WO2002052043A1 - Procede de detection d'un micro-organisme pathogene - Google Patents

Procede de detection d'un micro-organisme pathogene Download PDF

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WO2002052043A1
WO2002052043A1 PCT/JP2001/011422 JP0111422W WO02052043A1 WO 2002052043 A1 WO2002052043 A1 WO 2002052043A1 JP 0111422 W JP0111422 W JP 0111422W WO 02052043 A1 WO02052043 A1 WO 02052043A1
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detecting
probe
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nucleic acid
seq
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PCT/JP2001/011422
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Masamitsu Shimada
Fumitsugu Hino
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide probe and a primer useful for detecting a pathogenic microorganism, a method for detecting a pathogenic microorganism using them, and a kit for the method.
  • Known methods for detecting a pathogenic microorganism include a method of immunologically detecting a protein derived from the microorganism or a method of amplifying and detecting a specific region of a gene derived from the microorganism by a nucleic acid amplification reaction.
  • a detection method using a nucleic acid amplification reaction is exemplified.
  • the nucleic acid amplification reaction include the polymerase chain reaction (PCR) described in U.S. Patent Nos.
  • TAS Transcription ⁇ system
  • a nucleic acid amplification method that can be carried out under isothermal conditions has been developed.
  • SDA strand displacement amplification
  • nucleic acid amplification methods that can be used in the detection of pathogenic microorganisms.
  • Various target nucleic acid regions suitable for each nucleic acid amplification reaction are used to satisfy the detection sensitivity required by the actual site for testing actual pathogenic microorganisms. It has been difficult to select primers suitable for the nucleic acid amplification method described above and probes suitable for the target nucleic acid detection method following each nucleic acid amplification reaction.
  • a method for detecting pathogenic microorganisms that can obtain reproducible results at low running cost.
  • the pathogenic microorganisms will be described by taking, for example, Mycobacterium tuberculosis, Phosphorus bacteria, Chlamydia, and Hepatitis C virus (HCV).
  • Tuberculosis has been a leading cause of human death in the past, and there are still a large number of patients today when various therapies are developed.
  • the Mycobacterium tuberculosis group includes Mycobacteri um tubercuiosis, Mycobacteri um bovis B CG, My cobacteri um african um, My cobacteri um microti, and My cobacteri um canetti.
  • a method for rapidly detecting the presence of Mycobacterium tuberculosis by PCR [Lancet (Lancet), 8 6 ⁇ No. 1, pp. 1069 (1989)] has been reported I have.
  • a gene encoding the 65 kDa antigen of Mycobacterium tuberculosis is used as a target, amplified by PCR, and detected by electrophoresis.
  • a kit for amplifying 16S liposome RNA and detecting the amplified product with a chemiluminescent probe is also commercially available [Gen-Probe].
  • PCR kits targeting DNA encoding 16S liposomal RNA are also commercially available (Roche).
  • IS 6110 which is specific to the M. tuberculosis group, has been published [Nucleic Acids Research, Vol. 18, p. 188 (1990)]. It is described that it would be useful as a probe for detection. In fact, a method for detecting the IS 6110 gene by PCR has been reported [J. Clin. Microbiol., Vol. 28, p. 2668 (1990)]. . Since then, many papers on the PCR method targeting the IS6110 gene have been reported, and their usefulness has been described. In addition, there is Japanese Patent No.
  • a nucleic acid amplification detection method targeting a ribosomal RNA gene has been widely reported.
  • it is intended to amplify a portion common to the genus Mycobacterium and identify a tuberculosis bacterium with a species-specific probe.
  • this method it is only the probe sequence that determines the specificity for M. tuberculosis, and there are many cases in which there is anxiety, including the sensitivity of detection, and even culture-positive samples cannot be detected. It has been reported.
  • Hybridization is used to detect amplification products.
  • the amplified double-stranded nucleic acid is first denatured by strong force in a liquid layer, and then the denatured single-stranded nucleic acid is denatured.
  • a method of hybridizing with a probe under neutral conditions in the presence of a stripped complementary nucleic acid was used (Roche Amplicor Kit manual). In this case, there was a problem that the hybridization of the probe was competitively hindered by the complementary amplification nucleic acid peeled off from the double strand, and the sensitivity / specificity did not increase.
  • the amplified double-stranded DNA was converted into a single-stranded DNA by alkali denaturation, neutralized, and then hybridized with a probe under neutral conditions.
  • thermal denaturation was performed in favor of alkali denaturation, but this made it impossible to accurately test a large number of samples. For this reason, many steps were involved, and one of the single-stranded DNAs competed with the probe and hybridized, resulting in a decrease in target nucleic acid detection sensitivity.
  • Phosphorus bacteria ie, Neisseriagonorrhoeae
  • Phosphorus bacteria are pathogens of gonorrhea, one of the most commonly reported bacterial infections in the United States. Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5: 327-335; U.S. Pat. No. 5,256,536; and U.S. Pat. No. 5,525,711 are N. Gonorhoea.
  • Cytosine DNA methyl transferase Describes the detection of N. gonorphoea using a DNA probe derived from a genomic fragment containing an open reading frame (ORF 1) with significant homology to the sequence of the M. Ngo II gene are doing. However, there was no method that could specifically detect phosphorus bacteria with sufficient sensitivity.
  • Chlamydia refers to a microorganism belonging to the genus Chlamydia.
  • Chlamydia trachomatis has been reported to be the most common sexually transmitted disease in developed societies, causing genital infections in both sexes. Therefore, there is a need for methods and reagents that can specifically and timely detect Chlamydia trachomatis.
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • This method consists of (1) extraction of HCV RNA from serum, (2) synthesis of cDNA using the extracted RNA as type III, (3) amplification by PCR with increasing and decreasing temperature, and (4) immobilized probe. (5) Washing and removal of unreacted reagent, (6) Reaction with labeling reagent, (7) Washing and removal of unreacted reagent, (8) Addition of color-forming reagent, (9) Color-stopping agent (10) Absorbance measurement is performed in a total of 10 steps. Also, HCV detection by a homogenous detection method using a real-time detection PCR method described in J. Virol. Methods Vol. 64, ppl 47-159 (1997) has been studied.
  • a main object of the present invention is to provide a means for measuring pathogenic microorganisms for a large number of specimens within a certain period of time with high sensitivity, accuracy, accuracy, convenience, short time, and low cost.
  • the present inventors have found a method for detecting a pathogenic microorganism using a nucleic acid amplification method that is superior to conventional nucleic acid amplification methods.
  • a chimeric oligonucleotide primer for amplifying a target nucleic acid and a probe for detecting a target nucleic acid for the method have been found.
  • a kit for the method was constructed, and the present invention was completed.
  • the first invention of the present invention can detect Mycobacteri um tuberculosis, Mycobacteri um bovis BCG, Mycobacteri um african um, Mycobacteri um mi croti and Mycobacteri um canetti of Mycobacterium tuberculosis group
  • the present invention relates to a probe, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 or a part thereof in the sequence listing, or the base sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • a second invention of the present invention is a probe capable of detecting Neisseriago no rrhoeae of a phosphatium, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 or a part thereof.
  • the present invention relates to a probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing.
  • a third invention of the present invention relates to a probe capable of detecting Chlamydia Ch1 amy.
  • Diatracomatis comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • the fourth invention of the present invention relates to a probe capable of detecting HCV, wherein the probe has the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 34 or 35 in the sequence listing.
  • the fifth invention of the present invention relates to a probe which can hybridize to a target nucleic acid of a pathogenic microorganism in an alkaline region.
  • a probe capable of hybridizing to a target nucleic acid of a pathogenic microorganism in the pH region of pH 8 to 14 is suitable, and the target nucleic acid of the pathogenic microorganism is Mycobacterium tuberculosis, phosphorus bacterium, or Chlamydia. Probes that are any of the HCV-derived target nucleic acids are preferred.
  • the target nucleic acid of the pathogenic microorganism is selected from the IS611 gene of the M.
  • probes that can be hybridized can be suitably used.
  • a probe consisting of the nucleotide sequence represented by No. 11 is exemplified.
  • a probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing present in the cpp B gene of the bacterium or a nucleotide sequence containing a part thereof, preferably a nucleotide represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing A probe consisting of a sequence is exemplified.
  • a probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 of the sequence listing present in chlamydia pLGV440, or a nucleotide sequence containing a part thereof, preferably represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing A probe consisting of a base sequence is exemplified.
  • the probes according to the first to fifth aspects of the present invention may be provided with a label.
  • the probe is an oligonucleotide having a base sequence consisting of consecutive 8 to 53 bases among the base sequences represented by SEQ ID NOS: 11, 20, 21, 34 and 35 in the sequence listing. Therefore, when the probe is hybridized with the target nucleic acid, the fluorescence intensity is not suppressed. It may be a probe for detecting pathogenic microorganisms, which is characterized in that it has been obtained. Further, the probe may be a probe for detecting a pathogenic microorganism consisting of eight or more consecutive bases among the base sequences shown in SEQ ID NOS: 11, 20, 21, 34 and 35 in the sequence listing.
  • the labeled fluorescent dye is a probe having a reporter fluorescent dye and a quencher dye, and among the base sequences shown in SEQ ID NOs: 11, 20, 21, 34, and 35 in the sequence listing, It may be a probe for detecting a pathogenic microorganism, which comprises at least 8 consecutive bases.
  • the reporter dye is a fluorescein dye
  • the quencher dye may be a DABCYL dye.
  • a probe to which a label selected from a fluorescent substance, a dye, an enzyme, biotin, colloidal gold, and a radioisotope is added can be suitably used.
  • a sixth invention of the present invention relates to a method for detecting a pathogenic microorganism, which comprises a step of using the probe of the first to fifth inventions of the present invention to perform hybridization with a target nucleic acid of the pathogenic microorganism.
  • hybridization with a target nucleic acid of a pathogenic microorganism can be performed in an alkaline region.
  • the pathogenic microorganism include tuberculosis bacillus, phosphorus bacterium, chlamydia, and HCV.
  • the target nucleic acid is preferably the IS610 gene or a fragment thereof, and after amplifying the IS610 gene and / or a fragment thereof derived from Mycobacterium tuberculosis, the target nucleic acid is It is preferable to perform hybridization with the probe according to the first or fifth aspect of the present invention.
  • the target nucleic acid is preferably the cpp B gene or a fragment thereof.
  • the target nucleic acid and the fragment of the present invention are amplified.
  • Hybridization is preferably performed with the probe of the second or fifth invention.
  • the cppB gene and / or a fragment thereof derived from a phosphatium is amplified using a mer.
  • the target nucleic acid is preferably pLGV440 or a fragment thereof.
  • the amplified product and the fragment of the present invention are used. It is preferable to perform hybridization with the prop of the third or fifth invention.
  • the chlamydia-derived pLGV440 and Z or their primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 23 to 26 in the sequence listing, or primers having a sequence partially overlapping the sequences are used.
  • the fragment is amplified.
  • the target nucleic acid is preferably 5, untranslated region or fragment thereof of HCV, after amplifying the 5 5 untranslated region, and / or fragment thereof from HCV, amplified product and the present invention It is preferable to perform hybridization with the probe of the fourth or fifth invention.
  • the seventh invention of the present invention includes a step of detecting a nucleic acid derived from a group of Mycobacterium tuberculosis, a bacterium, a bacterium, a chlamydia or an HCV using the method for detecting a target nucleic acid of a pathogenic microorganism of the sixth invention of the present invention.
  • the present invention relates to a method for detecting a pathogenic microorganism.
  • An eighth invention of the present invention is a method for detecting a pathogenic microorganism, comprising detecting an amplified nucleic acid obtained by a nucleic acid amplification method comprising the following steps.
  • the primer is substantially complementary to the base sequence of the nucleic acid to be type III, contains at least one selected from deoxyribonucleotides or nucleotide analogs and ribonucleotides, and the liponucleotide is A chimeric oligonucleotide primer located at the 3 'end or 3' end of the primer;
  • the base sequence of the nucleic acid which is It is preferred to use a reaction mixture containing a chimeric oligonucleotide primer having qualitatively homologous sequences.
  • the chimeric oligonucleotide primer is a chimeric oligonucleotide primer represented by the following general formula can be suitably used.
  • dN deoxyribonucleotide and Z or nucleotide analog
  • N unmodified liponucleotide and / or modified ribonucleotide
  • Part of dNa dN may be substituted with N
  • c of the chimeric oligonucleotide primer may be 0, the nucleotide analog is a deoxyriboinosine nucleotide, a deoxyribouracil nucleotide, and the 'modified ribonucleotide is a -s) liponucleotide. You may.
  • the method may include a step of detecting the increased ⁇ ⁇ nucleic acid using the probe of the first to fifth inventions of the present invention.
  • the ninth invention of the present invention relates to a chimeric oligonucleotide primer for detecting a pathogenic microorganism represented by the following general formula.
  • dN deoxyliponucleotide and Z or nucleotide analog
  • N unmodified ribonucleotide and // or modified ribonucleotide Nucleotides, dN at some dNa sites may be substituted with N
  • the nucleotide analog is a deoxyriboinosine nucleotide, a deoxylipoperacil nucleotide, and the modified ribonucleotide is ( ⁇ -S ) Chimeric oligonucleotide primers that are liponucleotides are preferred.
  • chimeric oligonucleotide primers for detecting pathogenic microorganisms represented by SEQ ID NOs: 13 to 16, 23 to 26, and 28 to 31 in the sequence listing are preferable.
  • a tenth invention of the present invention relates to a Mycobacterium tuberculosis-derived IS 611 having a base sequence shown in SEQ ID NO: 36 or 37 in the sequence listing or a sequence partially overlapping the sequence.
  • the present invention relates to a primer for amplifying an HCV-derived 5, untranslated region and ⁇ Z or a fragment thereof, which have the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 41 to 43 in the column list or a sequence partially overlapping the sequence.
  • the primer may be a chimeric oligonucleotide primer in which a part of the nucleotide sequence is substituted with a liponucleotide.
  • a label may be added. Examples of the label include fluorescent substances, dyes, enzymes, biotin, and colloidal gold.
  • the eleventh invention of the present invention relates to a composition for detecting a target nucleic acid, comprising the probe of the first to fifth inventions of the present invention.
  • a twelfth invention of the present invention relates to a composition for detecting a target nucleic acid, comprising the primer of the ninth to tenth inventions of the present invention.
  • the eleventh and twelfth inventions of the present invention can be used for detecting pathogenic microorganisms.
  • a thirteenth invention of the present invention relates to a composition for use in the sixth to eighth pathogenic microorganism detection methods of the present invention, which comprises at least one of the following components for performing amplification or hybridization of a target nucleic acid.
  • the present invention relates to a composition for detecting pathogenic microorganisms, comprising a species of reagent.
  • the thirteenth invention of the present invention may comprise a reagent selected from a DNA polymerase having a strand displacement activity, RNase H, and deoxyribonucleotide triphosphate.
  • the DNA polymerase may be a 5, ⁇ 3 ′ exonuclease-deficient B ca DNA polymerase derived from Bacillus caldotenax, and the RNaseH is derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus and / or Ogropas (Ar chae og 1 obus).
  • a fifteenth aspect of the present invention relates to a kit for detecting a pathogenic microorganism, which comprises the probe of the first to fifth aspects of the present invention.
  • the fourteenth invention of the present invention may contain the ninth to tenth primers of the present invention.
  • the kit can be used for the detection of M. tuberculosis, phosphorus, chlamydia, and HCV.
  • the kit is a kit for use in the sixth to eighth pathogenic microorganism detection methods of the present invention, and includes at least one reagent for amplifying or hybridizing a target nucleic acid. You may. It may also contain a reagent selected from the group consisting of DNA polymerase having strand displacement activity, RNAse H, and deoxyribonucleotide triphosphate.
  • the DNA polymerase is preferably a 5, ⁇ 3 'exonuclease-deficient Bca DNA polymerase derived from Bacillus cardotenax, and RNase H is derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus and a bacterium derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or genus Zalca globus. Type II RNase H may be used. Further, a carrier for capturing the amplification product may be contained, and a carrier selected from microtiter plates, beads, magnetic beads, membranes, and glass can be suitably used.
  • the fifteenth invention of the present invention relates to a method for detecting a group of Mycobacterium tuberculosis, comprising a step of treating a sample containing Mycobacterium tuberculosis with lamidase and extracting a nucleic acid.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the relationship between the HCV-RNA concentration and the change in fluorescence intensity when various HCV-RNA concentrations are measured by the method of the present invention, and the difference in the measurement range from the conventional method. Detailed description of the invention
  • deoxyribonucleotide refers to a nucleotide in which the sugar moiety is composed of D-2-deoxylipose. Also has adenine, cytosine, guanine, and thymine Is included.
  • deoxyliponucleotide analogs such as deoxyliponucleotides and deoxyinosine nucleotides having modified bases such as 7-deazaguanosine are also included in the above deoxyribonucleotides. '
  • liponucleotide refers to a nucleotide in which the sugar moiety is composed of D-ribose, and has adenine, cytosine, guanine, and peracil in the base moiety. Is mentioned. Furthermore, the liponucleotide includes a modified liponucleotide, for example, a modified ribonucleotide in which an oxygen atom of a phosphate group at the ⁇ -position is replaced with a sulfur atom [(a-S) liponucleotide; And other derivatives.
  • a chimeric oligonucleotide primer refers to a primer containing a deoxyliponucleotide and a liponucleotide.
  • the primer may contain nucleotide analogs and / or modified nucleotides.
  • a liponucleotide is arranged at the 3, terminal or 3, terminal side of the primer, the nucleic acid chain can be extended in the method of the present invention, can be cleaved with end nuclease, and the strand can be displaced. Any one that can perform the reaction is included in the chimeric oligonucleotide primer of the present invention.
  • the term “3 ′ end” refers to a nucleic acid, for example, a portion of a primer from the center to the 3 ′ end.
  • the terminus 5 refers to a portion of a nucleic acid from its center to the 5 'end.
  • the endonuclease is defined as a ribonucleotide portion of the primer which acts on a double-stranded ⁇ ⁇ , ⁇ generated by extending DNA from the chimeric oligonucleotide primer annealed to the ⁇ -type nucleic acid, and It is only necessary that the DNA be specifically cleaved.
  • a DNA polymerase refers to an enzyme that synthesizes a new DN ⁇ chain using a DNA chain as a ⁇ type.
  • a mutant enzyme having the above activity is also included. Included.
  • the enzyme include DNA polymerase having a strand displacement activity, 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease.
  • the DNA polymerase include a DNA polymerase having no enzyme activity 1 "and a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity and a nuclease activity.
  • strand displacement activity means that when performing DNA replication in accordance with a nucleic acid sequence of type ⁇ , the DNA strand proceeds while displacing the DNA strand and releases a complementary strand that has been annealed to the type ⁇ strand. An activity that can be displaced. Further, in the present specification, a DNA strand released from a nucleic acid sequence having a ⁇ shape due to strand displacement is referred to as a “substituted strand”.
  • aliphatic region refers to a region where the pH exceeds 7.
  • pathogenic microorganisms refer to pathogenic bacteria and viruses.
  • target nucleic acid refers to any region of a gene derived from a pathogenic microorganism to be amplified or detected, and includes both DNA and RNA.
  • the probe of the present invention is characterized by being capable of detecting a pathogenic microorganism, for example, a tubercle bacillus group, a bacterium, a chlamydia or HCV.
  • a preferred embodiment of the probe of the present invention is exemplified by a probe capable of stably hybridizing to a target nucleic acid in the target region. That is, the probe capable of hybridizing in the alkaline region of the present invention is not particularly limited, but for example, an alkaline region having a pH exceeding 7.0, preferably having a pH in the range of 8 to 14, and particularly preferably having an pH in the range of pH 8 to pH 10.
  • Probes capable of hybridizing with a target nucleic acid having a sequence complementary to the base sequence under the conditions of force may be mentioned.
  • the probe of the present invention can be used for conventional hybridization in a neutral region.
  • double-stranded nucleic acid can be denatured to single-stranded by an aliquot treatment and then used in the hybridization step without neutralization. is there. This simplifies the process and improves sensitivity by more than 10 times compared to the conventional method. Up. In addition, by performing hybridization in an alkaline region, the specificity of hybridization can be improved.
  • the method for detecting a probe hybridized with a nucleic acid derived from a specimen is not particularly limited, and any known detection method can be applied to the present invention.
  • a target nucleic acid present in a sample can be detected efficiently and Z or with high sensitivity.
  • the method of labeling the probe is not limited, and for example, radioisotopes (eg, 32 P), dyes, fluorescent substances, luminescent substances, various ligands (eg, biotin, digoxigenin), enzymes and the like can be used.
  • the presence of the labeled probe can be confirmed by a detection method according to the label.
  • a ligand that cannot be directly detected it may be combined with a ligand-binding substance with a detectable label.
  • a target nucleic acid can be detected with high sensitivity by combining a ligand-labeled probe with an enzyme-labeled anti-ligand antibody and amplifying the signal.
  • the probe may have a labeling substance for detection.
  • the labeling substance is not particularly limited, and for example, any of a ligand or receptor substance, a radioisotope, fluorescence, luminescence, and coloring can be suitably used.
  • a method of hybridizing a probe having a labeling substance with a nucleic acid having an amplified target region and detecting a free probe after washing, or eliminating the washing step is omitted.
  • the deviation of the so-called homogenous air detection method can also be suitably used.
  • the homogenous detection method using fluorescence for example, Proc.
  • the 5 ′ end of the probe is labeled with a damine or oxazine dye
  • the 3 ′ end is a base sequence that causes quenching.
  • Examples are the molecular beacon method and the smart probe method, in which the probe is labeled with a lignonucleotide-reporter dye, and furthermore, the 5, 5 and 3, terminal sides of the probe are senorefreferred.
  • the probe hybridizes to the amplified nucleic acid, thereby eliminating the sefani ring structure of the probe and consequently reducing the fluorescence intensity. It emits a fluorescent signal without being suppressed.
  • the probe retains the self-annealing structure and the fluorescence intensity is suppressed, so that no fluorescent signal is detected.
  • the fluorescent dye is preferably a rhodamine dye or an oxazine dye, and the dye is bound to the 5 'end of the probe and cooperates with the base sequence at the 3' end to bind to the target nucleic acid. If the fluorescent probe is not bound, the fluorescence intensity is suppressed, and if the fluorescent probe is bound to the target nucleic acid, the fluorescence intensity is not suppressed.
  • the fluorescence intensity is suppressed by fluorescence resonance energy transfer, and when bound, the combination is such that the fluorescence intensity is not suppressed. I just need to be.
  • fluorescent dyes include FAM (6-carboxy-fluorescein), ⁇ AMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), JA242 (oxazine), and DABCYL (4-dimethylaminoazobenzene-1'4'-1). Sulphoyuric ride) is preferred. These fluorescent dyes are known and are commercially available.
  • the chain length of the probe of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 12 mer or more, preferably 2 Omer or more, particularly preferably 4 Omer or more.
  • the probe for detecting Mycobacterium tuberculosis of the present invention is My cobacteiut uber. culosis, Mycobacterium um bovis BCG, Mycobacterium africanum, Mycobacterium um microti and Z or Mycobacterium um canetti can be detected.
  • the target nucleic acid may be selected appropriately depending on the target nucleic acid to be detected or the organism, and is not particularly limited.For example, in the detection of a tuberculosis group, the target is the IS6110 gene.
  • a probe as a nucleic acid can be used.
  • the nucleotide sequence of the tubercle bacillus-derived IS6110 gene shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing can be designed by selecting an appropriate region.
  • a region containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 in the sequence listing preferably a region containing SEQ ID NO: 40 in the sequence listing, and more preferably a sequence containing SEQ ID NO: 38 in the sequence listing You can select from the area. In particular, it can be selected from a region containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • the above-mentioned probe is particularly useful for detection of the tubercle bacillus group because it stably hybridizes with the IS 6110 gene derived from the tubercle bacillus group or a fragment thereof with high specificity. .
  • the probe for detecting a bacterium according to the present invention can detect Neisse riag ogno rr hoe ae.
  • the probe may be selected as the target nucleic acid according to the nucleic acid to be detected or an organism, and is not particularly limited.
  • cryptic 1 asmidproteinB cp pB
  • a probe that uses a gene as a target nucleic acid can be used, and can be designed by selecting an appropriate region from the nucleotide sequence of the cpp B gene derived from a bacterium shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing.
  • the above-mentioned probe hybridizes stably and with high specificity with the cppB gene derived from a bacterium or a fragment thereof, it is particularly useful for detection of the gene and further detection of a bacterium.
  • the chlamydia detection probe of the present invention can detect Chlamydia diatrach omatis.
  • the probe attempts to detect the target nucleic acid It is sufficient to select an appropriate nucleic acid or an appropriate one according to the organism, and there is no particular limitation.For example, in the detection of chlamydia, a cryptic plasmid
  • a probe targeting pLGV440 as a target nucleic acid can be used, and can be designed by selecting an appropriate region from the base sequence of chlamydia-derived pLGV440 shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 22 the base sequence of chlamydia-derived pLGV440 shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
  • a region containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 in the sequence listing preferably from a region containing SEQ ID NO: 44 in the sequence listing, more preferably from a region containing SEQ ID NO: 20 in the sequence listing .You can choose.
  • the above-mentioned probe hybridizes stably and with high specific 1 "life with chlamydia-derived pLGV440 or a fragment thereof, and is therefore particularly useful for detection of the gene and further detection of chlamydia.
  • the HCV detection probe of the present invention is not particularly limited as long as it is a probe that can hybridize to the nucleotide sequence of the region between the forward primer and the reverse primer used for amplification of the target nucleic acid.
  • the length of the probe is not particularly limited, but is preferably in the range of 8 to 53 bases, and particularly preferably in the range of 8 to 36 bases.
  • a probe having a base sequence of 8 or more bases continuous in the above range may be selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 of the sequence listing, and is not particularly limited. Probe having 8 or more consecutive bases in the base sequence to be used.
  • a neutralization step following a denaturation step of a target nucleic acid from a double strand to a single strand can be omitted by using the probe described in the above (1). That is, in the method for detecting a target nucleic acid of the present invention, the nucleic acid has a sequence complementary to its base sequence under pH conditions of more than 7, particularly preferably pH 8 to 14. It is possible to hybridize with nucleic acids.
  • the conditions for the hybridization are not particularly limited, and include those known to those skilled in the art as “strict conditions”. These conditions were published in 1989 by Cold 'Spring Harbor Laboratory, edited by T. Maniatis et al., Molecular. Clawing: A' Laboratory '. The ones listed in IB in Mayuanole 2nd edition (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.) And those described in Examples of the present application can be used.
  • the typical composition of the hybridization solution is as follows: 0.5% SDS, 5X Denhardt's; 0.1% ⁇ serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrroli Don, 0.1% Ficoll 400] and
  • the pH of the hybridization solution may be adjusted in the range of 8 to 14.
  • the temperature of the hybridization is not particularly limited. For example, the hybridization is performed at a temperature lower than the Tm value of the probe by 5 ° C. or more.
  • the Tm value of the probe is, for example, the following equation:
  • Tm 81. 5—16.6 (lo gl . [Na +]) +0.41 (% G + C) one (600 / N)
  • Tm (% A + T) X2 + (% G + C) X4]
  • (% A + T) is the content of adeyun and thymine residues in the probe
  • (% G + C) is the content of guanine and cytosine residues in the probe.
  • Hybridization conditions in the detection method of the present invention are not particularly limited, and known hybridization conditions, preferably strict hybridization conditions, are used. Further, the pH of the hybridization solution may be adjusted in the range of 8 to 14.
  • a probe suitable for detecting the IS611 gene derived from a tubercle bacillus group can be suitably used, and although not limited, for example, as described in SEQ ID NO: 39 in the sequence listing
  • the base sequence or a part thereof, preferably the base sequence or a part thereof described in SEQ ID NO: 40 of the sequence listing, more preferably the base sequence of SEQ ID NO: 38 or a part thereof, particularly preferably A probe containing SEQ ID NO: 11 in the sequence listing can be suitably used in the present invention.
  • a probe suitable for detecting the cppB gene derived from a bacterium can be suitably used, and is not particularly limited.
  • a nucleotide sequence or a part thereof, preferably a probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or a part thereof in the Sequence Listing can be suitably used in the present invention.
  • a probe derived from chlamydia; suitable for detecting PL GV440 can be suitably used, and is not particularly limited.
  • a 5 ′ untranslated region is preferable, for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 43 in the sequence listing or a part thereof, preferably A probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 or a part thereof, or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 or a part thereof can be suitably used in the present invention.
  • the method for detecting a pathogenic microorganism of the present invention can specifically detect each pathogenic microorganism by using the probe described in (1) above. That is, the above-mentioned probe hybridizes stably with a gene or a fragment thereof derived from each pathogenic microorganism and has a high specific indigenous organism, so that the detection of the gene and the detection of each pathogenic microorganism can be performed. Especially useful for:
  • the use of the probe according to the above (1) allows the probe and the sample containing a nucleic acid to have a pH of more than pH 7, preferably under pH conditions.
  • Hybridization can be carried out under the conditions of 8 to 14, particularly preferably pH 8 to 10. That is, the method provides a method for detecting a gene or a fragment thereof derived from a pathogenic microorganism without passing through a neutralization step following a denaturation step of a target nucleic acid. Etc. can be detected.
  • the method of the present invention can be used for detection and quantification of a specific gene present in a sample. That is, a specific gene can be detected and quantified from any sample that may contain a nucleic acid such as DNA or RNA.
  • RNA or DNA is suitably used as the nucleic acid used as type I for the above detection method.
  • the preparation of a preparation having a nucleus from these materials is not particularly limited, and can be performed by, for example, dissolution treatment with a surfactant, ultrasonic treatment, shaking and stirring using glass beads, use of French press, and the like. .
  • it may be advantageous to purify the nucleic acid with further manipulations eg, when endogenous nucleases are present.
  • the nucleic acid is purified by known methods such as phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis or density gradient centrifugation.
  • the method of the present invention may be carried out using cDNA as a type II cDNA synthesized by a reverse transcription reaction using the type RNA as a type II.
  • the primer used in the above reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it anneals to type I RNA under the reaction conditions used.
  • the primer includes a primer having a base sequence complementary to a specific type I RNA (specific primer), an oligo dT (deoxythymine) primer and a primer having a random sequence (random primer) It may be.
  • the length of the reverse transcription primer is preferable from the viewpoint of performing specific annealing. Yes, more preferably 9 nucleotides or more, and from the viewpoint of oligonucleotide synthesis, preferably 100 nucleotides or less, more preferably 30 nucleotides or less.
  • a chimeric oligonucleotide primer that can be used as a primer for a strand displacement reaction when performing the nucleic acid amplification method of the present invention using the reversely transcribed cDNA as a ⁇ type can be used.
  • Such primers are not particularly limited as long as they have the properties described in the following (3) and can be used for the reverse transcription reaction from RNA, for example, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 32 in the sequence listing.
  • a primer having the base sequence described in 33 can be suitably used.
  • the enzyme used in the above reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing cDNA with RNA type II.
  • reverse transcriptase derived from avian myeloblastosis virus AMV RTa se
  • reverse transcriptase derived from Moro-mouse murine leukemia virus MMLV RTase
  • Rousse-related virus 2 reverse transcriptase Rousse-related virus 2 reverse transcriptase
  • an enzyme having a reverse transcription activity at a high temperature is suitable, for example, a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the genus Thermus sp.
  • Tth DNA polymerase or the like a DNA polymerase derived from a bacterium belonging to the thermophilic bacillus genus, or the like. Can be used. Although not particularly limited, for example, DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium is preferred, DNA polymerase derived from B.st (Bst DNA polymerase), and Bea DNA polymerase is more preferred.
  • Bst DNA polymerase DNA polymerase derived from B.st (Bst DNA polymerase)
  • Bea DNA polymerase does not require manganese ions for the reverse transcription reaction, and can synthesize cDNA while suppressing the formation of secondary structure of type I RNA under high temperature conditions.
  • the enzyme having the above reverse transcriptase activity both natural and mutant enzymes can be used as long as the enzyme has the activity.
  • double-stranded DNA such as genomic DNA and PCR fragments isolated by the above method
  • single-stranded DNA such as cDNA prepared by reverse transcription from total RNA or mRNA
  • It can be suitably used as type ⁇ DNA in the nucleic acid ⁇ method.
  • a DNA that has been subjected to a step of denaturing single-stranded DNA (denaturing) can be suitably used.
  • the nucleic acid can be amplified by a simple nucleic acid amplification method and used for hybridization.
  • the nucleic acid amplification method used is not particularly limited as long as it can amplify a region on the target nucleic acid.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the ICAN method is a method for continuously amplifying DNA having a specific base sequence on type I nucleic acid under isothermal conditions using a chimeric nucleotide primer, an endonuclease, and a DNA polymerase having strand displacement activity.
  • “continuously” means that the reaction is proceeding without changing the reaction temperature and the composition of the reaction solution.
  • “isothermal” means a substantially constant temperature condition under which an enzyme and a nucleic acid chain function in each of the above steps.
  • a chimeric oligonucleotide primer composed of a deoxyribonucleotide and a ribonucleotide and having a ribonucleotide arranged at the 3 ′ end or 3 ′ end thereof is used.
  • an oligonucleotide having a structure represented by the following general formula can be used as a primer in the ICAN method. "General formula: 5, -dNa-Nb-dNc-3 '
  • nucleotide analogs include, for example, deoxylipoinosine
  • nucleotide and the modified liponucleotide for example, ( ⁇ -S) ribonucleotide can be used, respectively.
  • the nucleotide analog can be contained within a range that does not substantially lose the function as a primer.
  • the primer has a sequence homologous to the base sequence on the 5 'side and a base sequence on the 3' side based on the base sequences on the 5, 5 and 3 sides of the region where amplification on type III is desired. Two complementary species are created and used for amplification.
  • the endonuclease used in the present invention is a strand displacement reaction that acts on a double-stranded DNA generated by extending DN DN from the above-described chimeric oligonucleotide primer that has been annealed to type III nucleic acid, and What is necessary is just to be able to cleave the extended strand so that the above-mentioned occurs. That is, it is an enzyme capable of generating a nick in the chimeric oligonucleotide primer portion of the double-stranded DNA.
  • ribonuclease can be used in the present invention, and in particular, endoliponuclease H (RNase H) which acts on the RNA portion of a double-stranded nucleic acid formed from DNA and RNA is preferable.
  • RNase H endoliponuclease H
  • any of the liponucleases having a normal temperature to a thermostability can be suitably used in the present invention as long as they have the above-mentioned action.
  • RNase H derived from Escherichia coli (E.co1i) can be used in the method of the present invention in a reaction at about 50 ° C. to about 70 ° C.
  • thermostable liponuclease in the method of the present invention, can also be suitably used.
  • the thermostable ribonuclease is not particularly limited, but, for example, commercially available Hybridase TM Thermo stable RNase
  • RNaseH derived from thermophilic Bacillus, Sirmas, Pyrococcus, Thermotoga, Alcaeoglobus, Methanococcus, etc. It can be suitably used. Furthermore, as the liponuclease, any of a natural form and a mutant can be suitably used.
  • the enzyme unit of RNaseH described in the specification of the present application is a numerical value displayed based on the enzyme unit measuring method shown in the reference example in the examples.
  • the RNaseH is not particularly limited as long as it can be used in the method of the present invention, and may be any of various viruses, phages, prokaryotes, and eukaryotes.
  • cellular RNase H or viral RNase H It may be a deviation.
  • the above-mentioned cellular RNaseH is Escherichia coli RNaseHI and the viral RNaseH is, for example, HIV-1 derived RNaseH.
  • any of type I, type II, and type III RNaseH can be used.
  • RNase HI derived from Escherichia coli RNase HI derived from a bacterium belonging to the genus Pyrococcus or bacterium belonging to the genus Alcaeoglobus
  • the efficiency of the cleavage reaction of the endonuclease used in the method of the present invention depends on the base sequence near the 3 'end of the primer, and may affect the amplification efficiency of the desired DNA. Therefore, it is natural to design the optimal brammer for the RNase H to be used.
  • a DNA polymerase having an activity of performing strand displacement of DNA is used. Those having substantially no 5, ⁇ 3, exonuclease activity are particularly preferably used.
  • the DNA polymerase used in the ICAN method is not particularly limited as long as it has the above strand displacement activity.
  • Bacillus caldotenax hereinafter referred to as B.ca
  • thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerases that lack the 5, ⁇ 3 'exonuclease activity or large fragments of Escherichia coli-derived DNA polymerase I (Tarenow cleavage) Fragment) and the like.
  • the DNA polymerase any one of from room temperature to heat can be suitably used.
  • the above enzyme may be any of those obtained by purifying from its original source, or recombinant proteins produced by genetic engineering.
  • the enzyme may be modified by substitution, deletion, addition, insertion or the like by genetic engineering or other techniques.
  • Examples of such an enzyme include 5 ′ ⁇ 3, B ca BEST DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), which is a B ca DNA polymerase lacking exonuclease activity, and the like.
  • the enzyme shows activity at 50 ° to 70 ° and can be suitably used in the method.
  • DNA polymerases under certain conditions have an endonuclease activity, For example, those having RNaseH activity are known.
  • Such DNA polymerase can be used in the method of the present invention. That is, there is an embodiment in which the DNA polymerase is used under conditions such that RNase H activity is expressed, for example, in the presence of Mn 2 + .
  • it is possible to implement the Ku method of the present invention such addition of the RNa S eH. That is, in a buffer containing Mnz + , the above-mentioned Bca DNA polymerase can exhibit RNase H activity.
  • the above embodiment is not limited to Bca DNA polymerase, and Known DNA polymerases known to have the same, such as Tth DNA polymerase derived from Thermus therraophilus, can also be used in the present invention.
  • a chimeric oligonucleotide primer In the ICAN method, a chimeric oligonucleotide primer, a sample containing a nucleic acid to be type III, an endonuclease, a DNA polymerase, a deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), etc. This is carried out by mixing in a buffer solution and keeping the reaction solution at an appropriate temperature for a period of time sufficient to generate a reaction product.
  • dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
  • the chimeric oligonucleotide primer and the nucleic acid to be type III are mixed and maintained at a temperature at which the double-stranded nucleic acid is denatured, for example, at 90 ° C or higher, and then the reaction used in the method of the present invention is performed.
  • the annealing may be performed by cooling to below the temperature. This is not an essential operation for the amplification reaction.
  • RNA when RNA is type II, the reverse transcription reaction and the nucleic acid amplification reaction may be performed in one step.
  • examples of a combination of a reverse transcriptase and a strand-replaceable DNA polymerase include AMV RTase, MMLVRTase, or RAV-21, 36 and 8. & A combination of DNA polymerases can be suitably used. Further, one kind of DNA polymerase having reverse transcriptase activity and strand displacement activity may be used.
  • the method for detecting a target nucleic acid of the present invention can be carried out by directly detecting the target nucleic acid from a sample containing the nucleic acid.
  • the chain length of the target nucleic acid to be expanded is not particularly limited, but from the viewpoint of detecting the target nucleic acid with high sensitivity, for example, a region of 200 bp or less, more preferably 150 bp or less is effective.
  • the width of the chain By setting the chimeric oligonucleotide primer of the present invention such that the target nucleic acid in the sample can be detected with high sensitivity.
  • a reaction buffer containing a bicine, tricine, a mouse, a phosphate, or a tris buffer component, and an annealing solution containing a spunolemidine or propylene diamine are used.
  • the target nucleic acid can be detected with even higher sensitivity from a small amount of nucleic acid sample.
  • the endonuclease and the DNA polymerase to be used are not particularly limited. For example, a combination of Escherichia coli, Pyrococcus bacteria or Alkaeoglobus bacteria RNaSeH and BcaBESTDNA polymerase is preferable.
  • the number of units that can be suitably used for the above-mentioned endonucleases and DNA polymerases may differ depending on their types.
  • improvement of the detection sensitivity or increase in the amount of the amplified product is used as an index.
  • the composition of the buffer and the amount of enzyme added may be adjusted.
  • each ⁇ DNA during the extension reaction from each primer is used.
  • Type II exchange may occur between the intermediates of the extended strands, and the synthesized primer extended strands may produce a double-stranded nucleic acid in which the two have been annealed.
  • This double-stranded nucleic acid has chimeric oligonucleotide primers at both ends, and then a complementary strand elongation reaction by strand displacement can be started again from both ends.
  • an amplification product having a primer sequence at one end is generated.
  • type ⁇ exchange occurs during this reaction, the same double-stranded nucleic acid as described above is generated again.
  • a nucleic acid amplification method including a step of performing a type I exchange reaction using a DNA polymerase having the above strand displacement activity
  • the DNA polymerase having the ability to carry out the type I exchange reaction during the strand displacement reaction include, for example, a mutant enzyme of Bca DNA polymerase lacking 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity. It is preferably used.
  • This enzyme is commercially available as Bca BESTDNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo), and Escherichia coli HB101 / pUI205 (FERM BP-3720, Tsukuba East 1-chome, Ibaraki Pref. 1 Chuo No. 6 (Zip code 3 05-8566) May 10, 1991 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology B) can be prepared by the method described in Japanese Patent No. 2978001.
  • dUTP can be incorporated as a substrate during amplification of a target nucleic acid. Therefore, when dUTP is used as a substrate, the amplification product is degraded using ⁇ lacinole N-glycoside, and urase 1 N-glycosidase (U NG). This can prevent false positives caused by the situation.
  • a known nucleic acid detection method for example, a method of detecting a reaction product of a specific size by electrophoresis, or a hybridization with a probe Detection by zession or the like can be used. Further, a detection method using a combination of magnetic beads and the like can also be suitably used.
  • a fluorescent substance such as ethidium bromide is usually used, but hybridization with a probe may be used in combination.
  • the probe may be labeled with a non-radioactive substance such as biotin or a fluorescent substance in addition to labeling with a radioisotope.
  • a labeled nucleotide in the above-mentioned step (b), it is possible to incorporate a labeled nucleotide into an amplification product to facilitate detection.
  • detection using a fluorescence polarization method, fluorescence energy transfer, or the like can be performed.
  • an appropriate detection system it is possible to automatically detect the target nucleic acid or to quantify the target nucleic acid. Also, a naked eye detection method using a hybrid chromatography method can be suitably used.
  • RNA probes or chimeric oligonucleotide probes composed of liponucleotides and deoxyribonucleotides, labeled with two or more fluorescent substances, arranged at a distance so as to be in the quenching state, were used in the present invention.
  • the probe does not fluoresce.
  • RNaseH degrades the probe when applied to amplified DNA from the target nucleic acid that is complementary to it. As a result, the distance between the fluorescent substances on the probe is reduced. A lot of fluorescence is emitted, and the presence of the target nucleic acid can be known.
  • a target nucleic acid can be detected only by adding the above probe to the reaction solution.
  • a fluorescent substance used for labeling the probe for example, a combination of 6-FAM (6-carboxyfluorescein) and TAMRA (N, N, N ,, N, -tetramethyl-6-carboxyrhodamine) is preferable.
  • 6-FAM 6-carboxyfluorescein
  • TAMRA N, N, N ,, N, -tetramethyl-6-carboxyrhodamine
  • the width method under isothermal conditions is used in the detection method of the present invention
  • a device such as a thermal cycler is not required.
  • the number of primers to be used can be one or two, which is smaller than that of the conventional method. Since a reagent such as dNTP used in PCR or the like can be used, the running cost can be reduced as compared with the conventional method. Therefore, it can be suitably used in fields such as genetic testing where routine work is performed. Furthermore, since the method of the present invention can obtain more amplification products in a shorter time than the PCR method, it can be used as a simple, rapid, and highly sensitive gene detection method.
  • a means for analyzing a large amount of a sample may be combined with a means for slightly reducing the reaction system and further increasing the degree of integration.
  • One of the means is to use the most advanced ultrafine processing technology to apply the basic process of the detection method of the present invention, for example, the process of extracting DNA from cells, nucleic acid amplification reaction, detection of target DNA, etc. May be combined on a microchip having a size of several cm square to a fingertip.
  • gel or capillary electrophoresis, and a hybridization process with a detection probe may be combined.
  • the system is also referred to as a microphone or chip, and it is also referred to as a chip or a nanochip.
  • any nucleic acid amplification reaction can be used as long as the target DNA fragment is amplified.
  • a method capable of amplifying a nucleic acid under isothermal conditions such as the ICAN method, can be suitably used.
  • the system can be simplified, and it is very suitable for use in an integrated system as described above.
  • a chimeric oligonucleotide primer for detecting a Mycobacterium tuberculosis group having a base sequence represented by each of SEQ ID NOS: 13 to 16 in the Sequence Listing, SEQ ID NOS: 28 to 29 in the Sequence Listing A chimeric oligonucleotide primer for detecting a bacterium having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23, a chimeric oligonucleotide primer for detecting chlamydia having a nucleotide sequence represented by each of SEQ ID NOS: 23 to 26 in the sequence listing, SEQ ID NO: in the sequence listing
  • a chimeric oligonucleotide primer for detecting HCV having a nucleic acid sequence represented by each of 30 to 31 can be suitably used.
  • the target nucleic acid in the sample is amplified using the chimeric oligonucleotide primer, and the target a
  • a probe for detecting a Mycobacterium tuberculosis group selected from the regions containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 11, 12, and 38 to 40 in the sequence listing, and the sequence in the sequence listing A probe for detecting a bacterium selected from the region containing the nucleotide sequence represented by No. 27; a probe for detecting a chlamydia selected from the region containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 22 and 44 in the sequence listing;
  • the target nucleic acid can be detected using an HCV detection probe selected from the regions containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 43 to 45 in the sequence listing.
  • a required reaction apparatus may be a thermostatic layer, and a strict apparatus such as a thermal cycler is not required.
  • a device for measuring the label signal a commercially available spectrophotometer, fluorescence detector, plate reader, or the like can be used. Therefore, large-volume rapid sample measurement is possible in the place where normal inspection work is performed. Further, reagents necessary for the method of the present invention are also on the market.
  • RNA of HCV extracted from a sample by a conventional method
  • a primer for a reverse transcription reaction a reverse transcriptase (a DNA polymerase having a reverse transcription activity is used. If you do not need reverse transcriptase), dATP, dGTP, dCTP, 11: Ding?
  • a mixed nucleic acid solution is prepared, and the target nucleic acid is amplified with the chimeric oligonucleotide primer and the DNA polymerase for ICAN using the cDNA generated from HCV-RNA at a constant temperature as type III, On this Hybridize with the fluorescent labeled probe in a homogenous system and measure the fluorescence intensity. Specific conditions for the reaction are described in detail in the Examples below.
  • cDNA is synthesized using HCV-RNA as type II, and then DNA is amplified by ICAN method using this cDNA as type II. Since the amplified DNA contains a region complementary to the fluorescent probe, the fluorescent probe hybridizes to the single-stranded amplified DNA. When the fluorescent probe hybridizes, the suppression of the fluorescence intensity is released and the fluorescence intensity increases. On the other hand, when HCV RNA does not exist in the sample, hybridization does not occur, and the fluorescence intensity is suppressed and the fluorescence intensity is weak. Therefore, by measuring the fluorescence intensity, the RNA of HCV in the sample can be detected simply, quickly and with high sensitivity.
  • HCV RNA is measured as a fluorescence intensity without a washing step in a homogenous system.
  • the present invention is also advantageous in that simultaneous measurement of multiple items can be performed by changing the measurement wavelength by changing the fluorescent dye. That is, at blood centers, not only HCV but also HBV, HIV, and HTLV are important test items.Specific ICAN primers and probes are prepared for each, and each probe is labeled with a fluorescent dye having a different measurement wavelength. By doing so, it is possible to measure the above items simultaneously.
  • a chimeric oligonucleotide primer is exemplified.
  • the primer is composed of a deoxyliponucleotide, a nucleotide analog, an unmodified or modified liponucleotide, and has a liponucleotide arranged at the 3, terminal or 3 'terminal thereof.
  • an oligonucleotide having a structure represented by the following general formula can be used as a primer in the ICAN method.
  • dN Deoxyliponucleotide and / or nucleotide analog
  • N Unmodified ribonucleotide and Z or modified liponucleotide nucleotides, Note, d N a part of d N sites may be substituted by N
  • nucleotide analogs include, for example, deoxyriboinosine nucleotides, deoxyribouracil nucleotides or modified deoxyribonucleotides, and the modified liponucleotides include, for example, (HIS) ribonucleotides. , Can be used respectively.
  • the primer has a sequence homologous to the 5'-side and 3'-side nucleotide sequences based on the 5'-side and 3'-side nucleotide sequences of the region of type III where amplification is desired, and has a 3'-side nucleotide sequence. Two complementary species are created and used for amplification.
  • nucleic acid amplification reaction for example, after performing a nucleic acid amplification reaction by the above-described method on a sample from which a group of M. tuberculosis is to be detected, hybridization is performed between the amplified product and the probe of the present invention.
  • a group of Mycobacterium tuberculosis can be detected.
  • Primers for nucleic acid amplification were designed for use in various nucleic acid amplification methods with reference to the nucleotide sequence of the Mycobacterium tuberculosis complex IS 6110 gene shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing. , Can be produced.
  • a region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 of the sequence listing in the IS610 gene or a region containing a part thereof preferably the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing or A region capable of amplifying a region containing a part thereof, more preferably a region containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 in the sequence listing or a part thereof is suitable for the present invention.
  • SEQ ID NO: 11 It is useful for amplification of a gene or a fragment thereof.
  • the detection can be suitably performed by using a probe for detecting phosphorus bacterium, chlamydia, HCV, and a chimeric oligonucleotide primer.
  • the primer is not limited to the above-mentioned base sequence, and those having a sequence around the base sequence, that is, a sequence partially overlapping the sequence, can be suitably used in the present invention. That is, a primer can be prepared by selecting an appropriate nucleotide sequence overlapping with the sequence according to the characteristics of the nucleic acid amplification method to be used.
  • chimeric oligonucleotide primers are designed to have an arbitrary nucleic acid sequence, for example, Applied Biosystems (ABI, Applied Biosystems).
  • the deoxyliponucleotide at the 3 ′ terminal of the primer may be replaced with liponucleotide so that it can be used in the method.
  • An example of such a primer is a chimeric oligonucleotide primer having a base sequence represented by each of SEQ ID NOS: 13 to 16, 23 to 26, and 28 to 31 in the sequence listing.
  • these primers may be labeled with an appropriate substance, for example, a fluorescent substance, a dye, a ligand (eg, biotin, digoxigen), or colloidal gold.
  • an appropriate substance for example, a fluorescent substance, a dye, a ligand (eg, biotin, digoxigen), or colloidal gold.
  • a primer labeled with a ligand for example, use a primer labeled with a ligand.
  • a highly sensitive and simple quantitative measurement method is provided, such as capturing the amplified target nucleic acid on a carrier.
  • the solid phase include microtiter plates, beads, magnetic beads, membranes, and glass.
  • Extracted DNA samples from sputum specimens contain not only human DNA but also DNA derived from bacteria resident in the respiratory tract and viruses. Therefore, in order to investigate the specificity of the primer developed in the present invention, an attempt was made to amplify the M. tuberculosis group gene using sputum from Porantia, which had no history of M. tuberculosis infection. The lack of a positive result in such a test may prove the specificity of this primer.
  • the present invention provides a composition used for the detection method of the present invention (2).
  • the yarn composition include those containing the probe described in the above (1) and the primer described in the above (3).
  • it may be in the form of a detection composition containing the above-mentioned probe and an amplification composition containing the above-mentioned primer.
  • it may be in the form of a composition containing magnesium acetate and a composition containing a primer.
  • it may contain a buffer component, dNTP and the like.
  • it may contain a modified deoxyribonucleotide or an analog of deoxynucleotide triphosphate.
  • composition of the present invention may contain an internal standard (I C; int ern alc on t ro 1) for confirming a non-amplification situation (false negative) due to decomposition and inactivation of the reagent in the composition of the present invention.
  • the internal standard can be amplified by the primer of the present invention.
  • composition suitable for the detection method of the present invention and containing the various components described above can be mentioned.
  • the composition is a suitable type III and chimeric oligonucleotide primer.
  • the amplification reaction can be carried out only by adding.
  • a composition containing a chimeric oligonucleotide primer suitable for amplification of the amplification target is suitable.
  • a composition suitable for the nucleic acid amplification method of the present invention and containing the various components described above.
  • the composition can be amplified only by adding an appropriate type II.
  • the reaction can be performed.
  • a detection probe is included, a target nucleic acid derived from a pathogenic microorganism can be detected in real time.
  • the use of the method of the present invention, the composition or the kit for the method makes it possible to compare the conventional Amplicon HCV kit with a measurement range of two orders.
  • the measurement range can be extended to three orders.
  • the time required for a conventional Amplicon HCV kit is approximately 5 Compared to the time, the present invention can significantly reduce the required time to about 45 minutes. Therefore, it is possible to increase the number of samples that can be processed in one day.
  • the kit of the present invention is a kit for detecting a target nucleic acid derived from a pathogenic microorganism, and is not particularly limited, but a probe capable of hybridizing with a target nucleic acid under conditions of pH exceeding pH 7, particularly limited
  • the probe contains the probe described in (1) above.
  • kits for detecting a tuberculosis bacterium group include Mycobacceteriumutubesirccuolisis, Mycobaccteiumbovios BCG, Mycobaccteriuimafricanum, Mycobatecreimummicoroti, and proprietary and bi
  • the kit can also be used for detection of Mycobacterium tuberculosis colonies under pH conditions exceeding pH 7.
  • kits of the present invention includes a kit for detecting a phosphorus bacterium.
  • the kit is characterized in that it contains a probe capable of specifically detecting Neisse riagon horea e.
  • the kit can also be used for detecting phosphate bacteria under alkaline conditions exceeding pH7.
  • kits for detecting chlamydia includes a kit for detecting chlamydia.
  • the kit is characterized in that it contains a probe capable of specifically detecting Chlamidiattrachomatis.
  • the kit can also be used for the detection of chlamydia under alkaline conditions exceeding pH7.
  • kits for detecting HCV includes a kit for detecting HCV.
  • the kit is characterized by containing a probe capable of specifically detecting HCV.
  • the kit can also be used for detecting HCV under alkaline conditions exceeding pH 7.
  • the above-mentioned kit may contain a primer as another embodiment. Furthermore, a reagent for a nucleic acid amplification method for amplifying a target gene (DNA polymerase) And a kit containing reagents used for the probe detection reaction, reagents used for extracting nucleic acids from the specimen, and the like.
  • the kit is suitable for performing the method for detecting a tuberculosis bacterium group or the like of the present invention simply and promptly.
  • the kit can provide test results with high reproducibility and reliability, especially when examining the presence of a tuberculosis bacterium group or the like in a large number of samples.
  • it may contain an internal standard (IC; internal 1 control) for live confirmation of false negative 'I "and a probe for detecting the internal standard.
  • the internal standard is amplified by the primer of the present invention. be able to.
  • the kit is characterized in that it comprises, in packaged form, instructions for the use of the probes, primers, DNA polymerase and endonuclease of the invention.
  • commercially available DNA polymerase and / or endonuclease may be selected and used according to the instructions. Further, it may contain a reagent for a reverse transcription reaction when the RNA is of type II.
  • the DNA polymerase can be selected from the DNA polymerases described above.
  • the end nuclease can be selected from either Pfu-derived RNAse HII or Afu-derived RNAseHII.
  • the ⁇ instructions '' are printed materials that describe how to use the kit, for example, how to prepare a reagent solution for strand displacement reaction, recommended reaction conditions, etc.
  • the label attached to the kit and the one described on the package containing the kit are included. It also includes information disclosed and provided through electronic media such as the Internet.
  • the kit of the present invention may include a reaction buffer containing a bicine, tricine, mouse, phosphate, or Tris buffer component, and a annealing solution.
  • DNA polymerase ⁇ RNaseH may be contained.
  • it may contain modified deoxyliponucleotides or analogs of deoxynucleotide triphosphates.
  • the kit of the present invention provides a kit capable of detecting a target nucleic acid derived from a pathogenic microorganism in real time by appropriately selecting a detection probe. (6) The nucleic acid extraction method of the present invention
  • the present invention provides a nucleic acid extraction method for detecting Mycobacterium tuberculosis or the like with high sensitivity.
  • nucleic acid extraction from clinical specimens is a delicate and difficult process, from liquid samples such as urine, pleural effusion, cerebrospinal fluid, and blood to dense viscous samples such as pus and sputum, as well as cells and tissues.
  • the target is wide even to things.
  • the present inventors have studied the above-mentioned various conventional methods and the muramidase, which has been used in the past to produce nucleic acids from the genus Listeria, Lactobaci 11 us, and the genus Streptococcus. Mutanolysin from S trept om ycesglobisporus
  • the sample containing M. tuberculosis was treated with muramidase for 30 minutes, treated at 96 ° C for 5 minutes at the next step, and the gene was amplified by the ICAN method to detect M. tuberculosis.
  • muramidase for 30 minutes
  • treated at 96 ° C for 5 minutes at the next step
  • the gene was amplified by the ICAN method to detect M. tuberculosis.
  • the above-described series of detection operations can eliminate the inhibitory effect of the components mixed in the nucleic acid extract on the nucleic acid amplification reaction in the conventional method using a surfactant or a chaotropic pick reagent.
  • the heat treatment also has a bactericidal effect against tuberculosis bacterium and the like, and has the advantage of preventing infection of tuberculosis bacterium and the like in the laboratory, which has been troublesome for conventional inspectors. Therefore, the invention of this protocol can rapidly, safely and highly sensitively extract DNA of M. tuberculosis and the like.
  • the sputum when sputum is used as a sample, the sputum is first processed by a known sputum processing method, NAL C (N-acetyl-L-cysteine) _NaOH method. After the treatment, it is preferable to carry out the above-described nucleic acid extraction method of the present invention. That is, the detection method of the present invention may include a step of treating a sample containing Mycobacterium tuberculosis or the like with muramidase to extract a nucleic acid.
  • NAL C N-acetyl-L-cysteine
  • the obtained bacterial cells were suspended in 4 ml of 25% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and 0.4 ml of 1 OmgZm 1 Shiojiri lysozyme (manufactured by Nakara Testa Co., Ltd.) ) An aqueous solution was added and reacted at 20 ° C for 1 hour. After completion of the reaction, 24 ml of 15 OmM NaCl, 1 mM EDTA, 2 OmM Tris-HC1 (pH 8.0), 0.2 ml of 2 Omg / m1 proteinase K
  • the PH1650 gene (SEQ ID NO: 1) and a part of the genome of Pyrococcus furiosus, which have been partially disclosed, are available at the University of Utah, Utah Genome Center homepage: http: // www. Genome. Utah, edu / sequence, html). As a result, a sequence with a very high homology was found.
  • primers 1650 Nde SEQ ID NO: 2
  • 165.0 Bam SEQ ID NO: 3
  • PCR was carried out in a volume of 100 Z1 using 20 pmol of 1650 Nde and 20 pmo 1 of 1650 Ba as primers.
  • DNA poly in PCR As the merase, Takara Ex tack (manufactured by Takara Shuzo) was used according to the attached protocol, and the PCR was performed 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute as one cycle.
  • the amplified DNA fragment of about 0.7 kb was digested with NdeI and BamHI (both from Takara Shuzo), and the obtained DNA fragment was digested with NdeI of plasmid vector; pET3a (Novagen). Plasmid p between I and BamHI
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pPFU220 obtained in (2) above was determined by the dideoxy method.
  • E. coli HMS174 (manufactured by Novagen)
  • E. coli HM S174 (DE3) containing the obtained pPFU220 was transformed at 100 g / m1.
  • the cells were inoculated into 2 liters of LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C for 16 hours with shaking. After completion of the culture, the cells collected by centrifugation were transferred to a 66.
  • Om 1 solution buffer [5 OmM Tris-HCl
  • the heat-treated supernatant was applied to a RES OUR SEQ column (manufactured by Amersham-Balmacia Biotech) equilibrated with buffer A [5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0) ImM EDTA], and then subjected to an FP LC system (Amersham Fanolemasia). Chromatography was performed using Biotech). As a result, the RNAse HII passed through the RE SOURS EQ column.
  • the passed RNase HII fraction was applied to a RES OUR SES column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer A, and the linear concentration of OmM NaC1 was determined using an FP LC system.
  • the RNase HII fraction eluted at about 15 OmM NaCl by the gradient was obtained.
  • This RNase HII fraction was purified by centrifugation using Centricon 10 (Amicon). The solution was concentrated by filtration, and 250 ⁇ l of the concentrated solution was flattened with 5 OmM Tris-HC1 (pH 8.0) containing 10 OmM NaCl10. ImM EDTA.
  • the solution was applied to a 200 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Nanotech) and eluted with the same buffer.
  • RNase HII was eluted at a position corresponding to a molecular weight of 17 kDa. This molecular weight corresponds to the case where RNase HII is present as a monomer.
  • RNAseHII eluted in this manner was used as a PfuRNaseHII standard.
  • RNaseH activity was measured by the following method using the P PuRNaseHHII sample obtained above.
  • Amelekajeglobus fulgidus (Archaeoglobus fulgidus, purchased from Germany Che Zamnosch von Microonoreganismen ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ D D D D D D D ⁇ ⁇ ⁇ 8) Suspend in 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0) and add 20 ⁇ l of 0.5 ⁇
  • the amplified DNA fragment of about 0.6 kb is digested with NdeI and BamHI (both from Takara Shuzo Co., Ltd.), and the obtained DNA fragment is treated with a plasmid vector: TV119Nd (1 ⁇ oI site of pTV1191 ⁇ ). Was converted to an NdeI site) to produce a plasmid pAFU204 which was inserted between NdeI and BamHI.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pAFU204 obtained in (2) above was determined by the dideoxy method.
  • E. coli JM109 was transformed with pAFU204 obtained in (2) above, and the obtained E. coli JM109 containing pAFU204 was inoculated into 2 liters of LB medium containing 100 wg Zml of ampicillin, and incubated at 37 ° C for 16 hours. The cells were cultured with shaking for hours. End of culture After completion, the cells collected by centrifugation were transferred to 37. lm 1 sonication buffer [50111] ⁇ 1 Tris ⁇ [ ⁇ 1 (pH 8.0), 1 mM EDTA, 2 mM phenyl methanesulfonyl fluoride] And sonicated.
  • This crushed liquid was centrifuged at 12000 r 1) 111 for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to a heat treatment at 70 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again at 12000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a heat-treated supernatant of 40.3 ml.
  • the heat-treated supernatant was applied to a RES OU RSEQ column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer A [50 mM Tris-HC1 (pH 8.0), ImM EDTA], and the F PLC system (Amersham Pharmacia Biotech) was used. Chromatography). As a result, RNaseHI I passed through the RESOURSE Q column.
  • RNAseHII passed through the RESOURSE S column.
  • the RNaseH II fraction passed through 40.Oml was buffered with 50 mM NaC1 in buffer B [50 mM Tris-HC1 (pH 7.0), ImMEDTA] 21 as an external solution, and subjected to 2 hour dialysis three times. Got it.
  • the dialyzed enzyme solution (40.2 ml) was applied to a HiTra ph eparin column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer B containing 5 OmM NaC1. Eluted with a linear gradient of O-550 mM NaCl. As a result, an RNaseHII fraction eluted at about 24 OmM NaC1 was obtained.
  • This RNaseHI fraction 7.8 ml was concentrated by ultrafiltration using Centricon-1 10 (manufactured by Amicon), and about 600 1 of the concentrated solution was divided into four portions to give 100 mM NaCl, 0 50 mM Tris-HC1 containing ImM EDTA (pH 7.
  • the solution was applied to a Superose 6 gel filtration column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated in step 0), and eluted with the same buffer.
  • RNase HI I was located at a position corresponding to a molecular weight of 30.0 kDa. Eluted. This molecular weight corresponds to the case where RNaseHII exists as a monomer. In this way The released RNaseHII was used as an AfuRNaseHII sample.
  • the number of cuts of the heat-resistant RNaseH used in the method of the present invention was calculated by the following method.
  • the poly (rA) - was prepared poly (dT) dissolved solution.
  • 0.5 M EDTA ( ⁇ ) was added to the above reaction solution, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 10 minutes, and the absorbance was measured.
  • a value (absorbance difference) was obtained by subtracting the absorbance of the control from the absorbance determined by reacting in the absence of EDTA. That is, the concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the absorbance difference.
  • concentration of nucleotides released from the poly (rA) -poly (dT) hybrid by the enzymatic reaction was determined from the absorbance difference.
  • One unit of RNaseH is equivalent to 1 nmol of ribonucleotide released A 26 . was calculated as the amount of the enzyme to be increased in 10 minutes, according to the following equation.
  • Polyadelic acid solution Polyadelic acid was diluted to 3 mM with sterile ultrapure water.
  • Enzyme diluent Final concentrations of 25 mM Tris-HCl (pH 7.5, 37 ° C), 5 mM 2-mercaptoethanol, 0.5 mM EDTA (pH 7.5, 37 ° C), 3 OmM sodium chloride And 50% glycerol in sterile water.
  • Preparation of heat-denatured calf thymus DNA 200 mg of calf thymus DNA was suspended in 100 ml of TE buffer and allowed to swell. The absorbance of the solution at UV 260 nm was measured and diluted with sterile ultrapure water to a concentration of 1 mg / ml. Next, the solution was heated at 100 ° C. for 10 minutes and rapidly cooled in an ice bath.
  • reaction solution 501 for total CPM and the reaction solution 501 for plank were prepared by adding 1 ⁇ l of an enzyme diluent instead of the enzyme solution.
  • the mixture was kept at 0 ° C for 5 minutes, and then centrifuged at lOOO rpm for 10 minutes. After centrifugation, place 250 ⁇ l of the resulting supernatant in a vial and add Aquasolu 2 ( ⁇ Life 1 Oml was added, and the CP ⁇ was measured with a night body scintillation counter.
  • the unit number of each enzyme was calculated by the following formula.
  • a specific oligonucleotide probe for detecting the IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis was prepared based on the nucleotide sequence described in GenBank Accession No. X 52471. That is, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing
  • the oligonucleotide probe MTIS-2BF with FITC (fluorescein isothiocyanate) at the end was synthesized using a DNA synthesizer.
  • a chimeric oligonucleotide primer was prepared for synthesizing a DNA fragment derived from the Mycobacterium tuberculosis group IS 6110 gene by the ICAN method.
  • a forward primer K-F103-3-2 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, a nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 16 in the sequence listing, and a biotin at the 5 'end
  • a reverse primer K-R113133-2Bio was synthesized by a DNA synthesizer.
  • a reaction solution for the ICAN reaction shown in Table 1 was prepared and allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes.
  • an ICAN amplification reaction was carried out also by combining the K-F1033-2 / K-R1133-2 primer. After the completion of the reaction, a part of the above reaction solution was subjected to electrophoresis to confirm a target amplified fragment.
  • Dissolve streptavidin (manufactured by Nacalai) at a concentration of PBS and add this solution to a 96-well microtiter plate for white light emission detection so as to obtain 15 Oju 1 urenole, and leave at 4 ° C overnight. Then, I fixed it. After discarding the streptavidin solution, a 1% BSA-PBS solution was dispensed to 200 ⁇ l / well and left at 4 ° C for ⁇ to perform blocking. The solution discarded was used as a streptavidin-coated plate in the following experiments.
  • Detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA was performed as described above for sputum-derived DNII samples containing 0, 5 and 10 copies of the genome of Mycobacterium tuberculosis complex. As a result, as shown in Table 2, strong luminescence with an S / N ratio of about 300 times was detected even in 5 copies.
  • the present invention enables rapid and highly sensitive detection of M. tuberculosis.
  • the method for detecting Mycobacterium tuberculosis of the present invention can be suitably used in any of the method for extracting nucleic acid of the present invention and the method using a reagent for yeast Gent. Therefore, the usefulness of the nucleic acid extraction method of the present invention was confirmed in view of the simplicity of the operation method.
  • the method of the present invention agreed well with the results of the culture test, but the PCR method detected two cases that were negative in the culture method as false positives, and one case that was positive in the culture method. Detected as false negative.
  • the method of the present invention can obtain an accurate inspection result extremely quickly and easily as compared with the conventional method.
  • the specificity of the detection method of the present invention for the Mycobacterium tuberculosis group was examined.
  • As the genomic DNA 37 strains shown in Table 4 were used.
  • each genomic D NA is the copy number was calculated from the OD value, was diluted to 2 X 1 0 7 copies.
  • Example 2 (1) Detection of Mycobacterium tuberculosis complex using magnetic beads was examined.
  • primers MTIS-2F primer and MTIS-2RBio primer were used.
  • the extracted genome derived from the positive sample in Example 2 was diluted with sterile water to prepare a 30-fold, 300-fold, or 3000-fold extract of type II. The reaction was performed as follows.
  • the reaction solution was set on a thermal cycler personal set at 60 ° C. in advance and held for 60 minutes. The obtained amplified fragment was automatically detected by Lumino.
  • the detection system when the internal standard (IC; internal control) was combined was examined.
  • An internal standard was prepared as follows. That is, human genome DNA was designated as type III, and PCR amplification was carried out using the primers of SEQ ID NOS: 17 and 18 in the rooster table. The resulting amplified fragment was purified by a conventional method and inserted into pT7BlueT-vector (Novagen). The plasmid was used as an internal standard. The reaction was carried out under the same conditions as described in Example 3 with the addition of 1, 3, and 10 pg of the above plasmid. 0, 2, and 20 copies were used for the type I M. tuberculosis genome.
  • an I C probe (I CF probe) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing and having a F ITC label at the 5 ′ end, and a F ITC labeled probe MT ISB F were used.
  • I C probe I CF probe
  • F ITC labeled probe MT ISB F F ITC labeled probe
  • Hybridization buffer (5 X SSC, 1% Triton Xl O O,
  • Negative control solution 0.02 ml Mycobacteri um tuberculosis strain and Mycobacteri um bovis BCG strain were detected using the above reagents. We have discovered that it can be specifically detected.
  • oligonucleotide probes for detecting Chlamydia cryptic plasmids were constructed. That is, an oligonucleotide probe CT1234 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 of the sequence listing and having FITC (fluorescein isothiosinate) attached to its 5 ′ end was synthesized by a DNA synthesizer. In addition, a specific oligonucleotide probe for detecting the cppB gene of the bacterium was prepared.
  • an oligonucleotide probe CppB3 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 of the sequence listing and having FITC (fluorescein isothiosinate) attached to its 5 'end was synthesized by a DNA synthesizer. .
  • DNA fragments derived from Chlamydia cryptic plasmids were combined by the ICAN method.
  • a chimeric oligonucleotide primer was prepared. That is, based on the base sequence of the chlamydia talibic plasmid shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing, a foreprimer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NOS: 23 and 24 in the sequence listing.
  • a chimeric oligonucleotide primer was prepared for synthesizing a DNA fragment derived from the phosphobacterium cppB gene by the ICAN method. That is, based on the base sequence of the Chlamydia talibutic 'plasmid shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, a forward primer pJDBF-I comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing Reverse primers pJDBR-3Bio having the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and having a biotin at the 5 'end were synthesized by a DNA synthesizer.
  • Dissolve streptavidin (manufactured by Nacalai) at a concentration of 2 / ig / ml in PBS, and add this solution to a 96-well microtiter plate for white luminescence detection at a concentration of 15 ⁇ l / well. It was left undisturbed at 4 ° C for 1 hour and fixed. After discarding the streptavidin solution, a 1% BSA-PBS solution was dispensed so as to be 200/1 / well, and allowed to stand at 4 ° C for blocking. The discarded solution was used as a streptavidin-coated plate in the following experiments.
  • Hybridization buffer was added to the above streptavidin-coated plate.
  • wash buffer 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Wash the well twice with Tween 20]. Then, a peroxidase-labeled anti-FITC ⁇ egret antibody (Chemicon ) was added to a hybridization buffer at a concentration of 2 g Zm 1, and the mixture was allowed to react at room temperature for 20 minutes. After the reaction, discard the solution, wash the wells 4 times with 200 ⁇ l / well of wash buffer,
  • Chlamydia DNA detection was performed on DNA samples containing the chlamydia genome equivalent to 0, 100 and 100 copies as described above. As a result, as shown in Table 8, even at 10 copies, strong emission of about 30 times in SZN ratio was detected. In addition, the detection of the phospho-DNA was performed on the DNA sample containing the phospho-genome corresponding to 0, 10 and 100 copies as described above. As a result, as shown in Table 9, even at 100 copies, light emission with a strong S / N ratio of about 300 times could be detected. Table 8
  • the present invention enables rapid and highly sensitive inspection of chlamydia and phosphobacterium.
  • HCV-F and HCV-R1 chimeric oligonucleotide primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 30 and 31 in the sequence listing and the bases of SEQ ID NOs: 32 and 33 in the sequence listing Oligonucleotide primers having a sequence for a reverse transcription reaction were synthesized. Furthermore, oligonucleotide probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 34 and 35 in the rooster list were synthesized.
  • TAMRA (manufactured by N, N, ⁇ ', N, -tetramethyl-6-carboxy-rhodamine ABI) was prepared at the 5, terminal of the above oligonucleotide probe by an automatic DNA synthesizer and used as a fluorescent-labeled probe. .
  • the copy number of the HCV-RNA positive serum obtained with informed consent was calculated using the Amplicon HCV moter kit (Roche), and this was used as the sample diluent supplied with the kit, and 1 copy from 1 x 10 7 copies. A 10-fold dilution series was prepared up to 71 and used as HCV-RNA.
  • CDNA was synthesized from the HCV-RNA prepared in the above (2) using the reverse transcription reaction primer prepared in the above (1), and First-sttranddcDNA SynthesEsKit (manufactured by Takara Shuzo).
  • Table 10 shows the composition of the reaction solution per tube.
  • the above reaction solution 471 was added per reaction tube, 3 ⁇ l of the cD ⁇ solution prepared in (4) was added thereto, and the mixture was kept at 56 ° C for 30 minutes. After completion of the reaction, apply the fluorescent labeling probe prepared in (1) above to this reaction mixture so that the final concentration becomes 300 nM, treat at 98 ° C for 2 minutes, and cool to 25 ° C by cooling with water. , Held.
  • the fluorescence intensity of the reaction solution was measured with a fluorescence detector, fluoroscan (manufactured by Lavao Systems). Furthermore, as a control, the same sample was used for the measurement using an amplicor HCV kit (manufactured by Roche) by a commercially available PCR method.
  • Figure 1 shows the results.
  • Figure 1 is a graph showing the change in fluorescence intensity when various HCV-RNA concentrations were measured and a comparison of the measurement range with the conventional method.
  • the left vertical axis shows the OD450 value, and the right vertical axis shows the fluorescence intensity (SN). Ratio) and the horizontal axis indicates the amount of HCV-RNA.
  • the black squares in Fig. 1 show the results obtained by the method of the present invention, and the black circles show the results obtained using the Amplicor HCV kit.
  • the fluorescence intensity (SN ratio) increased as the number of HCV-RNA copies increased.
  • the time required for the HCV detection method of the present invention was 45 minutes.
  • the time required for the control Amplicor HCV kit was about 5 hours.
  • the detection range of HCV-RNA as shown in Fig. Although increasing is in accordance with increase in the number of copies of the V- RNA, measurement range is 2 O over Zehnder, in 1 0 5 or more copies, it was confirmed that there is no quantitative properties.
  • the method of the present invention has a wide detection range of three orders.
  • the method of the present invention was excellent in terms of simplicity and rapidity, and it was confirmed that the method was suitable for processing multiple samples.
  • RNA was prepared from HCV-RNA extraction reagent (Roche) attached to Amplicor HCV kit from 100 ⁇ ⁇ of each of 28 serums of HCV patients from which informed consent was obtained.
  • Example 1 HCV-RN ⁇ was amplified by the same method as described in (3) and (4), and used for the detection method of the present invention.
  • the cut-off value was defined as the average value of the fluorescence intensity of 10 negative controls + 3 SD (three times the standard deviation) performed on the control sample containing no HCV-RNA. Specimens showing a fluorescence intensity exceeding were regarded as positive.
  • the same sample was measured with a commercially available Amplicor HCV kit, and positive / negative was determined according to the instruction manual of the kit. Table 11 shows a comparison between the results of the detection method of the present invention and the results of the conventional Amplicon HCV kit.
  • Negative 0 case 10 case As shown in Table 11, it was confirmed that the measurement result by the method of the present invention correlated well with the result obtained by the conventional method. In addition, it was confirmed that the method of the present invention can measure with high sensitivity, quickly and easily, compared to the conventional method.
  • the present invention it is possible to measure pathogenic microorganisms with high sensitivity, high specificity, and quickly and easily.
  • a method, a primer, a probe, and a kit that can process a large number of samples in a limited time without using special equipment are provided.
  • SEQ ID NO: 2 PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
  • SEQ ID NO: 3 PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
  • SEQ ID NO: 7 PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a
  • polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
  • SEQ ID NO: 8 PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a
  • polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
  • SEQ ID NO: 11 Oligonucleotide probe to detect the DNA derived from Mycobacterium tuberculosis
  • SEQ ID NO: 13 Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
  • nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides
  • SEQ ID NO: 14 Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
  • nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides
  • SEQ ID NO: 15 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
  • nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides
  • SEQ ID NO: 16 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of ISollO gene derived from Mycobacterium
  • nucleotides 20 to 22 are; ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides "
  • SEQ ID NO: 17 Oligonucleotide primer C4-MT2F— S100 to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
  • SEQ ID NO: 18 Oligonucleotide primer C4— MT2R- A to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
  • SEQ ID NO: 19 Oligonucleotide probe to detect the internal control DNA
  • SEQ ID NO: 20 Oligonucleotide probe CT1234 to detect the Chramydia criptic plasmid
  • SEQ ID N0: 21 Oligonucleotide probe CppB3 to detect Neisseria gonorrhoeae cppB gene
  • SEQ ID NO: 23 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. ⁇ nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides'
  • SEQ ID NO: 24 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "Nucleotides 20 to 22 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID NO: 25 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid, "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID NO: 26 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "Nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID NO: 28 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID NO: 29 Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuc ⁇ eotides"
  • SEQ ID No: 30 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV- F to amplify a portion of HCV. "Nucleotides 19 to 21 are
  • SEQ ID No: 31 Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
  • Ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
  • SEQ ID No: 32 Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV
  • SEQ ID No: 33 Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV
  • SEQ ID No: 34 Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
  • SEQ ID No: 35 Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
  • SEQ ID No: 36 Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
  • SEQ ID No: 37 Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
  • SEQ ID No: 41 Primer area to amplify a portion of HCV
  • SEQ ID No: 42 Primer area to amplify a portion of HCV
  • SEQ ID No: 43 Probe area to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV

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Description

明 細 書 病原微生物の検出方法 技術分野
本発明は、 病原微生物の検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブ、 プライマ 一、 これらを使用する病原微生物の検出方法、 ならびに該方法のためのキットに 関する。 背景技術
病原微生物の検出方法としては、 当該微生物由来のタンパク質を免疫学的に検 出する方法あるいは当該微生物由来の遺伝子の特定の領域を核酸増幅反応により 増幅して検出する方法等が知られている。 上記遺伝子の特定の領域を検出する方 法としては、 核酸増幅反応を用いる検出法が例示される。 該核酸増幅反応として は、 米国特許第 4， 683， 195号、 第 4， 683, 202号および第 4， 8 00, 159号に記載のポリメラーゼ連鎖反応法 （PCR法） 、 トレンズ イン バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology) 第 10卷、 146〜 152頁 (1992) に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写 PC R法 (RT—PCR法） 、 1989年 6月 14日に公開された欧州特許出願第 320， 308号に記述されているリガーゼ連鎖反応 （LCR； ligase chain
reaction) 法、 PCR プロ卜コールズ (PC Protocols, Academic Press.
Inc. , 1990) 245〜 252頁に記述されている転写增幅システム （TAS ; transcription-based amplification system) 法力 ¾ げられる。
また、 等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。 例えば、 特公平 7— 1 14718号に記載の鎖置換型増幅 （SDA； strand displacement
amplification; 法、 自 ΙΔ複製 (3 SR； self-sustained sequence
replication) 法、 日本国特許番号第 2650159号に記載の核酸配列増幅
(NASBA； nucleic acid sequence based amplification) fe、 TMA (transcription-mediated amplification) 法、 曰本国特許番号第 271015 9号に記載の Q j3レプリカーゼ法、 さらに米国特許番号第 5, 8 24, 5 1 7号、 国際公開第 9 9/0 9 2 1 1号パンフレツト、 国際公開第 9 5/25 1 8 0号パ ンフレツトあるいは、 国際公開第 9 9/49 08 1号パンフレツト等に記載の 種々の改良 SD A法が挙げられる。 米国特許番号第 5, 9 1 6， 77 7号には等 温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。 さらに、 国 際公開第 00/2808 2号パンフレツトに記載の LAMP (Loop-mediated Isothermal Ampl ication)法、 国際公開第 00/5 6 8 7 7号パンフレツトに 記載の Iし AN (Isotnerraal and Chimeric primer - initiated Amplification of Nucleic acids) 法力 sある。
このように、 病原微生物の検出方法において利用できる核酸増幅法はいろいろ ある力 実際の病原微生物を検査する現場が要求する検出感度を満たすように、 それぞれの核酸増幅反応に適した標的核酸領域、 それぞれの核酸増幅方法に適し たプライマーならびにそれぞれの核酸増幅反応に続く標的核酸検出方法に適した プローブを選択することは困難であった。 さらに、 低ランニングコストで、 かつ 再現性のある結果を得ることができる病原微生物の検出方法が求められていた。 以下、 病原微生物として、 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 C型肝炎ウィルス (HCV) を例に挙げて説明する。
(a) 結核菌群
結核は、 過去において人間の死因の上位を占める疾患であり、 種々の治療法が 開発された現在においてもなお多数の患者が存在する。
結核の診断は、 従来、 培養法、 塗抹法によって行われてきた力 結核菌は発育 が遅いことから、 検査結果が得られるまで 1〜 8週間、 通常約 1ヶ月と迅速性に 欠け、 正確さも 70 %以下であるなど十分な診断法ではなかつた。 このような背 景から、 近年、 結核菌の遺伝子をターゲットとした、 喀痰などからの直接、 迅速、 正確な検出法ならびに試薬が開発されている。 上記結核菌群には、 My c o b a c t e r i um t u b e r c u i o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s B CG、 My c o b a c t e r i um a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i、 My c o b a c t e r i um c a n e t t iが含まれる。 例えば、 喀痰などの検体から DN Aを抽出し、 PCR法により結核菌の存在を 迅速に検出する方法 [ランセット （Lancet) 、 第 86ァ1号、 第 1069頁 （1989) ] が 報告されている。 該方法は結核菌の 65 kD a抗原をコードする遺伝子をターゲ ットとして P C R法により増幅し、 電気泳動法で検出する方法である。 また、 1 6 Sリポソーム RN Aを増幅し、 増幅産物を化学発光プローブで検出するキット も市販されている [ジェンープローブ （Gen - Probe) 社] 。 さらに、 16 Sリポ ソーム RNAをコードする DNAをターゲットとした PCRキットも市販されて いる （ロシュ社） 。
一方、 結核菌群に特異的な I S 61 10という遺伝子の配列が公表されており [ヌクレイック ■ァシッズ' リサーチ （Nucleic Acids Research) 、 第 18卷、 第 188頁 （1990年） ] 、 結核菌群の検出のためのプローブとして有用であろうこ とが記載されている。 実際、 PCR法による I S 6110遺伝子の検出方法が報 告されている [ジャーナル ·ォブ■クリ二カル■マイクロバイオロジー (J. Clin. Microbiol. ) 、 第 28卷、 第 2668頁 （1990) ] 。 その後、 I S 61 10遺 伝子をターゲットとした P CR法に関する論文は多数報告され、 その有用性が記 載されている。 また、 PCR法とは別の核酸増幅法である SDA法による I S 6 1 10遺伝子の検出に関する日本特許第 2814422号、 LCR法による I S 61 1 0遺伝子の検出に関する特表平 10- 500023号がある。
しかしながら、 上記の結核菌の検出方法は臨床の現場ではまだまだ満足できる 方法ではなく、 さらなる改善が要望されている。 例えば、 リボソーム RNA遺伝 子をターゲットとした核酸増幅検出法が広く報告されているが、 あくまでも Mycobacterium属に共通な部分を増幅し、 種特異的なプローブで結核菌を同定す るものである。 該方法では結核菌への特異性を決定するのはプローブの配列だけ であり、 検出感度の点を含めて不安があり、 培養陽性検体であっても検出できな い症例が存在することが多々報告されている。 一方、 特異性と検出感度を上げる ため上記のように I S 61 10という結核菌特異的な遺伝子をターゲットとした PCR法も報告されている。 し力 し、 7つの施設での I S 61 10をターゲット とした検査の比較研究では、 当該方法による偽陽性の割合が 3〜77%、 感度が 2〜 90 %と各施設ごとに検査結果が大きく異なることが明らかとされている [ジャーナルォブ ·クリ二カル ·マイクロバイオロジー、 第 32巻、 第 277頁 (1994) ] 。
一方、 検体からの核酸の抽出方法も煩雑で、 検査員の感染という面でも十分配 慮された抽出法ではなかった。
また、 増幅産物の検出法においてハイブリダイゼーション法が利用されるが、 従来は増幅された二本鎖の核酸をまず液層で強アル力リで変成させ、 次に変成し た一本鎖核酸を剥がれた相補的核酸の共存下で中性条件でプローブとハイブリダ ィズさせる方法が用いられていた （ロシュ社アンプリコアキット説明書） 。 これ では、 プローブのハイプリダイゼーシヨンが、 2本鎖から剥がれた相捕的増幅核 酸に競合的に妨害され感度■特異性が上がらないという問題点があった。 すなわ ち、 増幅された二本鎖 D NAをいつたんアルカリ変性によって一本鎖とし、 これ を中和した後に中性条件下でプローブとハイプリダイズさせていた。 また、 アル カリ変性を嫌って熱変性を行う場合もあったが、 これでは多数の検体を精度良く 検査することは不可能であった。 このため、 工程も多く、 また一本鎖とされた D NAの一方がプローブと競合してハイブリダィズし、 標的核酸の検出感度を低下 させることにもなつた。
また、 従来の方法ならびに市販のキットでは検体採取から結果報告まで約 6時 間以上を要し、 結核症という感染症であるがゆえに一刻も早い診断と患者隔離な どの対処が要求されるにもかかわらず、 検体採取から結果報告とそれに伴う患者 への対処が即日対応できず翌日になってしまい、 結核感染の伝播を最小限に食い 止めることができないという公衆衛生上重大な問題点が解決されず残っていた。 以上のように公開されている情報から、 結核菌に対する信頼でき、 かつ医療の 場に有用なものは未だ存在しないことが明らかになつた。
( b ) リン菌
リン菌 （すなわちナイセリ了■ ゴノルホエア、 N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e ) は、 アメリカ合衆国において最も一般的に報告される細菌感染 の 1つである淋病の病原体である。 Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5 ： 327-335 ；アメリカ特許第 5， 2 5 6 , 5 3 6号；及びアメリカ特許第 5 , 5 2 5， 7 1 7号は、 N. ゴノルホエア シトシン D NAメチルトランスフェラ ーゼ遺伝子 (M. N g o ΡΠ) の配列と有意な相同性を有するオープンリーデ イングフレーム （ORF 1) を含むゲノムフラグメントに由来する DN Aプロ一 ブを用いての N. ゴノルホエアの検出を記載している。 しかしながら、 リン菌を 特異的にかつ十分な感度で検出できる方法はなかった。
また、 リン菌により感染された患者は、 クラミジァ トラコマチス （Ch i a my d i a t r a c h oma t i s) にも感染している事例が報告されている。
(c) クラミジァ
「クラミジァ」 とはクラミジァ属に属する微生物をいう。 クラミジァ属の三つ の種、 クラミジァ トラコマチス （C. t r a c h oma t i s) 、 クラミジァ シッタシ （C. p s i t t a c i ) 、 クラミジァ ェユーモニエ （C. p n e u mo n i a e) はヒト宿主に感染し、 疾患を起こしうることから臨床的に重要で ある。 特にクラミジァ トラコマチスは、 男女両性で性器感染症を引き起こす、 先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されている。 従って、 クラミジ ァ トラコマチスを特異的に、 そして適時に検出できる方法および試薬が必要と されている。
(d) HCV
従来より、 血清等の試料中の HCVの検出は、 逆転写 PCR (RT-PCR) 法により行われている。 この方法は、 （1) 血清からの HCVの RNAの抽出、 (2) 抽出した RNAを铸型とした cDNAの合成、 (3) 温度を上下させる P CR法による増幅、 （4) 固定化プローブとのハイプリダイゼーシヨン、 （5) 未反応試薬の洗浄除去、 (6) 標識試薬との反応、 (7) 未反応試薬の洗浄除去、 (8) 発色試薬の添加、 (9) 発色停止薬の添加、 (10) 吸光度の測定の計 1 0工程で行われている。 また、 J. V i r o l . Me t h o d s Vo l . 64， p p l 47-1 59 (1997) 記載のリアルタイム検出 P C R法を用いたホモ ジユアス検出法による HCV検出も検討されている。
上記のように HCVを高感度に簡便に、 かつ大量検体を迅速にかつ安価に測定 することは、 血液製剤、 輸血、 献血の品質管理、 治療経過の判定、 症例のモニタ リング、 あるいは治療費用の低減の観点からも非常に重要である。 しかしながら、 上記 P C R法では温度の厳密な制御が必須であり、 そのための測定機械は複雑か っ大掛かりなものとなる一方で、 その処理能力は、 現時点では 5時間で 96検体 が限界である。 そのため、 血液センタ や臨床検査センターで要求される 2時間 に 1000検体以上という大量検体を測定することは不可能であった。
このように従来の方法は、 いろいろな問題をかかえており、 一定時間内に多数 の検体中の HC V核酸を簡便に短時間で測定する技術が求められていた。 発明の目的
本発明の主な目的は、 一定時間内に多数の検体について病原微生物を高感度で 正確に、 カゝつ、 簡便に短時間で、 さらに安価で測定する手段を提供することにあ る。 発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、 従来の核酸増幅方法より優れた核酸増幅方法を 利用した病原微生物の検出方法を見出した。 また、 該方法のための標的核酸増幅 用キメラオリゴヌクレオチドプライマーおよび標的核酸検出用プローブを見出し た。 さらに、 該方法のためのキットを構築し、 、 本発明を完成するに至った。 すなわち本発明の第 1の発明は、 結核菌群の My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 M y c o b a c t e r i um a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um mi c r o t i及ぴ Z又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出 可能なプローブであって、 配列表の配列番号 39記載の塩基配列あるいはその一 部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 1 1記載の塩 基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 2の発明は、 リン菌の N e i s s e r i a g o no r r h o e a eを検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 27記載の塩基配列あるい はその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 21 記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 3の発明は、 クラミジァの Ch 1 amy. d i a t r a c homa t i sを検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 22記載の塩基配列あ るいはその一部を含有することを特徴とするプローブあるいは配列表の配列番号 2 0記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 4の発明は、 H C Vを検出可能なプローブであって、 配列表の配列 番号 3 4、 3 5記載の塩基配列であること特徴とするプローブに関する。
本発明の第 5の発明は、 アルカリ領域において病原微生物の標的核酸にハイプ リダィズ可能なプローブに関する。 本発明の第 5の発明において p H 8〜l 4の アル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプローブが 好適であり、 当該病原微生物の標的核酸は結核菌、 リン菌、 クラミジァ、 H C V 由来の標的核酸のいずれかであるプローブが好ましい。 また、 病原微生物の標的 核酸は結核菌群の I S 6 1 1 0遺伝子、 リン菌の c p p B遺伝子、 クラミジァの p L G V 4 4 0、 H C Vの 5 ' 非翻訳領域の塩基配列から選択され、 該遺伝子に ノ、イブリダィズ可能なプローブが好適に使用できる。 該プローブとしては、 結核 菌群の I S 6 1 1 0遺伝子に存在する配列表の配列番号 3 9に示される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番 号 1 1に示される塩基配列からなるプローブが例示される。 また、 リン菌の c p p B遺伝子に存在する配列表の配列番号 2 7に示される塩基配列、 又はその一部 を含有する塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 2 1に示さ れる塩基配列からなるプローブが例示される。 また、 クラミジァの p L G V 4 4 0に存在する配列表の配列番号 2 2に示される塩基配列、 又はその一部を含有す る塩基配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 2 0に示される塩基 配列からなるプローブが例示される。 さらに H C Vの 5 ' 非翻訳領域に存在する 配列表の配列番号 3 4、 3 5に示される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基 配列からなるプローブ、 好ましくは配列表の配列番号 3 4、 3 5に示される塩基 配列からなるプローブが例示される。
本発明の第 1〜第 5の発明のプロープは、 標識を付加されていてもよレ、。 該プ ローブは、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5で示される塩基配列 のうち連続する 8塩基ないし 5 3塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオ チドであって、 標的核酸とハイプリダイズした場合には蛍光強度が抑制されず、 標的核酸とハイプリダイズしない場合は蛍光強度が抑制されるように蛍光標識さ れたものであることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 ま た、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5に示される塩基配列のうち、 連続する 8塩基以上からなる病原微生物検出用プローブであってもよく、 その 5 '末端がローダミン系蛍光色素またはォキサジン系蛍光色素で標識されたプロ ープであつて、 配列表の配列番号 3 4に示される塩基配列のうち、 連続する 8塩 基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブであってもよい。 当 該標識蛍光色素がレポ一タ一蛍光色素及びクェンチヤ一色素を有するプローブで あって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4、 3 5に示される塩基配列の うち、 連続する 8塩基以上からなることを特徴とする病原微生物検出用プローブ であってもよい。 上記レポーター色素は、 フルォレツセイン系色素であり、 クェ ンチヤー色素が DA B C Y L系色素であってもよい。 さらに、 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 金コロイド、 および放射性同位体から選択される標識を付加さ れているプローブが好適に使用できる。
本発明の第 6の発明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを使用し、 病原 微生物の標的核酸とハイプリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の 検出方法に関する。 本発明の第 6の発明において、 アルカリ領域で病原微生物の 標的核酸とハイプリダイゼーシヨンを行うことができる。 また、 当該病原微生物 としては結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vが例示される。 当該病原微生物 が結核菌群の場合、 標的核酸は I S 6 1 1 0遺伝子またはその断片が好適であり、 結核菌由来の I S 6 1 1 0遺伝子および/またはその断片を増幅した後に、 増幅 物と本発明の第 1または第 5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨン を行うことが好ましい。 また、 配列表の配列番号 3 6、 3 7にそれぞれ示される 塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有するブラィマーを使用して結 核菌群由来の I S 6 1 1 0遺伝子および/またはその断片が増幅されることが好 ましい。 また、 病原微生物がリン菌の場合、 標的核酸は c p p B遺伝子またはそ の断片が好適であり、 リン菌由来の c p p B遺伝子および Zまたはその断片を増 幅した後に、 增幅物と本発明の第 2または第 5の発明のプローブとの間でハイブ リダイゼーシヨンを行うことが好ましい。 また、 配列表の配列番号 2 8、 2 9に それぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有するプライ マーを使用してリン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断片が増幅され ることが好ましい。 また、 病原微生物がクラミジァの場合、 標的核酸は p L G V 4 4 0またはその断片が好適であり、 クラミジァ由来の p L G V 4 4 0および/ またはその断片を増幅した後に、 増幅物と本発明の第 3または第 5の発明のプロ ープとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことが好ましい。 また、 配列表の配 列番号 2 3〜 2 6にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する 配列を有するプライマーを使用してクラミジァ由来の p L G V 4 4 0および Zま たはその断片が増幅されることが好ましい。 また、 病原微生物が H C Vの場合、 標的核酸は H C Vの 5， 非翻訳領域またはその断片が好適であり、 H C V由来の 5 5 非翻訳領域および/またはその断片を増幅した後に、 増幅物と本発明の第 4 または第 5の発明のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことが好ま しい。 また、 配列表の配列番号 3 0〜 3 3にそれぞれ示される塩基配列、 もしく は該配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して H C V由来の 5 ' 非 翻訳領域および/またはその断片が増幅されることが好ましい。
本 明の第 7の発明は、 本宪明の第 6の発明の病原微生物の標的核酸の検出方 法を用いて結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C V由来の核酸を検出する工程を 包含する病原微生物の検出方法に関する。
本発明の第 8の発明は、 下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸 を検出することを特徴とする病原微生物の検出方法。
( a ) 鎵型となる核酸、 デォキシリポヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る D NAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および RN a s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 铸型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリボヌクレオチド又はヌ クレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有し、 該リポヌ クレオチドは該プラィマーの 3 ' 末端又は 3 ' 末端側に配置されたキメラオリゴ ヌクレオチドプライマーであり、 ；および、
( b ) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程、
に関する。 本発明の第 8の発明において、 さらに铸型となる核酸の塩基配列に実 質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有する反応 混合物を使用することが好ましい。 また、 当該キメラオリゴヌクレオチドプライ マーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプラィマーであるものが 好適に使用できる。
一般式： 5' — dNa— Nb— dNc— 3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び 又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
また、 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの cが 0であってもよく、 ヌ クレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシリボウラシ ルヌクレオチドであり、 '修飾リボヌクレオチドが — s) リポヌクレオチドで あってもよい。 また、 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28~31で それぞれ表される塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を使用 することが好ましい。 さらに、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを用いて増 Φ畐核酸を検出する工程を包含してもよい。
本 明の第 9の発明は、 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴ ヌクレオチドプライマーに関する。
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及ぴ Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及び //又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
本発明の第 9の発明において、 cが 0であるものが好適に使用でき、 当該ヌク レオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシリポゥラシル ヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （ α— S ) リポヌクレオチドであ るキメラオリゴヌクレオチドプライマ一が好適である。 とくに限定はされないが、 例えば配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28〜31でそれぞれ表され る病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプラィマーが好適である。 本発明の第 10の発明は、 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩 基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 結核菌由来の I S 611
0遺伝子および Zまたはその断片を増幅するためのプラィマー、 配列表の配列番 号 27に示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 リン 菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断片を増幅するためのプライマー、 配列表の配列番号 22に示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列 を有する、 クラミジァ由来の p LGV440および Zまたはその断片を増幅する ためのプライマー、 配列表の配列番号 41〜43にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5， 非翻訳領域およ ぴ Zまたはその断片を増幅するためのプライマーに関する。
本発明の第 10の発明において、 上記プラィマーは塩基配列の一部がリポヌク レオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。 ま た、 本発明の第 9及び第 10の発明において、 標識を付加されていてもよい。 当 該標識としては、 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 および金コロイドが例示さ れる。
本発明の第 1 1の発明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを含有するこ とを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第 12の発明は、 本発明の第 9〜第 10の発明のプライマーを含有す ることを特徴とする標的核酸検出用組成物に関する。
本発明の第 1 1ならびに第 12の発明は、 病原微生物の検出に使用できる。 本発明の第 1 3の発明は、 本発明の第 6〜第 8の病原微生物の検出方法に使用 するための組成物であって、 標的核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーシヨンを 行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検出用組成物に関する。 本発明の第 1 3の発明において、 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 R N a s e H、 及びデォキシリボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有 してもよい。 当該 DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス （B a c i l l u s c a l d o t e n a x) 由来の 5，→3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c aDNAポリメラーゼであってもよく、 当該 RNa s eHがピロコッカス （P y r o c o c c u s) 属細菌由来及び/又はアルカェォグロパス （Ar c h a e o g 1 o b u s ) 属細菌由来の I I型 R N a s e Hであってもよい。
本発明の第 1 4の究明は、 本発明の第 1〜第 5の発明のプローブを含有するこ とを特徴とする病原微生物検出用キットに関する。
本発明の第 1 4の発明において、 本発明の第 9〜第 1 0のプライマーを含有し てもよい。 当該キットは、 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vの検出に使用 することができる。 また、 当該キットは、 本発明の第 6〜第 8の病原微生物の検 出方法に使用するためのキットであって、 標的核酸の増幅もしくはハイプリダイ ゼーシヨンを行うための少なくとも 1種の試薬を包含してもよい。 また、 鎖置換 活性を有する D N Aポリメラーゼ、 R N a s e H、 及ぴデォキシリボヌクレオチ ド 3リン酸から選択される試薬を含有してもよい。 当該 D NAポリメラーゼがバ チルス カルドテナックス由来の 5， →3 ' ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a D N Aポリメラーゼが好適であり、 RN a s e Hがピロコッカス属細菌由来及び Z又 はアルカェォグロバス属細菌由来の I I型 R N a s e Hであってもよい。 さらに、 増幅産物を捕捉するための担体を含有してもよく、 該担体がマイクロタイタープ レート、 ビーズ、 マグネチックビーズ、 メンブラン、 およびガラスから選択され る担体であるものが好適に使用できる。
本発明の第 1 5の発明は、 結核菌群の検出方法において、 結核菌含有検体をム ラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群 の検出方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1 本発明の方法により、 各種 H C V— R NA濃度を測定した場合、 H C V 一 R N A濃度と蛍光強度の変化の関係、 ならびに従来法との測定範囲の差を比較 した図である。 発明の詳細な説明
本明細書においてデォキシリボヌクレオチド （本明細書中では d Nとも記載す る） とは、 糖部分が D— 2ーデォキシリポースで構成されたヌクレオチドのこと をいい、 例えば、 塩基部分にアデニン、.シトシン、 グァニン、 チミンを有するも のが挙げられる。 さらに、 7—デァザグアノシン等の修飾塩基を有するデォキシ リポヌクレオチドゃデォキシィノシンヌクレオチドのようなデォキシリポヌクレ ォチドアナログも上記のデォキシリボヌクレオチドに包含される。'
本明細書においてリポヌクレオチド （本明細書中では Nとも記載する） とは、 糖部分が D—リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、 塩基部分にアデ ニン、 シトシン、 グァニン、 ゥラシルを有するものが挙げられる。 さらに、 当該 リポヌクレオチドには修飾リポヌクレオチドが包含され、 例えば α位のリン酸基 の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド [ ( a— S ) リポヌク レオチド、 （ひ一 S ) Νとも記載する] やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、 デォキシリポヌ クレオチドおよびリポヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。 該プラ イマ一はヌクレオチドアナログおよび/または修飾ヌクレオチドを含有していて もよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、 該プライマーの 3， 末端又は 3， 末端側にリポヌクレオチドを配置し、 本発明の方法において核 酸鎖が伸長でき、 ェンドヌクレアーゼで切断でき、 鎖置換反応を行うことができ るものであれば、 いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包 含される。
本明細書において 3 ' 末端側とは、 核酸、 例えば、 プライマーにおいてその中 央より 3 ' 末端にかけての部分を指す。 同様に 5， 末端側とは、 核酸においてそ の中央より 5 ' 末端にかけての部分を指す。
本明細書においてェンドヌクレアーゼとは、 铸型核酸にアニーリングした上記 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一より D NAの伸長を行って生成した二本鎖 ^Ν、Αに作用して、 該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するも のであればよい。
本明細書において D NAポリメラーゼとは、 D NA鎖を錶型として新たな D N Α鎖を合成する酵素のことを言レ、、 天然型の D NAポリメラーゼの他、 前記活性 を有する変異体酵素も包含される。 当該酵素としては、 例えば鎖置換 (Strand displacement)活性を有する D NAポリメラーゼ、 5 ' →3 ' ェキソヌクレア一 ゼ活 1"生を有していない DNAポリメラーゼ、 逆転写酵素活性ゃェンドヌクレア一 ゼ活性を併せ持つ DN Aポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において 「鎖置換活性」 とは、 铸型となる核酸配列に従って DNA複 製を行う際、 DNA鎖を置き換えながら進行し、 铸型鎖にアニーリングしている 相補鎖を遊離させる、 即ち鎖置換 （strand displacement) することができる活 性のことをいう。 また、 本明細書においては、 鎖置換により铸型となる核酸配列 カ ら遊離した DNA鎖のことを 「置換鎖」 と称する。
本明細書においてアル力リ領域とは、 pHが 7を越える領域のことをいう。 本明細書において、 病原微生物とは、 病原性の細菌ならびにウィルスのことを いう。
本明細書において標的核酸とは、 核酸増幅あるいは検出の対象となる病原微生 物由来の遺伝子の任意の領域のことをいい、 DNAあるいは RNAのいずれもが 含まれる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
(1) 本発明のプローブ
本発明のプローブは、 病原微生物、 例えば結核菌群、 リン菌、 クラミジァある いは HCVを検出しうることを特徴とする。 本発明のプローブの好適な態様とし ては、 アル力リ領域において標的核酸に安定してハイブリダイズできるものが例 示される。 すなわち本発明のアルカリ領域でハイブリダィズ可能なプローブとし ては、 特に限定はないが、 例えば pH7. 0を超えるアルカリ領域、 好ましくは p H 8〜 14の範囲、 特に好ましくは pH8〜pH10の範囲のアル力リ条件下 においてその塩基配列に相補的な配列を有する標的核酸とハイブリダイズするこ とが可能なプローブ挙げられる。 特に限定はされないが例えば、 配列表の配列番 号 1 1、 20、 21、 34、 35記載の塩基配列を含有するものが挙げられる。 なお、 本発明のプローブは従来の中性領域でのハイブリダィゼーシヨンに用いる ことができる。
本発明の： 7°口ープを使用する場合、 二本鎖核酸をアル力リ処理によつて一本鎖 に変性した後、 中和することなくハイプリダイゼーション工程に使用することが 可能である。 これによつて工程も簡略ィヒされ、 感度も従来の方法の 10倍以上向 上する。 また、 アルカリ領域でハイブリダィズさせることにより、 ハイプリダイ ゼーションの特異 '性を向上させることができる。
検体由来の核酸とハイプリダイズしたプローブの検出法には特に限定はなく、 公知の検出方法のいずれもが本発明に適用できる。
上記の本発明のプローブを適切な方法で標識して使用することにより、 試料中 に存在する標的核酸を効率よくおよび Zまたは高感度に検出することができる。 プローブの標識方法には限定はなく、 例えば放射性同位体 （32 P等） 、 色素、 蛍光物質、 発光物質、 種々のリガンド （ピオチン、 ジゴキシゲニン等) 、 酵素等 が使用できる。 標識されたプローブは当該標識に応じた検出方法でその存在を確 認することができる。 直接検出できないリガンドの場合には、 検出可能な標識を 付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。 例えば、 リガンド標識し たプローブと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、 シグナルを増幅するこ とによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
さらに上記プローブは、 検出のための標識物質を有していてもよい。 標識物質 は、 特に限定はされないが例えばリガンドあるいはレセプター物質、 放射性同位 元素、 蛍光、 発光、 発色のいずれもが好適に使用できる。
本発明の方法においては、 標識物質を有したプローブと目的の領域を増幅した 核酸とをハイプリダイズし、 フリ一のプローブを洗浄後に検出する方法やあるい は該洗净工程を省レ、た、 いわゆるホモジエアス検出法の 、ずれもが好適に使用で きる。 蛍光を利用した該ホモジ -ァス検出法としては、 例えば、 P r o c. ，
Na t l . Ac a d. S c i . USA、 v o l . 8 5、 p 8790〜879 4 (1 98 8) に記載の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET； Fluoresence resonance energy transfer) 法、 Na t u r e B i o t e c hn o l o g y、 v o l . 14、 p 303〜308 (1 9 96) に記載の分子ビーコン
(Molecular Beacons) 法、 An a l . C h e m. 、 v o l . 72、 p 371 7
〜3 724 (2000) に記載のスマートプローブ （Smart probe) 法等が好適 に使用できる。
本発明の態様の一つとして、 当該プローブの 5'末端がロ^ "ダミン系またはォ キサジン系色素で標識され、 3，末端がクェンチングを起こす塩基配列であるォ リゴヌクレオチドゃレポーター色素で標識され、 さらに該プローブの 5，末端側 と 3，末端側がセノレファエーリングしている、 分子ビーコン法あるいはスマート プ口ーブ法の場合が例示される。
上記のプローブを用いた場合、 本発明の増幅方法によって増幅された核酸が存 在すると、 該増幅核酸にプローブがハイプリダイズして、 プローブのセ ファニ ーリング構造が解消され、 その結果として蛍光強度が抑制されずに蛍光シグナル を発するようになる。 一方、 増幅核酸が存在しない場合は、 プローブはセルファ ニーリング構造を保持し、 蛍光強度が抑制されるため蛍光シグナルは検出されな い。
すなわち、 スマートプローブ法の場合、 前記蛍光色素はローダミン系色素また はォキサジン系色素が好ましく、 該色素は上記プローブの 5，末端に結合され、 3 '末端の塩基配列と協調して標的核酸に該蛍光プローブが結合していないとき は蛍光強度が抑制され、 標的核酸に該蛍光プローブが結合した場合には蛍光強度 が抑制されない性質を持つものであればょ 、。
一方、 分子ビーコン法の場合は、 標的核酸に該蛍光プローブが結合していない 場合には蛍光共鳴エネルギー転移によってその蛍光強度が抑制され、 結合した場 合には蛍光強度が抑制されないような組み合わせになればよい。
これら蛍光色素としては、 FAM (6—カルボキシーフルォレツセィン) や Τ AMRA (6—力ルポキシーテトラメチルーローダミン） や JA242 (ォキサ ジン） や DABCYL ( 4ージメチルァミノアゾベンゼン一 4 ' 一スルホユルク 口ライド） が好ましい。 これらの蛍光色素は公知であり、 市販されている。
なお、 オリゴヌクレオチドに蛍光標識する方法は、 例えば、 N u c . Ac i d s Re s. 、 v o l . 12、 p 3387〜3403 (1984) 、 J . Am. Ch em. S o c. 、 v o l. 112、 p l 253〜1254 (1990) あ るいは、 An a l . C h e m. 、 v o l. 70、 p 4771〜4779 (19
98) に記載の方法が利用できる。
本発明のプローブの鎖長は、 特に限定はされないが例えば、 12me r以上、 好ましくは 2 Ome r以上、 特に好ましくは 4 Ome r以上である。
本発明の結核菌群検出用プローブは、 My c o b a c t e i u t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i u m a f r i c a n u m、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i及ぴ Z又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出するこ とができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しょうとする核酸、 もしくは生物 に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するものではないが、 例えば結 核菌群の検出においては I S 61 10遺伝子を標的核酸とするプローブが使用で き、 配列表の配列番号 12に示される結核菌由来 I S 6110遺伝子の塩基配列 力 適切な領域を選択することにより設計することができる。 特に限定はされな いが例えば、 配列表の配列番号 39に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましく は配列表の配列番号 40を含む領域から、 さらに好ましくは配列表の配列番号 3 8を含む領域から選択することができる。 特に配列表の配列番号 11記載の塩基 配列を含む領域から選択することができる。 上記のプローブは、 結核菌群由来の I S 6110遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異性をもってハイ プリダイズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらには結核菌群の検出に特に有 用である。
本発明のリン菌検出用プローブは、 Ne i s s e r i a g o no r r h o e a eを検出することができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しょうとする核 酸、 もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するものでは ないが、 例えばリン菌の検出においては c r y p t i c 1 a s m i d p r o t e i nB (c p pB) 遺伝子を標的核酸とするプローブが使用でき、 配列表 の配列番号 27に示されるリン菌由来 c p p B遺伝子の塩基配列から適切な領域 を選択することにより設計することができる。 特に限定はされないが例えば、 配 列表の配列番号 27に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましくは配列表の配列 番号 21を含む領域から選択することができる。 上記のプローブは、 リン菌由来 の c p pB遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異性をもってハイブ リダィズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらにはリン菌の検出に特に有用で ある。
本発明のクラミジァ検出用プローブは、 Ch l amy d i a t r a c h om a t i sを検出することができる。 当該プローブは、 標的核酸は検出しようとす る核酸、 もしくは生物に応じて適切なものを選択すればよく、 特に限定するもの ではないが、 例えばクラミジァの検出においてはクリプティック 'プラスミド
(c r y t i c p l a smi d) p L G V 440を標的核酸とするプローブ が使用でき、 配列表の配列番号 22に示されるクラミジァ由来 p LGV440の 塩基配列から適切な領域を選択することにより設計することができる。 特に限定 はされないが例えば、 配列表の配列番号 22に記載の塩基配列を含む領域から、 好ましくは配列表の配列番号 44を含む領域から、 さらに好ましくは配列表の配 列番号 20を含む領域から.選択することができる。 上記のプローブは、 クラミジ ァ由来の pLGV440、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異 1"生をもって ハイブリダィズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらにはクラミジァの検出に 特に有用である。 ·
また、 本発明の HCV検出用プローブは、 標的核酸増幅時に使用するフォヮ一 ド側プライマー及びリバース側プライマーで挟まれた領域の塩基配列にハイプリ ダイズ可能なプローブであれば特に限定はされない。 また、 該プローブの長さは、 特に限定はされないが、 好ましくは 8塩基〜 53塩基の範囲、 特に好ましくは 8 塩基〜 36塩基の範囲で選択すればよい。 例えば、 配列表の配列番号 43に示さ れる塩基配列から上記範囲で連続する 8塩基以上の塩基配列を有するプローブを 選択すればよく、 特に限定はされないが、 配列表の配列番号 34あるいは 35に 示される塩基配列の中の連続する 8塩基以上を有するプローブが挙げられる。
(2) 本発明の検出方法
本発明の標的核酸の検出方法は、 上記 (1) 記載のプローブを用いることによ り、 標的核酸の 2本鎖から 1本鎖への変性工程に続く中和工程を省略できる。 す なわち、 本発明の標的核酸の検出方法において p Hが 7を越えるアル力リ条件、 特に好ましくは pH8〜14の範囲のアル力リ条件下においてその塩基配列に相 補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることが可能である。 当該ハイプリ ダイゼーシヨンの条件としては、 特に限定するものではないが、 「厳密な条件」 として当業者に知られている条件を挙げることができる。 このような条件は、 1989年、 コールド'スプリング ·ハーバー ·ラボラトリ一発行、 T. マニアティ ス （T. Maniatis) ら編集、 モレキュラー .クローユング：ァ 'ラボラトリー ' マ-ユアノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. ) に IB 載のものや、 本願実施例に記載されたものが使用できる。
代表的なハイブリダイゼーション溶液の組成としては次のものが挙げられる： 0 . 5 % S D S、 5 Xデンハルツ [Denhardt' s ； 0 . 1 %ゥシ血清アルブミン (B S A) 、 0 . 1 %ポリビ-ルピロリ ドン、 0 . 1 %フイコール 4 0 0 ] 及ぴ
1 0 0 /X g /m 1サケ精子 D NAを含む 6 X S S C ( 1 3 3〇は0 . 1 5 M N a C l、 0 . 0 1 5 M クェン酸ナトリウム） 。 なお、 本発明においてはハイ ブリダイゼーション溶液の p Hは 8〜 1 4の範囲に調整して実施してもよい。 ハイブリダィゼーシヨンの温度は、 特に限定されるものではないが、 例えばプ ローブの Tm値より 5 °C以上低い温度で実施される。
ここで、 プローブの T m値は、 例えば下記式：
Tm=81. 5— 16. 6 (logl。 [Na+]) +0. 41 (%G+C)一 (600/N)
(式中、 Nはプローブの鎖長、 ％G+Cはプローブ中のグァニンおよぴシトシン残 基の含量である）
により求められる。
また、 プローブの鎖長が 1 8塩基よりも短い場合には、 Tm値は下記式： Tm= (%A+T) X 2 + (%G+C) X 4 ]
(式中、 （％A+T)はプローブ中のアデユンおよびチミン残基の含量、 （%G+C) はプローブ中のグァ二ンぉよびシトシン残基の含量である）
として推定することができる。
上記のハイブリダイゼーション条件でプローブと標的核酸のハイブリダイズを 確認することにより、 標的核酸の検出に適したプローブを選定することができる。 本発明の検出方法におけるハイプリダイゼーション条件には特に限定はなく、 公知のハイブリダイゼーション条件、 好ましくは厳密なハイブリダイゼーション 条件が使用される。 また、 ハイブリダィゼーシヨン溶液の p Hは 8〜1 4の範囲 に調整してもよい。
本発明の標的核酸の検出方法の一態様としては、 例えば結核菌群の検出方法に おいては、 結核菌群由来の I S 6 1 1 0遺伝子の検出に適したプローブが好適に 使用でき、 特に限定するものではないが、 例えば、 配列表の配列番号 3 9記載の 塩基配列もしくはその一部、 好ましくは配列表の配列番号 4 0記載の塩基配列も しくはその一部、 さらに好ましくは配列表の配列番号 3 8記載の塩基配列もしく はその一部、 特に好ましくは配列表の配列番号 1 1を含有するプローブが本発明 に好適に使用できる。 また、 例えばリン菌の検出方法においては、 リン菌由来の c p p B遺伝子の検出に適したプローブが好適に使用でき、 特に限定するもので はないが、 例えば、 配列表の配列番号 2 7記載の塩基配列もしくはその一部、 好 ましくは配列表の配列番号 2 1記載の塩基配列もしくはその一部を含有するプロ 一プが本発明に好適に使用できる。 また、 クラミジァの検出方法においては、 ク ラミジァ由来の; P L GV 4 4 0の検出に適したプローブが好適に使用でき、 特に 限定するものではないが、 例えば、 配列表の配列番号 2 2記載の塩基配列もしく はその一部、 好ましくは配列表の配列番号 4 4記載の塩基配列もしくはその一部、 さらに好ましくは配列表の配列番号 2 0記載の塩基配列もしくはその一部を含有 するプローブが本発明に好適に使用できる。 さらに、 H C Vの検出方法において は、 特に限定するものではないが、 5 ' 非翻訳領域が好適であり、 例えば、 配列 表の配列番号 4 3記載の塩基配列もしくはその一部、 好ましくは配列表の配列番 号 3 4記載の塩基配列もしくはその一部、 又は配列番号 3 5記載の塩基配列もし くはその一部を含有するプローブが本発明に好適に使用できる。
本発明の病原微生物の検出方法は、 上記 ( 1 ) 記載のプローブを用いることに より個々の病原微生物を特異的に検出することができる。 すなわち、 上記のプロ 一ブは各病原微生物由来の遺伝子、 もしくはその断片と安定に、 かつ高い特異个生 をもつてハイブリダイズすることから、 当該遺伝子の検出、 さらには各病原微生 物の検出に特に有用である。
さらに本発明の検出方法においては、 上記 ( 1 ) 記載のプローブを使用するこ とにより当該プローブと核酸を含有する試料との間で、 p H 7を越えるアル力リ 条件下、 好ましくは p H 8〜 1 4、 特に好ましくは p H 8〜1 0の条件下でハイ ブリダィゼーシヨンを実施することができる。 すなわち、 当該方法により標的核 酸の変性工程に続く中和工程を経ることなく、 病原微生物由来の遺伝子、 もしく はその断片を検出する方法が提供され、 該方法によって検体中に含まれる結核菌 等を検出することができる。 本発明の方法は、 試料中に存在する特定の遺伝子の検出、 定量に利用すること ができる。 すなわち D NAまたは R N A等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試 料から特定の遺伝子を検出、 定量することができる。 前述の試料としては、 特に 限定はないが、 例えば、 全血、 血清、 バフィ一コート、 尿、 糞便、 脳脊髄液、 精 液、 唾液、 組織 （例えば、 癌組織、 リンパ節等） 、 細胞培養物 （例えば、 哺乳動 物細胞培養物及び細菌培養物等） のような生体由来試料、 ゥィノレス又は細菌のよ うな微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料 （食品、 生物学的製剤 等） 、 あるいは土壌、 排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の 遺伝子を検出、 定量することができる。 さらに例えば、 標的核酸の存在の有無に よって上記の病原微生物の存在の検出、 定量等に利用することができる。 特に、 病原性の微生物の検出方法は衛生、 環境分野で有用である。 上記検出法のための 铸型として使用される核酸は、 R NAあるいは D NAのいずれもが好適に使用で さる。
これら材料からの核^有調製物の調製には特に限定はなく、 例えば、 界面活 性剤による溶解処理、 超音波処理、 ガラスビーズを用いた振盪撹拌、 フレンチプ レスの使用等により行うことができる。 幾つかの例においては、 さらに操作を加 えて核酸を精製することが有利である （例えば、 内在性ヌクレアーゼが存在する とき） 。 これらの例において、 核酸の精製はフエノール抽出、 クロマトグラフィ 一、 イオン交換、 ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施 される。
R N A由来の配列を有する核酸を標的とする場合には、 当該 R NAを铸型とし た逆転写反応によって合成された c D NAを铸型として本発明の方法を実施すれ ばよい。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、 使用される反応条件において錄 型 R NAにァニールするものであれば特に限定されるものではない。 該プライマ 一は、 特定の鎵型 R NAに相捕的な塩基配列を有するプライマー （特異的プライ マー） の他、 オリゴ d T (デォキシチミン） プライマーやランダムな配列を有す るプライマー （ランダムプライマー） であっても良い。 逆転写用プライマーの長 さは、 特異的なアニーリングを行う観点から、 好ま あり、 更に好ましくは 9ヌクレオチド以上であり、 オリゴヌクレオチドの合成の 観点から、 好ましくは 100ヌクレオチド以下であり、 更に好ましくは 30ヌク レオチド以下である。 さらに、 逆転写用プライマーとして、 逆転写後の cDNA を鍚型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとし て使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。 こ のようなプライマーは、 下記 （3) に記載された性質を有し、 かつ RN Aからの 逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はないが、 例えば、 配列表の配列 番号 32及び 33に記載の塩基配列を有するプライマーが好適に使用できる。 上記の逆転写反応に使用される酵素としては、 RNAを鏺型とした c DNA合 成活性を有するものであれば特に限定はなく、 例えばトリ骨髄芽球症ウィルス由 来逆転写酵素 （AMV RTa s e) 、 モロ-一ネズミ白血病ウィルス由来逆転 写酵素 （MMLV RT a s e) 、 ラウス関連ウィルス 2逆転写酵素 （RAV— 2 RTa s e) 等、 種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。 このほか、 逆転写 活性を併せ持つ DN Aポリメラーゼを使用することもできる。 また、 本発明の目 的のためには、 高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、 例えばサーマス属 細菌由来 DNAポリメラーゼ （T t h DNAポリメラーゼ等） 、 好熱性バチル ス属細菌由来 DNAポリメラーゼ等を使用できる。 特に限定はないが、 例えば、 好熱性バチルス属細菌由来 DN Aポリメラーゼが好ましく、 B. s t由来 DNA ポリメラーゼ （B s t DNAポリメラーゼ） 、 さらに B e a DNAポリメラー ゼが好ましい。 例えば、 B e a DNAポリメラーゼは、 逆転写反応にマンガン イオンを必要とせず、 また、 高温条件下で铸型 RN Aの二次構造形成を抑制しな がら cDNAを合成することができる。 上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、 当該活性を有している範囲において天然体、 変異体のいずれもが使用できる。 上記方法により単離したゲノム D N Aや P C Rフラグメントのような二本鎖 D NA、 および全 RNA若しくは mRNAから逆転写反応で調製された c DNAの ような一本鎖 DNAのいずれもが本発明に使用される核酸增幅法において鍀型 D NAとして好適に使用できる。 上記二本鎖 DNAの場合は、 一本鎖 DNAに変性 する工程 （デネーチヤ一） を施したものが好適に使用できる。
上記のように、 本発明のプローブとハイブリダィズする標的核酸上の領域を適 切な核酸増幅方法によって増幅し、 これをハイブリダィゼーションに使用するこ とができる。 使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、 標的核酸上の領域を 増幅可能なものであればよい。 例えばポリメラーゼ連鎖反応法 （ P C R； polymerase chain reaction, 米国特許第 4， 683, 195号、 第 4, 683， 202号おょぴ第 4， 800, 159号） 、 リガーゼ連鎖反応 （LCR； ligase chain reaction) 、 鎖置換 型増幅法 (SDA； strand displacement amplification, 特公平 7- 114718号） 、 自立複製法 (3 S R； self-sustained sequence replication) 、 核酸配列増幅 法 (NASBA法； nucleic acid sequence based amplification 特午第 2650159号） 、 TMA法 （transcription- mediated amplification) 、 Q βレプ リカーゼ法 （特許番号第 2710159号） 、 I CAN法 (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、 国際公開第 00/568 77号パンフレット） 等を使用することができる。
I CAN法は、 キメラヌクレオチドプライマーとエンドヌクレアーゼ、 鎖置換 活性を有する DNAポリメラーゼを使用して、 等温条件下に铸型核酸上の特定の 塩基配列を有する D N Aを連続的に増幅する方法である。
ここで、 「連続的に」 とは、 反応温度、 反応液組成の変更を伴わずに反応が進 行していることを意味する。 また、 本明細書において 「等温」 とは、 酵素および 核酸鎖が上記各工程において機能する、 実質的に一定の温度条件のことを意味す る。
通常、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、 デォキシリボヌクレ才 チドとリボヌクレオチドから構成され、 リボヌクレオチドがその 3 ' 末端又は 3' 末端側に配置されたものが使用される。 例えば、 下記一般式で表す構造をも つオリゴヌクレオチドが I CAN法のプライマ^"として使用することができる。 一般式： 5， -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： クレオチド及ぴ Z又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい）
なお、 上記のヌクレオチドアナログとしては、 例えば、 デォキシリポイノシン ヌクレオチドを、 また修飾リポヌクレオチドとしては、 例えば、 （ α— S ) リボ ヌクレオチドを、 それぞれ使用することができる。 当該ヌクレオチドアナログは、 プライマーとしての機能を実質的に失わない範囲で含有させることができる。 当該プライマーは、 铸型上の増幅が望まれる領域の 5， 側、 3， 側の塩基配列 をもとに、 5' 側の塩基配列に相同な配列を有するもの、 3， 側の塩基配列に相 補的なものの 2種を作成し、 増幅に使用される。
本発明に使用されるェンドヌクレアーゼとは、 铸型核酸にァニーリングした上 記に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーより DN Αの伸長を行って生成 した二本鎖 DN Aに作用して、 鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるも のであればよい。 即ち、 上記の二本鎖 DNAのうちのキメラオリゴヌクレオチド プライマー部分にニックを生成しうる酵素である。 特に限定されるものではない 1 例えば、 本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、 特に DNAと RNAとか ら形成された二本鎖核酸の RNA部分に作用するェンドリポヌクレアーゼ H (R N a s e H) が好適に使用できる。 また、 該リポヌクレアーゼには、 上記作用を 有するものであれば、 常温性から耐熱性のリポヌクレアーゼのいずれもが好適に 本発明に使用できる。 例えば、 下記実施例に示すように、 約 50°C〜約 70°Cで の反応では大腸菌 (E. c o 1 i ) 由来の RNa s e Hが本発明の方法に使用す ることができる。 また、 本発明の方法においては、 耐熱性のリポヌクレアーゼも 好適に使用できる。 該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、 特に限定はされないが、 例えば市販の H y b r i d a s eT M Th e rmo s t a b l e RNa s e
H (ェピセンターテクノロジーズ社製） の他、 好熱性バチルス属細菌、 サーマス 属細菌、 ピロコッカス属細菌、 サーモトガ属細菌、 アルカェォグロバス属細菌、 メタノコッカス属細菌等由来の RNa s eH等も好適に使用できる。 さらに、 該 リポヌクレアーゼは、 天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。 なお、 本願明細書に記載されている RNa s e Hの酵素単位は、 実施例中の参考例に示 した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、 上記 RNa s eHは、 本発明の方法に使用できるものであれば特に限定 はなく、 例えば、 種々のウィルス、 ファージ、 原核、 真核生物由来のいずれであ つてもよい。 さらに、 細胞性 RNa s e Hあるいはウィルス性 RNa s e Hのい ずれであってもよい。 例えば、 上記細胞性 RNa s eHとしては大腸菌 RNa s eH I力 ウィルス性 RNa s eHとしては H I V— 1由来 RN a s e Hが例示 される。 本発明の方法において RN a s eHは、 I型、 I I型、 I I I型のいず れもが使用できる。 特に限定はされないが、 例えば大腸菌由来 RNa s eH I、 ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 RN a s e H I
Iが好適に使用できる。
また、 本宪明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、 例えば、 RNa s eHの 切断反応の効率は上記プライマーの 3， 末端近傍の塩基配列に左右され、 所望の DNAの増幅効率に影響することが考えられるので、 使用する RNa s e Hに最 適なブラィマーをデザィンすることは当然のことである。
I CAN法には、 DNAの鎖置換 (strand displacement) を行う活性を有す る DNAポリメラーゼが使用される。 また、 実質的に 5， →3， ェキソヌクレア ーゼ活性を有しないものが特に好適に使用される。
I CAN法に使用される DN Aポリメラーゼは、 上記の鎖置換活性を有するも のであれば特に限定はなく、 例えば、 バチルス カルドテナックス （Bacillus caldotenax, 以下、 B. c aと称す） ゃバチノレス ステアロサーモフィラス
(Bacillus stearotherraophilus, 以下 B. s tと称す） 等の好熱性バチルス属 細菌由来 DNAポリメラーゼの 5， →3' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した変 異体や、 大腸菌由来 DNAポリメラーゼ Iのラージ フラグメント （タレノウ断 片） 等が挙げられる。 また、 本発明に使用できる DNAポリメラーゼは、 常温性 カ ら耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。 上記の酵素は、 その本来の起源 より精製して取得されたもの、 あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタン パク質の何れであっても良い。 また、 該酵素は、 遺伝子工学的あるいはその他の 手法によって置換、 欠失、 付加、 挿入等の改変を加えたものであっても良く、 こ のような酵素の例として、 5' →3， ェキソヌクレアーゼ活性を欠損させた B c a DNAポリメラーゼである B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社 製） 等が挙げられる。 該酵素は50°〇〜70でで活性を示し、 当該方法に好適に 使用することができる。
なお、 DNAポリメラーゼの中には、 特定の条件でェンドヌクレアーゼ活†生、 例えば、 RNa s eH活性を有するものが知られている。 このような DN Aポリ メラーゼを本発明の方法に用いることができる。 すなわち、 該 DNAポリメラー ゼを RN a s e H活性が発現されるような条件下、 例えば Mn2 +の存在下で使用 する態様が挙げられる。 該態様においては、 上記 RNa S eHを添加することな く本発明の方法を実施することができる。 すなわち、 Mnz+を含有する緩衝液中 で上記の B c a DNAポリメラーゼは、 RNa s e H活性を示すことができる、 上記の態様は B c a DNAポリメラーゼに限定されるものではなく、 RNa s e H活性を併せ持つことが知られている公知の DN Aポリメラーゼ、 例えばサー マス サーモフィラス（Thermus therraophilus)由来の T t h DNAポリメラー ゼも本発明に使用することができる。
I CAN法は、 キメラオリゴヌクレオチドプライマー、 铸型となる核酸を含有 する試料、 ェンドヌクレアーゼ、 DNAポリメラーゼ、 デォキシリボヌクレオチ ド 3リン酸 (dNTP) 等を前記酵素が活性を示しうる組成の緩衝液中で混合し、 当該反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに +分な時間保温することによ り実施される。
なお、 反応に先立ってキメラオリゴヌクレオチドプライマーと錡型となる核酸 を混合し、 2本鎖核酸が変性する温度、 例えば、 90°C以上で保持した後、 本発 明の方法に使用される反応温度以下まで冷却してァニーリングを実施してもよい 力 これは増幅反応に必須の操作ではない。
また本発明の検出方法において、 RN Aを铸型とする場合は、 逆転写反応と核 酸増幅反応を 1段階で行ってもよい。 特に限定はされないが、 逆転写酵素と鎖置 換型 DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、 AMV RT a s e、 MM L V RT a s eあるいは RAV— 2 1 丁& 3 6と8。 & DNAポリメラー ゼの組み合わせが好適に使用できる。 さらに、 逆転写酵素活性と鎖置換活性とを 有する 1種の DNAポリメラーゼを用いてもよい。
本発明の標的核酸の検出方法は、 核酸を含有する試料より直接、 標的核酸を增 Ψ畐することにより実施することができる。 この場合、 增幅される標的核酸の鎖長 には、 特に限定はないが、 感度よく標的核酸を検出する観点からは、 例えば 20 0 b p以下、 さらに好ましくは 150 b p以下の領域が有効である。 該增幅鎖長 となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を設定することによ り、 高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、 本発明の検出方法では、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩あるい はトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及ぴスぺノレミジンやプロピレンジ アミンを含有するァニーリング溶液の使用により、 微量の核酸試料からもさらに 高感度に標的核酸を検出することができる。 この場合、 使用するエンドヌクレア ーゼと D NAポリメラーゼは特に限定はされないが、 例えば大腸菌由来、 ピロコ ッカス属細菌由来あるいはアルカェォグロバス属細菌由来 R N a s e H及び B c a B E S T D N Aポリメラーゼの組み合わせが好ましい。 特に、 上記エンドヌ クレア一ゼ及ぴ D N Aポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できる ュニット数が異なる場合が予想されるが、 その際には検出感度の向上あるいは增 幅産物量の増加を指標にして、 該バッファ一の組成および酵素の添加量を調整す ればよい。
また、 二本鎖の铸型 D N Aと 2種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使 用する核酸増幅方法の態様においては、 反応の条件等にもよるが、 各プライマー から伸長反応中のそれぞれの錄型一伸長鎖中間体の間で鑤型の交換が起こり、 合 成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することが ある。 この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有してお り、 次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができ る。 この反応の結果、 一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。 さらに、 この反応中に铸型の交換が起こった場合には前記と同様な二本鎖核酸が 再度生成される。
本発明では、 上記のような鎖置換活性を有する D N Aポリメラーゼを使用し、 鐯型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法を利用することができる。 鎖置換反応中に上記の铸型交換反応を行う能力を有する D NAポリメラーゼと しては、 例えば、 5 ' →3 ' ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した B c a D NA ポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。 当該酵素は B c a B E S T D N Aポリメラーゼ （宝酒造社製） として市販されており、 また、 該酵素の遺伝 子を含有する大腸菌、 Escherichia coli H B 1 0 1 / p U I 2 0 5 (F E RM BP— 3720、 曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 3 05-8566) 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 3年 5月 10曰 （原寄託日） に寄託） より B本特許第 2978001号に記載の 方法によって調製することもできる。
本発明の検出方法においては、 標的核酸の増幅の際に、 dUTPを基質として 取り込ませることができる。 したがって、 dUTPを基質に用いた場合には、 ゥ ラシノレ N—ク'リコシタ、、一ゼ (u r a c i 1 N— g l y c o s i d a s e : U NG) を利用して増幅産物を分解し、 増幅産物のキヤリ一オーバーコンタミネー ションによる偽陽性を防止することができる。
本発明の検出方法において上記の核酸増幅方法によって増幅された標的核酸を 検出するには公知の核酸検出方法、 例えば電気泳動により特定のサイズの反応産 物を検出する方法や、 プローブとのハイブリダイゼーシヨンによる検出等を使用 することができる。 さらに、 磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用 できる。 上記電気泳動による検出には、 通常、 ェチジゥムブロマイド等の蛍光物 質が使用されるが、 プローブとのハイブリダィゼーシヨンを組み合わせてもよい。 また、 プローブは放射性同位元素による標識の他、 ビォチンや蛍光物質のような 非放射性の標識を施したものが使用できる。 この他、 上記 （b) 工程において標 識ヌクレオチドを使用することにより、 増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ま せて検出を容易にすることゃ該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うこと ができ、 さらに蛍光偏光法、 蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも 可能である。 さらに、 適切な検出系を構築することにより、 標的核酸を自動的に 検出することや、 あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。 また、 ハイ プリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された 2種類以上の蛍光物質で標識されたリ ポヌクレオチド （RNA) プローブあるいはリポヌクレオチド及びデォキシリボ ヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発 明の検出方法に使用することができる。 当該プローブは蛍光を発することはない 力 これに相補的な標的核酸由来の増幅 DNAにァユーリングした場合、 RNa s eHは該プローブを分解する。 この結果、 プローブ上の蛍光物質間の距離が增 大して蛍光が発せられるようになり、 標的核酸の存在を知ることができる。 RN a s eHを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、 その反応液 中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。 当該プ ローブの標識に使用される蛍光物質としては、 例えば、 6-FAM(6- carboxyfluorescein)と T AMR A (N, N, N，， N， -tetramethyl-6- carboxyrhodamine)との組み合わせが好適に使用できる。
本発明の検出方法において等温下における增幅方法を用いる場合には、 サーマ ルサイクラーのような装置を必要としない。 また本発明の増幅方法では、 使用す るプライマーを 1種類もしくは 2種類と従来法よりも少なくすることができる。 dNTPのような試薬も PCR等で用いられるものを流用できるため、 ランニン グコストを従来法よりも低くすることができる。 そのため、 ルーチンワークを行 なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。 さらに、 本発明の方法は P CR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、 簡便、 迅速、 高 感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の検出方法を用いる場合には、 大量の検体を解析するために反応系を微 量ィ匕し、 さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。 その手段の一つとし て、 最先端の超微細加工技術を駆使して、 本発明の検出方法の基本プロセス、 例 えば、 DNAの細胞からの抽出、 核酸増幅反応、 目的 DNAの検出等のプロセス を数 c m角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものを組み合わせてもよい。 さらに、 必要に応じてゲル或いはキヤピラリー電気泳動、 検出用プローブとのハ ィプリダイゼーシヨンのプロセスを組み合わせてもよい。 該システムは、 マイク 口テツプ、 マづクロ CE c a p i 1 1 r y e l e c t o ph o r e s i s) チップあるいはナノチップとも呼ばれている。
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的の DN A断片が増幅さ れるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。 特に限定はさ れないが例えば、 I CAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適 に使用できる。 該方法を組み合わせることにより、 当該システムの単純化が可能 となり、 上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。 さら に、 本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。 本発明の検出方法においては、 特に限定はされないが例えば、 配列表の配列番 号 13〜16でそれぞれ表される塩基配列を有する結核菌群検出用キメラオリゴ ヌクレオチドプライマー、 配列表の配列番号 28〜 29でそれぞれ表される塩基 配列を有するリン菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一、 配列表の配列 番号 23〜 26でそれぞれ表される塩基配列を有するクラミジァ検出用キメラォ リゴヌクレオチドプライマ一、 配列表の配列番号 30〜 31でそれぞれ表される 核酸配列を有する H C V検出用キメラオリゴヌクレオチドプラィマーが好適に使 用できる。 上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いて試料中の標的核酸 を増幅し、 電気泳動あるいはリアルタイム検出により目的の増幅産物を確認する ことができる。
さらに本発明の検出方法においては、 配列表の配列番号 1 1、 12、 38〜4 0でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される結核菌群検出用プ ローブ、 配列表の配列番号 27で表される塩基配列を含有する領域から選択され るリン菌検出用プローブ、 配列表の配列番号 22、 44でそれぞれ表される塩基 配列を含有する領域から選択されるクラミジァ検出用プローブ、 配列表の配列番 号 43〜45でそれぞれ表される塩基配列を含有する領域から選択される HCV 検出用プローブを用いて標的核酸を検出することができる。
本発明の方法において等温核酸増幅方法を用いる場合、 必要な反応装置として は恒温層があればよく、 サーマルサイクラ一のような厳密な装置は必要ない。 ま た、 標識シグナルを測定する装置としては、 市販の分光光度計、 蛍光検出器、 プ レートリーダー等を使用することができる。 従って、 通常の検查業務を行ってい る所で、 大量迅速検体測定が可能である。 さらに、 本発明の方法に必要な試薬も 巿販されている。
本発明の方法を用いて H C Vの検出を行う場合、 検体から常法によつて抽出さ れた HCVの RNA、 逆転写反応用プライマー、 逆転写酵素 （逆転写活性を有す る DNAポリメラーゼを使用する場合は逆転写酵素は必要ない） 、 dATP、 d GTP、 dCTP、 11：丁？を含む(1^^丁？混合溶?夜を調製し、 一定温度で HC V— RNAから生成した cDNAを铸型として、 上記キメラオリゴヌクレオチド プライマー及び I CAN用 DNAポリメラーゼで標的核酸を増幅させ、 これに上 記蛍光標識プローブとホモジ-ァス系でハイプリダイゼーシヨンさせその蛍光強 度を測定する。 反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。
反応では、 まず、 HCV— RNAを鎵型として cDNAが合成され、 ついで、 この cDNAを铸型として I CAN法により DNAの増幅がおこる。 増幅 DNA は、 上記蛍光プローブと相補的な領域を含んでいるので、 蛍光プローブは一本鎖 状態の増幅 DN Aにハイプリダイズする。 蛍光プローブがハイプリダイズするこ とによって、 蛍光強度の抑制が解除され蛍光強度が増加する。 一方、 試料中に H C Vの RNAが存在しない場合はハイプリダイゼーションがおこらず、 蛍光強度 は抑制されたままで蛍光強度は弱い。 このため、 蛍光強度を測定することにより 簡便■迅速'高感度に試料中の HCVの RN Aを検出することができる。
本発明の方法では、 ホモジニァス系で洗浄工程無しに HCVの RNAを蛍光強 度として測定する。 本発明は蛍光色素を変え、 測定波長を変化させることで多項 目同時測定にも対応可能な点でも有利である。 すなわち、 血液センターでは HC Vのみでなく HBV、 HIV、 HTLVも重要な検査項目であり、 各々に特異的 な I CAN用のプライマーとプローブを用意し各プローブを測定波長の異なる蛍 光色素で標識することで上記項目を同時に測定することが可能である。 また、 反 応のェンドボイントでの蛍光強度を測定することで定性測定として血液センター など多量検体の高感度測定が可能となり、 一方、 反応をキネティックに蛍光測定 することで定量測定として治療のモニタリング用としての定量測定も可能である。 従って、 本発明の方法によれば、 従来の RT— PCR法のように温度を上げ下げ する複雑で特殊な機器が不要であり、 限られた時間、 設備内で大量に検体を測定 できない不便さも改良され、 洗浄工程が不要であり、 非常に便利である。
(3) 本発明のプライマー
本宪明の検出方法に用いられるプライマーとしては、 キメラオリゴヌクレオチ ドプライマ一が例示される。 該プライマーは、 デォキシリポヌクレオチド、 ヌク レオチドアナログ、 非修飾あるいは修飾リポヌクレオチドから構成され、 リポヌ クレオチドがその 3， 末端又は 3' 末端側に配置されたものが使用される。 例え ば、 下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドが I CAN法のプライマー として使用することができる。 一般式： 5 ' 一 d N a— N b _ d N c— 3，
( a ： 1 1以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 d N： デォキシリポヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リボヌ クレオチド及び Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい）
なお、 上記のヌクレオチドアナログとしては、 例えば、 デォキシリボイノシン ヌクレオチド、 デォキシリボウラシルヌクレオチドあるいは修飾されたデォキシ リボヌクレオチド等、 また修飾リポヌクレオチドとしては、 例えば、 （ひ一S ) リボヌクレオチドを、 それぞれ使用することができる。
当該プライマーは、 铸型上の増幅が望まれる領域の 5 ' 側、 3 ' 側の塩基配列 をもとに、 5， 側の塩基配列に相同な配列を有するもの、 3 ' 側の塩基配列に相 補的なものの 2種を作成し、 増幅に使用される。
本発明においては、 例えば、 結核菌群を検出しょうとする試料について上記方 法による核酸増幅反応を実施したうえ、 増幅物と本発明のプローブとの間でのハ ィプリダイゼーシヨンを実施して結核菌群を検出することができる。 核酸増幅の ためのプライマーは、 配列表の配列番号 1 2に示した結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝 子の塩基配列を参考に、 各種の核酸増幅方法での使用に適したものを設計し、 作 製することができる。 特に限定はされないが、 例えば I S 6 1 1 0遺伝子中の配 列表の配列番号 3 9に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、 好ましく は配列表の配列番号 4 0に示される塩基配列あるいはその一部を含む領域、 さら に好ましくは配列表の配列番号 3 8に示される塩基配列あるいはその一部を含む 領域を増幅できるものが本発明に好適である。 さらに、 配列表の配列番号 1 1記 0遺伝子もしくはその断片の増幅に有用である。
本発明においては、 上記結核菌群の検出と同様に、 リン菌、 クラミジァ、 H C Vを検出するためのプローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いるこ とにより好適に検出することができる。
当該プライマーは上記の塩基配列に限定されるものではなく、 当該塩基配列周 辺、 すなわち当該配列にその一部が重複した配列を有するものが本発明に好適に 使用できる。 すなわち、 使用する核酸増幅方法の特徴に応じて当該配列に重複す る適切な塩基配列を選択し、 プライマーを作成することができる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマ一は、 任意の核酸配列を持つよう に、 例えばアプライド バイオシステムズ社 （A B I社、 Applied Biosystems
Inc. ) の D NAシンセサイザー 3 9 4型を用いて、 ホスホアミダイト法により合 成できる。 また、 別法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、 チォ ホスホネート法等があるが、 いかなる方法で合成されたものであっても良い。
I C AN法により核酸増幅を行うためのプライマーとしては、 当該方法に使用 できるようにプライマーの 3 ' 末端部分のデォキシリポヌクレオチドをリポヌク レオチドに置換すればよい。 このようなプライマーの一例として、 配列表の配列 番号 1 3〜 1 6、 2 3〜 2 6、 2 8〜 3 1にそれぞれ塩基配列を示すキメラオリ. ゴヌクレオチドプライマ一が挙げられる。
さらに、 これらのプライマーは適切な物質、 例えば蛍光物質、 色素、 リガンド 類 （ピオチン、 ジゴキシゲェン等） 、 または金コロイド等で標識されていてもよ く、 例えば、 リガンド類で標識したプライマーを使用することにより、 増幅され た標的核酸を担体に捕捉させるなど、 高感度で簡便な定量性をもった測定方法が 提供される。 この場合、 固相としてはマイクロタイタープレート、 ビーズ、 マグ ネチックビーズ、 メンブラン、 またはガラス等が例示される。
喀痰検体からの抽出 D N A試料中には、 ヒト D N Aのみならず気道常在細菌な らびにウィルス由来の D NAが含まれる。 従って、 本発明で開発されたプライマ 一の特異性を調べるため、 結核菌の感染病歴のないポランティアからの喀痰を検 体として結核菌群遺伝子の増幅を試みた。 このような試験で陽性結果がでないこ とが本プライマーの特異性の証明となりうる。 3 8名のポランティアから採取さ れた喀痰からの抽出 DN Aに対し、 上記のキメラオリゴヌクレオチドプライマー を用いた I CAN法による I S 6110遺伝子断片の増幅を行った。 その結果、 陽性結果は 1例も認められず上記のプライマーの結核菌への特異性の高さが実証 され、 非 I S 6110標的 DNAを偽陽性にしないことが示された。
(4) 本発明の組成物
本発明は、 前述 （2) の本発明の検出方法に使用される組成物を提供する。 該 糸且成物としては、 例えば、 上記 （1) に記載のプローブならびに上記 （3) に記 載のプライマーを含有するものが挙げられる。 あるいは、 上記プローブを含む検 出用組成物及ぴ上記プライマーを含む増幅用組成物の形態であってもよい。 さら に、 酢酸マグネシウムを含む組成物及びプライマーを含む組成物の形態であって もよい。 さらに、 緩衝成分や d NT P等を含んでいてもよい。 さらに、 修飾され たデォキシリボヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3リン酸のアナログ を含有していてもよい。 さらに、 本発明の組成物中の試薬の分解'失活等による 非増幅状況 （偽陰性） 確認のための内部標準 （I C ; i n t e r n a l c o n t r o 1) を含有していてもよい。 当該内部標準は、 本発明のプライマーにより 增幅することができる。
また別の態様としては、 本発明の検出方法に適した組成で上記の各種成分が含 有された組成物を挙げることができ、 該組成物は適切な鍀型とキメラオリゴヌク レオチドプラィマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。 さらに、 増幅対象があらかじめ明らかである場合には、 当該増幅対象の増幅に適したキメ ラオリゴヌクレオチドプライマ一を含有する組成物が好適である。
特に好適な態様としては、 本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成 分が含有された組成物を挙げることができ、 該組成物は適切な铸型を添加するの みで増幅反応を実施することができる。 さらに、 検出用プローブを含んでいる場 合には、 リアルタイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができる。 特に限定されないが例えば、 HCVの検出において本発明の方法、 該方法のた めの組成物あるいはキットを用いることにより、 従来のアンプリコア HCVキッ トが 2オーダーの測定範囲にあつたのに比較して 3オーダーまで測定範囲を広げ ることができる。 また、 従来のアンプリコア HCVキットでは、 所用時間が約 5 時間であつたのに比較して、 本発明では約 45分間と大幅に所用時間を短縮する ことができる。 従って、 こ までよりも 1日に処理できる検体数を増大させるこ とが可能である。
(5) 本発明のキット
本発明のキットは、 病原微生物由来の標的核酸の検出のためのキットであり、 特に限定はされないが、 p H 7を越えるアル力リ条件下で標的核酸とハイブリダ ィズ可能なプローブ、 特に限定はされないが例えば、 上記 (1) 記載のプローブ を含有することを特徴とする。
また、 本発明のキットの一態様としては、 結核菌群の検出のためのキットが挙 げられる。 該キットは、 My c o b a c t e r i um t u b e r c u l o s i s、 My c o b a c t e i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i u m a f r i c a n um、 My c o b a c t e r i um m i c r o t i及び、Z 又は My c o b a c t e r i um c a n e t t iを特異的に検出可能なプロ一 ブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 p H 7を越えるアル力リ条件下 で結核菌群の検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットの一態様としては、 リン菌の検出のためのキットが挙げ られる。 該キットは、 Ne i s s e r i a g o n o r r h o e a eを特異的に 検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 pH7を越え るアル力リ条件下でリン菌の検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットのー態様としては、 クラミジァの検出のためのキットが 挙げられる。 該キットは、 Ch l amy d i a t r a c h oma t i sを特異 的に検出可能なプローブを含有することを特徴とする。 当該キットは、 pH7を 越えるアル力リ条件下でクラミジァの検出に用いることもできる。
また、 本発明のキットのー態様としては、 HCVの検出のためのキットが挙げ られる。 該キットは、 HCVを特異的に検出可能なプローブを含有することを特 徴とする。 当該キットは、 pH 7を越えるアルカリ条件下で HCVの検出に用い ることもできる。
さらに上記キットにおいては、 別の実施態様としてプライマ^ "を含有してもよ い。 さらに、 標的遺伝子を増幅する核酸増幅法のための試薬 （DNAポリメラー ゼ等） 、 プローブの検出反応に使用される試薬、 検体からの核酸の抽出に使用さ れる試薬等を含むキットであってもよい。 該キットは、 本発明の結核菌群等の検 出方法を簡便、 かつ迅速に実施するうえで好適である。 当該キットは、 特に多数 の試料について結核菌群等の存在を調べる際に、 高い再現性、 信頼性で検査結果 を与えることができる。 さらに、 偽陰' I"生確認のための内部標準 （I C； i n t e r n a 1 c o n t r o l ) 、 該内部標準検出用のプローブを含有していてもよ い。 当該内部標準は、 本発明のプライマーにより増幅することができる。
さらに 1つの実施態様において、 該キットは、 パッケージされた形態において、 本発明のプローブ、 プライマー、 D N Aポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼ の使用のための指示書を含むことを特徴とする。 さらに、 市販の D N Aポリメラ ーゼおよび/またはェンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、 使用してもよ い。 さらに、 R NAを錶型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。 D N Aポリメラーゼは、 上記の D N Aポリメラーゼから選択することができる。 また、 ェンドヌクレアーゼは、 P f u由来 R N a s e H I Iあるいは A f u由来 R N a s e H I Iのいずれかから選択することができる。
上記 「指示書」 とは、 当該キットの使用方法、 例えば鎖置換反応用試薬液の調 製方法、 推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、 パンフレットまたはリ 一フレット形式の取り扱 、説明書のほか、 キットに添付されたラベル、 キットが 納められたパッケージ等に記載されたものを含む。 さらに、 インターネットのよ うな電子媒体を通し、 開示、 提供された情報も含まれる。
また、 本発明のキットにおいては、 ビシン、 トリシン、 へぺス、 リン酸塩ある いはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、 及ぴァニーリング溶液が含まれ ていてもよい。 また、 D NAポリメラーゼゃ R N a s e Hが含まれていてもよい。 さらに、 修飾されたデォキシリポヌクレオチドあるいはデォキシヌクレオチド 3 リン酸のアナログを含有していてもよい。
本発明のキットにおいて、 検出用プローブを適宜選択することにより、 リアル タイムで病原微生物由来の標的核酸を検出することができるキットが提供される。 ( 6 ) 本発明の核酸抽出方法
本発明は、 高感度に結核菌等を検出するための核酸抽出方法を提供する。 すな わち、 臨床標本からの核酸抽出は、 デリケートで困難な工程であり、 尿、 胸水、 髄液、 血液などの液体検体から、 膿、 喀痰などのような濃厚粘性検体、 さらには 細胞、 組織といったものまでその対象は幅広い。 現在、 これら検体から結核菌等 の遺伝子を抽出するスタンダードな方法は存在せず、 従って現在まで報告された 結核菌等の遺伝子検査における報告では、 様々な核酸抽出方法が用いられている。 これら従来法では各種界面活性剤、 アルカリ、 有機溶媒、 またはカオトロピック 試薬を含む試薬中で混合したり、 ガラスビーズ存在下で超音波処理をすることで 実施されていた。
本 明者らは上記の各種の従来法と、 これまで L i s t e r i a属、 L a c t o b a c i 1 1 u s属ならびに S t r e p t o c o c c u s属カ らの核酸 ί由出に 用いられていたムラミダーゼ （mu r am i d a s e、 放線菌 S t r e p t om y c e s g l o b i s p o r u s由来のものが、 ムタノリシン
(mutanolysin) としてシグマ社より発売） を結核菌に使用する方法を比較し、 結核菌をムラミダーゼ消化する方法が最も優れていることを発見した。 また、 該 酵素で消化した菌体を 5分間煮沸処理することでさらに優れた結果が得られるこ とを発見した。
結核菌を含有する試料をムラミダーゼで 30分処理し、 次レ、で 96 °C、 5分間 の処理を行った後に I CAN法で遺伝子を増幅し結核菌の検出を試みた。 この結 果、 驚くべきことに、 従来の界面活性剤などの試薬を用いた場合に比べ 10倍高 い感度で結核菌 DN Aを検出することができ、 これは結核菌 5ゲノムコピーに相 当する検出感度であることが解った。
上記の一連の検出操作は、 従来の界面活性剤やカオト口ピック試薬を用いた方 法において核酸抽出液中に混入する成分の核酸増幅反応への阻害効果を排除する ことができる。 さらに、 加熱処理を加えることで結核菌等に対する殺菌効果も生 まれ、 従来検査員を悩ませていた検査室での結核菌等の感染を予防できる効果も 生まれるというメリットを持つ。 従って、 本プロトコールの発明は、 迅速に、 安 全に、 かつ高感度に結核菌等の DNAを抽出することができる。
例えば試料として、 喀痰を使用する場合には、 まず公知の喀痰処理方法である NAL C (N— a c e t y l— L— c y s t e i n e) _N a OH法で喀痰を処 理した後、 上記の本発明の核酸抽出方法を実施することが好適である。 すなわち、 本発明の検出方法において、 結核菌等を含有する検体をムラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含していてもよい。
上記の本発明の検出方法に使用される全てのプロトコール、 すなわちプローブ、 プライマー、 核酸の抽出法、 核酸增幅法は、 極めて迅速で信頼性があり、 力つ高 感度な結核菌等の検出を可能とする。 該方法を用いれば、 検体の採取から結果報 告までを 3時間以内に完了することができ、 6時間を要した従来のキット （例え ばロシュ社製キット） に比べ、 検査時間が 1Z2に短縮された。 つまり本発明の 方法は同日中に検査結果を提供でき、 感染患者の一刻も早い隔離を可能とし、 公 衆衛生上、 結核の伝播を早期に予防できるという多大な社会的貢献をもたらす。 以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は実施例の範 囲に限定されるものではない。 また、 本発明に基づき、 キャリーオーバーによる 増幅産物のコンタミネーションを防ぐ改良や、 内部標準物質や他の結核菌等の遺 伝子を同時增幅、 検出する改良は、 いずれも当業者に容易に類推される改良であ る。
実施例
以下に本発明を実施例に基づき具体的に説明する力 本発明は、 下記実施例に よって限定されるものではない。
参考例 1 ピロコッカス フリオサスの RNa s eH I I遺伝子のクローニン グ
(1) ピロコッカス フリオサス ゲノム DNAの調製
トリプトン （ディフコラボラトリーズ社製） 1°ん 酵母エキス （ディフコラボ ラトリーズ社製） 0. 5%、 可溶性でんぷん （ナカライテスタ社製） 1%、 ジャ マリン S ·ソリッド （ジャマリンラボラトリ一社製） 3. 5 %、 ジャマリン S■ リキッド （ジャマリンラボラトリー社製） .0. 5% , Mg S04 0. 00
30/o、 N a C 1 0. 001 %、 F e S 04 · 7 H2 O 0. 0001 %、 C o S O
4 0. 0001%、 C a C 12 - 7 H2 O 0. 0001%、 Z n S 04 0. 00 01%、 Cu SO4 ■ 5H20 0. 1 pm, KA 1 (S04)2 0. 1 m, H3 B04 0. l p m, Na2MoQ4 - 2H20 O. l p m, N i C l2 - 6H20 0.25 p pmの糸且成の培地 2リットノレを 2リットスレ容のメジユウムポトノレにい れ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込み、 溶存酸素を除去し、 これにピロコッカス フリオサス (Pyrococcus furiosus、 ドイツチェ ザムノレン ク フォン ミクロオルガ-スメンより購入： DSM3638) を接種して、 9 5°C、 16時間静置培養した後、 遠心分離によって菌体を得た。
次に、 得られた菌体を 4m 1の 25%ショ糖、 50mM Tr i s—HC l (p H8. 0) に懸濁し、 0. 4m 1の 1 OmgZm 1塩ィ匕リゾチーム （ナカラ ィテスタ社製） 水溶液を加えて、 20 °Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この 反応液に 24m 1の 15 OmM Na C l、 1 mM EDTA、 2 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 、 0. 2m 1の 2 Om g/m 1プロティナーゼ K
(宝酒造社製） 及び 2mlの 10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、 3 7°Cで 1時間保温した。
反応終了後、 フエノールークロロホルム抽出、 続いてエタノール沈殿を行い、 約 1 m gのゲノム DN Aを調製した。
(2) RN a s e H I I遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ （Pyrococcus horikoshii) の全ゲノム配列が公開さ れており 〔DN A リサーチ （DM Research) 、 第 5卷、 第 55— 76頁 （19 98) 〕 、 RNa s eH I Iのホモログをコードする遺伝子 （PH1650) 力 S 1つ存在することが明らかになつている （配列番号 1、 日本国 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ： http：〃 www. nite.go.jp/)。
そこで、 この PH1650遺伝子 （配列番号 1) と一部公開されているピロコ ッカス フリオサスのゲノム酉己歹 IJ (University of Utah, Utah Genome Centerホ ームへーシ： http://www. genome. Utah, edu/ sequence, html) でホモロシー検索を おこなった。 その結果、 非常にホモロジ一の高い配列が見つかった。
得られた配列もとにプライマ一 1650Nd e (配列番号 2 ) 及び 165.0 B am (配列番号 3) を合成した。
上記 （1) で得たピロコッカス フリオサス ゲノム DNA 20 O n gを铸 型にして、 20 pmo lの 1650Nd e及ぴ 20 pmo 1の 1650B a を プライマーに用い、 100 Z 1の容量で PCRを行った。 PCRでの DNAポリ メラーゼはタカラ Exタック （宝酒造社製） を添付のプロトコールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 3 0サイクル行った。 増幅した約 0. 7 k bの DNA断片を Nd e I及ぴ B amH I (ともに宝酒造社製)で消化し、 得られた DNA断片をプラスミドベクター; pE T 3 a (ノバジェン社製） の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミ ド p
PFU220を作製した。
(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
上記 (2) で得られた p P F U 220の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキ シ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eH I Iをコードすると 考えられるオープンリーディングフレーム （OR F、 o e n r e a d i n g f r ame) が見出された。 このオープンリーディングフレームの塩基配列を配 列表の配列番号 4に示す。 また、 該塩基配列から推定される RNa s eHI Iの ァミノ酸配列を配列表の配列番号 5に示す。
なお、 プラスミド p P F U 220で形質転換された大腸菌 J M 109は、
Escherichia coli JM109ZpPFU220と命名、 表示され、 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) ] に平成 1 2年 9月 5日 （原寄託日） より受託 番号 FERM P— 18020として寄託され、 ブタペスト条約のもと前記独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 13年 7月 9日 （国際 移管日） より FERM B P— 7654として移管されている。
(4) 精製 RN a s eH I I標品の調製
上記 （2) で得られた； PFU220を大腸菌 HMS 174 (DE3) (ノバ ジェン社製） に形質転換し、 得られた p P F U 220を含む大腸菌 HM S 174 (DE3) を 100 g/m 1のアンピシリンを含む 2リットルの LB培地に植 菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終了後、 遠心分離によって集めた菌 体を 66. Om 1のソ-ケーシヨンバッファー 〔5 OmM Tr i s—HC l
(p H8. O) 、 1 mM EDTA、 2 mMフエエルメタンスルフォニルフルォ ライド〕 に懸濁し、 超音波破砕機にかけた。 この破砕液を 12000 r pmで 1 0分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 6 0°C 1 5分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 1 2000 r pmで 1 0分の遠心分離を行い、 上清を集め、 6 1. 5 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔5 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) ImM EDTA] で平衡ィ匕した R E S OUR S E Qカラム （アマシャ ム ブアルマシア バイオテク社製） に供し、 F P LCシステム （アマシャム ファノレマシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その 結果、 RN a s e H I Iは RE SOURS E Qカラムを素通りした。
素通りした RN a s e H I I画分 6 0. Om 1をバッファー Aで平衡化した R E S OUR S E Sカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供 し、 F P LCシステムを用いて 0 5 0 OmM N a C 1直線濃度勾配により溶 出し、 約 1 5 OmM Na C 1のところに溶出された RN a s e H I I画分を得 この RN a s e H I I画分 2. Om lをセントリコン一 1 0 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 2 5 0 μ 1の濃縮液を 1 0 OmM N a C l 0. ImM EDTAを含む 5 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 0 ) で平後 ί 化した S u ρ e r d e χ 2 00ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシア ノ ィォテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e H I I は、 1 7キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分子量は、 R N a s e H I Iが 1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出された RN a s e H I Iを P f uRN a s e H I I標品とした。 上記で得られた P ί u RN a s e H I I標品を用いて下記の方法により RN a s e H活性を測定した。
1 OmM T r i s -HC 1 (pH 8. 0) 、 1 mMジチオスレィトール （ナ 力ライテスタ社製） 、 0. 00 3%ゥシ血清アルブミン （フラクション V、 シグ マ社製） 、 4%グリセロール、 20 /i g/m lポリ （d T) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製） 、 3 0 μ g/m 1ポリ (r A) (アマシャム ファ ルマシア バイオテク社製） を混合し、 3 7°Cで 1 0分間保温した。 これを RN a s e H活性を測定するための基質液として使用した。 100^ 1の基質液に Ι μ ΐの 1M MnC 12を加えて 40 °Cで保温し、 こ れに上記の P f u RNa s eH I I標品を適当に希釈したものを加えて反応を 開始した。 40°Cで 30分間反応を行った後、 10 1の0. 5M EDTAを 加えて反応を停止し、 260 nmにおける吸光度を測定した。
その結果、 上記の P f u RNa s eH I I標品を添加した反応液では、 先に
10 1の 0. 5Μ EDTAを加えた後にこれを添加したものに比べて 260 nmにおける吸光度の値が高かった。 よって、 当該標品が RNa s eH活性を有 することが明らかになった。
参考例 2 A f u RNa s eH I Iの調製
アルカェォグロバス フルギダスの RNa s e H I I遺伝子のクロー-ング
(1) アルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNAの調製
ァメレカェォグロバス フルギダス （Archaeoglobus fulgidus、 ドイツチェ ザムノレンク フォン ミクロオノレガニスメン ゥント ツエノレクルツレン Gmb Hより購入： D SM4139) 8 m 1相当分の菌体を集め、 100 1の25% ショ糖、 50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) に懸濁し、 20 μ 1の 0. 5Μ
EDTA、 10 1の 1 Omg/ml塩ィ匕リゾチーム （ナカライテスタ社製） 水 溶液を加えて、 20°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 この反応液に 800 μ 1の 150mM Na C l、 1 mM EDTA, 20mMトリス一 HC 1 ( H 8. 0) 、 10 1の 2 OmgZm 1プロティナーゼ K (宝酒造社製） 及び 50 1の 10 %ラウリノレ硫酸ナトリウム水溶液を加え、 37 で 1時間保温した。 反応終了後、 フエノール一クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿、 風乾した後に 5 0 μ 1の Τ Εに溶解してゲノム D Ν Α溶液を得た。
(2) RNa s e H I I遺伝子のクロー-ング
アルカェォグロバス フルギダス （Archaeoglobus fulgidus) は全ゲノム配歹 が公開されており 〔K1 e nk， HPら、 ネイチヤー （Nature) 、 第 390卷、 第 364— 370頁 （1997) 〕 、 RNa s eHI Iのホモログをコードする 遺伝子 （AF 0621) が 1つ存在することが明らかになつている （配列番号 6、 http： //www. tigr. org/tdb/CMR/btm/htrals/SplashPage. html) 0
そこで、 この AFO621遺伝子 （配列番号 6) の配列をもとにプライマー A f uNd e (配列番号 7 ) 及び A f uB am (配列番号 8 ) を合成した。
上記 （1) で得たアルカェォグロバス フルギダス ゲノム DNA 30 n g を铸型にして、 20 m o 1の A f uNd e及び 20 p m o 1の A f u B a mを プライマーに用い、 100 μ 1の容量で PCRを行なった。 PCRでの DNAポ リメラーゼはパイ口べスト DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） を添付のプロトコ ールに従って用い、 PCRは 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、 40サイクル行った。 増幅した約 0. 6 kbの DNA断片を N d e I及び B amHI (ともに宝酒造社製）で消化し、 得られた DNA断片をブラ スミドベクター： TV 119Nd (p TV 1191^の1^ o Iサイトを Nd e I サイトに変換したもの） の N d e I及び B a mH I間に組込んだプラスミド p A FU 204を作製した。
(3) RNa s eH I I遺伝子を含む DNA断片の塩基配列の決定
上記 (2) で得られた; p A F U 204の挿入 D N A断片の塩基配列をジデォキ シ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、 RNa s eHI Iをコードすると 考えられるオープンリ一ディングフレームが見出された。 このオープンリ一ディ ングフレームの塩基配列を配列表の配列番号 9に示す。 また、 該塩基配列から推 定される RNa s eH I Iのァミノ酸配列を配列表の配列番号 10に示す。 なお、 プラスミ ド PAFU204で形質転換された大腸菌 J M 109は、 Escherichia coli J 109/pAFU204と命名、 表示され、 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター [日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) ] に平成 13年 2月 22日 （原寄託日） より受 託番号 FERM P—18221として寄託され、 プタぺスト条約のもと前記独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 13年 8月 2日 （国 際移管日） より FERM BP— 7691として移管されている。
(4) 精製 RNa s eHI I標品の調製
上記 （2) で得られた pAFU204で大腸菌 JM109を形質転換し、 得ら れた p AFU204を含む大腸菌 JM109を 100 w gZmlのアンピシリン を含む 2リットルの LB培地に植菌し、 37 °Cで 16時間振盪培養した。 培養終 了後、 遠心分離によって集めた菌体を 37. lm 1のソニケーシヨンバッファー 〔50111]\1トリスー《[〇 1 (pH8. 0) 、 1 mM EDTA、 2mMフエ二ノレ メタンスルフォニルフルオラィド〕 に懸濁し、 超音波破石權にかけた。 この破碎 液を 12000 r 1)111で10分間の遠心分離を行い、 得られた上清を 70°C、 1 5分間の熱処理にかけた。 その後、 再度 12000 r pmで 10分の遠心分離を 行い、 上清を集め、 40. 3 m 1の熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファー A 〔50mMトリスー HC 1 (pH8. 0) 、 ImM EDTA〕 で平衡化した R E S OU R S E Qカラム （アマシャム フ アルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RNa s eHI Iは RESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファー Aで平衡化した RES OURS E Sカラム （アマシャム フアル マシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシステム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） を用いてクロマトグラフィーを行なった。 その結果、 RN a s eH I Iは RESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りした RNa s eH I I画分 40. Omlを 50mM N a C 1を含むバ ッファー B 〔50mMトリスー HC 1 (pH7. 0) 、 ImM EDTA] 2 1 を外液として、 2時間の透析を 3回行なつた。 透析後の酵素液 40. 2 m 1を 5 OmM N a C 1を含むバッファー Bで平衡化した H i Tr a p-h e p a r i nカラム （アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に供し、 F PLCシス テムを用いて 5 O〜550mM Na C l直線濃度勾配により溶出した。 その結 果、 約 24 OmM NaC 1のところに溶出された RN a s eHI I画分を得た。 この RNa s eHI I画分 7. 8 m 1をセントリコン一 10 (アミコン社製） を用いた限外ろ過により濃縮し、 約 600 1の濃縮液を 4回に分けて 100m M Na C l、 0. ImM E D T Aを含む 50 mMトリス一HC 1 (pH7.
0) で平衡化した Su p e r o s e 6ゲルろ過カラム （アマシャム フアルマシ ァ バイオテク社製） に供し、 同じバッファーで溶出を行った結果、 RNa s e HI Iは、 30. 0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。 この分 子量は、 RNa s eHI Iが 1量体として存在する場合に相当する。 こうして溶 出された RNa s eHI Iを Af u RNa s eH I I標品とした。
上記で得られた A f u RNa s e H I I標品を用いて、 参考例 1一 （4) に 記載の方法により酵素活性を測定した結果、 Af u RN a s e H I I標品に R Na s e H活性が認められた。
本発明の方法に使用される耐熱性 RNa s eHのュ-ット数は、 次の方法によ り算出した。
ポリ (r A) 及びポリ (d T) (ともにアマシャム フアルマシア バイオテ ク製） lmgをそれぞれ ImM EDTAを含む 40mM トリス _HC 1 (ρ Η7. 7) 1m lに溶解し、 ポリ （rA) 溶液及びポリ （dT) 溶液を調製した。 次に、 4mM MgC l2、 1 mM DTT、 0. 003%B S A, 4%グリ セロールを含む 40mM トリス一 HC 1 (pH7. 7) に、 終濃度 20 μ gZ mlとなるポリ （rA) 溶液、 終濃度 30μ §Ζιη1となるポリ （dT) 溶液を 加え、 37°Cで 10分間反応後、 4°Cに冷却し、 ポリ （rA) —ポリ （dT) 溶 液を調製した。 このポリ （rA) —ポリ （dT) 溶液 100/ 1に任意に希釈し た酵素液 Ι μ ΐを加え、 40°Cで 10分間反応させ、 0. 5M EDTA 10 μ 1を加えて反応を停止させた後、 260 nmの吸光度を測定した。 対照として、 上記反応液に 0. 5M EDTA Ι Ομ Ιを加えた後、 40°Cで 10分間反応 させ、 吸光度を測定した。 その後、 EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度か ら対照の吸光度を引いた値 （吸光度差） を求めた。 すなわち、 酵素反応によって ポリ （rA) —ポリ （dT) ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸 光度差から求めた。 RNa s eHの 1単位は、 1 n m o 1のリボヌクレオチドが 遊離したのに相当する A26。を 10分間に増加させる酵素量とし、 下記の式に従 つて算出した。
単位 (unit) = 〔吸光度差 X反応液量 （m l) ] /0. 0152X (1 10 /100) X希釈率
参考例 3
本発明の方法に使用される常温性 RNa s eHのュ-ット数は、 以下の方法で 測定した。
(1) 使用する試薬液の調製 力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ 40 mM トリス一塩酸 (pH7. 7、 37°C) 、 4mM 塩化マグネシウム、 1 mM DTT、 0. 003% B SA、 4%グリセロール、 2 Α μΜ ポリ （dT) になるように滅菌水で調製した。 ポリ [8— 3H] アデ-ル酸溶液： 370 k B qのポリ [8—3H] アデニル酸 溶液を 200〃 1の滅菌水に溶解した。
ポリアデエル酸溶液：ポリアデ-ル酸を 3 mMになるように滅菌超純水で希釈 した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ 25 mM トリス—塩酸 （pH 7. 5、 3 7°C) 、 5mM 2—メルカプトエタノール、 0. 5 mM EDTA (pH7. 5、 37°C) 、 3 OmM 塩化ナトリウム、 50 %グリセロールになるように滅 菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺 D N Aの調製：子牛胸腺 D NA 200mgを TEバッファー 1 00m lに懸濁し、 膨潤させた。 該溶液の UV 260 nmの吸光度を測定し、 lmg/m 1の濃度に滅菌超純水で希釈した。 次に、 該溶液を 100°Cで 10分 間加熱後、 氷浴中で急冷した。
(2) 活性測定方法
上記 （1) で調製した力価測定用反応液 9 85 1にポリ [8— 3H] アデェ ル酸溶液 7 /2 1を加え 3 7°Cで 10分間保持した。 次にポリアデュル酸を最終濃 度が 24 Mになるように 8 /z 1加え、 さらに 3 7°Cで 5分間保持した。 このよ うにしてポリ [8—3H] r A—ポリ dT反応液 1 00 1を調製した。 次に、 該反応液 200 ^ 1を分取し、 30°Cで 5分間保持した後、 任意の希釈系列で希 釈した酵素液 1 μ 1を加え、 これらの反応液を経時的に 50〃 1ずつサンプリン グして、 後の測定に用いた。 酵素添加からサンプリングまでの間の時間を Υ分と した。 また、 全 CPM用反応液 50 1およびプランク用反応液 50 1は、 酵 素液の代わりに酵素希釈液を 1 μ 1加えて調製した。 該サンプリング溶液に 10 OmMピロリン酸ナトリウム 1 00 / 1、 熱変性子牛胸腺 DN A溶液 50 μ 1お よび 10%トリクロ口酢酸 300 μ 1 (全 C ΡΜ測定の場合は、 超純水 300 1 ) を加え、 0°Cで 5分間保持後、 l O O O O r pmで 10分間遠心した。 遠心 後、 得られた上清 250 μ 1をバイアルに入れ、 アクアゾルー 2 (ΝΕΝライフ サイエンスプロダクツネ土製) 1 Om lを加え、 夜体シンチレーションカウンタ 一で CP Μを測定した。
(3) ュニット計算
各酵素のユニット （Unit) 数は、 以下の計算式で算出した。
Unit/ ml ={ (測定した C PM—ブランク C PM) X 1. 2* X 20 X 1 0 00
X希釈率 } X 200 (μ I ) / (全 CPMXY分 X 50 (μ 1 ) X 9*つ
1. 2* ：全 C PM中に含まれるポリ [8—3 H] r A—ポリ dTの 5 0 μ 1当 たりの n m o 1数
9** ：補正係数
実施例 1
(1) 喀痰からの DN A抽出
米国 CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) が推奨する N A LC法により喀痰を処理した。 すなわち、 喀痰を 5 Om l容のスクリューキヤ ップ付チューブに入れ、 等量の NALC液 （0. 1M クェン酸ナトリウム 5 0 m 1と 4 %水酸化ナトリウム 5 0m lの混合液に 0. 5 gの N—ァセチルー
L一システィンを加えたもの） を加え、 試験管ミキサーで 20秒間良く力き混ぜ 検体を液状にした。 室温で 1 5分間放置した後、 リン酸緩衝生理食塩水 (PB S) で全量を 5 Om 1とし、 次いで 3000 g以上で 20分遠心し沈殿を採取し た。 この沈殿に 5 C 1の溶解緩衝液 [lysis buffer； 1単位のムタノリシン (mutanolysin、 シグマ社製） を含有する 1 0 mM HE PE S緩衝液 (pH 7.
8) ] を加えよく混和する。 3 7°Cで 30分反応し、 ついで 5分間水浴中煮沸ま たは 9 6 °Cのヒートプロック中で加熱処理した。 必要な場合は微量高速遠心器に より遠心し、 その上清を分取した。 以上の操作により調製された上清を喀痰から の DN A抽出液として以降の操作に用いた。 さらに、 G e nとるくん酵母用 （宝 酒造社製） も使用取扱説明書に従い、 核酸抽出に使用した。
(2) プローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマーの作製
結核菌群由来の I S 61 10遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチ ドプロープを Ge n B a n k Ac c e s s i o n No. X 52471記載の 塩基配列をもとに作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 1 1に示す塩基配列か
計らなり、 5， 末端に F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） が付された オリゴヌクレオチドプローブ MT I S— 2 B Fを DNA合成機により合成した。 結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝子由来の DNA断片を I CAN法で合成するための キメラオリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表の配列番号 1 2に示された結核菌群 I S 6 1 1 0遺伝子の塩基配列をもとに、 配列表の配列番 号 1 3に示された塩基配列からなるフォワードプライマー MT I S— 2 F、 配列 表の配列番号 1 4に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にピオチンが付加され たリバースプライマー MT I S 2— RB i oをそれぞれ DNA合成機により合成 した。 同様に配列表の配列番号 1 5に示された塩基配列からなるフォワードブラ ィマー K— F 1 0 3 3— 2、 配列表の配列番号 1 6に塩基配列からなり、 5 ' 末 端にビォチンが付加されたリバースプライマー K一 R 1 1 3 3 - 2B i oをそれ ぞれ DN A合成機により合成した。
(3) I CAN法による增幅
表 1に示す I CAN反応のための反応液を調製し、 60°Cで 30分ィンキ： 一トした。
コンホーネント
(β 1 )
5 X反応緩衝液 (ρ Η7. 8) 1 0 l O OmM 酢酸マグネシウム 2
1 0 mM dNTP s (宝酒造社製） 2. 5 プライマー MT I S— 2 F (1 00 /iM) 0. 5 プライマー MT I S— 2 RB i o ( 1 00 /z M) 0. 5
P f u RN a s e H I I (6 3 n g/μ 1 ) 0. 5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社製、 8 /μ 1 ) 0. 5
DNA抽出液 1
H20 3 2. 5
50 μ 1
5 X反応緩衝液の組成：
1 0 OmM HE PE S—水酸化カリウム （p H 7. 8)
50 OmM 酢酸カリウム 5% ジメチルスルフォキシド （DMSO)
0. 05% ゥシ血清アルブミン （ B S A)
また、 同様に K— F 1033-2/K-R 1133— 2プライマーの糸且み合わ せでも I CAN増幅反応を行った。 反応終了後、 上記反応液の一部を電気泳動に 供して、 目的の増幅断片を確認した。
(4) 固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン （ナカライ社製） を PBSに の濃度に溶解し、 この溶液を白色発光検出用 96ゥェ マイクロタイタープレートに 15 Oju 1ノ ウエノレとなるように添力 し、 4 °Cで一晩放置し、 固定ィ匕した。 ストレブトァビジ ン溶液を捨てた後、 1 % B SA-PB S溶液を 200μ 1/ゥエルとなるよう に分注して 4 °Cでー晚放置し、 ブロッキングを行った。 この溶液を捨てたものを ストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイブリダイゼーション緩衝液 [ 1 % TritonX- 100、 1 % B S Aを含む 5 X S S C] 50 μ 1 /ゥエルを加え、 実施例 1一 （3) で MT I S— 2 F/MT I S 2— RB i οプライマーの組み合 わせで得られた増幅断片を含む I CAN反応液を 10 /i 1 /ゥェルずつ添加して 良く混合し、 室温で 15分間反応させ、 プレート表面に捕捉させた。 次に DNA 変性液 （ 0. 1 N NaO H溶液） を 5 μ 1 /ゥエルずつ添加し、 良く混和して 3分間の DNA変性を行い、 プレート表面に捕捉された二本鎖 DNAを一本鎖 D Ν Αに変性した。 引き続き上記のプローブ MT I S 2BFを 5 pmo 1 Zm 1と なるようにハイプリダイゼーシヨンバッファーに希釈し、 これを 100 1 ゥ ェノレずつ添加してよく混合し、 室温で 40分反応させた。 この時、 各ゥエルの p Hは 13~14であった。 反応後、 ゥェル内の溶液を捨て、 200μ ΐ Ζゥエル の洗净パッファー [25mM Tr i s—塩酸 （pH7. 5) 、 150mM N a C l、 1% BSA、 0. 05 % T w e e n 20] で 2回ゥエルを洗浄する。 その後、 パーォキシダーゼ標識抗 F I TCゥサギ抗体 （ケミコン社製） をハイブ リダイゼーションバッファーに 2 μ g/m 1に溶解したものを 100^ 1 /ゥェ ルずつ添加し室温で 20分反応させた。 反応後、 液を捨て、 200 μ 1 Zゥエル の洗浄バッファーで 4回ゥエルを洗浄した後、 発光基質 [SuperSignal ELISA Pico Substrate (ピアス社製） ] を 1 ΟΟμ 1/ウエノレずっ添加し、 直ちに発光 プレートリーダー （ラボシステムズ社製） で相対発光強度を測定した。
(5) 検出感度の検討
0、 5および 10コピー相当の結核菌群ゲノムを含む喀痰由来 DN Α試料につ き、 上記のとおり結核菌群 DNAの検出を実施した。 その結果、 表 2に示すよう に 5コピーにおいても S/N比で約 300倍という強い発光が検出できた。
ゲノム 装置発光強度 （RLU)
0コピー 11
5コピ一 3078
10コピー 6287 以上のように、 本発明により、 迅速かつ高感度な結核菌の検査が可能であるこ とが示された。 また、 本発明の結核菌の検出方法において、 本発明の核酸抽出方 法及び G e nとるくん酵母用試薬を用いた方法のいずれの方法においても好適に 利用できることを確認した。 従って、 操作法の簡便さから見て、 本宪明の核酸抽 出方法の有用性が確認できた。
実施例 2
結核菌感染の疑いを持たれた患者 26例から喀痰を採取し、 実施例 1記載の操 作に従って結核菌 DNAの検出を行った。 また、 同一検体を用いて、 既存の 16 S r RNAをコードする DNAをターゲットとした P CR法に基づくキットで あるアンプリコア マイコバクテリゥムッベルク口シス （ロシュネ： t¾) を用いた 検出、 小川培地による培養法による結核菌検査を実施した。 その結果を表 3に示 す。 表 3
小川培養法 陽性例 (n=9) 陰性例 (n= l 7) 遺伝子増幅法 PCR法 本発明法 PCR法 本発明法 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性
8 1 9 0 2 15 0 17 表 3に示したように、 本発明法は培養検査の結果と良く一致したが、 P C R法 では培養法で陰性であった 2例が偽陽性として検出され、 また、 培養法陽性の 1 例が偽陰性として検出された。
すなわち従来の方法に比べ本発明の方法は正確な検査結果を超迅速に簡便に得 られることが確認できた。
実施例 3
本発明の検出方法の結核菌群に対する特異性について検討した。 ゲノム D NA は、 表 4に示す 3 7株を使用した。
iviy ODd um c Li U Ut)
j JL 1 U. OU , d. V u【u . dgcl <Λ dfci
M ah ς oi o 1 700 S mut ns
499 M. bovis BCG 261 S. pneumoniae
858 M. chelonae 262 S. pyogenes
609 M. fortuitum 217 S. sanguinis
610 M. gastri Staphylococcus
612 M, gordonae GTC No. 286 S. aureus subsp. aureus
613 M. intracellulare 289 S. epidermidis
614 M. kansasii 266 S. intermedius
616 M. marinum 265 S. saprophyticus
617 M. nonchromogenicum Enterococcus
1725 M. peregrinum 228 E. faecalis
619 M. scrofulaceum 227 E. faecium
620 M. simiae Peptostreptococcus
622 M. szulgai 200 P. magnus
623 M. terra e Stomatococcus
624 M. triviale 311 S， muci丄 aginosus
601 M， tuberculosis Corynebacterium
626 M. xenopi 1438 C. pseudotuberculosis
Pseudomonas Listeria
2 P. aeruginosa 149 L. monocytogenes
Escherichia Erysipelothrix
503 E. coli 555 E. rhuthiopathiae 各ゲノム D NAは、 O D値からコピー数を計算し、 2 X 1 0 7 コピーになる ように希釈した。 上記铸型となるゲノム D NAを用いて、 以下の表 5に示す反応 液組成で検出を行った 表 5
コンポーネント 容量 1)
5 X反応緩衝液 (pH7. 8) 0
100 mM 酢酸マグネシゥム 2
10 mM dNTP s (宝酒造社製） 2, 5 プライマー MT I S— 2 F ( 100 μ M) 0. 5 プライマー MT I S_2 RB i o (100 /iM) 0 5
A f u RN a s e H I I (17. 5 U/ μ 1) 0 5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （ 16 UZ 1 ) 0 5
DNA抽出ί夜
H2O 32. 5 計 50 μ 1 上記反応液を 60°Cで 1時間保持した。 検出は、 実施例 1 (4) 記載の方法で 行った。 その |¾果、 My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s株 及び My c o b a c t e r i um b o v i s B C G株のみ特異的に検出する ことができた。 このことから、 本発明の方法が非常に特異性の高い検出方法であ ることを確認、した。
実施例 4
(1) 磁気ビーズを用いた結核菌群の検出について検討した。 プライマーは、 M T I S— 2 Fプライマー及び MT I S— 2RB i oプライマーを用いた。 次に、 錄型として実施例 2での陽性検体由来の抽出ゲノムを滅菌水にて 30倍、 300 倍、 3000倍となるように希釈調製した。 反応は以下のようにして行った。 即 ち、 最終濃度 32mM へぺス一水酸化カリウムバッファ (pH7. 8) 、 1 0 OmM 酢酸カリウム、 l%DMSO、 0. 01%BSA、 4mM 酢酸マグ ネシゥム、 各 500μΜ dNTP s、 各 50 pmo lの MT I S— 2 F及び M T I S— 2Rプライマー、 8. 75Uの Af u由来 RNa s eH、 8Uの B c a BEST DNAポリメラーゼ、 各錄型量 1 μ 1を添加し滅菌水で最終容量を 5 Ο μ ΐにした。 該反応液はあらかじめ 60°Cに設定したサーマルサイクラ一パー ソナルにセットし、 60分間保持した。 得られた増幅断片を自動検出装置、 ルミ ノ、。ルス （富士レビオネ土製） にセットし、 ストレプトアビジンコートされた磁気ビ ーズ （ピアス社製） による検出を行った。 ピオチン結合能 1 00 pmo 1相当の ストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュべット第 1層でピオチン化増幅断片 と 5分間反応させ、 次いで 0. IN N a OHを加えて F I TC標識プローブ M T I S B Fと 5分間ハイブリダイズさせ、 洗浄後 P OD標識抗 F I T C抗体を加 え、 5分間反応後洗浄し発光基質を加えた。 この結果、 既存の自動化検出装置に おいて磁気ビーズを用いて 20分間という短時間で半定量可能であることが示さ れた。 なお、 試薬は実施例 1と同様のものを用いた。 検出は、 発光量をフォト力 ゥンティングすることで測定した。 その結果を表 6に示す。 表 6
フォトカウンティング S/N比
X 30 3. 55 X 107 29. 6
X 300 1. 21 X 107 10. 0
X 3000 0. 21 X 107 1. 75
0 0. 1 2 X 1 07 表 6に示した結果から、 従来のプレート発光法と同等の感度で検出できること を確認した。
(2) 内部標準 （I C ; internal control) を組み合わせた場合の検出系につい て検討した。 内部標準は以下のようにして調製した。 すなわち、 ヒトゲノム DN Aを铸型とし、 酉己列表の配列番号 1 7及び 1 8記載のプライマーを用いて PCR 増幅した。 得られた増幅断片を常法により精製し、 pT7 B l u e T-v e c t o r (N o v a g e n社製） に挿入した。 該プラスミドを内部標準として用 いた。 反応は、 実施例 3記載の条件と同様にして、 上記プラスミドを 1、 3、 1 0 p gを添力 tlした。 铸型の結核菌ゲノムは、 0、 2及ぴ 20コピ を用いた。 検 出は、 配列表の配列番号 1 9記載の塩基配列を有し、 5' 末端に F I T C標識を 有する I C用プローブ （I CFプローブ） 及び F I TC標識プロ ブ MT I SB Fを用いた。 その結果、 いずれの I Cプラスミド濃度でも結核菌ゲノムを検出で きた。 特に I Cプラスミドの濃度が 3 p gの場合に好適であることが確認できた。
(3) 上記增幅断片の検出方法として、 ハイブリッド 'クロマト法を検討した。 即ち、 エトロセルロース膜にストレプトアビジン （ナカライテスタ社製） を固定 化し、 吸水パッドを連結し、 ハイプリ 'クロマト ·ストリップを作製した。 これ を用いて、 実施例 1で得られた増幅断片のハイプリ ■クロマト法による検出を行 つた。 検出は、 1一 s t e p TMB-B l o t t i n g (ピアス社製） を用い た発色で行った。 すなわち、 エトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液 を展開し、 その後順に 0. IN Na OH溶液、 F I TC標識プローブ、 洗浄液、 発色液を展開した。 その結果、 結核菌陽性の増幅断片では、 ブルーのバンドが検 出された。 また、 この方法を用いる事により、 本発明の方法実施後、 5〜： L 0分 で結果が肉眼で判明することから、 迅速な遺伝子検查方法として有用であること が確認できた。
実施例 5
実施例 1〜4の結果を踏まえ、 結核菌群のキットを構築した。 各コンポーネン トについて以下に示す。
(1) I CAN増幅用試薬； 50回分
5 X反応緩衝液 500 μ 1 l O OmM 酢酸マグネシウム 100 μ 1
10mM d NT Pミックス 1 25 μ ΐ
0. ImM MT I S— 2Fプライマー 25 μ 1
0. ImM ΜΤ I S— SRB i οプライマー 25 μ 1
A f u RN a s e H I I (1 7. 5 /μ 1 ) 25 μ 1 B c a BE ST DNAポリメラーゼ （ 1 6 1 ) 25 μ 1
(2) 検出用試薬 (50回分）
ストレプトアビジン固相化 96穴プレート 50個
ハイブリバッファー （5 X S SC、 1 % T r i t o nX l O O,
1 % B S A) 2. 5m l 変性剤 (0. IN NaOH) 0. 5m l 検出用 MTプローブ溶液 （25 nM MT I S_2 B Fプローブ） 5m l 検出用 I Cプローブ溶液 （25 nM I CFプローブ） 5m l 標識抗体液 （ブロックエース （大日本製薬社製） ： PB S=1 ： 3、
50 OUn i t ?00—抗？ 1丁じ抗体） 5m l 1 OX洗浄液 ( 250 mM トリス緩衝溶液 (pH7. 5) 、
1. 5M NaC l、 1%BSA、 0. 5% Tw e e n 20)
20ml 発光試薬 A (SuperS ignal ELISA Pico Substrate A液 （ピアス社製） )
2. 5m l 発光試薬 B (SuperS ignal ELISA Pico Substrate B液 （ピアス社製） )
2. 5m 1 内部標準液 （ I Cプラスミド、 T E緩衝液） 0. lml 陽性コントロール液 （ I S 61 10含有プラスミド、 TE緩衝液）
0. 02ml 陰性コント口ール液 ( T E緩衝液） 0. 02ml 上記試薬を用レヽて My c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s株 及ぴ My c o b a c t e r i um b o v i s B C G株を検出したところ、 迅 速、 高感度、 高特異的に検出できることを碓¾«した。
実施例 6
(1) スヮブ検体からの DN A抽出
男子尿道ならびに女子子宮頸部を綿棒で拭い取ったスヮブ検体に界面活性剤を 含む抽出バッファー （アンプリコア STD用検体処理試薬 （ロシュ社） ) を加え 95°C〜： L 00°Cで 10分間加熱処理した。
(2) プローブ、 キメラオリゴヌクレオチドプライマ一の作製
クラミジァのクリプティック ·プラスミドを検出するための特異的オリゴヌク レオチドプローブを作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 20に示す塩基配列 力 らなり、 5' 末端に F I TC (フルォレセインイソチオシァネート） が付され たオリゴヌクレオチドプローブ CT 1234を DN A合成機により合成した。 ま た、 リン菌の c p p B遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプロー ブを作製した。 すなわち、 配列表の配列番号 21に示す塩基配列からなり、 5' 末端に F I TC (フルォレセインィソチオシァネート） が付されたオリゴヌタレ ォチドプローブ Cp p B 3を DN A合成機により合成した。
クラミジァのクリプティック ·プラスミド由来の DNA断片を I CAN法で合 成するためのキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表 の配列番号 2 2に示されたクラミジァのタリブティック ·プラスミドの塩基酉己列 をもとに、 配列表の配列番号 2 3及ぴ 24に示された塩基配列からなるフォヮ一 ドプライマ一 F 1 2 1 2— 2 2、 F 1 1 6 2 - 2 2, 配列表の配列番号 2 5及び 2 6に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にビォチンが付加されたリバースプ ライマー R 1 2 72— 2 2 B i o、 R 1 3 7 9— 2 2 B i oをそれぞれ DNA合 成機により合成した。
リン菌 c p p B遺伝子由来の DNA断片を I CAN法で合成するためのキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一を作製した。 すなわち配列表の配列番号 2 7に示 されたクラミジァのタリブティック 'プラスミドの塩基配列をもとに、 配列表の 配列番号 28に示された塩基配列からなるフォワードプライマー p J DB F— l、 配列表の配列番号 2 9に示された塩基配列からなり、 5 ' 末端にビォチンが付カロ されたリバースプライマー p J DBR— 3 B i oをそれぞれ DNA合成機により 合成した。
(3) I CAN法による増幅
表 7に示す I CAN反応のための反応液を調製し、 5 5°Cで 60分インキ： 一トした。 表 7
コンポーネント 容量（ 1)
5 X反応緩衝液 (ρ Η7. 8) 10
1 00 mM 酢酸マグネシゥム 2
1 0 mM dNTP s (宝酒造社製） 2.5 プライマー F 1 2 1 2— 2 2 (1 00 /iM) 0.5 プライマー R 1 2 72— 2 2 B i o ( 1 00 ^ M) 0.5 プライマー p j DBF— 1 (1 00 /iM) 0.5 プライマー p J DBR— 3 ( 1 00 μ M) 0.5
P f u RN a s e H I I (6 3 n g/μ 1 ) 0.5
B c a BE ST DNAポリメラーゼ （宝酒造社製、 8U/// 1) 0.5
DNA抽出液 1
H20 32.5 計 50 μ\ 5 X反応緩衝液の組成：
1 0 OmM HE PE S—水酸化カリウム （pH7. 8)
50 OmM 酢酸カリウム
5% ジメチルスルフォキシド （DM SO)
0. 05 % ゥシ血清アルブミン （ B S A)
反応終了後、 上記反応液の一部を電気泳動に供して、 目的の增幅断片を確認し た。
(4) 固層プレート発光法による検出
ストレプトアビジン （ナカライ社製） を P B Sに 2 /i g/m lの濃度に溶解し、 この溶液を白色発光検出用 9 6ウェルマイクロタイタ一プレートに 1 5 Ο μ 1 / ゥエルとなるように添加し、 4°Cで一 Β免放置し、 固定化した。 ストレプトァビジ ン溶液を捨てた後、 1 % B SA-PB S溶液を 200 / 1 /ゥエルとなるよう に分注して 4 °Cでー晚放置し、 ブロッキングを行った。 この溶 ^液を捨てたものを ストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
上記のストレプトアビジンコートプレートにハイプリダイゼーション緩衝液
[ 1 % TritonX- 100、 1 % B S Aを含む 5 X S S C] 50 μ 1 /ゥエルを加え、 実施例 1一 （3) で F 1 2 1 2— 2 2/R 1 2 7 2— 2 2 B i oならびに p J D B F- l/p J DBR- 3 B i oプライマーの組み合わせで得られた増幅断片を 含む I CAN反応液を 1 0 /z 1 /ゥエルずつ 1検体につき 2ゥエルに添加して良 く混合し、 室温で 1 5分間反応させ、 プレート表面に捕捉させた。 次に DNA変 性液 （ 0. I N N a OH溶液） を 5 μ 1 /ゥエルずつ添加し、 良く混和して 3 分間の DNA変性を行い、 プレート表面に捕捉された二本鎖 DNAを一本鎖 DN Αに変性した。 引き続き上記のプローブ CT 1 2 34または C p p B 3を 5 pm o 1 /m 1となるようにハイブリダィゼーシヨンバッファーに希釈し、 これを 1 0 0 μ 1 Zゥエルずつ添加してよく混合し、 室温で 40分反応させた。 この時、 各ゥエルの； ρΗは 1 3〜1 4であった。 反応後、 ゥエル内の溶液を捨て、 200 μ 1 /ゥエルの洗浄バッファー [2 5mM T r i s—塩酸 （pH7. 5) 、 1 5 0 mM N a C l、 1% B SA、 0. 0 5% Tw e e n 20] で 2回ウエノレ を洗浄する。 その後、 パーォキシダーゼ標識抗 F I TCゥサギ抗体 （ケミコン社 製） をハイブリダイゼーシヨンバッファーに 2 g Zm 1に溶角 したものを 1 0 0 11 1 /ゥエルずつ添加し室温で 2 0分反応させた。 反応後、 液を捨て、 2 0 0 μ 1 /ゥエルの洗浄バッファーで 4回ゥエルを洗浄した後、 発光基質
[SuperSignal ELISA Pico Substrate (ピアス社製） ] を 1 0 Ο μ 1 /ゥェルず つ添加し、 直ちに発光プレートリーダー （ラボシステムズ社製） で相対発光強度 を彻 J定した。
( 5 ) 検出感度の検討
0、 1 0および 1 0 0コピー相当のクラミジァゲノムを含む D NA試料につき、 上記のとおりクラミジァ D NAの検出を実施した。 その結果、 表 8に示すように 1 0コピーにおいても S ZN比で約 3 0倍という強い発光が検出できた。 また、 0、 1 0および 1 0 0コピー相当のリン菌ゲノムを含む D NA試料につき、 上記 のとおりリン菌 D N Aの検出を実施した。 その結果、 表 9に示すように 1 0コピ 一においても S /N比で約 3 0 0倍という強レ、発光が検出できた。 表 8
ゲノム 装置発光強度 （R L U)
0コピ一 1 1
1 0コピー 3 4 7
1 0 0コピ一 3 9 6 1 表 9
ゲノム 装置発光強度 （R L U)
0コピ 1 1
1 0コピ 3 0 2 6
1 0 0コピー 3 8 4 0 以上のように、 本発明により、 迅速かつ高感度なクラミジァならびにリン菌の 検査が可能であることが示された。
実施例 7
クラミジァとリン菌の混合感染の疑いを持たれた検体 1 2例から実施例 1記載 の操作に従ってクラミジァならびにリン菌 D NAの同時増幅検出を行つた。
その結果、 クラミジァのみ陽性が 5例、 リン菌のみ陽 1·生が 1例、 クラミジァと リン菌共に陽性が 3例、 共に陰性が 3例であつた。 この結果は、 既存の P C R法 キット （アンプリコア STD (ロシュ社） ) の結果と一致した。
実施例 8
プライマー及びプローブの調製
H C Vゲノムの塩基配列に従って、 配列表の配列番号 30及ぴ 31に記載の塩 基配列を有する HCV— F及び HCV— R 1キメラオリゴヌクレオチドプライマ 一及び配列表の配列番号 32及び 33に記載の塩基配列を有する逆転写反応用ォ リゴヌクレオチドプラィマーを合成した。 さらに、 酉己列表の配列番号 34及び 3 5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。 さらに、 上記オリゴヌクレオチドプローブの 5，末端に TAMRA (N, N, Ν' , N，- tetramethyl-6-carboxy-rhodamine AB I社製） を自動 DN A合成機によって 作製し、 蛍光標識プローブとした。
(2) 合成 RNAの調製
インフォームド コンセントの得られた HCV— RN A陽性血清をアンプリコ ァ HCVモェターキット （ロッシュ社製） でコピー数を算出し、 これをキットに 付属の検体希釈液で、 1 X 107コピーから 1コピー 7 1まで 10倍希釈系列 を作製し、 HCV— RNAとした。
(3) 逆転写反応
上記 （1) で作製した逆転写反応用プライマーならぴに F i r s t- s t r a n d c DNA Syn t h e s i s K i t (宝酒造社製） を用いて上記 (2) で調製した HCV— RNAから cDNAを合成した。
(4) I CAN反応液の調製
上記 c DN A溶液を用いて I CAN反応を行った。 1チューブあたりの反応液 組成を表 10に示す。 表 10
Figure imgf000061_0001
(5) ホモジニァス検出
反応チューブ 1本あたり、 上記反応液 47 1を加え、 そこに （4) で作製し た c D Ν Α溶液 3 μ 1を添加し、 56 °Cで 30分間保持した。 反応終了後、 この 反応液に上記 ( 1 ) で調製した蛍光標識プロ一ブを終濃度が 300nMとなるよ うに添力 flし、 98 °Cで 2分間処理後、 水冷却により 25°Cにし、 保持した。 該反 応液を、 蛍光検出器、 フルォロスキャン （ラバオシステムズ社製） にて蛍光強度 を測定した。 さらに、 対照として、 市販の PCR法によるアンプリコア HCVキ ット （ロシュ社製） でも同一の検体を用いて測定した。 その結果を図 1に示す。 図 1は、 各種 HCV— RNA濃度を測定した場合の蛍光強度の変化及び従来法と の測定範囲の比較を示すグラフであり、 左縦軸は OD 450値、 右縦軸は蛍光強 度 （SN比） 、 横軸は、 HCV— RNA量を示す。 また、 図 1の黒四角は、 本発 明の方法による結果を示し、 黒丸は、 アンプリコア HCVキットによる結果を示 す。
図 1に示したように本発明の方法では、 蛍光強度 （SN比） は HCV— RNA コピー数が多いほど増加することが確認できた。 また、 本発明の HCV検出方法 の所用時間は 45分であった。 一方、 対照となるアンプリコア HCVキットにお いては、 所用時間は約 5時間であった。 さらに、 HCV— RNAの検出範囲につ いては、 図 1に示したように吸光度で示すアンプリコア HCVキットでは、 HC V— R N Aのコピー数の増加にしたがって増大はするものの、 測定範囲は 2ォー ダーであり、 1 05コピー以上では、 定量性がないことが確認できた。 一方、 本 発明の方法は、 3オーダーの広い検出範囲であることが確認できた。 さらに、 簡 便性 ·迅速性においても本発明の方法は優れており、 多検体を処理するのに適し た方法であることが確認できた。
実施例 9
(1) 患者血清からの HCV— RNAの調製
臨床検体からの H C Vの検出について検討した。 インフォームドコンセントの 得られた HCV患者の血清 28検体各 100 μ \からアンプリコア HCVキット 附属の HCV— RNA抽出試薬 （ロシュ社製） を用いて RNAを調製した。
(2) 患者血清中の HCV— RNA検出
実施例 1 (3) 及び （4) 記載の方法と同じ方法で HCV— RN Αを増幅し、 本発明の検出方法に供した。 本実施例においては、 対照の HCV— RNAを含ま ない試料について行ったネガティブコントロール 1 0本の蛍光強度の平均値 + 3 SD (標準偏差値の 3倍） をカットオフ値とし、 このカットオフ値を超えた蛍光 強度を示す検体を陽性とした。 一方、 同一の検体を市販のアンプリコア HCVキ ットにより測定し、 キットの取扱説明書に従って陽性'陰性を判定した。 本発明 の検出方法と従来法のアンプリコア HCVキットの結果の比較を表 1 1に示す。
本 法
陽性 陰性
アンプリコア'法
陽性 1 8例 0例
陰性 0例 1 0例 表 1 1に示したように、 本発明の方法による測定結果は、 従来法で得られた成 績と良く相関していることが確認できた。 また、 本発明の方法が従来法に比較し て、 高感度で迅速 ·簡便に測定できることが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、 病原性微生物を高感度、 高特異的 '迅速，簡便に測定できるこ とが可能となり、 特殊な機器を使用することなく多検体を限られた時間で処理す ることが可能な方法、 プライマー及びプローブ、 キットが提供される。
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO : 2·· PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO: 3: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO: 7: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a
polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 8: PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a
polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO: 11 : Oligonucleotide probe to detect the DNA derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID NO: 13 : Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis, "nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 14: Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis. "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 15 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium
tuberculosis, "nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 16: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of ISollO gene derived from Mycobacterium
tuberculosis. "nucleotides 20 to 22 are； ribonucleotides— other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 17 : Oligonucleotide primer C4一 MT2F— S100 to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO: 18 : Oligonucleotide primer C4— MT2R- A to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO: 19 : Oligonucleotide probe to detect the internal control DNA
SEQ ID NO: 20： Oligonucleotide probe CT1234 to detect the Chramydia criptic plasmid
SEQ ID N0: 21： Oligonucleotide probe CppB3 to detect Neisseria gonorrhoeae cppB gene
SEQ ID NO: 23 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides'
SEQ ID NO: 24: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 25： Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid, "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 26 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. "nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 28 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 18 to 20 are ribonucleot ides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 29 : Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene, "nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonuc丄 eotides"
SEQ ID No : 30 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV- F to amplify a portion of HCV. "nucleotides 19 to 21 are
： ribonucleotides- other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID No : 31 : Designed chimeric oligonucleotide primer designated as
HCV-R3 to amplify a portion of HCV. "nucleotides 16 to 18 are
； ribonucleotides - other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID No : 32 : Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV SEQ ID No: 33 :Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV SEQ ID No : 34: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No : 35: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No : 36 : Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No : 37 : Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of
IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No : 41 : Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No :42 : Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No :43 : Probe area to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV

Claims

請 求 の 範 囲
1. 結核菌群のマイコバクテリゥム ·ッベルク口シス （My c o b a c t e r i um t u b e r c u l o s i s) 、 マイコパクテリゥム ·ポビス B CG (M y c o b a c t e r i um b o v i s B C G) 、 マイコバクテリゥム 'ァフリ カナム (My c o b a c t e r i um a f r i c a num) 、 マイコノ クァリ ゥム .ミクロティ (My c o b a c t e r i um mi c r o t i) 及び/又 ίま マイコノ クテリゥム■カネティ (My c o b a c t e r i um c a n e t t i) を検出可肯 gなプローブであって、 配列表の配列番号 39記載の塩基配列ある いはその一部を含有することを特徴とするプローブ。
2. 結核菌の M y c o b a c t e r i um t ub e r c u l o s i s、 My c o b a c t e r i um b o v i s BCG、 My c o b a c t e r i um a f r i c a num、 My c o b a c t e r i um mi c r o t i及び Z又は M y c o b a c t e r i um c a n e t t iを検出可能なプローブであって、 酉己 列表の配列番号 11記載の塩基配列であること特徴とするプローブ。
3. リン菌のナイセリア 'ゴノノレホエア （Ne i s s e r i a g o n o r r h o e a e) を検出可能なプロープであって、 配列表の配列番号 27記載の塩基 配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプロープ。
4. リン菌の N e i s s e r i a g o n o r r h o e a eを検出可能なプロ ーブであって、 配列表の配列番号 21記載の塩基配列であること特徴とするプロ ーブ。
5. クラミジァのクラミジァ トラコマチス （Ch l amy d i a t r a c h oma t i s) を検出可能なプローブであって、 配列表の配列番号 22記載の 塩基配列あるいはその一部を含有することを特徴とするプローブ。
6. クラミジァの Ch 1 amy d i a t r a c h oma t i sを検出可能な プロープであつて、 配列表の配列番号 20記載の塩基配列であること特徴とする プローブ。
7. C型 炎ウィルス （HCV) を検出可能なプローブであって、 配列表の配 列番号 34又は 35記載の塩基配列であること特徴とするプロープ。
8. アル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダイズ可能なプロ ーブ。
9. pH8~l 4のアル力リ領域において病原微生物の標的核酸にハイブリダ ィズ可能な請求項 8記載のプローブ。
10. 病原微生物の標的核酸が結核菌、 リン菌、 クラミジァ、 HCV由来の標 的核酸のいずれかである請求項 8又は 9記載のプロープ。
1 1. 病原微生物の標的核酸が結核菌群の I S 6110遺伝子、 リン菌の c p pB遺伝子、 クラミジァの] p LGV440、 HCVの 5， 非翻訳領域の塩基配列 から選択され、 該遺伝子にハイブリダィズ可能な請求項 10記載のプローブ。
12. 結核菌群の I S 61 10遺伝子に存在する配列表の配列番号 39に示さ れる塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 11記載のプロ ープ。
1 3. 配列表の配列番号 1 1に示される塩基配列からなる請求項 12記載のプ ローブ。
14. リン菌の c p p B遺伝子に存在する配列表の配列番号 27に示される塩 基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 1 1記載のプローブ。
15. 配列表の配列番号 21に示される塩基配列からなる請求項 14記載のプ ロープ。
16. クラミジァの; PLGV440に存在する配列表の配列番号 22に示され る塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 11記載のプロ一 ブ。
1 7. 配列表の配列番号 20に示される塩基配列からなる請求項 16記載のプ ローブ。
18. H C Vの 5 ' 非翻訳領域に存在する配列表の配列番号 34又は 35に示 される塩基配列、 又はその一部を含有する塩基配列からなる請求項 1 1記載のプ ローブ。
1 9. 配列表の配列番号 34又は 35に示される塩基配列からなる請求項 18 記載のプローブ。
20. 標識を付加されている請求項 1〜19のいずれか 1項に記載のプローブ。
2 1 . 請求項 2 0記載のプローブであって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5で示される塩基配列のうち連続する 8塩基ないし 5 3塩基から なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、 標的核酸とハイブリダイズ した場合には蛍光強度が抑制されず、 標的核酸とハイプリダイズしない場合は蛍 光強度が抑制されるように蛍光標識されたものであることを特徴とする病原^:生 物検出用プローブ。
2 2 . 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5に示される塩基配列 のうち、 連続する 8塩基以上からなる請求項 2 1記載の病原微生物検出用プロ一 ブ。
2 3 . 5 '末端がローダミン系蛍光色素またはォキサジン系蛍光色素で標識さ れたプローブであって、 配列表の配列番号 3 4に示される塩基配列のうち、 連続 する 8塩基以上からなることを特徴とする請求項 2 2に記載の病原微生物検出用 プローブ。
2 4 . 標識蛍光色素がレポーター蛍光色素及ぴクェンチヤ一色素を有するプロ ープであって、 配列表の配列番号 1 1、 2 0、 2 1、 3 4又は 3 5に示される塩 基配列のうち、 連続する 8塩基以上からなることを特徴とする請求項 2 2に記載 の病原微生物検出用プローブ。
2 5 . レポーター色素が、 フノレオレツセィン系色素であり、 クェンチヤ一色素 が D A B C Y L系色素であることを特徴とする請求項 2 4に記載の病原微生物検 出用プローブ。
2 6 . 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 金コロイド、 および放射性同位体か ら選択される標識を付加されている請求項 2 0記載のプローブ。
2 7. 請求項 1〜 2 6のいずれか 1項に記載のプローブを使用し、 病原微生物 の標的核酸とハイプリダイゼーションを行う工程を包含する病原微生物の検出方 法。
2 8 · アル力リ領域で病原微生物の標的核酸とハイプリダイゼーシヨンを行う ことを特徴とする請求項 2 7記載の病原微生物の検出方法。
2 9 . 病原微生物が結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 H C V由来の標的核酸で ある請求項 2 7又は 2 8記載の病原微生物の検出方法。
30. 病原微生物の標的核酸が結核菌群の I S 6110遺伝子またはその断片 である請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
31. 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zまたはその断片を増幅した 後に、 増幅物と請求項 1、 2、 9〜1 1、 12、 1 3および 20〜26のいずれ 力、 1項記載のプロープとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことを特徴とする 請求項 30記載の病原微生物の検出方法。
32. 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用して結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zまたはその断片が増幅される請求項 31記載の病原微生物の 検出方法。
33. 病原微生物の標的核酸がリン菌の c p p B遺伝子またはその断片である 請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
34. リン菌由来の c p p B遺伝子および /またはその断片を増幅した後に、 増幅物と請求項 3、 4、 9-11, 14、 15および 20〜 26のいずれか 1項 記載のプローブとの間でハイプリダイゼーションを行うことを特徴とする請求項 33記載の病原微生物の検出方法。
35. 配列表の配列番号 28、 29にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してリン菌由来の c p pB遺 伝子および/またはその断片が增幅される請求項 34記載の病原微生物の検出方 法。
36. 病原微生物の標的核酸がクラミジァの PLGV440またはその断片で ある請求項 29記載の病原微生物の検出方法。
37. クラミジァ由来の p LGV440および Zまたはその断片を増幅した後 に、 增幅物と請求項 5、 6、 9-11, 16、 17および 20〜26のいずれか 1項記載のプローブとの間でハイプリダイゼーションを行うことを特徴とする請 求項 36記載の病原微生物の検出方法。
38. 配列表の配列番号 23〜 26にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するプライマーを使用してクラミジァ由来の P LG V440および/またはその断片が増幅される請求項 37記載の病原微生物の検 出方法。
39. 標的核酸が HCVの 5' 非翻訳領域またはその断片である請求項 29記 載の病原微生物の検出方法。
40. HCV由来の 5， 非翻訳領域および Zまたはその断片を増幅した後に、 増幅物と請求項 7、 8、 9〜： L l、 18、 19および 20〜26のいずれ力 1項 記載のプローブとの間でハイブリダイゼーシヨンを行うことを特徴とする請求項 39記載の病原微生物の検出方法。
41. 配列表の配列番号 30〜 33にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有するブラィマーを使用して H C V由来の 5， 非翻訳 領域および Zまたはその断片が増幅される請求項 40記載の病原微生物の検出方 法。
42. 請求項 27〜 41のいずれか 1項に記載の標的核酸の検出方法を用いて 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 HCV由来の核酸を検出する工程を包含する病 原微生物の検出方法。
43. 下記工程を包含する核酸増幅方法で得られる増幅核酸を検出することを 特徴とする病原微生物の検出方法。
(a) 铸型となる核酸、 デォキシリボヌクレオチド 3リン酸、 鎖置換活性を有す る DNAポリメラーゼ、 少なくとも 1種類のプライマー、 および RNa s e Hを 混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、 鍀型となる核酸の 塩基配列に実質的に相補的であり、 少なくともデォキシリボヌクレオチド又はヌ クレオチドアナログから選択されるものとリポヌクレオチドを含有し、 該リポヌ クレオチドは該プライマーの 3' 末端又は 3' 末端側に配置されたキメラオリゴ ヌクレオチドプライマーであり、 ；および、
(b) 反応産物を生成するのに充分な時間、 反応混合物をインキュベートするェ 程。
44. さらに錄型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラ オリゴヌクレオチドプライマ一を含有する反応混合物を使用する核酸増幅方法で あることを特徴とする請求項 43記載の病原微生物の検出方法。
45. キメラオリゴヌクレオチドプライマーが下記一般式で表されるキメラォ リゴヌクレオチドプライマ一である請求項 44記載の病原微生物の検出方法。 一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の dN は Nで置換されていてもよい）
46. キメラオリゴヌクレオチドプライマ一の cが 0である請求項 45記載の 病原微生物の検出方法。
47. ヌクレオチドアナ口グがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシ リボウラシノレヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （ひ一 S) リポヌク レオチドである請求項 45記載の病原微生物の検出方法。
48 , 配列表の配列番号 13〜： 16、 23〜26、 28〜31でそれぞれ表さ れる塩基配列からなるキメラオリゴヌクレオチドプライマ一を使用する請求項 4 3記載の病原微生物の検出方法。
49. 請求項 1〜 26いずれ力記載のプローブを用いて増幅核酸を検出するェ 程を包含する請求項 27〜42のいずれか 1項に記載の病原微生物の検出方法。
50. 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドブラ ィマー：
一般式： 5' -dNa-Nb~dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリボヌクレオチド及び/ /又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及び/又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 dNaの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい） 。
51. cが 0である請求項 50記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
52. ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキシ リボウラシ ヌクレオチドであり、 修飾リボヌクレオチドが （ α— S ) リポヌク レオチドである請求項 50記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
53. 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28-31でそれぞれ表さ れる請求項 52記載の病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマ一。
54. 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有する、 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Z またはその断片を増幅するためのプライマー。
55. 配列表の配列番号 27にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 リン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断 片を増幅するためのプライマー。
56. 配列表の配列番号 22にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 クラミジァ由来の p LGV440および/またはそ の断片を増幅するためのプライマー。
57. 配列表の配列番号 41〜 43にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該 配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5， 非翻訳領域および Zまたは その断片を増幅するためのプライマー。
58. 塩基酉己列の一部がリボヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一である請求項 54〜57のいずれか 1項に記載のプライマー。
59. 標識を付加されている下記から選択されるプライマー ：
( i ) 下記一般式で表される病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライ マー ：
一般式： 5' -dNa-Nb-dNc-3'
(a ： 11以上の整数、 b ： 1以上の整数、 c ： 0または 1以上の整数、 dN： デォキシリポヌクレオチド及び Z又はヌクレオチドアナログ、 N：未修飾リポヌ クレオチド及ぴ Z又は修飾リポヌクレオチド、 なお、 d N aの部位の一部の d N は Nで置換されていてもよい） ；
(i i) cが 0である （i) のキメラオリゴヌクレオチドプライマー；
(i i i) ヌクレオチドアナログがデォキシリボイノシンヌクレオチド、 デォキ シリボウラシノレヌクレオチドであり、 修飾リポヌクレオチドが （ α— S ) リボヌ クレオチドである （i) のキメラオリゴヌクレオチドプライマー； .
( i V ) 配列表の配列番号 13〜16、 23〜26、 28-31でそれぞれ表さ れる （i i i) の病原微生物検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマー；
(V ) 配列表の配列番号 36、 37にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配 列に一部重複する配列を有する、 結核菌群由来の I S 61 10遺伝子および Zま たはその断片を増幅するためのプライマー；
(v i) 配列表の配列番号 27にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列に 一部重複する配列を有する、 リン菌由来の c p p B遺伝子および/またはその断 片を増幅するためのプライマー；
(V i i ) 配列表の配列番号 22にそれぞれ示される塩基配列、 もしくは該配列 に一部重複する配列を有する、 クラミジァ由来の; LGV440および Zまたは その断片を増幅するためのプライマー；
( V i i i ) 配列表の配列番号 41〜43にそれぞれ示される塩基配列、 もしく は該配列に一部重複する配列を有する、 HCV由来の 5' 非翻訳領域および Zま たはその断片を増幅するためのプライマー；および
( 1 x) 塩基配列の一部がリポヌクレオチドに置換されたキメラオリゴヌクレオ チドプライマ一である (V ) ~ (V i i i ) のいずれかのプライマー。
60. 蛍光物質、 色素、 酵素、 ビォチン、 および金コロイドから選択される標 識を付加されている請求項 59記載のプライマー。
61. 請求項 1〜 26のいずれか 1項に記載のプローブを含有することを特徴 とする標的核酸検出用組成物。
62. 請求項 50〜60のいずれか 1項に記載のプライマーを含有することを 特徴とする標的核酸検出用組成物。
63. 病原微生物の検出に使用される請求項 61又は 62記載の標的核酸検出 用糸且成物。
64. 請求項 43記載の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であつ て、 標的核酸の増幅を行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検 出用組成物。
65. 鎖置換活性を有する DN Aポリメラーゼ、 RNa s e H、 及びデォキシ リボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有する請求項 64記載の病原 微生物検出用組成物。
66. DNAポリメラーゼがバチルス カルドテナックス （B a c i 1 1 u s c a l d o t e n a x) 由来の 5' →3， ェキソヌクレアーゼ欠損 B c a DNA ポリメラーゼである請求項 65記載の病原微生物検出用組成物。
67. RNa s eHがピロコッカス （Py r o c o c c u s) 属細菌由来及び Z又はアルカェォグロバス （Ar c h a e o g l o b u s) 属細菌由来の I I型 RNa s eHである請求項 65記載の病原微生物検出用糸且成物。
68. 請求項 1〜26のいずれか記載のプローブを含有することを特徴とする 病原微生物検出用キット。
69. 請求項 50〜 60のいずれ力記載のプライマーを含有することを特徴と する病原微生物検出用キット。
70. 結核菌群、 リン菌、 クラミジァ、 HCVの検出に使用される請求項 68 又は 69記載の病原微生物検出用キット。
71. 請求項 27記載の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであつ て、 標的核酸の増幅を行うための少なくとも 1種の試薬を包含する病原微生物検 出用キット。
72. 鎖置換活性を有する DNAポリメラーゼ、 RNa s eH、 及ぴデォキシ リボヌクレオチド 3リン酸から選択される試薬を含有する請求項 71記載のキッ
73. DN Aポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の 5， →3， ェ キソヌクレアーゼ欠損 B c a DNAポリメラーゼである請求項 72記載のキット。
74. RNa s eHがピロコッカス属細菌由来及び/又はアルカェォグロバス 属細菌由来の I I型 RNa s eHである請求項 72記載のキット&
75. 増幅産物を捕捉するための担体を含有する請求項 72記載のキット。
76. 担体がマイクロタイタープレート、 ビーズ、 マグネチックビーズ、 メン プラン、 およぴガラスから選択される担体である請求項 75記載のキット。
77. 結核菌群の検出方法において、 結核菌含有検体をムラミダーゼで処理し、 核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする結核菌群の検出方法。
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