KR20230092352A

KR20230092352A - 암전이의 검출용 신규 바이오마커

Info

Publication number: KR20230092352A
Application number: KR1020210181662A
Authority: KR
Inventors: 지헌영; 정재호; 박현우; 오종욱; 섭유진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-06-26
Also published as: WO2023113525A1

Abstract

본 발명은 부유 암세포의 전이부위에서 부착능력 재획득을 유도하는 인자를 발굴하고, 이들의 발현 조절을 통하여 전이암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 조기에 발견할 경우 환자의 생존율을 현저히 개선시킬 수 있는 전이암에 대한 유효한 바이오마커를 제공함으로써, 원발암이 전이암으로 진행될 가능성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있는 방법을 제공함과 동시에, 궁극적으로는 순환종양세포의 콜로니화를 차단하거나, 원발성 암조직으로부터의 순환종양세포 생성을 현저하게 차단함으로써, 전이암의 진행을 각 단계별로 다각적으로 차단하는 효율적인 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암전이의 검출용 신규 바이오마커{Novel Biomarkers for Detecting Metastasis of Caner}

본 발명은 부유 암세포의 부착 능력 재획득 여부를 결정하는 인자의 발현량을 측정하여 암세포의 전이 여부를 예측하거나, 해당 인자의 발현을 조절함으로써 암 전이를 억제하는 법에 관한 것이다.

암의 전이(metastasis)란 암세포가 원발성 암(primary tumor) 조직에서 이탈하여 주위의 혈관이나 림프관으로 침투해 이를 통로로 하여 체내의 다른 부위로 원거리 이동하면서 새로운 종양을 형성하는 현상을 말한다. 암 환자의 사망원인의 90% 이상은 원발암성 암으로부터의 전이에 기인하므로(Nature Reviews Cancer, 2006, 6:49-458), 원발암 환자의 진단 및 치료에 있어서 전이 여부를 조기에 진단하거나, 더 나아가 전이하기 전 단계에서 이를 예측하는 것은 암 환자의 사망률을 개선시키는 것과 관련하여 매우 중요한 문제이다.

암세포가 원발암(primary tumor)에서 나와 혈액을 통해 전이하는 과정에서 부착세포인 원발암 세포는 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)인 부유세포로 변신하는 것이 필요하며, 부유세포가 전이 부위로 이동한 뒤 전이 부위에서 암 조직으로 콜로니화(colonization) 하기 위해서 다시 부착세포의 표현형을 얻어야 하는데, 이에 따르면 부유세포에서 부착세포로의 변화에 관여하여 암세포의 부착능력을 활성화시키는 인자는 암 전이에 관여할 수 있다.

암의 종류 중 구체적으로 위암은 전 세계적으로 한국에서 가장 높은 발생률을 보이고 있는 암종이며, 조기 위암의 경우 생존율이 양호하나 진행된 위암의 경우 생존율이 급감하며, 우리나라 2019년 통계자료에 따르면 위암으로 인한 사망은 암 전체 사망 중 4번째에 이르고 있어 위암의 전이암으로의 진행을 예측하는 것은 임상적으로 매우 중요하다.

따라서 부유 암세포가 전이부위로 이동한 후 다시 부착세포의 표현형을 얻어 암 조직으로의 콜로니화를 하는 데 관여하는 인자는 전이의 진행 여부를 예측해 볼 수 있는 바이오마커로 사용 가능하고, 이는 원발암환자의 생존율을 높이는데 매우 유효한 진단방법이 될 수 있으나, 현재까지 위암에서 해당 인자로 보고된 유효한 바이오마커는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 원발암의 전이 여부를 조기에 발견하거나, 더 나아가 이를 예측할 수 있는 효율적인 바이오마커를 발굴하기 위하여 전이암 환자에서 발견되는 특정 유전자의 과발현과 전이여부와의 연관성에 대하여 연구하였으며, 해당 특정 유전자의 발현이 암세포의 전이에 중요한 역할을 하여 암전이의 바이오마커로써 가능성 있음을 확인하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 대한민국공개특허공보 제10-2020-0141166호

본 발명자들은 암 환자의 대다수 사망 원인을 구성하는 암전이(metastasis)의 효율적인 진단을 위한 바이오마커를 발굴하여 환자의 암세포가 전이 단계로 진행 될지 여부를 예측함으로써, 궁극적으로 전이암을 조기에 발견함으로써 전이암으로 인한 사망률을 현저히 낮출 수 있는 새로운 진단 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 부착세포인 원발암세포(primary tumor cell)가 부유세포인 순환종양세포(circulating tumor cell; CTC)로 변화한 뒤, 전이부위로 이동한 순환종양세포가 다시 부착세포로 변화하여 콜로니화하는 과정에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자가 특이적으로 고발현되며, 이와 같은 부착 의존성(anchorage dependency) 조절인자들의 발현 수준을 측정함으로써 전이 진행 전 단계에서도 이를 높은 신뢰도로 예측하여 암세포의 전이 능력 획득을 조기에 진단할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 암의 전이 여부를 예측할 수 있는 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암의 전이 여부를 예측할 수 있는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전이암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전이암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 EPAS1(Endothelial PAS Domain Protein 1), SNAI2(Snail Family Transcription Repressor 2) 및 TEAD1(TEA Domain Transcription Factor 1)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 전이암(Metastatic cancer)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 암 환자의 대다수 사망 원인을 구성하는 암전이(metastasis)의 효율적인 진단을 위한 바이오마커를 발굴하여 환자의 암세포가 전이 단계로 진행 될지 여부를 예측함으로써, 궁극적으로 전이암을 조기에 발견함으로써 전이암으로 인한 사망률을 현저히 낮출 수 있는 새로운 진단 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 부착세포인 원발암세포(primary tumor cell)가 부유세포인 순환종양세포(circulating tumor cell; CTC)로 변화한 뒤, 전이부위로 이동한 순환종양세포가 다시 부착세포로 변화하여 콜로니화하는 과정에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자가 특이적으로 고발현되며, 이와 같은 부착 의존성(anchorage dependency) 조절인자들의 발현 수준을 측정함으로써 전이 진행 전 단계에서도 이를 높은 신뢰도로 예측하여 암세포의 전이 능력 획득을 조기에 진단할 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“전이암”은 원발성 암(primary tumor) 조직에서 이탈한 암세포가 주위의 혈관이나 림프관으로 침투해 이를 통로로 하여 체내의 다른 부위로 원거리 이동하면서 형성된 새로운 종양을 의미한다. 암 환자의 사망원인의 90% 이상은 원발암성 암으로부터의 전이에 기인하므로(Nature Reviews Cancer, 2006, 6:449-458), 암 환자의 사망률을 개선시키기 위해 암 전이를 억제하는 것은 원발암의 치료에 못지않게 매우 중요한 문제이다.

전이 과정에서 암세포가 이동성을 획득하는 기작은 종양 상피세포(epithelial cell)가 유전적 변이에 의해 간엽세포(mesenchymal cell)의 형질을 획득하는 EMT(epithelial to mesenchymal transition)와 이의 반대 과정인 MET(mesenchymal to epithelial transition)로 설명된다(J Clin Invest. 2009, 119:1417-1419). 즉, 간엽세포의 형질을 갖게 된 상피세포는 세포 간 결합이 약화되어 본래 위치에서 이탈하여 혈관으로 이동하며, 혈관을 통해 이동하던 세포가 다시 본래의 상피적 특성을 회복하여(MET) 원발 부위에서 멀리 떨어진 2차 부위에 정착하여 종양을 증식시키게 된다.

본 발명자들은 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자가 일반 위암환자와는 달리 전이 위암 환자에게서 특이적으로 고발현된다는 사실과 이들 유전자가 고발현되는 경우 환자군의 생존율이 떨어진다는 사실 및 위암 세포가 부착세포에서 부유세포로 전환되는 과정(adherent-to-suspension transition: AST)에서는 오히려 발현량이 감소한다는 사실을 확인함으로써, EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1이 혈관 내에서 부유하는 암세포인 순환종양세포(CTC)가 전이 부위로 이동한 뒤, 전이 부위에서 다시 부착세포로 변화하여 암세포로 콜로니화(colonization)하는 과정(suspension-to-adherent transition; SAT)을 통하여 전이가 발생하는 과정에서의 신뢰도 높은 바이오마커로 기능할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이미 순환종양세포(CTC)가 생성되어 있는 환자에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1이 고발현될 경우 암의 전이가 발생하였거나 향후 발생할 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있으며, 순환종양세포가 아직 발생하지 않은 원발암환자에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1이 저발현될 경우 암의 전이가 발생하였거나 향후 발생할 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 이에 “전이암의 진단”은 “암 전이의 진단”“간엽상피이행의 예측”“순환종양세포의 전이 부위에서의 콜로니화 예측”또는 “암의 예후 예측”과 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체 내 암세포의 전이 능력 획득 여부를 판단하거나 획득 가능성을 예측하기 위해 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계의 암이고, 상기 발현량이 증가한 경우, 순환종양세포의 콜로니화가 증가함으로써 암 전이의 위험이 증가한 것으로 판단한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계의 암이고, 상기 발현량이 감소한 경우, 순환종양세포가 생성됨으로써 암 전이의 위험이 증가한 것으로 판단한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 인자는 암세포가 부착성 표현형으로 전환됨에 따라 고발현되는 인자로서, 원발조직에서 분리된 CTC가 혈액을 순환하다가 전이를 일으키고자 하는 조직 부위에 생착하는 과정에서 그 발현이 증가하게 된다. 이에, 이미 생성된 CTC가 혈액을 순환하는 단계의 종양에서 본 발명의 인자는 암 전이의 양성 마커(positive marker)가 된다. 반면, CTC가 생성되기 전의 상태에선 본 발명의 인자는 암세포의 부유성 표현형으로의 전환을 차단하는 인자로서 그 발현량과 전이암의 위험간 음의 상관관계를 가지는 음성 마커(negative marker)로 기능할 수 있다.

본 발명의 구성 중“전이암의 진단용 조성물”을 언급하면서 사용되는 용어“발현량의 증가”는 대조군 또는 정상군에 비해 해당 유전자의 발현량이 유의하게 높은 경우를 의미하며, 구체적으로는 발현량이 상기 대조군 또는 정상군과 비교하여 약 10% 이상 증가, 약 20% 이상 증가, 약 30% 이상 증가, 약 40% 이상 증가, 약 50% 이상 증가, 또는 약 60% 이상 증가한 경우를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다. 또한 용어“발현량의 감소”는 대조군 또는 정상군에 비해 해당 유전자의 발현량이 유의하게 낮은 경우를 의미하며, 구체적으로는 발현량이 상기 대조군 또는 정상군과 비교하여 약 10% 이상 감소, 약 20% 이상 감소, 약 30% 이상 감소, 약 40% 이상 감소, 약 50% 이상 감소, 또는 약 60% 이상 감소한 경우를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’말단 또는 5’말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단백질을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 암세포의 전이성 획득 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 종양의 전이 여부 또는 전이 가능성을 예측할 수 있다. 즉, 순환종양세포가 이미 생성된 개체의 시료에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 개체의 종양의 전이가 진행되었거나 향후 진행될 가능성이 높은 것으로 판단되며, 순환종양세포가 생성되기 전인 개체의 시료에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질에 대한 시그널이 정상 사료보다 약하게 나오는 경우에는 개체의 종양의 전이가 진행되었거나 향후 진행될 가능성이 높은 것으로 판단된다.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, “특이적으로 결합(specifically binding)”은 “특이적으로 인식(specifically recognizing)”과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 항체 대신 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 진단될 수 있는 암은 위암이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이암(Metastatic cancer)의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질, 이를 인코딩하는 유전자 및 이를 이용하여 진단될 수 있는 전이암(Metastatic cancer)에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 이를 생략한다.

본 발명자들은 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 유전자의 발현의 활성화가 순환종양세포가 이미 형성된 개체에서는 암세포의 전이능력 획득과 양의 상관관계를 가지고, 순환종양세포가 형성되기 전의 개체에서는 암세포의 전이능력 획득과 음의 상관관계를 가진다는 사실을 최초로 발견하였다. 이에, 순환종양세포가 이미 형성된 개체 내 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자가 고발현될 경우 상기 개체는 전이능력을 가지는 암세포를 가지고 있거나 향후 가질 수 있는 것으로 판단하며, 순환종양세포가 형성되기 전의 개체 내 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자가 저발현될 경우에는 상기 개체는 전이능력을 가지는 암세포를 가지고 있거나 향후 가질 수 있는 것으로 판단한다.

본 명세서에서 용어“개체”는 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 암세포의 전이 능력 획득의 분석 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 조성물은 현재 암세포의 전이 능력 획득 여부 뿐 아니라 향후 암세포가 전이 능력을 획득할 유전적 위험성을 예측하기 위한 정보도 제공하기 때문에, 본 발명의 개체는 전이암(Metastatic cancer) 환자일 수도 있고 아직 전이 능력을 획득하지 않은 원발암성 암 환자일 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명자들은 부유성 세포가 부착성 세포로 콜로니화(colonization)하는 과정에서 발현되는 유전자를 탐색하고, 이 유전자를 인위적으로 과발현시킨 세포는 본래 표현형과 달리 부착성 세포로 유도됨을 밝혔다. 나아가, 암세포에서 이들의 발현을 억제할 경우 부유세포의 부착세포로의 콜로니화(colonization) 이 저해됨으로써 종양의 전이가 억제될 수 있음을 실험적으로 증명하였다.

본 명세서에서 용어“억제제”는 타겟 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 타겟 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 타겟 유전자의 생물학적 기능이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다.

타겟 유전자의 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 그 서열이 공지된 상기 유전자의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 타겟 유전자를 인식하는 가이드 RNA(guideRNA ; gRNA)를 포함하는 CRISPR 시스템과, 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 이들의 활성을 억제하는 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 유전자 및 단백질 수준의 억제수단이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 인 비보 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.

본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.

본 명세서에서 용어“miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.

본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.

본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 용어“가이드 RNA (guideRNA ; gRNA)”는 타겟 유전자를 인식하여 핵산분해효소(nuclease)를 유도함으로써 인식된 분위를 특이적으로 절단하는 유전자 편집 시스템에 사용되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 유전자 편집 시스템에는 대표적으로 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 발현 억제제는 상기 유전자들이 코딩하는 단백질의 활성을 저해하는 특이적 항체일 수 있다. 목적 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 항체 또는 앱타머에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 방지하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현이 억제되면서 이미 순환 종양 세포가 형성된 암환자에서 순환 종양 세포의 전이 부위에서의 콜로니화(colonization)가 저해되어 종양, 구체적으로는 전이된 종양으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계의 암인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명은 EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물을 대상체에 투여하면 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현이 활성화되면서 아직 순환 종양 세포가 형성되지 않은 암환자에서 원발암세포의 순환 종양 세포로의 전환이 저해되어 종양, 구체적으로는 전이된 종양으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“활성화제”는 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질의 발현량 또는 활성을 증진시키는 유효성분을 의미하며, 예를 들어 당업계에 이미 그 서열 및 구조가 공지된 단백질인 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현을 유전자 또는 단백질 수준에서 증진시키거나 고유의 생물학적 활성을 증진시키는 핵산분자, 펩타이드, 단백질, 화합물 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에,“EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질의 활성화제(activator)”는“EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질 작용제(agonist)”와 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서“유전자 수준에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 단백질의 발현량을 증가시키는 방법”에는, 타겟 유전자의 mRNA의 생체 내 전달(in vivo delivery of mRNA)방법이 포함되나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 유전자 및 단백질 수준의 활성화 수단이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계의 암인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 위암이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 이들을 인코딩하는 유전자 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계,

상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 활성 또는 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계에서의 전이암의 예방 또는 치료용 조성물 조성물로 판정하며,

상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 활성 또는 발현량이 증가하는 경우, 상기 시험물질은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계에서 전이암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 암조직 또는 암세포를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 부착 의존성 조절 인자 및 이들의 발현 조절을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 암의 종류에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 상술한 유전자를 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 암조직, 암세포 또는 이의 배양액일 수 있으며, 가장 구체적으로는 위암 조직, 위암세포 또는 이의 배양액이다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 유전자를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 이들 유전자의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 부유 암세포의 전이부위에서 부착능력 재획득을 유도하는 인자를 발굴하고, 이들의 발현 조절을 통하여 전이암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 조기에 발견할 경우 환자의 생존율을 현저히 개선시킬 수 있는 전이암에 대한 유효한 바이오마커를 제공함으로써, 원발암이 전이암으로 진행될 가능성을 높은 신뢰도로 예측할 수 있는 방법을 제공함과 동시에, 궁극적으로는 순환종양세포의 콜로니화를 차단하거나, 원발성 암조직으로부터의 순환종양세포 생성을 현저하게 차단함으로써, 전이암의 진행을 각 단계별로 다각적으로 차단하는 효율적인 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 전이 위암환자 15명에서 원발조직과 전이조직에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자들의 발현량을 분석하기 위한 실험의 진행과정을 요약한 모식도이다.
도 1b는 전이 위암환자 15명에서 얻은 RNA 시퀀싱 데이터를 볼케이노 플롯으로 나타낸 그림이다.
도 2a는 위암 환자 18명의 정상 위조직과 위암세포 조직에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 유전자들의 발현량을 분석하기 위한 실험의 진행과정을 요약한 모식도이다.
도 2b는 위암환자 18명에서 얻은 RNA 시퀀싱 데이터를 볼케이노 플롯으로 나타낸 그림이다.
도 3a은 TCGA 데이터를 이용하여 EPAS1의 발현량 증가에 따라 환자군의 생존율이 떨어짐을 나타낸 그래프이다.
도 3b은 TCGA 데이터를 이용하여 TEAD1의 발현량 증가에 따라 환자군의 생존율이 떨어짐을 나타낸 그래프이다.
도 3c은 TCGA 데이터를 이용하여 SNAI2의 발현량 증가에 따라 환자군의 생존율이 떨어짐을 나타낸 그래프이다.
도 4는 인체위암세포(AGS) 위암 세포주에서 AST 어세이(AST assay)를 통하여 EPAS1의 발현량이 부착세포에서 부유세포로 전환되는 과정에서는 억제됨을 나타낸 그래프이다.
도 5는 부착세포에서 부유세포로 전환하는 과정을 볼 수 있는 실험방법인 AST 어세이(AST assay)의 진행과정을 요약한 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 분석방법

세포주

총 6가지의 위암 세포주(AGS, KATOIII, NCI-N87, SNU-1, SNU-5, SNU-16)가사용되었으며, 모두 한국세포주 은행에서 구입하였다.

AST 어세이 (AST assay)

부착세포에서 부유세포로 전환하는 과정을 볼 수 있는 실험방법으로, 세포를 세포판(cell plate)에 50% 정도 깔아 놓고, 세포 밀도(density)가 100%가 되었을 때 배양액을 교체한 뒤, 이후에는 배양액을 교체하지 않았다. 그 후 3일째에 배양액을 걷어냄으로써 부유세포를 채집하였다.

정량 실시간 PCR (Quantitative Real Time-PCR)

세포들을 세포판에 깔아 놓고, 세포 밀도가 70% 정도가 되었을 때, RNA 추출 킷(GeneAll, Korea)을 이용하여서 RNA를 추출하였다.

추출한 RNA는 역전사 킷(TaKaRa, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR Premix(TaKaRa, Japan)을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 진행하였고, GAPDH를 기준 유전자로 사용하였으며, 결과 값들은 인체위암세포(AGS 세포)를 기준으로 하여 상대량 값으로 표현하였다.

정량 실시간 PCR에서 사용한 프라이머

정량 실시간 PCR에서 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

사람 EPAS1(정방향), ACAGGTGGAGCTAACAGGAC; EPAS1(역방향) CCGTGCACTTCATCCTCATG; 사람 TEAD1(정방향) GCAAGGTTTGAGAATGGCCG; 사람 TEAD1(역방향) CACACAGGCCATGCAGAGTA; 사람 SNAI2(정방향) CTTTTTCTTGCCCTCACTGC; 사람 SNAI2(역방향) ACAGCAGCCAGATTCCTCAT

EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 각 유전자의 염기서열은 각각 서열목록 1 및 2로서 본 명세서에 첨부되었다.

암 환자 조직 샘플

신촌 세브란스 병원 암 병원 위암환자 코호트(cohort)에서 위암 수술 후 발생한 조직을 수집하였다. 첫 번째로는 전이가 발생한 위암환자 15명에서 원발암 조직과 전이암 조직을 수집하여 RNA 시퀀싱 분석을 진행하였다. 두 번째로는 위암 수술을 진행한 위암환자 18명에서 정상 위조직과 암 조직을 떼어내어 RNA 시퀀싱 분석을 진행하였다.

RNA 시퀀싱 분석(RNA sequencing analysis)

대조군 세포(Control cell, 세포밀도 70% 상태), 부착세포(Adhesion cell, day 3일째에 세포판에 붙어있는 세포), 부유세포(Suspension cell, day 3일째에 배양액에 떠있는 세포)에서 RNA 추출 킷(GeneAll, Korea)을 이용하여서 RNA를 추출하였다.

차등발현분석(Differential expression analysis)은 R software 와 DESeq2 package를 이용하여 진행하였다.

통계적으로 유의한 DEG는 p-값 <0.05이고 유전자 발현 배수 변화 값>1 으로 정의하였다.

TCGA data 생존율 분석

해당 데이터는 The Cancer Cenome Atlas(TCGA), Cell 2018;173(2):291-304 의 데이터를 cBioportal 에서 수집하였고, 생존율 분석은 R software와 서바이벌 패키지(Survival Package)를 이용하여 분석 진행하였다.

실험결과

전이 위암 환자들에게서 EPAS1, SNAI2 및 TEAD1 발현량이 증가된다.

부유 세포는 부착 세포에 비하여 인 비트로(in-vitro)에서의 배양이 까다로운 반면, 자유로운 이동이 보다 용이하여 암세포가 원발암(primary tumor) 조직으로부터 이탈하여 혈액을 통해 원격 전이하는 과정에서 핵심적인 역할을 하는 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)가 될 수 있다. 기존에는 부착성 세포와 부유성 세포 간 상호 배타적으로 발현하는 유전자가 명확히 알려지지 않았으나, 본 발명의 발명자들은 AGS(인체 위암 세포) 위암 세포주들이 전이부위로 이동한 뒤 부유성 세포에서 다시 부착성 세포로 전환될 때 EPAS1의 발현량이 높아짐을 확인함으로써 이들 유전자가 위암의 전이 진행에 대한 마커로 활용될 수 있음과 동시에, 부유성 세포가 전이 부위로 이동한 뒤 다시 부착성 세포로 전환되어 콜로니화하는 것을 막아 전이를 억제하기 위한 타겟으로도 활용될 수 있음을 발견하였다.

먼저 암세포의 전이과정에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현량이 증가하는 것을 확인하기 위하여, 전이성 위암환자 15명의 원발조직 및 전이조직에서 해당 유전자의 발현량 값을 정량 실시간 PCR과 RNA 시퀀싱 분석(RNA sequencing analysis)을 이용하여 확인하였다. 이에 따라, 전이성 위암환자의 전이부위 조직에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현량이 상대적으로 유의하게 증가함이 확인되었다. 이러한 점은 볼케이노 플롯에 의해서도 확인되었다. (도 1a 및 도 1b)

또한, EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현량 증가가 암세포의 전이와 관련되어 있다는 것을 확인하기 위하여, 위암 환자 18명의 정상 위조직과 위암세포 조직에서 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현량을 측정하여 비교해보았다. 이에 따르면, 전이가 일어나지 않은 암 조직은 정상조직에 비해 해당 유전자의 발현량의 의미있는 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 점은 볼케이노 플롯에 의해서도 확인되었다. (도 2a 및 도 2b)

EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1 의 발현량 증가가 암세포의 전이와 관련되어 있음은 TCGA 데이터에 의한 생존율 분석을 통해서도 확인된다.

여러 가지 암종에 관한 유전변이 데이터가 통합, 축적되어 있는 TCGA 데이터에 의한 생존율 분석에 의해 EPAS1, SNAI2 또는 TEAD1의 발현량 증가가 암의 전이와 관련되어 있음을 알 수 있었다. 암이 전이되는 경우 환자의 생존율이 떨어지는데, EPAS1의 발현량이 높았던 환자군에서 생존율이 떨어짐을 확인할 수 있었고(p=0.0052, 도 3a), SNAI2의 발현량이 높았던 환자군에서도 생존율이 떨어짐을 확인할 수 있었다(p=0.021, 도 3c). 또한 TEAD1의 발현량이 높았던 환자군에서도 역시 생존율이 떨어지는 경향을 있음을 확인할 수 있었다(p=0.07, 도 3b).

EPAS1은 부유세포가 부착세포로 전환되는 과정(SAT)에 관여하는 인자들이다.

대부분의 고형암(solid tumor)은 상피세포(epithelial cell)에서 기원하는데, 이러한 고형암세포가 전이능력을 획득하는 기작에 대하여 잘 알려진 이론은 상피간엽이행(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)으로, 상피간엽이행이 일어난 암세포는 혈관까지 침투하여 이동하고 혈관을 이루는 내피 세포를 뚫고 혈액으로 들어와 순환종양세포(CTC)가 된다. 이렇듯 암세포가 원발암(primary tumor)에서 나와 혈액을 통해 전이되려면 부착세포인 원발암세포는 부유세포인 순환종양세포(CTC)로 변신(adherent-to-suspension transition, AST)하는 것이 필요하며, 또한 원발부위로부터 먼 부위로 전이가 일어난 부유세포가 암조직으로 콜로니화(colonization)가 되려면 다시 부착세포로 전환되는 과정(suspension-to-adherent transition, SAT)이 필요하다.

인체위암세포(AGS) 위암 세포주에서 AST 어세이(AST assay)를 통하여 EPAS1의 발현량을 관찰한 결과(도 4), 부착세포에서 부유세포로 전환되는 과정에서는 EPAS1의 발현이 억제됨이 관찰되었다. 이에 따라 EPAS1이 암의 전이 과정 중 부유세포로 전환된 원발암세포가 다시 부착세포로 전환되는 과정에서 발현되는 인자인 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Yonsei University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel Biomarkers for Detecting Metastasis of Caner <130> PDPB214625 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2613 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacagctg acaaggagaa gaaaaggagt agctcggaga ggaggaagga gaagtcccgg 60 gatgctgcgc ggtgccggcg gagcaaggag acggaggtgt tctatgagct ggcccatgag 120 ctgcctctgc cccacagtgt gagctcccat ctggacaagg cctccatcat gcgactggca 180 atcagcttcc tgcgaacaca caagctcctc tcctcagttt gctctgaaaa cgagtccgaa 240 gccgaagctg accagcagat ggacaacttg tacctgaaag ccttggaggg tttcattgcc 300 gtggtgaccc aagatggcga catgatcttt ctgtcagaaa acatcagcaa gttcatggga 360 cttacacagg tggagctaac aggacatagt atctttgact tcactcatcc ctgcgaccat 420 gaggagattc gtgagaacct gagtctcaaa aatggctctg gttttgggaa aaaaagcaaa 480 gacatgtcca cagagcggga cttcttcatg aggatgaagt gcacggtcac caacagaggc 540 cgtactgtca acctcaagtc agccacctgg aaggtcttgc actgcacggg ccaggtgaaa 600 gtctacaaca actgccctcc tcacaatagt ctgtgtggct acaaggagcc cctgctgtcc 660 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cacacattac cttgtgtttg caagatctgc ggcaaggcgt tttccagacc ctggttgctt 600 caaggacaca ttagaactca cacgggggag aagccttttt cttgccctca ctgcaacaga 660 gcatttgcag acaggtcaaa tctgagggct catctgcaga cccattctga tgtaaagaaa 720 taccagtgca aaaactgctc caaaaccttc tccagaatgt ctctcctgca caaacatgag 780 gaatctggct gctgtgtagc acactga 807 <210> 3 <211> 1281 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 attgagccca gcagctggag cggcagtgag agccctgccg aaaacatgga aaggatgagt 60 gactctgcag ataagccaat tgacaatgat gcagaagggg tctggagccc cgacatcgag 120 caaagctttc aggaggccct ggctatctat ccaccatgtg ggaggaggaa aatcatctta 180 tcagacgaag gcaaaatgta tggtaggaat gaattgatag ccagatacat caaactcagg 240 acaggcaaga cgaggaccag aaaacaggtg tctagtcaca ttcaggttct tgccagaagg 300 aaatctcgtg attttcattc caagctaaag gatcagactg caaaggataa ggccctgcag 360 cacatggcgg ccatgtcctc agcccagatc gtctcggcca ctgccattca taacaagctg 420 gggctgcctg ggattccacg cccgaccttc ccaggggcgc cggggttctg gccgggaatg 480 attcaaacag ggcagccagg atcctcacaa gacgtcaagc cttttgtgca gcaggcctac 540 cccatccagc cagcggtcac agcccccatt ccagggtttg agcctgcatc ggccccagct 600 ccctcagtcc ctgcctggca aggtcgctcc attggcacaa ccaagcttcg cctggtggaa 660 ttttcagctt ttctcgagca gcagcgagac ccagactcgt acaacaaaca cctcttcgtg 720 cacattgggc atgccaacca ttcttacagt gacccattgc ttgaatcagt ggacattcgt 780 cagatttatg acaaatttcc tgaaaagaaa ggtggcttaa aggaactgtt tggaaagggc 840 cctcaaaatg ccttcttcct cgtaaaattc tgggctgatt taaactgcaa tattcaagat 900 gatgctgggg ctttttatgg tgtaaccagt cagtacgaga gttctgaaaa tatgacagtc 960 acctgttcca ccaaagtttg ctcctttggg aagcaagtag tagaaaaagt agagacggag 1020 tatgcaaggt ttgagaatgg ccgatttgta taccgaataa accgctcccc aatgtgtgaa 1080 tatatgatca acttcatcca caagctcaaa cacttaccag agaaatatat gatgaacagt 1140 gttttggaaa acttcacaat tttattggtg gtaacaaaca gggatacaca agaaactcta 1200 ctctgcatgg cctgtgtgtt tgaagtttca aatagtgaac acggagcaca acatcatatt 1260 tacaggcttg taaaggactg a 1281 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human EPAS1 F primer <400> 4 acaggtggag ctaacaggac 20 <210> 5 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Claims

EPAS1(Endothelial PAS Domain Protein 1), SNAI2(Snail Family Transcription Repressor 2) 및 TEAD1(TEA Domain Transcription Factor 1)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 전이암(Metastatic cancer)의 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계의 암이고, 상기 발현량이 증가한 경우, 순환종양세포의 콜로니화가 증가함으로써 암 전이의 위험이 증가한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계의 암이고, 상기 발현량이 감소한 경우, 순환종양세포가 생성됨으로써 암 전이의 위험이 증가한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 조성물.
개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이암(Metastatic cancer)의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계의 암인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 조성물.
EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 활성화제를 유효성분으로 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 전이암은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계의 암인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료용 조성물.
제 8 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 전이암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) EPAS1, SNAI2 및 TEAD1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질, 이들을 인코딩하는 유전자 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계,
상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 활성 또는 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환된 이후 단계에서의 전이암의 예방 또는 치료용 조성물 조성물로 판정하며,
상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 활성 또는 발현량이 증가하는 경우, 상기 시험물질은 원발암세포가 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)로 전환되기 전 단계에서 전이암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
제 13 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 암조직 또는 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.