake-cultured in an ACM medium (2% malt extract, 0.1% Bacto-peptone, glucose) at 37 ° C for 24 hours, and the cells were collected by filtration and collected in a natural medium (Bacto-peptone, 0. 5% KH 2 P0 4, 0. 13 ⁇ 4 NAN0 3, 0. 053 ⁇ 4 MgS0 4 - washed with 7H 2 0).
  • the cells were further cultured in a natural medium containing 2% maltose at 37 for 4 hours with shaking, and RNA was prepared from the obtained cells based on the Okayama-Berg method.
  • mRNA was purified from total RNA using oligot ex dT30 (Super) (Nippon Roche), and cDNA was synthesized according to cDNA synthes is kit (St rat agene). The obtained cMA was incorporated into the pBluescript KS (+) EcoR I ⁇ Xo I site. The procedures for transformation, plasmid preparation, and sequencing are the same as those for the eutrophic library.
  • the cells were cultured in YPD medium (1% yeast extract, Bacto-peptone, 0.04% adenine sulfate, 2% glucose) for 22 hours, and the cells were collected by filtration and washed with distilled water. The cells were transferred to a CD medium containing no carbon source such as glucose (Czapek-Dox) and cultured for an additional 8 hours, and mRNA was prepared from the obtained cells.
  • cDNA synthesis is the same as for the eutrophic library. The average length of the library cDNA was less than about 1.5 kbp.
  • cDNA synthesis was performed using LD PCR with SMART cDNA Library Contract Kit (CL0NTECH). The vector was inserted into the SHI site with ⁇ TiipEx2. Transformation, plasmid preparation, sequencing, etc. are the same as for the eutrophic library.
  • RNA isolated by capillary action It was transferred onto a rocellulose membrane. After blocking this membrane with a buffer containing casein, the respective EST sequences detected in solid culture conditions and initial germination culture conditions according to the present invention, 390 (SEQ ID NO: 3990) and 384, respectively.
  • a DIG-labeled RNA probe having the sequence of SEQ ID NO: 7 (SEQ ID NO: 3847) was added for hybridization.
  • the membrane was washed several times with a washing solution containing citric acid, and finally washed with 0.2 X SSC for 42 ⁇ 15 minutes.
  • the membrane was treated with a buffer containing an anti-DIG antibody and an alkaline phosphatase complex, and the chemiluminescent reagent was used.
  • Light was emitted by the CDP-Star and visualized by a CCD camera equipped with a photosensitizer.
  • the present invention provides a method for detecting expression of a forsythia gene, and a DNA for specific measurement of fermentation conditions of Aspergillus.
  • Conventional methods used to measure secondary factors such as the color, fragrance, pH, and water content of fermented products, but the method of the present invention directly and quantitatively determines the actual growth state (fermentation state) of Aspergillus oryzae. This is useful in that it can be measured dynamically.
  • the present invention covers almost all genes expressed in fermentative production with Aspergillus, and not only can the presence of other genes having a sequence similar to the target gene be predicted in advance, By using a probe or a primer having a nucleotide sequence that does not exist in a gene other than the target, even if a large amount of other gene having a sequence similar to the target gene is expressed, This is useful in that the expression level can be accurately measured.
  • SEQ ID NO: 6007 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6008 Synthetic DNA

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Description

麹菌遺伝子発現の検出方法 技術分野
本発明は、 糸状菌遺伝子発現の検出方法、 及び糸状菌発酵条件の特異的測定用
DNAに関する。 明
背景技術
田
麹菌を用いた発酵生産では、 麹菌の生育の状態、 麹菌の様々な発酵機能 （遺伝 子） の発現などを詳細にモニタ一することが重要である。 また、 発酵生産工程は 必ずしも単一の微生物の働きだけによるものではなく、 進化的に近縁の異なる複 数の微生物を使用することもあり、 かつ、 それらは人為的に接種されたものでは なく、 発酵生産の過程において自然環境中から受動的に混入される場合がある。 しかも、 これらの混入した微生物は、 発酵生産に必須な場合が多く、 本来その混 入が期待されていることから、 混入そのものを防ぐことができない場合が多数存 在する。 一方、 自然環境中には、 発酵生産に好ましくない微生物も多数存在し、 これらの中には進化的に麹菌と極めて近縁の生物種も存在する。 従って、 発酵生 産では、 多数の識別が困難な微生物種の中から、 麹菌だけについて、 上記の項目 を正確に測定する必要がある。
従来は、 これらを直接的にモニターする方法は存在せず、 目視ゃ芳香などを用 いた技術者 （職人） による観測、 あるいは生産物中の有機酸やエステルなどの成 分の分析などに基づいた観測が行われ、 これまでの経験に基づいて生育の状態や 発酵機能の発現を推定してきた。 しかし、 これらの観測は非客観的 ·非直接的で 数値化が難しく、 従って自動化や省力化が困難な場合が多々存在した。 発明の開示
本発明は、 麹菌遺伝子発現の検出方法、 及び麹菌発酵条件の特異的測定用 DNA を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 麹菌の多数の遺 伝子を利用して麹菌の生育状態や発酵の程度を検出し得ることに成功し、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の（a)又は（b)の DNAである。
(a) 配列番号 1〜6006のいずれかに示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1〜6006のいずれかに示される塩基配列を含む丽 Aとストリンジ ェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培養、 発芽初期培養、 アルカリ培養、 高温培養、 低温培養及びマルトース培養からなる 群から選択される少なくとも 1つの培養条件で糸状菌を培養したときに発現する ことができる DNA
さらに、 本発明は、 富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培養、 発芽初期培養、 アル カリ培養、 高温培養、 低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少 なくとも 1つの培養条件で麹菌を培養したときに発現することができる DNAである。 上記 DNAは、 富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培養、 発芽初期培養、 アルカリ培 養、 高温培養、 低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくと も 1つの培養条件で麹菌を培養したときに発現することができるものである。
ここで、 （a)富栄養培養条件で麹菌を培養したときに発現することができる DNA としては表 1の第 1列目に、 （b)貧栄養培養条件で麹菌を培養したときに発現す ることができる DNAとしては表 1の第 2列目に、 （c)固体培養条件で麹菌を培養し たときに発現することができる DNAとしては表 1の第 3列目に、 （d)発芽初期培養 条件で麹菌を培養したときに発現することができる DNAとしては表 1の第 4列目 に、 （e)アルカリ培養条件で麹菌を培養したときに発現することができる DNAとし ては表 1の第 5列目に、 （ί)高温培養条件で麹菌を培養したときに発現すること ができる DNAとしては表 1の第 6列目に、 （g)低温培養条件で麹菌を培養したとき に発現することができる DNAとしては表 1の第 7列目に、 （h)マルトース培養条件 で麹菌を培養したときに発現することができる DNAとしては表 1の第 8列目に、 それぞれ記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むものが挙げら れる。
さらに、 本発明は、 前記 DNAから選ばれる複数の DNAのうち全部又は一部の領域 から調製されるヌクレオチド配列からなる群から選択される、 少なくとも 2個の 麹菌遺伝子増幅用プライマーセッ卜である。
さらに、 本発明は、 前記 DNAから選ばれる複数の DNAのうち全部又は一部の領域 から調製されるヌクレオチド配列を含む、 糸状菌遺伝子検出用プローブである。 さらに、 本発明は、 糸状菌から抽出された RNAから cMAを合成し、 前記プライ マーセットを用いて該 cDNAを増幅し、 得られる増幅産物から糸状菌遺伝子を検出 することを特徴とする糸状菌の検出方法である。
さらに、 本発明は、 糸状菌から抽出された RNAに前記プローブをハイブリダィ ズさせ、 得られる産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検 出方法である。
さらに、 本発明は、 前記検出方法により得られた検出結果を指標として、 糸状 菌の生育状態又は発酵機能を推定する方法である。
糸状菌としては、 ァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 フミコーラ属、 卜リコ デルマ属、 ムコール属又はフザリウム属に属する微生物が挙げられる。 また、 ァ スペルギルス属に属する微生物としては麹菌 （例えばァスペルギルス ·ォリゼ） が挙げられる。 以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . はじめに
本発明は、 麹菌の多数の遺伝子の塩基配列を利用して、 上記の問題を解決しよ うとするものである。 即ち、 本発明による塩基配列を有する多数のハイブリダィ ゼーシヨンプローブ又は PCRプライマーを用いて、 麹菌の DNA量および麹菌遺伝子 の発現量を正確に測定することにより、 発酵生産工程に存在する多数の微生物種 から麹菌の生育状態又は麹菌の発酵機能の発現を直接的かつ正確に測定すること が可能となる。 本発明は、 種々の代表的な発酵生産条件において発現する遺伝子 の塩基配列のほとんど全てを網羅しており、 発酵生産過程における麹菌の発酵機 能の発現などを詳細にモニターすることが可能である。 また、 進化的に近縁な麹 菌と異なる微生物が存在していても、 多数の遺伝子の塩基配列を用いて解析する ことによって、 小数の遺伝子を用いて測定する場合よりも正確に測定することが 可能である。 これにより、 従来は極めて困難であった自動化および省力化が達成 されるばかりでなく、 発酵生産の信頼性の向上および標準化が達成される。 これ により、 大幅な生産コストの削減が可能となる。
麹菌は発酵工業で広範に用いられているが、 本発明において生産効率を向上さ せるために、 詳細な培養条件を設定する。 麹菌由来の DNAをクローニングし、 そ の塩基配列は、 麹菌の発酵状態を詳細にモニターするための、 ハイブリダィゼ一 シヨン用プローブあるいは PCR用プライマーの設計および製造に用いる。
2 . 麹菌由来 DNAのクロ一ニング
麹菌由来 mRNAの調製は、 通常行われる手法により行うことができる。 例えば、 麹菌の発酵処理物を、 グァニジゥムチオシァネート、 フエノール試薬等で処理し て全 RNAを得た後、 オリゴ dT-セルロース若しくはセファロース 2Bを担体とするポ リ ϋ-セファロース等を用いたァフィ二ティーカラム法又はバッチ法によりポリ （Α +) RNA (mRNA)を得る。 得られた mRNAを鐯型として、 オリゴ dTプライマー及び逆転 写酵素を用いて一本鎖 cDNAを合成した後、 該一本鎖 cDNAから二本鎖 cDNAを合成す る。 このようにして得られたニ本鎖 cDNAを適当なクローニングベクタ一に組み込 んで組換えベクターを作製する。 得られる組換えベクターを用いて大腸菌等を形 質転換し、 テトラサイクリン耐性、 アンピシリン耐性を指標として形質転換体を 選択することにより、 cDNAのライブラリーを得ることができる。
ここで、 大腸菌の形質転換は、 塩化カルシウム、 塩化マグネシウム又は塩化ル ビジゥムを共存させて調製したコンピテント細胞に、 組換えベクターを加える方 法等により行うことができる。 なお、 ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、 テトラサイクリン、 アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要であ る。 また、 プラスミド以外のクローニングベクター、 例えば λファージ等を用い ることもできる。 得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。 塩基配列の決定はマキサ ム-ギルバートの化学修飾法、 又は M13ファージを用いるジデォキシヌクレオチド 鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、 通常は自動塩基配列決定装置 (例えば Appl ied Biosystem社製のオートシークェンサ一 （モデル ABI 377)等） を用いて配列決定が行われる。
全塩基配列は配列番号 1〜6006に示す。 但し、 本発明の DNAは、 配列番号 1〜6 006に示す塩基配列を有するもののほか、 配列番号 1〜6006に示す塩基配列を有 する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 （a)富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培養、 発芽初期培養、 アルカリ培養、 高温培養、 低温培養及び マルトース培養からなる群から選択される少なくとも 1つの培養条件で糸状菌を 培養したときに発現することができる DNA、 あるいは（b)当該 DNAの発現産物と同 一機能を有するタンパク質をコードする DNAも、 本発明の DNAに含まれる。 「スト リンジェントな条件」 とは、 特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイ ブリツドが形成されない条件をいう。 例えば、 高い相同性 （相同性が 60%以上、 好ましくは 80%以上） を有する DNAがハイブリダィズする条件をいう。 より具体 的には、 ナトリウム濃度が 150〜900mM、 好ましくは 600〜900mMであり、 温度が 60 〜68 での条件をいう。
また、 本発明 DNAは、 培養条件によって発現の態様が異なるものである。 培養 条件と発現する DNAとの関係、 すなわちどの培養条件のときにどの DNAが発現する か、 培養条件と配列番号を表 1にまとめた。
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3. 糸状菌の培養条件
上記 DNAの塩基配列は、 糸状菌の各培養条件のうち単独又はこれらの種々の組 合わせの条件により発現が調節 （促進又は抑制） される遺伝子の塩基配列からな るものである。 これらの遺伝子をプライマー又はプローブとして使用すると、 様 々な条件の組合わせの状況を詳細かつ正確に測定することが可能となる。 本発明 において、 各種培養条件としては富栄養、 貧栄養、 固体培養、 発芽初期、 アル力 リ培養、 高温培養及び低温培養の各条件が挙げられる。
培養の対象となる糸状菌としては、 ァスペルギルス属 （エマリセラ属を含む） 、 ぺニシリウム属、 フミコーラ属、 トリコデルマ属、 ムコール属又はフザリウム属 に属する微生物が挙げられる （下記参照） 。
ぺニシリウム属：既知の Penicillimn属に分類される全ての種。
フミコ一ラ属：既知の Humicola属に分類される全ての種。
卜リコデルマ属：既知の Trichoderma属に分類される全ての種。
ムコール属：既知の Mucor属に分類される全ての種。
フザリウム属：既知の Fusarium属に分類される全ての種。
麹菌：ァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergillus oryzae)、 ァスペルギルス ·フミ ガタス（Aspergillus fumigatus) , ァスペルギルス ·フラバス（Aspergi 1 lus flay us) ァスペルギルス ·ゾーヤ（Aspergillus sojae)、 ァスペルギルス 'パラシテ イカス（Aspergillus paraciticus) アスペ^/千レス '二カー（Aspergillus nige r)、 ァスペルギルス ·ァヮモリ（Aspergillus awamori)、 ァスペルギルス ·カヮ チ（Aspergillus kawachii) . ァスぺ Jレギ Jレス ·二ドランス（Aspergil lus nidulan s又は Emericella nidulans)
なお、 本発明においては、 ァスペルギルス ·オリゼを使用することが好ましい。 本発明の塩基配列の決定に用いたァスペルギルス ·ォリゼ RIB40株は、 独立行政 法人 産業技術綏合研究所 特許生物寄託センタ一 （茨城県つくば市東 1丁目 1 · 番地 1 中央第 6) に、 FERM BP- 7935として平成 14年 3月 4日付で寄託されて- いる。
(1) 富栄養培養条件 富栄養培養条件とは、 ポリペプトンあるいは酵母ェクストラクトなどを含む完 全培地であり、 0. 1%〜^のグルコース、 好ましくは 2%のグルコースを含み、 pH5 〜7、 好ましくは pH6. 3の培地を用い、 培養温度 25°C〜33°C、 好ましくは 30でで、 麹菌が旺盛な生育をする培養条件を意味する。 典型的な培養条件は、 以下の YPD 培地中、 30°Cで 22時間培養する。
YPD培地
酵母エキス： 1 %
バク卜ペプトン： 2 %
アデニン硫酸： 0. 04%
グルコース： 2 %
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 1列目に記載した配 列番号に示すものである。
(2) 貧栄養培養条件
貧栄養培養条件とは、 タンパク質、 炭水化物などの炭素源を全く含まず、 麹菌 が増殖しない培養条件を意味する。 麹菌はあらかじめ生育が可能な培養条件、 好 ましくは上記 YPD液体培地で培養し、 菌体を集菌 ·洗浄後、 さらにグルコースな どの炭素源を含まない、 pH5〜7、 好ましくは pH5. 5の培地を用い、 25° (：〜 33 、 好ましくは 30°Cで、 4〜10時間、 好ましくは 8時間培養する。 典型的な培養条件は、 以下の YPD液体培地中、 30でで 22時間培養し、 菌体を濾過によって回収し、 滅菌 水で洗浄後、 以下の CD (Czapek-Dox)液体培地で 30°C、 8時間培養する。
YPD液体培地
酵母エキス： 1 %
バクトペプトン： 2 %
アデニン硫酸： 0. 04%
グルコース： 2 %
この条件で、 30°C、 22時間培養し、 集菌 *洗浄後、 以下の貧栄養培地に移す。 CD液体培地 誦3： 0. 3%
KC1： 0. 2%
KH2P04： 0. 1%
MgS04- 7H20： 0. 05%
FeS04 - 7H20： 0. 001¾
H 5. 5
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 2列目に記載した配 列番号に示すものである。
(3) 固体培養条件
固体培養条件とは、 蒸した米、 小麦、 大豆などの固形炭水化物あるいはタンパ ク質からなる穀物などを培地として麹菌を増殖させる培養状態を意味する。 同様 の培養条件は、 寒天培地上にメンプレンフィルターを密着して置き、 その上で菌 体を生育させることによつても実現される。 典型的な培養条件としては、 小麦ふ すまに分生子を着生させ、 30 、 27時間培養する。
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 3列目に記載した配 列番号に示すものである。
(4) 発芽初期培養条件
発芽初期培養条件とは、 麹菌が生育可能な液体あるいは寒天培地に分生子を接 種し、 25° (：〜 33°C、 好ましくは 30 で、 8〜15時間、 好ましくは 12時間培養し、 分生子が発芽した直後の培養条件を意味する。 典型的な培養条件は、 以下の SP液 体培地で 30t:、 12時間培養する。
SP液体培地 可溶性デンプン： 3. 5%
ポリペプトン： 2%
KH2P04： 0. 5%
MgS04 - 7H 20： 0. 5¾
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 4列目に記載した配 列番号に示すものである。
(5) アルカリ培養条件
アルカリ培養条件とは、 麹菌の生育に必要な炭素源および窒素源などを含み、 pHが 8〜10、 好ましくは pHIOに調整された液体あるいは寒天培地に麹菌分生子を 接種し、 25 〜 33°C、 好ましくは 30°Cで 1日〜 1週間、 好ましくは 3日間培養し、 麹菌菌体がアル力リ性環境化で生育する培養条件を意味する。 典型的な培養条件 は、 以下の pHIOに調製された CD液体培地で、 30° (：、 3日間培養する。
CD液体培地 （pHIO)
グルコース： 2%
NaN03： 0. 3¾
KC 1： 0. 2%
KH2P04： 0. 1%
MgS04 - 7H20： 0. 05%
FeS04- 7H20： 0. 001%
pH 10
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 5列目に記載した配 列番号に示すものである。
(6) 高温培養条件
高温培養条件とは、 ポリペプトンあるいは酵母ェクストラクトなどを含む完全 培地であり、 0. 〜 5%のグルコース、 好ましくは 2%のグルコースを含み、 ρΗ5~7、 好ましくは ρΗ6. 3の培地を用い、 培養温度 35で〜 42° (：、 好ましくは 37°Cで、 麹菌 が生育可能であり、 麹菌が高温に対する応答あるいは適応を必要とする培養条件 を意味する。 典型的な培養条件は、 以下の YPD培地中、 37でで 24時間培養する。
YPD培地
酵母エキス： 1 % バクトペプトン： 2 %
アデニン硫酸： 0. 04%
グルコース ： 2 %
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 6列目に記載した配 列番号に示すものである。
(7) 低温培養条件
低温培養条件とは、 蒸した米、 小麦、 大豆などの固形炭水化物あるいはタンパ ク質からなる穀物などを培地として、 培養温度 28 〜 33° ( 、 好ましくは 30 で、 1日〜 3日、 好ましくは 34時間培養した後、 培養温度を 20°C〜25で、 好ましくは 25 ^に降下させ、 さらに 2時間〜 5時間、 好ましくは 3時間培養する生育条件を意味 する。 典型的な培養条件としては、 脱脂加工大豆と焙炒割砕小麦を吸水後加熱滅 菌する。 麹菌分生子を接種後、 30°Cで 34時間培養して菌糸を生育させ、 25 に冷 却してさらに 3時間培養する。
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 7列目に記載した配 列番号に示すものである。
(8) マルトース培養条件
マルト一ス培養条件とは、 ポリペプトンなどを含む完全培地であり、 0. 1%〜5% のマル 1 ス、 好ましくは 2%のマルトースを含み、 pH5〜7、 好ましくは pH6. 3の 培地を用い、 培養温度 25^〜33 、 好ましくは 30°Cで、 麹菌が生育をする培養条 件を意味する。 典型的な培養条件は、 以下の ACM液体培地で、 30°C、 24時間培養 し、 菌体を濾過により集菌し滅菌水で洗浄した後、 以下の 2%マルトースを含む天 然培地で、 30で、 4時間、 麴菌を培養する条件をいう。
ACM液体培地
Mal t extract： U
Bacto-pepton： 0. 1%
グルコース ： 2% 2 %マルトースを含む液体培地
Bac to-pepton： 1¾
KH2P04： 0. 5¾
固 03： 0. 1¾
MgS04- 7H20： 0. 05¾
マルト一ス： 2 %
この条件で培養することにより発現する DNAは、 表 1の第 8列目に記載した配 列番号に示すものである。
(9) 培養条件の組合せ
上記各培養条件は、 単独で使用することができるが、 麹菌の検出目的、 各種培 養条件のモニターの目的等に応じて適宜組合せることも可能である。 例えば、 富 栄養培養条件と低温培養条件との組合せ、 固体培養条件と高温培養条件との組合 せ、 固体培養条件と高温培養条件とマルトース培養条件との組合せ、 富栄養培養 条件と発芽初期培養条件と高温培養条件とアルカリ培養条件との組合せ、 上記（1 )〜（8)の矛盾しない条件のすべての組合せ等が挙げられる。
4 . プローブ又はプライマーの設計
麹菌の検出用プライマー、 すなわち PCRのフォワードプライマ一 （センスブラ イマ一ともいう） 及びリバースプライマー （アンチセンスプライマーともいう） は、 配列番号 1〜6006に示される配列から設計及び合成することができる。 前記 培養条件のうち 1つの条件又はこれらの条件の組合せにより培養された結果得ら れる DNAの種類は、 各培養条件により変動する （表 1参照） 。 各培養条件により 得られる麹菌 DNAは複数個含まれているので、 そのような DNAから選ばれる多種類 かつ複数の DNAを、 本発明のプライマーを設計するための基礎とする。 例えば、 富栄養条件で培養されたときの麹菌 DNA (表 1、 第 1列目に記載の配列番号） か ら複数の DNAを任意に選択して当該選択された DNAの一部の領域からプライマーを 設計する。 また、 複数条件の組合せで培養されたときの麹菌は、 表 1中、 その条 件に対応する列に記載の DNAを発現する。
これらの DNAから複数の DNAを任意に選択して当該選択された DNAの一部の領域 からプライマーを設計する。 プライマーの数は、 麹菌近縁種の近縁度および混在 度を勘案して必要な最小限の数を決定するが、 少なくとも 1組 （2本） 、 好ましく は 2組〜 4組である。 プライマーは、 麹菌に特徴的な領域から設計することもでき、 それ以外の領域から設計することもできる。 プライマーの長さは 15〜50塩基、 好 ましくは 24〜30塩基の長さであり、 プライマー設計のための DNAの位置は、 増幅 したときの断片が 50〜40， 000bp、 好ましくは 300〜1， OOObpとなるように適宜選択 する。
本発明のプライマーは、 通常の化学合成、 例えば Appl ied 8 3 3 ( 61113社製の0 A自動合成装置を用いた化学合成により得ることができる。
一方、 麹菌の検出用プローブも、 麹菌検出用プライマ一を設計したときと同様 の要領で、上記 DNAの全部又は一部の領域から設計することができる。 あるいは、 上記プライマーを用いて、 ゲノム DNAあるいは cDNAを铸型として PCRにより増幅さ せることにより、 プローブを調製することも可能である。 一部の領域から設計す る場合は、 長さが 14〜3， 000塩基、 好ましくは 20〜1， 000塩基となるようにする。
5 . プライマーセット及び/又はプローブを含むキット
上記プライマーセット及び/又はプローブは、 麹菌由来 DMを増幅又は検出する ためのキットとして使用される。 プライマ一セットは、 DNAポリメラ一ゼ （Taa D NAポリメラ一ゼ、 Pfu DNAポリメラ一ゼ等） とともに、 麹菌由来の]) NA増幅用キッ 卜として使用される。
6 . PCR, ハイプリダイゼーシヨン及び検出
上記のようにして調製されたプライマーセット及び DNAポリメラーゼを用いて 麹菌の DNAを増幅する。 鐃型となる MAの調製は、 公知の手法、 例えばャ夕ラーゼ (Takara) などの細胞壁溶菌酵素を用いた方法、 あるいはグァニジゥムイソチォ シァネ一トを用いて RNAを調製した後、 市販の cDNA合成キッ卜（GibcoBRLなど）を 用いた法方等により行うことができる。
増幅は、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により行う。 應 Aポリメラーゼとしては Am pl iTaa DNAポリメラ一ゼ （Perkin- Elmer社） 、 LA Ta DNAポリメラーゼ（Takara)、 Pfu DMポリメラ一ゼ （Stratagene社） 等が挙げられる。
増幅の条件は、 90 〜 98°Cで 5秒〜 1分、 好ましくは 94°Cで 10秒〜 1分の変性ェ 程、 37°C〜68°Cで 5秒〜 3分、 好ましくは 55°Cで 30秒〜 1分のアニーリング工程、 及び 65 〜 75°Cで 2秒〜 30分、 好ましくは 72°Cで 30秒〜 1分の伸長工程を 1サイク ルとしてこれを 14〜40サイクル、 好ましくは 30サイクル行う。 伹し、 铸型丽 A及 びプライマーを十分変性させるために、 上記増幅サイクルの前に 94でで 1〜3分 の変性工程を加えてもよく、 また、 増幅された DNAを完全に伸長するために、 増 幅サイクルの後に 72°Cで 2〜10分の伸長工程を加えてもよい。 さらに、 増幅産物 の検出を直ちに行わない場合は、 非特異的な増幅が起こらないようにするために、 増幅産物を 4でで保存する工程を加えることが好ましい。 また、 アニーリング行 程と伸長工程を同一の温度で行うことにより、 反応時間を簡略かつ迅速化する事 もできる。
その後は、 増幅産物についてァガロースゲル電気泳動を行い、 臭化工チジゥム、 SYB Green液等により染色し、 そして増幅産物をバンドとして検出することによ り、 各麹菌の存在を判断することができる。 ァガロースゲル電気泳動の代わりに ポリアクリルアミドゲル電気泳動、 あるいはキヤピラリー電気泳動を実施しても よい。 また、 予め蛍光色素等により標識したプライマ一を用いて PCRを行い、 増 幅産物を検出することもできる。 また、 マイクロプレート等の固相に増幅産物を 結合させ、 蛍光又は酵素反応等により検出する等、 電気泳動を必要としない検出 方法も採用することができる。
ハイブリダィゼ一シヨンを行った場合は、 32Pあるいは35 S等の放射性同位体、 あるいはジゴキシゲニン （DIG) 等により標識されたプローブとサンプル DNAとを ハイブリダィズさせ、 オートラジオグラフィー、 イメージアナライザ一等により 検出することができる。
ところで、 麹菌は、 生産目的に応じて様々な突然変異体 （置換、 欠失、 挿入） が存在するが、 通常その変異の詳細は解明されていない。 従って、 ある種のプロ ーブでは、 対応する遺伝子が欠失していることなどにより、 本来検出されるべき 信号が検出できないことが多々存在する。 そこで、 多数のプローブを用いて （冗 長性を上げて） 検出することにより、 突然変異による例外的な検出結果を除去し、 正確な検出を可能にする。 この場合に使用するプローブの数は、 1〜100個、 好ま しくは 2〜5個である。
従って、 本発明の検出方法により得られた検出結果を指標として、 麹菌の生育 状態又は発酵状態の推定が可能となる。 例えば、 胞子発芽初期という検出結果が 得られた場合は、 麹菌の生育状態は発酵生産に不十分であると推定することがで き、 貧栄養条件であるという検出結果が得られた場合は、 麹菌の生育状態は既に 最良の状態を過ぎていると推定することができる。 また、 富栄養条件という検出 結果が得られた場合は、 麹菌の発酵状態は良好であり、 効率的な発酵生産が持続 可能であると推定することがでる。 さらに、 固体培養条件にあるという検出結果 が得られた場合は、 固形物の発酵は十分ではなく、 麹菌の発酵状態を持続させる ことによって、 発酵を進める必要があると推定することができる。
また、 突然変異体に対する測定の場合、 多数のプローブを用いた検出により、 特定の遺伝子の発現だけが異常になっているものが発見されることが多い。 この 結果に基づいて、 該突然変異体の変異に直接的に関与する遺伝子を同定すること が可能であり、 同定された突然変異に基づいて効率的に種を改良する （育種する ) ことが可能となる。 この場合に使用するプローブの数は、 1〜100個、 好ましく は 5〜20個である。 図面の簡単な説明
図 1は蒸米の発酵における麹菌の生育状態のモニターを示す写真である。
図 2は大豆の固体発酵における麹菌体栄養状態のモニターを示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 培養条件の設定
(1)富栄養ライブラリー
麹菌ァスペルギルス ·ォリゼ （Aspergillus oryzae) RIB40株を YPD培地 （1% 酵母エキス， 2%バクト -ペプトン， 0.04% アデニン硫酸， グルコース） で 22時 間培養し、 得られた菌体からグァニジゥムチオシァネートを用いた方法で mRNAを 調製した。 cDNA合成はクロンテック社の Marathon cDNA合成キットの逆転写用プ ライマーを用い、 アダプタ一は Pharmaciaの Directional Cloning Tool Boxの Eco RIアダプターを用いた。 ベクタ一は、 pBluescript SKII+を用い、 上記 cDNAを Eco RIと Notlサイトに 5'→3'の向きに挿入した。 これを大腸菌 XL1- Blueに形質転換し、 アルカリ法でプラスミドを調製し、 M13ユニバーサルプライマーを用いてシーク エンスした。
逆転写用プライマ一
5'-pTTCTAGAATTCAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' (配列番号 6007 : )
(V=A, C or G, N=A， T' G or 0
EcoRIアダプター
5'-AATTCGGCACGAGG-3'
3'-GCCGTGCTCCp-5'
その結果、 表 1の第 1列目に記載の配列番号に示す塩基配列を有する DNAを得 た。
(2)固体培養- 小麦ふすまに、 分生子水に麹菌を懸濁して添加し、 30° (：、 27時間培養して菌体 を回収した。 このときの肉眼観察によって状貌をみたところでは、 気中菌糸がは つきりと認められるが、 分生子形成は始まっていなかった。 菌体を液体窒素中で 粉砕後、 Cathala法によって total RNAを分離した。 mRNA分離は 01 igotex法によつ た。 cDNA合成は、 GIBC0 BRLの superscript cDNA plasmid systemを用いて行った c ベクターはキットに付属の pSPORTlを使用し、 cDNAを Sail- Notlサイ卜に挿入した 形質転換、 プラスミドの調製方法、 シークェンス方法などは富栄養ライブラリー と同じである。
逆転写用プライマー
5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT-3J (配列番号 6008) Sailアダプター
5'-TCGACCCACGCGTCCG-3'
3'-GGGTGCGCAGGCp-5'
その結果、 表 1の第 3列に記載の配列番号に示す塩基配列を有する DNAを得た c
(3)高温培養ライブラリー
YPD培地で， 3rc， 24時間振とう培養し， 菌体から日本ジーン社の IS0GENによ つて全 RNAを抽出したのち， フアルマシア社の IIIRNA精製キットを用いて mRNAを調 製した。 cDNA合成は， フアルマシアの cDNA合成キットと directional cloning to olboxの Notl/Oligo- dT18プライマーを用い、 得られた cDNAを pBluescript SKII+ の EcoRI→NotIサイトに組み込んだ。 形質転換、 プラスミドの調製方法、 シーク エンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、 表 1の第 6列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。
(4) 発芽初期
分生子は、 PD (ポテトデキス卜ロース寒天） 平板で 28°C 8日間培養し、 取得し た。 発芽菌体は、 分生子を SP液体培地 （3.5% 可溶性デンプン、 ポリペプトン、 0.5¾ KH2P04、 0.5% 、 MgS04 · 7H20) で 30°C、 12時間培養して得た。 分生子、 発芽菌体を液体窒素と海砂で破碎し、 Amersham Pharmacia 8^(6(；11社製^^1^^ p Micro mRNA Purification Kitを用いて mRNAの精製を行った。 次いで、 GIBC0 B RL社製の Superscript™ Choice System for cDNASyn thesis Kitを用いて cDNAを 合成した。 ベクターは、 pBluescript SKII +を用い、 EcoRIと Notl サイトに揷入 した。 形質転換、 プラスミドの調製方法、 シークェンス方法などは富栄養ライブ ラリーと同じである。
その結果、 表 1の第 4列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。
(5)アルカリ培養'
pHI Oに調製した CD (Czapek-Dox)寒天培地上に滅菌したセロファンを置き、 A. o ryzae RIB40株の分生子を植菌し、 30°Cで 3日間培養した。 セロファンに生育した 菌体を回収し、 Tot al RNA精製キット（QIAGEN)にて To t al RNAを調製後、 mRNA精製 キット （フアルマシア） にて mRNAを抽出した。 cDNA合成は BRLのキットを用い、 ベクタ一は pSPORTlで Sai lと Not lサイトに挿入した。 形質転換、 プラスミドの調 製方法、 シークェンス方法などは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、 表 1の第 5列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。
(6) マル! ^一ス培養ライブラリー
麹菌を ACM培地 （2% 麦芽エキス， 0. 1%バクト -ペプトン， グルコース） で 3 7°C、 24時間振とう培養し、 菌体を濾過集菌して天然培地 （ バクト -ペプトン， 0. 5% KH2P04, 0. 1¾ NAN03, 0. 05¾ MgS04 - 7H20) で洗浄した。 この菌体を 2 % マ ルトースを含む天然培地で 37で、 4時間更に振とう培養し、 得られた菌体より Oka yama- Berg法に基づき RNA を調製した。 to t al RNA から mRNAを ol igot ex dT30 (Super) (日本ロシュ) を用いて精製し、 cDNA synthes i s ki t (St rat agene) に 準じて cDNA を合成した。 得られた cMA を pBluescript KS (+) EcoR I →X o I サイトに組み込んだ。 形質転換、 プラスミドの調製方法、 シークェンス方法な どは富栄養ライブラリーと同じである。
その結果、 表 1の第 8列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。 (7) 貧栄養 ·
YPD培地 （1% 酵母エキス， バクト -ペプトン， 0. 04% アデニン硫酸， 2% グ ルコース） で 22時間培養し、 菌体をろ過によって集菌し蒸留水で洗浄した。 この 菌体を、 グルコースなどの炭素源を含まない（Czapek- Dox) CD培地に移してさら に 8時間培養し、 得られた菌体から mRNAを調製した。 cDNA合成は富栄養ライブラ リーの場合と同様である。 ライブラリーの cDNAの平均長は、 約 1. 5 kbp弱であつ た。
その結果、 表 1の第 2列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。
(8)低温培養- 脱脂加工大豆 10gに 15mlの水を加えて吸水させ、 焙炒割砕小麦 10gを加えて攪拌 した。 これを 500ml容三角フラスコに入れてバイオシリコ栓をして 30分間オート クレープ処理し、 冷却後 Aspergi l lus oryzae RIB40 を 1 χ ΐθ 5個胞子/ gになるよ うに接種した。 接種後 30°C (気相式） で 34時間、 その後 25°Cで 3時間製麹した。 従って製麹開始から 37時間目の麹の RNAから cDNAを作製した。 なお、 製麹途中 18 時間目と 34時間目に三角フラスコを振って撹拌した。 cDNA合成は、 SMART cDNA L ibrary Cons t ruc t ion Ki t (CL0NTECH)で LD PCRを用いて作製した。 ベクターは λ TiipEx2で SH Iサイトに挿入した。 形質転換、 プラスミドの調製方法、 シークェ ンス方法などは富栄養ライプラリーと同じである。
その結果、 表 1の第 7列目に記載した配列番号に示す塩基配列を有する DNAを 得た。
〔実施例 2〕 麹菌の生育状態の測定
蒸米に麹菌の分生子を付着させ、 水分含量 25 %、 室温 3日間菌糸を生育させた。 この発酵生産過程の 15時間後および 2日後の発酵産物より、 細胞壁溶解酵素とフ ェノール抽出を組合わせた方法で RMを抽出し、 ホルムアルデヒドを含む 1. 2%ァ ガロースゲル電気泳動を行い、 泳動分離された RNAを毛細管現象を利用して二卜 ロセルロース膜上に転写した。 この膜をカゼィンを含む緩衝液でブロッキングし た後、 本発明による固体培養条件および発芽初期培養条件において検出されたそ れぞれの EST配列、 3 9 9 0 (配列番号 3990) および 3 8 4 7 (配列番号 3847) の配列を有する DI G標識 RNAプローブを加えてハイブリダィゼーシヨンを行った。 クェン酸を含む洗浄液で数回洗浄し、 最終的に 0. 2 X SSCで 42^ 15分洗浄した膜 を、 抗- DIG抗体とアルカリフォスファターゼ複合体を含む緩衝液で処理し、 化 学発光試薬 CDP- S t arで発光させ、 光増感装置を備えた CCDカメラで映像化した。 これにより、 3 9 9 0由来のプローブを用いた場合には、 対照実験である富栄 養液体培養条件ではシグナルが検出されず、 蒸米を用いた場合の 15時間後および 2日後では、 いずれもシグナルが検出された。 一方、 3 8 4 7由来のプローブを 用いた場合には、 15時間後は強いシグナルが検出されたが、 2日後にはほぼ完全 に消失した。 （図 1 ) 。
発酵開始後 15時間後は、 分生子からの発芽が旺盛に進んでいる時期であり、 日後は、 発芽が終了して菌糸が活発に成長し、 固体状態での発酵が進む時期であ る。 本発明により、 遺伝子レベルで麹菌の正確な増殖状態を決定することが可能 であった。
〔実施例 3〕 麹菌の生育状態の測定
蒸した大豆に麹菌の菌糸を着生させた後、 水分含量約 30 %とし、 室温で発酵さ せた。 発酵開始から 1日後、 3日後および 5日後に発酵混合物を一部回収し、 濾過 残さから細胞壁溶解酵素とフエノール抽出を組合わせた方法で RNAを抽出した。 この RNAをホルムアルデヒドを含むァガロースゲル電気泳動を行い、 二トロセル ロース膜上に転写した。 この膜を定法通りブロッキングした後、 本発明による貧 栄養培養条件から得られた EST塩基配列 9 8 8 (配列番号 988) を有する DIG標識 プロ一ブをハイブリダィズさせた。
この結果、 培養開始から 1日後、 3日後および 5日後にかけてシグナル強度が増 大し、 特に 5日後にシグナル強度が大きく増大した （図 2 ) 。 一方、 対照として のヒストン遺伝子のシグナル強度はほぼ一定であった。 今回の発行条件では、 3 日〜 4日後にかけて炭水化物由来の炭素源が消費されて減少し、 これにともなつ てプロテアーゼが活発に生産されることが経験的に知られている。 従って、 本発 明を用いることによって、 これまで経験的に求められてきたプ口テアーゼの発現 状態を、 遺伝子的に求めることが可能である。 本明細書は、 本願優先権の基礎となる特願 2001- 98371の出願内容を包含するも のである。 また、 本明細書に引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 その 全文を参照により本明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 翹菌遺伝子発現の検出方法、 及び麹菌発酵条件の特異的測定用 DNAが提供される。 従来の方法では発酵産物の色、 香り、 pH、 水分含量などの 2次 的な要素で測定していたが、 本発明の方法により、 麹菌の実際の生育状態 （発酵 状態） を直接的かつ定量的に測定することができる点で有用である。 また、 本発 明は、 麹菌での発酵生産において発現するほぼ全ての遺伝子を網羅しており、 標 的とする遺伝子と似た配列を有する他の遺伝子の存在があらかじめ予測できるば かりでなく、 標的以外の遺伝子には存在しない塩基配列を有するプローブあるい はプライマ一を用いることによって、 標的遺伝子と似た配列を有する他の遺伝子 が大量に発現していた場合であっても、 標的遺伝子の発現量を正確に測定するこ とができる点で有用である。 配列表フリーテキス卜
配列番号 6007：合成 DNA
配列番号 6008：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲 . 以下の（a)又は（b)の DNA。
(a) 配列番号 1〜6006のいずれかに示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 1〜6006のいずれかに示される塩基配列を含む DNAとストリンジ ェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培 養、 発芽初期培養、 アルカリ培養、 高温培養、 低温培養及びマルトース培養 からなる群から選択される少なくとも 1つの培養条件で糸状菌を培養したとき に発現することができる DNA
. 富栄養培養、 貧栄養培養、 固体培養、 発芽初期培養、 アルカリ培養、 高温培 養、 低温培養及びマルトース培養からなる群から選択される少なくとも 1つの 培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNA。
. 富栄養培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1の第 1列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むも のである請求項 2記載の DNA。
. 貧栄養培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1の第 2列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むも のである請求項 2記載の DNA。
. 固体培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1 の第 3列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むもの である請求項 2記載の DNA。
. 発芽初期培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1の第 4列目に記載され'た配列番号のいずれかに示される塩基配列を含む ものである請求項 2記載の DNA。
. アルカリ培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1の第 5列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含む ものである請求項 2記載の DNA。
. 高温培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1 の第 6列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むもの である請求項 2記載の DNA。
. 低温培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる DNAが、 表 1 の第 7列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を含むもの である請求項 2記載の MA。
0 . マルト一ス培養条件で糸状菌を培養したときに発現することができる MA が、 表 1の第 8列目に記載された配列番号のいずれかに示される塩基配列を 含むものである請求項 2記載の DNA。
1 . 糸状菌がァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 フミコーラ属、 トリコデル マ属、 ムコール属又はフザリゥム属に属する微生物である請求項 1〜10のい ずれかに記載の DNA。
2 . ァスペルギルス属に属する微生物が麹菌である請求項 1 1記載の DNA。
3 . 麹菌がァスペルギルス ·ォリゼである請求項 12記載の DNA。
. 請求項 1〜10に記載の DNAから選ばれる複数の DNAのうち全部又は一部の領 域から調製されるヌクレオチド配列からなる群から選択される、 少なくとも
2個の糸状菌遺伝子増幅用プライマーセット。
5 . 請求項 1〜10に記載の DNAから選ばれる複数の DNAのうち全部又は一部の領 域から調製されるヌクレオチド配列を含む、 糸状菌遺伝子検出用プローブ。6 . 糸状菌から抽出した RNAから cDNAを合成し、 請求項 14記載のプライマーセ ットを用いて該 cDNAを増幅し、 得られる増幅産物から糸状菌遺伝子を検出す ることを特徴とする糸状菌の検出方法。
7 . 糸状菌から抽出された RNAに請求項 15記載のプローブをハイブリダィズさ せ、 得られる産物から糸状菌遺伝子を検出することを特徴とする糸状菌の検 出方法。
8 . 請求項 16又は Π記載の検出方法により得られた検出結果を指標として、 糸 状菌の生育状態又は発酵機能を推定する方法。
9 . 糸状菌がァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 フミコーラ属、 トリコデル マ属、 ムコール属又はフザリゥム属に属する微生物である請求項 16〜18のい ずれかに記載の方法。
0. ァスペルギルス属に属する微生物が麹菌である請求項 19記載の方法。 1. 麹菌がァスペルギルス ·ォリゼである請求項 20記載の方法。
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