WO2002059361A1 - Empleo del gen slug o de sus productos de transcripcion o expresion en la deteccion y/o tratamiento de celulas cancerosas - Google Patents

Empleo del gen slug o de sus productos de transcripcion o expresion en la deteccion y/o tratamiento de celulas cancerosas Download PDF

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WO2002059361A1
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cells
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Isidro Sánchez García
Alberto Orfao De Matos
Jesús PEREZ LOSADA
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Universidad De Salamanca (O.T.R.I.)
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to the use of the Slug gene to detect the presence of cancer cells in a biological sample based on the aberrant expression of said Slug gene, or of its transcription or expression products.
  • the invention also relates to the use of the Slug gene, or its transcription or expression products (RNA or protein), in the treatment of cancer.
  • Possible applications derived from the above-mentioned discovery include the possibility of using the Slug gene, or its transcription or expression products, to detect tumor invasiveness and / or as a therapeutic target in the treatment of cancer.
  • Figure 2 shows the expression of SLUG mRNA in normal mouse tissues.
  • Figure 2A shows the result of Northern blot analysis of total RNA isolated from various mouse tissues [lung, SP (peripheral blood), heart, testis, brain, intestine, kidney, muscle, liver, spleen, thymus and MO (bone marrow)], hybridized with a Slug cDNA probe and then purified and rehybridized with a ⁇ -actin probe. The mobility of 28S and 18S RNAs is indicated. (SP, peripheral blood; MO, bone marrow).
  • RNAs were evaluated for the non-leukemic hematopoietic cell line 707 (band 1), for the myeloid leukemic cell line U937 (band 2), for the leukemic cell lines ALL-SIL (band 3) and KOPTI-KI ( lane 4), for the pre-B 697 leukemic cell line (lane 5), for samples of patients with t (9; 22) (bands 6 to 8) and for the human leukemic cell lines positive for t (9; 22) K562 (band 9), TOM-1 (band 190) and Nalm-1 (band 11).
  • FIG. 4C illustrates that cell death is accompanied by the appearance of the DNA ladder due to inter-nucleus rupture after IL-3 deprivation.
  • Low molecular weight DNA was isolated 24 hours after IL-3 deprivation from Ba / F3 + Slug (band 1), Ba / F3 + p210 (band 2), Ba / F3 + pl90 (band 3) cells and from control Ba / F3 cells (band 4).
  • the DNA was labeled terminal, resolved by electrophoresis on a 2% agarose gel and visualized by autoradiography.
  • Figure 5 illustrates the repression of SLUG mRNA in
  • Figure 6 shows the requirements of Slug in the tumorigenicity of Ba / F3 cells expressing BCR-ABL.
  • Initial Ba / F3 cells expressing BCR-ABL oncogenes grew as tumors in nude mice (REF).
  • REF nude mice
  • tumor formation was observed five days after the injection of cell lines expressing BCR-ABL.
  • Ba / F3 cells expressing senseless BCR-ABL and Slug are much less tumorigenic.
  • Figure 7 illustrates the effect of Slug on the development of tumors by BCR-ABL cells.
  • Figure 7A shows the result of a macroscopic analysis of tumors induced by Ba / F3 + pl90 cells
  • Figures 7B and 7C show the histological appearance of tumors induced in nude mice.
  • the hematoxylin-eosin stained section of the mouse tumor developed after the injection of Ba / F3 + pl90 cells ( Figure 7B) compared to the section of the mouse tumor developed after the injection of Ba / F3 + pl90 cells in the that the expression of Slug had been specifically suppressed (Figure 7C).
  • Ba / F3 + pl90 cells that express Slugh disobey the social order of organ boundaries and migrate as individual cells producing metastases in different regions. Similar results were observed in multiple sections of the two tumors.
  • the images in Figures 7B and 7C are enlarged to 40 magnifications.
  • Figure 8 is a representation illustrating the model of Slug's role in cancer development.
  • Figure 8A it is shown that in the hematopoietic system, normal, non-compromised progenitor cells with the capacity for self-renewal differentiate into mature cells. During this transition, Slug's expression is negatively regulated. These normal non-compromised progenitor cells are responsible for signals from the environment that regulate the number of mature cells produced and limit the self-renewal of immature cells. When these non-compromised normal progenitor cells migrate in physiological situations, the Slug gene could promote
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of the Slug gene and / or its transcription or expression products (RNA or protein), when compared with normal cells, which allows establishing a method for the detection of said malignant cells based on the aberrant expression of the Slug gene or its transcription or expression products (RNA or protein).
  • test sample refers to a biological sample of a vertebrate suspected of having mesenchymal or cancerous tumor cells.
  • control sample includes (i) biological samples from vertebrates that do not have mesenchymal or cancerous tumor cells, and (ii) biological samples from vertebrates that have cells
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) mesenchymal or cancerous tumors in order to obtain information regarding the prognosis of the disease among vertebrates that contain these cells.
  • RNA or protein transcription or expression products
  • Aberrant gene expression includes gene amplification, gene overexpression and gene expression in cells that do not normally express it.
  • the invention provides a method for detecting the presence of cancer cells in a test sample, based on the aberrant expression of the Slug gene, comprising:
  • the method for the detection of cancer cells based on the aberrant expression of the Slug gene provided by this invention is applied to a human being suspected of having said cells.
  • the cDNA sequence of the human Slug gene as well as the amino acid sequence deduced from the cDNA have been described by Nieto et al. (Nieto et al., 1994, cited supra).
  • the cancer cells to be detected are mesenchymal tumor cells, for example, leukemia or sarcomas.
  • the test sample is obtained from a biological sample of the vertebrate to be tested.
  • Said biological sample can be obtained by any conventional method, for example, by tissue biopsy or blood collection.
  • Aberrant expression of the Slug gene in mesenchymal or cancerous tumor cells includes gene amplification
  • the expression of the Slug gene can be evaluated by any appropriate conventional method, for example, by determining the level of mRNA corresponding to the Slug gene (SLUG mRNA), or by determining the number of copies of Slug gene produced.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) it allows to measure or estimate qualitatively or quantitatively the level of mRNA that can be translated into the SLUG protein in the cells of a test sample either directly or relatively by comparing it with the level of SLUG mRNA in the cells of a control sample.
  • "determining the number of copies of the Slug gene produced” includes any method that allows to measure or estimate qualitatively or quantitatively the number of copies produced of the Slug gene in cells of a test sample either directly or relatively compared to the number of copies of the Slug gene produced in cells of a control sample.
  • the level of SLUG mRNA or the number of copies of the Slug gene produced in the cells of the test sample is measured or estimated and compared to the level of SLUG mRNA or the number of copies of the gene. Slug produced in the control sample cells.
  • the level of SLUG mRNA can be determined by any appropriate conventional method, for example, by Northern blot analysis (Harada et al., Cell 63: 303-312 (1990)), mapping with the SI nuclease (Fujita et al. , Cell 49: 357-367 (1987)), polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, US 4,683,202, US 4,965,188), back transcription in combination with the chain reaction of the polymerase (RT-PCR) (Makino et al., Technique 2: 295-301 (1990)), hybridization techniques, microarrays (Wooster R., Trends in Genetics 16: 327-329 (2000)], etc.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR back transcription in combination with the chain reaction of the polymerase
  • the presence of an aberrant expression of the Slug gene in the test sample when compared with the expression of the Slug gene in the control sample, is indicative of the presence of mesenchymal or cancerous tumor cells in said sample. of testing .
  • the invention also provides a method for detecting the presence of cancer cells in a test sample, based on the expression of the Slug gene expression product (SLUG protein), comprising:
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) b) evaluate the expression of the SLUG protein in cells of said test sample; Y
  • the cancer cells to be detected are mesenchymal tumor cells, for example, leukemia or sarcomas.
  • test sample is obtained from a biological sample of the vertebrate to be tested, for example, a human being, by any conventional method, for example, by tissue biopsy or extraction of blood.
  • the expression of the SLUG protein can be evaluated by any appropriate conventional method, for example, by techniques based on the use of antibodies, techniques based on in vivo imaging diagnosis, flow cytometry, proteomics, etc.
  • the expression of the SLUG protein in tissues can be studied using classical immuno-histological methods, in which specific recognition is provided by an anti-SLUG antibody while the detection system can use labeled secondary antibodies. with appropriate markers.
  • SLUG protein in tissues can also be studied by a Western blot or dot / slot assay.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)), by immunoassays, such as ELISA (assay enzyme-linked immunoabsorbent) or R ⁇ A (radioimmunoassay).
  • ELISA assay enzyme-linked immunoabsorbent
  • R ⁇ A radioimmunoassay
  • the expression of the SLUG protein can be detected in vivo by diagnostic imaging techniques by using anti-SLUG antibodies bound to appropriate markers, for example, X-ray detectable markers, nuclear magnetic resonance imaging (NMR), etc.
  • NMR nuclear magnetic resonance imaging
  • the anti-SLUG antibodies that can be used in the method provided by this invention can be antibodies against the intact SLUG protein or against an antigen fragment thereof, optionally conjugated to a carrier.
  • the antibodies can be polyclonal or, preferably, monoclonal, which can be obtained by hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)).
  • antibody fragments can be used, for example Fab, F (ab ') 2 , etc.
  • the aberrant expression of the SLUG protein in cells of the test sample when compared with the expression of the SLUG protein in cells of the control sample, is indicative of the presence of cancer cells in said sample. of testing.
  • the invention relates to the use
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of the Slug gene or its transcription or expression products in the treatment of cancer, in particular in the treatment of pathologies related to the presence of cancer cells, such as mesenchymal tumor cells, for example, leukemia and sarcomas.
  • the use of the Slug gene or its transcription or expression products in the treatment of cancer includes any method that qualitatively or quantitatively interferes with the Slug gene, the level of mRNA that can be translated in the SLUG protein or with the SLUG protein itself.
  • the invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an antibody that recognizes the SLUG protein, or a fragment thereof, or a compound that interferes with the function of Slug at the DNA level, or RNA level or protein level (SLUG), optionally together with pharmaceutically acceptable excipients.
  • the anti-SLUG antibodies that can be used in the preparation of the pharmaceutical composition provided by this invention can be antibodies against the intact SLUG protein or against an antigenic fragment thereof, optionally conjugated to a carrier.
  • the antibodies can be polyclonal or, preferably, monoclonal, which can be obtained by hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)).
  • antibody fragments can be used, for example Fab, F (ab ') 2 , etc., which can be obtained by conventional methods.
  • the compound that interferes with the function of Slug both at the level of DNA and of RNA or protein (SLUG) can be any compound, or mixture of compounds, that prevents the expression of the Slug gene, or that inactivates the SLUG mRNA that is generated , for example, by antisense oligonucleotides or ribozymes, or that inactivates the SLUG protein, for example,
  • the invention also relates to a method for in vitro screening of antitumor agents based on the regulation of the expression of the Slug gene which comprises (i) developing a cellular system that, under certain conditions, expresses the Slug gene, (ii ) contacting said cellular system with the compound to be tested, and (iii) evaluating the expression of the Slug gene, so that if the Slug gene is not expressed, the test compound is a potential antitumor agent.
  • Cell lines used include Ba / F3 cells
  • BCR-ABLP 190 Ba / F3 + pl90
  • BCR-ABLP 210 Ba / F3 + p210
  • the resulting mixture was amplified by PCR with oligonucleotides R-24 [SEC. ID. N °: 1] and the adapters were cleaved with Dpn II. Then, a second pair of adapters was attached: (J-24) [SEC. ID. N °: 3] and (J-12) [SEC. ID. N °: 4] to the amplified fragments from Ba / F3 + pl90 and Ba / F3 + p210 (tester) cells and hybridized with the cDNA fragments amplified with R-24 [SEC. ID. N °: 1] from Ba / F3 cells (inductor) with a ratio of 1: 100 for 20 hours.
  • the hybridization mixture was used as a template for PCR-based amplification.
  • a second subtraction round was performed by removing the adapters J [SEC. ID. N °: 3 and SEC. ID. N °: 4] of an aliquot of the product of the first round of PCR, joining a third pair of oligonucleotide adapters: (N-24) [SEC. ID. N °: 5] and (N-12) [SEC. ID. N °: 6] and hybridizing with
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) inductive amplicons at a ratio of 1: 1000.
  • the PCR products were separated on 2.0% agarose gels and the individual bands were subcloned and examined by Northern blot analysis for differential expression.
  • Mouse Slug AD ⁇ c was cloned by RT-PCR using the advance primer [SEC. ID. ⁇ °: 13] and the reverse primer [SEC. ID. ⁇ °: 14] (GenBank accession number U79550).
  • the mouse Slugh cDNA was cloned in both the sense orientation and the nonsense orientation in the pEF-BOS vector (called BOS-slug and BOS-antislug, respectively), which contained sequences of the EFl- ⁇ promoter followed by a Polylinker region bound to the poly (A) adenylation signal of the human G-CSF cDNA, as described (Mizushima and Nagata, Nucleic Acid Res. 18: 4322 (1990)).
  • the Combi-pl90 vector was obtained by replacing the luciferase cDNA of the Combi-tTA plasmid (Schultze et al., Nature Biotechnology 14: 499-503 (1996)) with the BCR-ABLP 190 cDNA. The authenticity of the constructions was confirmed by DNA sequencing.
  • Cellular transfection Ba / F3 cells were transfected by electroporation (960 ⁇ F, 220 V) with 20 ⁇ g of Combi-pl90, respectively, together with 1 ⁇ g of MCl-neo expression vector. In the cells
  • the specificity of the activation of the Slug gene was analyzed by hybridization analysis of Northern filters in Ba / F3 + Combipl90 cells. After two days in culture, in the presence or absence of tetracycline, the expression of SLUG was determined. As shown in Figure IB, the expression of SLUG was rapidly reduced coinciding with the reduction of the mRNA expression of BCR-ABLpl90.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Slug is present in cell lines of patients with leukemia with other chromosomal abnormalities
  • SLUG is a member of the Snail family of proteins involved in mesoderm formation (Nieto et al., 1994 cited above) and its expression is quite promiscuous (Figure 2), the expression of the Slug gene in other mesenchymal tumors was subsequently analyzed .
  • Examples of RNA from four other leukemia cell lines that lack t (9; 22), including early lineage 697 (Figure 3, lane 5), myeloid U937 (Figure 3, lane 2) are shown in Figure 3. and the ALL-SIL T cell lines (Figure 3, band 3) and KOPTI-KI (Figure 2, band 4).
  • Figure 3 expression of the Slug gene was demonstrated in all leukemic cell lines. In this sense, recent discoveries show that SLUG is also expressed in leukemic t cells (17; 19) (Inukai et al., Molecular Cell 4: 343-352
  • the Ba / F3 cell line transduced with vectors encoding the BCR-ABL fusion protein was also used (Sánchez-Garc ⁇ a and Grütz, 1995, cited supra).
  • the expression of BCR-ABL in Ba / F3 confers independent growth of cytokines and blocks apoptosis (Daley and Baltimore, 1988; Sánchez-Garc ⁇ a and Grütz, 1995, cited
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of Slugh were compared with those present in the non-transfected control cells ( Figure 5B).
  • Figure 5A In cells transfected with BOS-antislug, senseless Slugh was detected and in Ba / F3 cells expressing BCR-ABL transfected with BOS-antislug, the level of BCR-ABL was not affected ( Figure 5A).
  • SLUG mRNA was not detected in cells transfected with nonsense Slugh, although it was present in Ba / F3-pl90 and Ba / F3-p210 cells ( Figure 5B).
  • the consequences of suppressing Slugh expression were evaluated by examining the differentiation program imposed by BCR-ABL oncogenes in Ba / F3 cells and in vivo tumorigenicity of the various cell lines by injection in nude mice.
  • SUBSTITUTE SHEET transition from an in if you to an invasive tumor, allowing the migration of tumor cells as individual cells.
  • Metastasis and tumorigenicity can have the same genetic control Leukemic conversion of tumor target cells (Cobaleda et al., 2000; Sánchez-Garc ⁇ a, 2000, cited above) in cells with an autonomous growth state implies that certain specific genes have to be activated to decouple proliferation / differentiation control and generate intracellular signals that can replace the requirements of growth factors during invasion and cell dissemination.
  • tumor cells disobey the social order of organ boundaries and enter foreign tissues. Only during the transition from an in if tumor to an invasive tumor, the tumor cells penetrate the epithelial basement membrane and enter the underlying interstitial stroma interacting with the stromatic cells.
  • SLUG is a member of the Snail family of "zinc fingers" transcription factors that share an evolutionary role in mesoderm formation in invertebrates and vertebrates (Nieto et al., 1994, cited above).
  • Slug is expressed by ectodermal epithelial cells during their transition to mesenchymal cells.
  • Chicken embryos treated with nonsense oligonucleotides directed against Slug show inappropriate mesoderm formation related to defects in cell migration in transitional compartments from epithelial to mesenchymal (Nieto et al., 1994, cited above).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of Snail (Cano et al., Nature Cell Biology 2: 76-83 (2000)), which allows early mesoderm migration in the form of epithelial cells. Consequently, mice without Slug develop normally (Jiang et al., Development Biology 198: 277-285 (1998)).
  • the Snail gene has been shown to activate EMT associated with the acquisition of the invasive phenotype in solid epithelial tumors (Batlle et al., Nature Cell Biology 2: 84-89 (2000); Cano et al-, 2000 cited above) , where it contributes to the first event of the metastatic process.
  • EMT induction appears to be a function specifically associated with the Snail gene in the mouse (Cano et al., 2000 cited above).
  • Slug is an important regulator of invasion capacity during the progression of mesenchymal tumors in which EMTs are not required. This idea could be extended to the role of Slug in the acquisition by the mesenchymal stem cells of the ability to migrate.
  • the inventors' experiments indicate that, in vivo, Slug is not expressed in the peripheral blood of normal mice, but is present in the peripheral blood of BCR-ABL transgenic mice with leukemia, defining an undifferentiated phenotype , pluripotent and migratory in mesenchymal cells.
  • the presence of Slug is required at certain stages of normal development for proper expansion and for the survival of early hematopoietic cells (Figure 8).

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Abstract

La expresión aberrante del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión permite detectar la presencia de células cancerosas, en particular, células tumorales mesenquimales, en una muestra biológica sospechosa de contener dichas células malignas. El gen Slug, o sus productos de transcripción o expresión pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.

Description

EMPLEO DEL GEN Slug, O DE SUS PRODUCTOS DE TRANSCRIPCIÓN O EXPRESIÓN, EN LA DETECCIÓN Y/O TRATAMIENTO DE CÉLULAS CANCEROSAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al empleo del gen Slug para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra biológica basado en la expresión aberrante de dicho gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión. La invención también se refiere al empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) , en el tratamiento del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los recientes avances en el tratamiento del cáncer han puesto de manifiesto que para planificar un tratamiento adecuado del cáncer y determinar un pronóstico preciso es necesario disponer de métodos sensibles para detectar la existencia de cáncer, el tipo de cáncer y el estadio del mismo con el fin de conocer su localización concreta y su posible extensión a otros tejidos. Un diagnóstico preciso del cáncer puede contribuir a reducir el número de fallecimientos por esta causa y a mejorar la calidad de vida de los pacientes ya que permite seleccionar el tratamiento más adecuado (quimioterapia, resección quirúrgica, etc.) y reducir las incomodidades al paciente al definir el punto final del tratamiento terapéutico.
Los marcadores de pronóstico proporcionan información importante para el tratamiento y desarrollo del cáncer en los pacientes. De hecho, para la aplicación de terapia sistémica adyuvante en el tratamiento de algunos tipos de cánceres primarios, la identificación de los pacientes de alto y bajo riesgo constituye uno de los hitos principales. Se conocen diversos marcadores de pronóstico, tanto clásicos, por ejemplo, tamaño del tumor, estado del nodulo linfático,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) histopatología, estado del receptor de esferoides, como de segunda generación, por ejemplo, velocidad de proliferación, ploidía del ADN, oncogenes, receptores de los factores de crecimiento y algunas glícoproteínas, que resultan muy útiles para tomar decisiones terapéuticas (McGuire, .L., Pronostic Factors for Recurrence and Survival, en "Educational Booklet American Society of Clinical Oncology" , 25th Annual Meeting, 89-92 (1989); Contesso et al., Eur. J. Clin. Oncol . , 25:403- 409 (1989) ) . Aunque ninguno de los marcadores de pronóstico conocidos satisface completamente el objetivo de distinguir entre pacientes de alto y bajo riesgo, la combinación de distintos marcadores puede mejorar la predicción del pronóstico de un paciente, por lo que continúa la búsqueda de nuevos marcadores de pronóstico que puedan añadirse a los existentes actualmente para colaborar en el pronóstico del cáncer, de su progresión y de la enfermedad residual tras tratamiento.
Por otra parte, la mayoría de los métodos usados para la detección de células cancerosas tienen una sensibilidad muy limitada, aunque los métodos moleculares basados en el análisis de ácidos nucleicos han mejorado dicha sensibilidad (Burchill S.A. & Selby P.J., J. Pathol . 190:6-14 (2000)). No obstante, ninguna de estas estrategias permite distinguir una célula tumoral invasiva de una célula tumoral no invasiva. El gen Slug es un gen presente en los vertebrados que codifica un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" (SLUG) implicado en las transiciones epiteliales- mesenquimales (Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)).
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta, en general, con el problema de encontrar un marcador para la detección de células cancerosas, tales como las células tumorales mesenquimales .
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han descubierto, sorprendentemente, que la
HOÜA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) expresión del gen Slug está relacionada con la presencia de células cancerosas, tales como las células tumorales mesenquimales, ya que han podido observar que dichas células malignas expresan niveles significativamente elevados del gen Slug y/o de sus productos de transcripción o expresión cuando se comparan con células normales. Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el producto del gen SLUG se expresa en células de muestras de tej idos que presentan células tumorales mesenquimales pero no se expresa, o lo hace a niveles prácticamente inapreciables, en muestras de tejidos normales. En una realización particular, los inventores han observado que el gen Slug regula la capacidad dise inativa de las células leucémicas con BCR-ABL, lo que indica que dicho gen Slug juega un papel en la invasión tumoral .
Entre las posibles aplicaciones derivadas del descubrimiento arriba mencionado se incluyen la posibilidad de utilizar el gen Slug, o sus productos de transcripción o expresión, para detectar la invasividad tumoral y/o como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer.
Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo basado en la evaluación de la expresión del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) .
Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión, como diana terapéutica para el tratamiento del cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 ilustra la regulación positiva del gen Slug por BCR-ABL. La Figura 1A muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de células Ba/F3 (banda 1) , Ba/F3+pl90 (banda 2) y Ba/F3+p210
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (banda 3) . Se realizaron experimentos de control en células Ba/F3 transfectadas con un vector vacío. La membrana de nylon se híbrido con un fragmento de ADNc de SLUG y después se purificó y rehibridó con una sonda de β-actina. La Figura IB muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern del ARN total aislado a partir de células Ba/F3+Combipl90 desarrolladas en ausencia (banda 1) o presencia de tetraciclina (banda 2) , Ba/F3+pl90 (banda 2) y células Ba/F3 de control (banda 3) . La mancha de transferencia se híbrido con fragmentos de ADNc de SLUG, Bcl- 2 y myc, y después se purificó y rehibridó con una sonda de β-actina.
La Figura 2 muestra la expresión de ARNm de SLUG en tej idos de ratón normal . La Figura 2A muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de diversos tejidos de ratón [pulmón, SP (sangre periférica) , corazón, testículo, cerebro, intestino, riñon, músculo, hígado, bazo, timo y MO (médula ósea) ] , hibridado con una sonda de ADNc de Slug y después purificado y rehibridado con una sonda de β-actina. Se indica la movilidad de los ARN 28S y 18S. (SP, sangre periférica; MO, médula ósea) . La Figura 2B ilustra la expresión del ARNm de SLUG en ratones transgénicos BCR-ABLP190 y BCR-ABLP210 y recoge los resultados del análisis de transferencia de Northern del ARN total aislado a partir de sangre periférica de ratones de control (banda 1) , y de ratones transgénicos BCR-ABLP190 (bandas 2 a 4) y BCR-ABLP210 (bandas 5 a 6) , hibridado con una sonda de ADNc y después purificado y rehibridado con una sonda de β-actina. Se indica la movilidad de los ARN 28S y 18S.
La Figura 3 ilustra que el SLUG endógeno está presente en líneas de células invasivas humanas. Cada ARN se transcribió mediante retrotranscripción (RT) y los productos de PCR se transfirieron a una membrana de nylon y se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) analizaron por hibridación con sondas oligonucleotídicas internas marcadas, terminalmente específicas para cada gen. Se evaluaron los ARN para la línea de células hematopoyéticas no leucémicas 707 (banda 1) , para la línea de células leucémicas mieloides U937 (banda 2) , para las líneas leucémicas de células T ALL-SIL (banda 3) y KOPTI-KI (banda 4), para la línea de células leucémicas pre-B 697 (banda 5) , para muestras de pacientes con t(9;22) (bandas 6 a 8) y para las líneas de células leucémicas humanas positivas para t(9;22) K562 (banda 9) , TOM-1 (banda 190) y Nalm-1 (banda 11) .
La Figura 4 ilustra el efecto del gen Slug sobre la supervivencia de células Ba/F3 en ausencia de factor de crecimiento. La Figura 4A muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de células Ba/F3 transfectadas con ADNc de SLUG de ratón (banda 1) y células Ba/F3 de control (banda 2) . La membrana de nylon se híbrido con un fragmento de ADNc de SLUG y después se purificó y rehibridó con una sonda de β-actina. La Figura 4B es una gráfica que ilustra la supervivencia de células Ba/F3 que expresan la proteína SLUG en ausencia de IL-3. Las células que crecían exponencialmente en medio suplementado con IL-3 se ajustaron a 5 x 105 células/ml en el día 0 y se cultivaron después de la eliminación de IL-3. Se muestra el número de células viables para las células Ba/F3 transfectadas con BCR-ABL y con SLUG en ausencia de IL-3. La Figura 4C ilustra que la muerte celular va acompañada por aparición de la escalera de ADN por rotura inter-nucleoso al después de la deprivación de IL-3. Se aisló ADN de bajo peso molecular 24 horas después de la deprivación de IL-3 a partir de células Ba/F3+Slug (banda 1), Ba/F3+p210 (banda 2), Ba/F3+pl90 (banda 3) y a partir de células Ba/F3 de control (banda 4) . El ADN se marcó terminalmente, se resolvió por electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se visualizó por autorradiografía . La Figura 5 ilustra la represión del ARNm de SLUG en
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) células Ba/F3 que expresan BCR-ABL con un ADNc anti-sentido frente a SLUG. La Figura 5A muestra los resultados del aislamiento del ARN total a partir de células Ba/F3+p210 (banda 1) y Ba/F3+pl90 (banda 2) transfectadas con un vector que expresaba el gen Slugh (gen Slug de ratón) sin sentido. El ARN celular se híbrido con una sonda de ADNc de Slugh de ratón. El filtro se desnudó y se rehibridó con ABL y β- actina. La Figura 5B muestra los resultados del análisis de hibridación de filtro de Northern de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL transfectadas (banda 1, Ba/F3+p210+Aslug; banda 3, Ba/F3+pl90+Aslug) y no transfectadas (bandas 2, Ba/F3+p210; banda 4, Ba/F3+pl90) . Como sonda, se usó un oligonucleótido de Slugh sin sentido que comprende las primeras 49 bases de la secuencia codificante del ADNc de Slugh de ratón. La Figura 5C ilustra que la diferenciación linfoide y mieloide específica de células B inducida en células Ba/F3 por oncogenes BCR-ABLP190 y BCR-ABLP210 , respectivamente, no se ve influenciada por la supresión de Slug. En dicha Figura 5C se muestran los perfiles de expresión de células Ba/F3+pl90 (panel izquierdo superior) Ba/F3+pl90+slug sin sentido (panel derecho superior) , Ba/F3+p210 (panel izquierdo inferior) y Ba/F3+p210+Slug sin sentido (panel derecho inferior) . Las células se tiñeron con anticuerpos monoclonales B220 (marcador específico de células B) y Gr-1 (marcador específico de mieloides) y se analizaron por citometría de flujo.
La Figura 6 recoge los requerimientos de Slug en la tumorigenicidad de células Ba/F3 que expresan BCR-ABL. Las células Ba/F3 iniciales que expresaban oncogenes BCR-ABL crecieron como tumores en ratones desnudos (REF) . Análogamente, se descubrió que la formación de tumores se observaba ya a los cinco días después de la inyección de las líneas de células que expresaban BCR-ABL. A diferencia de estos controles, las células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL y Slug sin sentido son mucho menos tumorigénicas . Los tumores
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) se escindieron para realizar un análisis macroscópico en el día 20 después de la inyección celular. En promedio, el peso de los tumores encontrados en los ratones a los que se inyectaron células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL era dos veces mayor que el de los tumores inducidos por células que expresaban BCR-ABL y la construcción Slug sin sentido.
La Figura 7 ilustra el efecto de Slug en el desarrollo de tumores por células BCR-ABL. La Figura 7A muestra el resultado de un análisis macroscópico de tumores inducidos por células Ba/F3+pl90, mientras que las Figuras 7B y 7C muestran el aspecto histológico de los tumores inducidos en ratones desnudos. La sección teñida con hematoxilina-eosina del tumor de ratón desarrollado después de la inyección de células Ba/F3+pl90 (Figura 7B) en comparación con la sección del tumor del ratón desarrollado después de la inyección de células Ba/F3+pl90 en las que se había suprimido específicamente la expresión de Slug (Figura 7C) . Las células Ba/F3+pl90 que expresan Slugh desobedecen el orden social de límites de órganos y migran como células individuales produciendo metástasis en diferentes regiones . Se observaron resultados similares en secciones múltiples de los dos tumores. Las imágenes de las Figuras 7B y 7C están ampliadas a 40 aumentos.
La Figura 8 es una representación que ilustra el modelo del papel de Slug en el desarrollo del cáncer. En la Figura 8A se muestra que en el sistema hematopoyético, las células progenitoras normales, no comprometidas, con capacidad de auto-renovación se diferencian en células maduras. Durante esta transición, la expresión de Slug está regulada negativamente . Estas células progenitoras normales no comprometidas son responsables de señales del medio que regulan el número de células maduras producidas y limitan la auto renovación de las células inmaduras. Cuando en situaciones fisiológicas estas células progenitoras normales no comprometidas migran, el gen Slug podría promover la
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) supervivencia permitiéndolas realizar su función. Si esto no se consigue en un periodo de tiempo específico, sufrirían apoptosis, ya que se han visto privadas de las señales externas necesarias. En la Figura 8B se ilustra la situación en caso de leucemogénesis; en este caso, la célula diana en la que existe la anormalidad cromosómica es un progenitor no comprometido (Cobaleda et al., Blood 95:1007-1113 (2000); Sánchez-García et al., Current Genomics, 1:71-80 (2000)). Como resultado de ésto, se bloquea la diferenciación de la célula diana, pero la inhibición de la diferenciación no es suficiente para la transformación, porque la supervivencia y la proliferación de las células diana se restringiría a un microentorno particular. Así pues, tienen que existir otros cambios genéticos que permitan el crecimiento de las células fuera de su entorno normal, además de mutaciones que bloqueen la diferenciación. Los oncogenes de fusión creados como resultado de anormalidades cromosómicas asociadas con tumores mesenquimales (tanto leucemias como tumores sólidos) bloquean la diferenciación y tienen la capacidad de activar genes diana tales como Slug que promueven la supervivencia (con independencia de las señales externas requeridas) y la migración de las células diana defectuosas en diferentes entornos . Estos datos refuerzan la idea de que la transformación puede producirse como resultado de la creación/activación de un solo oncogen.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere, en general, al empleo del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en la detección y/o tratamiento de células cancerosas. El gen Slug codifica un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" (SLUG) implicado en las transiciones epiteliales-mesenquimales. Ahora se ha descubierto que células cancerosas, en particular, células tumorales mesenquimales, expresan niveles significativamente elevados
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) del gen Slug y/o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) , cuando se comparan con células normales, lo que permite establecer un método para la detección de dichas células malignas basadas en la expresión aberrante del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) .
1. Detección de células cancerosas En un primer aspecto, la invención proporciona un método para la detección de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado en la evaluación de la expresión aberrante del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) , en comparación con la expresión de dicho gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en una muestra de control . Este método puede ser aplicado a cualquier vertebrado sospechoso de tener dichas células, en particular, a un mamífero, por ejemplo, un ser humano .
El método proporcionado por esta invención es adecuado para la detección de células cancerosas que expresen dicho gen Slug o sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) , tales como células tumorales mesenquimales, por ejemplo, leucemias y sarcomas, y, por tanto, tiene utilidad en el diagnóstico de la enfermedad causada por dichas células, así como en la evaluación de su progresión y en la determinación de enfermedad residual tras tratamiento, aspectos esenciales en el tratamiento de dicha enfermedad.
En el sentido utilizado en esta descripción el término "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células tumorales mesenquimales o cancerosas .
El término "muestra de control" , tal como aquí se utiliza incluye (i) muestras biológicas de vertebrados que no tienen células tumorales mesenquimales o cancerosas, y (ii) muestras biológicas de vertebrados que tienen células
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) tumorales mesenquimales o cancerosas con el fin de obtener información relativa al pronóstico de la enfermedad entre vertebrados que contienen dichas células.
Por "expresión aberrante" tal como se utiliza en esta descripción debe entenderse, en general, la expresión alterada de un gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células procedentes de un tejido tumorigénico respecto a la expresión de dicho gen o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células normales del mismo tejido no tumorigénico. La expresión aberrante de un gen incluye la amplificación del gen, la sobreexpresión del gen y la expresión del gen en células que normalmente no lo expresan.
l.A Detección basada en la expresión aberrante del gen Slug La invención proporciona un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado en la expresión aberrante del gen Slug, que comprende :
1) obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
2) evaluar la expresión del gen Slug en las células contenidas en dicha muestra de ensayo; y
3) comparar la expresión del gen Slug en las células de la muestra de ensayo con la expresión del gen Slug en la células de una muestra de control;
en donde la presencia de una expresión aberrante del gen Slug en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión del gen Slug en las células de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de ensayo.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) En una realización particular, el método para la detección de células cancerosas basado en la expresión aberrante del gen Slug proporcionado por esta invención se aplica a un ser humano sospechoso de tener dichas células . La secuencia de ADNc del gen Slug humano así como la secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADNc han sido descritos por Nieto y col. (Nieto et al., 1994, citado supra) .
En una realización particular, las células cancerosas a detectar son células tumorales mesenquimales, por ejemplo, leucemias o sarcomas .
La muestra de ensayo se obtiene a partir de una muestra biológica del vertebrado a ensayar. Dicha muestra biológica puede ser obtenida por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante biopsia de tejido o extracción de sangre.
La expresión aberrante del gen Slug en células tumorales mesenquimales o cancerosas incluye la amplificación del gen
Slug, la sobreexpresión de dicho gen y la expresión del mismo en células que normalmente no lo expresan. Actualmente se admite que la amplificación del ADN juega un papel crucial en la progresión de los tumores permitiendo que las células cancerosas regulen numerosos genes. Por otra parte, la frecuencia de la amplificación del ADN así como el incremento del número de copias durante la progresión de diversos cánceres, generalmente en pacientes que no responden al tratamiento, sugiere que la sobreexpresión de los genes diana amplificados confiere una ventaja selectiva a las células malignas .
La expresión del gen Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug (ARNm de SLUG) , o bien determinando el número de copias de gen Slug producidas.
En el sentido utilizado en esta descripción, "determinar el nivel de ARNm de SLUG" incluye cualquier método que
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína SLUG en las células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el nivel de ARNm de SLUG en las células de una muestra de control. Asimismo, "determinar el número de copias de gen Slug producidas" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias producidas del gen Slug en células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el número de copias del gen Slug producidas en células de una muestra de control . En una realización particular, el nivel de ARNm de SLUG o el número de copias del gen Slug producidas en las células de la muestra de ensayo se mide o estima y se compara con el nivel de ARNm de SLUG o con el número de copias del gen Slug producidas en las células de la muestra de control .
En una realización particular, la muestra de control puede ser una muestra biológica de un vertebrado que no tiene células cancerosas, por ejemplo, células tumorales mesenquimales. En este caso, una vez que se conoce el nivel de ARΝm de SLUG o el número de copias del gen Slug en la muestra de control, la información resultante se puede utilizar repetidamente como patrón a efectos comparativos. Alternativamente, la muestra de control puede ser una muestra biológica de un vertebrado que tiene células cancerosas, por ejemplo, células tumorales mesenquimales, con lo que, en este caso, el nivel de ARΝm de SLUG o el número de copias del gen Slug proporcionará información relativa al pronóstico de la enfermedad entre vertebrados que contienen dichas células. La determinación del número de copias del gen Slug puede realizarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin) ] o regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated homogeneously staining regions (hsrs) ] (Gebhart et al., Breast Cáncer Res.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al., Cáncer Genet . Cytogenet . 49:203 (1990)), mediante técnicas de hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen Slug, etc.
Asimismo, el nivel de ARNm de SLUG puede determinarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante análisis Northern blot (Harada et al., Cell 63:303- 312 (1990)), mapeo con la nucleasa SI (Fujita et al., Cell 49:357-367 (1987)), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (patentes norteamericanas US 4.683.195, US 4.683.202, US 4.965.188), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Makino et al., Technique 2:295-301 (1990)), técnicas de hibridación, microarrays (Wooster R. , Trends in Genetics 16:327-329 (2000)], etc. En una realización particular, la expresión del ARNm de Slug se ha evaluado mediante un análisis Northern blot y RT-PCR [véase el apartado Materiales y Métodos] .
De acuerdo con la invención, la presencia de una expresión aberrante del gen Slug en la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión del gen Slug en la muestra de control, es indicativa de la presencia de células tumorales mesenquimales o cancerosas en dicha muestra de ensayo .
1.B Detección basada en el producto de expresión del gen Slug
La invención también proporciona un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado en la expresión del producto de expresión del gen Slug (proteína SLUG) , que comprende :
a) obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) b) evaluar la expresión de la proteína SLUG en células de dicha muestra de ensayo; y
3) comparar la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo con la expresión de la proteína SLUG en las células de una muestra de control ;
en donde la presencia de una expresión aberrante de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de ensayo.
En una realización particular, las células cancerosas a detectar son células tumorales mesenquimales, por ejemplo, leucemias o sarcomas .
Al igual que en la alternativa precedente [l.A], la muestra de ensayo se obtiene a partir de una muestra biológica del vertebrado a ensayar, por ejemplo, un ser humano, mediante cualquier método convencional, por ejemplo, mediante biopsia de tejido o extracción de sangre.
La expresión de la proteína SLUG puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometría de flujo, proteómica, etc.
A modo de ejemplo, la expresión de la proteína SLUG en tejidos puede ser estudiada empleando los métodos inmuno- histológicos clásicos, en los que el reconocimiento específico es proporcionado por un anticuerpo anti-SLUG mientras que el sistema de detección puede utilizar unos anticuerpos secundarios marcados con marcadores apropiados.
La expresión de la proteína SLUG en tejidos también puede estudiarse mediante un ensayo Western blot o dot/slot
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (Jalkanen et al., J. Cell. Biol . 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)), mediante inmunoensayos , tales como ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o RÍA (radioinmunoensayo) . Adicionalmente, la expresión de la proteína SLUG puede ser detectada in vivo mediante técnicas de diagnóstico por imagen mediante el empleo de anticuerpos anti-SLUG unidos a marcadores apropiados, por ejemplo, marcadores detectables por rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) , etc. Una revisión del diagnóstico por imagen de tumores puede encontrarse en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer (S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, eds . , Masson Publishing Inc. (1982) ) .
Los anticuerpos anti-SLUG que pueden utilizarse en el método proporcionado por esta invención pueden ser anticuerpos frente a la proteína SLUG intacta o frente a un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse mediante la tecnología del hibridoma (Kohler et al . , Nature 256:495 (1975)). Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')2, etc.
Otros métodos para determinar la expresión de la proteína SLUG en tejidos incluyen la citometría de flujo (Ward M.S., Pathology 31:382-392 (1999), proteómica (Pandey M. & Mann M. , Nature 405:837-846 (2000); Chambers et al., J. Pathol. 192:280-288 (2000), etc.
De acuerdo con la invención, la expresión aberrante de la proteína SLUG en células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión de la proteína SLUG en células de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de ensayo.
2. Tratamiento del cáncer En un segundo aspecto, la invención se refiere al empleo
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión en el tratamiento del cáncer, en particular, en el tratamiento de patologías relacionadas con la presencia de células cancerosas, tales como células tumorales mesenquimales, por ejemplo, leucemias y sarcomas.
En el sentido utilizado en esta descripción, "el empleo del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión en el tratamiento del cáncer" incluye cualquier método que permite interferir cualitativa o cuantitativamente con el gen Slug, el nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína SLUG o con la propia proteína SLUG.
En este sentido, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o a un fragmento de la misma, o de un compuesto que interfiere con la función de Slug a nivel del ADN, o a nivel del ARN o a nivel de la proteína (SLUG) , opcionalmente junto con los excipientes farmacéuticamente aceptables . Los anticuerpos anti-SLUG que pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica proporcionado por esta invención pueden ser anticuerpos frente a la proteína SLUG intacta o frente a un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse mediante la tecnología del hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495 (1975)). Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')2, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales. El compuesto que interfiere con la función de Slug tanto a nivel de ADN como de ARN o proteína (SLUG) puede ser cualquier compuesto, o mezcla de compuestos, que impida la expresión del gen Slug, o que inactive el ARNm de SLUG que se genera, por ejemplo, mediante oligonucléotidos antisentido o ribozimas, o que inactive la proteína SLUG, por ejemplo,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) mediante el empleo de anticuerpos o que compita el efecto de dicha proteína con dominantes negativos (Choo, Y., et al. J. Mol. Biol. 273:525-532, (1997); Cobaleda, C, & Sánchez- García, I., Blood 95:731-737 (2000)). Los excipientes que pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
La invención también se refiere a un método para el screening in vi tro de agentes antitumorales basado en la regulación de- la expresión del gen Slug que comprende (i) desarrollar un sistema celular que, en determinadas condiciones, expresa el gen Slug, (ii) poner en contacto dicho sistema celular con el compuesto a ensayar, y (iii) evaluar la expresión del gen Slug, de manera que si no se expresa el gen Slug el compuesto ensayado es un agente antitumoral potencial .
La interferencia con' la función del gen Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su expresión, inactivando el ARNm que se genera mediante oligonucléotidos antisentido o ribozimas, inactivando la proteína mediante el empleo de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha proteína con dominantes negativos (Choo, Y., et al. J. Mol. Biol. 273:525- 532, (1997); Cobaleda, C. & Sánchez-García, I., Blood 95:731- 737 (2000) ) . A continuación se ilustrará la invención mediante un ensayo realizado por los inventores que pone de manifiesto que el gen Slug regula la capacidad diseminativa de las células leucémicas con BCR-ABL .
I. MATERIALES Y MÉTODOS
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Cultivos celulares
Las líneas celulares usadas incluyen células Ba/F3
(Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)) y células Ba/F3 que expresan las proteínas humanas BCR-ABLP190 (Ba/F3 + pl90) y BCR-ABLP210 (Ba/F3 + p210) (Sánchez-García y Grütz, Proc .
Nati. Acad. Sci. USA, 92:5287-5291 (1995)). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternero fetal (FCS) .
Cuando fue necesario, se añadió un 10% de medio acondicionado con WEHI-3B como fuente de IL-3 (interleucina-3) .
Análisis de la Diferencia Representacional (RDA)
El RDA se realizó tal como describen Hubank y Schatz (Hubank y Schatz, Nucleic Acid Res. 22:5640-5648 (1994)). En resumen, se aislaron ARNm de células Ba/F3 , Ba/F3 + pl90 y Ba/F3 + p210. Se extrajo una muestra de 10 mg de ARNm de cada población celular para el análisis RDA. Se sintetizaron ADNc a partir de los ARNm y se digirieron con Dpn II. A los ADNc digeridos con Dpn II se añadieron adaptadores compuestos de dos oligonucleótidos: (R-24) [SEC. ID. N° : 1] y (R-12) [SEC. ID. N° : 2] . La mezcla resultante se amplificó por PCR con oligonucleótidos R-24 [SEC. ID. N° : 1] y los adaptadores se escindieron con Dpn II. Después, se unió un segundo par de adaptadores: (J-24) [SEC. ID. N° : 3] y (J-12) [SEC. ID. N° : 4] a los fragmentos amplificados procedentes de células Ba/F3 + pl90 y Ba/F3 + p210 (tester) y se hibridaron con los fragmentos de ADNc amplificados con R-24 [SEC. ID. N° : 1] procedentes de células Ba/F3 (inductor) con una relación de 1:100 durante 20 horas. La mezcla de hibridación se usó como molde para la amplificación basada en PCR.
Se realizó una segunda vuelta de sustracción retirando los adaptadores J [SEC. ID. N° : 3 y SEC. ID. N° : 4] de una alícuota del producto de la primera vuelta de PCR, uniendo un tercer par de adaptadores oligonucleotídicos : (N-24) [SEC. ID. N° : 5] y (N-12) [SEC. ID. N° : 6] e hibridando con
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) amplicones inductores a una relación de 1:1000. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2,0% y las bandas individuales se subclonaron y examinaron por análisis de transferencia de Northern con respecto a la expresión diferencial.
Retrotranscripción-reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR)
Para analizar la expresión de SLUG en líneas de células humanas y en muestras de sangre periférica de pacientes positivos con respecto a Ph-1, se realizó una RT de acuerdo con el protocolo del fabricante en una reacción de 20 μl que contenía 50 ng de hexámeros aleatorios, 3 μg de ARN total y 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript II RΝasa H" (GIBCO/BRL) . Los parámetros de los ciclos térmicos para las reacciones de PCR y las secuencias de los cebadores específicos fueron las siguientes: SLUG, 30 ciclos a 94°C durante 1 minuto, 56 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, cebador con el sentido correcto [SEC. ID. Ν° : 7] y cebador sin sentido [SEC. ID. Ν° : 8]; c-ABL , 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 56 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, cebador con el sentido correcto [SEC. ID. Ν° : 9] y cebador sin sentido [SEC. ID. Ν° : 10] . La amplificación del ARΝm de c-ABL sirvió como control para evaluar la calidad de cada muestra de ARΝ. Las secuencias de las sondas internas fueron las siguientes :
SLUG: SEC. ID. Ν° : 11, y C-ABL: SEC. ID. Ν° : 12.
Clonación de ADΝc de Slug de longitud completa por RT-PCR
El ADΝc de Slug de ratón se clonó por RT-PCR usando el cebador de avance [SEC. ID. Ν° : 13] y el cebador inverso [SEC. ID. Ν° : 14] (número de acceso del GenBank U79550) .
Análisis del ARΝ
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ~~ El ARN citoplásmico total (10 μg) se glioxiló y fraccionó en geles con un 1,4% de agarosa en tampón Na2HP04 10 M (pH 7,0) . Después de la electroforesis, el gel se transfirió a membranas de nylon Hybond-N (Amersham) , que se trataron con luz UV y se hibridaron con sondas marcadas con 32P. La carga se controló volviendo a tratar los filtros con una sonda de ADNc de -actina. El oligonucleótido Slugh sin sentido usado como sonda comprende las primeras 34 bases de la secuencia codificante del ADNc de Slugh de ratón.
Construcción de plásmidos para estudios in vivo Se realizó la amplificación por PCR del ADNc de Slug de ratón para facilitar la clonación, añadiendo enzimas de restricción, usando cebadores que hibridaban con los extremos 5' y 3' del ADNc y amplificando una región que incluía la región codificante entera del gen. El ADNc de Slugh de ratón se clonó tanto en la orientación con sentido como en la orientación sin sentido en el vector pEF-BOS (denominado BOS- slug y BOS-antislug, respectivamente) , que contenía secuencias del promotor EFl-α seguidas de una región de poliengarce unida a la señal de poli (A) adenilación del ADNc de G-CSF humano, como se ha descrito (Mizushima y Nagata, Nucleic Acid Res. 18:4322 (1990)). El vector Combi-pl90 se obtuvo reemplazando el ADNc de la luciferasa del plásmido Combi-tTA (Schultze et al., Nature Biotechnology 14:499-503 (1996)) por el ADNc de BCR-ABLP190. La autenticidad de las construcciones se confirmó por secuenciación del ADN.
Transfección celular Se transfectaron células Ba/F3 por electroporación (960 μF, 220 V) con 20 μg de Combi-pl90, respectivamente, junto con 1 μg de vector de expresión MCl-neo. En las células
(Ba/F3 + Combipl90) se analizó por transferencia de Northern la expresión de BCR-ABL en presencia y en ausencia de tetraciclina (20 ng/ml) . Estas células fueron resistentes a
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) la ausencia de IL-3 cuando se desarrollaron en presencia de tetraciclina.
Expresión del gen Slug urino en células que expresan Ba/P3 y BCR-ABL y Ensayo de Supervivencia Celular
Se transfectaron células Ba/F3, Ba/F3+pl90 y Ba/f3+p210 por electroporación (960 μF, 220 V) con 20 μg de BOS-Slug y BOS-antislug, respectivamente, junto con 1 μg de vector de expresión puro MCI. En las líneas celulares se analizó la expresión de Slug por transferencia de Northern. Las células se seleccionaron con respecto a la resistencia a la ausencia de IL-3 y la viabilidad celular se determinó por exclusión con azul de trypan.
Análisis del ADN
Se aisló ADN de bajo peso molecular como se indica a continuación. Las células se recogieron en 1,5 mi de medio de cultivo, se microcentrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400 x g) y los sedimentos se suspendieron en 300 μl de tampón de proteinasa K. Después de un periodo de incubación de una noche a 55°C, el ADN se precipitó con etanol , se suspendió en 200 μl de tampón TE que contenía 50 μl/ml de RNasa A y se incubó a 37°C durante 2 h. El ADN se extrajo con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol . Se marcaron terminalmente alícuotas de ADN (2 μg) con o;32-dCTP y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a Hybond-N (Amersham) y se autorradiografió durante 2 h a -70 °C.
Análisis del fenotipo
Para la tinción de citometría se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-ratón de Pharmingen: el marcador linfoide CD45R/B220 y el marcador mieloide Gr-1. Se incubaron suspensiones de una sola célula de las muestras de líneas celulares diferentes obtenidas por técnicas rutinarias
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) con CD32/CD16 anti-ratón (Pharmingen) purificado para bloquear la unión mediante receptores Fe y con una dilución adecuada de los diferentes anticuerpos a temperatura ambiente o a 4°C, respectivamente. Las muestras se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS . Las células muertas de las muestras se excluyeron por tinción con yoduro de propidio. Las muestras y los datos se analizaron por FACScan usando el software CellQuest (Becton Dickinson) .
Ensayo de tumorigenicidad
Para ensayar la tumorigenicidad de las diversas líneas celulares, se inyectaron por vía subcutánea, en los dos flancos de ratones macho (desnudos) atímicos de 2 a 4 semanas de edad, 106 células resuspendidas en 200 μl de solución salina tamponada con fosfato. En los animales se examinó la formación de tumores durante dos meses.
Análisis histológico
Las muestras de tumor se fijaron en formalina al 10% durante una noche, después se procesaron, se incluyeron en bloques de parafina, se tiñeron secciones de 6 μm con hematoxilina y eosina, se examinaron histológicamente y se fotografiaron. Todas las secciones se tomaron a partir de porciones homogéneas y viables de los tumores sometidos a resección.
II. RESULTADOS BCR-ABL regula positivamente la expresión de Slug en las células hematopoyéticas La caracterización molecular de ciertas anormalidades cromosómicas asociadas con el cáncer humano ha revelado que la consecuencia principal son proteínas de fusión específicas de tumores . Una idea común que surge es que la creación de estas proteínas altera el desarrollo normal de las células diana específicas de tumores bloqueando la apoptosis
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (Cobaleda et al., BioEssays 20:922 (1998), pero los aspectos más amenazadores para la vida del proceso oncogénico son la invasión y la metástasis. Aunque se ha apreciado correctamente el significado clínico de tal expresión del fenotipo maligno, los avances en la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la invasión han retrasado otros trabajos de desarrollo en el campo del cáncer. Así pues, una primera etapa crítica para comprender la transformación maligna mediada por los productos de las anormalidades cromosómicas asociadas con la leucemia es la identificación de los genes respondedores corriente abajo a los que se dirigen estas proteínas. Se están utilizando como modelo de estudio los, oncogenes BCR-ABL y se ha sacado partido de un sistema celular que usa una línea de células Ba/F3 precursoras hematopoyéticas murinas transducida con vectores que codificaban la proteína de fusión BCR-ABL
(Sánchez-García y Grütz, 1995 citado supra) . La expresión de
BCR-ABL en Ba/F3 induce la transformación celular, confiere un crecimiento independiente de citocinas y bloquea la apoptosis (Daley y Baltimore, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:9312 (1988); Sánchez-García y Grütz, 1995 citado supra) . Para identificar dianas potenciales de la acción de BCR-ABL, se ha elegido el proceso sustractivo del análisis de la diferencia representacional (RDA) . Usando moléculas de ARNm procedentes de células Ba/F3 , de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABLpl90 (Ba/F3 + pl90) y de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABLp210 (Ba/F3 + p210) , se prepararon ADNc y se sometieron a tres vueltas de hibridación secuencial y de amplificación por PCR de acuerdo con el protocolo de RDA de Hubank y Schatz (Hubank y Schatz, 1994 citado supra) . Varios fragmentos de ADNc amplificados diferencialmente se subclonaron individualmente y se ensayaron con respecto a la expresión génica diferencial por transferencia de Northern de ARN de Ba/F3. Se identificó un fragmento de ADNc que representaba un gen regulado de forma diferencial y se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) denominó 1-1. La comparación de las secuencias demostró que el fragmento 1-1 de 527 nucleótidos correspondía a una parte de la región codificante y la región 3' no traducida de ADNc de SLUG murino (Nieto et al, 1994, citado supra) , identificada con la utilidad de búsqueda BLAST (National Center for Biotechnology Information) .
La capacidad de los oncogenes BCR-ABL de estimular la producción de ARNm de SLUG se ensayó por hibridación con filtros de Northern de ARNm de células Ba/F3, Ba/F3+pl90 y Ba/F3+p210 (Figura 1A) . El análisis de transferencia de Northern mostró la expresión de SLUG en células Ba/F3+190 y Ba/F3+p210. Este ensayo demuestra que las células positivas con respecto a BCR-ABL expresan el ARNm de SLUG, pero que las células de control no lo hacen. Por lo tanto, estos datos indican una clara relación entre la activación del gen Slug y la expresión de BCR-ABL en este sistema.
La presencia de BCR-ABL se requiere para la expresión aberrante de SLUG Los datos descritos anteriormente demuestran la expresión aberrante de SLUG en células que contienen el gen de fusión BCR-ABL. Para determinar si se requiere BCR-ABL para la transcripción del gen Slug, se crearon células Ba/F3 en las que la expresión del gen BCR-ABL podía regularse exógenamente . Se aprovechó el sistema Combi-tTa, que tiene el transactivador y el promotor mínimo del operador tet que dirige a la unidad de expresión génica en un solo plásmido (Schultze et al., 1996 citado supra) . La proteína represora tet fusionada al dominio transactivador de VP16 viral se unía, en ausencia de tetraciclina, a un promotor mínimo del operador tet obtenido por ingeniería genética y activaba la transcripción de BCR-ABL (Combi-pl90) . En presencia de la molécula efectora, la unión se anulaba y el promotor se silenciaba (Figura IB) . En este sentido, aunque se detectó BCR-ABLP190 en Ba/F3+Combipl90 sin tetraciclina, no se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) encontró ARNm en presencia de tetraciclina (20 ng/ml) . Estos datos indican que la inducción de BCR-ABL puede reprimirse completamente por la tetraciclina.
La especificidad de la activación del gen Slug se analizó por análisis de hibridación de filtros de Northern en células Ba/F3+Combipl90. Después de dos días en cultivo, en presencia o en ausencia de tetraciclina, se determinó la expresión de SLUG. Como se muestra en la Figura IB, la expresión de SLUG se redujo rápidamente coincidiendo con la reducción de la expresión del ARNm de BCR-ABLpl90. Además, en estas células se analizó si la expresión de dos efectores corriente abajo bien conocidos de los oncogenes BCR-ABL, Myc (Sawyers et al., Cell 70:901-910 (1992)) y Bcl-2 (Sánchez- García y Grütz, 1995 citado supra; Sánchez-García y Martín- Zanca, J. Mol. Biol-. 267:225 (1997)) era dependiente de la presencia de BCR-ABL. Como se muestra en la Fig IB, aunque se detectaba la expresión tanto de Bcl2 como de Myc en Ba/F3+Combipl90 sin tetraciclina, no se pudo encontrar ningún ARNm en presencia de tetraciclina (Figura IB) . Esta observación confirma que los cambios observados en la expresión génica se estimulaban por NCR-ABL.
La expresión de Slug está presente en lineas celulares y en células de sangre periférica de pacientes con leucemia positiva con respecto al cromosoma Philadelphia
El descubrimiento de que BCR-ABL regula positivamente la expresión de Slug en células Ba/F3, motivó que los inventores ensayaran si los niveles de expresión de Slug también se regulan positivamente como consecuencia de la expresión de BCR-ABL en células madre primarias, la diana natural de la proteína de fusión BCR-ABL oncogénica (Cobaleda et al., 2000; Sánchez-García, 2000, citados supra) . Los análisis de transferencia de Northern de un espectro de tej idos de ratón indicaron que, con raras excepciones, SLUG se expresa ampliamente en tejidos de ratón (Figura 2A) . Sin embargo,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) SLUG no se expresaba por los leucocitos de sangre periférica
(Figura 2A) . Sabiendo que SLUG no se expresaba en la sangre periférica de ratones normales, se ensayaron los efectos posibles de la expresión de BCR-ABL sobre los niveles de ARNm de SLUG en la sangre periférica de los ratones BCR-ABL transgénicos con leucemia (Castellanos et al., Blood 90:2168
(1997)) . Se examinaron células madre de ratón que expresaban
BCR-ABL por hibridación con filtros de Northern (Figura 2B) .
Cada banda de ARN se evaluó con respecto a la integridad y la carga por hibridación con una sonda de -actina (Figura 2B, sección inferior) . De acuerdo con los resultados observados en las células Ba/F3, las células inmaduras con BCR-ABL producían un aumento de la expresión de SLUG. Después se ensayó si la expresión de SLUG también está presente en células inmaduras de pacientes de leucemias humanas positivas para Phl . Se demostró que el producto de expresión del gen Slug estaba ausente en las células procedentes de muestras humanas normales (Figura 3, banda 1) . Por el contrario, la expresión de SLUG estaba presente en células de pacientes con el cromosoma Philadelphia (Figura 3, bandas 6-8) . Las líneas celulares K562, Nalm-1 y TOM-1, positivas para t(9;22), proceden de pacientes con LMC y de pacientes LLA positivos para Phl. Por lo tanto, se compararon estas líneas celulares con una línea celular humana no leucémica con respecto a la expresión de SLUG. El examen de los ARNm para la expresión de
SLUG por PCR de transcriptasa inversa reveló que Slug está presente en todas estas líneas de células positivas para Phl
(Figura 3, bandas 9-11). El descubrimiento de que la expresión de SLUG está presente en las células después de la expresión del BCR-ABL de transformación, junto con el descubrimiento de que el gen Slug está presente en líneas celulares y en células de médula ósea aisladas de pacientes con leucemias positivas para BCR-ABL, sugiere que la presencia del gen Slug puede ser un componente en la invasión de leucemias positivas para BCR-ABL.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Slug está presente en líneas celulares de pacientes con leucemias con otras anormalidades cromosómicas
Como SLUG es un miembro de la familia Snail de proteínas implicadas en la formación del mesodermo (Nieto et al., 1994 citado supra) y su expresión es bastante promiscua (Figura 2) , posteriormente se analizó la expresión del gen Slug en otros tumores mesenquimales. En la Figura 3 se muestran ejemplos de ARN de otras cuatro líneas celulares de leucemia que carecen de t(9;22), incluyendo el linaje B temprano 697 (Figura 3, banda 5), el mieloide U937 (Figura 3, banda 2) y las líneas de células T ALL-SIL (Figura 3, banda 3) y KOPTI- KI (Figura 2, banda 4) . Como se muestra en la Figura 3, en todas las líneas de células leucémicas se demostró la expresión del gen Slug. En este sentido, los descubrimientos recientes demuestran que SLUG también se expresa en células leucémicas t(17;19) (Inukai et al., Molecular Cell 4:343-352
(1999) ) y en células de rabdomiosarcoma que expresan la translocación PAX3-FKHR (Khan et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
USA 96:13264-13269 (1999)). Así pues, estos resultados combinados indican que la expresión de Slug no es rara en tumores mesenquimales (tanto leucemias como sarcomas) transformados bajo los auspicios de otras alteraciones genéticas y sugieren que el gen Slug puede ser un componente de la biología del cáncer, no sólo de leucemias positivas para BCR-ABL, sino también posiblemente de otros cánceres mesenquimales .
Actividad antiapoptótica de SLUG
Para comprender mejor la función de SLUG en la biología del cáncer, también se aprovechó la línea de células Ba/F3 transducida con vectores que codificaban la proteína de fusión BCR-ABL (Sánchez-García y Grütz, 1995, citado supra) . La expresión de BCR-ABL en Ba/F3 confiere un crecimiento independiente de citocinas y bloquea la apoptosis (Daley y Baltimore, 1988; Sánchez-García y Grütz, 1995, citados
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) supra) . Así pues, los inventores se preguntaron si SLUG podía realizar estas funciones en ausencia de la oncoproteína . Así pues, se transfectaron células Ba/F3 con un vector que expresaba Slug (Figura 4A) y se analizó la viabilidad celular en ausencia de IL-3. Como se muestra en la Figura 4, las células Ba/F3 que expresaban los oncogenes BCR-ABL sobrevivían con poca pérdida de viabilidad y las que expresaban Slug no sufrían apoptosis después de la eliminación de IL-3 del medio de crecimiento (Figura 4B, 4C) . Esta observación confirma los resultados previos (Inukai et al, 1999 citado supra) e indica que Slug bloquea la apoptosis en el sistema de células de ensayo. Así pues, su disregulación por BCR-ABL en células Ph+ probablemente contribuye a las propiedades de supervivencia celular prolongada de las células t(9;22). El gen Slug podría sustituir a BCR-ABL en la promoción de la supervivencia de las células Ba/F3 murinas privadas del factor de crecimiento, lo que sugiere que es más probable que esté implicado en la resistencia de la muerte celular características de las leucemias Ph+ y una etapa clave hacia el desarrollo de leucemias positivas con respecto a t(9;22).
La supresión del gen Slug compromete la tumorigenicidad de oncogenes BCR-ABL afectando a la capacidad de diseminación de células leucémicas BCR-ABL
Los resultados anteriores ponen de manifiesto la idea de que la expresión de BCR-ABL protege a las células de la apoptosis induciendo una ruta del gen Slug. En este caso, sería de esperar que se produjera alguna modificación del crecimiento y la tumorigenicidad de las células Ba/F3 que expresan BCR-ABL sobre la alteración del nivel de la expresión de Slug. Se transfectaron células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL con un vector que expresaba el ADNc de Slugh de ratón sin sentido (BOS-antislug) y se establecieron clones (Figura 5A) . Se extrajo el ARN y los niveles de ARNm
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de Slugh se compararon con los presentes en las células de control no transfectadas (Figura 5B) . En las células transfectadas con BOS-antislug se detectó Slugh sin sentido y en las células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL transfectadas con BOS-antislug no se vio afectado el nivel de BCR-ABL (Figura 5A) . Por otra parte, no se detectó ARNm de SLUG en las células transfectadas con Slugh sin sentido, aunque sí estuvo presente en células Ba/F3-pl90 y Ba/F3-p210 (Figura 5B) . Las consecuencias de la supresión de la expresión de Slugh se evaluaron examinando el programa de diferenciación impuesto por oncogenes BCR-ABL en células Ba/F3 y la tumorigenicidad in vivo de las diversas líneas celulares por inyección en ratones desnudos .
Para determinar si la expresión de Slug es un componente crítico per se del programa de diferenciación inducido por los oncogenes BCR-ABL, los inventores midieron después la capacidad de diferenciar precursores he atopoyéticos que expresaban BCR-ABL transfectados en los que la expresión de Slug se hubiera suprimido específicamente. Los efectos de la supresión de la expresión de Slugh sobre la diferenciación celular en células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL se evaluaron analizando la expresión de marcadores hematopoyéticos específicos en las diversas líneas celulares . Como se muestra en la Figura 5C, las células Ba/F3 iniciales que expresan oncogenes BCR-ABL-plθO o BCR-ABL-p210 se diferencian específicamente en células mieloides y linfoides como se define por la presencia del marcador mieloide Gr-1 o del marcador linfoide B220, respectivamente. De forma análoga, no se vio afectada la diferenciación de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL en las que la expresión de Slug se había suprimido específicamente (Figura 5C) . Estos resultados demuestran que el efecto de los oncogenes BCR-ABL en la diferenciación no depende de la expresión de Slug.
Posteriormente, los presentes investigadores examinaron la capacidad tumorigénica in vivo de las diversas líneas
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) celulares. Las células Ba/F3 iniciales que expresaban los oncogenes BCR-ABL crecieron como tumores en ratones desnudos
(Sánchez-García y Grütz, 1995 citado supra) . Análogamente, se descubrió que se observaba formación de tumores tan sólo cinco días después de la inyección de las líneas de células
• que expresaban BCR-ABL. A diferencia de estos controles, las células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL y Slugh sin sentido eran mucho menos tumorigénicas (Figura 6) . Los tumores se escindieron para realizar el análisis macroscópico el día 20 después de la inyección de las células. En promedio, el peso de los tumores encontrados en los ratones a los que se habían inyectado células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL fue dos veces mayor que el peso de los tumores de los ratones a los que se habían inyectado células que expresaban BCR-ABL y la construcción de Slugh sin sentido (Figura 6) . Durante el desarrollo de los tumores invasivos in vivo, las células tumorales desobedecen el orden social de los límites de los órganos y entran en tejidos extraños. Así pues, posteriormente se procedió con el examen histológico de los tumores BCR-ABL generados en presencia o en ausencia de Slug. En los tumores originados como resultado de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL en las que se había suprimido la expresión de Slugh, las células se acumulaban, pero la proliferación se limitaba sistemáticamente al medio permisivo (Figura 7) . Por el contrario, en los tumores generados como resultado de células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL en las que no se había modificado la expresión de Slug se extendían los límites previos del medio permisivo y, por consiguiente, progresaba el tumor. Como se muestra en la Figura 7, Slug confiere claramente un comportamiento metastático a las células BCR- ABL, permitiendo la migración de las células tumorales como células individuales. Se encontraron resultados similares en secciones múltiples de tumores y para las dos formas (pl90 y p210) del oncogen BCR-ABL . Así pues, estos resultados demuestran que el gen Slug tiene un papel fundamental en la
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) transición de un tumor in si tu a invasivo, permitiendo la migración de las células tumorales como células individuales .
III. DISCUSIÓN SLUG regula la capacidad invasiva de células BCR-ABL: consecuencias para la patogénesis de tumores mesenquimales
En la leucemogénesis, las futuras células tumorales son células madre primitivas en las que se bloquea la diferenciación (Cobaleda et al., 2000; Sánchez-García, 2000, citados supra) , pero la inhibición de la diferenciación no es suficiente para la transformación porque la supervivencia y la proliferación de las células diana se restringe a un microentorno particular. Así pues, la transformación debe depender de cambios genéticos que permiten a las células desarrollarse fuera de su medio normal además de mutaciones que bloquean la diferenciación. Para validar esta hipótesis, se intentó identificar la diana corriente abajo de los genes BCR-ABL fusionados por t(9;22) (q34;qll) en las células hematopoyéticas. La identificación de los productos génicos corriente abajo que confieren la naturaleza neoplásica son un prerrequisito para la comprensión total del mecanismo de la leucemogénesis. En el presente estudio se ha identificado el gen Slug como un gen diana corriente abajo implicado en el proceso leucemogénico inducido por el gen de fusión quimérico BCR-ABL. Los estudios de los presentes investigadores no establecen si el promotor de Slug es una diana directa de BCR-ABL o si más bien este gen se implica como un elemento de ciertas cascadas bioquímicas que responden a la modulación por la proteína quimérica. El descubrimiento de que la expresión de Slug está presente en las células después de la expresión del BCR-ABL transformante, junto con el descubrimiento de que Slug está presente en líneas celulares y en células de médula ósea aisladas de pacientes con leucemias positivas con respecto a BCR-ABL, indican que la presencia de Slug tiene que ser un componente importante de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) la naturaleza maligna de las leucemias positivas con respecto a BCR-ABL. Esto sugiere la posibilidad de que Slug pueda contribuir al bloqueo de la diferenciación o ser responsable de la capacidad diseminativa de esta enfermedad. Otros descubrimientos de los inventores definen la función biológica de Slug en el contexto de la transformación celular dependiente de oncogenes BCR-ABL . Los datos presentados aquí demuestran que Slug, que se activa por la expresión de oncogenes BCR-ABL, media la prevención de la apoptosis en el sistema Ba/F3. Además, se produce una modificación del crecimiento y la tumorigenicidad de las células que expresan BCR-ABL alterando el nivel de expresión de Slug. En tumores in vivo originados como resultado de células BCR-ABL en las que se había suprimido previamente la expresión de Slug, las células se acumulaban, pero la proliferación se limitaba sistemáticamente al medio permisivo. Por el contrario, en los tumores generados como resultado de células BCR-ABL en las que no se ha modificado previamente la expresión de Slug, se extienden los límites previos del medio permisivo y, por consiguiente, progresa el tumor, desobedeciendo el orden de límites y entrando en tejidos extraños. Así pues, Slug confiere claramente un comportamiento metastático a las células BCR-ABL en transición de in si tu a invasivo, permitiendo la migración de las células tumorales como células individuales.
Los descubrimientos de los inventores son coherentes con un modelo en el que células madre que llevan la proteína de fusión BCR-ABL expresarían constitutivamente • Slug, promoviendo tanto la supervivencia aberrante de la célula diana tumoral con independencia de las señales externas requeridas, que permite a la célula crecer fuera de su medio normal, como la migración de las células diana defectuosas en diferentes medios (Figura 8) . Sin embargo, un aumento de la expresión de Slug no puede ser el único acontecimiento implicado en la transformación por oncogenes BCR-ABL . La
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) razón es la siguiente: aunque la expresión de Slug constitutiva reemplaza a las señales de supervivencia inducidas a través de receptores de crecimiento y permite que las células crezcan fuera de su microentorno normal, los resultados de los presentes investigadores demuestra que el efecto de los oncogenes BCR-ABL en la diferenciación no depende de la expresión de Slug. Así pues, se requieren otros componentes además de Slug para reconstituir la señal de transformación de BCR-ABL. Los inventores han demostrado que los oncogenes BCR-ABL
• son suficientes por sí mismos para inducir la expresión de
Slug, y que Slug se requiere para la actividad biológica de estos oncogenes en la invasión celular. Como Slug es una proteína implicada en la formación del mesodermo (Nieto et al., 1994 citado supra; Savagner et al., J. Cell Biology 137:1403-1419 (1997)) y su expresión es bastante promiscua (Figura 2) , puede tener un papel más general en la biología del cáncer que el asociado específicamente a la transformación de BCR-ABL. Así pues, la expresión de Slug podría servir como mecanismo de invasión celular para proteínas de fusión encontradas en otras leucemias y proteínas asociadas con sarcomas. De hecho, la expresión de Slug no es rara en tumores mesenquimales (tanto leucemias como sarcomas) transformados bajo los auspicios de otras alteraciones genéticas (Inukai et al., 1999; Khan et al., 1999, citados supra) , lo que sugiere que Slug puede ser un componente de la invasión tumoral no sólo de leucemias positivas para BCR-ABL, sino también posiblemente de otros cánceres mesenquimales. Por lo tanto, Slug parece ser un mecanismo de invasión tumoral tanto para leucemias como para sarcomas. En conclusión, con el presente trabajo se ha establecido el mecanismo responsable de la capacidad de invasión por BCR-ABL y se han presentado indicios que sugieren que Slug podría representar un mecanismo potencialmente amplio de invasión tumoral para tumores
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) mesenquimales. Por lo tanto, el propio Slug podría constituir una diana atractiva para el tratamiento (puede considerarse un marcador de malignidad) y la modulación terapéutica de la capacidad invasiva en el tratamiento del cáncer humano.
La metástasis y la tumorigenicidad pueden tener el mismo control genético La conversión leucémica de las células diana tumorales (Cobaleda et al., 2000; Sánchez-García, 2000, citados supra) en células con un estado de crecimiento autónomo implica que ciertos genes específicos tienen que activarse para desacoplar el control de proliferación/diferenciación y generar señales intracelulares que puedan sustituir a los requisitos de los factores de crecimiento durante la invasión y la diseminación celular. Durante el desarrollo de tumores invasivos, las células tumorales desobedecen el orden social de límites de órganos y entran en tejidos extraños. Sólo durante la transición de un tumor in si tu a un tumor invasivo, las células tumorales penetran en la membrana basal epitelial y entran en el estroma intersticial subyacente interaccionando con las células estromáticas . Así pues, una definición del comportamiento de las células de tumores metastáticos es la tendencia a cruzar límites de compartimentos tisulares y a entremezclarse con diferentes tipos celulares . Los inventores han demostrado que las células BCR-ABL se comportan como células de tumores metastáticos. Se asume que el bloqueo de la diferenciación es la consecuencia de la alteración de las propiedades de las proteínas de fusión quiméricas (Sánchez-García, Annu. Rev. Genetics 31:429-453 (1997)), BCR-ABL en el presente caso. Se ha sospechado que también pueden producir metástasis otros genes distintos de los oncogenes que se ha demostrado que son relevantes para la tumorigénesis . Sin embargo, los resultados demuestran claramente que la transfección de oncogenes BCR- ABL en una célula receptora apropiada puede inducir el
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) fenotipo completo de tumorigenicidad e invasión. Estos hallazgos demuestran que una proteína de fusión impone a la célula diana un programa de diferenciación alterado y un agente específico inductor de la invasión que se requiere para que una célula tumoral se transforme en invasiva. El modelo de los inventores también revela que los genes efectores de la invasión pueden regularse independientemente de los que confieren tumorigenicidad por el mismo gen de fusión, lo cual representa un nuevo mecanismo de acción oncogénica. Considerando conjuntamente estos datos, se refuerza la idea de que la transformación puede producirse como resultado de la creación/activación de un solo oncogen
(Sánchez-García, 1997, citado supra) . Un tópico interesante para la investigación futura será la identificación de los factores que modulan la expresión de Slug y la posible implicación de otras oncoproteínas que inducen su expresión.
Slug asocia la invasión y el desarrollo tumoral
SLUG es un miembro de la familia Snail de factores de transcripción con "dedos de zinc" que comparten un papel conservado desde el punto de vista evolutivo en la formación del mesodermo en invertebrados y vertebrados (Nieto et al . , 1994, citado supra) . En el pollo, Slug se expresa por células epiteliales ectodérmicas durante su transición a células mesenquimales. Los embriones de pollo tratados con oligonucleótidos sin sentido dirigidos contra Slug muestran una formación del mesodermo inapropiada relacionada con defectos en la migración celular en compartimentos de transición de epiteliales a mesenquimales (Nieto et al., 1994, citado supra) . Así pues, Slug induce la migración celular en la transición epitelial-mesenquimal , en la formación del mesodermo y en la migración de las células de la cresta neural (Fuse et al., Genes & Development 8, 2270- 2281 (1994)) . Sin embargo, en ratones, la activación de las transiciones epiteliales-mesenquimales está bajo el control
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de Snail (Cano et al., Nature Cell Biology 2:76-83 (2000)), que permite la migración del mesodermo temprano en forma de células epiteliales. Por consiguiente, los ratones sin Slug se desarrollan normalmente (Jiang et al . , Development Biology 198:277-285 (1998)). Además, se ha demostrado que el gen Snail activa el EMT asociado con la adquisición del fenotipo invasivo en tumores epiteliales sólidos (Batlle et al., Nature Cell Biology 2:84-89 (2000); Cano et al-, 2000 citado supra) , donde contribuye al primer acontecimiento del proceso metastático. Así pues, la inducción de EMT parece ser una función asociada específicamente al gen Snail en el ratón (Cano et al., 2000 citado supra) .
Los datos presentados aquí demuestran que Slug es un regulador importante de la capacidad de invasión durante la progresión de tumores mesenquimales en los que no se requieren los EMT. Esta idea podría ampliarse al papel de Slug en la adquisición por parte de las células madre mesenquimales de la capacidad de migrar. En apoyo a esta teoría, los experimentos de los inventores indican que, in vivo, Slug no se expresa en la sangre periférica de los ratones normales, pero está presente en la sangre periférica de ratones transgénicos BCR-ABL con leucemia, definiendo un fenotipo indiferenciado, pluripotente y migratorio en las células mesenquimales. Así pues, es concebible que la presencia de Slug se requiera en ciertas fases del desarrollo normal para una expansión apropiada y para la supervivencia de las células hematopoyéticas tempranas (Figura 8) . Conjuntamente, los resultados proporcionan una asociación molecular entre un regulador de las etapas iniciales del desarrollo y la leucemogénesis, y ofrecen pistas para comprender las alteraciones moleculares que conducen al comportamiento invasivo de leucemias, en particular, y tumores mesenquimales, en general.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado en la expresión aberrante del gen Slug, que comprende :
1) obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
2) evaluar la expresión del gen Slug en las células contenidas en dicha muestra de ensayo; y
3) comparar la expresión del gen Slug en las células de la muestra de ensayo con la expresión del gen Slug en la células de una muestra de control;
en donde la presencia de una expresión aberrante del gen Slug en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión del gen Slug en las células de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de ensayo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células cancerosas son células tumorales mesenquimales comprenden leucemias y sarcomas.
3. Método según la reivindicación 2, en el que dichas células tumorales mesenquimales comprenden leucemias y sarcomas .
4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho vertebrado sospechoso de tener células cancerosas es un ser humano .
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de control se selecciona entre (i) muestras biológicas de vertebrados que no tienen células cancerosas, y (ii) muestras biológicas de vertebrados que tienen células cancerosas .
6. Método según la reivindicación 1, en el que la evaluación de la expresión del gen Slug se realiza determinando el número de copias de gen Slug producidas.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la determinación del número de copias de gen Slug producidas se realiza visualizando fragmentos dobles extracromosómicos, visualizando regiones de tinción homogéneamente integradas, o mediante técnicas de hibridación.
8. Método según la reivindicación 1, en el que la evaluación de la expresión del gen Slug se realiza determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug (ARNm de SLUG) .
9. Método según la reivindicación 8, en el que la determinación del nivel de ARNm de SLUG se realiza mediante análisis Northern blot, mapeo con la nucleasa SI, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT- PCR) , retro-transcripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR) , hibridación o microarrays .
10. Un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado en la expresión del producto de expresión del gen Slug (proteína SLUG) , que comprende :
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 1) obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
2) evaluar la expresión de la proteína SLUG en células de dicha muestra de ensayo; y
3) comparar la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo con la expresión de la proteína SLUG en las células de una muestra de control ;
en donde la presencia de una expresión aberrante de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de ensayo.
11. Método según la reivindicación 10, en el que dichas células cancerosas son células tumorales mesenquimales comprenden leucemias y sarcomas.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dichas células tumorales mesenquimales comprenden leucemias y sarcomas .
13. Método según la reivindicación 10, en el que dicho vertebrado sospechoso de tener células cancerosas es un ser humano .
14. Método según la reivindicación 10, en el que dicha muestra de control se selecciona entre (i) muestras
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) biológicas de vertebrados que no tienen células cancerosas, y (ii) muestras biológicas de vertebrados que tienen células cancerosas .
15. Método según la reivindicación 10, en el que la evaluación de la expresión de la proteína SLUG se realiza mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometría de flujo o proteómica.
16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o a un fragmento de la misma, o de un compuesto que interfiere con la función de Slug a nivel del ADN, o a nivel del ARN o a nivel de la proteína (SLUG) , opcionalmente junto con los excipientes farmacéuticamente aceptables.
17. Composición según la reivindicación 16, en la que dicho anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG humana, o a un fragmento de la misma.
18. Composición según la reivindicación 16, en la que dicho anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o a un fragmento de la misma, es un anticuerpo monoclonal o policlonal .
19. Composición según la reivindicación 16, en la que dicho compuesto que interfiere con la función de Slug a nivel de ADN, o de ARN o de proteína (SLUG) es un compuesto, o mezcla de compuestos, que impida la expresión del gen Slug, o que inactive el ARNm de SLUG, o que inactive la proteína SLUG o que compita el efecto de dicha proteína con dominantes negativos .
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
20. Un método para el screening in vi tro de agentes antitumorales basado en la regulación de la expresión del gen Slug que comprende (i) desarrollar un sistema celular que, en determinadas condiciones, expresa el gen Slug, (ii) poner en contacto dicho sistema celular con el compuesto a ensayar, y (iii) evaluar la expresión del gen Slug, de manera que si no se expresa el gen Slug el compuesto ensayado es un agente antitumoral potencial .
21. Empleo de un anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o a un fragmento de la misma, o de un compuesto que interfiere con la función de Slug a nivel de ADN, a nivel de ARN o a nivel de la proteína (SLUG) , en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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