WO2002040660A2 - Promotor zur funktionellen charakterisierung von g-protein gekoppelten rezeptoren in der hefe saccharomyces cerevisiae - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a promoter, DNA fragments which contain this promoter and their use, in particular in methods for identifying substances which are receptors coupled to G protein show activating or inhibiting effect.
  • GPCRs G-protein coupled receptors
  • MAPK cascade pheromone-dependent itogen-activated protein kinase cascade
  • This property of the yeast can be used to test mammalian GPCRs, in particular human GPCRs, in a yeast model, in order to look for activators or inhibitors of the relevant GPCR or the corresponding one To seek signal transduction pathway, especially since non-species GPCRs can be functionally expressed in the yeast, with a measurable cellular response via the yeast MAPK cascade if the introduced GPCR is activated by a specific ligand and this signal to the MAPK cascade the yeast is passed on.
  • the pheromone ⁇ acts directly on the pheromone-dependent MAPK cascade, which regulates the expression of certain S. cerevisiae genes.
  • the detection of whether a substance has an activating or inhibiting effect on a GPCR heterologously expressed in S. cerevisiae can be carried out by expressing S. cerevisiae genes which are regulated by the MAPK cascade (“marker genes”).
  • the promoters of such marker genes can be used, for example, in connection with a suitable reporter system for the identification of GPCR activators or inhibitors.
  • the identification of pheromone-regulated genes can be done on the one hand by using transposon mutagenesis (Ross-Macdonald et al., 1999) or by using DNA microchips, which allow expression analysis for all mRNAs of a cell at a certain point in time (Wodicka et al ., 1997).
  • An object of the present invention was to identify another S. cerevisiae promoter which can be activated by pheromone ⁇ and with which a strong expression of the regulated gene can be achieved.
  • the invention relates to the promoter of the YNL 279 w gene from S. cerevisiae.
  • the invention relates to the promoter with the sequence SEQ ID NO. 4th
  • the invention also relates to a recombinant DNA fragment which contains the promoter of the Saccharomyces cerevisiae gene YNL 279 w, which, when functionally linked to a structural gene, regulates its transcription and a recombinant DNA fragment which contains a promoter with the DNA sequence SEQ ID NO. 4 contains.
  • the invention relates to a recombinant DNA fragment which contains the promoter YNL 279 w and a structural gene and in which the promoter is functionally linked to the structural gene.
  • the structural gene codes for example for a reporter gene or for a protein which is to be produced in large quantities in S. cerevisiae.
  • the invention relates to a DNA vector and a recombinant S. cerevisiae cell, which contain such a recombinant DNA fragment.
  • a recombinant S. cerevisiae cell preferably expresses no or only small amounts of functionally active endogenous receptors Ste2p and Ste3p.
  • the invention also relates to methods for the functional characterization of GPCRs, for the screening of inhibitors and / or activators of GPCRs and methods for the production of proteins in S. cerevisiae.
  • a recombinant S. cerevisiae cell which contains a reporter gene under the control of the promoter of the YNL 279 w gene and which expresses a heterologous G protein-coupled receptor; b) the cell is incubated with a substance to be examined and c) the change in transcription of the reporter gene is determined.
  • a method for identifying constitutively active mutants of G protein-coupled receptors wherein a) a recombinant S. cerevisiae cell is produced which contains one or more reporter genes under the control of the promoter of the YNL279w gene b) and which contains a mutated heterologous G protein coupled receptor expressed, the modification leads to a constitutively active G-protein coupled receptor, c) the cell is incubated with an activating or inhibiting substance and - d) the change in the transcription of the reporter gene is determined.
  • the corresponding endogenous GPCRs, Step2 and / or Step3 are not expressed in the recombinant S. cerevisiae cell, e.g. since these genes have been deleted. This deletion can e.g. as described in Broach Thorner (1996) Nature, 384, 14-16).
  • Another embodiment relates to methods for the production of heterologous proteins in S. cerevisiae, the structural gene of the heterologous protein to be expressed being functionally linked to the promoter of the YNL 279 w gene and being expressed under its control.
  • the ORF YNL279w showed a strong increase in its expression depending on the time ( Figures 2 and 3). Since the regulation of the transcription or expression of genes generally takes place via regulative sequences 5 'from the starting point of translation, the so-called promoters, the promoters which have such regulative sequences are of particular interest. To identify activators or inhibitors of pharmacologically and medically interesting GPCRs, such inducible or repressible promoters can likewise be cloned into genes or structural genes which represent a suitable reporter system in order to identify substances which have an activating or inhibiting effect after addition point to the reporter system.
  • Suitable reporter systems are, for example, the genes of LacZ, luciferase, aequorin, green fluorescent protein (GFP), DsRed, HIS3, URA3, TRP1 and LEU2, but also resistance genes against certain antibiotics, e.g. B. Kanamycin.
  • reporter genes can e.g. genes such as lacZ, act in which the effect of certain substances on the MAPK cascade can be demonstrated by discoloration of the cell colonies.
  • Reporter genes can also be e.g. are genes that enable the cell to grow under certain selection conditions, e.g. auxotrophic genes.
  • DNA constructs which contain the promoter of the YNL279w gene and reporter genes cloned behind are shown in Table 1. These DNA constructs can be used, for example, for the identification of GPCR Activators (agonists) and inhibitors (antagonists) can be used in functional assays.
  • the DNA encoding such a reporter gene is fused 3 'to the pheromone-inducible promoter of the ORF YNL279w of the yeast Saccharomyces cerevisae and e.g. cloned into a high-copy vector or iow-copy vector. Yeast cells can then be transformed with these vectors. Likewise, the DNA fused to the promoter can be stably integrated into the yeast genome.
  • yeast strains that are genetically manipulated with reporter genes that belong to the group of auxotrophic genes (eg HIS3, URA3, TRP1, LEU2, ADE2 and LYS1) must be mutated for the corresponding gene, ie functionally inactivated.
  • auxotrophic genes eg HIS3, URA3, TRP1, LEU2, ADE2 and LYS1
  • the yeast promoter YNL 279 w is activated and the expression of the reporter gene regulated by the promoter is increased.
  • the promoter of the YNL279w gene is preferably cloned in front of reporter genes such as, for example, HIS, ADE, TRP or LEU, since this combination permits a read-out about the growth of the cells in a correspondingly depleted medium.
  • a selected GPCR is activated via a substance to be investigated
  • the promoter at the end of the MAPK cascade, YNL279w is activated, and thus expression is regulated by the YNL 279 w promoter regulated reporter gene.
  • HIS HIS, ADE, TRP or LEU
  • An agonist can be identified by the corresponding S. cerevisiae cells growing in the selection medium.
  • a read-out can be carried out using colorimetric or luminometric measurements. Only those cells show chemiluminescence in which the heterologous GPCR was activated by an agonist.
  • CAN1 is used as the reporter gene, the cells grow in medium containing canavanine. In the presence of activators (agonists) of a heterologously expressed GPCR, the CAN1 gene is expressed so that the cells no longer grow in the medium containing canavanine. If an antagonist (inhibitor) is added, the cultures grow in this selection medium.
  • the screening methods can be carried out on microtiter plates in which yeast cells have been sown which have previously been transformed with the promoter-reporter gene construct (for example a DNA construct from Table 1).
  • these cells are transformed with a heterologous GPCR for which an agonist or antagonist is to be found.
  • human GPCRs for example adenosine receptors, somatostatin receptors, dopamine receptors, bradykinin receptors, lysolipid receptors, Adrenergic receptors, muscarinic acetylcholine receptors can be used in these procedures.
  • the promoter of YNL279w can also be used to identify activators and inhibitors of the pheromone-dependent MAPK cascade. Since the promoter YNL279W is more sensitive to stimulation after pheromone ⁇ treatment than is the case, for example, for the FUS1 promoter, the use of the YNL279w promoter proposed here offers advantages over other screening methods which, e.g. use the FUS1 promoter.
  • Figure 4 shows that stimulation of the YNL279w
  • Promoter / Aeqourin construct (p415YNL279-AEQ) reacts significantly better than is the case for a promoter element which corresponds to a region from the promoter of the FUS1 gene (here referred to as 4PRE-AEQ).
  • Figure 1a Sequence of YNL279w (Genbank AccNr .: Z71555, SEQ ID NO. 3). The start codon ATG is underlined. Sequence areas highlighted in bold represent pheromones responsive elements (PRE).
  • Figure 1 b Promoter region (5'-UTR) of YNL279w (SEQ ID NO. 4)
  • FIG. 1c Pheromone responsive elements (PRE) in the promoter area of YNL279w
  • Figure 2 Expression profile of the Saccharomyces cerevisiae ORF YNL279w after induction with pheromone ⁇ . The changes in gene expression observed are based on the results of investigations with DNA microchips. The changes in the gene expression of the FUS1 gene are shown for comparison.
  • Figure 3 Northern blot analysis of the expression profile of the YNL279w gene after stimulation of the yeast cultures with pheromone ⁇ in the yeast mutant sstl.
  • Figure 4 Induction of aequorin expression (as relative light units) after stimulation of the yeast cells with the specified concentrations of pheromone ⁇ (B). The values shown in the graph represent the mean for three independently performed tests, the associated individual values are shown in (A).
  • the aequorin reporter gene is under the control of the YNL279w promoter.
  • 4PRE-AEQ aequorin is under the control of an area (-271 to -1 before start) of the FUS1 gene. Each stimulation attempt was carried out in triplicate.
  • Figure 5 Schematic representation of the promoter-reporter gene-vector construct, consisting of the promoter region of YNL279w and the reporter gene aeqourin in the vector p415 (a derivative of vector pRS415: ATCC 87520).
  • RNA from these cells was isolated using standard methods (for example Sambrock et al. Molecular Chemistry Press, (Cold Spring Harbor Laboratory 1989) and first strand synthesis was carried out with 30 ⁇ g total RNA each.
  • the protocol for first and second strand synthesis as well the purification steps of the generated double-stranded cDNA, the in vitro transcription and the preparation of the cRNA for the hybridization correspond to the protocol of the company Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA, USA).
  • the ORF YNL279w was identified as one of the most induced ORFs.
  • the YNL279w promoter region was amplified from genomic Saccharomyces cerevisiae DNA.
  • Example 2 Isolation of the YNL279w Promoter ("Promoter")
  • the promoter region of the YNL279w gene was via the primer YNL279F1
  • promoter This fragment of the promoter region is hereinafter referred to as "promoter”.
  • the amplified promoter region of the YNL279w gene was cloned into the vector p415 before the gene coding for aequorin (see Figure 5; derivative of the vector pRS415, ATCC 87520).
  • This construct was transformed into the Saccharomyces cerevisiae strain (Mat a far1 :: hisG sst2 :: ura3 FOA fus1 :: HIS3) using the Li acetate method (Ito et al., 1983).
  • Mating factor ⁇ stock solution 100 ⁇ M in 90% methanol
  • Coelenterazine stock solution 1 mM in 100% methanol (MOLECULAR PROBES; ref C-2944).
  • CaCI 2 stock solution 1M in 1M Tris-HCl solution (100 times diluted in lysis buffer before use)
  • Lysis Buffer Yeast Protein Extraction Reagent
  • Cismowski MJ Takesono A, Ma C, Lizano JS, Xie X, Fuernkranz H, Lanier SM, Duzic E. (1999) Genetic screens in yeast to identify mammalian nonreceptor modulators of G-protein signaling. Nat Biotechnol 17: 878-83

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor, DNA Fragmente, die diesen Promotor enthalten sowie der Verwendung, insbesondere in Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf G-protein gekoppelte Rezeptoren eine aktivierende oder inhibierende Wirkung zeigen.

Description

Promotor zur funktionellen Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren in der Hefe Saccharomyces cerevisiae 5 Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor, DNA Fragmente, die diesen Promotor enthalten sowie deren Verwendung, insbesondere in Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren eine aktivierende oder inhibierende Wirkung zeigen.
10
GPCRs (G-Protein gekoppelte Rezeptoren) bilden eine Genfamilie strukturell und funktioneil verwandter Transmembranproteine. Für die medizinische Forschung und Entwicklung pharmakologischer Wirksubstanzen sind GPCRs Zielmoleküle von großer Bedeutung und nehmen in einer Vielzahl von Pathologien eine Schlüsselstellung ein"
15 (Stadel et al., 1997). Das klassische Beispiel für die zentrale Stellung von GPCRs in der pharmakologischen Behandlung von Asthma ist der ß2AR (ß2-adrenerger Rezeptor) oder die Beteiligung eines Kaposi Sarkom (KS) assoziierten Herpesvirus GPCRs an der KS-induzierten Tumorgenese (Geras-Raaka et al., 1998). Diese Klasse von Rezeptoren binden ein breites Spektrum von Liganden, wie zum Beispiel
20 Proteinhormone, Chemokine, Peptide oder divalente Kationen. Die Identifizierung von Aktivatoren und Inhibitoren G-Protein gekoppelter Rezeptoren ist somit einer der vielversprechendsten Ansätze zum besseren Verständnis und Behandeln von Krankheiten (Wilson et al., 1998).
25 Viele Komponenten des GPCR Signaltransduktionsweges in Säugerzellen haben orthologe Komponenten in dem GPCR Signaltransduktionsweg der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Durch Stimulation mit Mating Faktor (Phermon α bzw. Phermon a) wird z. B. die Pheromon-abhängige itogen-aktivierte Proteinkinasekasdade aktiviert (im weiteren MAPK Kaskade genannt) (Frederickson,
30 1999). Diese Eigenschaft der Hefe kann dazu genutzt werden Säuger-GPCRs, im besonderen humane GPCRs, in einem Hefemodell zu testen, um nach Aktivatoren bzw. Inhibitoren des betreffenden GPCRs bzw. des entsprechenden Signaltransduktionsweges zu suchen, insbesondere, da speziesfremde GPCRs, in der Hefe funktionell exprimiert werden können, wobei es über die Hefe MAPK-Kaskade zu einer meßbaren zellulären Antwort kommt, wenn der eingeführte GPCR durch einen spezifischen Liganden aktiviert wird und dieses Signal an die MAPK Kaskade der Hefe weitergegeben wird. Von besonderem Interesse ist die Suche nach Aktivatoren bzw. Inhibitoren von bisher nicht funktioneil annotierten GPCRs, den sogenannten Orphan- GPCRs.
Die Pheromone α oder a wirken in S. cerevisiae über die endogenen G-Protein gekoppelten Rezeptoren Ste2p und Ste3p (Gustin et al., 1998). Dabei wirkt das Pheromon α direkt auf die Pheromon-abhängige MAPK Kaskade, wodurch die Expression bestimmter S. cerevisiae Gene reguliert wird. Der Nachweis, ob eine Substanz eine aktivierende oder inhibierende Wirkung auf einen heterolog in S. cerevisiae exprimierten GPCR hat, kann durch die Expression S. cerevisiae Gene' erfolgen, die durch die MAPK Kaskade reguliert werden („Markergene"). Die Promotoren solcher Markergene können z.B. in Verbindung mit einem geeigneten Reportersystem zur Identifizierung von GPCR Aktivatoren bzw. Inhibitoren verwendet werden.
Die Identifizierung von Pheromon regulierten Genen kann einerseits über die Anwendung der Transposonmutagenese (Ross-Macdonald et al., 1999) oder die Anwendung von DNA-Mikrochips, die eine Expressionsanalyse für alle mRNAs einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt zuläßt, erfolgen (Wodicka et al., 1997).
Funktionelle Assays zur Identifizierung von Inhibitoren oder Aktivatoren von GPCRs werden bisher überwiegend in Säugerzellen durchgeführt (Wilson et al. (1998) British Journal of Pharmacology 125, 1387-1392); Geras-Raaka et al. (1998) J. Exp. Med. 188 No.2, 405-408). Für funktionelle Assays in S. cerevisiae ist die Verwendung der Promotoren des Gens FUS1 oder FUS2 beschrieben (Cisnowski et al. (1999) Nature 17, 878-883; Frederickson (1999) Nature Biotechnology A, 852-853). FUS1 ist ein
Gen, das nach Aktivierung mit Pheromon α in Wildtypzellen der Hefe Saccharomyces
I cerevisae erhöht exprimiert wird. In US 5,063,153 werden die Promotoren von FUS1 und FUS2 verwendet, um ein Strukturgen, das für ein Protein von Interesse kodiert, in großen Mengen zu exprimieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen anderen S. cerevisiae Promotor zu identifizieren, der durch Pheromon α aktivierbar ist und mit dem eine starke Expression des regulierten Gens erreicht werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist der Promotor des Gens YNL 279 w aus S. cerevisiae. Gegenstand der Erfindung ist der Promotor mit der Sequenz SEQ ID NO. 4.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombinantes DNA Fragment, das den Promotor des Saccharomyces cerevisiae Gens YNL 279 w enthält, der, wenn funktioneil mit einem Strukturgen verbunden, dessen Transkription reguliert und ein rekombinantes DNA Fragment, das einen Promotor mit der DNA-Sequenz SEQ ID NO. 4 enthält. Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes DNA Fragment, das den Promotor YNL 279 w und ein Strukturgen enthält und bei dem der Promotor funktioneil mit dem Strukturgen verbunden ist. Das Strukturgen kodiert beispielsweise für ein Reportergen oder für ein Protein, das in großen Mengen in S. cerevisiae hergestellt werden soll.
Gegenstand der Erfindung sind ein DNA-Vektor und eine rekombinante S. cerevisiae Zelle, die ein solches rekombinantes DNA-Fragment enthalten. Eine solche rekombinante S. cerevisiae Zelle exprimiert vorzugsweise keine oder nur geringe Mengen funktioneil aktiver endogener Rezeptoren Ste2p und Ste3p.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur funktioneilen Charakterisierung von GPCRs, zum Screening von Inhibitoren und/oder Aktivatoren von GPCRs und Verfahren zur Herstellung von Proteinen in S. cerevisiae.
Beispielsweise Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren und/oder Inhibitoren von G-Protein -gekoppelten Rezeptoren, wobei a) eine rekombinante S. cerevisiae Zelle hergestellt wird, die ein Reportergen unter der Kontrolle des Promotors des YNL 279 w Gens enthält und die einen heterologen G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert; b) die Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert wird und c) die Veränderung der Transkription des Reportergens bestimmt wird.
Verfahren zur Identifizierung von konstitutiv aktiven Mutanten von G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wobei a) eine rekombinante S. cerevisiae Zelle hergestellt wird, die ein oder mehrere Reportergene unter der Kontrolle des Promotors des YNL279w Gens enthält b) und die einen mutierten heterologen G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert, wobei die Modifikation zu einem konstitutiv aktiven G-Protein gekoppelten Rezeptor führt, c) die Zelle mit einer aktivierenden oder inhibierenden Substanz inkubiert wird und - d) die Veränderung der Transkription des Reportergens bestimmt wird.
Vorzugsweise werden in der rekombinanten S. cerevisiae Zelle die entsprechenden endogenen GPCRs, Step2 und/oder Step3, nicht exprimiert, z.B. da diese Gene deletiert wurden. Diese Deletion kann z.B. wie in Broach Thorner (1996) Nature, 384, 14-16) beschrieben, durchgeführt werden.
Eine andere Ausführungsform betrifft Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in S. cerevisiae, wobei das Strukturgen des zu exprimierenden heterologen Proteins funktioneil mit dem Promotor des YNL 279 w Gens verbunden und unter dessen Kontrolle exprimiert wird.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen:
Zur Identifizierung Pheromon-induzierbarer und -reprimierbarer ORFs (Open-Reading- Frames, offene Leseraster) wurden Kulturen der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae mit bzw. ohne Pheromon behandelt um festzustellen, welche bekannten f Gene und insbesondere bisher noch nicht charakterisierten Gene durch Pheromon induziert bzw. reprimiert werden. Es wurden DNA-Mikrochips verwendet, mit denen parallel die Expressionsmuster für die mehr als 6000 identifizierten Hefegene dargestellt werden können. Vergleicht man die Genexpressionsmuster von zwei Zellen, bzw. Kulturen von Zellen, die in unterschiedlicher Weise z.B. mit oder ohne Pheromon α behandelt wurden, so läßt sich mit Hilfe der DNA-Mikroarrays, nach entsprechender Aufbereitung der korrespondierenden mRNAs, feststellen, welche Gene spezifische aktiviert, bzw. reprimiert wurden.
Der ORF YNL279w zeigte nach Pheromon α Zugabe zeitabhängig einen starken Anstieg seiner Expression (Abbildung 2 und 3). Da die Regulation der Transkription bzw. Expression von Genen in der Regel über regulative Sequenzen 5' vom Startpunkt der Translation, den sogenannten Promotoren, erfolgt, sind die Promotoren die solche regulativen Sequenzen besitzen von besonderem Interesse. Zur Identifizierung von Aktivatoren bzw. Inhibitoren von pharmakologisch und medizinisch interessanten GPCRs können solche induzierbaren oder reprimierbaren Promotoren in gleicherweise vor Gene bzw. Strukturgene kloniert werden, die ein geeignetes Reporter-System darstellen, um Substanzen zu identifizieren, die nach Zugabe aktivierende bzw. inhibierende Wirkung auf das Reporter-System zeigen. Geeignete Reporter-Systeme stellen beispielsweise die Gene von LacZ, Luciferase, Aequorin, Green-fluorescent Protein (GFP), DsRed, HIS3, URA3, TRP1 und LEU2, aber auch Resistenzgene gegen bestimmte Antibiotika, z. B. Kanamycin dar. Bei diesen sogenannten Reportergenen kann es sich z.B. um Gene wie z.B. lacZ, handeln, bei denen über Verfärbung der Zellkolonien eine Wirkung bestimmter Substanzen auf die MAPK Kaskade nachgewiesen werden kann. Bei den Reportergenen kann es sich auch z.B. um Gene handeln, die der Zelle unter bestimmten Selektionsbedingungen das Wachstum ermöglichen, wie z.B. auxotrophe Gene.
Beispiele für rekombinante DNA Fragmente (DNA Konstrukte), die den Promotor des Gens YNL279w und dahinter klonierte Reportergene enthalten, sind in Tabelle 1 dargestellt. Diese DNA Konstrukte können z.B. für die Identifizierung von GPCR- Aktivatoren (Agonisten) und Inhibitoren (Antagonisten) in funktioneilen Assays verwendet werden.
Tabelle 1 :
DNA Konstrukt Nachweissystem (Read out)
Promoton (YNL279w) LacZ kolorimetrischer/Chemiluminiszenz Read-out Promotori (YNL279W) Luziferase Chemiluminiszenz Read-out
Promoton (YNL279w> Aeqourin Chemiluminiszenz Read-out
Promotori (YNL279w> GFP Fluoreszierende Kolonien (Zellen)
Promoton (YNL279w> EGFP Fluoreszierende Kolonien (Zellen)
Promoton (YNL279W) KAN Wachstum in Selektionsmedium Promoton (YNL279w> HIS3 Wachstum in Histidin-depletiertem Medium
Promoton (YNL279w) URA3 Wachstum in Uracil-depletiertem Medium
Promoton (YNL279w) TRP1 Wachstum in Tryptophan-depletiertem Medium
Promoton (YNL279w) LEU2 Wachstum in Leucin-depletiertem Medium
Promoton (YNL279W) ADE2 Wachstum in Adenin-depletiertem Medium Promoton (YNL279W) CAN1 Wachstum in Canavanin-haltigem Medium (bei Zugabe eines Inhibitors)
Die DNA, welche für ein solches Reportergen codiert, wird 3' an den Pheromon- induzierbaren Promotor des ORFs YNL279w der Hefe Saccharomyces cerevisae fusioniert und z.B. in einen high-copy Vektor oder Iow-copy Vektor kloniert. Mit diesen Vektoren können dann Hefezellen transformiert werden. Ebenso kann die an den Promotor fusionierte DNA stabil in das Hefegenom integriert werden.
Hefestämme, die mit Reportergenen genetisch manipuliert werden, die zur Gruppe der auxotrophen Gene (z.B. HIS3, URA3, TRP1, LEU2, ADE2 und LYS1) gehören, müssen für das korrespondierende Gene mutiert, d.h. funktionell inaktiviert sein. Bei Stimulation der Hefezellen durch Pheromon kommt es zu einer Aktivierung des Hefepromotors YNL 279 w und zur erhöhten Expression des durch den Promotor regulierten Reportergens. Bei der Suche nach GPCR-Agonisten wird der Promotor des Gens YNL279w vorzugsweise vor Reportergene wie z.B. HIS, ADE, TRP oder LEU kloniert, da diese Kombination einen Read-out über das Wachstum der Zellen in einem entsprechend depletiertem Medium zuläßt. Wird ein ausgewählter GPCR über eine zu untersuchende Substanz aktiviert, kommt es zur Aktivierung des am Ende der MAPK- Kaskade stehenden Promotors, YNL279w, und somit zur Expression durch den YNL 279 w Promotor regulierten Reportergens. Im Falle von HIS, ADE, TRP oder LEU führt dieses zu einem Wachstum im entsprechenden Selektionsmedium. Ein Agonist kann dadurch identifiziert werden, daß die entsprechenden S. cerevisiae Zellen in dem Selektionsmedium wachsen.
Bei Verwendung der Gene für LacZ, GFP oder EGFP kann ein Read-out über kolorimetrische, bzw. luminometrische Messungen erfolgen. Nur solche Zellen zeigen eine Chemiluminiszenz, bei denen der heterologe GPCR durch einen Agonisten aktiviert wurde.
Wird als Reportergen CAN1 verwendet, wachsen die Zellen in Canavanin-haltigem Medium. In Gegenwart von Aktivatoren (Agonisten) eines heterolog exprimierten GPCRs wird das CAN1-Gen exprimiert, so daß die Zellen nicht mehr in dem Canavanin-haltigen Medium wachsen. Wird ein Antagonist (Inhibitor) hinzugefügt, so wachsen die Kulturen in diesem Selektionsmedium.
Die Screening-Verfahren können auf Mikrotiterplatten durchgeführt werden, in denen Hefezellen ausgesät wurden, die zuvor mit der Promotor-Reportergen-Konstrukt (z.B. ein DNA-Konstrukt aus Tabelle 1) transformiert wurden. Zusätzlich werden diese Zellen mit einem heterologen GPCR transformiert, für den ein Agonist bzw. Antagonist gefunden werden soll. Beispielsweise können humane GPCRs, z.B. Adenosin-Rezeptoren, Somatostatin- Rezeptoren, Dopamine-Rezeptoren, Bradykinin-Rezeptoren, Lysolipid-Rezeptoren, ß- Adrenerge-Rezeptoren, Muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren in diesen Verfahren verwendet werden.
Als ein Pheromon α induziertes Gen kann der Promotor von YNL279w auch zur Identifizierung von Aktivatoren und Inhibitoren der Pheromon-abhängigen MAPK Kaskade verwendet werden. Da der Promotor YNL279W sensitiver auf Stimulation nach Pheromon α Behandlung reagiert, als dieses beispielsweise für den FUS1- Promotor der Fall ist, bietet die hier vorgeschlagene Verwendung des YNL279w- Promotors Vorteile gegenüber anderen Screeningverfahren, die z.B. den FUS1 Promotor verwenden. Abbildung 4 zeigt, daß die Stimulation des YNL279w-
Promotor/Aeqourin-Konstruktes (p415YNL279-AEQ) deutlich besser reagiert, als dies für ein Promotorelement der Fall ist, das einem Bereich aus dem Promotor des FUS1- Gens (hier als 4PRE-AEQ bezeichnet) entspricht.
Abbildung 1a: Sequenz von YNL279w (Genbank AccNr.:Z71555, SEQ ID NO. 3). Das Startcodon ATG ist unterstrichen. Fett unterlegte Sequenzbereiche stellen Pheromone responsive elements (PRE) dar.
Abbildung 1 b: Promotorregion (5'-UTR) von YNL279w (SEQ ID NO. 4)
Abbildung 1c: Pheromone responsive elements (PRE) im Promotorbereich von YNL279w
Abbildung 2: Expressionsprofil des Saccharomyces cerevisiae ORFs YNL279w nach Induktion mit Pheromon α. Die beobachteten Änderungen der Genexpression beruhen auf Ergebnissen der Untersuchungen mit DNA-Mikrochips. Die Änderungen der Genexpression des Gens FUS1 sind zum Vergleich dargestellt.
Abbildung 3: Northern Blot Analyse des Expressionsprofils des Gens YNL279w nach Stimulation der Hefekulturen mit Pheromon α in der Hefemutante sstl . Abbildung 4: Induktion der Aequorin Expression (als relative Lichteinheiten) nach Stimulation der Hefezellen mit den angegebenen Konzentrationen Pheromon α (B). Die im Graphen angegebenen Werte stellen den Mittelwert für drei unabhängig durchgeführte Versuche dar, die dazugehörigen Einzelwerte sind in (A) dargestellt. Das Aequorin-Reportergen steht bei pYNL279-AEQ unter der Kontrolle des Promotors von YNL279w. Bei 4PRE-AEQ steht Aequorin unter Kontrolle eines Bereiches (-271 bis -1 vor Start) des Gens FUS1. Jeder Stimulationsversuch wurde dreifach durchgeführt.
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Promotor-Reportergen-Vektor- Konstruktes, bestehend aus dem Promotorbereich von YNL279w und dem Reportergen Aeqourin in dem Vektor p415 (einem Derivat von Vektor pRS415: ATCC 87520).
Beispiele
Beispiel 1 : Identifizierung des ORF YN279w
Zellenkulturen des Hefestammes Saccharomyces cerevisiae mit dem Genotyp (MAT a sst1::LEU2; ade2;can1-100; his3-11,15; Ieu2-3,112; trp1-1 ; ura3-1) wurden mit 1μM Pheromon α (gelöst in 90% Methanol) stimuliert, Kontrollzellen wurden nur mit 90% Methanol behandelt. 20min, 90min und 180min nach Stimulation wurden eine Menge von Zellen entnommen, die etwa 10 ODβoonm entspricht. Gesamt-RNA aus diesen Zellen wurde nach Standardmethoden (z.B. Sambrock et al. Molecular Chemistry Press, (Cold Spring Harbor Laboratory 1989) isoliert und mit je 30μg Gesamt-RNA wurde eine Erststrangsynthese durchgeführt. Das Protokoll für die Erst- und Zweitstrangsynthese, wie auch die Aufreinigungsschritte der generierten doppelsträngigen cDNA, die in-vitro Transcription und die Aufbereitung der cRNA für die Hybridisierung entspricht dem Protokoll der Firma Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA, USA). Über den Vergleich der Expressionsprofile mit Pheromon α induzierter und nicht- induzierter Hefezellen wurden der ORF YNL279w als einer der am stärksten induzierten ORFs identifiziert.
Zur Feststellung der Aktivität und Verwendbarkeit des Promotors in einem Screeningsystem mit einem geeigneten Reporter wurden der YNL279w Promotorbereich aus genomischer Saccharomyces cerevisiae-DNA amplifiziert.
Beispiel 2: Isolierung des YNL279w Promotors („Promotor")
Der Promotorbereich des Gens YNL279w wurde über die Primer YNL279F1
(SEQ ID NO. 1 ; δ'-CCGAGTCCTACTCCTATGCTGTTTACAAGG-S') und YNL279R (SEQ ID NO. 2; 5'-TGCTCTAGAATCATCAACGTTCACAAATTCG-3') amplifiziert. Die Identität des resultierenden Amplifikates wurde über Standardsequenzierungsmethoden festgestellt. Länge des über YNL279F1/YNL279R amplifizierten Promotorbereiches ohne
Restriktionsschnittstellen beträgt: 473 bp; dieses Fragment des Promotorbereichs wird im weiteren "Promotor" genannt.
Beispiel 3: Bestimmung der Funktionalität
Zur Feststellung der Funktionalität des vorgeschlagenen Screeningverfahrens wurde der amplifizierte Promotorbereich des Gens YNL279w vor das für Aequorin kodierende Gen in den Vektor p415 (siehe Abbildung 5; Derivat des Vektors pRS415, ATCC 87520) kloniert. Dieses Konstrukt wurde über die Li-Acetat-Methode (Ito et al., 1983) in den Saccharomyces cerevisiae Stamm (Mat a far1 ::hisG sst2::ura3FOA fus1 ::HIS3) transformiert.
Die Detektion von Aeqourin nach Stimulation der MAPK Kaskade mit Pheromone α in in den Saccharomyces cerevisiae Stamm (Mat a far1::hisG sst2::ura3FOA fus1 ::HIS3) erfolgte wie dargestellt: 1. 25μl Zellsuspension (1 ,5.106 Zellen per 25μl in selektivem Medium, SC/Glucose- Leucin) wurden in eine Vertiefung einer 96-Loch Platte gegeben 2. Auf die Zellen wurden 25μl eines 2X konzentrierten Stimulationsmixes gegeben, der Mating Faktor α in serieller Verdünnung (10"6 M to 10"8 M) und 1 μM Coelenterazin (0,5μM Endkonzentration) enthielt
3. 96-Lochplatte vorsichtig schütteln 4. 96-Loch Platte für 1 ,5 Stunden in feuchter Atmosphäre bei 30°C im Dunkeln inkubieren 5. Zugabe von 150μl Caicium/Lysepuffer zur Detektion; Aequorin emitiert Photonen direkt nach der Zugabe dieses Mixes, 15s Integration des entstehenden Signals; Detektion des Signals mittels eines Luminometers (Luminoskan, LABSYSTEM)
Mating faktor α Stocklösung: 100μM in 90% Methanol
Coelenterazin Stocklösung: 1 mM in 100% Methanol (MOLECULAR PROBES; ref C- 2944) .
CaCI2 Stocklösung: 1M in 1M Tris-HCI Lösung (vor Gebrauch 100 fach verdünnt in Lysepuffer)
Lysepuffer: Yeast Protein Extraction Reagent; PIERCE, ref 78990
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Claims

Patentansprüche:
1. Rekombinantes DNA Fragment enthaltend den Promotor des Saccharomyces cerevisiae Gens YNL 279 w, der wenn funktionell mit einem Strukturgen verbunden, dessen Transkription reguliert.
2. Rekombinantes DNA Fragment enthaltend einen Promotor mit der DNA- Sequenz
CCTTT
TATTCTCTAC ACCGAATTTG TCTTTACTCC TATGCTGTTT ACAAGGTCTA
TCTGATAAGC AATTGCGCAA GAAAATAGTA GAATGAAAAC TGATTATTAA
AAACAAACGT AAACTCAAGC CTCACTTGAT GCTCAGACGG AGTACGTGAA
AAACGTCCGT TATGCAAAAC CCTTTATATG CACAACCTTC ACACAATGCA
AATTTCCGAT GATGCCTACA TACAAAAGAG CGAAAGGCGA TATAAATTTT
TTTCACGGGA TTTTCGTTTA GGTGAAAATA AAATGAACGA CAGAGCATGC
AGAGTCCGGG TAATACATAT GTTTCAATAC TGTTTCAATA CTGTTTCAGA
AGTGCGTCAC ATATTAATTT TAACTTATAA CTGGCCTGTT GCTGGCAAGA
GGTATATATA TATGACGAAT GTGACCAACA TAAGTCCTTA AGATAATCCC
GAAATATTTG GTTAGGATGA TTCCCTTTCG AATTTGTGAA CGTTGATGAT (SEQ IDNO.4)
3. Rekombinantes DNA Fragment nach einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend den Promotor und ein Strukturgen, wobei der Promotor funktionell mit dem Strukturgen verbunden ist und dessen Expression reguliert.
4. Rekombinantes DNA Fragment nach Anspruch 3, wobei das Strukturgen für ein Reportergen kodiert.
5. Rekombinantes DNA Fragment nach Anspruch 4, wobei das Reportergen ausgewählt wird aus LacZ, Luciferase, Aequorin, GFP, DsRed, His 3, URA 3, TRP1 oder LEU2.
6. DNA-Vektor enthaltend ein rekombinantes DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Rekombinante S. cerevisiae Zelle enthaltend ein rekombinantes DNA- Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
8. Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wobei
a) eine rekombinante S. cerevisiae Zelle hergestellt wird, die ein oder mehrere Reportergene unter der Kontrolle des Promotors des YNL 279 w Gens enthält und die einen heterologen G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert; b) die Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert wird und c) die Veränderung der Transkription des Reportergens bestimmt wird.
9. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wobei
a) eine rekombinante S. cerevisiae Zelle hergestellt wird, die ein oder mehrere Reportergene unter der Kontrolle des Promotors des YNL 279 w Gens enthält und die einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimiert; b) die Zelle mit einer zu untersuchenden Substanz inkubiert wird und c) die Veränderung der Transkription des Reportergens bestimmt wird.
10. Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in S. cerevisiae, wobei das Strukturgen des heterologen Proteins funktionell mit dem Promotor des YNL 279w Gens verbunden und unter dessen Kontrolle exprimiert wird.
11. Verfahren zur Identifizierung von konstitutiv aktiven Mutanten von G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wobei
a) eine rekombinante S. cerevisiae Zelle hergestellt wird, die ein oder mehrere Reportergene unter der Kontrolle des Promotors des YNL279w Gens enthält b) und die einen mutierten heterologen G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert, wobei die Modifikation zu einem konstitutiv aktiven G-Protein gekoppelten Rezeptor führt, c) die Zelle mit einer aktivierenden oder inhibierenden Substanz inkubiert wird und d) die Veränderung der Transkription des Reportergens bestimmt wird.
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