WO2002052043A1 - Procede de detection d'un micro-organisme pathogene - Google Patents

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Description

明 細 書 病原微生物の検出方法 技術分野
本発明は、 病原微生物の検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブ、 プライマ 一、 これらを使用する病原微生物の検出方法、 ならびに該方法のためのキットに 関する。 背景技術
病原微生物の検出方法としては、 当該微生物由来のタンパク質を免疫学的に検 出する方法あるいは当該微生物由来の遺伝子の特定の領域を核酸増幅反応により 増幅して検出する方法等が知られている。 上記遺伝子の特定の領域を検出する方 法としては、 核酸増幅反応を用いる検出法が例示される。 該核酸増幅反応として は、 米国特許第 4， 683， 195号、 第 4， 683, 202号および第 4， 8 00, 159号に記載のポリメラーゼ連鎖反応法 （PCR法） 、 トレンズ イン バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology) 第 10卷、 146〜 152頁 (1992) に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写 PC R法 (RT—PCR法） 、 1989年 6月 14日に公開された欧州特許出願第 320， 308号に記述されているリガーゼ連鎖反応 （LCR； ligase chain
reaction) 法、 PCR プロ卜コールズ (PC Protocols, Academic Press.
Inc. , 1990) 245〜 252頁に記述されている転写增幅システム （TAS ; transcription-based amplification system) 法力 ¾ げられる。
また、 等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。 例えば、 特公平 7— 1 14718号に記載の鎖置換型増幅 （SDA； strand displacement
amplification; 法、 自 ΙΔ複製 (3 SR； self-sustained sequence
replication) 法、 日本国特許番号第 2650159号に記載の核酸配列増幅
(NASBA； nucleic acid sequence based amplification) fe、 TMA (transcription-mediated amplification) 法、 曰本国特許番号第 271015 9号に記載の Q j3レプリカーゼ法、 さらに米国特許番号第 5, 8 24, 5 1 7号、 国際公開第 9 9/0 9 2 1 1号パンフレツト、 国際公開第 9 5/25 1 8 0号パ ンフレツトあるいは、 国際公開第 9 9/49 08 1号パンフレツト等に記載の 種々の改良 SD A法が挙げられる。 米国特許番号第 5, 9 1 6， 77 7号には等 温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。 さらに、 国 際公開第 00/2808 2号パンフレツトに記載の LAMP (Loop-mediated Isothermal Ampl ication)法、 国際公開第 00/5 6 8 7 7号パンフレツトに 記載の Iし AN (Isotnerraal and Chimeric primer - initiated Amplification of Nucleic acids) 法力 sある。
このように、 病原微生物の検出方法において利用できる核酸増幅法はいろいろ ある力 実際の病原微生物を検査する現場が要求する検出感度を満たすように、 それぞれの核酸増幅反応に適した標的核酸領域、 それぞれの核酸増幅方法に適し たプライマーならびにそれぞれの核酸増幅反応に続く標的核酸検出方法に適した プローブを選択することは困難であった。 さらに、 低ランニングコストで、 かつ 再現性のある結果を得ることができる病原微生物の検出方法が求められていた。 以下、 病原微生物として、 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 C型肝炎ウィルス (HCV) を例に挙げて説明する。
(a) 結核菌群
結核は、 過去において人間の死因の上位を占める疾患であり、 種々の治療法が 開発された現在においてもなお多数の患者が存在する。
結核の診断は、 従来、 培養法、 塗抹法によって行われてきた力 結核菌は発育 が遅いことから、 検査結果が得られるまで 1〜 8週間、 通常約 1ヶ月と迅速性に 欠け、 正確さも 70 %以下であるなど十分な診断法ではなかつた。 このような背 景から、 近年、 結核菌の遺伝子をターゲットとした、 喀痰などからの直接、 迅速、 正確な検出法ならびに試薬が開発されている。 上記結核菌群には、 My c o b a c t e r i um t u b e r c u i o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s B CG、 My c o b a c t e r i um a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i、 My c o b a c t e r i um c a n e t t iが含まれる。 例えば、 喀痰などの検体から DN Aを抽出し、 PCR法により結核菌の存在を 迅速に検出する方法 [ランセット （Lancet) 、 第 86ァ1号、 第 1069頁 （1989) ] が 報告されている。 該方法は結核菌の 65 kD a抗原をコードする遺伝子をターゲ ットとして P C R法により増幅し、 電気泳動法で検出する方法である。 また、 1 6 Sリポソーム RN Aを増幅し、 増幅産物を化学発光プローブで検出するキット も市販されている [ジェンープローブ （Gen - Probe) 社] 。 さらに、 16 Sリポ ソーム RNAをコードする DNAをターゲットとした PCRキットも市販されて いる （ロシュ社） 。
一方、 結核菌群に特異的な I S 61 10という遺伝子の配列が公表されており [ヌクレイック ■ァシッズ' リサーチ （Nucleic Acids Research) 、 第 18卷、 第 188頁 （1990年） ] 、 結核菌群の検出のためのプローブとして有用であろうこ とが記載されている。 実際、 PCR法による I S 6110遺伝子の検出方法が報 告されている [ジャーナル ·ォブ■クリ二カル■マイクロバイオロジー (J. Clin. Microbiol. ) 、 第 28卷、 第 2668頁 （1990) ] 。 その後、 I S 61 10遺 伝子をターゲットとした P CR法に関する論文は多数報告され、 その有用性が記 載されている。 また、 PCR法とは別の核酸増幅法である SDA法による I S 6 1 10遺伝子の検出に関する日本特許第 2814422号、 LCR法による I S 61 1 0遺伝子の検出に関する特表平 10- 500023号がある。
しかしながら、 上記の結核菌の検出方法は臨床の現場ではまだまだ満足できる 方法ではなく、 さらなる改善が要望されている。 例えば、 リボソーム RNA遺伝 子をターゲットとした核酸増幅検出法が広く報告されているが、 あくまでも Mycobacterium属に共通な部分を増幅し、 種特異的なプローブで結核菌を同定す るものである。 該方法では結核菌への特異性を決定するのはプローブの配列だけ であり、 検出感度の点を含めて不安があり、 培養陽性検体であっても検出できな い症例が存在することが多々報告されている。 一方、 特異性と検出感度を上げる ため上記のように I S 61 10という結核菌特異的な遺伝子をターゲットとした PCR法も報告されている。 し力 し、 7つの施設での I S 61 10をターゲット とした検査の比較研究では、 当該方法による偽陽性の割合が 3〜77%、 感度が 2〜 90 %と各施設ごとに検査結果が大きく異なることが明らかとされている [ジャーナルォブ ·クリ二カル ·マイクロバイオロジー、 第 32巻、 第 277頁 (1994) ] 。
一方、 検体からの核酸の抽出方法も煩雑で、 検査員の感染という面でも十分配 慮された抽出法ではなかった。
また、 増幅産物の検出法においてハイブリダイゼーション法が利用されるが、 従来は増幅された二本鎖の核酸をまず液層で強アル力リで変成させ、 次に変成し た一本鎖核酸を剥がれた相補的核酸の共存下で中性条件でプローブとハイブリダ ィズさせる方法が用いられていた （ロシュ社アンプリコアキット説明書） 。 これ では、 プローブのハイプリダイゼーシヨンが、 2本鎖から剥がれた相捕的増幅核 酸に競合的に妨害され感度■特異性が上がらないという問題点があった。 すなわ ち、 増幅された二本鎖 D NAをいつたんアルカリ変性によって一本鎖とし、 これ を中和した後に中性条件下でプローブとハイプリダイズさせていた。 また、 アル カリ変性を嫌って熱変性を行う場合もあったが、 これでは多数の検体を精度良く 検査することは不可能であった。 このため、 工程も多く、 また一本鎖とされた D NAの一方がプローブと競合してハイブリダィズし、 標的核酸の検出感度を低下 させることにもなつた。
また、 従来の方法ならびに市販のキットでは検体採取から結果報告まで約 6時 間以上を要し、 結核症という感染症であるがゆえに一刻も早い診断と患者隔離な どの対処が要求されるにもかかわらず、 検体採取から結果報告とそれに伴う患者 への対処が即日対応できず翌日になってしまい、 結核感染の伝播を最小限に食い 止めることができないという公衆衛生上重大な問題点が解決されず残っていた。 以上のように公開されている情報から、 結核菌に対する信頼でき、 かつ医療の 場に有用なものは未だ存在しないことが明らかになつた。
( b ) リン菌
リン菌 （すなわちナイセリ了■ ゴノルホエア、 N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e ) は、 アメリカ合衆国において最も一般的に報告される細菌感染 の 1つである淋病の病原体である。 Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5 ： 327-335 ；アメリカ特許第 5， 2 5 6 , 5 3 6号；及びアメリカ特許第 5 , 5 2 5， 7 1 7号は、 N. ゴノルホエア シトシン D NAメチルトランスフェラ ーゼ遺伝子 (M. N g o ΡΠ) の配列と有意な相同性を有するオープンリーデ イングフレーム （ORF 1) を含むゲノムフラグメントに由来する DN Aプロ一 ブを用いての N. ゴノルホエアの検出を記載している。 しかしながら、 リン菌を 特異的にかつ十分な感度で検出できる方法はなかった。
また、 リン菌により感染された患者は、 クラミジァ トラコマチス （Ch i a my d i a t r a c h oma t i s) にも感染している事例が報告されている。
(c) クラミジァ
「クラミジァ」 とはクラミジァ属に属する微生物をいう。 クラミジァ属の三つ の種、 クラミジァ トラコマチス （C. t r a c h oma t i s) 、 クラミジァ シッタシ （C. p s i t t a c i ) 、 クラミジァ ェユーモニエ （C. p n e u mo n i a e) はヒト宿主に感染し、 疾患を起こしうることから臨床的に重要で ある。 特にクラミジァ トラコマチスは、 男女両性で性器感染症を引き起こす、 先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されている。 従って、 クラミジ ァ トラコマチスを特異的に、 そして適時に検出できる方法および試薬が必要と されている。
(d) HCV
従来より、 血清等の試料中の HCVの検出は、 逆転写 PCR (RT-PCR) 法により行われている。 この方法は、 （1) 血清からの HCVの RNAの抽出、 (2) 抽出した RNAを铸型とした cDNAの合成、 (3) 温度を上下させる P CR法による増幅、 （4) 固定化プローブとのハイプリダイゼーシヨン、 （5) 未反応試薬の洗浄除去、 (6) 標識試薬との反応、 (7) 未反応試薬の洗浄除去、 (8) 発色試薬の添加、 (9) 発色停止薬の添加、 (10) 吸光度の測定の計 1 0工程で行われている。 また、 J. V i r o l . Me t h o d s Vo l . 64， p p l 47-1 59 (1997) 記載のリアルタイム検出 P C R法を用いたホモ ジユアス検出法による HCV検出も検討されている。
上記のように HCVを高感度に簡便に、 かつ大量検体を迅速にかつ安価に測定 することは、 血液製剤、 輸血、 献血の品質管理、 治療経過の判定、 症例のモニタ リング、 あるいは治療費用の低減の観点からも非常に重要である。 しかしながら、 上記 P C R法では温度の厳密な制御が必須であり、 そのための測定機械は複雑か っ大掛かりなものとなる一方で、 その処理能力は、 現時点では 5時間で 96検体 が限界である。 そのため、 血液センタ や臨床検査センターで要求される 2時間 に 1000検体以上という大量検体を測定することは不可能であった。
このように従来の方法は、 いろいろな問題をかかえており、 一定時間内に多数 の検体中の HC V核酸を簡便に短時間で測定する技術が求められていた。 発明の目的
本発明の主な目的は、 一定時間内に多数の検体について病原微生物を高感度で 正確に、 カゝつ、 簡便に短時間で、 さらに安価で測定する手段を提供することにあ る。 発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、 従来の核酸増幅方法より優れた核酸増幅方法を 利用した病原微生物の検出方法を見出した。 また、 該方法のための標的核酸増幅 用キメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的核酸検出用プローブを見出し た。 さらに、 該方法のためのキットを構築し、 、 本発明を完成するに至った。 すなわち本発明の第 1の発明は、 結核菌群の My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 M y c o b a c t e r i um a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um mi c r o t i及ぴ Z又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出 可能なプローブであって、 配列表の配列番号 39記載の塩基配列あるいはその一 部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 1 1記載の塩 基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 2の発明は、 リン菌の N e i s s e r i a g o no r r h o e a eを検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 27記載の塩基配列あるい はその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 21 記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 3の発明は、 クラミジァの Ch 1 amy. d i a t r a c homa t i sを検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 22記載の塩基配列あ るいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 2 0記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 4の発明は、 H C Vを検出可能なプローブであって、 配列表の配列 番号 3 4、 3 5記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 5の発明は、 アルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイプ リダィズ可能なプローブに関する。 本発明の第 5の発明において p H 8〜l 4の アル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブが 好適であり、 当該病原微生物の標的核酸は結核菌、 リン菌、 クラミジァ、 H C V 由来の標的核酸のいずれかであるプローブが好ましい。 また、 病原微生物の標的 核酸は結核菌群の I S 6 1 1 0遺伝子、 リン菌の c p p B遺伝子、 クラミジァの p L G V 4 4 0、 H C Vの 5 ' 非翻訳領域の塩基配列から選択され、 該遺伝子に ノ、イブリダィズ可能なプローブが好適に使用できる。 該プローブとしては、 結核 菌群の I S 6 1 1 0遺伝子に存在する配列表の配列番号 3 9に示される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番 号 1 1に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 また、 リン菌の c p p B遺伝子に存在する配列表の配列番号 2 7に示される塩基配列、 又はその一部 を含有する塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 2 1に示さ れる塩基配列からなるプローブが例示される。 また、 クラミジァの p L G V 4 4 0に存在する配列表の配列番号 2 2に示される塩基配列、 又はその一部を含有す る塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 2 0に示される塩基 配列からなるプローブが例示される。 さらに H C Vの 5 ' 非翻訳領域に存在する 配列表の配列番号 3 4、 3 5に示される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基 配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 3 4、 3 5に示される塩基 配列からなるプローブが例示される。
本発明の第 1〜第 5の発明のプロープは、 標識を付加されていてもよレ、。 該プ ローブは、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5で示される塩基配列 のうち連続する 8塩基ないし 5 3塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオ チドであって、 標的核酸とハイプリダイズした場合には蛍光強度が抑制されず、 標的核酸とハイプリダイズしない場合は蛍光強度が抑制されるように蛍光標識さ れたものであることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 ま た、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5に示される塩基配列のうち、 連続する 8塩基以上からなる病原微生物検出用プローブであってもよく、 その 5 '末端がローダミン系蛍光色素またはォキサジン系蛍光色素で標識されたプロ ープであつて、 配列表の配列番号 3 4に示される塩基配列のうち、 連続する 8塩 基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 当 該標識蛍光色素がレポ一タ一蛍光色素及びクェンチヤ一色素を有するプローブで あって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5に示される塩基配列の うち、 連続する 8塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブ であってもよい。 上記レポーター色素は、 フルォレツセイン系色素であり、 クェ ンチヤー色素が DA B C Y L系色素であってもよい。 さらに、 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 金コロイド、 および放射性同位体から選択される標識を付加さ れているプローブが好適に使用できる。
本発明の第 6の発明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを使用し、 病原 微生物の標的核酸とハイプリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の 検出方法に関する。 本発明の第 6の発明において、 アルカリ領域で病原微生物の 標的核酸とハイプリダイゼーシヨンを行うことができる。 また、 当該病原微生物 としては結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vが例示される。 当該病原微生物 が結核菌群の場合、 標的核酸は I S 6 1 1 0遺伝子またはその断片が好適であり、 結核菌由来の I S 6 1 1 0遺伝子および/またはその断片を増幅した後に、 増幅 物と本発明の第 1または第 5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨン を行うことが好ましい。 また、 配列表の配列番号 3 6、 3 7にそれぞれ示される 塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有するブラィマーを使用して結 核菌群由来の I S 6 1 1 0遺伝子および/またはその断片が増幅されることが好 ましい。 また、 病原微生物がリン菌の場合、 標的核酸は c p p B遺伝子またはそ の断片が好適であり、 リン菌由来の c p p B遺伝子および Zまたはその断片を増 幅した後に、 增幅物と本発明の第 2または第 5の発明のプローブとの間でハイブ リダイゼーシヨンを行うことが好ましい。 また、 配列表の配列番号 2 8、 2 9に それぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライ マーを使用してリン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断片が増幅され ることが好ましい。 また、 病原微生物がクラミジァの場合、 標的核酸は p L G V 4 4 0またはその断片が好適であり、 クラミジァ由来の p L G V 4 4 0および/ またはその断片を増幅した後に、 増幅物と本発明の第 3または第 5の発明のプロ ープとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことが好ましい。 また、 配列表の配 列番号 2 3〜 2 6にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する 配列を有するプライマーを使用してクラミジァ由来の p L G V 4 4 0および Zま たはその断片が増幅されることが好ましい。 また、 病原微生物が H C Vの場合、 標的核酸は H C Vの 5， 非翻訳領域またはその断片が好適であり、 H C V由来の 5 5 非翻訳領域および/またはその断片を増幅した後に、 増幅物と本発明の第 4 または第 5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことが好ま しい。 また、 配列表の配列番号 3 0〜 3 3にそれぞれ示される塩基配列、 もしく は該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して H C V由来の 5 ' 非 翻訳領域および/またはその断片が増幅されることが好ましい。
本 明の第 7の発明は、 本宪明の第 6の発明の病原微生物の標的核酸の検出方 法を用いて結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C V由来の核酸を検出する工程を 包含する病原微生物の検出方法に関する。
本発明の第 8の発明は、 下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸 を検出することを特徴とする病原微生物の検出方法。
( a ) 鎵型となる核酸、 デォキシリポヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る D NAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および RN a s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 铸型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリボヌクレオチド又はヌ クレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有し、 該リポヌ クレオチドは該プラィマーの 3 ' 末端又は 3 ' 末端側に配置されたキメラオリゴ ヌクレオチドプライマーであり、 ；および、
( b ) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程、
に関する。 本発明の第 8の発明において、 さらに铸型となる核酸の塩基配列に実 質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有する反応 混合物を使用することが好ましい。 また、 当該キメラオリゴヌクレオチドプライ マーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプラィマーであるものが 好適に使用できる。
一般式： 5' — dNa— Nb— dNc— 3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び 又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
また、 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの cが 0であってもよく、 ヌ クレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシリボウラシ ルヌクレオチドであり、 '修飾リボヌクレオチドが — s) リポヌクレオチドで あってもよい。 また、 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28~31で それぞれ表される塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を使用 することが好ましい。 さらに、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを用いて増 Φ畐核酸を検出する工程を包含してもよい。
本 明の第 9の発明は、 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴ ヌクレオチドプライマーに関する。
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及ぴ Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及び //又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
本発明の第 9の発明において、 cが 0であるものが好適に使用でき、 当該ヌク レオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシリポゥラシル ヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （ α— S ) リポヌクレオチドであ るキメラオリゴヌクレオチドプライマ一が好適である。 とくに限定はされないが、 例えば配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28〜31でそれぞれ表され る病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプラィマーが好適である。 本発明の第 10の発明は、 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩 基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 結核菌由来の I S 611
0遺伝子および Zまたはその断片を増幅するためのプラィマー、 配列表の配列番 号 27に示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 リン 菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断片を増幅するためのプライマー、 配列表の配列番号 22に示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列 を有する、 クラミジァ由来の p LGV440および Zまたはその断片を増幅する ためのプライマー、 配列表の配列番号 41〜43にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5， 非翻訳領域およ ぴ Zまたはその断片を増幅するためのプライマーに関する。
本発明の第 10の発明において、 上記プラィマーは塩基配列の一部がリポヌク レオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。 ま た、 本発明の第 9及び第 10の発明において、 標識を付加されていてもよい。 当 該標識としては、 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 および金コロイドが例示さ れる。
本発明の第 1 1の発明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを含有するこ とを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第 12の発明は、 本発明の第 9〜第 10の発明のプライマーを含有す ることを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第 1 1ならびに第 12の発明は、 病原微生物の検出に使用できる。 本発明の第 1 3の発明は、 本発明の第 6〜第 8の病原微生物の検出方法に使用 するための組成物であって、 標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーシヨンを 行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検出用組成物に関する。 本発明の第 1 3の発明において、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 R N a s e H、 及びデォキシリボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有 してもよい。 当該 DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス （B a c i l l u s c a l d o t e n a x) 由来の 5，→3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c aDNAポリメラーゼであってもよく、 当該 RNa s eHがピロコッカス （P y r o c o c c u s) 属細菌由来及び/又はアルカェォグロパス （Ar c h a e o g 1 o b u s ) 属細菌由来の I I型 R N a s e Hであってもよい。
本発明の第 1 4の究明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを含有するこ とを特徴とする病原微生物検出用キットに関する。
本発明の第 1 4の発明において、 本発明の第 9〜第 1 0のプライマーを含有し てもよい。 当該キットは、 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vの検出に使用 することができる。 また、 当該キットは、 本発明の第 6〜第 8の病原微生物の検 出方法に使用するためのキットであって、 標的核酸の増幅もしくはハイプリダイ ゼーシヨンを行うための少なくとも 1種の試薬を包含してもよい。 また、 鎖置換 活性を有する D N Aポリメラーゼ、 R N a s e H、 及ぴデォキシリボヌクレオチ ド 3リン酸から選択される試薬を含有してもよい。 当該 D NAポリメラーゼがバ チルス カルドテナックス由来の 5， →3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a D N Aポリメラーゼが好適であり、 RN a s e Hがピロコッカス属細菌由来及び Z又 はアルカェォグロバス属細菌由来の I I型 R N a s e Hであってもよい。 さらに、 増幅産物を捕捉するための担体を含有してもよく、 該担体がマイクロタイタープ レート、 ビーズ、 マグネチックビーズ、 メンブラン、 およびガラスから選択され る担体であるものが好適に使用できる。
本発明の第 1 5の発明は、 結核菌群の検出方法において、 結核菌含有検体をム ラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群 の検出方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1 本発明の方法により、 各種 H C V— R NA濃度を測定した場合、 H C V 一 R N A濃度と蛍光強度の変化の関係、 ならびに従来法との測定範囲の差を比較 した図である。 発明の詳細な説明
本明細書においてデォキシリボヌクレオチド （本明細書中では d Nとも記載す る） とは、 糖部分が D— 2ーデォキシリポースで構成されたヌクレオチドのこと をいい、 例えば、 塩基部分にアデニン、.シトシン、 グァニン、 チミンを有するも のが挙げられる。 さらに、 7—デァザグアノシン等の修飾塩基を有するデォキシ リポヌクレオチドゃデォキシィノシンヌクレオチドのようなデォキシリポヌクレ ォチドアナログも上記のデォキシリボヌクレオチドに包含される。'
本明細書においてリポヌクレオチド （本明細書中では Nとも記載する） とは、 糖部分が D—リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、 塩基部分にアデ ニン、 シトシン、 グァニン、 ゥラシルを有するものが挙げられる。 さらに、 当該 リポヌクレオチドには修飾リポヌクレオチドが包含され、 例えば α位のリン酸基 の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド [ ( a— S ) リポヌク レオチド、 （ひ一 S ) Νとも記載する] やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、 デォキシリポヌ クレオチドおよびリポヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。 該プラ イマ一はヌクレオチドアナログおよび/または修飾ヌクレオチドを含有していて もよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、 該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側にリポヌクレオチドを配置し、 本発明の方法において核 酸鎖が伸長でき、 ェンドヌクレアーゼで切断でき、 鎖置換反応を行うことができ るものであれば、 いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包 含される。
本明細書において 3 ' 末端側とは、 核酸、 例えば、 プライマーにおいてその中 央より 3 ' 末端にかけての部分を指す。 同様に 5， 末端側とは、 核酸においてそ の中央より 5 ' 末端にかけての部分を指す。
本明細書においてェンドヌクレアーゼとは、 铸型核酸にアニーリングした上記 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一より D NAの伸長を行って生成した二本鎖 ^Ν、Αに作用して、 該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するも のであればよい。
本明細書において D NAポリメラーゼとは、 D NA鎖を錶型として新たな D N Α鎖を合成する酵素のことを言レ、、 天然型の D NAポリメラーゼの他、 前記活性 を有する変異体酵素も包含される。 当該酵素としては、 例えば鎖置換 (Strand displacement)活性を有する D NAポリメラーゼ、 5 ' →3 ' ェキソヌクレア一 ゼ活 1"生を有していない DNAポリメラーゼ、 逆転写酵素活性ゃェンドヌクレア一 ゼ活性を併せ持つ DN Aポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において 「鎖置換活性」 とは、 铸型となる核酸配列に従って DNA複 製を行う際、 DNA鎖を置き換えながら進行し、 铸型鎖にアニーリングしている 相補鎖を遊離させる、 即ち鎖置換 （strand displacement) することができる活 性のことをいう。 また、 本明細書においては、 鎖置換により铸型となる核酸配列 カ ら遊離した DNA鎖のことを 「置換鎖」 と称する。
本明細書においてアル力リ領域とは、 pHが 7を越える領域のことをいう。 本明細書において、 病原微生物とは、 病原性の細菌ならびにウィルスのことを いう。
本明細書において標的核酸とは、 核酸増幅あるいは検出の対象となる病原微生 物由来の遺伝子の任意の領域のことをいい、 DNAあるいは RNAのいずれもが 含まれる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
(1) 本発明のプローブ
本発明のプローブは、 病原微生物、 例えば結核菌群、 リン菌、 クラミジァある いは HCVを検出しうることを特徴とする。 本発明のプローブの好適な態様とし ては、 アル力リ領域において標的核酸に安定してハイブリダイズできるものが例 示される。 すなわち本発明のアルカリ領域でハイブリダィズ可能なプローブとし ては、 特に限定はないが、 例えば pH7. 0を超えるアルカリ領域、 好ましくは p H 8〜 14の範囲、 特に好ましくは pH8〜pH10の範囲のアル力リ条件下 においてその塩基配列に相補的な配列を有する標的核酸とハイブリダイズするこ とが可能なプローブ挙げられる。 特に限定はされないが例えば、 配列表の配列番 号 1 1、 20、 21、 34、 35記載の塩基配列を含有するものが挙げられる。 なお、 本発明のプローブは従来の中性領域でのハイブリダィゼーシヨンに用いる ことができる。
本発明の： 7°口ープを使用する場合、 二本鎖核酸をアル力リ処理によつて一本鎖 に変性した後、 中和することなくハイプリダイゼーション工程に使用することが 可能である。 これによつて工程も簡略ィヒされ、 感度も従来の方法の 10倍以上向 上する。 また、 アルカリ領域でハイブリダィズさせることにより、 ハイプリダイ ゼーションの特異 '性を向上させることができる。
検体由来の核酸とハイプリダイズしたプローブの検出法には特に限定はなく、 公知の検出方法のいずれもが本発明に適用できる。
上記の本発明のプローブを適切な方法で標識して使用することにより、 試料中 に存在する標的核酸を効率よくおよび Zまたは高感度に検出することができる。 プローブの標識方法には限定はなく、 例えば放射性同位体 （32 P等） 、 色素、 蛍光物質、 発光物質、 種々のリガンド （ピオチン、 ジゴキシゲニン等) 、 酵素等 が使用できる。 標識されたプローブは当該標識に応じた検出方法でその存在を確 認することができる。 直接検出できないリガンドの場合には、 検出可能な標識を 付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。 例えば、 リガンド標識し たプローブと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、 シグナルを増幅するこ とによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
さらに上記プローブは、 検出のための標識物質を有していてもよい。 標識物質 は、 特に限定はされないが例えばリガンドあるいはレセプター物質、 放射性同位 元素、 蛍光、 発光、 発色のいずれもが好適に使用できる。
本発明の方法においては、 標識物質を有したプローブと目的の領域を増幅した 核酸とをハイプリダイズし、 フリ一のプローブを洗浄後に検出する方法やあるい は該洗净工程を省レ、た、 いわゆるホモジエアス検出法の 、ずれもが好適に使用で きる。 蛍光を利用した該ホモジ -ァス検出法としては、 例えば、 P r o c. ，
Na t l . Ac a d. S c i . USA、 v o l . 8 5、 p 8790〜879 4 (1 98 8) に記載の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET； Fluoresence resonance energy transfer) 法、 Na t u r e B i o t e c hn o l o g y、 v o l . 14、 p 303〜308 (1 9 96) に記載の分子ビーコン
(Molecular Beacons) 法、 An a l . C h e m. 、 v o l . 72、 p 371 7
〜3 724 (2000) に記載のスマートプローブ （Smart probe) 法等が好適 に使用できる。
本発明の態様の一つとして、 当該プローブの 5'末端がロ^ "ダミン系またはォ キサジン系色素で標識され、 3，末端がクェンチングを起こす塩基配列であるォ リゴヌクレオチドゃレポーター色素で標識され、 さらに該プローブの 5，末端側 と 3，末端側がセノレファエーリングしている、 分子ビーコン法あるいはスマート プ口ーブ法の場合が例示される。
上記のプローブを用いた場合、 本発明の増幅方法によって増幅された核酸が存 在すると、 該増幅核酸にプローブがハイプリダイズして、 プローブのセ ファニ ーリング構造が解消され、 その結果として蛍光強度が抑制されずに蛍光シグナル を発するようになる。 一方、 増幅核酸が存在しない場合は、 プローブはセルファ ニーリング構造を保持し、 蛍光強度が抑制されるため蛍光シグナルは検出されな い。
すなわち、 スマートプローブ法の場合、 前記蛍光色素はローダミン系色素また はォキサジン系色素が好ましく、 該色素は上記プローブの 5，末端に結合され、 3 '末端の塩基配列と協調して標的核酸に該蛍光プローブが結合していないとき は蛍光強度が抑制され、 標的核酸に該蛍光プローブが結合した場合には蛍光強度 が抑制されない性質を持つものであればょ 、。
一方、 分子ビーコン法の場合は、 標的核酸に該蛍光プローブが結合していない 場合には蛍光共鳴エネルギー転移によってその蛍光強度が抑制され、 結合した場 合には蛍光強度が抑制されないような組み合わせになればよい。
これら蛍光色素としては、 FAM (6—カルボキシーフルォレツセィン) や Τ AMRA (6—力ルポキシーテトラメチルーローダミン） や JA242 (ォキサ ジン） や DABCYL ( 4ージメチルァミノアゾベンゼン一 4 ' 一スルホユルク 口ライド） が好ましい。 これらの蛍光色素は公知であり、 市販されている。
なお、 オリゴヌクレオチドに蛍光標識する方法は、 例えば、 N u c . Ac i d s Re s. 、 v o l . 12、 p 3387〜3403 (1984) 、 J . Am. Ch em. S o c. 、 v o l. 112、 p l 253〜1254 (1990) あ るいは、 An a l . C h e m. 、 v o l. 70、 p 4771〜4779 (19
98) に記載の方法が利用できる。
本発明のプローブの鎖長は、 特に限定はされないが例えば、 12me r以上、 好ましくは 2 Ome r以上、 特に好ましくは 4 Ome r以上である。
本発明の結核菌群検出用プローブは、 My c o b a c t e i u t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i u m a f r i c a n u m、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i及ぴ Z又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出するこ とができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しょうとする核酸、 もしくは生物 に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するものではないが、 例えば結 核菌群の検出においては I S 61 10遺伝子を標的核酸とするプローブが使用で き、 配列表の配列番号 12に示される結核菌由来 I S 6110遺伝子の塩基配列 力 適切な領域を選択することにより設計することができる。 特に限定はされな いが例えば、 配列表の配列番号 39に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましく は配列表の配列番号 40を含む領域から、 さらに好ましくは配列表の配列番号 3 8を含む領域から選択することができる。 特に配列表の配列番号 11記載の塩基 配列を含む領域から選択することができる。 上記のプローブは、 結核菌群由来の I S 6110遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異性をもってハイ プリダイズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらには結核菌群の検出に特に有 用である。
本発明のリン菌検出用プローブは、 Ne i s s e r i a g o no r r h o e a eを検出することができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しょうとする核 酸、 もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するものでは ないが、 例えばリン菌の検出においては c r y p t i c 1 a s m i d p r o t e i nB (c p pB) 遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、 配列表 の配列番号 27に示されるリン菌由来 c p p B遺伝子の塩基配列から適切な領域 を選択することにより設計することができる。 特に限定はされないが例えば、 配 列表の配列番号 27に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましくは配列表の配列 番号 21を含む領域から選択することができる。 上記のプローブは、 リン菌由来 の c p pB遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異性をもってハイブ リダィズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらにはリン菌の検出に特に有用で ある。
本発明のクラミジァ検出用プローブは、 Ch l amy d i a t r a c h om a t i sを検出することができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しようとす る核酸、 もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するもの ではないが、 例えばクラミジァの検出においてはクリプティック 'プラスミド
(c r y t i c p l a smi d) p L G V 440を標的核酸とするプローブ が使用でき、 配列表の配列番号 22に示されるクラミジァ由来 p LGV440の 塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。 特に限定 はされないが例えば、 配列表の配列番号 22に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましくは配列表の配列番号 44を含む領域から、 さらに好ましくは配列表の配 列番号 20を含む領域から.選択することができる。 上記のプローブは、 クラミジ ァ由来の pLGV440、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異 1"生をもって ハイブリダィズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらにはクラミジァの検出に 特に有用である。 ·
また、 本発明の HCV検出用プローブは、 標的核酸増幅時に使用するフォヮ一 ド側プライマー及びリバース側プライマーで挟まれた領域の塩基配列にハイプリ ダイズ可能なプローブであれば特に限定はされない。 また、 該プローブの長さは、 特に限定はされないが、 好ましくは 8塩基〜 53塩基の範囲、 特に好ましくは 8 塩基〜 36塩基の範囲で選択すればよい。 例えば、 配列表の配列番号 43に示さ れる塩基配列から上記範囲で連続する 8塩基以上の塩基配列を有するプローブを 選択すればよく、 特に限定はされないが、 配列表の配列番号 34あるいは 35に 示される塩基配列の中の連続する 8塩基以上を有するプローブが挙げられる。
(2) 本発明の検出方法
本発明の標的核酸の検出方法は、 上記 (1) 記載のプローブを用いることによ り、 標的核酸の 2本鎖から 1本鎖への変性工程に続く中和工程を省略できる。 す なわち、 本発明の標的核酸の検出方法において p Hが 7を越えるアル力リ条件、 特に好ましくは pH8〜14の範囲のアル力リ条件下においてその塩基配列に相 補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることが可能である。 当該ハイプリ ダイゼーシヨンの条件としては、 特に限定するものではないが、 「厳密な条件」 として当業者に知られている条件を挙げることができる。 このような条件は、 1989年、 コールド'スプリング ·ハーバー ·ラボラトリ一発行、 T. マニアティ ス （T. Maniatis) ら編集、 モレキュラー .クローユング：ァ 'ラボラトリー ' マ-ユアノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. ) に IB 載のものや、 本願実施例に記載されたものが使用できる。
代表的なハイブリダイゼーション溶液の組成としては次のものが挙げられる： 0 . 5 % S D S、 5 Xデンハルツ [Denhardt' s ； 0 . 1 %ゥシ血清アルブミン (B S A) 、 0 . 1 %ポリビ-ルピロリ ドン、 0 . 1 %フイコール 4 0 0 ] 及ぴ
1 0 0 /X g /m 1サケ精子 D NAを含む 6 X S S C ( 1 3 3〇は0 . 1 5 M N a C l、 0 . 0 1 5 M クェン酸ナトリウム） 。 なお、 本発明においてはハイ ブリダイゼーション溶液の p Hは 8〜 1 4の範囲に調整して実施してもよい。 ハイブリダィゼーシヨンの温度は、 特に限定されるものではないが、 例えばプ ローブの Tm値より 5 °C以上低い温度で実施される。
ここで、 プローブの T m値は、 例えば下記式：
Tm=81. 5— 16. 6 (logl。 [Na+]) +0. 41 (%G+C)一 (600/N)
(式中、 Nはプローブの鎖長、 ％G+Cはプローブ中のグァニンおよぴシトシン残 基の含量である）
により求められる。
また、 プローブの鎖長が 1 8塩基よりも短い場合には、 Tm値は下記式： Tm= (%A+T) X 2 + (%G+C) X 4 ]
(式中、 （％A+T)はプローブ中のアデユンおよびチミン残基の含量、 （%G+C) はプローブ中のグァ二ンぉよびシトシン残基の含量である）
として推定することができる。
上記のハイブリダイゼーション条件でプローブと標的核酸のハイブリダイズを 確認することにより、 標的核酸の検出に適したプローブを選定することができる。 本発明の検出方法におけるハイプリダイゼーション条件には特に限定はなく、 公知のハイブリダイゼーション条件、 好ましくは厳密なハイブリダイゼーション 条件が使用される。 また、 ハイブリダィゼーシヨン溶液の p Hは 8〜1 4の範囲 に調整してもよい。
本発明の標的核酸の検出方法の一態様としては、 例えば結核菌群の検出方法に おいては、 結核菌群由来の I S 6 1 1 0遺伝子の検出に適したプローブが好適に 使用でき、 特に限定するものではないが、 例えば、 配列表の配列番号 3 9記載の 塩基配列もしくはその一部、 好ましくは配列表の配列番号 4 0記載の塩基配列も しくはその一部、 さらに好ましくは配列表の配列番号 3 8記載の塩基配列もしく はその一部、 特に好ましくは配列表の配列番号 1 1を含有するプローブが本発明 に好適に使用できる。 また、 例えばリン菌の検出方法においては、 リン菌由来の c p p B遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、 特に限定するもので はないが、 例えば、 配列表の配列番号 2 7記載の塩基配列もしくはその一部、 好 ましくは配列表の配列番号 2 1記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプロ 一プが本発明に好適に使用できる。 また、 クラミジァの検出方法においては、 ク ラミジァ由来の; P L GV 4 4 0の検出に適したプローブが好適に使用でき、 特に 限定するものではないが、 例えば、 配列表の配列番号 2 2記載の塩基配列もしく はその一部、 好ましくは配列表の配列番号 4 4記載の塩基配列もしくはその一部、 さらに好ましくは配列表の配列番号 2 0記載の塩基配列もしくはその一部を含有 するプローブが本発明に好適に使用できる。 さらに、 H C Vの検出方法において は、 特に限定するものではないが、 5 ' 非翻訳領域が好適であり、 例えば、 配列 表の配列番号 4 3記載の塩基配列もしくはその一部、 好ましくは配列表の配列番 号 3 4記載の塩基配列もしくはその一部、 又は配列番号 3 5記載の塩基配列もし くはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。
本発明の病原微生物の検出方法は、 上記 ( 1 ) 記載のプローブを用いることに より個々の病原微生物を特異的に検出することができる。 すなわち、 上記のプロ 一ブは各病原微生物由来の遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異个生 をもつてハイブリダイズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらには各病原微生 物の検出に特に有用である。
さらに本発明の検出方法においては、 上記 ( 1 ) 記載のプローブを使用するこ とにより当該プローブと核酸を含有する試料との間で、 p H 7を越えるアル力リ 条件下、 好ましくは p H 8〜 1 4、 特に好ましくは p H 8〜1 0の条件下でハイ ブリダィゼーシヨンを実施することができる。 すなわち、 当該方法により標的核 酸の変性工程に続く中和工程を経ることなく、 病原微生物由来の遺伝子、 もしく はその断片を検出する方法が提供され、 該方法によって検体中に含まれる結核菌 等を検出することができる。 本発明の方法は、 試料中に存在する特定の遺伝子の検出、 定量に利用すること ができる。 すなわち D NAまたは R N A等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試 料から特定の遺伝子を検出、 定量することができる。 前述の試料としては、 特に 限定はないが、 例えば、 全血、 血清、 バフィ一コート、 尿、 糞便、 脳脊髄液、 精 液、 唾液、 組織 （例えば、 癌組織、 リンパ節等） 、 細胞培養物 （例えば、 哺乳動 物細胞培養物及び細菌培養物等） のような生体由来試料、 ゥィノレス又は細菌のよ うな微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料 （食品、 生物学的製剤 等） 、 あるいは土壌、 排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の 遺伝子を検出、 定量することができる。 さらに例えば、 標的核酸の存在の有無に よって上記の病原微生物の存在の検出、 定量等に利用することができる。 特に、 病原性の微生物の検出方法は衛生、 環境分野で有用である。 上記検出法のための 铸型として使用される核酸は、 R NAあるいは D NAのいずれもが好適に使用で さる。
これら材料からの核^有調製物の調製には特に限定はなく、 例えば、 界面活 性剤による溶解処理、 超音波処理、 ガラスビーズを用いた振盪撹拌、 フレンチプ レスの使用等により行うことができる。 幾つかの例においては、 さらに操作を加 えて核酸を精製することが有利である （例えば、 内在性ヌクレアーゼが存在する とき） 。 これらの例において、 核酸の精製はフエノール抽出、 クロマトグラフィ 一、 イオン交換、 ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施 される。
R N A由来の配列を有する核酸を標的とする場合には、 当該 R NAを铸型とし た逆転写反応によって合成された c D NAを铸型として本発明の方法を実施すれ ばよい。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、 使用される反応条件において錄 型 R NAにァニールするものであれば特に限定されるものではない。 該プライマ 一は、 特定の鎵型 R NAに相捕的な塩基配列を有するプライマー （特異的プライ マー） の他、 オリゴ d T (デォキシチミン） プライマーやランダムな配列を有す るプライマー （ランダムプライマー） であっても良い。 逆転写用プライマーの長 さは、 特異的なアニーリングを行う観点から、 好ま あり、 更に好ましくは 9ヌクレオチド以上であり、 オリゴヌクレオチドの合成の 観点から、 好ましくは 100ヌクレオチド以下であり、 更に好ましくは 30ヌク レオチド以下である。 さらに、 逆転写用プライマーとして、 逆転写後の cDNA を鍚型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとし て使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。 こ のようなプライマーは、 下記 （3) に記載された性質を有し、 かつ RN Aからの 逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はないが、 例えば、 配列表の配列 番号 32及び 33に記載の塩基配列を有するプライマーが好適に使用できる。 上記の逆転写反応に使用される酵素としては、 RNAを鏺型とした c DNA合 成活性を有するものであれば特に限定はなく、 例えばトリ骨髄芽球症ウィルス由 来逆転写酵素 （AMV RTa s e) 、 モロ-一ネズミ白血病ウィルス由来逆転 写酵素 （MMLV RT a s e) 、 ラウス関連ウィルス 2逆転写酵素 （RAV— 2 RTa s e) 等、 種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。 このほか、 逆転写 活性を併せ持つ DN Aポリメラーゼを使用することもできる。 また、 本発明の目 的のためには、 高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、 例えばサーマス属 細菌由来 DNAポリメラーゼ （T t h DNAポリメラーゼ等） 、 好熱性バチル ス属細菌由来 DNAポリメラーゼ等を使用できる。 特に限定はないが、 例えば、 好熱性バチルス属細菌由来 DN Aポリメラーゼが好ましく、 B. s t由来 DNA ポリメラーゼ （B s t DNAポリメラーゼ） 、 さらに B e a DNAポリメラー ゼが好ましい。 例えば、 B e a DNAポリメラーゼは、 逆転写反応にマンガン イオンを必要とせず、 また、 高温条件下で铸型 RN Aの二次構造形成を抑制しな がら cDNAを合成することができる。 上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、 当該活性を有している範囲において天然体、 変異体のいずれもが使用できる。 上記方法により単離したゲノム D N Aや P C Rフラグメントのような二本鎖 D NA、 および全 RNA若しくは mRNAから逆転写反応で調製された c DNAの ような一本鎖 DNAのいずれもが本発明に使用される核酸增幅法において鍀型 D NAとして好適に使用できる。 上記二本鎖 DNAの場合は、 一本鎖 DNAに変性 する工程 （デネーチヤ一） を施したものが好適に使用できる。
上記のように、 本発明のプローブとハイブリダィズする標的核酸上の領域を適 切な核酸増幅方法によって増幅し、 これをハイブリダィゼーションに使用するこ とができる。 使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、 標的核酸上の領域を 増幅可能なものであればよい。 例えばポリメラーゼ連鎖反応法 （ P C R； polymerase chain reaction, 米国特許第 4， 683, 195号、 第 4, 683， 202号おょぴ第 4， 800, 159号） 、 リガーゼ連鎖反応 （LCR； ligase chain reaction) 、 鎖置換 型増幅法 (SDA； strand displacement amplification, 特公平 7- 114718号） 、 自立複製法 (3 S R； self-sustained sequence replication) 、 核酸配列増幅 法 (NASBA法； nucleic acid sequence based amplification 特午第 2650159号） 、 TMA法 （transcription- mediated amplification) 、 Q βレプ リカーゼ法 （特許番号第 2710159号） 、 I CAN法 (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、 国際公開第 00/568 77号パンフレット） 等を使用することができる。
I CAN法は、 キメラヌクレオチドプライマーとエンドヌクレアーゼ、 鎖置換 活性を有する DNAポリメラーゼを使用して、 等温条件下に铸型核酸上の特定の 塩基配列を有する D N Aを連続的に増幅する方法である。
ここで、 「連続的に」 とは、 反応温度、 反応液組成の変更を伴わずに反応が進 行していることを意味する。 また、 本明細書において 「等温」 とは、 酵素および 核酸鎖が上記各工程において機能する、 実質的に一定の温度条件のことを意味す る。
通常、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、 デォキシリボヌクレ才 チドとリボヌクレオチドから構成され、 リボヌクレオチドがその 3 ' 末端又は 3' 末端側に配置されたものが使用される。 例えば、 下記一般式で表す構造をも つオリゴヌクレオチドが I CAN法のプライマ^"として使用することができる。 一般式： 5， -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： クレオチド及ぴ Z又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい）
なお、 上記のヌクレオチドアナログとしては、 例えば、 デォキシリポイノシン ヌクレオチドを、 また修飾リポヌクレオチドとしては、 例えば、 （ α— S ) リボ ヌクレオチドを、 それぞれ使用することができる。 当該ヌクレオチドアナログは、 プライマーとしての機能を実質的に失わない範囲で含有させることができる。 当該プライマーは、 铸型上の増幅が望まれる領域の 5， 側、 3， 側の塩基配列 をもとに、 5' 側の塩基配列に相同な配列を有するもの、 3， 側の塩基配列に相 補的なものの 2種を作成し、 増幅に使用される。
本発明に使用されるェンドヌクレアーゼとは、 铸型核酸にァニーリングした上 記に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーより DN Αの伸長を行って生成 した二本鎖 DN Aに作用して、 鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるも のであればよい。 即ち、 上記の二本鎖 DNAのうちのキメラオリゴヌクレオチド プライマー部分にニックを生成しうる酵素である。 特に限定されるものではない 1 例えば、 本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、 特に DNAと RNAとか ら形成された二本鎖核酸の RNA部分に作用するェンドリポヌクレアーゼ H (R N a s e H) が好適に使用できる。 また、 該リポヌクレアーゼには、 上記作用を 有するものであれば、 常温性から耐熱性のリポヌクレアーゼのいずれもが好適に 本発明に使用できる。 例えば、 下記実施例に示すように、 約 50°C〜約 70°Cで の反応では大腸菌 (E. c o 1 i ) 由来の RNa s e Hが本発明の方法に使用す ることができる。 また、 本発明の方法においては、 耐熱性のリポヌクレアーゼも 好適に使用できる。 該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、 特に限定はされないが、 例えば市販の H y b r i d a s eT M Th e rmo s t a b l e RNa s e
H (ェピセンターテクノロジーズ社製） の他、 好熱性バチルス属細菌、 サーマス 属細菌、 ピロコッカス属細菌、 サーモトガ属細菌、 アルカェォグロバス属細菌、 メタノコッカス属細菌等由来の RNa s eH等も好適に使用できる。 さらに、 該 リポヌクレアーゼは、 天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。 なお、 本願明細書に記載されている RNa s e Hの酵素単位は、 実施例中の参考例に示 した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、 上記 RNa s eHは、 本発明の方法に使用できるものであれば特に限定 はなく、 例えば、 種々のウィルス、 ファージ、 原核、 真核生物由来のいずれであ つてもよい。 さらに、 細胞性 RNa s e Hあるいはウィルス性 RNa s e Hのい ずれであってもよい。 例えば、 上記細胞性 RNa s eHとしては大腸菌 RNa s eH I力 ウィルス性 RNa s eHとしては H I V— 1由来 RN a s e Hが例示 される。 本発明の方法において RN a s eHは、 I型、 I I型、 I I I型のいず れもが使用できる。 特に限定はされないが、 例えば大腸菌由来 RNa s eH I、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RN a s e H I
Iが好適に使用できる。
また、 本宪明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、 例えば、 RNa s eHの 切断反応の効率は上記プライマーの 3， 末端近傍の塩基配列に左右され、 所望の DNAの増幅効率に影響することが考えられるので、 使用する RNa s e Hに最 適なブラィマーをデザィンすることは当然のことである。
I CAN法には、 DNAの鎖置換 (strand displacement) を行う活性を有す る DNAポリメラーゼが使用される。 また、 実質的に 5， →3， ェキソヌクレア ーゼ活性を有しないものが特に好適に使用される。
I CAN法に使用される DN Aポリメラーゼは、 上記の鎖置換活性を有するも のであれば特に限定はなく、 例えば、 バチルス カルドテナックス （Bacillus caldotenax, 以下、 B. c aと称す） ゃバチノレス ステアロサーモフィラス
(Bacillus stearotherraophilus, 以下 B. s tと称す） 等の好熱性バチルス属 細菌由来 DNAポリメラーゼの 5， →3' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した変 異体や、 大腸菌由来 DNAポリメラーゼ Iのラージ フラグメント （タレノウ断 片） 等が挙げられる。 また、 本発明に使用できる DNAポリメラーゼは、 常温性 カ ら耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。 上記の酵素は、 その本来の起源 より精製して取得されたもの、 あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタン パク質の何れであっても良い。 また、 該酵素は、 遺伝子工学的あるいはその他の 手法によって置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加えたものであっても良く、 こ のような酵素の例として、 5' →3， ェキソヌクレアーゼ活性を欠損させた B c a DNAポリメラーゼである B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社 製） 等が挙げられる。 該酵素は50°〇〜70でで活性を示し、 当該方法に好適に 使用することができる。
なお、 DNAポリメラーゼの中には、 特定の条件でェンドヌクレアーゼ活†生、 例えば、 RNa s eH活性を有するものが知られている。 このような DN Aポリ メラーゼを本発明の方法に用いることができる。 すなわち、 該 DNAポリメラー ゼを RN a s e H活性が発現されるような条件下、 例えば Mn2 +の存在下で使用 する態様が挙げられる。 該態様においては、 上記 RNa S eHを添加することな く本発明の方法を実施することができる。 すなわち、 Mnz+を含有する緩衝液中 で上記の B c a DNAポリメラーゼは、 RNa s e H活性を示すことができる、 上記の態様は B c a DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、 RNa s e H活性を併せ持つことが知られている公知の DN Aポリメラーゼ、 例えばサー マス サーモフィラス（Thermus therraophilus)由来の T t h DNAポリメラー ゼも本発明に使用することができる。
I CAN法は、 キメラオリゴヌクレオチドプライマー、 铸型となる核酸を含有 する試料、 ェンドヌクレアーゼ、 DNAポリメラーゼ、 デォキシリボヌクレオチ ド 3リン酸 (dNTP) 等を前記酵素が活性を示しうる組成の緩衝液中で混合し、 当該反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに +分な時間保温することによ り実施される。
なお、 反応に先立ってキメラオリゴヌクレオチドプライマーと錡型となる核酸 を混合し、 2本鎖核酸が変性する温度、 例えば、 90°C以上で保持した後、 本発 明の方法に使用される反応温度以下まで冷却してァニーリングを実施してもよい 力 これは増幅反応に必須の操作ではない。
また本発明の検出方法において、 RN Aを铸型とする場合は、 逆転写反応と核 酸増幅反応を 1段階で行ってもよい。 特に限定はされないが、 逆転写酵素と鎖置 換型 DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、 AMV RT a s e、 MM L V RT a s eあるいは RAV— 2 1 丁& 3 6と8。 & DNAポリメラー ゼの組み合わせが好適に使用できる。 さらに、 逆転写酵素活性と鎖置換活性とを 有する 1種の DNAポリメラーゼを用いてもよい。
本発明の標的核酸の検出方法は、 核酸を含有する試料より直接、 標的核酸を增 Ψ畐することにより実施することができる。 この場合、 增幅される標的核酸の鎖長 には、 特に限定はないが、 感度よく標的核酸を検出する観点からは、 例えば 20 0 b p以下、 さらに好ましくは 150 b p以下の領域が有効である。 該增幅鎖長 となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を設定することによ り、 高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、 本発明の検出方法では、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩あるい はトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及ぴスぺノレミジンやプロピレンジ アミンを含有するァニーリング溶液の使用により、 微量の核酸試料からもさらに 高感度に標的核酸を検出することができる。 この場合、 使用するエンドヌクレア ーゼと D NAポリメラーゼは特に限定はされないが、 例えば大腸菌由来、 ピロコ ッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 R N a s e H及び B c a B E S T D N Aポリメラーゼの組み合わせが好ましい。 特に、 上記エンドヌ クレア一ゼ及ぴ D N Aポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できる ュニット数が異なる場合が予想されるが、 その際には検出感度の向上あるいは增 幅産物量の増加を指標にして、 該バッファ一の組成および酵素の添加量を調整す ればよい。
また、 二本鎖の铸型 D N Aと 2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使 用する核酸増幅方法の態様においては、 反応の条件等にもよるが、 各プライマー から伸長反応中のそれぞれの錄型一伸長鎖中間体の間で鑤型の交換が起こり、 合 成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することが ある。 この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有してお り、 次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができ る。 この反応の結果、 一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。 さらに、 この反応中に铸型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が 再度生成される。
本発明では、 上記のような鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼを使用し、 鐯型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法を利用することができる。 鎖置換反応中に上記の铸型交換反応を行う能力を有する D NAポリメラーゼと しては、 例えば、 5 ' →3 ' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した B c a D NA ポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。 当該酵素は B c a B E S T D N Aポリメラーゼ （宝酒造社製） として市販されており、 また、 該酵素の遺伝 子を含有する大腸菌、 Escherichia coli H B 1 0 1 / p U I 2 0 5 (F E RM BP— 3720、 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 3 05-8566) 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 3年 5月 10曰 （原寄託日） に寄託） より B本特許第 2978001号に記載の 方法によって調製することもできる。
本発明の検出方法においては、 標的核酸の増幅の際に、 dUTPを基質として 取り込ませることができる。 したがって、 dUTPを基質に用いた場合には、 ゥ ラシノレ N—ク'リコシタ、、一ゼ (u r a c i 1 N— g l y c o s i d a s e : U NG) を利用して増幅産物を分解し、 増幅産物のキヤリ一オーバーコンタミネー ションによる偽陽性を防止することができる。
本発明の検出方法において上記の核酸増幅方法によって増幅された標的核酸を 検出するには公知の核酸検出方法、 例えば電気泳動により特定のサイズの反応産 物を検出する方法や、 プローブとのハイブリダイゼーシヨンによる検出等を使用 することができる。 さらに、 磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用 できる。 上記電気泳動による検出には、 通常、 ェチジゥムブロマイド等の蛍光物 質が使用されるが、 プローブとのハイブリダィゼーシヨンを組み合わせてもよい。 また、 プローブは放射性同位元素による標識の他、 ビォチンや蛍光物質のような 非放射性の標識を施したものが使用できる。 この他、 上記 （b) 工程において標 識ヌクレオチドを使用することにより、 増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ま せて検出を容易にすることゃ該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うこと ができ、 さらに蛍光偏光法、 蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも 可能である。 さらに、 適切な検出系を構築することにより、 標的核酸を自動的に 検出することや、 あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。 また、 ハイ プリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された 2種類以上の蛍光物質で標識されたリ ポヌクレオチド （RNA) プローブあるいはリポヌクレオチド及びデォキシリボ ヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発 明の検出方法に使用することができる。 当該プローブは蛍光を発することはない 力 これに相補的な標的核酸由来の増幅 DNAにァユーリングした場合、 RNa s eHは該プローブを分解する。 この結果、 プローブ上の蛍光物質間の距離が增 大して蛍光が発せられるようになり、 標的核酸の存在を知ることができる。 RN a s eHを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、 その反応液 中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。 当該プ ローブの標識に使用される蛍光物質としては、 例えば、 6-FAM(6- carboxyfluorescein)と T AMR A (N, N, N，， N， -tetramethyl-6- carboxyrhodamine)との組み合わせが好適に使用できる。
本発明の検出方法において等温下における增幅方法を用いる場合には、 サーマ ルサイクラーのような装置を必要としない。 また本発明の増幅方法では、 使用す るプライマーを 1種類もしくは 2種類と従来法よりも少なくすることができる。 dNTPのような試薬も PCR等で用いられるものを流用できるため、 ランニン グコストを従来法よりも低くすることができる。 そのため、 ルーチンワークを行 なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。 さらに、 本発明の方法は P CR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、 簡便、 迅速、 高 感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の検出方法を用いる場合には、 大量の検体を解析するために反応系を微 量ィ匕し、 さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。 その手段の一つとし て、 最先端の超微細加工技術を駆使して、 本発明の検出方法の基本プロセス、 例 えば、 DNAの細胞からの抽出、 核酸増幅反応、 目的 DNAの検出等のプロセス を数 c m角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものを組み合わせてもよい。 さらに、 必要に応じてゲル或いはキヤピラリー電気泳動、 検出用プローブとのハ ィプリダイゼーシヨンのプロセスを組み合わせてもよい。 該システムは、 マイク 口テツプ、 マづクロ CE c a p i 1 1 r y e l e c t o ph o r e s i s) チップあるいはナノチップとも呼ばれている。
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的の DN A断片が増幅さ れるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。 特に限定はさ れないが例えば、 I CAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適 に使用できる。 該方法を組み合わせることにより、 当該システムの単純化が可能 となり、 上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。 さら に、 本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。 本発明の検出方法においては、 特に限定はされないが例えば、 配列表の配列番 号 13〜16でそれぞれ表される塩基配列を有する結核菌群検出用キメラオリゴ ヌクレオチドプライマー、 配列表の配列番号 28〜 29でそれぞれ表される塩基 配列を有するリン菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一、 配列表の配列 番号 23〜 26でそれぞれ表される塩基配列を有するクラミジァ検出用キメラォ リゴヌクレオチドプライマ一、 配列表の配列番号 30〜 31でそれぞれ表される 核酸配列を有する H C V検出用キメラオリゴヌクレオチドプラィマーが好適に使 用できる。 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いて試料中の標的核酸 を増幅し、 電気泳動あるいはリアルタイム検出により目的の増幅産物を確認する ことができる。
さらに本発明の検出方法においては、 配列表の配列番号 1 1、 12、 38〜4 0でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される結核菌群検出用プ ローブ、 配列表の配列番号 27で表される塩基配列を含有する領域から選択され るリン菌検出用プローブ、 配列表の配列番号 22、 44でそれぞれ表される塩基 配列を含有する領域から選択されるクラミジァ検出用プローブ、 配列表の配列番 号 43〜45でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される HCV 検出用プローブを用いて標的核酸を検出することができる。
本発明の方法において等温核酸増幅方法を用いる場合、 必要な反応装置として は恒温層があればよく、 サーマルサイクラ一のような厳密な装置は必要ない。 ま た、 標識シグナルを測定する装置としては、 市販の分光光度計、 蛍光検出器、 プ レートリーダー等を使用することができる。 従って、 通常の検查業務を行ってい る所で、 大量迅速検体測定が可能である。 さらに、 本発明の方法に必要な試薬も 巿販されている。
本発明の方法を用いて H C Vの検出を行う場合、 検体から常法によつて抽出さ れた HCVの RNA、 逆転写反応用プライマー、 逆転写酵素 （逆転写活性を有す る DNAポリメラーゼを使用する場合は逆転写酵素は必要ない） 、 dATP、 d GTP、 dCTP、 11：丁？を含む(1^^丁？混合溶?夜を調製し、 一定温度で HC V— RNAから生成した cDNAを铸型として、 上記キメラオリゴヌクレオチド プライマー及び I CAN用 DNAポリメラーゼで標的核酸を増幅させ、 これに上 記蛍光標識プローブとホモジ-ァス系でハイプリダイゼーシヨンさせその蛍光強 度を測定する。 反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。
反応では、 まず、 HCV— RNAを鎵型として cDNAが合成され、 ついで、 この cDNAを铸型として I CAN法により DNAの増幅がおこる。 増幅 DNA は、 上記蛍光プローブと相補的な領域を含んでいるので、 蛍光プローブは一本鎖 状態の増幅 DN Aにハイプリダイズする。 蛍光プローブがハイプリダイズするこ とによって、 蛍光強度の抑制が解除され蛍光強度が増加する。 一方、 試料中に H C Vの RNAが存在しない場合はハイプリダイゼーションがおこらず、 蛍光強度 は抑制されたままで蛍光強度は弱い。 このため、 蛍光強度を測定することにより 簡便■迅速'高感度に試料中の HCVの RN Aを検出することができる。
本発明の方法では、 ホモジニァス系で洗浄工程無しに HCVの RNAを蛍光強 度として測定する。 本発明は蛍光色素を変え、 測定波長を変化させることで多項 目同時測定にも対応可能な点でも有利である。 すなわち、 血液センターでは HC Vのみでなく HBV、 HIV、 HTLVも重要な検査項目であり、 各々に特異的 な I CAN用のプライマーとプローブを用意し各プローブを測定波長の異なる蛍 光色素で標識することで上記項目を同時に測定することが可能である。 また、 反 応のェンドボイントでの蛍光強度を測定することで定性測定として血液センター など多量検体の高感度測定が可能となり、 一方、 反応をキネティックに蛍光測定 することで定量測定として治療のモニタリング用としての定量測定も可能である。 従って、 本発明の方法によれば、 従来の RT— PCR法のように温度を上げ下げ する複雑で特殊な機器が不要であり、 限られた時間、 設備内で大量に検体を測定 できない不便さも改良され、 洗浄工程が不要であり、 非常に便利である。
(3) 本発明のプライマー
本宪明の検出方法に用いられるプライマーとしては、 キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一が例示される。 該プライマーは、 デォキシリポヌクレオチド、 ヌク レオチドアナログ、 非修飾あるいは修飾リポヌクレオチドから構成され、 リポヌ クレオチドがその 3， 末端又は 3' 末端側に配置されたものが使用される。 例え ば、 下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドが I CAN法のプライマー として使用することができる。 一般式： 5 ' 一 d N a— N b _ d N c— 3，
( a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 d N： デォキシリポヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及び Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい）
なお、 上記のヌクレオチドアナログとしては、 例えば、 デォキシリボイノシン ヌクレオチド、 デォキシリボウラシルヌクレオチドあるいは修飾されたデォキシ リボヌクレオチド等、 また修飾リポヌクレオチドとしては、 例えば、 （ひ一S ) リボヌクレオチドを、 それぞれ使用することができる。
当該プライマーは、 铸型上の増幅が望まれる領域の 5 ' 側、 3 ' 側の塩基配列 をもとに、 5， 側の塩基配列に相同な配列を有するもの、 3 ' 側の塩基配列に相 補的なものの 2種を作成し、 増幅に使用される。
本発明においては、 例えば、 結核菌群を検出しょうとする試料について上記方 法による核酸増幅反応を実施したうえ、 増幅物と本発明のプローブとの間でのハ ィプリダイゼーシヨンを実施して結核菌群を検出することができる。 核酸増幅の ためのプライマーは、 配列表の配列番号 1 2に示した結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝 子の塩基配列を参考に、 各種の核酸増幅方法での使用に適したものを設計し、 作 製することができる。 特に限定はされないが、 例えば I S 6 1 1 0遺伝子中の配 列表の配列番号 3 9に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、 好ましく は配列表の配列番号 4 0に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、 さら に好ましくは配列表の配列番号 3 8に示される塩基配列あるいはその一部を含む 領域を増幅できるものが本発明に好適である。 さらに、 配列表の配列番号 1 1記 0遺伝子もしくはその断片の増幅に有用である。
本発明においては、 上記結核菌群の検出と同様に、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vを検出するためのプローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いるこ とにより好適に検出することができる。
当該プライマーは上記の塩基配列に限定されるものではなく、 当該塩基配列周 辺、 すなわち当該配列にその一部が重複した配列を有するものが本発明に好適に 使用できる。 すなわち、 使用する核酸増幅方法の特徴に応じて当該配列に重複す る適切な塩基配列を選択し、 プライマーを作成することができる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 任意の核酸配列を持つよう に、 例えばアプライド バイオシステムズ社 （A B I社、 Applied Biosystems
Inc. ) の D NAシンセサイザー 3 9 4型を用いて、 ホスホアミダイト法により合 成できる。 また、 別法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、 チォ ホスホネート法等があるが、 いかなる方法で合成されたものであっても良い。
I C AN法により核酸増幅を行うためのプライマーとしては、 当該方法に使用 できるようにプライマーの 3 ' 末端部分のデォキシリポヌクレオチドをリポヌク レオチドに置換すればよい。 このようなプライマーの一例として、 配列表の配列 番号 1 3〜 1 6、 2 3〜 2 6、 2 8〜 3 1にそれぞれ塩基配列を示すキメラオリ. ゴヌクレオチドプライマ一が挙げられる。
さらに、 これらのプライマーは適切な物質、 例えば蛍光物質、 色素、 リガンド 類 （ピオチン、 ジゴキシゲェン等） 、 または金コロイド等で標識されていてもよ く、 例えば、 リガンド類で標識したプライマーを使用することにより、 増幅され た標的核酸を担体に捕捉させるなど、 高感度で簡便な定量性をもった測定方法が 提供される。 この場合、 固相としてはマイクロタイタープレート、 ビーズ、 マグ ネチックビーズ、 メンブラン、 またはガラス等が例示される。
喀痰検体からの抽出 D N A試料中には、 ヒト D N Aのみならず気道常在細菌な らびにウィルス由来の D NAが含まれる。 従って、 本発明で開発されたプライマ 一の特異性を調べるため、 結核菌の感染病歴のないポランティアからの喀痰を検 体として結核菌群遺伝子の増幅を試みた。 このような試験で陽性結果がでないこ とが本プライマーの特異性の証明となりうる。 3 8名のポランティアから採取さ れた喀痰からの抽出 DN Aに対し、 上記のキメラオリゴヌクレオチドプライマー を用いた I CAN法による I S 6110遺伝子断片の増幅を行った。 その結果、 陽性結果は 1例も認められず上記のプライマーの結核菌への特異性の高さが実証 され、 非 I S 6110標的 DNAを偽陽性にしないことが示された。
(4) 本発明の組成物
本発明は、 前述 （2) の本発明の検出方法に使用される組成物を提供する。 該 糸且成物としては、 例えば、 上記 （1) に記載のプローブならびに上記 （3) に記 載のプライマーを含有するものが挙げられる。 あるいは、 上記プローブを含む検 出用組成物及ぴ上記プライマーを含む増幅用組成物の形態であってもよい。 さら に、 酢酸マグネシウムを含む組成物及びプライマーを含む組成物の形態であって もよい。 さらに、 緩衝成分や d NT P等を含んでいてもよい。 さらに、 修飾され たデォキシリボヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログ を含有していてもよい。 さらに、 本発明の組成物中の試薬の分解'失活等による 非増幅状況 （偽陰性） 確認のための内部標準 （I C ; i n t e r n a l c o n t r o 1) を含有していてもよい。 当該内部標準は、 本発明のプライマーにより 增幅することができる。
また別の態様としては、 本発明の検出方法に適した組成で上記の各種成分が含 有された組成物を挙げることができ、 該組成物は適切な鍀型とキメラオリゴヌク レオチドプラィマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。 さらに、 増幅対象があらかじめ明らかである場合には、 当該増幅対象の増幅に適したキメ ラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有する組成物が好適である。
特に好適な態様としては、 本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成 分が含有された組成物を挙げることができ、 該組成物は適切な铸型を添加するの みで増幅反応を実施することができる。 さらに、 検出用プローブを含んでいる場 合には、 リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができる。 特に限定されないが例えば、 HCVの検出において本発明の方法、 該方法のた めの組成物あるいはキットを用いることにより、 従来のアンプリコア HCVキッ トが 2オーダーの測定範囲にあつたのに比較して 3オーダーまで測定範囲を広げ ることができる。 また、 従来のアンプリコア HCVキットでは、 所用時間が約 5 時間であつたのに比較して、 本発明では約 45分間と大幅に所用時間を短縮する ことができる。 従って、 こ までよりも 1日に処理できる検体数を増大させるこ とが可能である。
(5) 本発明のキット
本発明のキットは、 病原微生物由来の標的核酸の検出のためのキットであり、 特に限定はされないが、 p H 7を越えるアル力リ条件下で標的核酸とハイブリダ ィズ可能なプローブ、 特に限定はされないが例えば、 上記 (1) 記載のプローブ を含有することを特徴とする。
また、 本発明のキットの一態様としては、 結核菌群の検出のためのキットが挙 げられる。 該キットは、 My c o b a c t e r i um t u b e r c u l o s i s、 My c o b a c t e i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i u m a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i及び、Z 又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを特異的に検出可能なプロ一 ブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 p H 7を越えるアル力リ条件下 で結核菌群の検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットの一態様としては、 リン菌の検出のためのキットが挙げ られる。 該キットは、 Ne i s s e r i a g o n o r r h o e a eを特異的に 検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 pH7を越え るアル力リ条件下でリン菌の検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットのー態様としては、 クラミジァの検出のためのキットが 挙げられる。 該キットは、 Ch l amy d i a t r a c h oma t i sを特異 的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 pH7を 越えるアル力リ条件下でクラミジァの検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットのー態様としては、 HCVの検出のためのキットが挙げ られる。 該キットは、 HCVを特異的に検出可能なプローブを含有することを特 徴とする。 当該キットは、 pH 7を越えるアルカリ条件下で HCVの検出に用い ることもできる。
さらに上記キットにおいては、 別の実施態様としてプライマ^ "を含有してもよ い。 さらに、 標的遺伝子を増幅する核酸増幅法のための試薬 （DNAポリメラー ゼ等） 、 プローブの検出反応に使用される試薬、 検体からの核酸の抽出に使用さ れる試薬等を含むキットであってもよい。 該キットは、 本発明の結核菌群等の検 出方法を簡便、 かつ迅速に実施するうえで好適である。 当該キットは、 特に多数 の試料について結核菌群等の存在を調べる際に、 高い再現性、 信頼性で検査結果 を与えることができる。 さらに、 偽陰' I"生確認のための内部標準 （I C； i n t e r n a 1 c o n t r o l ) 、 該内部標準検出用のプローブを含有していてもよ い。 当該内部標準は、 本発明のプライマーにより増幅することができる。
さらに 1つの実施態様において、 該キットは、 パッケージされた形態において、 本発明のプローブ、 プライマー、 D N Aポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼ の使用のための指示書を含むことを特徴とする。 さらに、 市販の D N Aポリメラ ーゼおよび/またはェンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、 使用してもよ い。 さらに、 R NAを錶型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。 D N Aポリメラーゼは、 上記の D N Aポリメラーゼから選択することができる。 また、 ェンドヌクレアーゼは、 P f u由来 R N a s e H I Iあるいは A f u由来 R N a s e H I Iのいずれかから選択することができる。
上記 「指示書」 とは、 当該キットの使用方法、 例えば鎖置換反応用試薬液の調 製方法、 推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、 パンフレットまたはリ 一フレット形式の取り扱 、説明書のほか、 キットに添付されたラベル、 キットが 納められたパッケージ等に記載されたものを含む。 さらに、 インターネットのよ うな電子媒体を通し、 開示、 提供された情報も含まれる。
また、 本発明のキットにおいては、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩ある いはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及ぴァニーリング溶液が含まれ ていてもよい。 また、 D NAポリメラーゼゃ R N a s e Hが含まれていてもよい。 さらに、 修飾されたデォキシリポヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3 リン酸のアナログを含有していてもよい。
本発明のキットにおいて、 検出用プローブを適宜選択することにより、 リアル タイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができるキットが提供される。 ( 6 ) 本発明の核酸抽出方法
本発明は、 高感度に結核菌等を検出するための核酸抽出方法を提供する。 すな わち、 臨床標本からの核酸抽出は、 デリケートで困難な工程であり、 尿、 胸水、 髄液、 血液などの液体検体から、 膿、 喀痰などのような濃厚粘性検体、 さらには 細胞、 組織といったものまでその対象は幅広い。 現在、 これら検体から結核菌等 の遺伝子を抽出するスタンダードな方法は存在せず、 従って現在まで報告された 結核菌等の遺伝子検査における報告では、 様々な核酸抽出方法が用いられている。 これら従来法では各種界面活性剤、 アルカリ、 有機溶媒、 またはカオトロピック 試薬を含む試薬中で混合したり、 ガラスビーズ存在下で超音波処理をすることで 実施されていた。
本 明者らは上記の各種の従来法と、 これまで L i s t e r i a属、 L a c t o b a c i 1 1 u s属ならびに S t r e p t o c o c c u s属カ らの核酸 ί由出に 用いられていたムラミダーゼ （mu r am i d a s e、 放線菌 S t r e p t om y c e s g l o b i s p o r u s由来のものが、 ムタノリシン
(mutanolysin) としてシグマ社より発売） を結核菌に使用する方法を比較し、 結核菌をムラミダーゼ消化する方法が最も優れていることを発見した。 また、 該 酵素で消化した菌体を 5分間煮沸処理することでさらに優れた結果が得られるこ とを発見した。
結核菌を含有する試料をムラミダーゼで 30分処理し、 次レ、で 96 °C、 5分間 の処理を行った後に I CAN法で遺伝子を増幅し結核菌の検出を試みた。 この結 果、 驚くべきことに、 従来の界面活性剤などの試薬を用いた場合に比べ 10倍高 い感度で結核菌 DN Aを検出することができ、 これは結核菌 5ゲノムコピーに相 当する検出感度であることが解った。
上記の一連の検出操作は、 従来の界面活性剤やカオト口ピック試薬を用いた方 法において核酸抽出液中に混入する成分の核酸増幅反応への阻害効果を排除する ことができる。 さらに、 加熱処理を加えることで結核菌等に対する殺菌効果も生 まれ、 従来検査員を悩ませていた検査室での結核菌等の感染を予防できる効果も 生まれるというメリットを持つ。 従って、 本プロトコールの発明は、 迅速に、 安 全に、 かつ高感度に結核菌等の DNAを抽出することができる。
例えば試料として、 喀痰を使用する場合には、 まず公知の喀痰処理方法である NAL C (N— a c e t y l— L— c y s t e i n e) _N a OH法で喀痰を処 理した後、 上記の本発明の核酸抽出方法を実施することが好適である。 すなわち、 本発明の検出方法において、 結核菌等を含有する検体をムラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含していてもよい。
上記の本発明の検出方法に使用される全てのプロトコール、 すなわちプローブ、 プライマー、 核酸の抽出法、 核酸增幅法は、 極めて迅速で信頼性があり、 力つ高 感度な結核菌等の検出を可能とする。 該方法を用いれば、 検体の採取から結果報 告までを 3時間以内に完了することができ、 6時間を要した従来のキット （例え ばロシュ社製キット） に比べ、 検査時間が 1Z2に短縮された。 つまり本発明の 方法は同日中に検査結果を提供でき、 感染患者の一刻も早い隔離を可能とし、 公 衆衛生上、 結核の伝播を早期に予防できるという多大な社会的貢献をもたらす。 以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は実施例の範 囲に限定されるものではない。 また、 本発明に基づき、 キャリーオーバーによる 増幅産物のコンタミネーションを防ぐ改良や、 内部標準物質や他の結核菌等の遺 伝子を同時增幅、 検出する改良は、 いずれも当業者に容易に類推される改良であ る。
実施例
以下に本発明を実施例に基づき具体的に説明する力 本発明は、 下記実施例に よって限定されるものではない。
参考例 1 ピロコッカス フリオサスの RNa s eH I I遺伝子のクローニン グ
(1) ピロコッカス フリオサス ゲノム DNAの調製
トリプトン （ディフコラボラトリーズ社製） 1°ん 酵母エキス （ディフコラボ ラトリーズ社製） 0. 5%、 可溶性でんぷん （ナカライテスタ社製） 1%、 ジャ マリン S ·ソリッド （ジャマリンラボラトリ一社製） 3. 5 %、 ジャマリン S■ リキッド （ジャマリンラボラトリー社製） .0. 5% , Mg S04 0. 00
30/o、 N a C 1 0. 001 %、 F e S 04 · 7 H2 O 0. 0001 %、 C o S O
4 0. 0001%、 C a C 12 - 7 H2 O 0. 0001%、 Z n S 04 0. 00 01%、 Cu SO4 ■ 5H20 0. 1 pm, KA 1 (S04)2 0. 1 m, H3 B04 0. l p m, Na2MoQ4 - 2H20 O. l p m, N i C l2 - 6H20 0.25 p pmの糸且成の培地 2リットノレを 2リットスレ容のメジユウムポトノレにい れ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込み、 溶存酸素を除去し、 これにピロコッカス フリオサス (Pyrococcus furiosus、 ドイツチェ ザムノレン ク フォン ミクロオルガ-スメンより購入： DSM3638) を接種して、 9 5°C、 16時間静置培養した後、 遠心分離によって菌体を得た。
次に、 得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mM Tr i s—HC l (p H8. 0) に懸濁し、 0. 4m 1の 1 OmgZm 1塩ィ匕リゾチーム （ナカラ ィテスタ社製） 水溶液を加えて、 20 °Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この 反応液に 24m 1の 15 OmM Na C l、 1 mM EDTA、 2 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 2 Om g/m 1プロティナーゼ K
(宝酒造社製） 及び 2mlの 10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 3 7°Cで 1時間保温した。
反応終了後、 フエノールークロロホルム抽出、 続いてエタノール沈殿を行い、 約 1 m gのゲノム DN Aを調製した。
(2) RN a s e H I I遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ （Pyrococcus horikoshii) の全ゲノム配列が公開さ れており 〔DN A リサーチ （DM Research) 、 第 5卷、 第 55— 76頁 （19 98) 〕 、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子 （PH1650) 力 S 1つ存在することが明らかになつている （配列番号 1、 日本国 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ： http：〃 www. nite.go.jp/)。
そこで、 この PH1650遺伝子 （配列番号 1) と一部公開されているピロコ ッカス フリオサスのゲノム酉己歹 IJ (University of Utah, Utah Genome Centerホ ームへーシ： http://www. genome. Utah, edu/ sequence, html) でホモロシー検索を おこなった。 その結果、 非常にホモロジ一の高い配列が見つかった。
得られた配列もとにプライマ一 1650Nd e (配列番号 2 ) 及び 165.0 B am (配列番号 3) を合成した。
上記 （1) で得たピロコッカス フリオサス ゲノム DNA 20 O n gを铸 型にして、 20 pmo lの 1650Nd e及ぴ 20 pmo 1の 1650B a を プライマーに用い、 100 Z 1の容量で PCRを行った。 PCRでの DNAポリ メラーゼはタカラ Exタック （宝酒造社製） を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 3 0サイクル行った。 増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及ぴ B amH I (ともに宝酒造社製)で消化し、 得られた DNA断片をプラスミドベクター; pE T 3 a (ノバジェン社製） の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミ ド p
PFU220を作製した。
(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
上記 (2) で得られた p P F U 220の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキ シ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると 考えられるオープンリーディングフレーム （OR F、 o e n r e a d i n g f r ame) が見出された。 このオープンリーディングフレームの塩基配列を配 列表の配列番号 4に示す。 また、 該塩基配列から推定される RNa s eHI Iの ァミノ酸配列を配列表の配列番号 5に示す。
なお、 プラスミド p P F U 220で形質転換された大腸菌 J M 109は、
Escherichia coli JM109ZpPFU220と命名、 表示され、 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) ] に平成 1 2年 9月 5日 （原寄託日） より受託 番号 FERM P— 18020として寄託され、 ブタペスト条約のもと前記独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 13年 7月 9日 （国際 移管日） より FERM B P— 7654として移管されている。
(4) 精製 RN a s eH I I標品の調製
上記 （2) で得られた； PFU220を大腸菌 HMS 174 (DE3) (ノバ ジェン社製） に形質転換し、 得られた p P F U 220を含む大腸菌 HM S 174 (DE3) を 100 g/m 1のアンピシリンを含む 2リットルの LB培地に植 菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって集めた菌 体を 66. Om 1のソ-ケーシヨンバッファー 〔5 OmM Tr i s—HC l
(p H8. O) 、 1 mM EDTA、 2 mMフエエルメタンスルフォニルフルォ ライド〕 に懸濁し、 超音波破砕機にかけた。 この破砕液を 12000 r pmで 1 0分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 6 0°C 1 5分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 1 2000 r pmで 1 0分の遠心分離を行い、 上清を集め、 6 1. 5 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) ImM EDTA] で平衡ィ匕した R E S OUR S E Qカラム （アマシャ ム ブアルマシア バイオテク社製） に供し、 F P LCシステム （アマシャム ファノレマシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その 結果、 RN a s e H I Iは RE SOURS E Qカラムを素通りした。
素通りした RN a s e H I I画分 6 0. Om 1をバッファー Aで平衡化した R E S OUR S E Sカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供 し、 F P LCシステムを用いて 0 5 0 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶 出し、 約 1 5 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得 この RN a s e H I I画分 2. Om lをセントリコン一 1 0 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 2 5 0 μ 1の濃縮液を 1 0 OmM N a C l 0. ImM EDTAを含む 5 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 0 ) で平後 ί 化した S u ρ e r d e χ 2 00ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシア ノ ィォテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e H I I は、 1 7キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分子量は、 R N a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RN a s e H I Iを P f uRN a s e H I I標品とした。 上記で得られた P ί u RN a s e H I I標品を用いて下記の方法により RN a s e H活性を測定した。
1 OmM T r i s -HC 1 (pH 8. 0) 、 1 mMジチオスレィトール （ナ 力ライテスタ社製） 、 0. 00 3%ゥシ血清アルブミン （フラクション V、 シグ マ社製） 、 4%グリセロール、 20 /i g/m lポリ （d T) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製） 、 3 0 μ g/m 1ポリ (r A) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製） を混合し、 3 7°Cで 1 0分間保温した。 これを RN a s e H活性を測定するための基質液として使用した。 100^ 1の基質液に Ι μ ΐの 1M MnC 12を加えて 40 °Cで保温し、 こ れに上記の P f u RNa s eH I I標品を適当に希釈したものを加えて反応を 開始した。 40°Cで 30分間反応を行った後、 10 1の0. 5M EDTAを 加えて反応を停止し、 260 nmにおける吸光度を測定した。
その結果、 上記の P f u RNa s eH I I標品を添加した反応液では、 先に
10 1の 0. 5Μ EDTAを加えた後にこれを添加したものに比べて 260 nmにおける吸光度の値が高かった。 よって、 当該標品が RNa s eH活性を有 することが明らかになった。
参考例 2 A f u RNa s eH I Iの調製
アルカェォグロバス フルギダスの RNa s e H I I遺伝子のクロー-ング
(1) アルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNAの調製
ァメレカェォグロバス フルギダス （Archaeoglobus fulgidus、 ドイツチェ ザムノレンク フォン ミクロオノレガニスメン ゥント ツエノレクルツレン Gmb Hより購入： D SM4139) 8 m 1相当分の菌体を集め、 100 1の25% ショ糖、 50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) に懸濁し、 20 μ 1の 0. 5Μ
EDTA、 10 1の 1 Omg/ml塩ィ匕リゾチーム （ナカライテスタ社製） 水 溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応液に 800 μ 1の 150mM Na C l、 1 mM EDTA, 20mMトリス一 HC 1 ( H 8. 0) 、 10 1の 2 OmgZm 1プロティナーゼ K (宝酒造社製） 及び 50 1の 10 %ラウリノレ硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37 で 1時間保温した。 反応終了後、 フエノール一クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿、 風乾した後に 5 0 μ 1の Τ Εに溶解してゲノム D Ν Α溶液を得た。
(2) RNa s e H I I遺伝子のクロー-ング
アルカェォグロバス フルギダス （Archaeoglobus fulgidus) は全ゲノム配歹 が公開されており 〔K1 e nk， HPら、 ネイチヤー （Nature) 、 第 390卷、 第 364— 370頁 （1997) 〕 、 RNa s eHI Iのホモログをコードする 遺伝子 （AF 0621) が 1つ存在することが明らかになつている （配列番号 6、 http： //www. tigr. org/tdb/CMR/btm/htrals/SplashPage. html) 0
そこで、 この AFO621遺伝子 （配列番号 6) の配列をもとにプライマー A f uNd e (配列番号 7 ) 及び A f uB am (配列番号 8 ) を合成した。
上記 （1) で得たアルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNA 30 n g を铸型にして、 20 m o 1の A f uNd e及び 20 p m o 1の A f u B a mを プライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポ リメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） を添付のプロトコ ールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 40サイクル行った。 増幅した約 0. 6 kbの DNA断片を N d e I及び B amHI (ともに宝酒造社製）で消化し、 得られた DNA断片をブラ スミドベクター： TV 119Nd (p TV 1191^の1^ o Iサイトを Nd e I サイトに変換したもの） の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミド p A FU 204を作製した。
(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
上記 (2) で得られた; p A F U 204の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキ シ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると 考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。 このオープンリ一ディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 9に示す。 また、 該塩基配列から推 定される RNa s eH I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 10に示す。 なお、 プラスミ ド PAFU204で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli J 109/pAFU204と命名、 表示され、 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) ] に平成 13年 2月 22日 （原寄託日） より受 託番号 FERM P—18221として寄託され、 プタぺスト条約のもと前記独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 13年 8月 2日 （国 際移管日） より FERM BP— 7691として移管されている。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
上記 （2) で得られた pAFU204で大腸菌 JM109を形質転換し、 得ら れた p AFU204を含む大腸菌 JM109を 100 w gZmlのアンピシリン を含む 2リットルの LB培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終 了後、 遠心分離によって集めた菌体を 37. lm 1のソニケーシヨンバッファー 〔50111]\1トリスー《[〇 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mMフエ二ノレ メタンスルフォニルフルオラィド〕 に懸濁し、 超音波破石權にかけた。 この破碎 液を 12000 r 1)111で10分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 70°C、 1 5分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を 行い、 上清を集め、 40. 3 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA〕 で平衡化した R E S OU R S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s eHI Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファー Aで平衡化した RES OURS E Sカラム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RN a s eH I Iは RESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りした RNa s eH I I画分 40. Omlを 50mM N a C 1を含むバ ッファー B 〔50mMトリスー HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 1 を外液として、 2時間の透析を 3回行なつた。 透析後の酵素液 40. 2 m 1を 5 OmM N a C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i Tr a p-h e p a r i nカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシス テムを用いて 5 O〜550mM Na C l直線濃度勾配により溶出した。 その結 果、 約 24 OmM NaC 1のところに溶出された RN a s eHI I画分を得た。 この RNa s eHI I画分 7. 8 m 1をセントリコン一 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 約 600 1の濃縮液を 4回に分けて 100m M Na C l、 0. ImM E D T Aを含む 50 mMトリス一HC 1 (pH7.
0) で平衡化した Su p e r o s e 6ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e HI Iは、 30. 0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分 子量は、 RNa s eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。 こうして溶 出された RNa s eHI Iを Af u RNa s eH I I標品とした。
上記で得られた A f u RNa s e H I I標品を用いて、 参考例 1一 （4) に 記載の方法により酵素活性を測定した結果、 Af u RN a s e H I I標品に R Na s e H活性が認められた。
本発明の方法に使用される耐熱性 RNa s eHのュ-ット数は、 次の方法によ り算出した。
ポリ (r A) 及びポリ (d T) (ともにアマシャム フアルマシア バイオテ ク製） lmgをそれぞれ ImM EDTAを含む 40mM トリス _HC 1 (ρ Η7. 7) 1m lに溶解し、 ポリ （rA) 溶液及びポリ （dT) 溶液を調製した。 次に、 4mM MgC l2、 1 mM DTT、 0. 003%B S A, 4%グリ セロールを含む 40mM トリス一 HC 1 (pH7. 7) に、 終濃度 20 μ gZ mlとなるポリ （rA) 溶液、 終濃度 30μ §Ζιη1となるポリ （dT) 溶液を 加え、 37°Cで 10分間反応後、 4°Cに冷却し、 ポリ （rA) —ポリ （dT) 溶 液を調製した。 このポリ （rA) —ポリ （dT) 溶液 100/ 1に任意に希釈し た酵素液 Ι μ ΐを加え、 40°Cで 10分間反応させ、 0. 5M EDTA 10 μ 1を加えて反応を停止させた後、 260 nmの吸光度を測定した。 対照として、 上記反応液に 0. 5M EDTA Ι Ομ Ιを加えた後、 40°Cで 10分間反応 させ、 吸光度を測定した。 その後、 EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度か ら対照の吸光度を引いた値 （吸光度差） を求めた。 すなわち、 酵素反応によって ポリ （rA) —ポリ （dT) ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸 光度差から求めた。 RNa s eHの 1単位は、 1 n m o 1のリボヌクレオチドが 遊離したのに相当する A26。を 10分間に増加させる酵素量とし、 下記の式に従 つて算出した。
単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量 （m l) ] /0. 0152X (1 10 /100) X希釈率
参考例 3
本発明の方法に使用される常温性 RNa s eHのュ-ット数は、 以下の方法で 測定した。
(1) 使用する試薬液の調製 力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ 40 mM トリス一塩酸 (pH7. 7、 37°C) 、 4mM 塩化マグネシウム、 1 mM DTT、 0. 003% B SA、 4%グリセロール、 2 Α μΜ ポリ （dT) になるように滅菌水で調製した。 ポリ [8— 3H] アデ-ル酸溶液： 370 k B qのポリ [8—3H] アデニル酸 溶液を 200〃 1の滅菌水に溶解した。
ポリアデエル酸溶液：ポリアデ-ル酸を 3 mMになるように滅菌超純水で希釈 した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ 25 mM トリス—塩酸 （pH 7. 5、 3 7°C) 、 5mM 2—メルカプトエタノール、 0. 5 mM EDTA (pH7. 5、 37°C) 、 3 OmM 塩化ナトリウム、 50 %グリセロールになるように滅 菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺 D N Aの調製：子牛胸腺 D NA 200mgを TEバッファー 1 00m lに懸濁し、 膨潤させた。 該溶液の UV 260 nmの吸光度を測定し、 lmg/m 1の濃度に滅菌超純水で希釈した。 次に、 該溶液を 100°Cで 10分 間加熱後、 氷浴中で急冷した。
(2) 活性測定方法
上記 （1) で調製した力価測定用反応液 9 85 1にポリ [8— 3H] アデェ ル酸溶液 7 /2 1を加え 3 7°Cで 10分間保持した。 次にポリアデュル酸を最終濃 度が 24 Mになるように 8 /z 1加え、 さらに 3 7°Cで 5分間保持した。 このよ うにしてポリ [8—3H] r A—ポリ dT反応液 1 00 1を調製した。 次に、 該反応液 200 ^ 1を分取し、 30°Cで 5分間保持した後、 任意の希釈系列で希 釈した酵素液 1 μ 1を加え、 これらの反応液を経時的に 50〃 1ずつサンプリン グして、 後の測定に用いた。 酵素添加からサンプリングまでの間の時間を Υ分と した。 また、 全 CPM用反応液 50 1およびプランク用反応液 50 1は、 酵 素液の代わりに酵素希釈液を 1 μ 1加えて調製した。 該サンプリング溶液に 10 OmMピロリン酸ナトリウム 1 00 / 1、 熱変性子牛胸腺 DN A溶液 50 μ 1お よび 10%トリクロ口酢酸 300 μ 1 (全 C ΡΜ測定の場合は、 超純水 300 1 ) を加え、 0°Cで 5分間保持後、 l O O O O r pmで 10分間遠心した。 遠心 後、 得られた上清 250 μ 1をバイアルに入れ、 アクアゾルー 2 (ΝΕΝライフ サイエンスプロダクツネ土製) 1 Om lを加え、 夜体シンチレーションカウンタ 一で CP Μを測定した。
(3) ュニット計算
各酵素のユニット （Unit) 数は、 以下の計算式で算出した。
Unit/ ml ={ (測定した C PM—ブランク C PM) X 1. 2* X 20 X 1 0 00
X希釈率 } X 200 (μ I ) / (全 CPMXY分 X 50 (μ 1 ) X 9*つ
1. 2* ：全 C PM中に含まれるポリ [8—3 H] r A—ポリ dTの 5 0 μ 1当 たりの n m o 1数
9** ：補正係数
実施例 1
(1) 喀痰からの DN A抽出
米国 CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) が推奨する N A LC法により喀痰を処理した。 すなわち、 喀痰を 5 Om l容のスクリューキヤ ップ付チューブに入れ、 等量の NALC液 （0. 1M クェン酸ナトリウム 5 0 m 1と 4 %水酸化ナトリウム 5 0m lの混合液に 0. 5 gの N—ァセチルー
L一システィンを加えたもの） を加え、 試験管ミキサーで 20秒間良く力き混ぜ 検体を液状にした。 室温で 1 5分間放置した後、 リン酸緩衝生理食塩水 (PB S) で全量を 5 Om 1とし、 次いで 3000 g以上で 20分遠心し沈殿を採取し た。 この沈殿に 5 C 1の溶解緩衝液 [lysis buffer； 1単位のムタノリシン (mutanolysin、 シグマ社製） を含有する 1 0 mM HE PE S緩衝液 (pH 7.
8) ] を加えよく混和する。 3 7°Cで 30分反応し、 ついで 5分間水浴中煮沸ま たは 9 6 °Cのヒートプロック中で加熱処理した。 必要な場合は微量高速遠心器に より遠心し、 その上清を分取した。 以上の操作により調製された上清を喀痰から の DN A抽出液として以降の操作に用いた。 さらに、 G e nとるくん酵母用 （宝 酒造社製） も使用取扱説明書に従い、 核酸抽出に使用した。
(2) プローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製
結核菌群由来の I S 61 10遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチ ドプロープを Ge n B a n k Ac c e s s i o n No. X 52471記載の 塩基配列をもとに作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 1 1に示す塩基配列か
計らなり、 5， 末端に F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） が付された オリゴヌクレオチドプローブ MT I S— 2 B Fを DNA合成機により合成した。 結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝子由来の DNA断片を I CAN法で合成するための キメラオリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表の配列番号 1 2に示された結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝子の塩基配列をもとに、 配列表の配列番 号 1 3に示された塩基配列からなるフォワードプライマー MT I S— 2 F、 配列 表の配列番号 1 4に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にピオチンが付加され たリバースプライマー MT I S 2— RB i oをそれぞれ DNA合成機により合成 した。 同様に配列表の配列番号 1 5に示された塩基配列からなるフォワードブラ ィマー K— F 1 0 3 3— 2、 配列表の配列番号 1 6に塩基配列からなり、 5 ' 末 端にビォチンが付加されたリバースプライマー K一 R 1 1 3 3 - 2B i oをそれ ぞれ DN A合成機により合成した。
(3) I CAN法による增幅
表 1に示す I CAN反応のための反応液を調製し、 60°Cで 30分ィンキ： 一トした。
コンホーネント
(β 1 )
5 X反応緩衝液 (ρ Η7. 8) 1 0 l O OmM 酢酸マグネシウム 2
1 0 mM dNTP s (宝酒造社製） 2. 5 プライマー MT I S— 2 F (1 00 /iM) 0. 5 プライマー MT I S— 2 RB i o ( 1 00 /z M) 0. 5
P f u RN a s e H I I (6 3 n g/μ 1 ) 0. 5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社製、 8 /μ 1 ) 0. 5
DNA抽出液 1
H20 3 2. 5
50 μ 1
5 X反応緩衝液の組成：
1 0 OmM HE PE S—水酸化カリウム （p H 7. 8)
50 OmM 酢酸カリウム 5% ジメチルスルフォキシド （DMSO)
0. 05% ゥシ血清アルブミン （ B S A)
また、 同様に K— F 1033-2/K-R 1133— 2プライマーの糸且み合わ せでも I CAN増幅反応を行った。 反応終了後、 上記反応液の一部を電気泳動に 供して、 目的の増幅断片を確認した。
(4) 固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン （ナカライ社製） を PBSに の濃度に溶解し、 この溶液を白色発光検出用 96ゥェ マイクロタイタープレートに 15 Oju 1ノ ウエノレとなるように添力 し、 4 °Cで一晩放置し、 固定ィ匕した。 ストレブトァビジ ン溶液を捨てた後、 1 % B SA-PB S溶液を 200μ 1/ゥエルとなるよう に分注して 4 °Cでー晚放置し、 ブロッキングを行った。 この溶液を捨てたものを ストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液 [ 1 % TritonX- 100、 1 % B S Aを含む 5 X S S C] 50 μ 1 /ゥエルを加え、 実施例 1一 （3) で MT I S— 2 F/MT I S 2— RB i οプライマーの組み合 わせで得られた増幅断片を含む I CAN反応液を 10 /i 1 /ゥェルずつ添加して 良く混合し、 室温で 15分間反応させ、 プレート表面に捕捉させた。 次に DNA 変性液 （ 0. 1 N NaO H溶液） を 5 μ 1 /ゥエルずつ添加し、 良く混和して 3分間の DNA変性を行い、 プレート表面に捕捉された二本鎖 DNAを一本鎖 D Ν Αに変性した。 引き続き上記のプローブ MT I S 2BFを 5 pmo 1 Zm 1と なるようにハイプリダイゼーシヨンバッファーに希釈し、 これを 100 1 ゥ ェノレずつ添加してよく混合し、 室温で 40分反応させた。 この時、 各ゥエルの p Hは 13~14であった。 反応後、 ゥェル内の溶液を捨て、 200μ ΐ Ζゥエル の洗净パッファー [25mM Tr i s—塩酸 （pH7. 5) 、 150mM N a C l、 1% BSA、 0. 05 % T w e e n 20] で 2回ゥエルを洗浄する。 その後、 パーォキシダーゼ標識抗 F I TCゥサギ抗体 （ケミコン社製） をハイブ リダイゼーションバッファーに 2 μ g/m 1に溶解したものを 100^ 1 /ゥェ ルずつ添加し室温で 20分反応させた。 反応後、 液を捨て、 200 μ 1 Zゥエル の洗浄バッファーで 4回ゥエルを洗浄した後、 発光基質 [SuperSignal ELISA Pico Substrate (ピアス社製） ] を 1 ΟΟμ 1/ウエノレずっ添加し、 直ちに発光 プレートリーダー （ラボシステムズ社製） で相対発光強度を測定した。
(5) 検出感度の検討
0、 5および 10コピー相当の結核菌群ゲノムを含む喀痰由来 DN Α試料につ き、 上記のとおり結核菌群 DNAの検出を実施した。 その結果、 表 2に示すよう に 5コピーにおいても S/N比で約 300倍という強い発光が検出できた。
ゲノム 装置発光強度 （RLU)
0コピー 11
5コピ一 3078
10コピー 6287 以上のように、 本発明により、 迅速かつ高感度な結核菌の検査が可能であるこ とが示された。 また、 本発明の結核菌の検出方法において、 本発明の核酸抽出方 法及び G e nとるくん酵母用試薬を用いた方法のいずれの方法においても好適に 利用できることを確認した。 従って、 操作法の簡便さから見て、 本宪明の核酸抽 出方法の有用性が確認できた。
実施例 2
結核菌感染の疑いを持たれた患者 26例から喀痰を採取し、 実施例 1記載の操 作に従って結核菌 DNAの検出を行った。 また、 同一検体を用いて、 既存の 16 S r RNAをコードする DNAをターゲットとした P CR法に基づくキットで あるアンプリコア マイコバクテリゥムッベルク口シス （ロシュネ： t¾) を用いた 検出、 小川培地による培養法による結核菌検査を実施した。 その結果を表 3に示 す。 表 3
小川培養法 陽性例 (n=9) 陰性例 (n= l 7) 遺伝子増幅法 PCR法 本発明法 PCR法 本発明法 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性
8 1 9 0 2 15 0 17 表 3に示したように、 本発明法は培養検査の結果と良く一致したが、 P C R法 では培養法で陰性であった 2例が偽陽性として検出され、 また、 培養法陽性の 1 例が偽陰性として検出された。
すなわち従来の方法に比べ本発明の方法は正確な検査結果を超迅速に簡便に得 られることが確認できた。
実施例 3
本発明の検出方法の結核菌群に対する特異性について検討した。 ゲノム D NA は、 表 4に示す 3 7株を使用した。
iviy ODd um c Li U Ut)
j JL 1 U. OU , d. V u【u . dgcl <Λ dfci
M ah ς oi o 1 700 S mut ns
499 M. bovis BCG 261 S. pneumoniae
858 M. chelonae 262 S. pyogenes
609 M. fortuitum 217 S. sanguinis
610 M. gastri Staphylococcus
612 M, gordonae GTC No. 286 S. aureus subsp. aureus
613 M. intracellulare 289 S. epidermidis
614 M. kansasii 266 S. intermedius
616 M. marinum 265 S. saprophyticus
617 M. nonchromogenicum Enterococcus
1725 M. peregrinum 228 E. faecalis
619 M. scrofulaceum 227 E. faecium
620 M. simiae Peptostreptococcus
622 M. szulgai 200 P. magnus
623 M. terra e Stomatococcus
624 M. triviale 311 S， muci丄 aginosus
601 M， tuberculosis Corynebacterium
626 M. xenopi 1438 C. pseudotuberculosis
Pseudomonas Listeria
2 P. aeruginosa 149 L. monocytogenes
Escherichia Erysipelothrix
503 E. coli 555 E. rhuthiopathiae 各ゲノム D NAは、 O D値からコピー数を計算し、 2 X 1 0 7 コピーになる ように希釈した。 上記铸型となるゲノム D NAを用いて、 以下の表 5に示す反応 液組成で検出を行った 表 5
コンポーネント 容量 1)
5 X反応緩衝液 (pH7. 8) 0
100 mM 酢酸マグネシゥム 2
10 mM dNTP s (宝酒造社製） 2, 5 プライマー MT I S— 2 F ( 100 μ M) 0. 5 プライマー MT I S_2 RB i o (100 /iM) 0 5
A f u RN a s e H I I (17. 5 U/ μ 1) 0 5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （ 16 UZ 1 ) 0 5
DNA抽出ί夜
H2O 32. 5 計 50 μ 1 上記反応液を 60°Cで 1時間保持した。 検出は、 実施例 1 (4) 記載の方法で 行った。 その |¾果、 My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s株 及び My c o b a c t e r i um b o v i s B C G株のみ特異的に検出する ことができた。 このことから、 本発明の方法が非常に特異性の高い検出方法であ ることを確認、した。
実施例 4
(1) 磁気ビーズを用いた結核菌群の検出について検討した。 プライマーは、 M T I S— 2 Fプライマー及び MT I S— 2RB i oプライマーを用いた。 次に、 錄型として実施例 2での陽性検体由来の抽出ゲノムを滅菌水にて 30倍、 300 倍、 3000倍となるように希釈調製した。 反応は以下のようにして行った。 即 ち、 最終濃度 32mM へぺス一水酸化カリウムバッファ (pH7. 8) 、 1 0 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグ ネシゥム、 各 500μΜ dNTP s、 各 50 pmo lの MT I S— 2 F及び M T I S— 2Rプライマー、 8. 75Uの Af u由来 RNa s eH、 8Uの B c a BEST DNAポリメラーゼ、 各錄型量 1 μ 1を添加し滅菌水で最終容量を 5 Ο μ ΐにした。 該反応液はあらかじめ 60°Cに設定したサーマルサイクラ一パー ソナルにセットし、 60分間保持した。 得られた増幅断片を自動検出装置、 ルミ ノ、。ルス （富士レビオネ土製） にセットし、 ストレプトアビジンコートされた磁気ビ ーズ （ピアス社製） による検出を行った。 ピオチン結合能 1 00 pmo 1相当の ストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュべット第 1層でピオチン化増幅断片 と 5分間反応させ、 次いで 0. IN N a OHを加えて F I TC標識プローブ M T I S B Fと 5分間ハイブリダイズさせ、 洗浄後 P OD標識抗 F I T C抗体を加 え、 5分間反応後洗浄し発光基質を加えた。 この結果、 既存の自動化検出装置に おいて磁気ビーズを用いて 20分間という短時間で半定量可能であることが示さ れた。 なお、 試薬は実施例 1と同様のものを用いた。 検出は、 発光量をフォト力 ゥンティングすることで測定した。 その結果を表 6に示す。 表 6
フォトカウンティング S/N比
X 30 3. 55 X 107 29. 6
X 300 1. 21 X 107 10. 0
X 3000 0. 21 X 107 1. 75
0 0. 1 2 X 1 07 表 6に示した結果から、 従来のプレート発光法と同等の感度で検出できること を確認した。
(2) 内部標準 （I C ; internal control) を組み合わせた場合の検出系につい て検討した。 内部標準は以下のようにして調製した。 すなわち、 ヒトゲノム DN Aを铸型とし、 酉己列表の配列番号 1 7及び 1 8記載のプライマーを用いて PCR 増幅した。 得られた増幅断片を常法により精製し、 pT7 B l u e T-v e c t o r (N o v a g e n社製） に挿入した。 該プラスミドを内部標準として用 いた。 反応は、 実施例 3記載の条件と同様にして、 上記プラスミドを 1、 3、 1 0 p gを添力 tlした。 铸型の結核菌ゲノムは、 0、 2及ぴ 20コピ を用いた。 検 出は、 配列表の配列番号 1 9記載の塩基配列を有し、 5' 末端に F I T C標識を 有する I C用プローブ （I CFプローブ） 及び F I TC標識プロ ブ MT I SB Fを用いた。 その結果、 いずれの I Cプラスミド濃度でも結核菌ゲノムを検出で きた。 特に I Cプラスミドの濃度が 3 p gの場合に好適であることが確認できた。
(3) 上記增幅断片の検出方法として、 ハイブリッド 'クロマト法を検討した。 即ち、 エトロセルロース膜にストレプトアビジン （ナカライテスタ社製） を固定 化し、 吸水パッドを連結し、 ハイプリ 'クロマト ·ストリップを作製した。 これ を用いて、 実施例 1で得られた増幅断片のハイプリ ■クロマト法による検出を行 つた。 検出は、 1一 s t e p TMB-B l o t t i n g (ピアス社製） を用い た発色で行った。 すなわち、 エトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液 を展開し、 その後順に 0. IN Na OH溶液、 F I TC標識プローブ、 洗浄液、 発色液を展開した。 その結果、 結核菌陽性の増幅断片では、 ブルーのバンドが検 出された。 また、 この方法を用いる事により、 本発明の方法実施後、 5〜： L 0分 で結果が肉眼で判明することから、 迅速な遺伝子検查方法として有用であること が確認できた。
実施例 5
実施例 1〜4の結果を踏まえ、 結核菌群のキットを構築した。 各コンポーネン トについて以下に示す。
(1) I CAN増幅用試薬； 50回分
5 X反応緩衝液 500 μ 1 l O OmM 酢酸マグネシウム 100 μ 1
10mM d NT Pミックス 1 25 μ ΐ
0. ImM MT I S— 2Fプライマー 25 μ 1
0. ImM ΜΤ I S— SRB i οプライマー 25 μ 1
A f u RN a s e H I I (1 7. 5 /μ 1 ) 25 μ 1 B c a BE ST DNAポリメラーゼ （ 1 6 1 ) 25 μ 1
(2) 検出用試薬 (50回分）
ストレプトアビジン固相化 96穴プレート 50個
ハイブリバッファー （5 X S SC、 1 % T r i t o nX l O O,
1 % B S A) 2. 5m l 変性剤 (0. IN NaOH) 0. 5m l 検出用 MTプローブ溶液 （25 nM MT I S_2 B Fプローブ） 5m l 検出用 I Cプローブ溶液 （25 nM I CFプローブ） 5m l 標識抗体液 （ブロックエース （大日本製薬社製） ： PB S=1 ： 3、
50 OUn i t ?00—抗？ 1丁じ抗体） 5m l 1 OX洗浄液 ( 250 mM トリス緩衝溶液 (pH7. 5) 、
1. 5M NaC l、 1%BSA、 0. 5% Tw e e n 20)
20ml 発光試薬 A (SuperS ignal ELISA Pico Substrate A液 （ピアス社製） )
2. 5m l 発光試薬 B (SuperS ignal ELISA Pico Substrate B液 （ピアス社製） )
2. 5m 1 内部標準液 （ I Cプラスミド、 T E緩衝液） 0. lml 陽性コントロール液 （ I S 61 10含有プラスミド、 TE緩衝液）
0. 02ml 陰性コント口ール液 ( T E緩衝液） 0. 02ml 上記試薬を用レヽて My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s株 及ぴ My c o b a c t e r i um b o v i s B C G株を検出したところ、 迅 速、 高感度、 高特異的に検出できることを碓¾«した。
実施例 6
(1) スヮブ検体からの DN A抽出
男子尿道ならびに女子子宮頸部を綿棒で拭い取ったスヮブ検体に界面活性剤を 含む抽出バッファー （アンプリコア STD用検体処理試薬 （ロシュ社） ) を加え 95°C〜： L 00°Cで 10分間加熱処理した。
(2) プローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一の作製
クラミジァのクリプティック ·プラスミドを検出するための特異的オリゴヌク レオチドプローブを作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 20に示す塩基配列 力 らなり、 5' 末端に F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） が付され たオリゴヌクレオチドプローブ CT 1234を DN A合成機により合成した。 ま た、 リン菌の c p p B遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプロー ブを作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 21に示す塩基配列からなり、 5' 末端に F I TC (フルォレセインィソチオシァネート） が付されたオリゴヌタレ ォチドプローブ Cp p B 3を DN A合成機により合成した。
クラミジァのクリプティック ·プラスミド由来の DNA断片を I CAN法で合 成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表 の配列番号 2 2に示されたクラミジァのタリブティック ·プラスミドの塩基酉己列 をもとに、 配列表の配列番号 2 3及ぴ 24に示された塩基配列からなるフォヮ一 ドプライマ一 F 1 2 1 2— 2 2、 F 1 1 6 2 - 2 2, 配列表の配列番号 2 5及び 2 6に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にビォチンが付加されたリバースプ ライマー R 1 2 72— 2 2 B i o、 R 1 3 7 9— 2 2 B i oをそれぞれ DNA合 成機により合成した。
リン菌 c p p B遺伝子由来の DNA断片を I CAN法で合成するためのキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表の配列番号 2 7に示 されたクラミジァのタリブティック 'プラスミドの塩基配列をもとに、 配列表の 配列番号 28に示された塩基配列からなるフォワードプライマー p J DB F— l、 配列表の配列番号 2 9に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にビォチンが付カロ されたリバースプライマー p J DBR— 3 B i oをそれぞれ DNA合成機により 合成した。
(3) I CAN法による増幅
表 7に示す I CAN反応のための反応液を調製し、 5 5°Cで 60分インキ： 一トした。 表 7
コンポーネント 容量（ 1)
5 X反応緩衝液 (ρ Η7. 8) 10
1 00 mM 酢酸マグネシゥム 2
1 0 mM dNTP s (宝酒造社製） 2.5 プライマー F 1 2 1 2— 2 2 (1 00 /iM) 0.5 プライマー R 1 2 72— 2 2 B i o ( 1 00 ^ M) 0.5 プライマー p j DBF— 1 (1 00 /iM) 0.5 プライマー p J DBR— 3 ( 1 00 μ M) 0.5
P f u RN a s e H I I (6 3 n g/μ 1 ) 0.5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社製、 8U/// 1) 0.5
DNA抽出液 1
H20 32.5 計 50 μ\ 5 X反応緩衝液の組成：
1 0 OmM HE PE S—水酸化カリウム （pH7. 8)
50 OmM 酢酸カリウム
5% ジメチルスルフォキシド （DM SO)
0. 05 % ゥシ血清アルブミン （ B S A)
反応終了後、 上記反応液の一部を電気泳動に供して、 目的の增幅断片を確認し た。
(4) 固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン （ナカライ社製） を P B Sに 2 /i g/m lの濃度に溶解し、 この溶液を白色発光検出用 9 6ウェルマイクロタイタ一プレートに 1 5 Ο μ 1 / ゥエルとなるように添加し、 4°Cで一 Β免放置し、 固定化した。 ストレプトァビジ ン溶液を捨てた後、 1 % B SA-PB S溶液を 200 / 1 /ゥエルとなるよう に分注して 4 °Cでー晚放置し、 ブロッキングを行った。 この溶 ^液を捨てたものを ストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイプリダイゼーション緩衝液
[ 1 % TritonX- 100、 1 % B S Aを含む 5 X S S C] 50 μ 1 /ゥエルを加え、 実施例 1一 （3) で F 1 2 1 2— 2 2/R 1 2 7 2— 2 2 B i oならびに p J D B F- l/p J DBR- 3 B i oプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を 含む I CAN反応液を 1 0 /z 1 /ゥエルずつ 1検体につき 2ゥエルに添加して良 く混合し、 室温で 1 5分間反応させ、 プレート表面に捕捉させた。 次に DNA変 性液 （ 0. I N N a OH溶液） を 5 μ 1 /ゥエルずつ添加し、 良く混和して 3 分間の DNA変性を行い、 プレート表面に捕捉された二本鎖 DNAを一本鎖 DN Αに変性した。 引き続き上記のプローブ CT 1 2 34または C p p B 3を 5 pm o 1 /m 1となるようにハイブリダィゼーシヨンバッファーに希釈し、 これを 1 0 0 μ 1 Zゥエルずつ添加してよく混合し、 室温で 40分反応させた。 この時、 各ゥエルの； ρΗは 1 3〜1 4であった。 反応後、 ゥエル内の溶液を捨て、 200 μ 1 /ゥエルの洗浄バッファー [2 5mM T r i s—塩酸 （pH7. 5) 、 1 5 0 mM N a C l、 1% B SA、 0. 0 5% Tw e e n 20] で 2回ウエノレ を洗浄する。 その後、 パーォキシダーゼ標識抗 F I TCゥサギ抗体 （ケミコン社 製） をハイブリダイゼーシヨンバッファーに 2 g Zm 1に溶角 したものを 1 0 0 11 1 /ゥエルずつ添加し室温で 2 0分反応させた。 反応後、 液を捨て、 2 0 0 μ 1 /ゥエルの洗浄バッファーで 4回ゥエルを洗浄した後、 発光基質
[SuperSignal ELISA Pico Substrate (ピアス社製） ] を 1 0 Ο μ 1 /ゥェルず つ添加し、 直ちに発光プレートリーダー （ラボシステムズ社製） で相対発光強度 を彻 J定した。
( 5 ) 検出感度の検討
0、 1 0および 1 0 0コピー相当のクラミジァゲノムを含む D NA試料につき、 上記のとおりクラミジァ D NAの検出を実施した。 その結果、 表 8に示すように 1 0コピーにおいても S ZN比で約 3 0倍という強い発光が検出できた。 また、 0、 1 0および 1 0 0コピー相当のリン菌ゲノムを含む D NA試料につき、 上記 のとおりリン菌 D N Aの検出を実施した。 その結果、 表 9に示すように 1 0コピ 一においても S /N比で約 3 0 0倍という強レ、発光が検出できた。 表 8
ゲノム 装置発光強度 （R L U)
0コピ一 1 1
1 0コピー 3 4 7
1 0 0コピ一 3 9 6 1 表 9
ゲノム 装置発光強度 （R L U)
0コピ 1 1
1 0コピ 3 0 2 6
1 0 0コピー 3 8 4 0 以上のように、 本発明により、 迅速かつ高感度なクラミジァならびにリン菌の 検査が可能であることが示された。
実施例 7
クラミジァとリン菌の混合感染の疑いを持たれた検体 1 2例から実施例 1記載 の操作に従ってクラミジァならびにリン菌 D NAの同時増幅検出を行つた。
その結果、 クラミジァのみ陽性が 5例、 リン菌のみ陽 1·生が 1例、 クラミジァと リン菌共に陽性が 3例、 共に陰性が 3例であつた。 この結果は、 既存の P C R法 キット （アンプリコア STD (ロシュ社） ) の結果と一致した。
実施例 8
プライマー及びプローブの調製
H C Vゲノムの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 30及ぴ 31に記載の塩 基配列を有する HCV— F及び HCV— R 1キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一及び配列表の配列番号 32及び 33に記載の塩基配列を有する逆転写反応用ォ リゴヌクレオチドプラィマーを合成した。 さらに、 酉己列表の配列番号 34及び 3 5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。 さらに、 上記オリゴヌクレオチドプローブの 5，末端に TAMRA (N, N, Ν' , N，- tetramethyl-6-carboxy-rhodamine AB I社製） を自動 DN A合成機によって 作製し、 蛍光標識プローブとした。
(2) 合成 RNAの調製
インフォームド コンセントの得られた HCV— RN A陽性血清をアンプリコ ァ HCVモェターキット （ロッシュ社製） でコピー数を算出し、 これをキットに 付属の検体希釈液で、 1 X 107コピーから 1コピー 7 1まで 10倍希釈系列 を作製し、 HCV— RNAとした。
(3) 逆転写反応
上記 （1) で作製した逆転写反応用プライマーならぴに F i r s t- s t r a n d c DNA Syn t h e s i s K i t (宝酒造社製） を用いて上記 (2) で調製した HCV— RNAから cDNAを合成した。
(4) I CAN反応液の調製
上記 c DN A溶液を用いて I CAN反応を行った。 1チューブあたりの反応液 組成を表 10に示す。 表 10
Figure imgf000061_0001
(5) ホモジニァス検出
反応チューブ 1本あたり、 上記反応液 47 1を加え、 そこに （4) で作製し た c D Ν Α溶液 3 μ 1を添加し、 56 °Cで 30分間保持した。 反応終了後、 この 反応液に上記 ( 1 ) で調製した蛍光標識プロ一ブを終濃度が 300nMとなるよ うに添力 flし、 98 °Cで 2分間処理後、 水冷却により 25°Cにし、 保持した。 該反 応液を、 蛍光検出器、 フルォロスキャン （ラバオシステムズ社製） にて蛍光強度 を測定した。 さらに、 対照として、 市販の PCR法によるアンプリコア HCVキ ット （ロシュ社製） でも同一の検体を用いて測定した。 その結果を図 1に示す。 図 1は、 各種 HCV— RNA濃度を測定した場合の蛍光強度の変化及び従来法と の測定範囲の比較を示すグラフであり、 左縦軸は OD 450値、 右縦軸は蛍光強 度 （SN比） 、 横軸は、 HCV— RNA量を示す。 また、 図 1の黒四角は、 本発 明の方法による結果を示し、 黒丸は、 アンプリコア HCVキットによる結果を示 す。
図 1に示したように本発明の方法では、 蛍光強度 （SN比） は HCV— RNA コピー数が多いほど増加することが確認できた。 また、 本発明の HCV検出方法 の所用時間は 45分であった。 一方、 対照となるアンプリコア HCVキットにお いては、 所用時間は約 5時間であった。 さらに、 HCV— RNAの検出範囲につ いては、 図 1に示したように吸光度で示すアンプリコア HCVキットでは、 HC V— R N Aのコピー数の増加にしたがって増大はするものの、 測定範囲は 2ォー ダーであり、 1 05コピー以上では、 定量性がないことが確認できた。 一方、 本 発明の方法は、 3オーダーの広い検出範囲であることが確認できた。 さらに、 簡 便性 ·迅速性においても本発明の方法は優れており、 多検体を処理するのに適し た方法であることが確認できた。
実施例 9
(1) 患者血清からの HCV— RNAの調製
臨床検体からの H C Vの検出について検討した。 インフォームドコンセントの 得られた HCV患者の血清 28検体各 100 μ \からアンプリコア HCVキット 附属の HCV— RNA抽出試薬 （ロシュ社製） を用いて RNAを調製した。
(2) 患者血清中の HCV— RNA検出
実施例 1 (3) 及び （4) 記載の方法と同じ方法で HCV— RN Αを増幅し、 本発明の検出方法に供した。 本実施例においては、 対照の HCV— RNAを含ま ない試料について行ったネガティブコントロール 1 0本の蛍光強度の平均値 + 3 SD (標準偏差値の 3倍） をカットオフ値とし、 このカットオフ値を超えた蛍光 強度を示す検体を陽性とした。 一方、 同一の検体を市販のアンプリコア HCVキ ットにより測定し、 キットの取扱説明書に従って陽性'陰性を判定した。 本発明 の検出方法と従来法のアンプリコア HCVキットの結果の比較を表 1 1に示す。
本 法
陽性 陰性
アンプリコア'法
陽性 1 8例 0例
陰性 0例 1 0例 表 1 1に示したように、 本発明の方法による測定結果は、 従来法で得られた成 績と良く相関していることが確認できた。 また、 本発明の方法が従来法に比較し て、 高感度で迅速 ·簡便に測定できることが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、 病原性微生物を高感度、 高特異的 '迅速，簡便に測定できるこ とが可能となり、 特殊な機器を使用することなく多検体を限られた時間で処理す ることが可能な方法、 プライマー及びプローブ、 キットが提供される。
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO : 2·· PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO: 3: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO: 7: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a
polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 8: PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a
polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 11 : Oligonucleotide probe to detect the DNA derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID NO: 13 : Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis, "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 14: Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 15 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis, "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 16: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of ISollO gene derived from Mycobacterium
tuberculosis. "nucleotides 20 to 22 are； ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 17 : Oligonucleotide primer C4一 MT2F— S100 to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO: 18 : Oligonucleotide primer C4— MT2R- A to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO: 19 : Oligonucleotide probe to detect the internal control DNA
SEQ ID NO: 20： Oligonucleotide probe CT1234 to detect the Chramydia criptic plasmid
SEQ ID N0: 21： Oligonucleotide probe CppB3 to detect Neisseria gonorrhoeae cppB gene
SEQ ID NO: 23 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides'
SEQ ID NO: 24: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 25： Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid, "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 26 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 28 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 29 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonuc丄 eotides"
SEQ ID No : 30 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV- F to amplify a portion of HCV. "nucleotides 19 to 21 are
： ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID No : 31 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
HCV-R3 to amplify a portion of HCV. "nucleotides 16 to 18 are
； ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID No : 32 : Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV SEQ ID No: 33 :Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV SEQ ID No : 34: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No : 35: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No : 36 : Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No : 37 : Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No : 41 : Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No :42 : Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No :43 : Probe area to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV

Claims

請 求 の 範 囲
1. 結核菌群のマイコバクテリゥム ·ッベルク口シス （My c o b a c t e r i um t u b e r c u l o s i s) 、 マイコパクテリゥム ·ポビス B CG (M y c o b a c t e r i um b o v i s B C G) 、 マイコバクテリゥム 'ァフリ カナム (My c o b a c t e r i um a f r i c a num) 、 マイコノ クァリ ゥム .ミクロティ (My c o b a c t e r i um mi c r o t i) 及び/又 ίま マイコノ クテリゥム■カネティ (My c o b a c t e r i um c a n e t t i) を検出可肯 gなプローブであって、 配列表の配列番号 39記載の塩基配列ある いはその一部を含有することを特徴とするプローブ。
2. 結核菌の M y c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i um a f r i c a num、 My c o b a c t e r i um mi c r o t i及び Z又は M y c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出可能なプローブであって、 酉己 列表の配列番号 11記載の塩基配列であること特徴とするプローブ。
3. リン菌のナイセリア 'ゴノノレホエア （Ne i s s e r i a g o n o r r h o e a e) を検出可能なプロープであって、 配列表の配列番号 27記載の塩基 配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプロープ。
4. リン菌の N e i s s e r i a g o n o r r h o e a eを検出可能なプロ ーブであって、 配列表の配列番号 21記載の塩基配列であること特徴とするプロ ーブ。
5. クラミジァのクラミジァ トラコマチス （Ch l amy d i a t r a c h oma t i s) を検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 22記載の 塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブ。
6. クラミジァの Ch 1 amy d i a t r a c h oma t i sを検出可能な プロープであつて、 配列表の配列番号 20記載の塩基配列であること特徴とする プローブ。
7. C型 炎ウィルス （HCV) を検出可能なプローブであって、 配列表の配 列番号 34又は 35記載の塩基配列であること特徴とするプロープ。
8. アル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプロ ーブ。
9. pH8~l 4のアル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダ ィズ可能な請求項 8記載のプローブ。
10. 病原微生物の標的核酸が結核菌、 リン菌、 クラミジァ、 HCV由来の標 的核酸のいずれかである請求項 8又は 9記載のプロープ。
1 1. 病原微生物の標的核酸が結核菌群の I S 6110遺伝子、 リン菌の c p pB遺伝子、 クラミジァの] p LGV440、 HCVの 5， 非翻訳領域の塩基配列 から選択され、 該遺伝子にハイブリダィズ可能な請求項 10記載のプローブ。
12. 結核菌群の I S 61 10遺伝子に存在する配列表の配列番号 39に示さ れる塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 11記載のプロ ープ。
1 3. 配列表の配列番号 1 1に示される塩基配列からなる請求項 12記載のプ ローブ。
14. リン菌の c p p B遺伝子に存在する配列表の配列番号 27に示される塩 基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 1 1記載のプローブ。
15. 配列表の配列番号 21に示される塩基配列からなる請求項 14記載のプ ロープ。
16. クラミジァの; PLGV440に存在する配列表の配列番号 22に示され る塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 11記載のプロ一 ブ。
1 7. 配列表の配列番号 20に示される塩基配列からなる請求項 16記載のプ ローブ。
18. H C Vの 5 ' 非翻訳領域に存在する配列表の配列番号 34又は 35に示 される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 1 1記載のプ ローブ。
1 9. 配列表の配列番号 34又は 35に示される塩基配列からなる請求項 18 記載のプローブ。
20. 標識を付加されている請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のプローブ。
2 1 . 請求項 2 0記載のプローブであって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5で示される塩基配列のうち連続する 8塩基ないし 5 3塩基から なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、 標的核酸とハイブリダイズ した場合には蛍光強度が抑制されず、 標的核酸とハイプリダイズしない場合は蛍 光強度が抑制されるように蛍光標識されたものであることを特徴とする病原^:生 物検出用プローブ。
2 2 . 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5に示される塩基配列 のうち、 連続する 8塩基以上からなる請求項 2 1記載の病原微生物検出用プロ一 ブ。
2 3 . 5 '末端がローダミン系蛍光色素またはォキサジン系蛍光色素で標識さ れたプローブであって、 配列表の配列番号 3 4に示される塩基配列のうち、 連続 する 8塩基以上からなることを特徴とする請求項 2 2に記載の病原微生物検出用 プローブ。
2 4 . 標識蛍光色素がレポーター蛍光色素及ぴクェンチヤ一色素を有するプロ ープであって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5に示される塩 基配列のうち、 連続する 8塩基以上からなることを特徴とする請求項 2 2に記載 の病原微生物検出用プローブ。
2 5 . レポーター色素が、 フノレオレツセィン系色素であり、 クェンチヤ一色素 が D A B C Y L系色素であることを特徴とする請求項 2 4に記載の病原微生物検 出用プローブ。
2 6 . 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 金コロイド、 および放射性同位体か ら選択される標識を付加されている請求項 2 0記載のプローブ。
2 7. 請求項 1〜 2 6のいずれか 1項に記載のプローブを使用し、 病原微生物 の標的核酸とハイプリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の検出方 法。
2 8 · アル力リ領域で病原微生物の標的核酸とハイプリダイゼーシヨンを行う ことを特徴とする請求項 2 7記載の病原微生物の検出方法。
2 9 . 病原微生物が結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C V由来の標的核酸で ある請求項 2 7又は 2 8記載の病原微生物の検出方法。
30. 病原微生物の標的核酸が結核菌群の I S 6110遺伝子またはその断片 である請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
31. 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zまたはその断片を増幅した 後に、 増幅物と請求項 1、 2、 9〜1 1、 12、 1 3および 20〜26のいずれ 力、 1項記載のプロープとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことを特徴とする 請求項 30記載の病原微生物の検出方法。
32. 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zまたはその断片が増幅される請求項 31記載の病原微生物の 検出方法。
33. 病原微生物の標的核酸がリン菌の c p p B遺伝子またはその断片である 請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
34. リン菌由来の c p p B遺伝子および /またはその断片を増幅した後に、 増幅物と請求項 3、 4、 9-11, 14、 15および 20〜 26のいずれか 1項 記載のプローブとの間でハイプリダイゼーションを行うことを特徴とする請求項 33記載の病原微生物の検出方法。
35. 配列表の配列番号 28、 29にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してリン菌由来の c p pB遺 伝子および/またはその断片が增幅される請求項 34記載の病原微生物の検出方 法。
36. 病原微生物の標的核酸がクラミジァの PLGV440またはその断片で ある請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
37. クラミジァ由来の p LGV440および Zまたはその断片を増幅した後 に、 增幅物と請求項 5、 6、 9-11, 16、 17および 20〜26のいずれか 1項記載のプローブとの間でハイプリダイゼーションを行うことを特徴とする請 求項 36記載の病原微生物の検出方法。
38. 配列表の配列番号 23〜 26にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してクラミジァ由来の P LG V440および/またはその断片が増幅される請求項 37記載の病原微生物の検 出方法。
39. 標的核酸が HCVの 5' 非翻訳領域またはその断片である請求項 29記 載の病原微生物の検出方法。
40. HCV由来の 5， 非翻訳領域および Zまたはその断片を増幅した後に、 増幅物と請求項 7、 8、 9〜： L l、 18、 19および 20〜26のいずれ力 1項 記載のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことを特徴とする請求項 39記載の病原微生物の検出方法。
41. 配列表の配列番号 30〜 33にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するブラィマーを使用して H C V由来の 5， 非翻訳 領域および Zまたはその断片が増幅される請求項 40記載の病原微生物の検出方 法。
42. 請求項 27〜 41のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法を用いて 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 HCV由来の核酸を検出する工程を包含する病 原微生物の検出方法。
43. 下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸を検出することを 特徴とする病原微生物の検出方法。
(a) 铸型となる核酸、 デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る DNAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および RNa s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 鍀型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリボヌクレオチド又はヌ クレオチドアナログから選択されるものとリポヌクレオチドを含有し、 該リポヌ クレオチドは該プライマーの 3' 末端又は 3' 末端側に配置されたキメラオリゴ ヌクレオチドプライマーであり、 ；および、
(b) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程。
44. さらに錄型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一を含有する反応混合物を使用する核酸増幅方法で あることを特徴とする請求項 43記載の病原微生物の検出方法。
45. キメラオリゴヌクレオチドプライマーが下記一般式で表されるキメラォ リゴヌクレオチドプライマ一である請求項 44記載の病原微生物の検出方法。 一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
46. キメラオリゴヌクレオチドプライマ一の cが 0である請求項 45記載の 病原微生物の検出方法。
47. ヌクレオチドアナ口グがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシ リボウラシノレヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （ひ一 S) リポヌク レオチドである請求項 45記載の病原微生物の検出方法。
48 , 配列表の配列番号 13〜： 16、 23〜26、 28〜31でそれぞれ表さ れる塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を使用する請求項 4 3記載の病原微生物の検出方法。
49. 請求項 1〜 26いずれ力記載のプローブを用いて増幅核酸を検出するェ 程を包含する請求項 27〜42のいずれか 1項に記載の病原微生物の検出方法。
50. 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドブラ ィマー：
一般式： 5' -dNa-Nb~dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び/ /又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び/又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい） 。
51. cが 0である請求項 50記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
52. ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシ リボウラシ ヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （ α— S ) リポヌク レオチドである請求項 50記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
53. 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28-31でそれぞれ表さ れる請求項 52記載の病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
54. 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有する、 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Z またはその断片を増幅するためのプライマー。
55. 配列表の配列番号 27にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 リン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断 片を増幅するためのプライマー。
56. 配列表の配列番号 22にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 クラミジァ由来の p LGV440および/またはそ の断片を増幅するためのプライマー。
57. 配列表の配列番号 41〜 43にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5， 非翻訳領域および Zまたは その断片を増幅するためのプライマー。
58. 塩基酉己列の一部がリボヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一である請求項 54〜57のいずれか 1項に記載のプライマー。
59. 標識を付加されている下記から選択されるプライマー ：
( i ) 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライ マー ：
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい） ；
(i i) cが 0である （i) のキメラオリゴヌクレオチドプライマー；
(i i i) ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキ シリボウラシノレヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （ α— S ) リボヌ クレオチドである （i) のキメラオリゴヌクレオチドプライマー； .
( i V ) 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28-31でそれぞれ表さ れる （i i i) の病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー；
(V ) 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配 列に一部重複する配列を有する、 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zま たはその断片を増幅するためのプライマー；
(v i) 配列表の配列番号 27にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 リン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断 片を増幅するためのプライマー；
(V i i ) 配列表の配列番号 22にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列 に一部重複する配列を有する、 クラミジァ由来の; LGV440および Zまたは その断片を増幅するためのプライマー；
( V i i i ) 配列表の配列番号 41〜43にそれぞれ示される塩基配列、 もしく は該配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5' 非翻訳領域および Zま たはその断片を増幅するためのプライマー；および
( 1 x) 塩基配列の一部がリポヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一である (V ) ~ (V i i i ) のいずれかのプライマー。
60. 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 および金コロイドから選択される標 識を付加されている請求項 59記載のプライマー。
61. 請求項 1〜 26のいずれか 1項に記載のプローブを含有することを特徴 とする標的核酸検出用組成物。
62. 請求項 50〜60のいずれか 1項に記載のプライマーを含有することを 特徴とする標的核酸検出用組成物。
63. 病原微生物の検出に使用される請求項 61又は 62記載の標的核酸検出 用糸且成物。
64. 請求項 43記載の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であつ て、 標的核酸の増幅を行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検 出用組成物。
65. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ、 RNa s e H、 及びデォキシ リボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有する請求項 64記載の病原 微生物検出用組成物。
66. DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス （B a c i 1 1 u s c a l d o t e n a x) 由来の 5' →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNA ポリメラーゼである請求項 65記載の病原微生物検出用組成物。
67. RNa s eHがピロコッカス （Py r o c o c c u s) 属細菌由来及び Z又はアルカェォグロバス （Ar c h a e o g l o b u s) 属細菌由来の I I型 RNa s eHである請求項 65記載の病原微生物検出用糸且成物。
68. 請求項 1〜26のいずれか記載のプローブを含有することを特徴とする 病原微生物検出用キット。
69. 請求項 50〜 60のいずれ力記載のプライマーを含有することを特徴と する病原微生物検出用キット。
70. 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 HCVの検出に使用される請求項 68 又は 69記載の病原微生物検出用キット。
71. 請求項 27記載の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであつ て、 標的核酸の増幅を行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検 出用キット。
72. 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 RNa s eH、 及ぴデォキシ リボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有する請求項 71記載のキッ
73. DN Aポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の 5， →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼである請求項 72記載のキット。
74. RNa s eHがピロコッカス属細菌由来及び/又はアルカェォグロバス 属細菌由来の I I型 RNa s eHである請求項 72記載のキット&
75. 増幅産物を捕捉するための担体を含有する請求項 72記載のキット。
76. 担体がマイクロタイタープレート、 ビーズ、 マグネチックビーズ、 メン プラン、 およぴガラスから選択される担体である請求項 75記載のキット。
77. 結核菌群の検出方法において、 結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群の検出方法。
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