ES2241402A1 - Metodo para el screening in vitro de agentes antitumorales basados en la regulacion de la expresion del gen slug. - Google Patents
Metodo para el screening in vitro de agentes antitumorales basados en la regulacion de la expresion del gen slug.Info
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Abstract
El método para el screening in vitro de agentes antitumorales se basa en la regulación de la expresión del gen Slug y comprende (i) desarrollar un sistema celular que, en determinadas condiciones, expresa el gen Slug, (ii) poner en contacto dicho sistema celular con el compuesto a ensayar, y (iii) evaluar la expresión del gen Slug, de manera que si no se expresa el gen Slug el compuesto ensayado es un agente antitumoral potencial.
Description
Método para el screening in vitro de
agentes antitumorales basado en la regulación de la expresión del
gen Slug.
La invención se refiere al empleo del gen
Slug para detectar la presencia de células cancerosas en una
muestra biológica basado en la expresión aberrante de dicho gen
Slug, o de sus productos de transcripción o expresión. La
invención también se refiere al empleo del gen Slug, o de sus
productos de transcripción o expresión (ARN o proteína), en el
tratamiento del cáncer.
Los recientes avances en el tratamiento del
cáncer han puesto de manifiesto que para planificar un tratamiento
adecuado del cáncer y determinar un pronóstico preciso es necesario
disponer de métodos sensibles para detectar la existencia de
cáncer, el tipo de cáncer y el estadio del mismo con el fin de
conocer su localización concreta y su posible extensión a otros
tejidos. Un diagnóstico preciso del cáncer puede contribuir a
reducir el número de fallecimientos por esta causa y a mejorar la
calidad de vida de los pacientes ya que permite seleccionar el
tratamiento más adecuado (quimioterapia, resección quirúrgica,
etc.) y reducir las incomodidades al paciente al definir el punto
final del tratamiento terapéutico.
Los marcadores de pronóstico proporcionan
información importante para el tratamiento y desarrollo del cáncer
en los pacientes. De hecho, para la aplicación de terapia sistémica
adyuvante en el tratamiento de algunos tipos de cánceres
primarios, la identificación de los pacientes de alto y bajo riesgo
constituye uno de los hitos principales. Se conocen diversos
marcadores de pronóstico, tanto clásicos, por ejemplo, tamaño del
tumor, estado del nódulo linfático, histopatología, estado del
receptor de esteroides, como de segunda generación, por ejemplo,
velocidad de proliferación, ploidía del ADN, oncogenes, receptores
de los factores de crecimiento y algunas glicoproteínas, que
resultan muy útiles para tomar decisiones terapéuticas (McGuire,
W.L., Pronostic Factors for Recurrence and Survival, en
"Educational Booklet American Society of Clinical Oncology",
25th Annual Meeting, 89-92 (1989); Contesso et
al., Eur. J. Clin. Oncol., 25:403-409 (1989)).
Aunque ninguno de los marcadores de pronóstico conocidos satisface
completamente el objetivo de distinguir entre pacientes de alto y
bajo riesgo, la combinación de distintos marcadores puede mejorar
la predicción del pronóstico de un paciente, por lo que continúa la
búsqueda de nuevos marcadores de pronóstico que puedan añadirse a
los existentes actualmente para colaborar en el pronóstico del
cáncer, de su progresión y de la enfermedad residual tras
tratamiento.
Por otra parte, la mayoría de los métodos usados
para la detección de células cancerosas tienen una sensibilidad muy
limitada, aunque los métodos moleculares basados en el análisis de
ácidos nucleicos han mejorado dicha sensibilidad (Burchill S.A.
& Selby P.J., J. Pathol. 190:6-14 (2000)). No
obstante, ninguna de estas estrategias permite distinguir una
célula tumoral invasiva de una célula tumoral no invasiva.
El gen Slug es un gen presente en los
vertebrados que codifica un factor de transcripción del tipo
"dedos de zinc" (SLUG) implicado en las transiciones
epiteliales-mesenquimales (Nieto et al.,
Science 264:835-849 (1994)).
La invención se enfrenta, en general, con el
problema de encontrar un marcador para la detección de células
cancerosas, tales como las células tumorales mesenquimales.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han descubierto, sorprendentemente, que
la expresión del gen Slug está relacionada con la presencia
de células cancerosas, tales como las células tumorales
mesenquimales, ya que han podido observar que dichas células
malignas expresan niveles significativamente elevados del gen
Slug y/o de sus productos de transcripción o expresión cuando
se comparan con células normales. Diversos ensayos realizados por
los inventores han puesto de manifiesto que el producto del gen
SLUG se expresa en células de muestras de tejidos que presentan
células tumorales mesenquimales pero no se expresa, o lo hace a
niveles prácticamente inapreciables, en muestras de tejidos
normales. En una realización particular, los inventores han
observado que el gen Slug regula la capacidad diseminativa de las
células leucémicas con BCR-ABL, lo que indica
que dicho gen Slug juega un papel en la invasión tumoral.
Entre las posibles aplicaciones derivadas del
descubrimiento arriba mencionado se incluyen la posibilidad de
utilizar el gen Slug, o sus productos de transcripción o
expresión, para detectar la invasividad tumoral y/o como diana
terapéutica en el tratamiento del cáncer.
Por tanto, un objeto de esta invención lo
constituye un método para detectar la presencia de células
cancerosas en una muestra de ensayo basado en la evaluación de la
expresión del gen Slug o de sus productos de transcripción o
expresión (ARN o proteína).
Un objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo del gen Slug o de sus productos de
transcripción o expresión, como diana terapéutica para el
tratamiento del cáncer.
La Figura 1 ilustra la regulación positiva del
gen Slug por BCR-ABL. La Figura 1A muestra
el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total
aislado a partir de células Ba/F3 (banda 1), Ba/F3+p190 (banda 2) y
Ba/F3+p210 (banda 3). Se realizaron experimentos de control en
células Ba/F3 transfectadas con un vector vacío. La membrana de
nylon se hibridó con un fragmento de ADNc de SLUG y después se
purificó y rehibridó con una sonda de
\beta-actina. La Figura 1B muestra el resultado
del análisis de transferencia de Northern del ARN total aislado a
partir de células Ba/F3+Combip190 desarrolladas en ausencia (banda
1) o presencia de tetraciclina (banda 2), Ba/F3+p190 (banda 2) y
células Ba/F3 de control (banda 3). La mancha de transferencia se
hibridó con fragmentos de ADNc de SLUG, Bcl-2 y
myc, y después se purificó y rehibridó con una sonda de
\beta-actina.
La Figura 2 muestra la expresión de ARNm de SLUG
en tejidos de ratón normal. La Figura 2A muestra el resultado del
análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir
de diversos tejidos de ratón [pulmón, SP (sangre periférica),
corazón, testículo, cerebro, intestino, riñón, músculo, hígado,
bazo, timo y MO (médula ósea)], hibridado con una sonda de ADNc de
Slug y después purificado y rehibridado con una sonda de
\beta-actina. Se indica la movilidad de los ARN
28S y 18S. (SP, sangre periférica; MO, médula ósea). La Figura 2B
ilustra la expresión del ARNm de SLUG en ratones transgénicos
BCR-ABLP^{190} y BCR-ABLP^{210}
y recoge los resultados del análisis de transferencia de Northern
del ARN total aislado a partir de sangre periférica de ratones de
control (banda 1), y de ratones transgénicos
BCR-ABLP^{190} (bandas 2 a 4) y
BCR-ABLP^{210} (bandas 5 a 6), hibridado con una
sonda de ADNc y después purificado y rehibridado con una sonda de
\beta-actina. Se indica la movilidad de los ARN
28S y 18S.
La Figura 3 ilustra que el SLUG endógeno está
presente en líneas de células invasivas humanas. Cada ARN se
transcribió mediante retrotranscripción (RT) y los productos de PCR
se transfirieron a una membrana de nylon y se analizaron por
hibridación con sondas oligonucleotídicas internas marcadas
terminalmente específicas para cada gen. Se evaluaron los ARN para
la línea de células hematopoyéticas no leucémicas 707 (banda 1),
para la línea de células leucémicas mieloides U937 (banda 2), para
las líneas leucémicas de células T ALL-SIL (banda 3)
y KOPTI-KI (banda 4), para la línea de células
leucémicas pre-B 697 (banda 5), para muestras de
pacientes con t(9;22) (bandas 6 a 8) y para las líneas de
células leucémicas humanas positivas para t(9;22) K562
(banda 9), TOM-1 (banda 190) y
Nalm-1 (banda 11).
La Figura 4 ilustra el efecto del gen Slug
sobre la supervivencia de células Ba/F3 en ausencia de factor de
crecimiento. La Figura 4A muestra el resultado del análisis de
transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de células
Ba/F3 transfectadas con ADNc de SLUG de ratón (banda 1) y células
Ba/F3 de control (banda 2). La membrana de nylon se hibridó con un
fragmento de ADNc de SLUG y después se purificó y rehibridó con una
sonda de \beta-actina. La Figura 4B es una gráfica
que ilustra la supervivencia de células Ba/F3 que expresan la
proteína SLUG en ausencia de IL-3. Las células que
crecían exponencialmente en medio suplementado con
IL-3 se ajustaron a 5 x 10^{5} células/ml en el
día 0 y se cultivaron después de la eliminación de
IL-3. Se muestra el número de células viables para
las células Ba/F3 transfectadas con BCR-ABL y con
SLUG en ausencia de IL-3. La Figura 4C ilustra que
la muerte celular va acompañada por aparición de la escalera de ADN
por rotura inter-nucleosomal después de la
deprivación de IL-3. Se aisló ADN de bajo peso
molecular 24 horas después de la deprivación de IL-3
a partir de células Ba/F3+Slug (banda 1), Ba/F3+p210 (banda 2),
Ba/F3+p190 (banda 3) y a partir de células Ba/F3 de control (banda
4). El ADN se marcó terminalmente, se resolvió por electroforesis
en un gel de agarosa al 2% y se visualizó por autorradiografía.
La Figura 5 ilustra la represión del ARNm de SLUG
en células Ba/F3 que expresan BCR-ABL con un ADNc
anti-sentido frente a SLUG. La Figura 5A muestra
los resultados del aislamiento del ARN total a partir de células
Ba/F3+p210 (banda 1) y Ba/F3+p190 (banda 2) transfectadas con un
vector que expresaba el gen Slugh (gen Slug de ratón) sin sentido.
El ARN celular se hibridó con una sonda de ADNc de Slugh de ratón.
El filtro se desnudó y se rehibridó con ABL y
\beta-actina. La Figura 5B muestra los resultados
del análisis de hibridación: de filtro de Northern de células Ba/F3
que expresaban BCR-ABL transfectadas (banda 1,
Ba/F3+p210+Aslug; banda 3, Ba/F3+p190+Aslug) y no transfectadas
(bandas 2, Ba/F3+p210; banda 4, Ba/F3+p190). Como sonda, se usó un
oligonucleótido de Slugh sin sentido que comprende las
primeras 49 bases de la secuencia codificante del ADNc de Slugh de
ratón. La Figura 5C ilustra que la diferenciación linfoide y
mieloide específica de células B inducida en células Ba/F3 por
oncogenes BCR-ABLP^{190} y
BCR-ABLP^{210}, respectivamente, no se ve
influenciada por la supresión de Slug. En dicha Figura 5C se
muestran los perfiles de expresión de células Ba/F3+p190 (panel
izquierdo superior) Ba/F3+p190+Slug sin sentido (panel derecho
superior), Ba/F3+p210 (panel izquierdo inferior) y Ba/F3+p210+Slug
sin sentido (panel derecho inferior). Las células se tiñeron con
anticuerpos monoclonales B220 (marcador específico de células B) y
Gr-1 (marcador específico de mieloides) y se
analizaron por citometría de flujo.
La Figura 6 recoge los requerimientos de
Slug en la tumorigenicidad de células Ba/F3 que expresan
BCR-ABL. Las células Ba/F3 iniciales que expresaban
oncogenes BCR-ABL crecieron como tumores en ratones
desnudos (REF). Análogamente, se descubrió que la formación de
tumores se observaba ya a los cinco días después de la inyección de
las líneas de células que expresaban BCR-ABL. A
diferencia de estos controles, las células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL y Slug sin sentido son mucho menos
tumorigénicas. Los tumores se escindieron para realizar un análisis
macroscópico en el día 20 después de la inyección celular. En
promedio, el peso de los tumores encontrados en los ratones a los
que se inyectaron células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL era dos veces mayor que el de los tumores
inducidos por células que expresaban BCR-ABL y la
construcción Slug sin sentido.
La Figura 7 ilustra el efecto de Slug en
el desarrollo de tumores por células BCR-ABL. La
Figura 7A muestra el resultado de un análisis macroscópico de
tumores inducidos por células Ba/F3+p190, mientras que las Figuras
7B y 7C muestran el aspecto histológico de los tumores inducidos en
ratones desnudos. La sección teñida con
hematoxilina-eosina del tumor de ratón desarrollado
después de la inyección de células Ba/F3+p190 (Figura 7B) en
comparación con la sección del tumor del ratón desarrollado después
de la inyección de células Ba/F3+p190 en las que se había suprimido
específicamente la expresión de Slug (Figura 7C). Las
células Ba/F3+p190 que expresan Slugh desobedecen el orden
social de límites de órganos y migran como células individuales
produciendo metástasis en diferentes regiones. Se observaron
resultados similares en secciones múltiples de los dos tumores. Las
imágenes de las Figuras 7B y 7C están ampliadas a 40 aumentos.
La Figura 8 es una representación que ilustra el
modelo del papel de Slug en el desarrollo del cáncer. En la
Figura 8A se muestra que en el sistema hematopoyético, las células
progenitoras normales, no comprometidas, con capacidad de
auto-renovación se diferencian en células maduras.
Durante esta transición, la expresión de Slug está regulada
negativamente. Estas células progenitoras normales no comprometidas
son responsables de señales del medio que regulan el número de
células maduras producidas y limitan la auto renovación de las
células inmaduras. Cuando en situaciones fisiológicas estas células
progenitoras normales no comprometidas migran, el gen Slug
podría promover la supervivencia permitiéndolas realizar su
función. Si esto no se consigue en un periodo de tiempo específico,
sufrirían apoptosis, ya que se han visto privadas de las señales
externas necesarias. En la Figura 8B se ilustra la situación en
caso de leucemogénesis; en este caso, la célula diana en la que
existe la anormalidad cromosómica es un progenitor no comprometido
(Cobaleda et al., Blood 95:1007-1113 (2000);
Sánchez-García et al., Current Genomics,
1:71-80 (2000)). Como resultado de ésto, se bloquea
la diferenciación de la célula diana, pero la inhibición la
diferenciación r ) es suficiente para la transformación, porque la
supervivencia y la proliferación de las células diana se
restringiría a un microentorno particular. Así pues, tienen que
existir otros cambios genéticos que permitan el crecimiento de las
células fuera de su entorno normal, además de mutaciones que
bloqueen la diferenciación. Los oncogenes de fusión creados como
resultado de anormalidades cromosómicas asociadas con tumores
mesenquimales (tanto leucemias como tumores sólidos) bloquean la
diferenciación y tienen la capacidad de activar genes diana tales
como Slug que promueven la supervivencia (con independencia
de las señales externas requeridas) y la migración de las células
diana defectuosas en diferentes entornos. Estos datos refuerzan la
idea de que la transformación puede producirse como resultado de la
creación/activación de un solo oncogen.
La invención se refiere, en general, al empleo
del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión
(ARN o proteína) en la detección y/o tratamiento de células
cancerosas. El gen Slug codifica un factor de transcripción
del tipo "dedos de zinc" (SLUG) implicado en las transiciones
epiteliales-mesenquimales. Ahora se ha descubierto
que células cancerosas, en particular, células tumorales
mesenquimales, expresan niveles significativamente elevados del gen
Slug y/o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o
proteína), cuando se comparan con células normales, lo que permite
establecer un método para la detección de dichas células malignas
basadas en la expresión aberrante del gen Slug o de sus
productos de transcripción o expresión (ARN o proteína).
En un primer aspecto, la invención proporciona un
método para la detección de células cancerosas en una muestra de
ensayo, basado en la evaluación de la expresión aberrante del gen
Slug o de sus productos de transcripción o expresión ARr o
proteína), en comparación con la expresión de dicho gen o de sus
productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en una
muestra de control. Este método puede ser aplicado a cualquier
vertebrado sospechoso de tener dichas células, en particular, a un
mamífero, por ejemplo, un ser humano.
El método proporcionado por esta invención es
adecuado para la detección de células cancerosas que expresen dicho
gen Slug o sus productos de transcripción o expresión (ARN o
proteína), tales como células tumorales mesenquimales, por ejemplo,
leucemias y sarcomas, y, por tanto, tiene utilidad en el
diagnóstico de la enfermedad causada por dichas células, así como
en la evaluación de su progresión y en la determinación de
enfermedad residual tras tratamiento, aspectos esenciales en el
tratamiento de dicha enfermedad.
En el sentido utilizado en esta descripción el
término "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica
de un vertebrado sospechoso de tener células tumorales
mesenquimales o cancerosas.
El término "muestra de control", tal como
aquí se utiliza incluye (i) muestras biológicas de vertebrados que
no tienen células tumorales mesenquimales o cancerosas, y (ii)
muestras biológicas de vertebrados que tienen células tumorales
mesenquimales o cancerosas con el fin de obtener información
relativa al pronóstico de la enfermedad entre vertebrados que
contienen dichas células.
Por "expresión aberrante" tal como se
utiliza en esta descripción debe entenderse, en general, la
expresión alterada de un gen o de sus productos de transcripción o
expresión (ARN o proteína) en células procedentes de un tejido
tumorigénico respecto a la expresión de dicho gen o de sus
productos de transcripción o expresión (ARN o proteína) en células
normales del mismo tejido no tumorigénico. La expresión aberrante
de un gen incluye la amplificación del gen, la sobreexpresión del
gen y la expresión del gen en células que normalmente no lo
expresan.
La invención proporciona un método para detectar
la presencia de células cancerosas en una muestra de ensayo, basado
en la expresión aberrante del gen Slug, que comprende:
- 1)
- obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
- 2)
- evaluar la expresión del gen Slug en las células contenidas en dicha muestra de ensayo; y
- 3)
- comparar la expresión del gen Slug en las células de la muestra de ensayo con la expresión del gen Slug en la células de una muestra de control;
en donde la presencia de una
expresión aberrante del gen Slug en las células de la
muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión del gen
Slug en las células de la muestra de control, es indicativa
de la presencia de células cancerosas en dicha muestra de
ensayo.
En una realización particular, el método para la
detección de células cancerosas basado en la expresión aberrante
del gen Slug proporcionado por esta invención se aplica a un
ser humano sospechoso de tener dichas células. La secuencia de ADNc
del gen Slug humano así como la secuencia de aminoácidos deducida a
partir del ADNc han sido descritos por Nieto y col. (Nieto et
al., 1994, citado supra).
En una realización particular, las células
cancerosas a detectar son células tumorales mesenquimales, por
ejemplo, leucemias o sarcomas.
La muestra de ensayo se obtiene a partir de una
muestra biológica del vertebrado a ensayar. Dicha muestra biológica
puede ser obtenida por cualquier método convencional, por ejemplo,
mediante biopsia de tejido o extracción de sangre.
La expresión aberrante del gen Slug en
células tumorales mesenquimales o cancerosas incluye la
amplificación del gen Slug, la sobreexpresión de dicho gen y
la expresión del mismo en células que normalmente no lo expresan.
Actualmente se admite que la amplificación del ADN juega un papel
crucial en la progresión de los tumores permitiendo que las células
cancerosas regulen numerosos genes. Por otra parte, la frecuencia
de la amplificación del ADN así como el incremento del número de
copias durante la progresión de diversos cánceres, generalmente en
pacientes que no responden al tratamiento, sugiere que la
sobreexpresión de los genes diana amplificados confiere una ventaja
selectiva a las células malignas.
La expresión del gen Slug puede ser
evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo,
determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug
(ARNm de SLUG), o bien determinando el número de copias de gen
Slug producidas.
En el sentido utilizado en esta descripción,
"determinar el nivel de ARNm de SLUG" incluye cualquier método
que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el
nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína SLUG en las
células de una muestra de ensayo bien directamente o bien
relativamente comparándolo con el nivel de ARNm de SLUG en las
células de una muestra de control. Asímismo, "determinar el
número de copias de gen Slug producidas" incluye
cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o
cuantitativamente el número de copias producidas del gen
Slug en células de una muestra de ensayo bien directamente o
bien relativamente comparándolo con el número de copias del gen
Slug producidas en células de una muestra de control. En una
realización particular, el nivel de ARNm de SLUG o el número de
copias del gen Slug producidas en las células de la muestra
de ensayo se mide o estima y se compara con el nivel de ARNm de
SLUG o con el número de copias del gen Slug producidas en
las células de la muestra de control.
En una realización particular, la muestra de
control puede ser una muestra biológica de un vertebrado que no
tiene células cancerosas, por ejemplo, células tumorales
mesenquimales. En este caso, una vez que se conoce el nivel de ARNm
de SLUG o el número de copias del gen Slug en la muestra de
control, la información resultante se puede utilizar repetidamente
como patrón a efectos comparativos. Alternativamente, la muestra de
control puede ser una muestra biológica de un vertebrado que tiene
células cancerosas, por ejemplo, células tumorales mesenquimales,
con lo que, en este caso, el nivel de ARNm de SLUG o el número de
copias del gen Slug proporcionará información relativa al
pronóstico de la enfermedad entre vertebrados que contienen dichas
células.
La determinación del número de copias del gen
Slug puede realizarse por cualquier método convencional
apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles
extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin)] o
regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated
homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al.,
Breast Cancer Res. Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al.,
Cancer Genet. Cytogenet. 49:203 (1990)), mediante técnicas de
hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos
convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen
Slug, etc.
Asimismo, el nivel de ARNm de SLUG puede
determinarse por cualquier método convencional apropiado, por
ejemplo, mediante análisis Northern blot (Harada et al.,
Cell 63:303-312 (1990)), mapeo con la nucleasa S1
(Fujita et al., Cell 49:357-367 (1987)),
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (patentes norteamericanas
US 4.683.195, US 4.683.202, US 4.965.188), retrotranscripción en
combinación con la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) (Makino et al., Technique
2:295-301 (1990)), técnicas de hibridación,
microarrays (Wooster R., Trends in Genetics
16:327-329 (2000)], etc. En una realización
particular, la expresión del ARNm de Slug se ha evaluado
mediante un análisis Northern blot y RT-PCR [véase
el apartado Materiales y Métodos].
De acuerdo con la invención, la presencia de una
expresión aberrante del gen Slug en la muestra de ensayo,
cuando se compara con la expresión del gen Slug en la
muestra de control, es indicativa de la presencia de células
tumorales mesenquimales o cancerosas en dicha muestra de
ensayo.
La invención también proporciona un método para
detectar la presencia de células cancerosas en una muestra de
ensayo, basado en la expresión del producto de expresión del gen
Slug (proteína SLUG), que comprende:
- a)
- obtener una muestra biológica de un vertebrado sospechoso de tener células cancerosas, con lo que se obtiene una muestra de ensayo;
- b)
- evaluar la expresión de la proteína SLUG en células de dicha muestra de ensayo; y
- c)
- comparar la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo con la expresión de la proteína SLUG en las células de una muestra de control;
en donde la presencia de una
expresión aberrante de la proteína SLUG en las células de la
muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión de la
proteína SLUG en las células de la muestra de control, es
indicativa de la presencia de células cancerosas en dicha muestra
de
ensayo.
En una realización particular, las células
cancerosas a detectar son células tumorales mesenquimales, por
ejemplo, leucemias o sarcomas.
Al igual que en la alternativa precedente [1.A],
la muestra de ensayo se obtiene a partir de una muestra biológica
del vertebrado a ensayar, por ejemplo, un ser humano, mediante
cualquier método convencional, por ejemplo, mediante biopsia de
tejido o extracción de sangre.
La expresión de la proteína SLUG puede ser
evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo,
mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas
basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometría de
flujo, proteómica, etc.
A modo de ejemplo, la expresión de la proteína
SLUG en tejidos puede ser estudiada empleando los métodos
inmuno-histológicos clásicos, en los que el
reconocimiento específico es proporcionado por un anticuerpo
anti-SLUG mientras que el sistema de detección
puede utilizar unos anticuerpos secundarios marcados con marcadores
apropiados. La expresión de la proteína SLUG en tejidos también
puede estudiarse mediante un ensayo Western blot o dot/slot
(Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985
(1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol.
105:3087-3096 (1987)), mediante inmunoensayos, tales
como ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o RIA
(radioinmunoensayo).
Adicionalmente, la expresión de la proteína SLUG
puede ser detectada in vivo mediante técnicas de diagnóstico
por imagen mediante el empleo de anticuerpos
anti-SLUG unidos a marcadores apropiados, por
ejemplo, marcadores detectables por rayos X, resonancia magnética
nuclear (RMN), etc. Una revisión del diagnóstico por imagen de
tumores puede encontrarse en Tumor Imaging: The Radiochemical
Detection of Cancer (S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, eds., Masson
Publishing Inc. (1982)).
Los anticuerpos anti-SLUG que
pueden utilizarse en el método proporcionado por esta invención
pueden ser anticuerpos frente a la proteína SLUG intacta o frente a
un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un
portador. Los anticuerpos pueden ser policlonales o,
preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse mediante
la tecnología del hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495
(1975)).
Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de
anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')_{2}, etc.
Otros métodos para determinar la expresión de la
proteína SLUG en tejidos incluyen la citometría de flujo (Ward
M.S., Pathology 31:382-392 (1999), proteómica
(Pandey M. & Mann M., Nature 405:837-846
(2000); Chambers et al., J. Pathol.
192:280-288 (2000), etc.
De acuerdo con la invención, la expresión
aberrante de la proteína SLUG en células de la muestra de ensayo,
cuando se compara con la expresión de la proteína SLUG en células
de la muestra de control, es indicativa de la presencia de células
cancerosas en dicha muestra de ensayo.
En un segundo aspecto, la invención se refiere al
empleo del gen Slug o de sus productos de transcripción o
expresión en el tratamiento del cáncer, en particular, en el
tratamiento de patologías relacionadas con la presencia de células
cancerosas, tales como células tumorales mesenquimales, por
ejemplo, leucemias y sarcomas.
En el sentido utilizado en esta descripción,
"el empleo del gen Slug o de sus productos de
transcripción o expresión en el tratamiento del cáncer" incluye
cualquier método que permite interferir cualitativa o
cuantitativamente con el gen Slug, el nivel de ARNm que se
puede traducir en la proteína SLUG o con la propia proteína
SLUG.
En este sentido, la invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que reconoce a la proteína
SLUG, o a un fragmento de la misma, o de un compuesto que
interfiere con la función de Slug a nivel del ADN, o a nivel
del ARN o a nivel de la proteína (SLUG), opcionalmente junto con
los excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los anticuerpos anti-SLUG que
pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica
propercionado por esta invención pueden ser anticuerpos frente a la
proteína SLUG intacta o frente a un fragmento antigénico de la
misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos
pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los
cuales pueden obtenerse mediante la tecnología del hibridoma
(Kohler et al., Nature 256:495 (1975)). Alternativamente se
pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab,
F(ab')_{2}, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos
convencionales.
El compuesto que interfiere con la función de
Slug tanto a nivel de ADN como de ARN o proteína (SLUG) puede ser
cualquier compuesto, o mezcla de compuestos, que impida la
expresión del gen Slug, o que inactive el ARNm de SLUG que
se genera, por ejemplo, mediante oligonucléotidos antisentido o
ribozimas, o que inactive la proteína SLUG, por ejemplo, mediante
el empleo de anticuerpos o que compita el efecto de dicha proteína
con dominantes negativos (Choo, Y., et al. J. Mol. Biol.
273:525-532, (1997); Cobaleda, C., &
Sánchez-García, I., Blood 95:731-737
(2000)).
Los excipientes que pueden estar presentes en la
composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otras
cosas, de la forma de administración de dicha composición
farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de
administración de principios activos, de los excipientes a utilizar
y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el
Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de
Ediciones, 1993.
La invención también se refiere a un método para
el screening in vitro de agentes antitumorales basado en la
regulación de la expresión del gen Slug que comprende (i)
desarrollar un sistema celular que, en determinadas condiciones,
expresa el gen Slug, (ii) poner en contacto dicho sistema
celular con el compuesto a ensayar, y (iii) evaluar la expresión
del gen Slug, de manera que si no se expresa el gen
Slug el compuesto ensayado es un agente antitumoral
potencial.
La interferencia con la función del gen
Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su expresión,
inactivando el ARNm que se genera mediante oligonucléotidos
antisentido o ribozimas, inactivando la proteína mediante el empleo
de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha proteína con
dominantes negativos (Choo, Y., et al. J. Mol. Biol.
273:525-532, (1997); Cobaleda, C. &
Sánchez-García, I., Blood 95:731-737
(2000)).
A continuación se ilustrará la invención mediante
un ensayo realizado por los inventores que pone de manifiesto que
el gen Slug regula la capacidad diseminativa de las células
leucémicas con BCR-ABL.
Las líneas celulares usadas incluyen células
Ba/F3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)) y células Ba/F3
que expresan las proteínas humanas BCR-ABLP^{190}
(Ba/F3 + p190) y BCR-ABLP^{210} (Ba/F3 + p210)
(Sánchez-García y Grütz, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 92:5287-5291 (1995)). Las células se
mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
suplementado con un 10% de suero de ternero fetal (FCS). Cuando fue
necesario, se añadió un 10% de medio acondicionado con
WEHI-3B como fuente de IL-3
(interleucina-3).
El RDA se realizó tal como describen Hubank y
Schatz (Hubank y Schatz, Nucleic Acid Res.
22:5640-5648 (1994)). En resumen, se aislaron ARNm
de células Ba/F3, Ba/F3 + p190 y Ba/F3 + p210. Se extrajo una
muestra de 10 mg de ARNm de cada población celular para el análisis
RDA. Se sintetizaron ADNc a partir de los ARNm y se digirieron con
Dpn II. A los ADNc digeridos con Dpn II se añadieron adaptadores
compuestos de dos oligonucleótidos:(R-24) [SEC. ID.
N°: 1] y (R-12) [SEC. ID. N°: 2]. La mezcla
resultante se amplificó por PCR con oligonucleótidos
R-24 [SEC. ID. N°: 1] y los adaptadores se
escindieron con Dpn II. Después, se unió un segundo par de
adaptadores:(J-24) [SEC. ID. N°: 3] y
(J-12) [SEC. ID. N°: 4] a los fragmentos
amplificados procedentes de células Ba/F3 + p190 y Ba/F3 + p210
(tester) y se hibrídaron con los fragmentos de ADNc amplificados
con R-24 [SEC. ID. N°: 1] procedentes de células
Ba/F3 (inductor) con una relación de 1:100 durante 20 horas. La
mezcla de hibridación se usó como molde para la amplificación
basada en PCR.
Se realizó una segunda vuelta de sustracción
retirando los adaptadores J [SEC. ID. N°: 3 y SEC. ID. N°: 4] de
una alícuota del producto de la primera vuelta de PCR, uniendo un
tercer par de adaptadores oligonucleotídicos:
(N-24) [SEC. ID. N°: 5] y (N-12)
[SEC. ID. N°: 6] e hibridando con amplicones inductores a una
relación de 1:1000. Los productos de PCR se separaron en geles de
agarosa al 2,0% y las bandas individuales se subclonaron y
examinaron por análisis de transferencia de Northern con respecto a
la expresión diferencial.
Para analizar la expresión de SLUG en líneas de
células humanas y en muestras de sangre periférica de pacientes
positivos con respecto a Ph-1, se realizó una RT de
acuerdo con el protocolo del fabricante en una reacción de 20
\mul que contenía 50 ng de hexámeros aleatorios, 3 \mug de ARN
total y 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript II RNasa
H^{-}(GIBCO/BRL). Los parámetros de los ciclos térmicos
para las reacciones de PCR y las secuencias de los cebadores
específicos fueron las siguientes: SLUG, 30 ciclos a 94ºC durante 1
minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, cebador con
el sentido correcto [SEC. ID. N°: 7] y cebador sin sentido [SEC.
ID. N°: 8] ; c-ABL, 30 ciclos a 94ºC durante 1
minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, cebador con
el sentido correcto [SEC. ID. Nº: 9] y cebador sin sentido [SEC.
ID. N°: 10]. La amplificación del ARNm de
c-ABL sirvió como control para evaluar la
calidad de cada muestra de ARN. Las secuencias de las sondas
internas fueron las siguientes:
SLUG: SEC. ID. N°: 11, y
c-ABL: SEC. ID. N°:
12.
El ADNc de Slug de ratón se clonó por
RT-PCR usando el cebador de avance [SEC. ID. N°:
13] y el cebador inverso [SEC. ID. N°: 14] (número de acceso del
GenBank U79550).
El ARN citoplásmico total (10 \mug) se glioxiló
y fraccionó en geles con un 1,4% de agarosa en tampón
Na_{2}HPO_{4} 10 mM (pH 7,0). Después de la electroforesis, el
gel se transfirió a membranas de nylon Hybond-N
(Amersham), que se trataron con luz UV y se hibridaron con sondas
marcadas con ^{32}P. La carga se controló volviendo a tratar los
filtros con una sonda de ADNc de \beta-actina. El
oligonucleótido Slugh sin sentido usado como sonda comprende
las primeras 34 bases de la secuencia codificante del ADNc de
Slugh de ratón.
Se realizó la amplificación por PCR del ADNc de
Slug de ratón para facilitar la clonación, añadiendo enzimas de
restricción, usando cebadores que hibridaban con los extremos 5' y
3' del ADNc y amplificando una región que incluía la región
codificante entera del gen. El ADNc de Slugh de ratón se clonó
tanto en la orientación con sentido como en la orientación sin
sentido en el vector pEF-BOS (denominado
BOS-slug y BOS-antislug,
respectivamente), que contenía secuencias del promotor
EF1-\alpha seguidas de una región de poliengarce
unida a la señal de poli(A) adenilación del ADNc de
G-CSF humano, como se ha descrito (Mizushima y
Nagata, Nucleic Acid Res. 18:4322 (1990)). El vector
Combi-pl90 se obtuvo reemplazando el ADNc de la
luciferasa del plásmido Combi-tTA (Schultze et
al., Nature Biotechnology 14:499-503 (1996))
por el ADNc de BCR-ABLP^{190} La autenticidad de
las construcciones se confirmó por secuenciación del ADN.
Se transfectaron células Ba/F3 por
electroporación (960 pF, 220 V) con 20 \mug de
Combi-pl90, respectivamente, junto con 1 \mug de
vector de expresión MC1-neo. En las células (Ba/F3 +
Combip190) se analizó por transferencia de Northern la expresión
de BCR-ABL en presencia y en ausencia de
tetraciclina (20 ng/ml). Estas células fueron resistentes a la
ausencia de IL-3 cuando se desarrollaron en
presencia de tetraciclina.
Se transfectaron células Ba/F3, Ba/F3+p190 y
Ba/f3+p210 por electroporación (960 \muF, 220 V) con 20 \mug de
BOS-Slug y BOS-antislug,
respectivamente, junto con 1 \mug de vector de expresión puro
MCl. En las líneas celulares se analizó la expresión de Slug por
transferencia de Northern. Las células se seleccionaron con
respecto a la resistencia a la ausencia de IL-3 y la
viabilidad celular se determinó por exclusión con azul de
trypan.
Se aisló ADN de bajo peso molecular como se
indica a continuación. Las células se recogieron en 1,5 ml de medio
de cultivo, se microcentrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400
x g) y los sedimentos se suspendieron en 300 \mul de tampón de
proteinasa K. Después de un periodo de incubación de una noche a
55ºC, el ADN se precipitó con etanol, se suspendió en 200 \mul de
tampón TE que contenía 50 \mul/ml de RNasa A y se incubó a 37ºC
durante 2 h. El ADN se extrajo con fenol y cloroformo y se
precipitó con etanol. Se marcaron terminalmente alícuotas de ADN (2
\mug) con \alpha32-dCTP y se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa al 2%. Después de la
electroforesis, el gel se transfirió a Hybond-N
(Amersham) y se autorrad.icjrafió durante 2 h a -70ºC.
Para la tinción de citometría se usaron los
siguientes anticuerpos monoclonales anti-ratón de
Pharmingen: el marcador linfoide CD45R/B220 y el marcador mieloide
Gr-1. Se incubaron suspensiones de una sola célula
de las muestras de líneas celulares diferentes obtenidas por
técnicas rutinarias con CD32/CD16 anti-ratón
(Pharmingen) purificado para bloquear la unión mediante receptores
Fc y con una dilución adecuada de los diferentes anticuerpos a
temperatura ambiente o a 4ºC, respectivamente. Las muestras se
lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en PBS. Las células
muertas de las muestras se excluyeron por tinción con yoduro de
propidio. Las muestras y los datos se analizaron por FACScan usando
el software CellQuest (Becton Dickinson).
Para ensayar la tumorigenicidad de las diversas
líneas celulares, se inyectaron por vía subcutánea, en los dos
flancos de ratones macho (desnudos) atímicos de 2 a 4 semanas de
edad, 10^{6} células resuspendidas en 200 \mul de solución
salina tamponada con fosfato. En los animales se examinó la
formación de tumores durante dos meses.
Las muestras de tumor se fijaron en formalina al
10% durante una noche, después se procesaron, se incluyeron en
bloques de parafina, se tiñeron secciones de 6 \mum con
hematoxilina y eosina, se examinaron histológicamente y se
fotografiaron. Todas las secciones se tomaron a partir de porciones
homogéneas y viables de los tumores sometidos a resección.
La caracterización molecular de ciertas
anormalidades cromosómicas asociadas con el cáncer humano ha
revelado que la consecuencia principal son proteínas de fusión
específicas de tumores. Una idea común que surge es que la creación
de estas proteínas altera el desarrollo normal de las células diana
específicas de tumores bloqueando la apoptosis (Cobaleda et
al., BioEssays 20:922 (1998), pero los aspectos más
amenazadores para la vida del proceso oncogénico son la invasión y
la metástasis. Aunque se ha apreciado correctamente el significado
clínico de tal expresión del fenotipo maligno, los avances en la
comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la invasión
han retrasado otros trabajos de desarrollo en el campo del cáncer.
Así pues, una primera etapa crítica para comprender la
transformación maligna mediada por los productos de las
anormalidades cromosómicas asociadas con la leucemia es la
identificación de los genes respondedores corriente abajo a los que
se dirigen estas proteínas. Se están utilizando como modelo de
estudio los oncogenes BCR-ABL y se ha sacado
partido de un sistema celular que usa una línea de células Ba/F3
precursoras hematopoyéticas murinas transducida con vectores que
codificaban la proteína de fusión BCR-ABL
(Sánchez-García y Grütz, 1995 citado supra).
La expresión de BCR-ABL en Ba/F3 induce la
transformación celular, confiere un crecimiento independiente de
citocinas y bloquea la apoptosis (Daley y Baltimore, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:9312 (1988); Sánchez-García y
Grütz, 1995 citado supra). Para identificar dianas
potenciales de la acción de BCR-ABL, se ha elegido
el proceso sustractivo del análisis de la diferencia
representacional (RDA). Usando moléculas de ARNm procedentes de
células Ba/F3, de células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABLp190 (Ba/F3 + p190) y de células Ba/F3 que
expresaban BCR-ABLp210 (Ba/F3 + p210), se
prepararon ADNc y se sometieron a tres vueltas de hibridación
secuencial y de amplificación por PCR de acuerdo con el protocolo
de RDA de Hubank y Schatz (Hubank y Schatz, 1994 citado
supra). Varios fragmentos de ADNc amplificados
diferencialmente se subclonaron individualmente y se ensayaron con
respecto a la expresión génica diferencial por transferencia de
Northern de ARN de Ba/F3. Se identificó un fragmento de ADNc que
representaba un gen regulado de forma diferencial y se denominó
I-1. La comparación de las secuencias demostró que
el fragmento I-1 de 527 nucleótidos correspondía a
una parte de la región codificante y la región 3' no traducida de
ADNc de SLUG murino (Nieto et al, 1994, citado supra),
identificada con la utilidad de búsqueda BLAST (National Center for
Biotechnology Information).
La capacidad de los oncogenes
BCR-ABL de estimular la producción de ARNm
de SLUG se ensayó por hibridación con filtros de Northern de ARNm
de células Ba/F3, Ba/F3+p190 y Ba/F3+p210 (Figura 1A). El análisis
de transferencia de Northern mostró la expresión de SLUG en células
Ba/F3+190 y Ba/F3+p210. Este ensayo demuestra que las células
positivas con respecto a BCR-ABL expresan el ARNm
de SLUG, pero que las células de control no lo hacen. Por lo tanto,
estos datos indican una clara relación entre la activación del gen
Slug y la expresión de BCR-ABL en este
sistema.
Los datos descritos anteriormente demuestran la
expresión aberrante de SLUG en células que contienen el gen de
fusión BCR-ABL. Para determinar si se requiere
BCR-ABL para la transcripción del gen Slug,
se crearon células Ba/F3 en las que la expresión del gen
BCR-ABL podía regularse exógenamente. Se aprovechó
el sistema Combi-tTa, que tiene el transactivador y
el promotor mínimo del operador tet que dirige a la unidad de
expresión génica en un solo plásmido (Schultze et al., 1996
citado supra). La proteína represora tet fusionada al dominio
transactivador de VP16 viral se unía, en ausencia de tetraciclina,
a un promotor mínimo el operador tet obtenido por ingeniería
genética y activaba la transcripción de BCR-ABL
(Combi-p190). En presencia de la molécula efectora,
la unión se anulaba y el promotor se silenciaba (Figura 1B). En
este sentido, aunque se detectó BCR-ABLP^{190} en
Ba/F3+Combip190 sin tetraciclina, no se encontró ARNm en presencia
de tetraciclina (20 ng/ml). Estos datos indican que la inducción de
BCR-ABL puede reprimirse completamente por la
tetraciclina.
La especificidad de la activación del gen
Slug se analizó por análisis de hibridación de filtros de
Northern en células Ba/F3+Combipl90. Después de dos días en
cultivo, en presencia o en ausencia de tetraciclina, se determinó
la expresión de SLUG. Como se muestra en la Figura 1B, la expresión
de SLUG se redujo rápidamente coincidiendo con la reducción de la
expresión del ARNm de BCR-ABLp190. Además, en estas
células se analizó si la expresión de dos efectores corriente abajo
bien conocidos de los oncogenes BCR-ABL, Myc
(Sawyers et al., Cell 70:901-910 (1992)) y
Bcl-2 (Sánchez-García y Grütz, 1995
citado supra; Sánchez-García y
Martín-Zanca, J. Mol. Biol. 267:225 (1997)) era
dependiente de la presencia de BCR-ABL. Como se
muestra en la Fig 1B, aunque se detectaba la expresión tanto de
Bcl2 como de Myc en Ba/F3+Combipl90 sin tetraciclina, no se pudo
encontrar ningún ARNm en presencia de tetraciclina (Figura 1B).
Esta observación confirma que los cambios observados en la
expresión génica se estimulaban por NCR-ABL.
El descubrimiento de que BCR-ABL
regula positivamente la expresión de Slug en células Ba/F3,
motivó que los inventores ensayaran si los niveles de expresión de
Slug también se regulan positivamente como consecuencia de
la expresión de BCR-ABL en células madre primarias,
la diana natural de la proteína de fusión BCR-ABL
oncogénica (Cobaleda et al., 2000;
Sánchez-García, 2000, citados supra). Los
análisis de transf.eren la de Northern de un espectro de tejidos de
ratón indicaron que, con raras excepciones, SLUG se expresa
ampliamente en tejidos de ratón (Figura 2A). Sin embargo, SLUG no
se expresaba por los leucocitos de sangre periférica (Figura 2A).
Sabiendo que SLUG no se expresaba en la sangre periférica de
ratones normales, se ensayaron los efectos posibles de la expresión
de BCR-ABL sobre los niveles de ARNm de SLUG en la
sangre periférica de los ratones BCR-ABL
transgénicos con leucemia (Castellanos et al., Blood 90:2168
(1997)). Se examinaron células madre de ratón que expresaban
BCR-ABL por hibridación con filtros de Northern
(Figura 2B). Cada banda de ARN se evaluó con respecto a la
integridad y la carga por hibridación con una sonda de
\beta-actina (Figura 2B, sección inferior). De
acuerdo con los resultados observados en las células Ba/F3, las
células inmaduras con BCR-ABL producían un aumento
de la expresión de SLUG. Después se ensayó si la expresión de SLUG
también está presente en células inmaduras de pacientes de
leucemias humanas positivas para Ph1. Se demostró que el producto
de expresión del gen Slug estaba ausente en las células
procedentes de muestras humanas normales (Figura 3, banda 1). Por
el contrario, la expresión de SLUG estaba presente en células de
pacientes con el cromosoma Philadelphia (Figura 3, bandas
6-8). Las líneas celulares K562,
Nalm-1 y TOM-1, positivas para
t(9;22), proceden de pacientes con LMC y de pacientes LLA
positivos para Ph1. Por lo tanto, se compararon estas líneas
celulares con una línea celular humana no leucémica con respecto a
la expresión de SLUG. El examen de los ARNm para la expresión de
SLUG por PCR de transcriptasa inversa reveló que Slug está
presente en todas estas líneas de células positivas para Ph1
(Figura 3, bandas 9-11). El descubrimiento de que
la expresión de SLUG está presente en las células después de la
expresión del BCR-ABL de transformación, junto con
el descubrimiento de que el gen Slug está presente en líneas
celulares y en células de médula ósea aisladas de pacientes con
leucemias positivas para BCR-ABL, sugiere que la
presencia del gen Slug puede ser un componente en la invasión
de leucemias positivas para BCR-ABL.
Como SLUG es un miembro de la familia Snail de
proteínas implicadas en la formación del mesodermo (Nieto et
al., 1994 citado supra) y su expresión es bastante
promiscua (Figura 2), posteriormente se analizó la expresión del
gen Slug en otros tumores mesenquimales. En la Figura 3 se
muestran ejemplos de ARN de otras cuatro líneas celulares de
leucemia que carecen de t(9;22), incluyendo el linaje B
temprano 697 (Figura 3, banda 5), el mieloide U937 (Figura 3, banda
2) y las líneas de células T ALL-SIL (Figura 3,
banda 3) y KOPTI-KI (Figura 2, banda 4). Como se
muestra en la Figura 3, en todas las líneas de células leucémicas
se demostró la expresión del gen Slug. En este sentido, los
descubrimientos recientes demuestran que SLUG también se expresa en
células leucémicas t(17;19) (Inukai et al., Molecular
Cell 4:343-352 (1999)) y en células de
rabdomiosarcoma que expresan la translocación PAX3 FKHR (Khan et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13264-13269
(1999)). Así pues, estos resultados combinados indican que la
expresión de Slug no es rara en tumores mesenquimales (tanto
leucemias como sarcomas) transformados bajo los auspicios de otras
alteraciones genéticas y sugieren que el gen Slug puede ser
un componente de la biología del cáncer, no sólo de leucemias
positivas para BCR-ABL, sino también posiblemente
de otros cánceres mesenquimales.
Para comprender mejor la función de SLUG en la
biología del cáncer, también se aprovechó la línea de células Ba/F3
transducida con vectores que codificaban la proteína de fusión
BCR-ABL (Sánchez-García y Grütz,
1995, citado supra). La expresión de BCR-ABL
en Ba/F3 confiere un crecimiento independiente de citocinas y
bloquea la apoptosis (Daley y Baltimore, 1988;
Sánchez-García y Grütz, 1995, citados supra).
Así pues, los inventores se preguntaron si SLUG podía realizar
estas funciones en ausencia de la oncoproteína. Así pues, se
transfectaron células Ba/F3 con un vector que expresaba Slug
(Figura 4A) y se analizó la viabilidad celular en ausencia de
IL-3. Como se muestra en la Figura 4, las células
Ba/F3 que expresaban los oncogenes BCR-ABL
sobrevivían con poca pérdida de viabilidad y las que expresaban
Slug no sufrían apoptosis después de la eliminación de
IL-3 del medio de crecimiento (Figura 4B, 4C). Esta
observación confirma los resultados previos (Inukai et al,
1999 citado supra) e indica que Slug bloquea la
apoptosis en el sistema de células de ensayo. Así pues, su
disregulación por BCR-ABL en células Ph^{+}
probablemente contribuye a las propiedades de supervivencia celular
prolongada de las células t(9;22). El gen Slug podría
sustituir a BCR-ABL en la promoción de la
supervivencia de las células Ba/F3 murinas privadas del factor de
crecimiento, lo que sugiere que es más probable que esté implicado
en la resistencia de la muerte celular características de las
leucemias Ph^{+} y una etapa clave hacia el desarrollo de
leucemias positivas con respecto a t(9;22).
Los resultados anteriores ponen de manifiesto la
idea de que la expresión de BCR-ABL protege a las
células de la apoptosis induciendo una ruta del gen Slug. En
este caso, sería de esperar que se produjera alguna modificación
del crecimiento y la tumorigenicidad de las células Ba/F3 que
expresan BCR-ABL sobre la alteración del nivel de
la expresión de Slug. Se transfectaron células Ba/F3 que
expresaban BCR-ABL con un vector que expresaba el
ADNc de Slugh de ratón sin sentico
(BOS-antislug) y se establecieron clones (Figura
5A). Se extrajo el ARN y los niveles de ARNm de Slugh se
compararon con los presentes en las células de control no
transfectadas (Figura 5B). En las células transfectadas con
BOS-antislug se detectó Slugh sin sentido y en las
células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL transfectadas
con BOS-antislug no se vio afectado el nivel de
BCR-ABL (Figura 5A). Por otra parte, no se detectó
ARNm de SLUG en las células transfectadas con Slugh sin sentido,
aunque sí estuvo presente en células Ba/F3-p190 y
Ba/F3-p210 (Figura 5B). Las consecuencias de la
supresión de la expresión de Slugh se evaluaron examinando el
programa de diferenciación impuesto por oncogenes
BCR-ABL en células Ba/F3 y la tumorigenicidad
in vivo de las diversas líneas celulares por inyección en
ratones desnudos.
Para determinar si la expresión de Slug es
un componente crítico per se del programa de diferenciación
inducido por los oncogenes BCR-ABL, los
inventores midieron después la capacidad de diferenciar precursores
hematopoyéticos que expresaban BCR-ABL transfectados
en los que la expresión de Slug se hubiera suprimido
específicamente. Los efectos de la supresión de la expresión de
Slugh sobre la diferenciación celular en células Ba/F3 que
expresaban BCR-ABL se evaluaron analizando la
expresión de marcadores hematopoyéticos específicos en las diversas
líneas celulares. Como se muestra en la Figura 5C, las células
Ba/F3 iniciales que expresan oncogenes
BCR-ABL-p190 o
BCR-ABL-p210 se diferencian
específicamente en células mieloides y linfoides como se define por
la presencia del marcador mieloide Gr-1 o del
marcador linfoide B220, respectivamente. De forma análoga, no se
vio afectada la diferenciación de células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL en las que la expresión de Slug se había
suprimido específicamente (Figura 5C). Estos resultados demuestran
que el efecto de los oncogenes BCR-ABL en la
diferenciación no depende de la expresión de Slug.
Posteriormente, los presentes investigadores
examinaron la capacidad tumorigénica in vivo de las diversas
líneas celulares. Las células Ba/F3 iniciales que expresaban los
oncogenes BCR-ABL crecieron como tumores en ratones
desnudos (Sánchez-García y Grütz, 1995 citado
supra). Análogamente, se descubrió que se observaba
formación de tumores tan sólo cinco días después de la inyección de
las líneas de células que expresaban BCR-ABL. A
diferencia de estos controles, las células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL y Slugh sin sentido eran mucho menos
tumorigénicas (Figura 6). Los tumores se escindieron para realizar
el análisis macroscópico el día 20 después de la inyección de las
células. En promedio, el peso de los tumores encontrados en los
ratones a los que se habían inyectado células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL fue dos veces mayor que el peso de los
tumores de los ratones a los que se habían inyectado células que
expresaban BCR-ABL y la construcción de Slugh sin
sentido (Figura 6). Durante el desarrollo de los tumores invasivos
in vivo, las células tumorales desobedecen el orden social
de los límites de los órganos y entran en tejidos extraños. Así
pues, posteriormente se procedió con el examen histológico de los
tumores BCR-ABL generados en presencia o en
ausencia de Slug. En los tumores originados como resultado de
células Ba/F3 que expresaban BCR-ABL en las que se
había suprimido la expresión de Slugh, las células se acumulaban,
pero la proliferación se limitaba sistemáticamente al medio
permisivo (Figura 7). Por el contrario, en los tumores generados
como resultado de células Ba/F3 que expresaban
BCR-ABL en las que no se había modificado la
expresión de Slug se extendían los límites previos del medio
permisivo y, por consiguiente, progresaba el tumor. Como se muestra
en la Figura 7, Slug confiere claramente un comportamiento
metastático a las células BCR-ABL, permitiendo la
migración de las células tumorales como células individuales. Se
encontraron resultados similares en secciones múltiples de tumores
y para las dos formas (p190 y p210) del oncogen
BCR-ABL. Así pues, estos resultados
demuestran que el gen Slug tiene un papel fundamental en la
transición de un tumor in situ a invasivo, permitiendo la
migración de las células tumorales como células individuales.
En la leucemogénesis, las futuras células
tumorales son células madre primitivas en las que se bloquea la
diferenciación (Cobaleda et al., 2000;
Sánchez-García, 2000, citados supra), pero
la inhibición de la diferenciación no es suficiente para la
transformación porque la supervivencia y la proliferación de las
células diana se restringe a un microentorno particular. Así pues,
la transformación debe depender de cambios genéticos que permiten a
las células desarrollarse fuera de su medio normal además de
mutaciones que bloquean la diferenciación. Para validar esta
hipótesis, se intentó identificar la diana corriente abajo de los
genes BCR-ABL fusionados por
t(9;22)(q34;q11) en las células hematopoyéticas. La
identificación de los productos génicos corriente abajo que
confieren la naturaleza neoplásica son un prerrequisito para la
comprensión total del mecanismo de la leucemogénesis. En el
presente estudio se ha identificado el gen Slug como un gen
diana corriente abajo implicado en el proceso leucemogénico
inducido por el gen de fusión quimérico BCR-ABL. Los
estudios de los presentes investigadores no establecen si el
promotor de Slug es una diana directa de
BCR-ABL o si más bien este gen se implica como un
elemento de ciertas cascadas bioquímicas que responden a la
modulación por la proteína quimérica. El descubrimiento de que la
expresión de Slug está presente en las células después de la
expresión del BCR-ABL transformante, junto con el
descubrimiento de que Slug está presente en líneas celulares
y en células de médula ósea aisladas de pacientes con leucemias
positivas con respecto a BCR-ABL, indican que la
presencia de Slug tiene que ser un componente importante de
la naturaleza maligna de las leucemias positivas con respecto a
BCR-ABL. Esto sugiere la posibilidad de que
Slug pueda contribuir al bloqueo de la diferenciación o ser
responsable de la capacidad diseminativa de esta enfermedad.
Otros descubrimientos de los inventores definen
la función biológica de Slug en el contexto de la
transformación celular dependiente de oncogenes
BCR-ABL. Los datos presentados aquí
demuestran que Slug, que se activa por la expresión de
oncogenes BCR-ABL, media la prevención de la
apoptosis en el sistema Ba/F3. Además, se produce una modificación
del crecimiento y la tumorigenicidad de las células que expresan
BCR-ABL alterando el nivel de expresión de Slug. En
tumores in vivo originados como resultado de células
BCR-ABL en las que se había suprimido previamente
la expresión de Slug, las células se acumulaban, pero la
proliferación se limitaba sistemáticamente al medio permisivo. Por
el contrario, en los tumores generados como resultado de células
BCR-ABL en las que no se ha modificado previamente
la expresión de Slug, se extienden los límites previos del
medio permisivo y, por consiguiente, progresa el tumor,
desobedeciendo el orden de límites y entrando en tejidos extraños.
Así pues, Slug confiere claramente un comportamiento
metastático a las células BCR-ABL en transición de
in situ a invasivo, permitiendo la migración de las células
tumorales como células individuales.
Los descubrimientos de los inventores son
coherentes con un modelo en el que células madre que llevan la
proteína de fusión BCR-ABL expresarían
constitutivamente Slug, promoviendo tanto la supervivencia
aberrante de la célula diana tumoral con independencia de las
señales externas requeridas, que permite a la célula crecer fuera
de su medio normal, como la migración de las células diana
defectuosas en diferentes medios (Figura 8). Sin embargo, un
aumento de la expresión de Slug no puede ser el único
acontecimiento implicado en la transformación por oncogenes
BCR-ABL. La razón es la siguiente: aunque la
expresión de Slug constitutiva reemplaza a las señales de
supervivencia inducidas a través de receptores de crecimiento y
permite que las células crezcan fuera de su microentorno normal,
los resultados de los presentes investigadores demuestra que el
efecto de los oncogenes BCR-ABL en la diferenciación
depende de la expresión de Slug. Así pues, se requieren otros
componentes además de Slug para reconstituir la señal de
transformación de BCR-ABL.
Los inventores han demostrado que los oncogenes
BCR-ABL son suficientes por sí mismos para
inducir la expresión de Slug, y que Slug se requiere
para la actividad biológica de estos oncogenes en la invasión
celular. Como Slug es una proteína implicada en la formación
del mesodermo (Nieto et al., 1994 citado supra;
Savagner et al., J. Cell Biology
137:1403-1419 (1997)) y su expresión es bastante
promiscua (Figura 2), puede tener un papel más general en la
biología del cáncer que el asociado específicamente a la
transformación de BCR-ABL. Así pues, la expresión
de Slug podría servir como mecanismo de invasión celular
para proteínas de fusión encontradas en otras leucemias y proteínas
asociadas con sarcomas. De hecho, la expresión de Slug no es
rara en tumores mesenquimales (tanto leucemias como sarcomas)
transformados bajo los auspicios de otras alteraciones genéticas
(Inukai et al., 1999; Khan et al., 1999, citados
supra), lo que sugiere que Slug puede ser un
componente de la invasión tumoral no sólo de leucemias positivas
para BCR-ABL, sino también posiblemente de otros
cánceres mesenquimales. Por lo tanto, Slug parece ser un
mecanismo de invasión tumoral tanto para leucemias como para
sarcomas. En conclusión, con el presente trabajo se ha establecido
el mecanismo responsable de la capacidad de invasión por
BCR-ABL y se han presentado indicios que sugieren
que Slug podría representar un mecanismo potencialmente
amplio de invasión tumoral para tumores mesenquimales. Por lo
tanto, el propio Slug podría constituir una diana atractiva
para el tratamiento (puede considerarse un marcador de malignidad)
y la modulación terapéutica de la capacidad invasiva en el
tratamiento del cáncer humano.
La conversión leucémica de las células diana
tumorales (Cobaleda et al., 2000;
Sánchez-García, 2000, citados supra) en
células con un estado de crecimiento autónomo implica que ciertos
genes específicos tienen que activarse para desacoplar el control
de proliferación/diferenciación y generar señales intracelulares
que puedan sustituir a los requisitos de los factores de
crecimiento durante la invasión y la diseminación celular. Durante
el desarrollo de tumores invasivos, las células tumorales
desobedecen el orden social de límites de órganos y entran en
tejidos extraños. Sólo durante la transición de un tumor in
situ a un tumor invasivo, las células tumorales penetran en la
membrana basal epitelial y entran en el estroma intersticial
subyacente interaccionando con las células estromáticas. Así pues,
una definición del comportamiento de las células de tumores
metastáticos es la tendencia a cruzar límites de compartimentos
tisulares y a entremezclarse con diferentes tipos celulares. Los
inventores han demostrado que las células BCR-ABL
se comportan como células de tumores metastáticos. Se asume que el
bloqueo de la diferenciación es la consecuencia de la alteración de
las propiedades de las proteínas de fusión quiméricas
(Sánchez-García, Annu. Rev. Genetics
31:429-453 (1997)), BCR-ABL en el
presente caso. Se ha sospechado que también pueden producir
metástasis otros genes distintos de los oncogenes que se ha
demostrado que son relevantes para la tumorigénesis. Sin embargo,
los resultados demuestran claramente que la transfección de
oncogenes BCR-ABL en una célula receptora
apropiada puede inducir el fenotipo completo de tumorigenicidad e
invasión. Estos hallazgos demuestran que una proteína de fusión
impone a la célula diana un programa de diferenciación alterado y
un agente específico inductor de la invasión que se requiere para
que una célula tumoral se transforme en invasiva. El modelo de los
inventores también revela que los genes efectores de la invasión
pueden regularse independientemente de los que confieren
tumorigenicidad por el mismo gen de fusión, lo cual representa un
nuevo mecanismo de acción oncogénica. Considerando conjuntamente
estos datos, se refuerza la idea de que la transformación puede
producirse como resultado de la creación/activación de un solo
oncogen (Sánchez-García, 1997, citado
supra). Un tópico interesante para la investigación futura
será la identificación de los factores que modulan la expresión de
Slug y la posible implicación de otras oncoproteínas que
inducen su expresión.
SLUG es un miembro de la familia Snail de
factores de transcripción con "dedos de zinc" que comparten un
papel conservado desde el punto de vista evolutivo en la formación
del mesodermo en invertebrados y vertebrados (Nieto et al.,
1994, citado supra). En el pollo, Slug se expresa por
células epiteliales ectodérmicas durante su transición a células
mesenquimales. Los embriones de pollo tratados con oligonucleótidos
sin sentido dirigidos contra Slug muestran una formación del
mesodermo inapropiada relacionada con defectos en la migración
celular en compartimentos de transición de epiteliales a
mesenquimales (Nieto et al., 1994, citado supra). Así
pues, Slug induce la migración celular en la transición
epitelial-mesenquimal, en la formación del mesodermo
y en la migración de las células de la cresta neural (Fuse et
al., Genes & Development 8, 2270-2281
(1994)). Sin embargo, en ratones, la activación de las transiciones
epiteliales-mesenquimales está bajo el control de
Snail (Cano et al., Nature Cell Biology
2:76-83 (2000)), que permite la migración del
mesodermo temprano en forma de células epiteliales. Por
consiguiente, los ratones sin Slug se desarrollan
normalmente (Jiang et al., Development Biology
198:277-285 (1998)). Además, se ha demostrado que el
gen Snail activa el EMT asociado con la adquisición del fenotipo
invasivo en tumores epiteliales sólidos (Batlle et al.,
Nature Cell Biology 2:84-89 (2000); Cano et
al., 2000 citado supra), donde contribuye al primer
acontecimiento del proceso metastático. Así pues, la inducción de
EMT parece ser una función asociada específicamente al gen Snail en
el ratón (Cano et al., 2000 citado supra).
Los datos presentados aquí demuestran que
Slug es un regulador importante de la capacidad de invasión
durante la progresión de tumores mesenquimales en los que no se
requieren los EMT. Esta idea podría ampliarse al papel de
Slug en la adquisición por parte de las células madre
mesenquimales de la capacidad de migrar. En apoyo a esta teoría,
los experimentos de los inventores indican que, in vivo,
Slug no se expresa en la sangre periférica de los ratones
normales, pero está presente en la sangre periférica de ratones
transgénicos BCR-ABL con leucemia, definiendo un
fenotipo indiferenciado, pluripotente y migratorio en las células
mesenquimales. Así pues, es concebible que la presencia de
Slug se requiera en ciertas fases del desarrollo normal para
una expansión apropiada y para la supervivencia de las células
hematopoyéticas tempranas (Figura 8). Conjuntamente, los resultados
proporcionan una asociación molecular entre un regulador de las
etapas iniciales del desarrollo y la leucemogénesis, y ofrecen
pistas para comprender las alteraciones moleculares que conducen al
comportamiento invasivo de leucemias, en particular, y tumores
mesenquimales, en general.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
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<110> UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
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<120> MÉTODO PARA EL SCREENING IN
VITRO DE AGENTES ANTITUMORALES BASADO EN LA REGULACIÓN DE LA
EXPRESIÓN DEL GEN SLUG
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<160> 14
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<170> Patentln version 2.1
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<210> 1
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<211> 24
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Claims (1)
1. Un método para el screening in vitro de
agentes antitumorales basado en la regulación de la expresión del
gen Slug que comprende (i) desarrollar un sistema celular
que, en determinadas condiciones, expresa el gen Slug, (ii)
poner en contacto dicho sistema celular con el compuesto a ensayar,
y (iii) evaluar la expresión del gen Slug, de manera que si
no se expresa el gen Slug el compuesto ensayado es un agente
antitumoral potencial.
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