ES2301268A1 - Empleo del gen slug, o de sus productos de replicacion, transcripcion o expresion, en la identificacion, diagnostico, prevencion o tratamiento de la diseminacion del cancer y/o desarrollo de metastasis. - Google Patents

Empleo del gen slug, o de sus productos de replicacion, transcripcion o expresion, en la identificacion, diagnostico, prevencion o tratamiento de la diseminacion del cancer y/o desarrollo de metastasis. Download PDF

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Abstract

Empleo del gen Slug, o de sus productos de replicación, transcripción o expresión, en la identificación, diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación del cáncer y/o desarrollo de metástasis. El gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser utilizado en la identificación, prevención o tratamiento de la diseminación o el desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas expresan el gen Slug.

Description

Empleo del gen Slug, o de sus productos de replicación, transcripción o expresión, en la identificación, diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación del cáncer y/o desarrollo de metástasis.
Campo de la invención
La invención se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, en la identificación, diagnóstico, prevención o tratamiento de la diseminación o el desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas expresan el gen Slug.
Antecedentes de la invención
Los recientes avances en el tratamiento del cáncer han puesto de manifiesto que para planificar un tratamiento adecuado del cáncer y determinar un pronóstico preciso es necesario disponer de métodos sensibles para detectar la existencia de cáncer, el tipo de cáncer y el estadio del mismo con el fin de conocer su localización concreta y su posible extensión a otros tejidos. Un diagnóstico preciso del cáncer puede contribuir a reducir el número de fallecimientos por esta causa y a mejorar la calidad de vida de los pacientes ya que permite seleccionar el tratamiento más adecuado (quimioterapia, resección quirúrgica, etc.) y reducir las incomodidades al paciente al definir el punto final del tratamiento terapéutico.
Los marcadores de pronóstico proporcionan información importante para el tratamiento y desarrollo del cáncer en los pacientes. De hecho, para la aplicación de terapia sistémica adyuvante en el tratamiento de algunos tipos de cánceres primarios, la identificación de los pacientes de alto y bajo riesgo constituye uno de los hitos principales. Se conocen diversos marcadores de pronóstico, tanto clásicos, por ejemplo, tamaño del tumor, estado del nódulo linfático, histopatología, estado del receptor de esteroides, como de segunda generación, por ejemplo, velocidad de proliferación, ploidía del ADN, oncogenes, receptores de los factores de crecimiento y algunas glicoproteínas, que resultan muy útiles para tomar decisiones terapéuticas (McGuire, W.L., Pronostic Factors for Recurrence and Survival, en "Educational Booklet American Society of Clinical Oncology", 25th Annual Meeting, 89-92 (1989); Contesso et al., Eur. J. Clin. Oncol., 25:403-409 (1989)). Aunque ninguno de los marcadores de pronóstico conocidos satisface completamente el objetivo de distinguir entre pacientes de alto y bajo riesgo, la combinación de distintos marcadores puede mejorar la predicción del pronóstico de un paciente, por lo que continúa la búsqueda de nuevos marcadores de pronóstico que puedan añadirse a los existentes actualmente para colaborar en el pronóstico del cáncer, de su progresión y de la enfermedad residual tras tratamiento. No obstante, tan importante es el pronóstico del cáncer como el diagnóstico de la posible metástasis en aquellos pacientes que ya han desarrollado cáncer, determinar el estadio de severidad de la enfermedad de un sujeto con cáncer, ó monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con cáncer.
Los elementos génicos responsables de la invasión y la metástasis del cáncer continúan siendo desconocidos. Seria conveniente, por tanto, identificar marcadores de diagnóstico de invasividad que pudieran ser analizados de forma sencilla.
Compendio de la invención
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que en diferentes células cancerosas, tanto en células tumorales mesenquimales como carcinomatosas, se expresan niveles significativamente elevados del gen Slug y/o de sus productos de replicación, transcripción o traducción (ADNg, ARNm o proteína), cuando se comparan con células normales, lo que proporciona una alternativa a los métodos actuales de diagnóstico, pues posibilita el empleo del gen Slug y/o de sus productos relacionados como marcador diagnóstico de invasividad (diseminación del cáncer y/o invasión tumoral) y como diana terapéutica para modular dicha actividad invasora de las células cancerosas. Por tanto, la expresión o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser utilizada para evaluar el riesgo de un sujeto que padece cáncer a desarrollar metástasis.
La expresión o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser utilizada para evaluar la predisposición de un sujeto que padece cáncer, en particular, de un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+ (es decir, cuyas células cancerosas expresan el gen Slug), a desarrollar metástasis, o para evaluar la malignidad de un tumor, así como para evaluar el estadio de severidad de la enfermedad de un sujeto que padece cáncer y/o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece cáncer.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro (i) para evaluar la predisposición de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a desarrollar metástasis, ó (ii) para determinar el estadio de severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer, ó (iii) para monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con cáncer, que comprende analizar en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de dicho sujeto, al menos, un producto de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o un producto relacionado con la regulación de dicho gen Slug o con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un inhibidor de Slug o de su función, en la elaboración de una composición farmacéutica para tratar, impedir o minimizar el desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+.
Aspectos adicionales resultarán evidentes para el experto en la materia a la vista de la descripción.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra la construcción del transgén CombitTA-Slug así como la expresión y efecto de Slug en la supervivencia de células Ba/F3 privadas del factor de crecimiento. La Figura 1A es una representación esquemática del vector CombitTA-Slug. La Figura 1B muestra el resultado del análisis de la expresión de Slug dependiente de tetraciclina, mediante RT-PCR para CombitTA-Slug en células Ba/F3 (-tet, +tet en el medio). Los productos de la PCR se transfirieron a una membrana de nylon y se analizaron con una sonda específica para Slug. Se usó la actina para asegurar la integridad del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 1C muestra los resultados de la supervivencia de células Ba/F3 que expresan Slug en ausencia de IL-3. Células que crecían exponencialmente en medio suplementado con IL-3 se llevaron a 5 x 10^{5} células/ml el día 0, se retiró la IL-3 y se cultivaron. Se indica el número de células viables, de las células Ba/F3+p190, de las células Ba/F3 crecidas en presencia de IL-3 y de las células Ba/F3 transfectadas con Slug crecidas en ausencia de IL-3. La Figura ID pone de manifiesto que la muerte celular cursa con nucleosomas en escalera tras la privación de IL-3. Veinticuatro horas después de la retirada de IL-3 se aisló el ADN de bajo peso molecular procedente de células Ba/F3+ BCR-ABL^{p190} (calle 1), BaJF3 crecidas en presencia de IL-3 (calle 2), Ba/F3-Combi-Slug crecidas en ausencia de IL-3 y doxiciclina (-tet) (calle 3), y Ba/F3-Combi-Slug crecidas en ausencia de IL-3 y en presencia de doxiciclina (+tet) (calle 4). El ADN se marcó terminalmente con a^{32}P-dCTP, se resolvió por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizó por autoradiografía.
La Figura 2 muestra la expresión del transgén en ratones transgénicos CombitTA-Slug. La Figura 2A muestra la identificación de los ratones transgénicos por análisis Southern del ADN de un pequeño fragmento de la cola tras digestión con EcoRI, se utilizó el ADNc de Slug de ratón para la detección del transgén. La expresión del transgén se demostró por RT-PCR (Figura 2B); se analizó la expresión de CombitTA-Slug y de Slug endógeno mediante RT-PCR de muestras tisulares procedentes de ratones CombitTA-Slug y control. Los productos de PCR se transfirieron a una membrana de nylon y se analizaron por hibridación con una sonda específica. Se usó actina para asegurar la integridad del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 2C muestra los resultados del análisis de la expresión de Slug dependiente de tetraciclina, mediante RT-PCR para CombitTA-Slug, de muestras de médula ósea de ratones
Slug -/- (-tet, +tet en el medio).
La Figura 3 pone de manifiesto la presencia de cáncer mesenquimal en los ratones transgénicos CombitTA-Slug. La Figura 3A muestra el aspecto macroscópico de los cortes tisulares teñidos con hematoxilina/eosina del bazo de ratones de la cepa salvaje y CombitTA-Slug. El bazo de los ratones CombitTA-Slug muestra alteración de la arquitectura esplénica normal. La Figura 3B muestra el aspecto histológico de un tumor sólido desarrollado en ratones CombitTA-Slug, tras tinción con hematoxilina/eosina. La Figura 3C muestra el aspecto histológico de diferentes tejidos de los ratones CombitTA-Slug; las células que expresan Slug (células Slug+) desobedecen el orden social de los límites de órgano, migran individualmente y producen metástasis en diferentes zonas. La Figura 3D muestra las características fenotípicas de las leucemias de los ratones CombitTA-Slug; las células de la sangre de los ratones CombitTA-Slug se analizaron por citometría de flujo; las distintas células fueron identificadas con combinaciones específicas de anticuerpos; se analizaron 10.000 células de cada muestra y las células muertas se excluyeron mediante el análisis de la tinción por yoduro de propidio.
La Figura 4 muestra el fenotipo de los ratones CombitTA-Slug tras supresión de la expresión de Slug mediante tratamiento con tetraciclina. La Figura 4A muestra el resultado del análisis de la expresión de Slug dependiente de tetraciclina en sangre de los ratones transgénicos CombitTA-Slug (-tet, +tet en el agua), mediante RT-PCR. Se usó actina para asegurar la integridad del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 4B muestra las características fenotípicas (según el estudio de citometría de flujo) de las células de la sangre analizada y cortes de tejido teñidos con hematoxilina/eosina de ratones CombitTA-Slug tras la supresión de la expresión de Slug mediante tratamiento con tetraciclina (4 g/l) durante 4 semanas.
La Figura 5 ilustra la expresión de Slug en células que expresan BCR-ABL. La expresión de Slug de humano (hSlug) y de Slug de ratón (mSlug) se analizó por RT-PCR y los productos de la amplificación se transfirieron a una membrana de nylon y se analizaron por hibridación con una sonda específica. Se usó actina o ABL para asegurar la integridad del ADN y la homogeneidad de carga. La Figura 5A muestra el resultado del análisis de la expresión de Slug en células Ba/F3 que expresan BCR-ABL, tanto Ba/F3+p190 (calle 1) como Ba/F3+p210 (calle 2), y en células Ba/F3 (calle 3). La Figura 5B muestra los resultados de la expresión de Slug en sangre de los ratones transgénicos BCR-ABL^{p190} y BCR-ABL^{p210}; se recogen los resultados de la sangre de los ratones control (calle 1) y transgénicos BCR-ABL^{p190} (calles 2 a 4) y BCR-ABL^{p210} (calles 5 y 6). La Figura 5C pone de manifiesto que Slug está presente en líneas celulares leucémicas humanas y en muestras de pacientes con t(9;22): sangre humana control (calle 1), la línea celular leucémica mieloide U937 (calle 2), las líneas leucémicas T ALL-SIL (calle 3) y KOPTI-KI (calle 4), la línea celular leucémica pre-B 697 (calle 5), sangre de pacientes con t(9;22) (calles 6 a 8; los pacientes 1 y 3 presentaban Ph-B-ALL, y el paciente 2 una crisis mieloblástica), y las líneas celulares leucémicas t(9;22)-positivas K562 (calle 9), TOM-1 (calle 10) y Nalm-1 (calle 11).
La Figura 6 muestra que Slug es necesario para la génesis de tumores en ratones que expresan BCR-ABL. La Figura 6A muestra el aspecto histológico de frotis sanguíneos (tinción Giemsa) y de tejidos (cortes teñidos con hematoxilinaleosina). La Figura 6B muestra el resultado de un análisis por citometría de flujo de la médula ósea (bm, por sus siglas en inglés) y de la sangre (pb, por sus siglas en inglés) con combinaciones específicas de anticuerpos. Los ratones de los genotipos que se indican se cruzaron y se determinó el genotipo de su descendencia. Cabe destacar que los ratones BCR-ABL^{p190} sufrieron leucemia linfoblástica aguda (B-ALL), característica por la presencia de blastocitos que coexpresan Mac-1 y B220. Este tipo de leucemia se caracteriza también por la infiltración del bazo, hígado y los pulmones, y por la presencia de linfoblastocitos en los frotis sanguíneos. Sin embargo, los ratones BCR-ABL^{p190} no desarrollan leucemia en ausencia de Slug (Slug -/-).
La Figura 7 muestra el resultado del análisis de la expresión de hSlug en líneas celulares y tejidos de cáncer de mama. La expresión de Slug se analizó mediante RT-PCR. Carril 1: control positivo (línea humana que expresa Slug, K562); carril 3: control sin ADNc; carriles 4-7: tejidos primarios de cáncer de mama; carril 8: línea celular MCF-7.
La Figura 8 muestra el resultado del análisis de la expresión de hSlug en la sangre de individuos (humanos) sanos. Carril 1: control sin cDNA; carriles 2-3: sangre de individuos con cáncer de mama como control positivo; carriles 4-8: sangre de individuos sanos.
La Figura 9 muestra el resultado del análisis de la expresión de hSlug en la sangre de individuos (humanos) con cáncer de mama metastatizados. La expresión de hSlug se analizó mediante RT-PCR. Carril 1: línea celular K562 como control positivo; carril 3: control sin cDNA; carriles 4-9: pacientes con cáncer de mama metastatizado.
La Figura 10 muestra el resultado del análisis de la expresión de hSlug en pacientes (humanos) con cáncer de mama en estadio TNMO. La expresión de hSlug se analizó mediante RT-PCR. Carril 1: K562 como control positivo; carril 3: control sin ADNc; carril 4: cáncer de mama metastatizado; carriles 5-6: cáncer de mama estadios TNMO.
Descripción detallada de la invención
La invención se relaciona, en general, con el descubrimiento de que la expresión del gen Slug está relacionada con la diseminación del cáncer y/o con la invasión tumoral en un sujeto. Por tanto, la expresión o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser utilizada para evaluar el riesgo de un sujeto que padece cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a desarrollar metástasis, por lo que dicho gen, sus productos de replicación, transcripción y/o expresión, así como productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, son marcadores de la malignidad del cáncer y constituyen una diana muy atractiva para el tratamiento del cáncer.
El gen Slug es un gen presente en los vertebrados que codifica un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" (Slug) implicado en las transiciones epiteliales-mesenquimales (Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)). Previamente se ha descrito el empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión, en la detección y/o tratamiento de células cancerosas [WO 02/059361]. También se ha descrito el empleo del gen Slug y de su producto de expresión (Slug) en la movilización de células madre hematopoyéticas para transplante o terapia génica, en la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas, y/o en el tratamiento de problemas de esterilidad masculina [W003/046181].
Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que dicho gen Slug no se expresa en sangre de individuos sanos, pero sí en células cancerosas o tumorales. Aparentemente, el gen Slug inhibe la producción de E-cadherina, impidiendo que la célula cancerosa se adhiera a las células adyacentes. En este proceso la célula maligna invade otros tejidos y órganos, dando lugar a metástasis, por lo que la expresión o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o expresión, así como de productos relacionados , con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, puede ser utilizada para evaluar la predisposición de un sujeto que padece cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a desarrollar metástasis, o para evaluar la malignidad de un tumor, así como para evaluar el estadio de severidad de la enfermedad de un sujeto que padece cáncer y/o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece cáncer.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro (i) para evaluar la predisposición de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto que padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+, a desarrollar metástasis, ó (ii) para determinar el estadio de severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer, ó (iii) para monitorizar el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con cáncer, en adelante método de la invención, que comprende analizar en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de dicho sujeto, al menos, un producto de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o un producto relacionado con la regulación de dicho gen Slug o con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "analizar" incluye "medir y/o detectar y/o identificar y/o cuantificar".
Asimismo, el término "sujeto", tal como se utiliza, el término "sujeto" incluye a cualquier animal vertebrado, tal como un mamífero, incluido el ser humano.
El método de la invención puede ser aplicado a cualquier sujeto con cáncer, es decir, un sujeto que padece cáncer o que se sospecha que padece cáncer cuyas células cancerosas o tumorales expresan el gen Slug (células cancerosas Slug+). Ejemplos ilustrativos de células cancerosas que expresan el gen Slug incluyen, entre otras, células de cánceres mesenquimáticos o epiteliales, tales como células de leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias mieloides agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19), linfomas, sarcomas, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón, por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, carcinomas de mama, cáncer de colon, por ejemplo, tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF), etc. En una realización particular, dicho sujeto es un ser humano, que padece un cáncer mesenquimático o epitelial, tal como un cáncer de mama, cáncer de colón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, un sarcoma, un linfoma, una leucemia o cualquier otro cáncer cuyas células sean Slug+.
La presencia, en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, procedente de un sujeto con cáncer, de productos de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, es indicativa de una predisposición de dicho sujeto con cáncer a desarrollar metástasis. Asimismo, la presencia y cantidad de dichos productos puede ser indicativa del estadio de severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer y/o del efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con cáncer con el fin de valorar la eficacia del tratamiento aplicado al sujeto y, si este fuera ineficiente, proceder a modificar el régimen terapéutico a aplicar al sujeto y controlar su eficacia.
El método de la invención puede llevarse a cabo a partir de una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto a analizar, que contiene, al menos, un producto de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o un producto relacionado con la regulación de dicho gen Slug o con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción. El término "sangre" tal como aquí se utiliza incluye sangre completa o una fracción de la misma. La extracción de la sangre del sujeto se realiza por métodos convencionales. Derivados de la sangre incluyen plasma, suero, fracción celular, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. La extracción de la sangre del sujeto se realiza por métodos convencionales.
En una realización particular, el método de la invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto de replicación del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto, tal como, por ejemplo, ADN genómico (ADNg) de dicho gen Slug o un fragmento del mismo.
En otra realización particular, el método de la invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto que padece cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto de transcripción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto, tal como, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) del gen Slug, un fragmento de dicho ARNm, ADN complementario (ADNc) al ARN que codifica para el producto de transcripción o de expresión de dicho gen Slug, un fragmento de dicho ADNc, o mezclas de los mismos.
El análisis de dichos productos de replicación o de transcripción del gen Slug, indicativos de la expresión o represión de dicho gen, puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos. En general, dichos ensayos se basan en reacciones de mapeo, secuenciación, hibridación, amplificación, etc. y visualización de los productos de la reacción por cualquier técnica apropiada, tanto radiactiva como no radiactiva, por ejemplo, mediante técnicas colorimétricas, fluorimétricas, luminiscentes (por ejemplo, bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc. Ejemplos ilustrativos de dichos ensayos incluyen secuenciación, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), PCR cuantitativa, PCR a tiempo real, hibridación, Southern blot, Northern blot, RNA Protection Assay, etc. A modo ilustrativo, el análisis de dichos productos de replicación o de transcripción del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo que comprende la amplificación enzimática de la totalidad o un fragmento de dicho producto de replicación o transcripción del gen Slug, por ejemplo, mediante RT-PCR, e hibridación con una sonda específica de Slug, opcionalmente marcada con un marcador apropiado, por ejemplo, nucleótidos radiactivos, haptenos, enzimas, etc.
En una realización particular, la expresión (o represión) del gen Slug puede ser evaluada determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug, o bien determinando el número de copias del gen Slug producidas. En el sentido utilizado en esta descripción, "determinar el nivel de ARNm" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína Slug en las células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el nivel de ARNm de Slug en las células de una muestra de control. Asimismo, "determinar el número de copias de gen Slug producidas" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias producidas del gen Slug en células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el número de copias del gen Slug producidas en células de una muestra de control. La determinación del número de copias del gen Slug puede realizarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin)] o regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al., Breast Cancer Res. Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al., Cancer Genet. Cytogenet. 49:203 (1990)), mediante técnicas de hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen Slug, etc. Adicionalmente, el nivel de ARNm de Slug puede determinarse por otros métodos convencionales apropiados, por ejemplo, mediante análisis Northern blot, mapeo con la nucleasa S1, PCR, RT-PCR, técnicas de hibridación, arrays, etc.
En otra realización particular, el método de la invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto de traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto, tal como, por ejemplo, la proteína Slug o un fragmento de la misma.
El análisis de dicho producto de traducción del gen Slug puede llevarse a cabo mediante cualquier ensayo apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar proteínas, por ejemplo, mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, citometría de flujo, proteómica, etc. A modo ilustrativo, la expresión de la proteína Slug puede ser analizada mediante un ensayo Western blot o dot/slot (Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)), o bien mediante inmunoensayos basados en la formación de complejos mediante reacciones cruzadas, de tipo antígeno-anticuerpo, en los que el reconocimiento específico es proporcionado por un anticuerpo frente a la proteína Slug o frente a un fragmento de la misma, por ejemplo un fragmento antigénico de la misma, y visualización de los complejos formados por cualquier técnica apropiada, tanto radiactiva como no radiactiva, por ejemplo, mediante técnicas colorimétricas, fluorimétricas, luminiscentes (por ejemplo, bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc., utilizando para ello, en su caso, unos anticuerpos secundarios marcados con marcadores apropiados; ejemplos de dichos inmunoensayos incluyen ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), ensayos inmunohistoquímicos, inmunofluorescentes, de inmunoprecipitación, etc. Los anticuerpos a utilizar son anticuerpos frente a la proteína Slug o frente a un fragmento de la misma, por ejemplo, un fragmento antigénico de la proteína Slug, opcionalmente conjugados a un portador. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante la tecnología del hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495 (1975)). Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')_{2}, etc.
Otros métodos para determinar la expresión de Slug incluyen la citometría de flujo (Ward M.S., Pathology 31:382-392 (1999), proteómica (Pandey M. & Mann M., Nature 405:837-846 (2000); Chambers et al., J. Pathol. 192:280-288 (2000), etc.
En una realización particular, el análisis de dicho producto de traducción del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo que comprende el empleo de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o, preferentemente, un anticuerpo monoclonal, específico de la proteína Slug o de un fragmento de la misma, que reconoce un epítopo de dicha proteína o fragmento, y la visualización del complejo formado por métodos convencionales.
Además, la expresión del producto de traducción del gen Slug puede ser detectada in vivo mediante técnicas de diagnóstico por imagen in vivo basadas en el empleo de anticuerpos anti-Slug unidos a marcadores apropiados, por ejemplo, marcadores detectables por rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN), etc. Una revisión del diagnóstico por imagen de tumores puede encontrarse en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer (S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
En otra realización particular, el método de la invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto relacionado con la regulación del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto. Tal como aquí se utiliza, la expresión "producto relacionado con la regulación del gen Slug" se refiere a cualquier producto implicado directa o indirectamente en la regulación del gen Slug, tanto a nivel de ácido nucleico como de proteína. En una realización particular, dicho producto relacionado con la regulación del gen Slug es un factor de transcripción que interviene en la regulación de dicho gen. Ejemplos ilustrativos de dicho producto relacionado con la regulación del gen Slug incluyen el factor de células madre [SCF (stem cell factor)], la citocina c-kit, etc.
En otra realización particular, el método de la invención comprende el análisis, en dicha muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, de un producto relacionado con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto. Tal como aquí se utiliza, la expresión "producto relacionado con la eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción del gen Slug" se refiere a cualquier producto implicado directa o indirectamente en la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug, tanto a nivel de ácido nucleico como de proteína. En una realización particular, dicho producto relacionado con la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug es una proteína o un anticuerpo que directa o indirectamente provoca la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug, tanto a nivel de ácido nucleico como de proteína.
Dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug así como dichos productos relacionados con la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug, dependiendo de su naturaleza (nucleotídica o peptídica), pueden ser analizados por métodos convencionales.
En una realización particular, cuando dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug o dichos productos relacionados con la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug son de naturaleza nucleotídica, dichos productos podrán ser analizados mediante cualquier ensayo apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos, tales como los mencionados previamente en relación con dichos productos de replicación o de transcripción del gen Slug pero utilizando los reactivos (iniciadores, sondas, etc.) apropiados.
Asimismo, en otra realización particular, cuando dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug o dichos productos relacionados con la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug son de naturaleza peptídica o proteica, dichos productos podrán ser analizados mediante cualquier ensayo apropiado para detectar, identificar y/o cuantificar proteínas, tales como los mencionados previamente en relación con dichos productos de traducción del gen Slug.
Como se ha mencionado previamente, la presencia de productos de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto y/o de productos relacionados con la regulación de dicho gen Slug o con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción, en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, procedente de un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+, es indicativa de una predisposición de dicho sujeto con cáncer a que se produzca la diseminación del cáncer y/o desarrollar metástasis, o del estadio de severidad de la enfermedad de dicho sujeto con cáncer o del efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con cáncer con el fin de valorar la eficacia del tratamiento aplicado a dicho sujeto.
Por tanto, la represión, total o parcial, de la expresión del gen Slug o de la actividad de la proteína Slug, podría ser útil para tratar, impedir o minimizar el riesgo o predisposición de un sujeto con cáncer a desarrollar metástasis.
Consecuentemente, la invención se relaciona, además, con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o traducción, para tratar, impedir o minimizar el desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+. La reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de inhibidores de Slug o de su función. El gen Slug, sus productos de replicación, transcripción o traducción, así como dichos productos relacionados con la regulación del gen Slug o con la regulación, eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug pueden ser utilizados en la búsqueda de inhibidores de Slug o de su función, los cuales pueden ser utilizados en el tratamiento o prevención del desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un inhibidor de Slug o de su función, en la elaboración de una composición farmacéutica para tratar, impedir o minimizar el desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer, tal como un sujeto con un cáncer cuyas células sean Slug+.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "inhibidor de Slug o de su función" incluye a cualquier compuesto que interfiere, reduce, anula o reprime la expresión del gen Slug así como a cualquier compuesto capaz de interferir en la función de la proteína Slug o del gen Slug, o que inhiba o reduzca los efectos regulados por el gen Slug y sus productos de replicación, transcripción o traducción, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir con Slug a nivel de ácido nucleico (ADNg, ADNc, ARN) o proteína (Slug). Entre los efectos regulados por el gen Slug y sus productos de replicación, transcripción o traducción, se encuentran la migración celular, por ejemplo, en las transiciones epiteliales-mesenquimales, el desarrollo y supervivencia de líneas de melanocitos y de líneas hematopoyéticas, la migración y/o supervivencia de células de Leydig, la movilización de células madre hematopoyéticas, la resistencia a daño en el ADN, la resistencia celular a la irradiación, etc. Los efectos regulados por el gen Slug y/o sus productos de replicación, transcripción o traducción, podrían ser inhibidos o reducidos por diferentes mecanismos, por ejemplo, inhibiendo la producción endógena de Slug. Ejemplos ilustrativos compuestos potencialmente útiles como inhibidores de Slug incluyen factores de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcionales.
En general, la interferencia con la función del gen Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su expresión, inactivando el ARNm que se genera mediante oligonucléotidos antisentido o ribozimas, inactivando la proteína mediante el empleo de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha proteína con dominantes negativos [Choo Y et al. J. Mol. Biol., 1997, 273:525-532; Cobaleda C and Sánchez-García I. Blood, 2000, 95:731-737] y/o, en general, mediante el empleo de cualquier compuesto que reprima la expresión del gen Slug o reprima o inhiba la formación o la actividad de sus productos de transcripción o traducción. A modo ilustrativo, dicho inhibidor de Slug o de su función puede ser una proteína, un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
En una realización particular, dicho inhibidor de Slug es un oligonucleótido antisentido, es decir, un compuesto que, cuando se administra a una célula que expresa el gen Slug, por ejemplo, una célula tumoral que expresa la proteína Slug, es capaz de, por ejemplo, reducir, anular, o reprimir la expresión del gen Slug, reduciendo de este modo los niveles de la proteína Slug o anulándolos completamente, o bien de reprimir o inhibir la formación o la actividad de los productos de transcripción o traducción del gen Slug. Dicho oligonucleótido antisentido podría unirse específicamente, por ejemplo, al ARNm del gen Slug evitando de ese modo su traducción en la proteína Slug. Información sobre ADNg, ADNc o ARNm del gen Slug y/o de la proteína Slug, en particular, del gen Slug de humanos (hSlug) o de la proteína Slug de humanos (hSlug) puede encontrarse en WO 02/059361 así como en las referencias bibliográficas contenidas en dicho documento; asimismo, información sobre el gen Slug de ratón (mSlug) o de la proteína Slug de ratón (mSlug) puede encontrarse en Nieto et al. (Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)). Dicho oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos y una longitud adecuados para su hibridación con la secuencia de nucleótidos del gen Slug o de su producto de replicación o transcripción, bajo condiciones de alta astringencia. A modo ilustrativo, dicho oligonucleótido antisentido comprende, al menos 8, nucleótidos consecutivos, preferentemente, al menos, 12, 16 ó 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen Slug o capaces de hibridar con la secuencia de nucleótidos del gen Slug bajo condiciones de alta astringencia, tales como, por ejemplo, SSPE 5x y SDS al 0,5%, a 65ºC o condiciones equivalentes. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que pueden utilizarse para evitar la expresión del gen Slug pueden encontrarse en WO 02/059361.
En otra realización particular dicho inhibidor de Slug o de su función es un anticuerpo anti-Slug, tal como un anticuerpo que reconoce a la proteína Slug intacta o a un fragmento de la misma, tal como un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos anti-Slug pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante la tecnología del hibridoma. Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')_{2}, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, que reconocen a la proteína Slug o un fragmento antigénico de la misma.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende, al menos, un inhibidor de Slug o de su función, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica puede contener uno o más inhibidores de Slug o de su función, es decir, uno o más compuestos capaces de reducir, anular o reprimir la expresión del gen Slug por lo que es útil para prevenir o tratar el desarrollo de metástasis en sujetos con cáncer, en particular, en sujetos que padecen cánceres cuyas células cancerosas son Slug+. Ejemplos ilustrativos de células tumorales o cancerosas Slug+ incluyen, entre otras, células de cánceres mesenquimáticos o epiteliales, tales como células de leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias mieloides agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19), linfomas, sarcomas, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón, por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, carcinomas de mama, cáncer de colon, por ejemplo, tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF), etc.
Por tanto, dicho inhibidor de Slug o de su función podría ser utilizado, además, en el tratamiento, como coadyuvante o tratamiento principal, de dichos tumores y cánceres.
Los excipientes que pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.
En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug o de su función. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Ejemplo 1 Desarrollo de cáncer por desregulación de la expresión de Slug I. Materiales y métodos
Cultivos celulares. Las líneas celulares utilizadas incluyen la línea celular precursora hematopoyética Ba/F3 [Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)] y células Ba/F3 que expresan las proteínas humanas BCR-ABL^{p190} (Ba/F3 + p190) y BCR-ABL^{p210} (Ba/F3 + p210) [Sánchez-García y Grütz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5287-5291 (1995)]. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB). Cuando fue necesario, se añadió un 10% de medio acondicionado con WEHI-3B como fuente de IL-3 (interleucina-3).
Transfección celular y Ensayo de supervivencia. Las células Ba/F3 se transfectaron por electroporación (960 \muF, 220 V) con 20 \mug de plásmido CombitTA-Slug. La población de células resistentes a neomicina (Ba/F3 + CombitTA-Slug) se analizó por RT-PCR (retrotranscripción-reacción en cadena de la polimerasa) para detectar la expresión de CombitTA-Slug en presencia y en ausencia de tetraciclina (20 ng/ml). Estas células eran resistentes a la retirada de IL-3 cuando se crecían en ausencia de tetraciclina. Se confirmó la resistencia de las células a la retirada de IL-3 y la viabilidad celular se determinó por exclusión de azul tripano.
RT-PCR. Para analizar la expresión de CombitTA-Slug y de Slug endógeno en líneas celulares de ratón y en ratones, se realizó una RT-PCR siguiendo las instrucciones del fabricante en un volumen de reacción de 20 \mul que contenía 50 ng de hexámeros aleatorios, 3 \mug de RNA total, y 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript II RNase H- (GIBCO/BRL). Se realizaron 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, utilizando las secuencias de los cebadores específicos que se indican a continuación:
-
Combi-polyA-B 1: 5'-TTGAGTGCATTCTAGTTGTG-3';
-
mSlug directo: 5'-GTTTCAGTGCAATTTATGCAA-3';
-
mSlug reverso: 5'-TTATACATACTATTTGGTTG-3'.
La amplificación del ARN de la \beta-actina sirvió de control para garantizar la calidad de las muestras de ARN.
Asimismo, para analizar la expresión de hSlug en las líneas celulares humanas y en muestras de sangre de pacientes Ph^{1}-positivos, los parámetros de los ciclos usados en las reacciones de PCR, y las secuencias de los cebadores específicos fueron las siguientes:
hSlug: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, cebador directo 5'-GCCTCCAAAAAGCCAAACTA-3' y cebador inverso 5'-CACAGTGATGGGGCTGTATG-3';
c-ABL: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, cebador directo 5'-GTATCATCTGACTTTGAGCC-3' y cebador inverso 5'-GTACCAGGAGTGTTTCTCCA-3'.
La amplificación del ARNm de c-ABL sirvió como control de calidad de las muestras.
Análisis Southern. ADN procedente de fragmentos de las colas de los ratones se digirió con endonucleasas de restricción tal como se ha descrito previamente [García Hernández et al., (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 13239-13244], se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se transfirió a un filtro Hybond-N (Amersham). El ADN se fijó a los filtros mediante exposición a radiación ultravioleta. Los filtros se hibridaron con una sonda de ADNc de la secuencia completa de Slug, correspondiente al ADNc completo de Slug [Pérez Losada et al., (2002). Blood, 100(4):1274-1286], marcada radiactivamente con ^{32}P [García Hernández et al., (1997). citado supra].
Generación de ratones transgénicos
Ratones CombitTA-Slug. El ADNc de Slug de ratón (mSlug) [Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)] se clonó en el vector Combi-tTA [Schultze et al. (1996) Nature Biotechnology, 14: 499-503]. El conjunto se cortó para hacerlo lineal por digestión con NotI, y se inyectó en óvulos fecundados de ratonas CBAxC57B/J6 [Jackson Laboratory]. Se identificaron los ratones transgénicos mediante análisis Southern del ADN de un pequeño fragmento de la cola, tras digestión con EcoRI. Se usó el ADNc de mSlug para la detección del transgén.
Ratones con la mutación Slug^{\Delta 1} . Los ratones horno y heterocigóticos para la mutación Slug^{\Delta 1}, generada mediante la supresión de la secuencia génica total que codifica la proteína Slug (ratones mutantes Slug^{\Delta 1} o ratones deficientes de Slug), han sido descritos previamente [Jiang et al., (1998). Developmental Biology. 198; 277-2855].
Ratones heterocigóticos Slug +/- (ratones Slug^{\Delta 1} ) se cruzaron con ratones transgénicos CombitTA-Slug y ratones transgénicos BCR-ABL^{p190} (EP 1354962) para dar lugar a ratones heterocigóticos compuestos. Los animales de la primera generación (F1) se cruzaron para obtener los ratones sin Slug (Slug -/-), heterocigóticos para Combi-tTA y BCR-ABL^{p190}.
Análisis histológico. Los animales incluidos en este estudio fueron sometidos a necropsia estándar. Todos los órganos mayores se sometieron a examen bajo el microscopio de disección, se incluyeron muestras de cada uno de ellos en parafina, se prepararon cortes y se examinaron histológicamente. Todas las muestras fueron obtenidas de partes viables y homogéneas del tejido disecado y se fijaron en los siguientes 2-5 minutos. Posteriormente se revisaron los cortes
de tejido, teñidos con hematoxilina y eosina. Para los estudios comparativos se usaron ratones de la misma edad.
Análisis fenotípico. Para la citometría de flujo se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales: CD45R/B220, IgM, Macl, Gr-1 (Pharmingen). Suspensiones de células únicas procedentes de diferentes muestras titulares obtenidas por técnicas rutinarias, fueron incubadas con un anticuerpo purificado contra CD32/CD16 de ratón para bloquear la unión a los receptores Fc, y con una dilución apropiada de los diferentes anticuerpos, a temperatura ambiente o a 4ºC, respectivamente. Las muestras se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en PBS. Las células muertas de las muestras se excluyeron mediante tinción con yoduro de propidio. Las muestras y los datos se analizaron con un citómetro de flujo FACScan y con el programa informático CellQuest (Becton Dickinson).
Análisis del ADN de bajo peso molecular. El ADN de bajo peso molecular se aisló como se describe a continuación. Se recogieron las células en 1,5 ml de medio de cultivo, se centrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400 x g), y el "pellet" se resuspendió en 300 \mul de tampón de proteinasa K. Tras incubarse durante la noche a 55ºC, se precipitó el ADN con etanol, se resuspendió en 200 \mul de tampón TE (Tris-EDTA (ácido etilendiamino-tetraacético)) que contenía 50 \mug/ml de ARNasa A, y se incubó a 37ºC durante 2 horas. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Se marcaron terminalmente alícuotas de ADN (2 \mug) con \alpha^{32}P-dCTP y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%. Tras la electroforesis, el ADN del gel se transfirió a una membrana Hybond-N (Amersham) y se sometió a autoradiografia durante 2 horas a -70ºC.
Ensayo de la capacidad formadora de tumores. Para estudiar la capacidad de formación de tumores de varios cánceres, 10^{6} células suspendidas en 200 \mul de PBS se inyectaron vía subcutánea en cada uno de los dos flancos de ratones macho atímicos (desnudos). Se hizo un seguimiento de los animales y del crecimiento de los tumores durante 3 semanas.
II. Resultados
Generación de los ratones CombitTA-Slug. Para determinar si la desregulación de la expresión de Slug es necesaria para el desarrollo de cáncer, se generaron unos ratones transgénicos (CombitTA-Slug) en los que la expresión del gen Slug podía ser regulada exógenamente. Para ello se utilizó el sistema Combi-tTA, que posee en un único plásmido el transactivador y el promotor mínimo tet-operador (tetO) para dirigir la expresión génica. Este procedimiento asegura la integración del mismo número de copias del transactivador que del gen reportero en configuración cis directa, en el mismo punto del mismo cromosoma, e impide la segregación genética de los elementos de control durante el cruce. La inserción del gen mSlug bajo el control del promotor mínimo tetO produjo el plásmido CombitTA-Slug (Figura 1A), que se probó en la línea celular precursora hematopoyética Ba/F3. La proteína represora tet, fusionada al dominio de transactivación viral de VP16 (dentro de tTA) se une, en ausencia de tetraciclina, a un promotor mínimo tet de diseño genético y activa la transcripción de CombitTA-Slug. En presencia de la molécula efectora, este gen no se expresa y el promotor queda silenciado (Figura 1B). Tras dos días en cultivo, tanto en presencia como en ausencia de tetraciclina, se midió la expresión de CombitTA-Slug. En este sentido, se detectó la presencia de CombitTA-Slug en células Ba/F3 en ausencia, pero no en presencia, de tetraciclina (20 ng/ml). Estos datos indican que la tetraciclina reprime completamente la inducción de CombitTA-Slug. El hecho de que la expresión de Slug protege a las células Ba/F3 de la apoptosis inducida por la retirada de IL-3 ya ha sido demostrado [Inukai et al. (1999). Molecular Cell. 4:343-352]. Así pues, a continuación se estudió la supervivencia de células Ba/F3 que expresaban CombitTA-Slug, 24 horas después de la retirada de IL-3. La expresión de Slug fue suficiente para que todas las células Ba/F3 que expresaban CombitTA-Slug resistiesen la muerte inducida por la retirada de IL-3. El tratamiento con tetraciclina restauró la sensibilidad de las células Ba/F3 a la retirada de IL-3 (Figuras 1C y ID).
Se crearon dos líneas transgénicas de ratones CombitTA-Slug (Figura 2A). En ambas, la expresión de CombitTA-SLUG se pudo detectar de forma reproducible en todos los tejidos analizados (Figura 2B). La relevancia fisiológica de dichos ratones CombitTA-Slug se analizó mediante el cruce con ratones deficientes de Slug (ratones mutantes Slug^{\Delta 1}). La anemia y los defectos de pigmentación característicos de los ratones homocigóticos con Slug mutante no se produjeron en ratones de este tipo cruzados con ratones transgénicos CombitTA-Slug. La expresión de CombitTA-Slug se produjo por transactivación, ya que en aquellos ratones a los que se administró tetraciclina (4 mg/mL) en el agua, la transactivación cayó hasta niveles indetectables (Figura 2C).
Desarrollo de cáncer en ratones transgénicos CombitTA-Slug. En humanos, Slug está vinculado a células cancerosas mesenquimales que expresan genes de fusión como consecuencia de anomalías cromosómicas (leucemias o sarcomas). Por ese motivo, se estudió si los ratones transgénicos CombitTA-Slug desarrollan cánceres mesenquimales, observándose que todos los ratones transgénicos CombitTA-Slug mostraron signos claros de falta de salud a partir de los 9 meses de edad. El cuadro clínico de estos ratones fue empeorando rápidamente y se convirtió en cánceres mesenquimales (el 90% desarrollaron leucemia y el 10% sarcomas) (Figuras 3A y 3B), que se caracterizaron clínicamente por un descenso de la movilidad en la jaula, aumento del ritmo respiratorio, piloerección, temblor y pérdida de peso sustancial. Esta condición persistió y los animales se sacrificaron. El examen macroscópico mostró esplenomegalias (Figura 3A) o sarcomas (Figura 3B). Los timos, en general, eran normales. Estas observaciones son consistentes con cánceres mesenquimales. Sin embargo, no se observaron ni alteraciones epiteliales ni carcinomas en ninguno de los 77 ratones CombitTA-Slug analizados a pesar de la extensa expresión de CombitTA-SLUG. El examen histológico de estos animales reveló una marcada filtración leucémica de los tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos (Figura 3C). Las células mononucleares de la sangre de los ratones leucémicos analizados permitieron diagnosticar las leucemias generadas como leucemia linfoblástica aguda en células B o leucemia mieloide aguda (Figura 3D).
Las células transplantadas subcutáneamente en ratones sanos procedentes de ratones transgénicos CombitTA-Slug, desarrollaron el mismo tipo de tumor tal y como se deduce del análisis histológico. Además, se comprobó que las células que formaban el tumor provenían del donante mediante PCR, que reveló la presencia del producto de CombitTA-Slug. Estos datos permiten definir los tumores desarrollados en ratones transgénicos CombitTA-Slug como malignos, demuestran que Slug causa cáncer mesenquimal e indican que Slug no requiere formación previa de un tumor para que ocurra la diseminación.
Irreversibilidad de las alteraciones inducidas por Slug . Los resultados anteriores proporcionan evidencia de que la expresión de Slug dota a las células con la capacidad de migrar. Como tal, Slug (ácido nucleico o producto de expresión) podría convertirse en una atractiva diana terapéutica para controlar la capacidad invasiva de los cánceres humanos. Si esto es así, cabria esperar que las células que sobreexpresan Slug presenten modificaciones en los patrones de crecimiento y diseminación al modificarles el nivel de expresión de Slug. Por tanto, se evaluaron las consecuencias de la supresión de Slug mediante el examen fenotípico de 10 ratones transgénicos CombitTA-Slug, en los que se había confirmado previamente la presencia de leucemia mediante análisis de su sangre I antes del tratamiento con tetraciclina. La administración a los ratones transgénicos CombitTA-Slug de tetraciclina (4 g/l) en el agua se llevó a cabo durante 2 semanas provocó la supresión de la expresión de Slug (Figura 4A). Sin embargo, no se observó ninguna modificación fenotípica en ninguno de los 10 ratones CombitTA-Slug analizados a pesar de la supresión de la expresión de Slug tras el tratamiento con tetraciclina. El análisis por citometría de flujo de los animales tratados con tetraciclina puso de manifiesto la persistencia de células leucémicas en la sangre (Figura 4B), y el análisis histológico confirmó la infiltración de los tejidos no hematopoyéticos (Figura 4B).
La supresión de Slug bloquea in vivo el desarrollo de leucemia BCR-ABL^{190}. Un paso crítico para el entendimiento de la transformación maligna mediada por oncogenes asociados al cáncer mesenquimal, es la identificación de los genes modulados por estas oncoproteínas, que permiten a las células crecer fuera de su entorno normal. Aunque se ha demostrado que Slug es suficiente para generar leucemias y sarcomas, y para que el crecimiento de estas células se haga independiente de la expresión del propio Slug, estos resultados no implican que los oncogenes asociados a cánceres mesenquimales necesiten Slug para producir transformación maligna. Para estudiar este asunto se utilizaron los oncogenes BCR-ABL [Sánchez-García & Grütz, PNAS (1995), 92:5287-5291] como modelo. Los oncogenes BCR-ABL activan la expresión de Slug en células Ba/F3 y en blastocitos procedentes de ratones transgénicos que expresan BCR-ABL (Figuras 5A y 5B). La expresión de Slug también se produce en blastocitos procedentes de pacientes con leucemias humanas Ph^{1}-positivas, mientras que el producto del gen Slug estaba ausente en las células de muestras humanas normales (Figura 5C, carril 1). Por el contrario, Slug está presente en líneas celulares t(9;22)-positivas derivadas de pacientes con leucemia crónica mieloide (LMC) y con leucemia linfocítica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), en células de pacientes Ph^{1}-positivos, y en otras líneas celulares leucémicas carentes de t(9;22), incluyendo el linaje B temprano 697, la mieloide U937, y las líneas celulares T ALL-SIL y KOPTI-KI (Figura 5C). Estas y otras observaciones previas muestran que la expresión de Slug es una característica común en los tumores mesenquimales.
Con objeto de demostrar si Slug es necesario para la génesis de la leucemia inducida por BCR-ABL, se estudió la capacidad inductora de leucemia de BCR-ABL^{p190} en presencia y en ausencia de Slug. En humanos, este oncogén está vinculado a células B leucémicas que coexpresan marcadores mieloides. Así pues, se generaron ratones transgénicos de BCR-ABL^{p190}. El examen histológico y fenotípico de los ratones transgénicos de BCR-ABL^{p190} de entre 7 y 9 meses de edad confirmó la presencia de blastocitos en tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos (Figura 6A). De forma muy parecida a lo que ocurre en humanos, estos blastocitos coexpresan marcadores mieloides y de células B (Figura 6B). Seguidamente se procedió al estudio biológico de BCR-ABL^{p190}-B-ALL [ratones transgénicos con leucemia linfoblástica aguda tipo B (EP 1354962)] en ausencia de Slug. Se generaron 12 ratones transgénicos BCR-ABL^{p190} homocigóticos para la mutación específica del gen Slug. Entre los 6 y los 9 meses de edad, se analizó periódicamente la sangre de esos ratones BCR-ABL^{p190} x Slug -/- y no se detectó ningún blastocito. A los 12 meses de edad se sacrificó a los ratones y la autopsia mostró que no existían anomalías morfológicas significativas de los tejidos hematopoyéticos y no hematopoyéticos. A pesar de realizar un análisis extenso tanto histológico como fenotípico, no se observó ningún signo de leucemia en dichos ratones BCR-ABL^{p190} x Slug -/- (Figura 6). Estos resultados demuestran que Slug desempeña un papel fundamental en la génesis de células cancerosas BCR-ABL^{p190}.
III. Discusión
Se ha estudiado con precisión la importancia de Slug en cada uno de los aspectos de los fenotipos generados por los ratones que expresan Slug. Para ello se ha utilizado un sistema que, en un único plásmido, contiene los elementos reguladores y de expresión del sistema binario de tetraciclina original, que permite una elevada inducción y un gran control de la expresión génica por tetraciclina en el ratón. En el ratón, Slug no está involucrado en las transiciones epitelio-mesenquimales. De acuerdo con esa idea, no se observaron ni alteraciones epiteliales ni carcinomas en ninguno de los ratones transgénicos CombitTA-Slug analizados. El análisis de todos los aspectos de los fenotipos humanos relacionados con la expresión de Slug en los ratones que expresan Slug, puso de manifiesto que estos ratones presentaban cánceres mesenquimales, fundamentalmente leucemias.
En el sistema hematopoyético, las células progenitoras normales no comprometidas se diferencian en células maduras. Durante esta transición, la expresión de Slug está inactivada. En situaciones fisiológicas, cuando estas células progenitoras normales no comprometidas migran, Slug favorece su supervivencia y les permite llevar a cabo su función. Si esto no se consigue en un periodo concreto de tiempo, estas células sufren apoptosis como respuesta a la ausencia de señales externas específicas. Por ello, los cánceres mesenquimales que se observan en los ratones transgénicos CombitTA-Slug suponen una demostración in vivo de la idea de que la transformación depende de cambios genéticos que permiten a las células no diferenciadas crecer fuera de su entorno normal (Figura 3). Estos resultados proporcionan evidencia de que la expresión de Slug dota a las células con capacidad migratoria. Como tal, Slug podría convertirse en una diana terapéutica atractiva para el control de la capacidad invasiva de los cánceres humanos. Sin embargo, aunque la supervivencia conferida por Slug es reversible in vitro (Figura 1), las alteraciones inducidas por Slug se hacen independientes de su propia expresión in vivo.
Estos hallazgos también sitúan la función biológica de Slug en el contexto de la transformación celular dependiente de los oncogenes BCR-ABL. Los datos que se presentan aquí demuestran que los oncogenes BCR-ABL inducen la expresión de Slug. De hecho, la expresión de Slug no es rara en los tumores mesenquimales (tanto leucemias como sarcomas) en los que la transformación se ha producido por otras alteraciones genéticas. Esto sugiere que Slug podría participar en la invasión tumoral, no solamente en leucemias BCR-ABL-positivas, sino también, posiblemente, en otros cánceres mesenquimales.
Con el fin de demostrar si Slug es necesario para la génesis de la leucemia inducida por BCR-ABL, se estudió la capacidad inductora de leucemia del oncogén BCR-ABL^{p190} en presencia y en ausencia de Slug. Los resultados obtenidos demuestran que Slug tiene un papel fundamental en la biología de los cánceres BCR-ABL. Estos datos son consistentes con un modelo en el que las células tumorales que contienen la proteína de fusión BCR-ABL expresan constitutivamente Slug, que promueve la supervivencia y la migración aberrantes de las células defectuosas en diferentes entornos (Figura 3). Dado que es frecuente encontrar Slug en células de tumores mesenquimales, es posible que Slug tenga un papel más general en la biología del cáncer que el específicamente asociado a la transformación por BCR-ABL. Así pues, la expresión de Slug podría constituir una vía de invasión común de leucemias y sarcomas asociados a otras proteínas. En conclusión, Slug podría representar un mecanismo de invasión tumoral ampliamente distribuido en los tumores mesenquimales. Como tal, Slug podría ser una diana terapéutica atractiva para el control de la capacidad invasiva tumoral, y puede ser considerado como marcador de malignidad.
Ejemplo 2 Expresión del gen Slug como marcador de la diseminación precoz del cáncer I. Material y métodos Selección de pacientes
Se seleccionaron 124 pacientes con diagnóstico de carcinoma de mama (81 pacientes con cáncer de mama metastatizados y 43 pacientes con cáncer de mama en estadio TNM0), a los que se extrajeron 10 ml de sangre antes de administrarles el primer ciclo de quimioterapia y la misma cantidad antes de recibir el último ciclo. Finalizado el tratamiento con quimioterapia adyuvante, se realizó un seguimiento de los pacientes a los 3 meses durante los 2 primeros años, y cada 6 meses los siguientes 3 años hasta un total de 5 años.
Análisis de la expresión de Slug
La metodología utilizada para la determinación de la expresión del gen Slug en sangre fue:
\bullet
Extracción de ARN de la sangre periférica mediante el uso del kit QIAamp® siguiendo las instrucciones del fabricante.
\bullet
Eliminación del ADN contaminante mediante tratamiento de las muestras con DNAsa I siguiendo las instrucciones del fabricante.
\bullet
Obtención de ADNc a partir del RNA tratado con DNAsa mediante el uso del kit Promega® siguiendo las instrucciones del fabricante.
\bullet
La integridad del ADNc se comprobó mediante amplificación de la actina con los oligos apropiados:
Actin-F: 5'-TAG GAA TCC ATG GCC ACT GCC GCA TCC TCT TCC-3'
Actin-B: 5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3'
35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto/55ºC durante 1 minuto/72ºC durante 1 minuto y 30 segundos.
\bullet
RT-PCR para detectar la expresión del gen Slug. Se utilizaron oligos con las siguientes características
hSlug-F: 5'-AGC GAA CTG GAC ACA CAT A-3'
hSlug-B: 5'-AAT GCT CTG TTG CAG TGA G-3'
35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto/55ºC durante 1 minuto/72ºC durante 1 minuto y 30 segundos.
\bullet
Electroforesis en gel de agarosa al 1%, a 55 v durante 1 hora, para ver el resultado de la RT-PCR [García-Hernández et al., (1997) PNAS, 94:13239-13244].
\bullet
Transferencia a membranas de nylon e hibridación con sonda Slug [García-Hernández et al., (1997) PNAS, 94:13239-13244].
II. Resultados
Inicialmente se estudió la expresión de Slug en líneas celulares y tejidos tumorales de cáncer de mama. Como se muestra en la Figura 7, tanto la línea celular MCF-7 (Figura 7, carril 8) derivada de un adenocarcinoma de mama, como los carcinomas de mama primarios (Figura 7, carriles 4-7) expresan Slug.
Tras confirmar la presencia de Slug en cánceres de mama, se procedió a estudiar la expresión de Slug en la sangre de pacientes con cáncer de mama. Como muestra la Figura 8, Slug no se expresa en la sangre de individuos sanos; sin embargo, la expresión de Slug se detectó en el 58% de los casos de cáncer de mama metastatizados y que llevaban un tratamiento quimioterapéutico variable (Figura 9).
Una vez detectada la expresión de Slug en una amplia mayoría de cánceres de mama metastatizados, se procedió a estudiar pacientes diagnosticados de cáncer de mama en estadio TNM0. Como se muestra en la Figura 10, la presencia de Slug se detectó en el 65% de los pacientes con cáncer de mama en estadio TNM0.
III. Discusión
Los resultados obtenidos indican que Slug puede servir como un marcador de diseminación temprano de cáncer de mama y de otros tipos de cáncer tanto epitelial como mesenquimal. Por tanto, el estudio de la expresión de Slug en sangre puede ser usado para monitorizar el diagnóstico, el beneficio terapéutico y la recaída en pacientes con cáncer.
<110> Centro de Investigación Biomolecular Aplicada Salamanca, S.L.
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<120> Empleo del gen Slug, o sus produtos de replicación, transcripcion, o expresión, en la identificación, diagnóstico o tratamiento de la diseminación del cáncer y/o desarrollo de metástasis
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<130> P044360ES
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<140> P200402559
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<141> 2004-10-25
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<160> 11
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<170> SeqWin99, version 1.02
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Combi-polyA-B1
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<400> 1
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ttgagtgcat tctagttgtg 
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20 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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ttatacatac tatttggttg 
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33 
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<220>
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<223> Actina-B
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aatgctctgt tgcagtgag 
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19

Claims (16)

1. Método in vitro (i) para evaluar la predisposición de un sujeto con cáncer a desarrollar metástasis, ó (ii) para determinar el estadio de severidad de la enfermedad de un sujeto con cáncer, ó (iii) para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con cáncer. que comprende analizar en una muestra de sangre, o de un derivado de la misma, de dicho sujeto, al menos, un producto de replicación, transcripción o traducción del gen Slug específico de la especie de dicho sujeto.
2. Método según la reivindicación 1, en donde dicho producto de replicación del gen Slug comprende la totalidad o un fragmento del ADN genómico (ADNg) del gen Slug.
3. Método según la reivindicación 1, en donde dicho producto de transcripción se selecciona entre ARN mensajero (ARNm) del gen Slug, un fragmento de dicho ARNm, ADN complementario (ADNc) al ARN que codifica para el producto de transcripción o de expresión de dicho gen Slug, un fragmento de dicho ADNc, y sus mezclas.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3 en el que el análisis de dicho producto de replicación o dicho producto de transcripción del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos.
5. Método según la reivindicación 1, en donde dicho producto de traducción es la proteína Slug o un fragmento de la misma.
6. Método según la reivindicación 5, que comprende analizar dicha proteína Slug o fragmento de la misma mediante un ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar proteínas.
7. Método según la reivindicación 1, que comprende, además, analizar un producto relacionado con la regulación del dicho gen Slug, o con la regulación, eliminación o degradación de sus productos de expresión o traducción.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el análisis de dicho producto relacionado con la regulación del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos o proteínas, en función de su naturaleza.
9. Método según la reivindicación 7, en donde dicho producto relacionado con la regulación del gen Slug es un factor de transcripción que interviene en la regulación de dicho gen.
10. Método según la reivindicación 7, en el que el análisis de dicho producto relacionado con la regulación. eliminación o degradación de los productos de expresión o traducción del gen Slug se lleva a cabo mediante un ensayo para detectar, identificar y/o cuantificar ácidos nucleicos o proteínas, en función de su naturaleza.
11. Método según la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un ser humano.
12. Método según la reivindicación 1 ó 11, en donde dicho sujeto padece un cáncer cuyas células cancerosas son Slug+.
13. Método según la reivindicación 12, en donde dicho sujeto padece un cáncer mesenquimático o epitelial.
14. Método según la reivindicación 1 ó 12, en donde dicho sujeto padece leucemia, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, tumores ginecológicos, cáncer de ovario, carcinoma de mama, o cáncer de colon.
15. Empleo de un inhibidor de Slug o de su función, donde dicho inhibidor se selecciona entre una proteína, un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo, en la elaboración de una composición farmacéutica para tratar, impedir o minimizar el desarrollo de metástasis en un sujeto con cáncer.
16. Empleo según la reivindicación 15, en donde dicho inhibidor de Slug o de su función es una proteína, un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo capaz de interferir en la replicación, transcripción o traducción del gen Slug, una proteína, un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo capaz de interferir en la función de la proteína Slug, o del gen Slug, o una proteína, un péptido, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" no funcional, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo que inhibe o reduce los efectos regulados por el gen Slug o sus productos de replicación. transcripción o traducción.
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