CN111455049A - LncRNA MEG3和MALAT1作为诊断胆囊癌的标志物的应用及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胆囊癌的诊断标志物，所述标志物为LncRNA MEG3和MALAT1；本发明还提供了一种用于诊断胆囊癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测LncRNA MEG3和MALAT1表达水平的试剂；本发明还提供了一种治疗胆囊癌的药物组合物，所述药物组合物包括LncRNA MEG3。本发明的LncRNA MEG3和MALAT1可以作为胆囊癌的诊断标志物。另外，本发明提供的检测LncRNA MEG3和MALAT1的试剂盒，可以在它们作为诊断标志物时，对其进行评价，为胆囊癌的治疗提供指导和帮助。本发明以LncRNA MEG3质粒为主的药物组合物，在胆囊癌的治疗中可能有着重要意义。

Description

LncRNA MEG3和MALAT1作为诊断胆囊癌的标志物的应用及其 检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种与胆囊癌相关的长链非编码RNA和蛋白及其在胆囊癌中应用，所述的长链非编码RNA为LncRNA MEG3，所述蛋白为MALAT1。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

胆囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是最具侵袭性的消化系统肿瘤之一。作为最常见的胆道恶性肿瘤，胆道恶性肿瘤的85％-90％都为胆囊癌。由于胆囊癌起病缺乏典型症状，只有当肿瘤生长到一定大小时才会出现如疼痛、黄疸、发热等非特异性症状，故早期诊断率仅为19.1％。胆囊癌T1、T2期的5年生存率分别高达85.9％和56.1％，但在T3和T4人群里仅为19.2％和14.1％，由此可见寻找早期诊断标记物对于胆囊癌治疗亟待解决。长期以来，胆囊癌的治疗策略并未取得突破性进展，目前首选治疗仍为手术治疗，由于胆囊癌起病隐匿，仅有约10％的患者有行根治性手术治疗的指征，而对于晚期不可切除性胆囊癌，目前采用的多为姑息治疗，包括放疗、化疗及靶向治疗。目前指南尚无关于化疗的明确的循证医学证据，化疗方案以吉西他滨+铂类药物方案为主。近十几年来如火如荼的靶向及免疫治疗在胆囊癌中取得了一定的进展，但目前为止的国内外多个临床研究尚未取得突破性成果，考虑与胆囊癌复杂的发病机制相关。迄今为止，胆囊癌进展的分子机制仍如迷雾。因此，探究用于胆囊癌确诊的早期生物标记物和有效治疗策略迫在眉睫。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指转录长度大于200个核苷酸，特点是没有开放阅读框及蛋白质编码功能。其与肿瘤的发生、增殖、分化，DNA损伤应答关系密切，lncRNA在肿瘤中不仅可起促进作用，也可起抑制作用。肺腺癌转移相关转录子1(themetastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是lncRNA的重要成员之一，又名为细胞核浓缩转录子2(nuclear-enriched transcript 2,NEAT2)。近年来，研究发现MALAT1与包括胃癌、胰腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的发生有密切关系。研究者们于2014年首次发现，在胆囊癌中MALAT1表达上调。在随后的数年中，与胆囊癌发展和患者预后相关的lncRNAs不断被发现，包括LET、GCASPC、MALAT1等。

一篇纳入了2015-2019年发表的18篇共1001名胆囊癌患者的荟萃分析分析了15个相关的lncRNA基因。亚组分析提示lncRNAs的过表达与不良的总生存时间高度相关(HR＝2.454,95％CI2.004-3.004,I2＝0％)，MALAT1的高表达状态与肿瘤大小、局部淋巴结转移呈正相关。目前现有的基础研究也许可以从部分角度解释上述现象的发生。2014年，研究者们.发现在SGC-996和NOZ胆囊癌细胞系中，将慢病毒导入si-RNA从而减低MALAT1的表达，相应的癌细胞的增殖、侵袭及转移能力也可被明显抑制。他们进一步敲除了MALAT1基因，发现P53等下游基因被激活，而ERK/MAPK信号通路被抑制。2016年，研究者们发现MALAT1的高表达与在肿瘤大小与总生存时间呈负相关，而和淋巴结转移呈正相关关系。这篇文章还报道了MALAT1对miR-206表现出竞争性内源RNA作用。由于miR-206可以直接抑制促进胆囊癌细胞增殖的ANXA2和KRAS的表达，MALAT1在胆囊癌细胞中结合miR-206从而起到致癌作用。动物体内实验也证实了沉默MALAT1基因可以有效缩小肿瘤体积。该研究者发表的另一篇文章则是揭示了胆囊癌细胞中MALAT1作为miR-363-3p的竞争性内源RNA，可调节髓样细胞白血病-1(MCL-1)的表达，增加S相细胞数量，敲除MALAT1则可诱导肿瘤细胞的凋亡。这一研究表明了MALAT1/miR-363-3p/MCL-1调节通路在胆囊癌增殖中的作用。MALAT1还可间接与β-catenin结合并影响细胞通路传导，调节凋亡相关蛋白的表达，最终影响肿瘤细胞的凋亡。Ke-KeSun,etal.的研究共纳入了102名胆囊癌患者，再次证实了MALAT1与肿瘤大小、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移的关系，ROC曲线同时提示了MALAT1可用来预测胆囊癌的复发转移。

大量国内外的研究均表明MALAT1与肿瘤的发生发展关系密切，并成为近年来肿瘤研究的热点。然而，关于胆囊癌与MALAT1的研究尚待深入，且大部分研究仅仅停留于现象及功能层面，对于分子机制研究少且浅。不过，基于目前的研究，MALAT1作为胆囊癌的诊断指标及预后标志物已显示出足够的潜力，为发现胆囊癌的新治疗靶点提供一些启示。更多相关的临床试验及细胞、分子试验有待进一步展开，阐述MALAT1影响胆囊癌发生、增殖、分化、凋亡等一系列过程的具体分子机制。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种长链非编码RNA标志物和蛋白标志物在筛选治疗胆囊癌的候选药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种评价该长链非编码RNA和蛋白表达水平的试剂盒，以用于胆囊癌的诊断。

为了研究与胆囊癌相关的长链非编码RNA和蛋白在胆囊癌中的作用，从而筛选合适的长链非编码RNA和蛋白。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从胆囊癌组织中找到了可以作为胆囊癌标志物的LncRNA MEG3和MALAT1。

因此，本发明一方面提供了一种胆囊癌的诊断标志物，所述标志物为LncRNA MEG3和MALAT1。

优选地，本发明所述的LncRNA MEG3在胆囊癌中低表达。

优选地，本发明所述的MALAT1在胆囊癌中高表达。

优选地，本发明所述的LncRNA MEG3如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明还提供了一种用于诊断胆囊癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测LncRNA MEG3和MALAT1表达水平的试剂。

优选地，本发明所述试剂为特异性扩增LncRNA MEG3的引物。

优选地，本发明所述特异性扩增LncRNA MEG3的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

优选地，本发明所述的试剂为特异性扩增MALAT1的引物。

优选地，本发明所述的特异性扩增MALAT1的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。

再一方面本发明还提供了一种治疗胆囊癌的药物组合物，所述药物组合物包括LncRNA MEG3。

优选地，本发明所述的药物组合物为含有LncRNA MEG3的质粒。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从胆囊癌组织中筛选到用于胆囊癌诊断的标志物LncRNA MEG3和MALAT1(LncRNA MEG3在胆囊癌中低表达，MALAT1在胆囊癌中高表达)。在此基础上，本发明一方面提供了一种胆囊癌的诊断标志物，所述标志物为LncRNA MEG3和MALAT1；本发明还提供了一种用于诊断胆囊癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测LncRNA MEG3和MALAT1表达水平的试剂；再一方面本发明还提供了一种治疗胆囊癌的药物组合物，所述药物组合物包括LncRNA MEG3。本发明的LncRNA MEG3和MALAT1可以作为胆囊癌的诊断标志物。另外，本发明提供的检测LncRNA MEG3和MALAT1的试剂盒，可以在它们作为诊断标志物时，对其进行评价，为胆囊癌的治疗提供指导和帮助。本发明以LncRNA MEG3质粒为主的药物组合物，在胆囊癌的治疗中可能有着重要意义。

附图说明

图1为胆囊癌与正常组织中MEG3与MALAT1的表达水平差异；图中*表示与对照组比较具有统计学差异。

图2为MEG3和MALAT1表达对胆囊癌患者生存率的影响；图中A表示MEG3的表达对胆囊癌患者生存率的影响，图中B表示MALAT1的表达对胆囊癌患者生存率的影响。

图3为转染细胞系中MEG3和MALAT1的表达情况；图中A表示细胞系不同质粒转染后MEG3的表达水平，图中B表示细胞系不同质粒转染后MALAT1的表达水平；图中*表示与pCDNA3.1组比较具有统计学差异。

图4为细胞系转染质粒后，MTT法检测96h内细胞的活性；图中A表示GBC-SD细胞系中的不同转染组活性检测，图中B表示QBC939细胞系中的不同转染组活性检测；图中*表示与pCDNA3.1组比较具有统计学差异，图中**表示与pCDNA3.1组比较具有显著的统计学差异。

图5为GBC-SD和QBC939细胞系转染不同质粒后克隆形成数；图中A表示转染不同质粒14天后，GBC-SD和QBC939细胞系中菌落数情况，图中B表示GBC-SD和QBC939细胞系转染不同质粒后克隆形成数直方图；图中**表示与pCDNA3.1组相比具有显著的统计学差异。

图6为流式细胞术检测细胞系转染不同质粒后各周期细胞数变化；图中A表示转染pCDNA-MEG3和pCDNA-MALAT1的细胞系各细胞周期数变化，图中B表示GBC-SD细胞系各细胞周期数变化直方图，图中C表示QBC939细胞系各细胞周期数变化直方图。

图7为AnnexinV/PI双染测定检测细胞系不同转染质粒的凋亡率；图中A表示不同转染质粒两种细胞系的流式细胞凋亡图情况，图中B表示不同转染质粒细胞系的凋亡率直方图；与pCDNA3.1组相比，图中*表示具有统计学差异，图中**表示具有显著统计学差异。

图8为Western Blotting检测细胞增殖相关蛋白p53和CyclinD1明确细胞增殖状况；图中A表示Western blotting检测细胞增殖相关蛋白在两种细胞系中的表达情况，图中B表示Western blotting检测细胞增殖相关蛋白在GBC-SD中的表达情况，图中C表示Western blotting检测细胞增殖相关蛋白在QBC939中的表达情况；图中*表示与pCDNA3.1比较具有统计学差异，图中**表示与pCDNA3.1比较具有显著的统计学差异。

图9为转染不同质粒的GBC-SD细胞在体内形成肿瘤的大小与时间关系；图中*与pCDNA3.1组相比具有统计学差异，图中**与pCDNA3.1组相比具有显著的统计学差异。

图10为肿瘤组织在体内形成16d后的质量；图中A表示肿瘤组织在体内形成16d后的实体图，图中B表示肿瘤组织在体内形成16d后的质量；图中*表示与pCDNA3.1组相比具有统计学差异，图中**表示与pCDNA3.1组相比具有显著的统计学差异。

图11为RT-PCR检测肿瘤组织MEG3和MALAT1相对表达水平；图中**表示与pCDNA3.1组相比具有显著的统计学差异。

图12为对肿瘤组织中的ki-67和caspase-3进行免疫组化分析结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测胆囊癌组织中长链非编码RNA和蛋白的表达水平，发现其中具有明显表达差异的长链非编码RNA片段和蛋白，探讨其与胆囊癌的发生之间的关系，从而为胆囊癌的诊断和靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过实验，本发明发现胆囊癌组织中LncRNA MEG3显著性下调，MALAT1显著性上调，因此，LncRNA MEG3和MALAT1可以作为胆囊癌的诊断标志物。另外，进一步的实验证明，改变LncRNA MEG3的表达水平可以影响胆囊癌的生长，提示LncRNA MEG3可以作为药物靶标用于胆囊癌的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与胆囊癌相关联的基因、基因的片段或变体。

基于发明人的发现，本发明提供了一种LncRNA MEG3在制备治疗胆囊癌的产品中的用途以及由此制备的药物组合物和该药物组合物在治疗胆囊癌的应用，所述药物组合物的性质对本发明来说并不重要，只要它含有LncRNA MEG3基因的功能性即可，举例来说，本发明的药物组合物可以是以LncRNA MEG3基因的合成序列构建的重组质粒、其能抑制胆囊癌的自我更新(本发明的优先实施例中有详细介绍)。

本发明的LncRNA MEG3可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗胆囊癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

在本发明的实施例中，一种代表性的人LncRNA MEG3基因和MALAT1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和NR_144568.1所示。本发明的LncRNA MEG3和MALAT1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNAISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LncRNA MEG3和MALAT1的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测LncRNA MEG3和MALAT1的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测LncRNA MEG3和MALAT1表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。所述的试剂盒一方面可以在LncRNA MEG3和MALAT1作为诊断标志物时，对其进行评价，为胆囊癌的治疗提供指导和帮助。另一方面，在LncRNA MEG3用于治疗胆囊癌的药物时，对LncRNA MEG3进行评价，以用于评价LncRNA MEG3的表达水平，从而对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供帮助，这对LncRNA MEG3作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

本项目选取2008年1月至2010年6月共84例的胆囊癌组织标本以及周边正常标本，采用RT-PCR方法检测MEG3和MALAT1表达。将空载体，pCDNA-MEG3和pCDNA-MALAT1载体均转染至GBC-SD和QBC939细胞，MTT法测定细胞活性以及群落形成数，流式细胞术检测细胞周期，Western-bolting法检查细胞增殖相关因子p53和CyclinD1的表达。通过往小鼠体内注射3种转染的GBC-SD细胞，验证MEG3和MALAT1对肿瘤形成的影响，并通过免疫组化方法检测凋亡相关因子ki-67和caspase-3的表达水平。

一、实验方法

1.组织标本的收集

收集2008年1月至2010年6月共84例的胆囊癌组织标本以及癌旁3-5cm正常标本。其中男性25例，女性59例。年龄分布在29-81岁，平均年龄59.51±8.95岁。组织学类型腺癌67例，鳞癌11例，腺鳞癌6例；病理分级中低分化63例，高分化21例；根据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第七版胆囊癌TMN分期I-Ⅱ期16例，Ⅲ-IV期68例；有淋巴结转移的58例，无淋巴结转移的26例。纳入标准：所有患者手术前未经放疗及化疗，术后均经过病理证实；术前检查未发现除胆囊癌以外的其他恶性肿瘤。排除医疗记录不完整的或记录有矛盾的患者。胆囊癌的标本在切除后马上置于液氮中迅速急冻然后储存在-80℃之中。此次研究已经获得我院伦理部门的相关批准并且患者及其家属均知情同意。

2.细胞分组及转染

人胆囊癌细胞株GBC-SD和QBC939购自上海通蔚生物科技有限公司。使用含10％进口胎牛血清的RPMI-1640培养基，100U/ml青霉素，100mg/L链霉素，37℃，5％二氧化碳饱和湿度下培养，传代用0.125％胰蛋白酶(含0.1％EDTA)消化。取对数期细胞株进行细胞转染。合成MEG3和MALAT1序列并克隆至pCDNA3.1载体中(Invitrogen，Guangzhou，China)。然后将pCDNA-MEG3载体，pCDNA-MALAT1以及空载体转染至胆囊癌的细胞株中。转染前一天用不含抗生素的DMEM培养基将细胞(2×105/孔)均匀的铺在6孔细胞培养板中。次日，细胞贴壁密度达到60％-80％左右时进行转染(铺板后16-24小时转染)。转染前用不含双抗含血清的DMEM培养基进行换液(2ml/孔)。将250μl不含双抗、血清的MEM培养基放入无菌的EP管中，在其中加入载体(终浓度为50nM)。将250μl不含双抗、血清的MEM培养基放入另外一个无菌的EP管中，在其中加入4μl转染使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche，Basel，Switzerland)。空载体pcDNA3.1用作对照组。转染48小时后回收细胞。

3.RT-qPCR检测MEG3及MALAT1表达

总RNA通过TRIzol进行抽提(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。RNA先通过PrimeScriptRTreagentkit反转录为cDNA(Takara公司)。然后使用qPCRSuperMix-UGD(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行检测，实验以GAPDH作为内参。引物长度18～29bp；扩增产物长度在250～350bp之间；引物设计跨内含子区。在PCR管中依次加入qPCR SuperMix12.5μl，Forward primer 0.5μl，Reverse primer 0.5μl，cDNA模版0.5μl，DEPC水11μl，最终反应体系为25ul，PCR程序设计为第一步95℃ 30s预变性，第二步95℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s变性，并将第二步进行40个循环，57℃至70℃退火30s,72℃ 30s延伸，72℃ 5min最终延伸。RT-PCR通过ABI 7500(美国ABI公司)进行扫描分析，并通过2-ΔΔCt法进行相对定量分析，2-ΔΔCt表示癌组织组与癌旁组织组目的基因表达的倍比关系，公式如下：ΔΔCT＝ΔCt癌组织组-ΔCt癌旁组织组，其中ΔCt＝Ct目的基因–CtGAPDH。所有样品的Ct值都根据以内参基因(GAPDH)标准化后计算样品的相对表达量。即目的基因相对表达量＝level目的基因/levelGAPDH，每次实验每个样本均设2个副孔，取三次结果平均值为实验结果。

可以用下表表示PCR扩增引物及内参序列：

4.MTT法及细胞克隆检测细胞增殖

细胞增殖测定主要使用Cell proliferation reagent kitI(MTT)(Roche，Basel，Switzerland)。转染的细胞将移至96孔板中并按照操作说明进行测定，每24h测定一次，连续测定4天。除此以外，还进行细胞群落形成测定，把特定的转染细胞置于6孔板中然后以10％小牛血清培养基连续培养14天，每3天更换一次培养基。细胞群通过甲醇固定然后以0.1％结晶紫进行染色(Sigma，USA)。克隆形成数则通过对染色的群落进行直接计数获得。

5.流式细胞仪检测细胞周期分布

将细胞接种到96孔板内，调整细胞密度至1×104个/ml，每组细胞设6个复孔。在各组培养72h后，细胞于4℃下2000rpm离心5分钟，弃去上清，然后用PBS(phosphate-buffersaline)洗涤，用标记缓冲液悬浮细胞；用300μl的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700μl预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70％，4℃避光固定过夜，800rpm离心10min，去上清，PBS清洗两次，重悬细胞于500μl含100unit/ml RNaseA的PBS缓冲液中，避光37℃孵育30min；加2mg/mlPI(Propidium Iodide)至终浓度50μg/ml，避光孵育30min；在FACscan流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)上检测细胞周期，检测数据用ModFitLT3.3软件分析。

6.AnnexinV/PI双染测定细胞凋亡率

细胞经胰酶消化，PBS洗两次。细胞染色：EP管收集1～5×105个细胞，每次lmL PBS洗涤细胞两次(2000rpm离心5min)：加入500uL的Binding Buffer悬浮细胞：加入5uLAnnexinV-FITC混匀后，加入5uLPI混匀；室温条件下避光反应5～15min；1h内进行检测。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。流式细胞仪激发光波长为488nm，通带滤器以515nm的波长检测FITC荧光，另一滤器以大于560nm的波长检测PI。

7.Western blotting分析

收集细胞蛋白并通过10％SDS-PAGE进行分离，并转移到0.22um的硝酸纤维素膜上(Sigma公司)，牛奶封闭后孵一抗过夜，TBST(TRIS-buffered saline-Tween)洗膜4次，每次10min，然后加入HRP(horse radish peroxidase)标记的二抗室温孵育1h，TBST洗膜4次，最后加入显影底物显影。使用Auto-radiograms测定仪进行显影分析。GAPDH抗体作为对照，与Anti-p53抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司。Anti-Cyclin D1抗体，HRP标记二抗购自Cell signaling Technology公司。一抗与二抗均使用TBST，以1：1000稀释。

8.肿瘤形成实验

获取5周龄的雄性无胸腺BALB/c小鼠并处于无病原环境中饲养。实验已经获得相关实验动物协会的批准。GBC-SD的转染细胞(空载pcDNA3.1，pCDNA-MALAT1和pCDNA-MEG3)，进行胰蛋白酶处理回收，并控制浓度为2×107cells/ml。取悬浮细胞液0.1ml注射到小鼠的后侧腹(每组各三只)。每两天检查一次肿瘤的大小以及重量。肿瘤的体积是通过长×宽2×0.5计算。16天后，将对小鼠进行安乐死，并切取肿瘤组织，进行重量测定以及后续实验。切除的组织将进行RT-qPCR的MEG3及MALAT1检测，并通过免疫染色分析Ki-67和caspase3蛋白的表达。

9.免疫组化检测Ki-67和caspase3蛋白

将上述实验切除的新鲜组织中性甲醛固定，组织常规脱水、石蜡包埋，切片，常规脱蜡；切片用0.1％tritonx-100浸泡10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟；加入复合消化酶消化40s，,PBS冲洗3次,每次5分钟，后置于3％H2O2溶液中，室温孵育20min，PBS漂洗3次,每次5分钟。血清覆盖切片，37℃孵育20分钟，甩去血清，加入1：50兔抗人特异性一抗ki67及Caspase-3，4℃过夜,用含有0.1％tritonx-100的PBS液漂洗洗3次,每次5分钟；加生物素标记的二抗每张切片约50ul,37℃孵育30分钟；DAB显色,在室温下显色,镜下观察并控制染色时间及时用蒸烟水终止显色；苏木素复染,镜下观察控制染色时间,然后蒸饱水冲洗,盐酸分色后自来水冲洗3分钟,供干,二甲苯透明,中性树胶封片,注意封片时尽量避免空气进入。ki67阳性定位与细胞核染色，染色呈棕黄色；Caspase-3阳性定位与细胞质内或细胞核内染色，染色呈棕黄色颗粒。上述抗体均购自Cell signaling Technology公司。

10.统计学分析

以SPSSver18进行统计分析，计量资料采用mean±SD格式表示，对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验。MEG3和MALAT1表达在胆囊癌及周边组织的比较采用配对样本t检验，在多组细胞间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。生存曲线使用Kaplan-Meier方法进行不同表达条件下的生存可能统计。MTT法检测细胞活性与肿瘤形成试验中转染同一质粒不同时间点的比较采用重复测量方差分析，转染不同质粒后同一时间点的比较采用单因素方差分析。P<0.05认为是具有显著的统计学意义。

二、实验结果

1.MEG3和MALAT1在胆囊癌组织的表达及对胆囊癌患者预后的影响

通过RT-qPCR检测方法测定MEG3以及ANRILMALAT1在胆囊癌及周边组织的相对表达水平(图1)，结果显示：MEG3在胆囊癌组织中水平显著低于周边正常组织(0.16±0.19vs.1.00±0.00)，而ANRILMALAT1的水平则显著高于周边正常组织(2.43±0.24vs.1.00±0.00)(均P<0.05)。根据MEG3和ANGIL的中位水平，把84例患者划分为高表达组(高于中位值，n＝42)和低表达组(低于中位值，n＝42)各42例。调查数据一共进行5年统计，每10个月统计一次，失访6人，失访率为7.41％。从结果中可以体现，高MEG3表达和低ANRILMALAT1的表达水平个体具有显著较高的生存率(P<0.05)。因此，MEG3可能与抑制肿瘤的增殖与恶化有关，ANRILMALAT1则可能是参与抑制某些抑癌因子的过程而增加癌组织恶化的风险。(图2)

2.癌组织MEG3和MALAT1与临床病理特征的关系

如表2所示，胆囊癌患者癌组织中MEG3和MALAT1与患者性别、组织学类型、病理分级、TMN分期和淋巴结转移无明显差异。(P>0.05)。可用下表表示癌组织MEG3和MALAT1与临床病理特征的关系：

表2临床病理特征与癌组织MEG3和MALAT1的关系

3.MEG3和MALAT1对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

通过RT-qPCR方法在转染48h后观察细胞系的MEG3和MALAT1的表达情况。结果显示：对比空载体pCDNA3.1转染组，转染pCDNA-MEG3和pCDNA-MALAT1的细胞则出现明显的MEG3和MALAT1的表达量提高(P<0.01)(图3)。

MTT检测发现，细胞的增殖水平在三种不同的转染组中，随着时间的进程逐渐产生显著差异，于72h后存在显著差异，过表达的MEG3能够明显抑制两种细胞的细胞活性，而过dsaASDFGHJKL；’表达的MALAT1则对细胞活性具有明显的加强提cbnm,/高(P<0.05)(图4)。克隆形成的结果发现：在两种细胞中，过表达的MEG3都能够减少细胞群落的形成(均P<0.01)；反之过表达的MALAT1则显著提高了细胞克隆群的形成(均P<0.01)(图5)。通过流式细胞的分析，过表达的MEG3使细胞显著地停留在G1-G0时期，而且细胞的凋亡率明显地增高(P<0.05)，而MALAT1则更多是使细胞处于S期，凋亡率相对于对照组更低(P<0.05)(图6-7)。且western blotting检测细胞增殖相关蛋白p53和Cyclin D1进一步确认细胞的增殖情况(图8)，结果显示：p53在过表达MEG3的细胞中显著提高(P<0.05)，而Cyclin D1则是显著降低(P<0.05)，暗示细胞的增殖受到了抑制；而在MALAT1转染细胞中则相反，p53的表达量显著减少(P<0.05)，而Cyclin D1的情况则很明显的增高(P<0.05)，说明细胞的增殖速度加快。

通过以上的实验可以展示，MEG3是肿瘤的抑制因子，其能够通过增强p53和减弱Cyclin D1的表达抑制癌细胞的增长；MALAT1是促癌的因子，在其作用下p53的表达减弱，Cyclin D1增强，因此能够增强细胞的增殖能力。

4.体内实验验证MEG3和MALAT1对胆囊癌细胞的影响

为了验证MEG3和MALAT1在体内对胆囊癌细胞的影响，把转染了空载体，pCDNA-MEG3和pCDNA-MALAT1的GBC-SD注射到小鼠体内。在注射的位置，将会出现移植瘤。在整个过程中可以发现，MEG3转染组的肿瘤增殖大小显然小于空载体组(P<0.05)，而MALAT1则显著大于空载体组(P<0.05)，如附图9所示。在16日后进行进一步的研究发现，肿瘤的质量，在MEG3的肿瘤组织显然小于空载体组，而MALAT1则相反，显著大于空载体组(P<0.05)，如附图10所示。然后再进行qPCR的分析，此时MEG3和MALAT1的表达水平仍与转染前一致，MEG3和MALAT1转染组中MEG3和MALAT1的表达水平仍高于其在空载体中的水平(P<0.05)，如附图11所示。此时通过免疫组化染色鉴定常规的凋亡相关因子ki-67和caspase-3因子，发现在MEG3转染组中ki-67因子显著减少，而caspase-3的水平显著增加，表明肿瘤细胞更大程度受到增殖抑制，更趋向于凋亡过程；而在MALAT1转染组中对比空白组，caspase-3的水平显著减少，ki-67的水平更多，说明此时肿瘤细胞的凋亡水平较低，更趋向于增殖，如附图12所示。

综上所述，胆囊组织中长链非编码RNAMEG3和MALAT1两种基因表达水平可诊断预示胆囊癌的转移。MEG3基因表达能够抑制癌细胞的增殖和促进其凋亡，其在胆囊癌组织中表达量较低；而MALAT1基因表达能够促进癌细胞的增殖并减少凋亡，其在胆囊癌组织中表达量较高。胆囊组织中MEG3基因高表达而MALAT1基因低表达能够提高胆囊癌患者生存率，因此MEG3和MALAT1基因可作为诊断胆囊癌的候选靶指标，不仅精准性高，而且具有检测成本低和操作流程简便等特点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 湖南医睿通生物医药科技有限公司

<120> LncRNA MEG3和MALAT1作为诊断胆囊癌的标志物的应用及其检测试剂盒

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1785

<212> DNA

<213> LncRNA MEG3核苷酸序列

<400> 1

agcccctagc gcagacggcg gagagcagag agggagcgcg ccttggctcg ctggccttgg 60

cggcggctcc tcaggagagc tggggcgccc acgagaggat ccctcacccg ggtctctcct 120

cagggatgac atcatccgtc cacctccttg tcttcaagga ccacctcctc tccatgctga 180

gctgctgcca aggggcctgc tgcccatcta cacctcacga gggcactagg agcacggttt 240

cctggatccc accaacatac aaagcagcca ctcactgacc cccaggacca ggatggcaaa 300

ggatgaagag gaccggaact gaccagccag ctgtccctct tacctaaaga cttaaaccaa 360

tgccctagtg agggggcatt gggcattaag ccctgacctt tgctatgctc atactttgac 420

tctatgagta ctttcctata agtctttgct tgtgttcacc tgctagcaaa ctggagtgtt 480

tccctcccca agggggtgtc agtctttgtc gactgactct gtcatcaccc ttatgatgtc 540

ctgaatggaa ggatcccttt gggaaattct caggaggggg acctgggcca agggcttggc 600

cagcatcctg ctggcaactc caaggccctg ggtgggcttc tggaatgagc atgctactga 660

atcaccaaag gcacgcccga cctctctgaa gatcttccta tccttttctg ggggaatggg 720

gtcgatgaga gcaacctcct agggttgttg tgagaattaa atgagataaa agaggcctca 780

ggcaggatct ggcatagagg aggtgatcag caaatgtttg ttgaaaaggt ttgacaggtc 840

agtcccttcc cacccctctt gcttgtctta cttgtcttat ttattctcca acagcactcc 900

aggcagccct tgtccacggg ctctccttgc atcagggcta atctcgggcc ttgtcgaagg 960

aagaggctgc agacgttaat gaggttagct gctggattcc agtattcgtc gcataaggat 1020

ccttctttgt ctgcgaagga aaaacacact gattatcata atgagcaggt tcccagtgcc 1080

cccgacaagc ccctgctggt gtctccatct cctgccaagc atcctccagt gcctcctcct 1140

gtgggcctgg cctcagggct atggacagac tcctgtccca tcccagagac ccctcgtgat 1200

cgtgccctgg cacgtgggcc gtggcccggc tgggtcggct gaagaactgc ggatggaagc 1260

tgcggaagag gccctgatgg ggcccaccat cccggaccca agtcttcttc ctggcgggcc 1320

tctcgtctcc ttcctggttt gggcggaagc catcacctgg atgcctacgt gggaagggac 1380

ctcgaatgtg ggaccccagc ccctctccag ctcgaaatcc ctccacagcc acggggacac 1440

cctgcaccta ttcccacggg acaggctgga cccagagact ctggacccgg ggcctcccct 1500

tgagtagaga cccgccctct gactgatgga cgccgctgac ctggggtcag acccgtgggc 1560

tggacccctg cccaccccgc aggaaccctg aggcctaggg gagctgttga gccttcagtg 1620

tctgcatgtg ggaagtgggc tccttcacct acctcacagg gctgttgtga ggggcgctgt 1680

gatgcggttc caaagcacag ggcttggcgc accccactgt gctctcaata aatgtgtttc 1740

ctgtcttaac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1785

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcccatct acacctcacg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctccgccg tctgcgctag gggct 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttattttat tcctggctcc cct 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcattctcc tcaaattaca gag 23

Claims (11)

1.一种胆囊癌的诊断标志物，其特征在于，所述标志物为LncRNAMEG3和MALAT1。

2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述的LncRNAMEG3在胆囊癌中低表达。

3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述的MALAT1在胆囊癌中高表达。

4.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述的LncRNAMEG3如SEQ ID NO.1所示。

5.一种用于诊断胆囊癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测LncRNA MEG3和MALAT1表达水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增LncRNAMEG3的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增LncRNAMEG3的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂为特异性扩增MALAT1的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性扩增MALAT1的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

10.一种治疗胆囊癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LncRNAMEG3。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为含有LncRNAMEG3的质粒。

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