WO2003046181A1 - Mamiferos no humanos transgenicos como modelos para patologias humanas con origen en celulas stem - Google Patents

Mamiferos no humanos transgenicos como modelos para patologias humanas con origen en celulas stem Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to transgenic non-human mammals that reproduce the human pathology that has its origin in stem cells using as a strategy the expression of the genes involved in said pathology in human beings by means of a promoter that directs the expression of a transgene in Sca-cells. 1 + .
  • Transgenic animals are animals that carry an exogenous gene (transgene) in their genome, which has been introduced into the germ cells of the animal, or in an ancestor thereof, at an early stage of development.
  • the introduction of a transgene in an animal can have the purpose of studying the behavior, expression or function of the introduced gene. Alternatively, it can pursue a genetic improvement in the affected individual for therapeutic or animal improvement purposes.
  • transgenic mammals The generation of transgenic mammals is well established [see, for example, Hogan, Constantini & Lacy (1986), "Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1986)] and proof of this It is the high number of articles and patents that describe transgenic mammals.
  • US patents US 4,736,866, US 4,873,191, US 5,175,383 and US 5,175,384, among others, may be cited.
  • transgenic mammals are valuable models for the in vivo study of compounds that could potentially be useful in the treatment or prevention of said disease and / or in the development of useful methods for the diagnosis of said disease.
  • human pathology that has its origin in stem cells includes a group of human diseases, both neoplastic and non-neoplastic, which they originate in stem cells, both hematopoietic and non-hematopoietic, for example, myeloid leukemias, lymphoid leukemia of line B, lymphoid leukemia of lineage T, lymphomas, sarcomas and pathology of stem cell development, for example, congenital immunodeficiencies, anemia of Fanconi, etc.
  • Neoplastic malignant pathology (whose almost all originates from stem cells) is currently treated in humans through a combination of chemotherapy and radiotherapy and / or surgery strategies, strategies that do not discriminate between normal and tumor cells.
  • BCR-ABL p210 acute lymphoblastic leukemia of line B
  • BCR-ABL p190 acute lymphoblastic leukemia of line T
  • HOX11, RHOM2 / LMO-2 and TAL1 acute lymphoblastic leukemia of line T
  • the invention faces the problem of developing animal models that reproduce the human pathology that has its origin in stem cells.
  • transgenic mice that contain a DNA construct comprising a gene that is created and / or activated by chromosomal abnormalities associated with different types of leukemia, or by stem cell migration hematopoietic or embryonic, said gene being under the control of a promoter that directs the expression of said gene in Sca-1 + cells, such as stem cells, develop varying levels of human pathology, both neoplastic and non-neoplastic, originating in cells hematopoietic or non-hematopoietic stem.
  • transgenic mammals By directing the expression of the different genes to the stem cell compartment through the use of a promoter that directs the expression of such genes in Sca-1 cells, a set of animal models that reproduce human pathology has been generated. This fact has been demonstrated by generating a set of transgenic mice that have genotypes that confer a greater tendency to develop human pathology originating in stem cells when compared to non-transgenic mice.
  • the transgenic mammals provided by this invention therefore constitute a new and useful model for the study of said diseases and for the evaluation of compounds useful for the treatment and / or prevention of said diseases.
  • the animal models that reproduce the human pathology originating in stem cells allow: a) to have a unique tool to study how this pathology is generated, maintained and developed; b) predict the efficacy of potentially valid therapies for humans; c) discover new therapies, and d) make genomic identifications of alleles that suppress or increase the natural evolution of each pathology.
  • an object of this invention is a DNA construct comprising a gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells, said gene being under the control of a promoter that directs the expression of said gene in Sca-1 cells.
  • a further object of this invention is a non-human mammal.
  • transgenic that has a genotype that confers a greater tendency to the development of human pathology with stem cell origin when compared to that of a non-transgenic mammal.
  • Said transgenic non-human mammal is useful, among other purposes, for studying said pathology and evaluating compounds potentially useful for treating and / or preventing said pathology. Therefore, an object of this invention is a transgenic non-human mammal that contains a transgene and its progeny.
  • transgenic mouse that contains a transgene and its progeny.
  • said transgenic mouse is selected from the graph formed by Sca-l + BCR-ABL p21 °, Sca-l + BCR-ABL pl90 3 Sca-1 + Slug, Sca-1 + Snail, Sca-1 + HOXl 1, Sca-l + RHOM2 / LMO-2, Sca-1 + TALl.
  • Another additional object of this invention is a process for the preparation of a transgenic non-human mammal useful as an animal model for the in vivo study of human pathology with stem cell origin.
  • Another additional object of this invention is a transgenic non-human mammalian cell line that contains said DNA construct in its genome.
  • Another additional object of this invention is the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells for the generation of animal models that reproduce human pathology originating in stem cells.
  • Another additional object of this invention is the use of said transgenic non-human mammal in the evaluation of compounds potentially useful for the treatment and / or prevention of human pathology originating in stem cells.
  • Another additional object of this invention is the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells as a vehicle for therapeutic strategies.
  • Pharmaceutical compositions containing a DNA construct comprising said promoter and a therapeutic gene, as well as the use of said promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells constitute additional objects of this invention.
  • Figure 1 consists of a set of graphs and photographs that constitute the phenotypic and histological demonstration of Sca-l + BCR-ABL p210 mice with chronic myeloid leukemia.
  • Figure 1A shows the representative analysis of the cellular composition present in the bone marrow (BM) and in the peripheral blood (PB) of Scal + BCR-ABL 21 ° mice.
  • Cells isolated from Sca-l + BCR-ABL p21 ° mice were stained with the indicated monoclonal antibodies [Gr-1, for the granulocytic series; Macl for the myelomonocytic series and Seal for the stem series] and were analyzed by flow cytometry. The percentage of positive cells is indicated.
  • FIG. 1B shows the result of the representative histological examination of spleen, liver and lymph node sections of Sca-l + BCR-ABL 210 mice with chronic myeloid leukemia. All sections were stained with hematosilin and eosin. The arrows indicate the presence of fibrosis and megakaryocytes typical of the chronic myeloid leukemia process.
  • Figure 1C shows a representative staining of the peripheral blood of Sca-l + BCR-ABL p210 mice stained with Gie sa.
  • Figure 2 consists of a set of graphs and photographs that constitute the phenotypic and histological demonstration of myeloid and lymphoid blast crisis in Scal + BCR-ABL p210 mice with chronic myeloid leukemia.
  • Figure 2A shows the representative analysis of the cellular composition present in the bone marrow (BM), spleen and peripheral blood (PB) of Sca-l + BCR-ABL 210 mice in blast crisis.
  • BM bone marrow
  • PB peripheral blood
  • Figure 2C shows a representative staining of the peripheral blood of Sca-l + BCR-ABL p210 mice in blast crisis stained with Giemsa where blast cells are seen.
  • Figure 3 consists of a set of graphs and photographs that constitute the phenotypic and histological demonstration of Sca-l + BCR-ABL p190 mice with acute lymphoblastic line leukemia B.
  • Figure 3A shows DNA analysis by Southern blot of Sca mice -l + BCR-ABL 190 and hybridized controls with a specific ABL probe. The presence of the transgene (pl90) is observed in Sca-1 + BCR-ABL P mice.
  • Figure 3B shows the results of the representative histological examination of spleen, liver, lung and peripheral blood stains of control mice and Sca-l + BCR-ABL pl9 °. All histological sections were stained with hematosilin and eosin and peripheral blood stains with Giemsa and evidenced the presence of leukemic cells in Sca-l + BCR-ABL p190 mice .
  • Figure 3C shows the representative analysis of the cellular composition present in the bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) of control mice and Sca-l ⁇ BCR-ABL p190 mice .
  • BM bone marrow
  • PB peripheral blood
  • the invention provides a DNA construct, hereinafter referred to as the DNA construct of the invention, comprising a gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells, said gene being under the control of a promoter that directs the expression of said gene in Sca-1 + cells.
  • said chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells is selected from the chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B, acute lymphoblastic leukemia of strain T, or with the Hematopoietic or embryonic stem cell migration.
  • the stem cell factor are an example of human pathology associated with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells.
  • the expression "gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells", hereinafter, activatable gene refers to a gene or gene fusion that when incorporated into the genome of a mammal, the probability that said mammal develops the pathology to which said gene or gene fusion is associated increases.
  • said activatable gene is a gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells selected from the chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of lineage. B, acute lymphoblastic leukemia of strain T, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells.
  • said activatable gene is selected from the genes identified as BCR-ABL p210 , BCR-ABL p190 , Slug, Snail, HOX11, RHOM2 / LMO-2 and TAL1.
  • said activatable gene is selected from the following genes: human BCR-ABL p210 , gene fusion that occurs as a consequence of t (9; 22) (q34; ql 1) and is associated to chronic myeloid leukemia; the patients who present this chromosomal anomaly develop over time a blastic crisis, which is an evolutionary phenomenon characteristic of said disease;
  • BCR-ABL p190 human an oncogene generated by the chromosomal translocation t (9; 22) and associated with acute lymphoblastic leukemia of line B;
  • Murine Slug a gene that participates in the mobilization of hematopoietic stem cells
  • Murine Snail a gene from the Slug family that participates in the migration of embryonic stem cells
  • Human HOX11 a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of T-line;
  • Human RHOM2 / LMO-2 a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of T-strain; Y
  • TAL1 murine a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of strain T.
  • Activatable genes identified as BCR-ABL p21 °, BCR-ABL p190 , HOX11, RHOM2 / LMO-2 and TAL1 are described in Annu. Rev. Genet. (1997) 31: 429-453;
  • the Slug gene has been described by Nieto MA, Sargent MG, Wilkinson DG and Cooke J (1994) "Control of cell behavior during vertébrate development by Slug, a zinc-fmger gene".
  • the promoter that directs the expression of the activatable gene in Sca-1 + cells is a nucleic acid sequence involved, and necessary, at the start of transcription, which directs the expression of the activatable gene in Sca-1 cells, and includes the site binding of RNA polymerase.
  • the term "promoter" may include other sites at which transcriptional regulatory proteins can bind.
  • the promoter that directs the expression of the activatable gene in Sca-1 + cells is the mouse pLy-6E.l promoter or a functional fragment thereof, that is, capable of directing tissue specific expression of the Different transgenes in mice.
  • the pLy-6E.l promoter is well characterized and contains all the elements necessary for selective expression in Sca-1 cells [Miles C, Sánchez MJ, Sinclair A, and Dzierzak, E. (1997) "Expression of the Ly-6E .l (Sca-1) transgene in adult hematopoietic stem cells and the developing mouse embryo ". Development 124: 537-547].
  • the term "operably linked” refers to the orientation of the promoter with respect to the sequence of the activatable gene. The promoter is placed in such a way that it is capable of controlling or regulating the expression of said activatable gene.
  • the DNA construct of the invention can be easily obtained by conventional methods of digestion with restriction and binding enzymes, and the like such as those described by Sambrook, Fitsch and Maniatis, eds., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.
  • the DNA construct of the invention can be used, if desired, for the production of vectors useful for transforming mammalian embryos and generating transgenic animals using conventional methods such as those described by Sambrook et al., Cited supra.
  • the DNA construct of the invention can be used to obtain a linear DNA fragment useful for microinjection of DNA to fertilized oocytes in order to generate transgenic animals.
  • Said linear DNA fragment useful for microinjection can be obtained by cutting with restriction enzymes in order to obtain a linear DNA fragment comprising the activatable gene.
  • the invention provides a transgenic non-human mammal that contains in its genome a DNA construct of the invention, that is, a constnition comprising a gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology.
  • a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells, for example, chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of line B, acute lymphoblastic leukemia of line T, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells, said gene being under the control of a promoter that directs the expression of said gene in Sca-1 + cells.
  • the transgenic non-human mammal provided by this invention consequently possesses a genotype that confers a greater tendency to the development of human pathology originating in stem cells when compared to that of a non-transgenic mammal.
  • Said transgenic non-human mammal is useful, among other purposes, for studying said pathology and evaluating compounds potentially useful for treating and / or preventing said pathology.
  • non-human mammal includes any non-human animal belonging to the class of mammals, for example, mice.
  • the transgenic non-human animal provided by this invention is a transgenic mouse identified as: Sca-l + BCR-ABL p210 : these mice develop chronic myeloid leukemia;
  • Sca-1 + Slug these mice mobilize hematopoietic stem cells
  • Sca-1 + Snail these mice mobilize stem embryonic cells
  • Sca-1 + HOXll these mice develop acute lymphoblastic leukemia of T-strain
  • the DNA construct of the invention has been introduced into said mammal, or an ancestor thereof, into an embryogenic stage, for example, in the stage of a cell, or fertilized oocyte, and, generally, not later than the 8-cell stage.
  • the invention provides a method for the preparation of a transgenic non-human mammal that has a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells, comprising
  • said chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells is a human pathology selected from the chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B, acute lymphoblastic leukemia of strain T, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells (for example, alterations of the c-kit receptor or its ligand (SCF)), in which case, the offspring is analyzed to assess the existence of genes activated and / or created by the Chromosomal abnormality associated with human pathology originating in stem cells in question.
  • SCF c-kit receptor or its ligand
  • Non-human transgenic of the present invention One method is to transfect the embryo with said nucleic acid sequence as it occurs naturally, and select the transgenic animals in which said sequence has been integrated into the chromosome in a locus that results in the activation of said sequence. Another method involves modifying the nucleic acid sequence, or its control sequences, before introducing it into the embryo. Another method is to transfect the embryo using a vector that contains the nucleic acid sequence to be introduced.
  • the introduction of the DNA construct of the invention into the germ line of a non-human mammal is performed by microinjection of a linear DNA fragment comprising the activatable gene operably linked to the promoter that directs expression in Sca cells. -1 + in fertilized oocytes of non-human mammal.
  • the fertilized oocytes can be isolated by conventional methods, for example, causing ovulation of the female, either in response to intercourse with a male or by induction by treatment with luteinizing honnone. In general, superovulation is induced in females by hormonal action and they cross with males. After For an appropriate period of time, females are sacrificed to isolate fertilized oocytes from their oviducts, which are maintained in an appropriate culture medium. Fertilized oocytes can be recognized under the microscope by the presence of pronuclei. The microinjection of the linear DNA fragment is advantageously carried out in the male pronucleus.
  • the fertilized oocytes After the introduction of the linear DNA fragment comprising the DNA construct of the invention in the fertilized oocytes, these are incubated in vitro for an appropriate period of time or reimplanted in pseudopregnated mothers (obtained by copulating females with sterile males) . Implantation is performed by conventional methods, for example, anesthetizing the females and inserting a sufficient number of embryos, for example, 10-20 embryos, into the oviducts of the pseudopregnated mothers. After the pregnancy, some embryos will carry out the pregnancy and will lead to transgenic non-human mammals, which theoretically must carry the DNA restriction of the invention integrated in their genomes and present in all cells of the organism. This progeny is the G0 generation and its individuals are the "transgenic founders".
  • Confirmation that an individual has incorporated the injected nucleic acid and is transgenic is obtained by analyzing the individuals of the progeny.
  • DNA is extracted from each individual and is analyzed by conventional methods, for example, by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers or by Southern blot or Northern blot analysis using, for example, a probe that is complementary to at least a part of the transgene, or by Western blot analysis using an antibody against the protein encoded by the transgene.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Southern blot or Northern blot analysis using, for example, a probe that is complementary to at least a part of the transgene, or by Western blot analysis using an antibody against the protein encoded by the transgene.
  • Other methods for assessing the presence of the transgene include, without limitation, appropriate biochemical assays, such as enzymatic and / or immunological assays, histological stains for particular markers, enzymatic activities, etc.
  • the inserted transgene is transmitted as a Mendelian character so it is not difficult to establish stable lines of such an individual. If the individuals of the G0 intersect with the paternal strain (backcrossing) and the transgene It behaves like a Mendelian character, 50% of the progeny will be heterozygous for the inserted transgene (hemizigotic). These individuals constitute the Gl progeny and a transgenic line that can be maintained indefinitely by pairing hemizigotic Gl with normal individuals. Alternatively, Gl individuals can cross each other to produce 25% homozygous for the inserted transgene, 50% hemizigotics and 25% without transgene as long as the transgene does not affect the viability of the offspring.
  • the progeny of a transgenic non-human mammal provided by this invention can therefore be obtained by coupling the transgenic animal with an appropriate individual, or by in vitro fertilization of eggs and / or sperm of transgenic animals.
  • the term "progeny” or “progeny of a transgenic non-human mammal” refers to each and every descendant of each generation subsequent to that of the originally transfonted non-human mammals. The progeny can be analyzed to detect the presence of the transgene by any of the previously mentioned methods.
  • the invention also relates to a transgenic non-human mammalian cell line that contains in its genome a DNA construct of the invention, that is, a construct comprising a gene that is created and / or activated by a chromosomal abnormality associated with a human pathology with stem cell origin, for example, chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of line B, acute lymphoblastic leukemia of line T, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells, said gene being under the control of a promoter that directs the expression of said gene in Sca-1 + cells.
  • said cell line is a murine cell line.
  • the invention relates to the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells for the generation of non-human animal models that reproduce human, neoplastic or non-neoplastic pathology, which has its origin in stem, hematopoietic or non-hematopoietic cells, such as non-human animal models presenting a chromosomal abnormality associated with a human pathology originating in stem cells, for example, a chromosomal abnormality associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B, acute lymphoblastic leukemia of strain T, or the migration of hematopoietic or embryonic stem cells.
  • said promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 cells is the mouse pLy-6E.l promoter.
  • the transgenic non-human mammal provided by this invention, its progeny or the cell line provided by this invention, are useful for, among other applications, evaluating compounds potentially useful for treating and / or preventing a chromosomal abnormality associated with human, neoplastic or non-human pathology.
  • the invention also relates to the use of said transgenic non-human mammal, its progeny or a cell line provided by this invention, in the evaluation of compounds potentially useful for treating and / or preventing a chromosomal abnormality associated with human pathology that has its origin in stem cells.
  • said chromosomal abnormality is selected from the chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B, acute lymphoblastic leukemia of strain T, or the migration of hematopoietic or embryonic stem cells.
  • the evaluation of the compound potentially useful for the treatment and / or prevention of said human pathology originating in stem cells can be performed by administering the compound to be tested to said transgenic animal, at different dosages, and evaluate the physiological response of the animal over time.
  • the administration of the compound to be tested may be orally or parenterally depending on the chemical nature of the compound to be evaluated. In some cases it may be appropriate to administer the compound in question together with co-factors that enhance the efficacy of the compound.
  • the evaluation of the compound potentially useful for the treatment and / or prevention of said human pathology originating in stem cells can be performed by adding the compound to be tested to a medium of cell culture, for an appropriate period of time, at different concentrations, and evaluate the cellular response to the compound over time using the appropriate biochemical and / or histological assays. Sometimes it may be appropriate to add the compound in question to the cell culture medium together with co-factors that enhance the efficacy of the compound.
  • the invention relates to the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 cells as a vehicle of therapeutic strategies for the treatment and / or prevention of a chromosomal abnormality associated with a human pathology that has its origin in stem cells, for example, in the treatment and / or prevention of a chromosomal alteration associated with a human pathology originating in stem cells selected from the chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, the acute lymphoblastic leukemia of strain B, the acute lymphoblastic leukemia of T-line, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells.
  • the promoter directs the expression of a transgene in Sca-1 + cells, such as stem cells, allows the specific and exclusive expression of different therapeutic strategies in stem cells.
  • said promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells is the mouse pLy-6E.l promoter.
  • therapeutic strategies for the treatment and / or prevention of chromosomal abnormalities associated with human pathologies that have their origin in stem cells developed through the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells as a vehicle for said therapeutic strategies are the inactivation of a gene or malignant gene fusion, for example, in neoplasms, or the inclusion of a functional gene that is lacking or the replacement of a defective gene by a functional gene, for example, in immunodeficiencies
  • These therapeutic strategies can be materialized by (i) the preparation of a DNA restriction comprising said promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells and a therapeutic gene suitable for the treatment and / or prevention of the anomaly chromosome associated with human pathology originating in stem cells to be treated and / or prevented, said therapeutic gene being under the control of said gene that directs expression in Sca-1 cells; and (ii) the incorporation of said DNA construct into a vector or system that helps the process of transferring an exogenous
  • said vectors or systems may be viral vectors, for example, based on adeno virus, lentivirus, retro virus, etc., or non-viral such as DNA-liposome, DNA-polymer, DNA-polymer-liposome complexes, etc. [see “Nonviral Vectors for Gene Therapy”, edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)].
  • the term "therapeutic gene” refers to a gene or gene construct useful for the treatment and / or prevention of a chromosomal abnormality associated with human pathology originating in stem cells, and includes ribozymes, genes , antisense gene constructs or fusions, and, in general, any gene, fusion or gene construct useful against the gene created and / or activated by the chromosomal abnormality in question, for example, chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B, leukemia acute lymphoblastic strain T, alterations of the c-kit receptor or its ligand (SCF), etc.
  • SCF c-kit receptor or its ligand
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a DNA construct comprising a therapeutic gene suitable for the treatment and / or prevention of a chromosomal abnormality associated with human pathology originating from stem cells to be treated and / or prevented.
  • a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 + cells, said therapeutic gene being under the control of said promoter that directs the expression in Sca-1 + cells, together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable excipients .
  • Said DNA construct comprising the promoter and the therapeutic gene can be obtained by conventional genetic engineering techniques. Excipients that may be present in the pharmaceutical composition of the invention will depend, among other things, on the manner of administration of said pharmaceutical composition. A review of the different forms of administration of active ingredients, the excipients to be used and their manufacturing procedures can be found in the Treaty of Farmacia Galenica, C. Faul ⁇ i Trillo, Luzán 5, SA de Ediations, 1993.
  • the active ingredient (DNA construction) of the pharmaceutical composition of the invention comprises vectors or systems that help the process of transferring an exogenous gene to a cell, which contain inside said DNA construct, which can be viral, for example, based on adenovirus, lentiviras, retrovims, etc., or non-viral such as the DNA-liposome, DNA-polymer, DNA-polymer complexes -liposome, etc. [see “Nonviral Vectors for Gene Therapy", edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)].
  • the invention also relates to the use of a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 cells in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of a chromosomal abnormality associated with human pathology that has its origin in stem cells, for example, chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of line B, acute lymphoblastic leukemia of line T, or with the migration of hematopoietic or embryonic stem cells (for example, alterations in the c receptor -kit or its ligand).
  • a promoter that directs the expression of a gene in Sca-1 cells in the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of a chromosomal abnormality associated with human pathology that has its origin in stem cells, for example, chromosomal abnormalities associated with chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of line B, acute lymphoblastic leukemia of line T, or with the migration
  • Example 1 describes the generation of transgenic mice
  • Example 2 demonstrates the utility of said transgenic mice as models for the in vivo study of human pathologies originating from stem cells.
  • the characteristic chromosomal translocations that lead to gene fusions encoding chimeric proteins associated with human leukemia have been selected (see Example 2).
  • the altered expression of said gene fusions has been implicated in a characteristic subgroup of human leukemias.
  • Transgenes containing said gene fusions have been introduced into mouse genomes in which the expression of said transgenes is satisfactorily directed by the mouse pLy-6E.l promoter in Sca-1 cells.
  • the pLy-6E.l promoter was used to direct tissue specific expression of the different transgenes (cDNA) in C57BL / 6 x CBA mice (Jackson Laboratory). This promoter is well characterized and the 16 kilobase (kb) fragment used contains all the elements necessary for selective expression in Sca-1 + cells [Miles C, Sánchez MJ, Sinclair A, and Dzierzak, E (1997). "Expression of the Ly-6E.l (Sca-1) transgene in adult hematopoietic stem cells and the developing mouse embryo"; Development 124, 537-547].
  • genes used have been the following: BCR-ABL p210 human, gene fusion that occurs as a result of t (9; 22) (q34; ql 1) and is associated with chronic myeloid leukemia; the patients who present this chromosomal anomaly develop over time a blastic crisis, which is an evolutionary phenomenon characteristic of said disease;
  • BCR-ABL p190 human an oncogene generated by the chromosomal translocation t (9; 22) and associated with acute lymphoblastic leukemia of line B;
  • Murine Slug a gene that participates in the mobilization of hematopoietic stem cells
  • Murine Snail a gene from the Slug family that participates in the migration of embryonic stem cells
  • Human HOX11 a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of T-line
  • Human RHOM2 / LMO-2 a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of T-strain
  • Y a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of T-strain
  • Murine TALl a gene activated by chromosomal abnormalities associated with acute lymphoblastic leukemia of strain T.
  • Activatable genes identified as BCR-ABL p21 °, BCR-ABL 190 , HOX11, RHOM2 / LMO-2 and TALl are described in Annu. Rev. Genet. (1997) 31: 429-453; the Slug gene is described in Science (1994) 264: 835-849; and the Snail gene is described in Developmental Biology (1998) 198: 277-285; Development (1998) 125: 3111-3121; and Gene (2000) 257: 1-12.
  • mice The mice used are C57BL / 6 x CBA and the mothers are CD1; These animals can be purchased commercially, for example, from The Jackson Laboratory (USA).
  • the different cDNAs (human BCR-ABL p190, human BCR-ABL 210 , murine Slug, murine Snail, human HOX11, human LMO2 / RHOM2 and murine TALl) were cloned into the Clal site of the mouse pLy-6E.l promoter.
  • the different cDNAs were obtained by digestion with the appropriate restriction endonucleases and each cDNA was cloned into the vector containing the pLy-6E.l promoter digested with Clal by conventional techniques [Molecular Cloning, thrid edition, CSHL Press by Sambrook and Russell, 2001].
  • ABL p190 , Sca-1 + Slug, Sca-1 + Snail and Sca-l + RHOM2 / LMO-2 obtained a linear DNA fragment for microinjection by Notl digestion, while for the generation of the Sca-1 transgenic mice + HOXl ly Sca-1 + TALl
  • the linear DNA fragment for microinjection was obtained by digestion with BamHI.
  • the different linear DNA fragments were microinjected into fertilized oocytes of C57BL / 6J x CBA mice.
  • the founding transgenic mice were identified by Southern blot analysis using specific probes that recognized said cDNAs, in DNA samples extracted from the tails of mice.
  • the preparation of the fertilized oocytes, the microinjection of the DNA constructs containing the operably linked promoter and gene, the reimplantation of the fertilized oocytes to which said DNA constructs had been injected into the pseudopregnated mother mothers and the maintenance of Nurse mothers during pregnancy were performed using conventional techniques [Hogan, Constantini & Lacy (1986), "Manipulating the Mouse Embryo.
  • the progeny / offspring of the transgenic mice was obtained by crossing the founder mouse with C57BL / 6 x CBA mice and identifying the positives by Southern blot analysis with specific probes that recognized the cDNAs.
  • CD45R / B220 For staining for cytometry the following anti-mouse monoclonal antibodies conjugated to phycoerythrin (PE) (all of Pharmingen) were used: CD45R / B220, Thy-1.1 and Thy-1.2, myeloid markers (Mac 1 / CDl Ib and Gr- 1) and Sig.
  • Cell suspensions from whole blood samples obtained by routine techniques were incubated with purified anti-mouse CD32 / CD16 (Pharmingen) to block receptor binding via Fe and with appropriate dilution of the different antibodies to room temperature or 4 ° C, respectively. Erythrocytes were lysed using lysis solution (Becton Dickinson).
  • MRNA was obtained from different chimeric mouse tissues. By reverse transcription of each RNA preparation treated with DNase I (HT) of RNase cDNA was obtained. The cDNA was subjected to PCR using specific primers in each case [the direct initiator (5 ') corresponded to the first 20 bases of the cDNA and the reverse initiator (3') was complementary to the last 20 bases of the cDNA]. The reactions were carried out following the instructions of the supplier of Taq polymerase (Perkin-Elmer Cetus) under the following conditions: 1 minute at 95 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C for 25 cycles with one final elongation of 10 minutes at 72 ° C.
  • Taq polymerase Perkin-Elmer Cetus
  • Tissue samples were fixed in 4% formaldehyde in PBS and embedded in paraffin. Thin sheets were cut and processed and stained with hematoxylin-eosin by routine techniques. The plates were examined and photographed.
  • DNA from various tissues was prepared by conventional techniques.
  • the DNA was digested with BamHI and the Southern blots were analyzed with a probe of a specific imnunoglobulin [Blood (rapid publication) 90: 2168-2174 (1997)].
  • Transgene expression was observed in both lines and the progeny multiplied to level F7 (Generation 7). Transgene expression was demonstrated by PCR and / or Western blot analysis. Both cell lines showed preferential expression in Sca-1 + cells. Transgene expression was detected in both male and female mice, similar findings being found in both lines of the Sca-l + BCR-ABL 210 transgenic mice.
  • Sca-1 + Snail produce embryonic stem cell migration but not leukemia
  • Sca-1 + HOXll develop acute lymphoblastic leukemias of strain T
  • Sca-1 + TAL1 develop acute lymphoblastic leukemias of strain T. In all cases the expression of the transgene was observed in both lines and the progeny multiplied to level F7 (Generation 7). Transgene expression was demonstrated by PCR and / or Western blot analysis. Both cell lines showed preferential expression in Sca-1 cells. Transgene expression was detected in both male and female mice, similar findings being found in both lines of the transgenic mice.
  • EXAMPLE 2 Production of leukemia in transgenic mice Although in human pathology the chimeric products of the genes BCR-ABL p210 , BCR-ABL 190 , Sca-1 + HOXl l, Sca-l + RHOM2 / LMO-2 and Sca-1 + TALl , are associated with different types of leukemia, namely chronic myeloid leukemia (BCR-ABL p21 °), acute lymphoblastic leukemia of line B (BCR-ABL pl9 °) and acute lymphoblastic leukemia of lineage T (HOX11, RHOM2 / LMO-2 and TALl), the current murine models for these leukemias have failed to consistently reproduce these pathologies [Annu. Rev. Genetics (1997) 31: 429-453; Current Genomics (2000), 1: 71-80] due to the difficulty of choosing a promoter to manipulate expression in the appropriate cell type.
  • BCR-ABL p21 ° chronic myeloid leukemia
  • mice 1 x 10 or " cells were injected intravenously into normal non-irradiated NOD / SCE) mice. All injected mice progressively developed leukemia within 6-11 weeks after On the contrary, none of the 20 mice injected with cells from 10 control mice developed a leukemia whose origin was attributed to the donor. The transplanted cells developed the same leukemia class, and the origin of the leukemic clones of the mice Donors were confirmed by means of a PCR analysis revealing the presence of the core transponders.
  • the male and female transgenic mice showed, uniformly, the same symptoms (of the corresponding pathology) beginning at 8 weeks of age and increasing the clinical signs over time to death. 100%> of the mice, which took place at 12-16 months of age.
  • the transgenic founding mice were male and female and developed the clinical symptoms of the corresponding disease, similar to that of the other transgenic mice. All transgenic mice died from tumors at 14-18 months of age. The percentage of survival in the lines of the 2 founding mice was similar in each case. No tumors were observed in control groups consisting of an equal number of non-transgenic bait mice. Often the animals suffered tachypnea so they were sacrificed.
  • the murine models studied not only resemble the regrouping that takes place in human leukemias considered [chronic myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia of strain B and acute lymphoblastic leukemia of strain T] but also reproduce the same phenotype with which the gene fusions involved are associated in human pathologies.
  • These results validate these murine models as ideal models for the in vivo study of the biology of the transgenes tested (BCR-ABL p21 °, BCR-ABL p190 , Sca-1 + HOXll, Sca-l + RHOM2 / LMO-2 and Sca - 1 + SIZ1).

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Abstract

Mamíferos no humanos transgénicos que reproducen la patología humana que tiene su origen en células stem, por ejemplo, anomalías cromosómicas asociadas a leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o a la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias, utilizando como estrategia la expresión de los genes involucrados en dicha patología en seres humanos mediante un promotor que dirige la expresión de un transgén en células Sca-1+. Dichos animales transgénicos constituyen un modelo para el estudio de dichas enfermedades y para la evaluación de compuestos útiles para el tratamiento y/o la prevención de dichas enfermedades.

Description

MAMÍFEROS NO HUMANOS TRANSGENICOS COMO MODELOS PARA PATOLOGÍAS HUMANAS CON ORIGEN EN CÉLULAS STEM
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con mamíferos no humanos transgénicos que reproducen la patología humana que tiene su origen en células stem utilizando como estrategia la expresión de los genes involucrados en dicha patología en seres humanos mediante un promotor que dirige la expresión de un transgén en células Sca-1+.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los animales transgénicos son animales que portan un gen exógeno (transgén) en su genoma, que les ha sido introducido en células germinales del animal, o en un antecesor del mismo, en una etapa temprana del desarrollo. La introducción de un transgén en un animal puede tener como finalidad el estudio del comportamiento, expresión o función del gen introducido. Alternativamente, puede perseguir una mejora genética en el individuo afectado con fines terapéuticos o de mejora animal.
La generación de mamíferos transgénicos está bien establecida [véase, por ejemplo, Hogan, Constantini & Lacy (1986), "Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1986)] y prueba de ello es el elevado número de artículos y patentes que describen mamíferos transgénicos. A modo ilustrativo, pueden citarse las patentes norteamericanas US 4.736.866, US 4.873.191, US 5.175.383 y US 5.175.384, entre otras.
La expresión de un transgén puede conferir un nuevo fenotipo al mamífero. Dependiendo del transgén insertado y de su nivel de expresión en el mamífero, éste puede hacerse más o menos susceptible a ima enfermedad determinada. Tales mamíferos transgénicos son modelos valiosos para el estudio in vivo de compuestos que potencialmente podrían ser útiles en el tratamiento o prevención de dicha enfermedad y/o en el desarrollo de métodos útiles para el diagnóstico de dicha enfermedad. Bajo la denominación "patología humana que tiene su origen en células stem" se incluye a un grapo de enfermedades humanas, tanto neoplásicas como no neoplásicas, que tienen su origen en células stem, tanto hematopoyéticas como no hematopoyéticas, por ejemplo, leucemias mieloides, leucemias linfoides de estirpe B, leucemias linfoides de estirpe T, linfomas, sarcomas y patología de desarrollo de células stem, por ejemplo, inmunodeficiencias congénitas, anemia de Fanconi, etc. La patología neoplásica maligna (cuya práctica totalidad tiene su origen en células stem) es tratada actualmente en los seres humanos mediante una combinación de estrategias de quimioterapia y radioterapia y/o cirugía, estrategias que no discriminan entre células normales y tumorales. El tratamiento terapéutico de la patología no neoplásica se realiza mediante terapias sustitutivas (inmunoglobulinas, vacunas, transfusiones, etc.). Durante los últimos años se han identificado los genes activados y/o generados por anomalías cromosómicas asociadas tanto a tumores hematopoyéticos como sólidos [Annu. Rev. Genetics (1997) 31 :429-453]. A pesar de su identificación no se dispone actualmente de modelos animales que reproduzcan dicha patología [Oncogene (1999) 18:5248; Oncogene (1999) 18:5249-5252], aunque se haya demostrado que dichos genes son tumorigénicos in vivo [Current Genomics (2000), 1 :71-80]. Asimismo, recientemente, se ha demostrado que la diana donde se inicia el cáncer es una célula stem [Blood (2000) 95:1007-1113; Oncogene (2000) 19(20):2413-2422; Nature (2001) 414: 105-111].
En Current Genomics (2000), 1:71-80 se mencionan unos modelos conocidos de ratones que expresan genes o fusiones génicas que se activan por anomalías cromosómicas asociadas con distintas patologías, por ejemplo, leucemia mieloide crónica
(BCR-ABLp210), leucemia linfoblástica aguda de estirpe B (BCR-ABLp190), leucemia linfoblástica aguda de estirpe T (HOX11, RHOM2/LMO-2 y TAL1), etc. Sin embargo, dichos modelos sólo han puesto de manifiesto que las proteínas expresadas por dichos genes o fusiones génicas son rumorigénicas, pero no han reproducido específicamente la patología humana con la que se asocian.
A la vista de los efectos tan devastadores que produce la patología humana con origen en células stem, existe la necesidad de desarrollar animales apropiados que proporcionen un modelo in vivo para estudiar dicha patología humana así como compuestos potencialmente útiles en el tratamiento y/o prevención de dicha patología. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta con el problema de desarrollar modelos animales que reproduzcan la patología humana que tiene su origen en células stem.
La solución proporcionada por esta invención se basa en el descubrimiento de que ratones transgénicos que contienen una construcción de ADN que comprende un gen que se crea y/o activa por anomalías cromosómicas asociadas a distintos tipos de leucemia, o bien por la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1+, tales como las células stem, desarrollan niveles variables de patología humana, tanto neoplásica como no neoplásica, con origen en células stem hematopoyéticas o no hematopoyéticas. Al dirigir la expresión de los diferentes genes al compartimento de células stem mediante el empleo de un promotor que dirige la expresión de tales genes en células Sca-1 se ha conseguido generar un conjunto de modelos animales que reproducen la patología humana. Este hecho ha sido demostrado mediante la generación de un conjunto de ratones transgénicos que poseen unos genotipos que confieren una mayor tendencia al desarrollo de patología humana con origen en células stem cuando se comparan con ratones no transgénicos. Los mamíferos transgénicos proporcionados por esta invención constituyen, por tanto, un nuevo y útil modelo para el estudio de dichas enfermedades y para la evaluación de compuestos útiles para el tratamiento y/o la prevención de dichas enfermedades.
Los modelos animales que reproducen la patología humana con origen en células stem proporcionados por esta invención permiten: a) disponer de una herramienta única para estudiar cómo se genera, se mantiene y desarrolla dicha patología; b) predecir la eficacia de terapias potencialmente válidas para seres humanos; c) descubrir nuevas terapias, y d) hacer identificaciones genómicas de alelos que supriman o aumenten la evolución natural de cada patología.
Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye una construcción de ADN que comprende un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1 .
Un objeto adicional de esta invención lo constituye un mamífero no humano transgénico que posee un genotipo que confiere una mayor tendencia al desarrollo de patología humana con origen en células stem cuando se compara con la de un mamífero no transgénico. Dicho mamífero no humano transgénico es útil, entre otros fines, para estudiar dicha patología y evaluar compuestos potencialmente útiles para tratar y/o prevenir dicha patología. Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un mamífero no humano transgénico que contiene un transgén y su progenie.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un ratón transgénico que contiene un transgén y su progenie. En una realización particular, dicho ratón transgénico se selecciona del grapo formado por Sca-l+BCR-ABLp21°, Sca-l+BCR-ABLpl90 3 Sca- 1+Slug, Sca-1+Snail, Sca-1+HOXl 1, Sca-l+RHOM2/LMO-2, Sca-1+TALl.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para la preparación de un mamífero no humano transgénico útil como modelo animal para el estudio in vivo de patología humana con origen en células stem.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una línea celular de mamífero no humano transgénica que contiene en su genoma dicha construcción de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ para la generación de modelos animales que reproducen la patología humana con origen en células stem.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicho mamífero no humano transgénico en la evaluación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de patología humana con origen en células stem.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ como vehículo de estrategias terapéuticas. Composiciones farmacéuticas que contienen una construcción de ADN que comprende dicho promotor y un gen terapéutico, así como el empleo de dicho promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ constituyen objetos adicionales de esta invención.
Otros objetos resultarán aparentes para un experto en la materia a la vista de la descripción y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 consta de un conjunto de gráficas y fotografías que constituyen la demostración fenotípica e histológica de ratones Sca-l+BCR-ABLp210 con leucemia mieloide crónica. La Figura 1A muestra el análisis representativo de la composición celular presente en la médula ósea (BM) y en la sangre periférica (PB) de ratones Sca- l+BCR-ABL 21°. Células aisladas de ratones Sca-l+BCR-ABLp21° se tiñeron con los anticuerpos monoclonales indicados [Gr-1, para la serie granulocítica; Macl para la serie mielomonocítica y Seal para la serie stem] y se analizaron mediante citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células positivas. La distribución de células positivas para Gr-1 + Macl y Gr-1+Scal se muestra de acuerdo al tamaño (size, SSC) y la granularidad (forward, FSC). La Figura IB muestra el resultado del examen histológico representativo de secciones de bazo, hígado y nodulos linfáticos de ratones Sca-l+BCR-ABL 210 con leucemia mieloide crónica. Todas las secciones se tiñeron con hematosilina y eosina. Las flechas indica la presencia de fibrosis y megacariocitos típicos del proceso de leucemia mieloide crónica. La Figura 1C muestra una tinción representativa de la sangre periférica de ratones Sca-l+BCR-ABLp210 teñida con Gie sa.
La Figura 2 consta de un conjunto de gráficas y fotografías que constituyen la demostración fenotípica e histológica de crisis blástica mieloide y linfoide en ratones Sca- l+BCR-ABLp210 con leucemia mieloide crónica. La Figura 2A muestra el análisis representativo de la composición celular presente en la médula ósea (BM), bazo y en la sangre periférica (PB) de ratones Sca-l+BCR-ABL 210 en crisis blástica. Células aisladas de ratones Sca-l+BCR-ABLp210 en crisis blástica se tiñeron con los anticuerpos monoclonales indicados [Gr-1, para la serie granulocítica; Macl para la serie mielomonocítica; B220 para la serie linfoide B, y Seal para la serie stem] y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestra un ejemplo de crisis blástica linfoide B (PB#1) y otro de crisis blástica mieloide (PB#2). La distribución de células positivas para Gr-1 + Macl se muestra de acuerdo al tamaño (size, SSC). La Figura 2B muestra el resultado del examen histológico representativo de secciones de hígado de ratones Sca-1+BCR- ABLp con crisis blástica. Todas las secciones se tiñeron con hematosilina y eosina. Se observa la infiltración hepática por las células leucémicas. La Figura 2C muestra una tinción representativa de la sangre periférica de ratones Sca-l+BCR-ABLp210 en crisis blástica teñida con Giemsa donde se aprecian las células blásticas. La Figura 3 consta de un conjunto de gráficas y fotografías que constituyen la demostración fenotípica e histológica de ratones Sca-l+BCR-ABLp190 con leucemia aguda linfoblástica de estirpe B. La Figura 3A muestra el análisis de ADN mediante Southern blot de ratones Sca-l+BCR-ABL 190 y controles hibridados con una sonda específica para ABL. Se observa la presencia del transgén (pl90) en ratones Sca-1+BCR- ABLP . La Figura 3B muestra los resultados del examen histológico representativo de secciones de bazo, hígado, pulmón y tinciones de sangre periférica de ratones controles y Sca-l+BCR-ABLpl9°. Todas las secciones histológicas se tiñeron con hematosilina y eosina y las tinciones de sangre periférica con Giemsa y evidenciaron la presencia de células leucémicas en los ratones Sca-l+BCR-ABLp190. La Figura 3C muestra el análisis representativo de la composición celular presente en la médula ósea (BM) y en la sangre periférica (PB) de ratones controles y ratones Sca-l^BCR-ABLp190. Células aisladas de ratones controles y ratones Sca-l+BCR-ABL 190 se tiñeron con los anticuerpos monoclonales indicados [Macl para la serie mielomonocítica; B220, CD19 y CD43 para la serie linfoide y Seal para la serie stem] y se analizaron mediante citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células neoplásicas en los ratones Sca-l+BCR-ABLp190. La distribución de células neoplásicas para B220/CD19 se muestra de acuerdo al tamaño (size, SSC) y la granularidad (forward/FSC).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una construcción de ADN, en adelante construcción de ADN de la invención, que comprende un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1+. En una realización particular, dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. Las alteraciones del receptor c-l it o su ligando, el stem cell factor (SCF) son un ejemplo de patología humana asociada con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem", en adelante, gen activable, se refiere a un gen o fusión génica que cuando se incorpora en el genoma de un mamífero aumenta la probabilidad de que dicho mamífero desarrolle la patología a la que está asociado dicho gen o fusión génica. En una realización particular, dicho gen activable es un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem seleccionada entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. A modo ilustrativo, dicho gen activable se selecciona entre los genes identificados como BCR- ABLp210, BCR-ABLp190, Slug, Snail, HOX11, RHOM2/LMO-2 y TAL1. De fonna más concreta, en una realización particular, dicho gen activable se selecciona entre los siguientes genes: BCR-ABLp210 humano, fusión génica que se produce como consecuencia de la t(9;22)(q34;ql 1) y se asocia a leucemia mieloide crónica; los pacientes que presentan esta anomalía cromosómica desarrollan con el tiempo una crisis blástica, que es un fenómeno evolutivo característico de dicha enfermedad;
BCR-ABLp190 humano, un oncogén generado por la translocación cromosómica t(9;22) y asociado a leucemia linfoblástica aguda de estirpe B;
Slug murino, un gen que participa en la movilización de células stem hematopoyéticas;
Snail murino, un gen de la familia Slug que participa en la migración de células stem embrionarias; HOX11 humano, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T;
RHOM2/LMO-2 humano, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T; y
TAL1 murino, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T. Los genes activables identificados como BCR-ABLp21°, BCR-ABLp190 , HOX11, RHOM2/LMO-2 y TAL1 se describen en Annu. Rev. Genet. (1997) 31:429-453; el gen Slug ha sido descrito por Nieto MA, Sargent MG, Wilkinson DG and Cooke J (1994) "Control of cell behavior during vertébrate development by Slug, a zinc-fmger gene". Science 264: 835-849; y el gen Snail ha sido descrito por Jiang, R, Lan, Y, Norton, CR, Sundberg, JP, and Gridley, T (1998) "The Slug gene is not essential for mesoderm or neural crest development in mice". Developmental Biology 198:277-285; Sefion, M, Sánchez, S, and Nieto, MA (1998) "Conserved and divergent roles for members of the Snail family of transcription factors in the chick amd mouse embryo". Development 125:3111-3121; y Hemavathy, K, Ashraf, SI, and Ip, YT (2000) "Snail/slug family of repressors: slowly going into the fast lañe of development and cáncer". Gene 257:1-12. Estos genes activables pueden obtenerse en base a la información proporcionada por las publicaciones previamente mencionadas. Aunque se ha particularizado para unas cuantas realizaciones particulares, las enseñanzas de la presente invención son aplicables a cualquier gen o fusión génica creado y/o activado por una anomalía cromosómica presente en el cáncer. Información relacionada con tales genes o fusiones génicas puede encontrarse, por ejemplo, en Annu. Rev. Genet. (1997) 31:429-453.
El promotor que dirige la expresión del gen activable en células Sca-1+ es una secuencia de ácido nucleico implicada, y necesaria, en el inicio de la transcripción, que dirige la expresión del gen activable en células Sca-1 , e incluye el sitio de unión de la ARN polimerasa. Dentro del contexto de la presente invención, el término "promotor" puede incluir otros sitios en los que pueden unirse proteínas reguladoras de la transcripción. En una realización particular, el promotor que dirige la expresión del gen activable en células Sca-1+ es el promotor pLy-6E.l de ratón o un fragmento funcional del mismos, es decir, capaz de dirigir la expresión específica de tejido de los diferentes transgenes en ratones. El promotor pLy-6E.l está bien caracterizado y contiene todos los elementos necesarios para la expresión selectiva en células Sca-1 [Miles C, Sánchez M-J, Sinclair A, and Dzierzak, E. (1997) "Expression of the Ly-6E.l (Sca-1) transgene in adult hematopoietic stem cells and the developing mouse embryo". Development 124:537- 547]. La expresión "operativamente unida" se refiere a la orientación del promotor con respecto a la secuencia del gen activable. El promotor se coloca de tal manera que es capaz de controlar o regular la expresión de dicho gen activable.
La construcción de ADN de la invención puede obtenerse fácilmente por métodos convencionales de digestión con enzimas de restricción y unión, y similares tales como los descritos por Sambrook, Fitsch and Maniatis, eds., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.
La construcción de ADN de la invención puede utilizarse, si se desea, para la producción de vectores útiles para transformar embriones de mamífero y generar animales transgénicos utilizando métodos convencionales tales como los descritos por Sambrook et al., citado supra.
Alternativamente, la construcción de ADN de la invención puede utilizarse para la obtención de un fragmento lineal de ADN útil para la microinyección de ADN a oocitos fertilizados con el fin de generar animales transgénicos. Dicho fragmento lineal de ADN útil para microinyección puede obtenerse mediante corte con enzimas de restricción con el fin de obtener un fragmento lineal de ADN que comprende el gen activable.
En otro aspecto, la invención proporciona un mamífero no humano transgénico que contiene en su genoma una construcción de ADN de la invención, es decir, una constnicción que comprende un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, por ejemplo, anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1+. El mamífero no humano transgénico proporcionado por esta invención posee, consecuentemente, un genotipo que confiere una mayor tendencia al desarrollo de patología humana con origen en células stem cuando se compara con la de un mamífero no transgénico. Dicho mamífero no humano transgénico es útil, entre otros fines, para estudiar dicha patología y evaluar compuestos potencialmente útiles para tratar y/o prevenir dicha patología.
La expresión "mamífero no humano", tal como se utiliza en esta descripción incluye a cualquier animal no humano perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, ratones.
En una realización particular, el animal no humano transgénico proporcionado por esta invención es un ratón transgénico identificado como: Sca-l+BCR-ABLp210: estos ratones desarrollan leucemia mieloide crónica;
Sca-l+BCR-ABLp190: estos ratones desarrollan leucemia linfoblástica aguda de estirpe B;
Sca-1+Slug: estos ratones movilizan células stem hematopoyéticas;
Sca-1+Snail: estos ratones movilizan células stem embrionarias; Sca-1+HOXll: estos ratones desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T;
Sca-l+RHOM2/LMO-2: estos ratones desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T; y
Sca-1+TALl: estos ratones desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T.
Para la generación del mamífero no humano transgénico proporcionado por esta invención, la construcción de ADN de la invención ha sido introducida en dicho mamífero, o en un antecesor del mismo, en un estadio embriogénico, por ejemplo, en el estadio de una célula, u oocito fertilizado, y, generalmente, no más tarde del estadio de 8 células.
Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de un mamífero no humano transgénico que posee una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, que comprende
(i) introducir una constracción de ADN de la invención en un oocito fecundado de un mamífero no humano transgénico;
(ii) implantar dicho oocito fecundado en una madre nodriza pseudopreñada para producir descendencia; y
(iii) analizar dicha descendencia para evaluar la existencia de genes activados y/o creados por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem.
En una realización particular, dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem es una patología humana seleccionada entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias (por ejemplo, alteraciones del receptor c-kit o de su ligando (SCF)), en cuyo caso, se analiza la descendencia para evaluar la existencia de genes activados y/o creados por la anomalía cromosómica asociada a la patología humana con origen en células stem en cuestión.
Existen diversos medios conocidos por el estado de la técnica mediante los cuales una secuencia de ácido nucleico puede ser introducida en un embrión de un animal de forma que pueda ser incorporada cromosómicamente en un estado activado, todos los cuales pueden ser aplicados en la generación de mamíferos no humanos transgénicos de la presente invención. Un método consiste en transfectar el embrión con dicha secuencia de ácido nucleico tal como ocurre de forma natural, y seleccionar los animales transgénicos en los que dicha secuencia se ha integrado en el cromosoma en un locus que da como resultado la activación de dicha secuencia. Otro método implica modificar la secuencia de ácido nucleico, o sus secuencias de control, antes de introducirla en el embrión. Otro método consiste en transfectar el embrión utilizando un vector que contiene la secuencia de ácido nucleico a introducir.
En una realización particular, la introducción de la construcción de ADN de la invención en la línea germinal de un mamífero no humano se realiza mediante microinyección de un fragmento de ADN lineal que comprende el gen activable operativamente unido al promotor que dirige la expresión en células Sca-1+ en oocitos fecundados de mamífero no humano.
Los oocitos fecundados pueden aislarse por métodos convencionales, por ejemplo, provocando la ovulación de la hembra, bien en respuesta a cópula con un macho o bien mediante inducción por tratamiento con honnona luteinizante. En general, se induce una superovulación en las hembras por acción hormonal y se cruzan con machos. Al cabo de un periodo de tiempo apropiado, las hembras se sacrifican para aislar los oocitos fecundados de sus oviductos, los cuales se mantienen en un medio de cultivo apropiado. Los oocitos fecundados pueden ser reconocidos al microscopio por la presencia de pronúcleos. La microinyección del fragmento de ADN lineal se realiza, ventajosamente, en el pronúcleo masculino.
Tras la introducción del fragmento lineal de ADN que comprende la construcción de ADN de la invención en los oocitos fecundados, éstos se incuban in vitro durante un periodo de tiempo apropiado o bien se reimplantan en madres nodriza pseudopreñadas (obtenidas haciendo copular hembras con machos estériles). La implantación se realiza por métodos convencionales, por ejemplo, anestesiando las hembras e insertando quüúrgicamente un número suficiente de embriones, por ejemplo, 10-20 embriones, en los oviductos de las madres nodriza pseudopreñadas. Finalizada la gestación, algunos embriones llevarán a término la gestación y darán lugar a mamíferos no humanos transgénicos, los cuales teóricamente deben llevar la constracción de ADN de la invención integrada en sus genomas y presente en todas las células del organismo. Esta progenie es la generación G0 y sus individuos son los "fundadores transgénicos". La confirmación de que un individuo ha incorporado el ácido nucleico inyectado y es transgénico se obtiene analizando los individuos de la progenie. Para ello, a partir de una muestra de material del animal, por ejemplo, a partir de un trocito de cola del animal (en caso de que sea, por ejemplo, un ratón) o de una muestra de sangre, se extrae el ADN de cada individuo y se analiza por métodos convencionales, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando unos iniciadores específicos o bien mediante análisis Southern blot o Northern blot utilizando, por ejemplo, una sonda que es complementaria a, al menos, una parte del transgén, o bien mediante análisis Western blot utilizando un anticuerpo frente a la proteína codificada por el transgén. Otros métodos para evaluar la presencia del transgén incluyen, sin limitación, ensayos bioquímicos apropiados, tales como ensayos enzimáticos y/o inmunológicos, tinciones histológicas para marcadores particulares, actividades enzimáticas, etc.
En general, en animales transgénicos, el transgén insertado se transmite como un carácter mendeliano por lo que no es difícil establecer líneas estables de tales individuo. Si los individuos de la G0 se cruzan con la cepa paterna (retrocrazamiento) y el transgén se comporta como un carácter mendeliano, el 50% de la progenie será heterozigótico para el transgén insertado (hemizigóticos). Estos individuos constituyen la progenie Gl y una línea transgénica que se puede mantener indefinidamente apareando hemizigóticos de la Gl con individuos normales. Alternativamente, individuos de la Gl pueden cruzarse entre sí para producir un 25% de homozigóticos para el transgén insertado, un 50% de hemizigóticos y un 25% sin transgén siempre y cuando el transgén no afecte a la viabilidad de la descendencia.
La progenie de un mamífero no humano transgénico proporcionado por esta invención, tal como la progenie de un ratón transgénico proporcionado por esta invención, puede obtenerse, por tanto, mediante copulación del animal transgénico con un individuo apropiado, o bien mediante fertilización in vitro de huevos y/o esperma de los animales transgénicos. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "progenie" o "progenie de un mamífero no humano transgénico" se refiere a todos y cada uno de los descendientes de cada generación posterior a la de los mamíferos no humanos originalmente transfonnados. La progenie puede ser analizada para detectar la presencia del transgén mediante cualquiera de los métodos citados previamente.
La invención también se refiere a una línea celular de mamífero no humano transgénico que contiene en su genoma una construcción de ADN de la invención, es decir, una construcción que comprende un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, por ejemplo, anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1+. En una realización particular, dicha línea celular es una línea celular murina.
En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ para la generación de modelos animales no humanos que reproducen la patología humana, neoplásica o no neoplásica, que tiene su origen en células stem, hematopoyéticas o no hematopoyéticas, tales como modelos animales no humanos que presentan una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, por ejemplo, una anomalía cromosómica asociada a la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o a la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. En mía realización particular, dicho promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1 es el promotor pLy-6E.l de ratón. El mamífero no humano transgénico proporcionado por esta invención, su progenie o la línea celular proporcionada por esta invención, son útiles para, entre otras aplicaciones, evaluar compuestos potencialmente útiles para tratar y/o prevenir una anomalía cromosómica asociada a patología humana, neoplásica o no neoplásica, que tiene su origen en células stem, hematopoyéticas o no hematopoyéticas, por ejemplo, anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. Por tanto, la invención también se refiere al empleo de dicho mamífero no humano transgénico, su progenie o una línea celular proporcionada por esta invención, en la evaluación de compuestos potencialmente útiles para tratar y/o prevenir una anomalía cromosómica asociada a patología humana que tiene su origen en células stem. En una realización particular, dicha anomalía cromosómica se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas a la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o a la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
En el caso de los animales transgénicos, la evaluación del compuesto potencialmente útil para el tratamiento y/o prevención de dicha patología humana con origen en células stem se puede realizar administrando el compuesto a ensayar a dicho animal transgénico, a distintas dosificaciones, y evaluar la respuesta fisiológica del animal a lo largo del tiempo. La administración del compuesto a ensayar puede ser por vía oral o parenteral dependiendo de la naturaleza química del compuesto a evaluar. En algunos casos puede ser apropiado administrar el compuesto en cuestión junto con co-factores que potencien la eficacia del compuesto.
En el caso de las líneas celulares de la invención, la evaluación del compuesto potencialmente útil para el tratamiento y/o prevención de dicha patología humana con origen en células stem se puede realizar añadiendo el compuesto a ensayar a un medio de cultivo celular, durante un periodo de tiempo apropiado, a distintas concentraciones, y evaluar la respuesta celular al compuesto a lo largo del tiempo utilizando los ensayos bioquímicos y/o histológicos apropiados. En ocasiones puede ser apropiado añadir el compuesto en cuestión al medio de cultivo celular junto con co-factores que potencien la eficacia del compuesto.
En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1 como vehículo de estrategias terapéuticas para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a una patología humana que tiene su origen en células stem, por ejemplo, en el tratamiento y/o prevención de una alteración cromosómica asociada con una patología humana con origen en células stem seleccionada entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias. El hecho de que el promotor dirija la expresión de un transgén en células Sca-1+, tales como las células stem, permite la expresión específica y exclusiva de diferentes estrategias terapéuticas en células stem. En una realización particular, dicho promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ es el promotor pLy-6E.l de ratón.
Entre las estrategias terapéuticas para el tratamiento y/o la prevención de anomalías cromosómicas asociadas a patologías humanas que tienen su origen en células stem desarrolladas mediante el empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ como vehículo de dichas estrategias terapéuticas se encuentran la inactivación de un gen o fusión génica maligna, por ejemplo, en neoplasias, o bien la inclusión de un gen funcional del que se carece o el re-emplazamiento de un gen defectuoso por un gen funcional , por ejemplo, en imunodeficiencias. Estas estrategias terapéuticas se pueden materializar mediante (i) la preparación de una constracción de ADN que comprende dicho promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ y un gen terapéutico adecuado para el tratamiento y/o la prevención de la anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem a tratar y/o prevenir, estando dicho gen terapéutico bajo el control de dicho gen que dirige la expresión en células Sca-1 ; y (ii) la incorporación de dicha construcción de ADN en un vector o sistema que ayuda al proceso de transferencia de un gen exógeno a una célula, facilitando la entrega y biodisponibilidad intracelular del mismo de tal modo que éste pueda funcionar correctamente. A modo ilustrativo, dichos vectores o sistemas pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en adeno virus, lentivirus, retro virus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero- liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].
Tal como se utiliza en esta descripción el término "gen terapéutico" se refiere a un gen o a una construcción génica útil para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem, e incluye ribozimas, genes, fusiones o construcciones génicas antisentido, y, en general, cualquier gen, fusión o construcción génica útil frente al gen creado y/o activado por la anomalía cromosómica en cuestión, por ejemplo, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, alteraciones del receptor c- kit o de su ligando (SCF), etc. La invención se refiere, además, a una composición farmacéutica que comprende una construcción de ADN que comprende un gen terapéutico adecuado para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem a tratar y/o prevenir, y un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+, estando dicho gen terapéutico bajo el control de dicho promotor que dirige la expresión en células Sca-1+, junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Dicha construcción de ADN que comprende el promotor y el gen terapéutico puede obtenerse por técnicas convencionales de ingeniería genética. Los excipientes que pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
En una realización particular, debido a la naturaleza génica del principio activo (construcción de ADN) de la composición farmacéutica de la invención, ésta comprende unos vectores o sistemas que ayudan al proceso de transferencia de un gen exógeno a una célula, que contienen en su interior a dicha construcción de ADN, que pueden ser virales, por ejemplo, basados en adenovirus, lentiviras, retrovims, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].
La invención también se refiere al empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1 en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana que tiene su origen en células stem, por ejemplo, anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias (por ejemplo, alteraciones en el receptor c-kit o su ligando).
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe la generación de ratones transgénicos, mientras que el Ejemplo 2 pone de manifiesto la utilidad de dichos ratones transgénicos como modelos para el estudio in vivo de patologías humanas con origen en células stem. Para ello, se han seleccionado las translocaciones cromosómicas características que conducen a las fusiones génicas que codifican para proteínas quiméricas asociadas con leucemias humanas (véase el Ejemplo 2). La expresión alterada de dichas fusiones génicas ha sido implicada en un subgrupo característico de leucemias humanas. Se han introducido transgenes conteniendo dichas fusiones génicas en genomas de ratón en los que la expresión de dichos transgenes es dirigida de forma satisfactoria por el promotor pLy-6E.l de ratón en células Sca-1 . La consecuente sobreexpresión de dichos productos génicos da como resultado la mayoría de los síntomas de las leucemias humanas estudiadas en cada caso, incluyendo la presencia de blastos (en su caso) y un bloque concordante en el programa de diferenciación. No se han encontrado tumores de otros tejidos en los ratones transgénicos, lo que conduce a la conclusión de que la sobreexpresión de dichos τransgenes es un determinante clave de las leucemias humanas estudiadas, proporcionándose de este modo el primer modelo murino que mimetiza in vivo la patología humana con la que están asociadas las fiísiones génicas estudiadas. Estos resultados ponen de manifiesto que los ratones transgénicos proporcionados por esta invención constituyen un nuevo modelo para estudiar in vivo la biología de los transgenes estudiados e indican la eficacia de esta estrategia para estudiar el papel de anomalías cromosómicas específicas en el desarrollo de tumores.
EJEMPLOS
Los Materiales y Métodos utilizados en los Ejemplos que se describen a continuación fueron los siguientes.
MATERIALES
Promotor: Se utilizó el promotor pLy-6E.l para dirigir la expresión específica de tejido de los diferentes transgenes (ADNc) en ratones C57BL/6 x CBA (Jackson Laboratory). Este promotor está bien caracterizado y el fragmento de 16 kilobases (kb) utilizado contiene todos los elementos necesarios para la expresión selectiva en células Sca-1+ [Miles C, Sánchez M-J, Sinclair A, and Dzierzak, E (1997). "Expression of the Ly-6E.l (Sca-1) transgene in adult hematopoietic stem cells and the developing mouse embryo"; Development 124, 537-547].
Genes: Los genes utilizados han sido los siguientes: BCR-ABLp210 humano, fusión génica que se produce como consecuencia de la t(9;22)(q34;ql 1) y se asocia a leucemia mieloide crónica; los pacientes que presentan esta anomalía cromosómica desarrollan con el tiempo una crisis blástica, que es un fenómeno evolutivo característico de dicha enfermedad;
BCR-ABLp190 humano, un oncogén generado por la translocación cromosómica t(9;22) y asociado a leucemia linfoblástica aguda de estirpe B;
Slug murino, un gen que participa en la movilización de células stem hematopoyéticas;
Snail murino, un gen de la familia Slug que participa en la migración de células stem embrionarias; HOX11 humano, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T; RHOM2/LMO-2 humano, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T; y
TALl murino, un gen activado por anomalías cromosómicas asociadas a leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T.
Los genes activables identificados como BCR-ABLp21°, BCR-ABL 190 , HOX11, RHOM2/LMO-2 y TALl se describen en Annu. Rev. Genet. (1997) 31:429-453; el gen Slug se describe en Science (1994) 264:835-849; y el gen Snail se describe en Developmental Biology (1998) 198:277-285; Development (1998) 125:3111-3121; y Gene (2000) 257:1-12.
Ratones: Los ratones utilizados son C57BL/6 x CBA y las madres nodriza son CD1; estos animales se pueden adquirir comercialmente, por ejemplo, en The Jackson Laboratory (EEUU).
MÉTODOS
Generación y selección (screening) de ratones transgénicos
Los diferentes ADNc (BCR-ABLp190 humano, BCR-ABL 210 humano, Slug murino, Snail murino, HOX11 humano, LMO2/RHOM2 humano y TALl murino) fueron clonados en el sitio Clal del promotor pLy-6E.l de ratón. Los distintos ADNc se obtuvieron mediante digestión con las endonucleasas de restricción apropiadas y cada ADNc se clonó en el vector que contenía el promotor pLy-6E.l digerido con Clal mediante técnicas convencionales [Molecular Cloning, thrid edition, CSHL Press by Sambrook and Russell, 2001]. Para la generación de los ratones transgénicos Sca-l+BCR-ABLp210, Sca-1+BCR-
ABLp190, Sca-1+Slug, Sca-1+Snail y Sca-l+RHOM2/LMO-2 se obtuvo un fragmento de ADN lineal para microinyección mediante digestión con Notl, mientras que para la generación de los ratones transgénicos Sca-1+HOXl l y Sca-1+TALl el fragmento de ADN lineal para microinyección se obtuvo mediante digestión con BamHI. Los diferentes fragmentos de ADN lineal fueron microinyectados en oocitos fecimdados de ratones C57BL/6J x CBA. Los ratones transgénicos fundadores fueron identificados mediante análisis Southern blot utilizando sondas específicas que reconocían dichos ADNc, en muestras de ADN extraídas de las colas de los ratones.
La preparación de los oocitos fecundados, la microinyección de las construcciones de ADN conteniendo el promotor y el gen activable operativamente enlazados, la reimplantación de los oocitos fecundados a los que se les habían inyectado dichas construcciones de ADN en las madres nodrizas pseudopreñadas y el mantenimiento de las madres nodriza durante la gestación se realizó mediante el empleo de técnicas convencionales [Hogan, Constantini & Lacy (1986), "Manipulating the Mouse Embryo.
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1986)]. Los porcentajes de (i) oocitos fecundados que fueron transformados correctamente y (ii) embriones que llegaron a término y dieron lugar a ratones transgénicos fueron similares a los descritos en Hogan, Constantini & Lacy (1986), citado supra.
La progenie/descendencia de los ratones transgénicos se obtuvo cruzando el ratón fundador con ratones C57BL/6 x CBA e identificando los positivos mediante análisis Southern blot con sondas específicas que reconocían los cDNAs.
Análisis del fenotipo
Para la tinción para citometría se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-ratón conjugados a ficoeritrina (PE) (todos ellos de Pharmingen): CD45R/B220, Thy-1.1 y Thy-1.2, marcadores mieloides (Mac 1/CDl Ib y Gr-1) y Sig. Suspensiones de células procedentes de muestras de sangre completa obtenidas por técnicas rutinarias fueron incubadas con CD32/CD16 anti-ratón (Pharmingen) purificado para bloquear la unión a los recepores vía Fe y con una dilución apropiada de los diferentes anticuerpos a temperatura ambiente o a 4°C, respectivamente. Los eritrocitos fueron lisados utilizando solución de lisis (Becton Dickinson). Las muestras se lavaron 2 veces con tampón fosfato salino (PBS) y se resuspendieron en PBS. Las células muertas presentes en las muestras fueron excluidas mediante tinción con ioduro de propidio. Las muestras y los datos se analizaron en un FACScan utilizando el programa CellQuest (Becton Dickinson). Análisis PCR
Se obtuvo ARNm de diferentes tejidos de ratón quimérico. Mediante transcripción en reverso de cada preparación de ARN tratada con DNasa I (HT) de RNasa se obtuvo ADNc. El ADNc se sometió a PCR utilizando unos iniciadores específicos en cada caso [el iniciador directo (5') correspondía a las primeras 20 bases del ADNc y el iniciador inverso (3') era complementario a las últimas 20 bases del ADNc]. Las reacciones se llevaron a cabo siguiendo las instracciones del suministrador de Taq polimerasa (Perkin- Elmer Cetus) bajo las siguientes condiciones: 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C durante 25 ciclos con una elongación final de 10 minutos a 72°C.
Análisis histológico
Las muestras de tejidos se fijaron en formaldehído al 4% en PBS y se embebieron en parafina. Se cortaron láminas delgadas que se procesaron y tiñeron con hematoxilina- eosina mediante técnicas rutinarias. Las láminas fueron examinadas y fotografiadas.
Análisis Western blot
Suspensiones de células procedentes de bazo fueron analizadas por técnicas de immunoblotting mediante métodos convencionales [Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow and Lañe. CSH, 1988].
Reagrupamiento inmunoglobulina/gen TCR
Se preparó ADN procedente de diversos tejidos mediante técnicas convencionales. El ADN se digerió con BamHI y los Southern blots se analizaron con una sonda de una imnunoglobulina específica [Blood (rapid publication) 90:2168-2174 (1997)].
Transferencias celulares
Células procedentes de órganos de ratones donantes frieron suspendidas, lavadas e inyectadas por vía intravenosa en la cola de ratones receptores (NOD/SCLD) (The Jackson Laboratory) de 4-6 meses de edad. Los ratones se monitorizaron una vez a la semana y fueron sacrificados para estudios histopatológicos y recogida de tejidos para análisis de ADN cuando se encontraban moribundos.
EJEMPLO 1 Generación de ratones transgénicos 1.1 Generación de ratones transgénicos Sca-l+BCR-ABL 21°
Para examinar las consecuencias directas de la expresión del producto del gen BCR-ABLp210 (fusión génica que se produce como consecuencia de la t(9;22)(q34;ql 1) y se asocia a leucemia mieloide crónica) in vivo el ADNc de la proteína quimérica humana BCR-ABLp210 se clonó bajo el control del promotor pLy-6E.l de ratón y se inyectó en oocitos fecundados de ratones C57BL/6J x CBA siguiendo el procedimiento previamente descrito en el apartado relativo a los "Métodos". Se obtuvieron 2 ratones fundadores transgénicos (Sca-l+BCR-ABLp21°) que demostraron su capacidad de transmitir el transgén por la línea de células germinales. La expresión del transgén se observó en ambas líneas y la progenie se multiplicó hasta el nivel F7 (Generación 7). La expresión del transgén se demostró mediante PCR y/o análisis Western blot. Ambas líneas celulares mostraron una expresión preferencial en células Sca-1+. La expresión del transgén se detectó tanto en ratones macho como en ratones hembra, encontrándose hallazgos similares en ambas líneas de los ratones transgénicos Sca-l+BCR-ABL 210.
1.2 Generación de otros ratones transgénicos
Para examinar las consecuencias directas de la expresión de los productos de los genes BCR-ABLp190 humano, Slug murino, Snail murino, HOX11 humano, RHOM2/LMO-2 humano y TALl murino in vivo los ADNc correspondientes se clonaron bajo el control del promotor pLy-6E.l de ratón y las construcciones resultantes, previamente linearizadas, se inyectaron en oocitos fecundados de ratones C57BL/6J x CBA siguiendo el procedimiento previamente descrito en el apartado relativo a los "Métodos". Se obtuvieron 2 fundadores transgénicos por cada construcción que demostraron su capacidad de transmitir el transgén por la línea de células germinales. Procediendo de esta manera se obtuvieron los ratones transgénicos identificados como: Sca-l+BCR-ABLp190 (desarrollan leucemia linfoblástica aguda de estirpe B)
[véase la Figura 3]; Sca-1+Slug (producen migración de células stem hematopoyéticas pero no leucemias);
Sca-1+Snail (producen migración de células stem embrionarias pero no leucemias); Sca-1+HOXll (desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T);
Sca-1 +RHOM2/LMO-2 (desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe
T); y
Sca-1+TAL1 (desarrollan leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T). En todos los casos la expresión del transgén se observó en ambas líneas y la progenie se multiplicó hasta el nivel F7 (Generación 7). La expresión del transgén se demostró mediante PCR y/o análisis Western blot. Ambas líneas celulares mostraron una expresión preferencial en células Sca-1 . La expresión del transgén se detectó tanto en ratones macho como en ratones hembra, encontrándose hallazgos similares en ambas líneas de los ratones transgénicos.
EJEMPLO 2 Producción de leucemias en ratones transgénicos Aunque en patología humana los productos quiméricos de los genes BCR- ABLp210, BCR-ABL 190, Sca-1+HOXl l, Sca-l+RHOM2/LMO-2 y Sca-1+TALl, están asociados con distintos tipos de leucemia, concretamente, leucemia mieloida crónica (BCR-ABLp21°), leucemia linfoblástica aguda de estirpe B (BCR-ABLpl9°) y leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T (HOX11, RHOM2/LMO-2 y TALl), los modelos murinos actuales para dichas leucemias han fracasado a la hora de reproducir de forma consistente dichas patologías [Annu. Rev. Genetics (1997) 31 :429-453; Current Genomics (2000), 1 :71-80] debido a la dificultad de elegir un promotor para manipular la expresión en el tipo celular apropiado.
El análisis detallado de las células leucémicas de los distintos ratones transgénicos ensayados (Sca-l+BCR-ABLp21° (Figuras 1 y 2) Sca-l+BCR-ABLp190 (Figura 3), Sca-
1+HOXH, Sca-l+RHOM2/LMO-2 y Sca-1+TALl) permitió establecer la diagnosis de las leucemias conespondi entes. La tinción con hematoxilina/eosina puso de manifiesto que las células leucémicas tenían una morfología linfoide/mieloide. La mayoría de las células mononucleares de la sangre periférica tenía un fenotipo compatible con las leucemias correspondientes.
Para ensayar la tumorigenicidad de las células de los ratones transgénicos ensayados, 1 x 10o" células fueron inyectadas por vía intravenosa en ratones NOD/SCE) normales no irradiados. Todos los ratones inyectados desarrollaron progresivamente leucemias dentro de las 6-11 semanas posteriores al transplante. Por el contrario, ninguno de los 20 ratones inyectados con células de 10 ratones de control desabollaron una leucemia cuyo origen fuera atribuido al donante. Las células transplantadas desarrollaron la misma clase de leucemia. Además, el origen de los clones leucémicos de los ratones donantes fue confirmado por medio de un análisis PCR revelando la presencia de los transgenes coreespondientes.
De forma más concreta, en cada caso, los ratones transgénicos machos y hembras mostraron, de forma uniforme, los mismos síntomas (de la patología correspondiente) comenzando a las 8 semanas de edad y aumentando los signos clínicos a lo largo del tiempo hasta la muerte del 100%> de los ratones, lo que tuvo lugar a los 12-16 meses de edad. Los ratones fundadores transgénicos eran machos y hembras y desarrollaron los síntomas clínicos propios de la enfermedad correspondiente, de forma similar a la de los otros ratones transgénicos. Todos los ratones transgénicos murieron a causa de los tumores a los 14-18 meses de edad. El porcentaje de supervivencia en las líneas de los 2 ratones fundadores fue similar en cada caso. No se observaron tumores en grupos control constituidos por un número igual de ratones de una carnada no transgénicos. A menudo los animales sufrieron taquipnea por lo que fueron sacrificados. Al realizar la autopsia se observó que los animales habían desarrollado unas masas palpables (propias de cada patología) que implicaban tejido hematopoyético que, tras disección, revelaron unos órganos con un tamaño de 5 a 100 veces superior al de los órganos normales. La infiltración del tumor en tejidos no hematopoyéticos era visible y se confirmó microscópicamente. Este examen es consistente con la enfermedad de tejido hematopoyético. Sin embargo, no se observaron rumores de otros tejidos en estos ratones transgénicos. El análisis histológico de estos animales reveló una infiltración marcada de células leucémicas de tejidos hematopoyéticos (bazo y médula) y no hematopoyético (hígado, pulmón, testículos, etc.). Por tanto, los modelos murinos estudiados no solo asemejan el reagrup amiento que tiene lugar en las leucemias humanas consideradas [leucemia mieloida crónica, leucemia linfoblástica aguda de estirpe B y leucemias linfoblásticas agudas de estirpe T] sino que también reproducen el mismo fenotipo con el que las fusiones génicas implicadas están asociadas en patologías humanas. Estos resultados validan estos modelos murinos como modelos ideales para el estudio in vivo de la biología de los transgenes ensayados (BCR-ABLp21°, BCR-ABLp190, Sca-1+HOXll, Sca-l+RHOM2/LMO-2 y Sca- 1+TAL1).
En su conjunto, los resultados obtenidos ponen de manifiesto la generación de nuevos modelos de ratón en los que la expresión de los correspondientes oncogenes es dirigida por los elementos reguladores del control de la expresión del promotor pLy-6E.1 de ratón, recapitulando las consecuencias de la anomalía cromosómica.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ADN que comprende un gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, estando dicho gen bajo el control de un promotor que dirige la expresión de dicho gen en células Sca-1 .
2. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
3. Construcción según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre los genes identificados como BCR-ABLp210, BCR- ABLp190, Slug, Snail, HOX11, RHOM2/LMO-2, y TALl.
4. Construcción según la reivindicación 3, en la que dicho gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre los genes BCR-ABLp210 humano, BCR-ABLp190 humano, Slug murino, Snail murino, HOX11 humano, RHOM2/LMO-2 humano y TALl murino.
5. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho promotor que dirige la expresión en células Sca-1 de dicho gen que se crea y/o activa por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, es el promotor pLy-6E.l de ratón o un fragmento funcional del mismo.
6. Un mamífero no humano transgénico que contiene en su genoma una constracción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Mamífero no humano transgénico según la reivindicación 6, en el que dicho mamífero es un ratón.
8. Mamífero no humano transgénico según la reivindicación 7, en el que dicho ratón transgénico se selecciona entre los ratones identificados como Sca-l+BCR-ABLp210,
Sca-l+BCR-ABLp190, Sca-1+Slug, Sca-1+Snail, Sca-1+HOXl l, Sca-l+RHOM2/LMO-2 y Sca-1+TALl.
9. La progenie de un mamífero no humano transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
10. Una línea celular de un mamífero no humano transgénico que contiene en su genoma una constracción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. Línea celular según la reivindicación 10, en la que dicha línea celular es una línea celular murina.
12. Un procedimiento para la preparación de un mamífero no humano transgénico que posee una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem, que comprende:
(i) introducir una constracción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un oocito fecundado de un mamífero no humano transgénico;
(ii) implantar dicho oocito fecundado en una madre nodriza pseudopreñada para producir descendencia; y
(iii) analizar dicha descendencia para evaluar la existencia de genes creados y/o activados por una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho mamífero no humano es un ratón.
15. Empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ para la generación de modelos animales no humanos que presentan una anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem.
16. Empleo según la reivindicación 15, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
17. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, en el que dicho promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ es el promotor pLy-6E.l de ratón.
18. Empleo de un mamífero no humano transgénico o su progenie según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o una línea celular según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, para evaluar compuestos potencialmente útiles para tratar y/o prevenir una anomalía cromosómica asociada a patología humana, neoplásica o no neoplásica, que tiene su origen en células stem, hematopoyéticas o no hematopoyéticas.
19. Empleo según la reivindicación 18, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre las anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
20. Empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ como vehículo de una estrategia terapéutica para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a una patología humana que tiene su origen en células stem.
21. Empleo según la reivindicación 20, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a una patología humana con origen en células stem se selecciona entre anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
22. Empleo según la reivindicación 20 ó 21, en el que dicha estrategia terapéutica para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana que tienen su origen en células stem comprende la inactivación de un gen o fusión génica maligna, la inclusión de un gen funcional del que se carece o el reemplazamiento de un gen defectuoso por un gen funcional.
23. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de ADN que comprende un gen terapéutico adecuado para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem, y un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+, estando dicho gen terapéutico bajo el control de dicho promotor que dirige la expresión en células Sca-1+, junto con, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, en el que dicho gen terapéutico es un gen o una constracción génica útil para el tratamiento y/o la prevención de una anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem.
25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, en el que dicho gen terapéutico se selecciona entre ribozimas; genes, fusiones o constracciones génicas antisentido; y genes, fusiones o constracciones génicas útiles frente al gen creado y/o activado por una anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem.
26. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem es una anomalía cromosómica asociada a leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o a la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en la que dicho gen terapéutico se encuentra en un vector viral o no viral.
28. Empleo de un promotor que dirige la expresión de un gen en células Sca-1+ en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de una alteración cromosómica asociada a patología humana que tiene su origen en células stem.
29. Empleo según la reivindicación 28, en el que dicha anomalía cromosómica asociada a patología humana con origen en células stem se selecciona entre anomalías cromosómicas asociadas con la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe B, la leucemia linfoblástica aguda de estirpe T, o con la migración de células stem hematopoyéticas o embrionarias.
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