JP2002534127A - 酵母におけるトランス−作用因子 - Google Patents

酵母におけるトランス−作用因子

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Abstract

(57)【要約】 酵母における転写の終結と関連するトランス−作用因子の同定に用いるための遺伝子スクリーニング法を提供する。また、かかる方法に用いるためのＤＮＡ構築物も提供する。本発明の方法により同定したトランス−作用因子は、抗菌介入用の新規な標的を提供し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、酵母における転写の終結をモジュレートするトランス−作用因子を
同定する方法、およびかかる方法に有用なＤＮＡ構築物に関する。 ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写終結は真核生物におけるタンパク質−コード遺
伝子の転写において重要な事象である。このプロセスには２の主要なシグナルが
関与する：上流ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルおよび下流エレメント（
ＤＳＥ）。
【０００２】 ポリ（Ａ）シグナルは転写終結において中心的な役割を果たすことが実証され
ているが、それによってそれがこのプロセスを調節する機構はまだ大部分が明ら
かでない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる遺伝子の転写は遺伝子の転写ユニット
の下流に進行し、伸長したプレ−ｍＲＮＡ転写物を生成する。ポリ（Ａ）シグナ
ルは、このプレ−ｍＲＮＡを切断およびポリアデニル化するトランス−作用因子
を活性化することが示されている。最近の事実は、ポリ（Ａ）シグナルがＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩを誘導して、切断反応の結果として転写を終結させ得ることを
示唆している（Birseら, (1998)28：298−301）。
【０００３】 転写が終結する領域に位置するＤＳＥは、転写終結の効率を上昇させるＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩポーズ（pausing）・シグナルとして作用する。ＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩをポーズさせるその能力は、そのＤＮＡ配列に内在性であり、それに
よって配列がＤＮＡ自体中か（Kerppolaら,（1990）Biochemistry 29: 269-278
）、またはｍＲＮＡ転写物中（Pribylら, (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 5369-53
77)かのいずれかに特定の構造特徴を誘導するか、あるいはＤＮＡにベンドを引
起こすトランス−作用因子の結合によって誘導し得る（Ashfieldら, (1994) EMB
O J. 13: 5656-5667; Ashfieldら, (1991) EMBO J. 10: 4197-4207）。このポー
ズ活性を考慮して、ＤＳＥはポーズ・エレメントとして記載されることもある。
【０００４】 効率的な転写終結は隣接遺伝子の発現に非常に重要である。このプロセスが損
なわれた場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは正常な終結部位を超えて転写を続け、
下流遺伝子に到達し得る。これは、下流遺伝子のプロモーターへの転写因子の結
合を阻害し、その結果その発現を部分的または完全に抑制する“転写干渉（tran
scription interference）”を生じ得る（Irnigerら（1991） Nucleic Acids Re
s. 20：4733−4739；Cullenら(1984) Nature 307: 241-245）。転写終結の損傷
は、真核生物染色体の伝達（Hillら(1987) Mol. Cell. Biol. 7: 2397-2405）お
よび減数分裂遺伝子変換（Roccoら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 120
68-12072）を阻害することも示されている。
【０００５】 酵母は、そのゲノムの非常に圧縮された性質のため、転写干渉に対して特に感
受性である（Oliverら（1992）Nature 357:38-46）。したがって、転写終結を調
節する因子およびそれがコードされている遺伝子の知識は、新たな抗菌化学物質
の開発に特に有用であろう。
【０００６】 したがって、本発明者らは、かかる因子の同定に用い得、酵母における転写終
結調節プロセスの解明に用い得る遺伝子構築物およびそれで形質転換した酵母を
開発した。詳細には、本発明は、酵母におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写終
結を調節するトランス−作用因子を同定する改善された方法を提供する。
【０００７】 本発明の特定の具体例は、転写終結事象における変化をシグナル伝達し得るよ
うに改変したサッカロミセスのＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７遺伝子クラスタ
ーおよびｕｒａ４遺伝子を利用する。
【０００８】 定義 “トランス−作用因子”なる語は、酵母においてポリメラーゼＩＩによって行
われる転写の終結の調節に関与するタンパク質をいう。 “ポリメラーゼＩＩ”なる語は、“ＰｏｌＩＩ”遺伝子といわれることもある
、タンパク質をコードする遺伝子を転写する酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩをいう
。 “レポーター遺伝子”なる語は、特異的な発現または非発現が早期に選択可能
な表現型を生成する酵母遺伝子をいう。
【０００９】 “シス−突然変異”または“シス−作用突然変異”なる語は、それが起こる遺
伝子の転写の終結をモジュレートする突然変異をいう。 “トランス−突然変異”または“トランス−作用突然変異”なる語は、それが
起こる遺伝子とは異なる遺伝子の転写の終結をモジュレートする突然変異をいう
。 “合成イントロン”なる語は、いずれかの公知の天然発生イントロンの配列に
対応しないが、それが遺伝子に挿入された場合には、転写物から除去され、した
がって該遺伝子からの機能性ｍＲＮＡの生成に通じるイントロンとしてふるまう
ヌクレオチドの配列をいう。
【００１０】 ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ７はエス・セレビシア（S．cerevisiae）
中でＧＡＬ遺伝子クラスターを形成し、ガラクトースからグルコース−６−リン
酸への代謝変換に寄与する。 サッカロミセス・セレビシアにおいては、ＧＡＬ１０ポリアデニル化シグナル
中の欠失が転写干渉を引起こし、ＧＡＬ７発現を劇的に低下させることが以前に
実証されている（Greger, I. H.およびProudfoot, N. J.(1998) EMBO J. 17: 47
71-4779）。ＧＡＬ７発現が廃止されている酵母細胞は、代謝中間体ガラクトー
ス−１−リン酸の毒性効果のため、ガラクトース含有培地上で生存できない（Do
uglas, H. C.ら (1964) Genetics 49: 837-844)。
【００１１】 本発明者らは、ＧＡＬ７遺伝子とＧＡＬ１０遺伝子との間の転写干渉の存在を
使用し、転写終結に関与するトランス−作用因子の単離を許容する方法を開発し
た。 かくして、第１の態様において本発明は、 （ａ）ＧＡＬ１０遺伝子の転写終結シグナル中の欠陥のために、ガラクトース
含有培地上で生育することができないサッカロミセス株を準備し、 （ｂ）所望により変異原を含有んでいていてもよい、ガラクトース含有培地上
で該株を培養してガラクトース含有培地上で生育することができる復帰突然変異
体を得、 （ｃ）シス−作用突然変異またはトランス−作用突然変異の存在について該復
帰突然変異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体からのゲノム・フ
ラグメントのプラスミド・ライブラリー、および／または、（ｉｉ）工程（ａ）
のサッカロミセス株からのゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリーを
調製し、 （ｅ）工程（ｄ）（ｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ａ
）で準備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ
）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトランス−
作用突然変異を含むサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、ついで （ｆ）ガラクトース上で生育する能力について工程（ｅ）の形質転換体をスク
リーニングすることからなり、 ここに、ガラクトース上で生育することができる工程（ｅ）（ｉ）からのいず
れの形質転換体は転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因
子をコードするＤＮＡの突然変異変異型を含み、一方ガラクトース上で生育する
ことができない工程（ｅ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母における転写の
終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコードするＤＮＡを
含むであろうことを特徴とする、酵母における転写の終結をモジュレートするこ
とができるトランス−作用因子を同定する方法を提供する。本発明のこの方法は
、本明細書中で以後ＧＡＬ法という。
【００１２】 ＧＡＬ法で用いるべきサッカロミセス株、好ましくはサッカロミセス・セレビ
シア（Saccharomyces cerevisiae）株は、ｇａｌ１０−／ｇａｌ７−株をＧＡＬ
７遺伝子および終結シグナル−欠失ＧＡＬ１０遺伝子を含むプラスミドで形質転
換することによって得ることができる。好ましくは、ＧＡＬ１０遺伝子の転写終
結は、ポリアデニル化シグナルの部分的または完全な欠失によって損なわれてい
る。酵母細胞における形質転換に好適ないずれかのプラスミドを利用して、該サ
ッカロミセス株を構築し得る。ＧＡＬ７−１０インサートは、当該技術分野でよ
く知られ、かつ、Sambrookら（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual
；Cold Spring Harbor Pressに記載されている標準的な技術を用いてプラスミド
に導入する。プラスミドは、当該技術分野で知られているいずれかの標準的な技
術を用いて酵母細胞に形質転換し得る。
【００１３】 ガラクトースの存在下で生育するその能力によって同定される復帰突然変異体
は、変異原、例えばエチジウム・ブロマイドを培養培地に入れることによって得
ることができる。この化学物質は好気的呼吸をもブロックし、したがってＧＡＬ
７＋とＧＡＬ７−酵母細胞の間の識別を容易にする。しかしながら、自然復帰突
然変異体は、いずれの変異原の不存在下でも得られることがある。
【００１４】 復帰突然変異株は、ＧＡＬ１０−７領域（シス−作用する）中の突然変異から
、またはＧＡＬ７（トランス−作用する）の転写干渉を間接的に妨害する遺伝子
中の突然変異の結果として生じ得る。当該技術分野で知られているいずれかの方
法を用いて、シス−またはトランス−突然変異の存在について復帰突然変異体を
スクリーニングし得る。例えば、工程（ａ）で用いた出発酵母株がＧＡＬ１０−
７インサートを含むプラスミドを含有する場合には、該プラスミドを復帰突然変
異体から単離し、ｇａｌ１０−／ｇａｌ７−株に形質転換し得る。ついで、ガラ
クトース含有培地上で生育する形質転換株の能力をアッセイすることができ、そ
の場合、ＧＡＬ７＋表現型はシス−突然変異を示し、一方ＧＡＬ７−表現型はト
ランス−突然変異を示す。
【００１５】 トランス−作用突然変異を含有する復帰突然変異体は、転写終結と関連するト
ランス−作用因子をコードし得る突然変異遺伝子または遺伝子群を同定するため
にさらに分析し得る。この目的につき使用し得る２の異なる手法を以下に記載す
る。第１の手法は復帰突然変異体が優性突然変異を運搬する場合に用いるのに特
に好適であり、第２の手法は復帰突然変異体が劣性突然変異を運搬する場合に用
いるのに特に好適である。
【００１６】 第１の手法においては、ゲノム・ライブラリー、最も好ましくはプラスミド−
ベースのゲノム・ライブラリーをトランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体
から調製し、これを前記した出発サッカロミセス株に戻し形質転換する。ついで
、形質転換サッカロミセス株の表現型を調べる。ＧＡＬ＋表現型を示すコロニー
は、転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコードす
るＤＮＡの突然変異変異型を含むプラスミドを含み、突然変異変異型は優性トラ
ンス−作用突然変異を運搬するであろう。
【００１７】 第２の手法においては、ゲノム・ライブラリー、最も好ましくはプラスミド−
ベースのゲノム・ライブラリーを前記した出発サッカロミセス株から調製し、ト
ランス−作用突然変異を運搬する復帰突然変異体に形質転換する。ついで、ガラ
クトース上で生育する形質転換体の能力を調べる。ＧＡＬ−表現型を示すコロニ
ーは、転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコード
するＤＮＡを含むプラスミドを含むであろう。この方法により、劣性トランス−
作用突然変異によって特徴付けられる復帰突然変異体からのトランス−作用因子
の同定が許容される。 両方の手法において、プラスミドは精製し、その中に含まれるゲノム・フラグ
メントを関連遺伝子を同定するために配列決定する。
【００１８】 トランス−作用突然変異を含む所定の復帰突然変異体中で突然変異した遺伝子
または遺伝子群を同定するために用いる適当な手法を選択するために、該復帰突
然変異体を最初に分析して、突然変異が優性か劣性かを決定し得る。例えば、復
帰突然変異体半数体株を前記した出発半数体サッカロミセス株と接合させること
によって二倍体株に突然変異を導入し、得られた二倍体株の表現型を調べること
ができる。ガラクトース上で生育することができる突然変異表現型を有する二倍
体は優性突然変異の存在を示し、一方ガラクトース上で生育することができない
野生型表現型を有する二倍体は劣性突然変異の存在を示す。
【００１９】 第２の態様において、本発明は、当該構築物を酵母細胞に形質転換した場合に
レポーター遺伝子の未熟終結転写の手段（means）が挿入される酵母レポーター
遺伝子を含むＤＮＡ構築物に関する。 １の具体例において、そのイントロン内にポリアデニル化シグナルが挿入され
た酵母レポーター遺伝子および該ポリアデニル化シグナルの下流に少なくとも１
の酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを含むＤＮＡ構築物を提供する。該
イントロンは、レポーター遺伝子中に自然発生するものとし得、あるいは、レポ
ーター遺伝子がいずれのイントロンも含まない場合には常に、組換え事象によっ
てレポーター遺伝子に人為的に挿入し得る。レポーター遺伝子への挿入に好適な
イントロンは、もう１の酵母遺伝子から単離するかまたは人為的に構築するかの
いずれかとし得る。例えば、好適な合成イントロンは、ＳｔｕＩ部位に挿入され
たポリアデニル化シグナルおよびＸｈｏＩ部位に挿入されたポリメラーゼＩＩポ
ーズ・エレメントを含む以外は図１に記載するヌクレオチドの配列を有するもの
である。
【００２０】 本発明のＤＮＡ構築物中で用い得るポリアデニル化シグナルは、例えば、以下
のプライマー：
【００２１】
【化８】
【００２２】 を用いてｕｒａ４ ＤＮＡを増幅させ、ついで増幅産物を制限酵素ＳｔｙＩおよ
びＲｓａＩで消化することによって得ることができる、ｕｒａ４ポリアデニル化
シグナルである。
【００２３】 好ましくは、酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントは、前進方向でポリア
デニル化シグナルの下流のイントロンに挿入する。好適な酵母ポリメラーゼＩＩ
ポーズ・エレメントは、酵母ｕｒａ４またはｎｍｔ２遺伝子由来のものとし得る
。かかるポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントは以下の配列を有する：
【００２４】
【化９】
【００２５】 しかしながら、いずれか他の好適なポリアデニル化シグナルおよび酵母ポリメ
ラーゼＩＩポーズ・エレメントを構築物に利用し得る。
【００２６】 好ましい具体例において、ＤＮＡ構築物は、（Humphreyら,（1994）EMBO J.13
：2331-2451に記載の）前記のイントロンが、例えばユニークＳｔｕＩ部位に導
入されているサッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）のｕｒａ４遺伝
子を酵母レポーター遺伝子として含む。ｕｒａ４遺伝子を含む好ましいＤＮＡ構
築物は、例えば、実施例１に記載するｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４またはｐＵＩｐＡ＋
ｎｍｔ２構築物である。
【００２７】 別の具体例において、その中に合成イントロンが挿入されている単一酵母レポ
ーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を提供し、該合成イントロンは完全レポーター
遺伝子の転写を妨害している際に効力がない酵母ポリアデニル化シグナルを含む
。
【００２８】 好ましくは、該合成イントロンは酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントの
挿入に好適な制限部位を該ポリアデニル化シグナルの下流に有する。好適な合成
イントロンは、例えば、ＳｔｕＩ部位に挿入されたポリアデニル化シグナルを含
む以外は図１に記載するヌクレオチドの配列を有するものである。好適な酵母ポ
リアデニル化シグナルは、前記したｕｒａ４ポリアデニル化シグナルである。後
記の実施例２に示すごとく、このポリアデニル化シグナルがイントロンに挿入さ
れた場合、その終結活性は最小限レベルまで低下し、ポリメラーゼＩＩポーズ・
エレメントがその下流に挿入されなければ転写の終結が起こらない。
【００２９】 好ましくは、該酵母レポーター遺伝子は、合成イントロンがその中に、例えば
ＳｔｕＩ部位に導入されているサッカロミセス・ポンベのｕｒａ４遺伝子である
。例えば、好ましいＤＮＡ構築物は実施例１に記載するｐＵＩｐＡ構築物である
。
【００３０】 本発明は、レポーター遺伝子の機能性ゲノム・コピーを欠く酵母細胞、好まし
くはエス・ポンベ細胞も提供し、それは該レポーター遺伝子を含む前記したＤＮ
Ａ構築物で形質転換されている。レポーター遺伝子がｕｒａ４である場合、ｕｒ
ａ４−サッカロミセス細胞、好ましくはｕｒａ４−サッカロミセス・ポンベ細胞
を利用する。
【００３１】 ｕｒａ４遺伝子は、ウラシルの生合成に必須である酵素オロチジン ５'−リ
ン酸デカルボキシラーゼをコードする。該酵素は、５−フルオロオロト酸（５−
ＦＯＡ）、その天然基質のアナログ、の存在下では５−フルオロウラシルの生成
に導き、それは酵母細胞に対して毒性である。したがって、発現または非発現ｕ
ｒａ４遺伝子は、必要な選択可能な表現型を提供する。詳細には、酵母細胞はガ
ラクトースの不存在下では生育することができるが、該酵素が正確に発現してい
る場合には５−ＦＯＡの存在下で死滅し、一方、それは細胞外ウラシルの不存在
下では死滅するが、該酵素の発現が阻害された場合には５−ＦＯＡの存在下で生
育し得る。
【００３２】 第４の態様において、本発明は、酵母における転写をモジュレートすることが
できるトランス−作用因子を同定する方法を提供し、該方法は： （ａ）その中にポリアデニル化シグナルおよび少なくとも１のポリメラーゼ・
ポーズ・エレメントを含有する合成イントロンが挿入されているｕｒａ４遺伝子
を含む前記ＤＮＡ構築物で形質転換したｕｒａ４−サッカロミセス株を準備し、 （ｂ）該株を、ウラシルを省略し、所望により変異原が存在していてもよい培
地上で培養し、ｕｒａ＋表現型への復帰突然変異体を同定し、 （ｃ）シス−作用またはトランス−作用突然変異の存在について該復帰突然変
異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体からのゲノム・フ
ラグメントのプラスミド・ライブラリー、および／または、（ｉｉ）工程（ａ）
のサッカロミセス株からのゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリーを
調製し、 （ｅ）（ｉ）工程（ｄ）（ｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工
程（ａ）で準備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）
（ｉｉ）のライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトランス−作用突
然変異を含有するサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、 （ｆ）ウラシルの不存在下または／およびウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下
で工程（ｅ）の形質転換体を培養することによって、ｕｒａ＋またはｕｒａ−表
現型の存在について工程（ｅ）の形質転換体をスクリーニングすることからなり
、 ここに、ｕｒａ４＋表現型を示す工程（ｅ）（ｉ）のいずれの復帰した形質転
換体は酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用
因子をコードするＤＮＡの突然変異変異型を含むプラスミドを含み、一方、ｕｒ
ａ４−表現型を示す工程（ｅ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母における転
写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコードする野生
型ＤＮＡを含むであろうことを特徴とする。
【００３３】 この方法は、本明細書中で以降ｕｒａ４法という。 ｕｒａ４法で使用するのに好ましいサッカロミセス株は、サッカロミセス・ポ
ンベである。好ましくは、ウラシルの不存在下で生育することができる復帰突然
変異体は、エチジウム・ブロマイドのごとき変異原を培地に入れることによって
得る。しかしながら、いずれの変異原の不存在下でも自然復帰突然変異体が得ら
れることもある。
【００３４】 種々の技術をｕｒａ４法に利用して、シス−またはトランス−突然変異の存在
について復帰突然変異体をスクリーニングし得る。例えば、レポーター遺伝子Ｄ
ＮＡ構築物を該復帰突然変異体から単離して、ｕｒａ４−サッカロミセス株に形
質転換し得る。ついで、ウラシル不存在下で生育する形質転換株の能力をアッセ
イし、ここにｕｒａ４＋表現型はシス−突然変異を示し、一方ｕｒａ４−表現型
はトランス−突然変異を示す。
【００３５】 再度、トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体は、転写終結と関連する
トランス−作用因子をコードし得る突然変異遺伝子または遺伝子群を同定するた
めに、さらに分析し得る。以下の手法をこの目的に用い得、手法の選択はトラン
ス−突然変異の優性または劣性の性質に依存する。
【００３６】 第１の手法において、ゲノム・ライブラリー、最も好ましくはプラスミド−ベ
ースのゲノム・ライブラリーを、トランス−突然変異を含む復帰突然変異体から
調製し、これを前記した出発サッカロミセス株に形質転換する。ついで、形質転
換したサッカロミセス株の表現型を調べる。ｕｒａ４＋表現型を示すコロニーは
、転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコードする
ＤＮＡの突然変異変異型を含むプラスミドを含むであろう。
【００３７】 第２の手法において、ゲノム・ライブラリー、再度最も好ましくはプラスミド
−ベースのゲノム・ライブラリーを、前記したサッカロミセス株から調製し、こ
れをトランス−突然変異を含むことが見出された復帰突然変異体に形質転換する
。ついで、ウラシルの不存在下で生育する形質転換体の能力を調べる。ｕｒａ− 表現型を示すコロニーは、転写の終結をモジュレートすることができるトランス
−作用因子をコードするＤＮＡを含むプラスミドを含むであろう。
【００３８】 両方の手法において、ついで対応する遺伝子または遺伝子群を同定するために
、プラスミドを精製し、その中に含まれるゲノム・フラグメントを配列決定する
。ＧＡＬ法と関連して前記したごとく、より適当な手法を選択し、つづいて劣性
または優性のいずれかの突然変異の存在についてトランス−作用突然変異を含む
復帰突然変異体を試験することができる。
【００３９】 ポリ（Ａ）シグナルのレベルで転写をモジュレートするトランス−作用因子を
同定するために、変形ｕｒａ４法を開発し得る。したがって、さらなる態様にお
いて、本発明は、酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトラ
ンス−作用因子を同定する方法を提供し、該方法は： （ａ）その中に完全レポーター遺伝子の転写を妨害している際に効力のないポ
リアデニル化シグナルを含む合成イントロンが挿入されているｕｒａ４遺伝子を
含む前記したＤＮＡ構築物で形質転換したｕｒａ４−サッカロミセス株を準備し
、該サッカロミセス株は野生型表現型を示し、 （ｂ）ウラシルおよび５−ＦＯＡを含有し、所望により変異原が存在していて
もよい培地上で該株を培養し、ｕｒａ４−表現型への復帰突然変異体を同定し、 （ｃ）シス−作用またはトランス−作用突然変異の存在について該復帰突然変
異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体からゲノム・フラ
グメントのプラスミド・ライブラリー、および／または、（ｉｉ）工程（ａ）の
サッカロミセス株からゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリーを調製
し、 （ｅ）工程（ｄ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ａ）で準
備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ）のプ
ラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトランス−作用突
然変異を含むサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、 ｆ）それらをウラシルの不存在下、または／および、ウラシルおよび５−ＦＯ
Ａの存在下で培養することによってｕｒａ−またはｕｒａ＋表現型の存在につい
て工程（ｅ）の形質転換体をスクリーニングすることからなり、 ここに、ｕｒａ４−表現型を示す工程（ｅ）（ｉ）のいずれの復帰した形質転
換体は酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用
因子をコードするＤＮＡの突然変異変異型を含むプラスミドを含み、一方ｕｒａ
４−表現型を示す工程（ｅ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母における転写
の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコードするＤＮＡ
を含むであろうことを特徴とする。この方法は、本明細書中で以降変形ｕｒａ４
法という。
【００４０】 変形ｕｒａ４法で用いるのに好ましいサッカロミセス株はサッカロミセス・ポ
ンベである。好ましくは、エチジウム・ブロマイドのごとき変異原を培地に入れ
ることによって復帰突然変異体を得る。しかしながら、いずれの変異原の不存在
下でも自然復帰突然変異体が得られることもある。
【００４１】 異なる技術を用いて、シス−作用またはトランス−作用突然変異の存在につい
て復帰突然変異体をスクリーニングし得る。例えば、復帰突然変異体からＤＮＡ
構築物を単離し、前記した形質転換ｕｒａ４−サッカロミセス株に形質転換し得
る。ついで、ウラシルおよび５−ＦＯＡを含有する培地上で生育する形質転換株
の能力をアッセイし得、ここにｕｒａ４−表現型はシス−作用突然変異を示し、
一方ｕｒａ４＋表現型はトランス−作用突然変異を示す。
【００４２】 再度、転写終結と関連するトランス−作用因子をコードし得る突然変異遺伝子
または遺伝子群を同定するために、トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異
体をさらに分析し得る。以下の手法をこの目的に用い得、手法の選択はトランス
−突然変異の優性または劣性の性質に依存する。
【００４３】 第１の手法において、ゲノム・ライブラリー、最も好ましくはプラスミド−ベ
ースのゲノム・ライブラリーをトランス−作用突然変異を含む復帰突然変異から
調製し、これを前記した野生型表現型を示すサッカロミセス株に形質転換する。
ついで、形質転換サッカロミセス株の表現型をアッセイし、ここにｕｒａ４−表
現型を示すコロニーは酵母における転写の終結をモジュレートすることができる
トランス−作用因子をコードするＤＮＡの突然変異変異型を含むプラスミドを含
み、該突然変異変異型は優性の突然変異を運搬しているであろう。
【００４４】 第２の手法において、ゲノム・ライブラリー、再度最も好ましくはプラスミド
−ベースのゲノム・ライブラリーを前記したサッカロミセス株から調製し、トラ
ンス−作用突然変異を含むことが見出された復帰突然変異体に形質転換する。つ
いで、形質転換体の表現型を調べる。ｕｒａ４−表現型を示すコロニーは、酵母
における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコー
ドするＤＮＡを含むプラスミドを含むであろう。 両方の手法において、ついで対応する遺伝子または遺伝子群を同定するために
、プラスミドを精製し、その中に含まれるゲノム・フラグメントを配列決定する
。
【００４５】 その特異的な発現または非−発現が早期の選択可能な表現型を生成するいずれ
か他の遺伝子を酵母レポーター遺伝子として含む構築物を利用する、ｕｒａ４法
に類似する方法または変形ｕｒａ４法を開発し得る。 Ｇａｌ、ｕｒａ４および変形ｕｒａ４法は、酵母における転写の終結をモジュ
レートすることができるトランス−作用因子をより高い信頼性で同定するために
、組合せて用いることもできる。
【００４６】 したがって、さらなる態様において、本発明は酵母における転写の終結をモジ
ュレートすることができるトランス−作用因子を同定する方法を提供し、該方法
は： （ａ）ＧＡＬ法を行い、 （ｂ）ｕｒａ４法の工程（ａ）で準備したｕｒａ４−サッカロミセス株を工程
（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードする核酸を含むプラスミドで形質
転換し、ついで （ｃ）それらをウラシルの不存在下で培養することによって、ｕｒａ４＋表現
型への復帰について、工程（ｂ）の形質転換体をスクリーニングすることからな
る。
【００４７】 さらなる態様において、本発明は、酵母における転写の終結をモジュレートす
ることができるトランス−作用因子を同定する方法を提供し、該方法は： （ａ）ＧＡＬ法を行い、 （ｂ）変形ｕｒａ４法の工程（ａ）で準備したｕｒａ４−サッカロミセス株を
工程（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードする核酸を含むプラスミドで
形質転換し、ついで （ｃ）それらをウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下で培養することによってｕ
ｒａ４−表現型への復帰について、工程（ｂ）の形質転換体をスクリーニングす
ることからなる。
【００４８】 なおさらなる態様において、本発明は、酵母における転写の終結をモジュレー
トすることができるトランス−作用因子を同定する方法を提供し、該方法は： （ａ）変形ｕｒａ４法を行い、 （ｂ）ＧＡＬ１０遺伝子の転写終結シグナル中に欠陥を有するサッカロミセス
株を工程（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードする核酸を含むプラスミ
ドで形質転換し、ついで （ｃ）それらをガラクトースの存在下で培養することによって、野生型表現型
への復帰について該形質転換体をスクリーニングすることからなる。
【００４９】 さらなる態様において、本発明は、前記した方法のいずれかによって同定した
転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子を提供する。前
記した方法のいずれかで転写の終結をモジュレートすることに関与しているとの
トランス−作用因子の同定は、該因子が酵母−特異的であって、したがって抗菌
介入に関する潜在的な標的であることを示す。
【００５０】 また、前記したトランス−作用因子をコードする遺伝子および核酸も、本発明
によって提供される。本明細書中にて例示するごとく、“ライブラリー形質転換
”アプローチを用いて、ＧＡＬ法、ｕｒａ４法または変形ｕｒａ４法を用いて同
定されたトランス−復帰突然変異体中で突然変異した遺伝子または遺伝子群を同
定することの主たる利点は、それが対応する遺伝子または遺伝子群を含む酵母ゲ
ノムＤＮＡのフラグメントの単離に直接通じることである。
【００５１】 本発明のＵｒａ４スクリーニング法を用いて本発明者らが同定した１の特定の
トランス−作用因子は、よく知られている切断／ポリアデニル化因子ＣｓｔＦ６
４のサッカロミセス・ポンベ同族体である（図３を参照されたし）。ＣｓｔＦ６
４は、ＳＰＢＣ３Ｂ９.１１ｃと呼ばれるエス・ポンベ遺伝子のタンパク質産物
である。該タンパク質配列はGenbamk受入番号2950466、SPTREMBL：043040下で入
手可能である。実施例４で論じるごとく、広範囲の真核生物種で保存されている
ＣｓｔＦ６４のＣ−末端領域は、転写終結において重要な役割を有するようであ
る。エス・ポンベＣｓｔＦ６４同族体のＣ−末端ドメインの機能を調べるために
、本発明者らはタンパク質のこの領域を用いて慣用的な酵母ツーハイブリッド実
験を行い、それによってこのドメインと相互作用する多くのタンパク質を同定し
た。
【００５２】 エス・ポンベＣｓｔＦ６４タンパク質のＣ−末端ドメインとタンパク質のこの
ドメインと直接的に相互作用することが示されている他のタンパク質との間の相
互作用は、転写終結のプロセスにおいて重要であると仮定する。その結果、かか
る相互作用を妨害し、破壊しまたは向上させ、それによって酵母における転写の
終結をモジュレートする化学化合物は、潜在的な抗菌活性を有し得る。
【００５３】 かくして、さらなる態様において、本発明は、サッカロミセス・ポンベのＣｓ
ｔＦ６４タンパク質が、該ＣｓｔＦ６４タンパク質のＣ−末端ドメインに結合す
ると以前に同定された相互作用タンパク質へ結合することを阻害、向上または破
壊することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は： ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節され
るプロモーターに作動可能に結合したレポーター遺伝子または逆選択マーカー遺
伝子を含むＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を準備し； 該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかにイン−フ
レームで融合したＣｓｔＦ６４タンパク質またはそのＣ−末端フラグメントを含
む第１のハイブリッドタンパク質をコードする第１のハイブリッドＤＮＡ配列を
該宿主細胞中で発現させ； 該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかにイン−フ
レームで融合した相互作用タンパク質またはそのフラグメントを含む第２のハイ
ブリッドタンパク質をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を、第１の融合
タンパク質が該転写因子の活性化ドメインを含む場合には第２の融合タンパク質
が該転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含み、第１の融合タンパク質が転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインを含む場合には第２の融合タンパク質が活性化ドメインを含
むように、宿主細胞中で発現させ； 該宿主細胞と化合物の試料とを試験下にて接触させ；ついで 該宿主細胞におけるいずれかのレポーター遺伝子産物の生成を検出するか、あ
るいは、逆選択マーカー遺伝子の発現の欠失に正の選抜を適用するかのいずれか
によって、相互作用タンパク質またはそのフラグメントへのＣｓｔＦ６４タンパ
ク質またはそのＣ−末端フラグメントのいずれかの結合を検出することからなる
。
【００５４】 本発明の方法は、ＣｓｔＦ６４タンパク質または保存されたＣ−末端ドメイン
を含むそのフラグメント（図３を参照されたし）、およびＣｓｔＦ６４のＣ−末
端ドメインと相互作用すると以前に同定されたいずれのタンパク質またはポリペ
プチド（本明細書中で以降“相互作用タンパク質”または“相互作用ポリペプチ
ド”という）、またはＣｓｔＦ６４との相互作用に必要な領域を含むそのフラグ
メントを用いて行うことができる。最も好ましくは、該相互作用タンパク質は表
１に掲載するエス・ポンベ遺伝子のうちの１のタンパク質産物であろう（下記を
参照されたし）。これらのタンパク質は、酵母ツーハイブリッド分析を用いてＣ
ｓｔＦ６４のＣ−末端ドメインと相互作用することが同定された。表１に掲載す
る各遺伝子のヌクレオチド配列、および対応するタンパク質産物のアミノ酸配列
は、すべて公共的にアクセス可能な配列データベース中に寄託されている。受入
番号のリストを後記に提供する。
【００５５】 本発明のスクリーニング法はそれ自体が酵母−ツーハイブリッド法に基づく。
古典的な酵母ツーハイブリッド系（Chienら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88
, 9578-9582, 1991）は、単純な直接的な方法で特定の相互作用の解離に寄与す
る事象の選択を許容しない。したがって、タンパク質−タンパク質相互作用の特
徴付けおよび操作におけるその使用は制限される。それにもかかわらず、古典的
な酵母ツーハイブリッド系を用いて、２のタンパク質間の相互作用を阻害または
向上させる化合物についてスクリーニングし得る。典型的なスクリーニングは、
ｇａｌ４プロモーターの制御下のｌａｃＺレポーター遺伝子の使用に基づき得、
スクリーニングの情報の概要は適当な蛍光またはルミネセンス基質を用いて簡単
に測定することができるβ−ガラクトシダーゼ活性である。
【００５６】 解離事象についてのスクリーニングに用いるのにより好適である他のツーハイ
ブリッド系を開発した。これらの系は、一般的に逆ハイブリッド・スクリーンと
呼ばれ、相互作用ハイブリッドタンパク質の発現が特定の条件下で毒性である逆
選択マーカーの発現を増大させる酵母株を使用する。これらの条件下では、相互
作用の解離が選択的な利点を提供し、それによって検出が促進される：ハイブリ
ッドが相互作用できなかった幾つかの生育酵母コロニーを、相互作用タンパク質
を発現する数百万の非−生育コロニーの中で同定することができる。
【００５７】 当該技術分野で知られている幾つかの逆ハイブリッド系を用いて、本発明のこ
の態様によるスクリーニングを行い得る。第１の逆ツーハイブリッド系は酵母株
を利用し、これは突然変異ＣＹＨ２遺伝子の存在に起因してシクロへキシミドに
耐性である。この株は、ＧＡＬ１プロモーターの転写制御下の野生型ＣＹＨ２対
立遺伝子も含む。野生型ＧＡＬ４タンパク質の発現は、シクロヘキシミドに対す
る生育感受性を回復するのに十分である。シクロヘキシミドに対する生育感受性
は、ＧＡＬ４融合タンパク質と同様に、鳥類ｃ−Ｒｅｌタンパク質およびそのＩ
κＢ−αカウンターパート、ｐ４０の同時発現によっても回復する。シクロヘキ
シミドに対する生育感受性の回復は、ＧＡＬ１プロモーターにおけるｃ−ＲＥＬ
およびｐ４０の会合を必要とし、ＧＡＬ１プロモーターからの発現を活性化する
ｃ−ＲＥＬ／ｐ４０相互作用の能力と相関する（LeannaおよびHannink，1996, N
AR 24：3341−3347）。
【００５８】 もう１の逆ハイブリッド系は酵母遺伝学において最も広範に用いられている逆
選択マーカー、ＵＲＡ３を使用し、これはウラシルの生合成に必要な酵素、オロ
チジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼをコードする。プラスミド上のまたは
ゲノムに組込まれた野生型ＵＲＡ３を含む酵母細胞は、ウラシルを欠く培地上で
生育する（ＵＲＡ３＋表現型）。しかしながら、ｕｒａ３がコードするデカルボ
キシラーゼは、非−毒性アナログ、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）から毒性産
物、５'−フルオロウラシルの変換も触媒し得る（Boekeら, 1984, Mol. Gen. Ge
net. 197: 345-346）。したがって、相互作用を妨害し得る突然変異は、大きな
ライブラリーまたはランダムな対立遺伝子から選択し得る。同様にして、相互作
用を解離または妨害する分子は、ペプチドまたは化合物の大きなライブラリーか
ら選択し得る（Vidalら，1996，PNAS 93：10315−10320；Vidalら，1996，PNAS
93：10321−10326）。
【００５９】 第３の逆酵母ツーハイブリッドは、リレイ遺伝子（relay gene）としてのＧＡ
Ｌ８０遺伝子に基づく。ＧＡＬ８０は、ＧＡＬ４のごとき転写アクチベーターの
活性化ドメインに結合し、それをマスクするタンパク質をコードする。転写情報
の概要を提供するであろうレポーター遺伝子（ＨＩＳ３またはＬＡＣＺ）は、発
現について機能性ＧＡＬ４に依存する。ＧＡＬ８０マスキング・タンパク質のレ
ベルがツーハイブリッド相互作用で妨害されることによって低下する場合にのみ
、転写アクチベーターとしてＧａｌ４が機能し、ツーハイブリッド・タンパク質
−タンパク質相互作用を阻害する分子に関する正の転写情報の概要を提供する。
この逆ツーハイブリッド系の重要な特徴は、リレイタンパク質、ＧＡＬ８０の基
底レベルおよび半減期を微調整して、最大感度を提供し得ることである（Powers
およびErickson，1996, WO 95／26400）。
【００６０】 （前記し、変形ｕｒａ４法で用いた）完全レポーター遺伝子の転写を妨害して
いる際には効力がないポリアデニル化シグナルを含む合成イントロンがその中に
挿入されているｕｒａ４遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有利に用いて、他の真核生
物遺伝子からポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを同定し得る。
【００６１】 したがって、もう１の態様において、本発明は、真核生物遺伝子からポリメラ
ーゼＩＩポーズ・エレメントを同定する方法を提供し、該方法は： （ａ）真核生物遺伝子からの推定ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを含む
ＤＮＡフラグメントを、完全ｕｒａ４遺伝子の転写が妨害されている際には効力
がないポリアデニル化シグナルがそのイントロン内に挿入されているｕｒａ４遺
伝子を含むＤＮＡ構築物に挿入し、ここに該ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメン
トは該ポリアデニル化シグナルの下流に挿入され、 （ｂ）サッカロミセスのｕｒａ４−株を工程（ａ）で調製したＤＮＡ構築物を
含むプラスミドで形質転換し、ここに該株は完全ｕｒａ４遺伝子の転写が妨害さ
れている際には効力がないポリアデニル化シグナルがそのイントロン内に挿入さ
れているｕｒａ４遺伝子を含むＤＮＡ構築物を取込んでいるプラスミドで形質転
換されており、 （ｃ）ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下の培地上で培養することによってｕ
ｒａ４−表現型への復帰についてスクリーニングすることからなり、 ここに、ｕｒａ４−表現型への復帰は、該挿入フラグメントがポリメラーゼＩ
Ｉポーズ活性を有することを示すことを特徴とする。
【００６２】 推定ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントは、ポリアデニル化シグナルの下流
のイントロンに導入される。好ましくは、ｕｒａ４遺伝子に挿入されるイントロ
ンは、ＳｔｕＩ部位に挿入された前記したｕｒａ４ポリアデニル化シグナルを含
む以外は図１に記載するヌクレオチドの配列を有する合成イントロンである。つ
いで、本発明の方法で試験すべき推定ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを、
ＸｈｏＩ部位に挿入する。該方法において使用するのに好適なＤＮＡ構築物は、
例えば、実施例１に記載するｐＵＩｐＡ構築物である。
【００６３】 さらなる態様において、本発明は、前記した方法を用いてエス・ポンベのｎｍ
ｔ２遺伝子の３'領域中に本発明者らが同定した新規な酵母ポリメラーゼＩＩポ
ーズ・エレメントを提供する。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列：
【００６４】
【化１０】
【００６５】 またはその相補体を有するエス・ポンベのｎｍｔ２遺伝子の酵母ポリメラーゼＩ
Ｉポーズ・エレメントを提供する。
【００６６】 さらに、本発明は、ヌクレオチド配列：
【００６７】
【化１１】
【００６８】 またはその相補体を有するエス・ポンベのｕｒａ４遺伝子からの酵母ポリメラー
ゼ・ポーズ・エレメントを提供する。
【００６９】 また、本発明によって提供するのは、前記で同定したｎｍｔ２およびｕｒａ４
ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを含むＤＮＡ分子である。本発明のＤＮＡ
分子は、好ましくは二本鎖であろう。ＤＮＡ分子がｕｒａ４ポーズ・エレメント
を含む場合には、これらの分子は、好ましくは、その中に同定された１８ｂｐの
ｕｒａ４ポーズ・エレメント配列と隣接するｕｒａ４ ＤＳＥ（Birseら, EMBO
J., 16: 3633-3643 (1997)）からのいずれのさらなるヌクレオチド配列も含まな
いことは理解される。Birseらは、転写ポーズ・エレメントとして機能する４９
ｂｐのｕｒａ４ ＤＳＥフラグメントを同定した。ここに本発明者らは、機能性
ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントであるＤＳＥのコアの１８ｂｐフラグメン
ト
【００７０】
【化１２】
【００７１】 を同定した。このフラグメントの全体が、完全ポーズ活性を達成するために必要
である。
【００７２】 本発明は、添付する図面と共に以下の実施例に参照すればより良好に理解され
るであろう：
【００７３】 本発明に従って用い得る標準的な酵母の遺伝学的および分子生物学的な技術は
： Methods in Yeast Genetics. A Laboratory Course Manual. (1997) Cold Spr
ing Harbor Press, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Methods in Enzymology,
Vol. 194. (1991) Academic Press, Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach. (1993) IRL Press a
t OUPに記載されている。
【００７４】 実施例１：レポーター遺伝子ＤＮＡ構築物の調製 以下の相補的オリゴヌクレオチド：
【００７５】
【化１３】
【００７６】 をアニーリングさせることによって、図１に示す合成イントロンを得た。 ついで、このイントロンをｐＵＲＡ４（Humphreyら （1994） EMBO J．13：23
31−2451に記載されている）のユニークＳｔｕＩ部位に導入し、ｐＵＩを生成す
る。 最小限のｕｒａ４ポリアデニル化シグナルは、以下のプライマー：
【００７７】
【化１４】
【００７８】 を用いてｕｒａ４ ＤＮＡを増幅させることによって得た。
【００７９】 増幅産物を制限酵素ＳｔｙＩおよびＲｓａＩで消化し、１３４ｂｐの平滑末端
化したＳｔｙＩ−ＲｓａＩフラグメントをｐＵＩのイントロン性配列内のＳｔｕ
Ｉ部位にクローン化してｐＵＩｐＡを生成した。
【００８０】 ｕｒａ４およびｎｍｔ２酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントは、以下の
相補的オリゴヌクレオチド・ペア：
【００８１】
【化１５】
【００８２】 をアニーリングさせることによって得た。
【００８３】 ついで、ｐＵＩｐＡをＸｈｏＩで消化し、平滑末端化し、ｕｒａ４またはｎｍ
ｔ２酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントを導入して、各々、ｐＵＩｐＡ＋
ｕｒａ４またはｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２を生成した。全ての構築物はＤＮＡ配列決
定によって確認した。
【００８４】 実施例２：ｐＵＩｐＡ、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４およびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２にお
ける転写終結の分析 方法： 形質転換プラスミドと一緒に２０μｇの煮沸サケ精子担体ＤＮＡを添加する以
外は、Hillら（1991） Nucleic Acids Res. 19：5791に記載されているＤＭＳＯ
−増強法（DMSO−enhanced method）に従って、ｐＵＩ、ｐＵＩｐＡ、ｐＵＩｐ
Ａ＋＋ｕｒａ４およびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２をｕｒａ４−エス・ポンベ細胞に形
質転換した。形質転換体を、ウラシルを含有しない培地上で生育するその能力に
ついて試験した。Kohrerら（1991）Methods Enzymol. 194：398−405に記載され
ている方法に従って全ＲＮＡを抽出した。Humphreyら（1994） EMBO J. 13：23
31−2451に記載されているごとく、ノザン・ブロット分析を行った。一般に、Ｒ
ＮＡを１.５％ホルムアルデヒド・ゲル中で分離し、ナイロン膜上にブロットし
、１.２ｋｂのＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＶランダム・プライマー標識プローブと
ハイブリダイズさせた。対照として、同じ実験手法を、ｐＵＲＡ４プラスミド（
ポジティブ・コントロール）、および逆向きでｐＵＩｐＡ中への前記したｕｒａ
４またはｎｍｔ２ポリメラーゼ・ポーズ・エレメントの挿入に由来する、ｐＵＩ
ｐＡ＋ｕｒａ４ＲおよびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２Ｒプラスミド（ネガティブ・コン
トロール）につづいて利用した。
【００８５】 結果： 終結シグナルの効力に依存して、ｐＵＩｐＡ、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４およびｐ
ＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２プラスミドから３の異なるｕｒａ４転写物を生成し得る。終
結シグナルが転写機構によって認識される場合には、短い切頭転写物（Ｔ）が生
成されるであろう。さもなければ、非スプライシングｍＲＮＡ（ＵＳ）が形成さ
れるであろう。ついで、これはプロセシングされて、野生型ｕｒａ４ ｍＲＮＡ
（ＷＴ）を得ることができる。
【００８６】 図２は、ｐＵＩｐＡの場合のごとく、ポリアデニル化シグナルが単独で存在す
る場合、大部分の転写物は正確にスプライシングされ、野生型ｕｒａ４のｍＲＮ
Ａが生成することを示す。ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４およびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２の
場合のごとく、前進向きで酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントが付加され
ると、有効な転写終結および切頭ｍＲＮＡのみの生成に通じる。
【００８７】 これらの結果は、挿入したｕｒａ４ポリアデニル化シグナルがイントロン性環
境中では最小限の終結活性を有し、ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントがその
下流に挿入されなければ、転写の終結を指示することができないことを示してい
る。これらの結果は、図２に示すごとく、形質転換体の表現型の分析によって確
認される。
【００８８】 実施例３：ＧＡＬ法を用いた転写終結をモジュレートするトランス−作用因子の
検出 実験手法： ＹＣｐｌａｃ２２のＢａｍＨＩ部位にＧＡＬ１０−７フラグメントを挿入する
ことによって構築したｐＹＣ１０−７プラスミドを、ｇａｌ１０−／ｇａｌ７− エス・セレビシア欠失株に形質転換した。プラスミドおよび欠失株は両方ともGr
egerら（1998）EMBO J. 17：4771−4779に以前に記載されている。 形質転換体をガラクトースおよびエチジウム・ブロマイドの存在下、寒天培地
上で生育させた。ガラクトース上で生育することができる復帰突然変異体のコロ
ニーを同定した。ついで、復帰突然変異体をスクリーニングして、それらからｐ
ＹＣ１０−７プラスミドを単離し、それをｇａｌ１０−／ｇａｌ７−エス・セレ
ビシア株に形質転換し、形質転換細胞をガラクトースの存在下で培養することに
よって、それらがトランス−またはシス−突然変異を運搬しているかを確かめた
。ガラクトース上で生育する形質転換細胞の能力はシス−作用突然変異の存在を
示すと考え、一方ガラクトース上で生育することの能力のなさはトランス−作用
突然変異の存在を示すと考えた。
【００８９】 ついで、トランス−作用突然変異を運搬している復帰突然変異体を解析して、
突然変異が優性または劣性であるかを決定した。復帰突然変異体半数株をｐＹＣ
１０−７−形質転換ｇａｌ１０−／ｇａｌ７−エス・セレビシア株と接合させる
ことによって突然変異を二倍体株に導入し、形質転換体をガラクトース中で培養
した。ガラクトース上で生育する形質転換細胞の能力は、優性突然変異の存在を
示すと考え、一方ガラクトース上で生育する能力のなさは劣性突然変異の存在を
示すと考えた。
【００９０】 プラスミド・ゲノム・ライブラリーを、優性トランス−作用突然変異を運搬し
ている復帰突然変異体から調製し、ｐＹＣ１０−７−形質転換ｇａｌ１０−／ｇ
ａｌ７−エス・セレビシア細胞に形質転換した。ガラクトース上で生育すること
ができる細胞を選抜し、これらの細胞から推定トランス−作用因子をコードする
ＤＮＡフラグメントを精製し、配列決定した。同定した配列を用いてデータベー
ス検索を行った。
【００９１】 全ての上記工程は以下の文献に記載されているプロトコールに従って行った： Methods in Yeast Genetics. A Laboratory Course Manual. (1997) Cold Sp
ring Harbor Press, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Methods in Enzymology,
Vol. 194 (1991) Academic Press,または Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach. (1993) IRL Press a
t OUP.
【００９２】 結果：シス−およびトランス−作用突然変異の両方を含む多数の復帰突然変異体
株をＧＡＬスクリーンを用いて単離した。特に興味深いのは、顕著なレベルのｇ
ａｌ７ｐ（タンパク質）を発現しているが、なお検出可能なレベルのＧＡＬ７
ｍＲＮＡを生成することができないトランス突然変異体の群である。これらのト
ランス突然変異体は、内部ＧＡＬ７シストロンに対して翻訳開始を許容する翻訳
開始または終結と関連する遺伝子の突然変異から生じ得るようである。かかる突
然変異遺伝子は、これらの非常に圧縮された真核生物ゲノム中ではポリシストロ
ンｍＲＮＡ上の内部翻訳開始はより一般的な現象であることが証明され得るため
、酵母遺伝子発現にユニークな機能を同定し得る。これらの遺伝子の生成物は、
抗菌介入の潜在的な標的となり得る。
【００９３】 実施例４：ＵＲＡ４法を用いた転写終結をモジュレートするトランス−作用因子
の検出 実験手法： 実施例２に前記したごとく、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４プラスミドで形質転換した
サッカロミセス・ポンベ細胞を、エチジウム・ブロマイドを含有し、ウラシル不
存在下の寒天平板上で培養した。ウラシル上で生育することができる復帰突然変
異体のコロニーを同定した。
【００９４】 ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４プラスミドを単離し、それをｕｒａ４−エス・ポンベ細
胞に形質転換し、形質転換細胞をウラシルの不存在下で培養することにより、復
帰突然変異体をスクリーニングして、それがトランス−またはシス−突然変異を
運搬するかを確かめた。ウラシルの不存在下で生育する形質転換細胞の能力はシ
ス−突然変異の存在を示すと考え、一方ウラシルの不存在下で生育することがで
きる能力のなさはトランス−突然変異の存在を示すと考えた。 ついで、トランス−突然変異を運搬している復帰突然変異体を分析して、突然
変異が優性または劣性であるかを決定した。復帰突然変異体半数体株をｐＵＩｐ
Ａ＋ｕｒａ４−形質転換ｕｒａ４−エス・ポンベ株と接合させることによって突
然変異を二倍体株に導入し、形質転換体をウラシルの不存在下で培養した。ウラ
シルの不存在下で生育する形質転換細胞の能力は優性突然変異の存在を示すと考
え、一方ウラシルの不存在下で生育する能力のなさは劣性突然変異の存在を示す
と考えた。
【００９５】 プラスミド・ゲノム・ライブラリーを優性トランス−突然変異を運搬している
復帰突然変異体から調製し、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４−形質転換ｕｒａ４−エス・
ポンベ細胞に形質転換した。ウラシルの不存在下で生育することができる細胞を
選抜し、推定トランス−作用因子をコードするＤＮＡフラグメントをこれらの細
胞から精製して、配列決定した。データベース検索を、同定した配列を用いて行
った。
【００９６】 全ての上記工程は以下の文献に記載されているプロトコールに従って行った： Methods in Yeast Genetics. A Laboratory Course Manual. (1997) Cold Sp
ring Harbor Press, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Methods in Enzymology,
Vol. 194 (1991) Academic Press,または Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach. (1993) IRL Press a
t OUP.
【００９７】 結果： 前記したｕｒａ４スクリーンを用いて、ｕｒａ＋表現型に復帰した数百の突然
変異体株を同定した。これらは、終結シグナルを欠失している、ｕｒａ４遺伝子
を直接的に変調するシス突然変異、および、それがｕｒａ４遺伝子内の終結シグ
ナルをもはや認識しないようにトランス−作用因子を変化させるトランス突然変
異に分けた。顕著な数の異なるトランス突然変異体株が得られたという事実はこ
のスクリーンの有効性を実証しており、この遺伝子アプローチが転写終結と関連
する顕著な数の因子を得るであろうことを示している。
【００９８】 これらのトランス作用因子のうちの１の遺伝子を、ｍ７０と呼ぶ劣性突然変異
体エス・ポンベ株からクローン化した。これは、ｍ７０を野生型エス・ポンベ遺
伝子ライブラリーで形質転換し、（選抜として５−ＦＯＡに対する耐性を用いて
）ｕｒａ＋からｕｒａ−に復帰したｍ７０コロニーについて選抜することによっ
て行った。図３は、ＣｓｔＦ６４と呼ばれるよく知られている切断／ポリアデニ
ル化因子のものと同様のこの突然変異体遺伝子の同定を図示する。目立つことに
は、突然変異体表現型を引起こすこの遺伝子中の突然変異がエス・ポンベＣｓｔ
Ｆ６４遺伝子同族体のカルボキシル末端に向けてのナンセンス突然変異であるこ
とである。この終止コドンは、以前に帰結された機能を有していないポリペプチ
ド配列の領域を欠失している、ＣｓｔＦ６４のＣ−末端切頭を効果的に生じる。
しかしながら、タンパク質のこのドメインは他の真核生物の配列間で保存されて
おり、それが、おそらくは転写装置と相互作用することによって、転写終結にお
いて重要な役割を有する可能性が浮上する。
【００９９】 この仮定と取組むために、標準的な遺伝子スクリーニングを行って、このＣ−
末端ドメインと相互作用するタンパク質の探索を行った。この相互作用スクリー
ニング技術は、酵母ツーハイブリッド解析と呼ばれ（Chienら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 88, 9578-9582, 1991）、分子遺伝学においては広範に用いられて
いる技術である。概略において、この手法には、転写因子Ｇａｌ４ｐに対する複
数の結合部位を含むプロモーターによって両方が制御される、β−ｇａｌおよび
ＨＩＳ３レポーター遺伝子を含有する酵母株の生成が含まれる。多くの転写因子
と同様に、Ｇａｌ４ｐは２の機能性ドメインを含み、これらは特異的なプロモー
ター配列と相互作用するＤＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡポリメラーゼ開始複合
体と相互作用し、それをそのように補充することによって転写を活性化する活性
化ドメインである。レポーター株は、Ｇａｌ４ｐ ＤＮＡ結合ドメインおよび前
記したエス・ポンベＣｓｔＦ６４のＣ−末端ドメイン（いわゆる、バイト配列（
bait sequence））を結合する融合タンパク質を発現するプラスミドでも形質転
換する。このハイブリッドタンパク質はレポーターのプロモーターに結合するが
、それはＧａｌ４ｐ活性化ドメインを欠いているため、それはレポーター遺伝子
を活性化し得ない。しかしながら、この酵母株を、Ｇａｌ４活性化ドメインをコ
ードするＤＮＡ配列をエス・ポンベのｃＤＮＡ配列のランダム混合物に融合させ
たプラスミド・ライブラリーで形質転換することにより、幾つかの形質転換酵母
はβ−ｇａｌおよびＨＩＳ３を発現する。これらのポジティブ酵母コロニーは、
エス・ポンベＣｓｔＦ６４のＣ−末端ドメインと相互作用するエス・ポンベ・ラ
イブラリー中のタンパク質ドメイン（いわゆる、プレイ配列（prey sequence）
）の発現から生じる。これらのタンパク質ドメインはＧａｌ４ｐ活性化ドメイン
に融合しているため、かかる相互作用はレポーター・プロモーターへ活性化ドメ
インを補充し、生育およびβ−ｇａｌ発現をそのように許容する。このアプロー
チによって、エス・ポンベＣｓｔＦ６４のＣ−末端ドメインと相互作用する多数
のタンパク質ドメインが同定されている。これらのタンパク質をコードする遺伝
子を、同族エス・セレビシア・タンパク質の詳細およびタンパク質のありそうな
機能の記載と共に表１に記載する。
【０１００】
【表１】
【０１０１】 エス・ポンベ ＣｓｔＦ６４のＣ−末端ドメインと相互作用するドメインを有
する６のタンパク質の中で特に興味深いのは、エス・セレビシア遺伝子ＳＴＨ１
およびＳＦＨ１の同族体であり、これらは両方ともクロマチン再モデリング（re
modeling）複合体、ＲＳＣのサブユニットである（Cairnsら, Cell 87, 1249-12
60, 1996）。ＲＳＣのコンポーネントがＣｓｔＦ６４のＣ−末端ドメインと相互
作用し得るという事実は、転写終結のプロセスにおいてクロマチン再モデリング
が直接的な役割を果たし得るという興味をそそる可能性を浮上させる。転写遺伝
子のクロマチン構造は転写プロセスの間はほぐれていなければならないことが知
られているため、ポリアデニル化装置とクロマチン再モデリング活性との間の接
触が転写終結の機構において直接的な役割を果たし得る可能性がある。
【０１０２】 酵母ツーハイブリッド系で元々決められたＣｓｔＦ６４とｒｅｓ２との間の機
能的リンクは、ｒｅｓ２中に遺伝子ノックアウトを有するエス・ポンベ株がＰｏ
ｌＩＩ転写終結においても欠陥があるという知見によって確認されている。した
がって、ＣｓｔＦ６４／ｒｅｓ２相互作用は、抗菌介入に関する興味深い新たな
標的も表し得る。ｒｅｓ２タンパク質は、Zhu，Y.ら，EMBO J., 16, 1023, 1997
によって記載されている。
【０１０３】 下記は、表１に掲載した遺伝子のデータベース受入番号のリストである（遺伝
子配列＋対応するタンパク質配列）：
【０１０４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｐＵＩならびにしたがってｐＵＩｐＡ、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒ
ａ４およびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２の構築に使用した合成イントロンのヌクレオチ
ド配列を示す。スプライシング共通配列ならびにＳｔｕＩおよびＸｈｏＩ制限部
位を示す。
【図２】 図２は、ｐＵＲＡ４、ｐＵＩ、ｐＵＩｐＡ、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４
、ｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２、ｐＵＩｐＡ＋ｕｒａ４ＲおよびｐＵＩｐＡ＋ｎｍｔ２
Ｒから得られたｍＲＮＡ転写物のノザンブロット分析を示す。矢印は、非スプラ
イス（Ｕ）、野生型（ＷＴ）または切頭（truncated）（Ｔ）転写物の位置を示
す。ウラシルを含まない培地中で生育する形質転換細胞の能力または能力のなさ
は、各形質転換体について、各々＋または−として示す。
【図３】 図３は、切断／ポリアデニル化因子ＣｓｔＦ６４のものと同様なエ
ス・ポンベ終結突然変異株ｍ７０中に存在する突然変異遺伝子の同定を図示する
。ヒト、アフリカツメガエル（Xenopus）、エス・セレビシア（Saccharomyces c
erevisiae）およびエス・ポンベ(S. pombe)のＣｓｔＦ６４同族体の概略図を示
す。ＲＢＤとは、３'切断活性に必要であることが知られている“ＲＮＡ結合ド
メイン”を示す。明暗灰色陰付けボックスは、４の真核生物種間のホモロジーを
示す。ｍ７０株中で突然変異表現型を引起こす突然変異は、ＣｓｔＦ６４のＣ−
末端に向けてのナンセンス突然変異である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:86） (72)発明者 インゴ・ハラルト・グレガー アメリカ合衆国10016ニューヨーク州ニュ ーヨーク、アパートメント・シー、グリー ンバーグ・ホール、ファースト・アベニュ ー545番 (72)発明者 ニコラス・ジャービス・プラウドフット イギリス、オーエックス４・１エイエス、 オックスフォード、ディビニティ・ロード 206番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA02 CA05 CA06 CA07 CA20 DA12 EA04 FA20 GA11 GA25 HA11 4B063 QA05 QA18 QQ07 QQ43 QQ53 QQ79 QR33 QR40 QR48 QR76 QR80 QS32 QS38 QX10 4B065 AA79X AA79Y AA80X AA80Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 CA24 CA46 4H045 AA10 CA10 EA50

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ＧＡＬ１０遺伝子の転写終結シグナル中の欠陥のため
    に、ガラクトース含有培地上で生育することができないサッカロミセス（Saccha
    romyces）株を準備し、 （ｂ）所望により変異原を含有んでいてもよい、ガラクトース含有培地上で該
    株を培養してガラクトース含有培地上で生育することができる復帰突然変異体を
    得、 （ｃ）シス−作用突然変異またはトランス−作用突然変異の存在について工程
    （ｂ）で得られた復帰突然変異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）トランス−作用突然変異を含む復帰突然変異体からのゲノム・フ
    ラグメントのプラスミド・ライブラリー、および／または、（ｉｉ）工程（ａ）
    のサッカロミセス株からのゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリーを
    調製し、 （ｅ）工程（ｄ）（ｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ａ
    ）で準備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ
    ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトランス−
    作用突然変異を含むサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、ついで （ｆ）ガラクトース上で生育する能力について工程（ｅ）の形質転換体をスク
    リーニングすることからなり、 ここに、ガラクトース上で生育することができる工程（ｅ）（ｉ）からのいず
    れの形質転換体は酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトラ
    ンス−作用因子をコードするＤＮＡの突然変異変異型を含み、一方ガラクトース
    上で生育することができない工程（ｅ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母に
    おける転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコード
    するＤＮＡを含むであろうことを特徴とする、酵母における転写の終結をモジュ
    レートすることができるトランス−作用因子を同定する方法。
  2. 【請求項２】 ＧＡＬ１０遺伝子の転写終結シグナル中の欠陥が、ＧＡＬ１
    ０ポリアデニル化シグナルの全体または一部分の欠失である請求項１記載の方法
    。
  3. 【請求項３】 ガラクトース上で生育することができない該サッカロミセス
    株が機能性ゲノム版のＧＡＬ１０およびＧＡＬ７を欠き、かつ、ＧＡＬ１０ポリ
    アデニル化シグナルが欠失しているＧＡＬ１０−７インサートを含むプラスミド
    で形質転換されている請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 該シス−作用またはトランス−作用突然変異を、該復帰突然
    変異体からＧＡＬ１０−７インサートを含むプラスミドを単離し、機能性ゲノム
    版のＧＡＬ１０およびＧＡＬ７を欠くサッカロミセス株をその様にして単離した
    プラスミドで形質転換し、ついでガラクトース上で生育する能力について形質転
    換体をスクリーニングすることによって同定する請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 工程（ａ）で用いるサッカロミセス株がサッカロミセス・セ
    レビシア（Saccharomyces cerevisiae）である前記請求項いずれか１項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 工程（ｂ）において、該株をエチジウム・ブロマイドの存在
    下で培養する前記請求項いずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし６いずれか１項記載の方法により同定した転
    写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子。
  8. 【請求項８】 請求項７記載のトランス−作用因子をコードする核酸配列。
  9. 【請求項９】 そのイントロン内に挿入されている酵母レポーター遺伝子、
    ポリアデニル化シグナル、および該ポリアデニル化シグナルの下流の少なくとも
    １の酵母ポリメラーゼＩＩポーズ（pause）・エレメントを含むＤＮＡ構築物。
  10. 【請求項１０】 該イントロンが組換え事象によって該酵母レポーター遺伝
    子に導入されている請求項９記載のＤＮＡ構築物。
  11. 【請求項１１】 該イントロンが合成イントロンである請求項１０記載のＤ
    ＮＡ構築物。
  12. 【請求項１２】 該イントロンが、ＳｔｕＩ部位に挿入された該ポリアデニ
    ル化シグナルおよびＸｈｏＩ部位に挿入された該ポリメラーゼＩＩポーズ・エレ
    メントを有する以外は図１に示す配列を含む請求項１１記載のＤＮＡ構築物。
  13. 【請求項１３】 該ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントが前進向きでポリ
    アデニル化シグナルの下流に挿入され、かつ、それが酵母ｕｒａ４またはｎｍｔ
    ２遺伝子からのものである請求項９ないし１２いずれか１項記載のＤＮＡ構築物
    。
  14. 【請求項１４】 該ポリアデニル化シグナルが酵母ｕｒａ４遺伝子からのも
    のである請求項９ないし１３いずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
  15. 【請求項１５】 該ｕｒａ４ポリアデニル化シグナルが、 （ａ）以下のプライマー： 【化１】 を用いてｕｒａ４ ＤＮＡを増幅させ、ついで （ｂ）工程（ａ）の増幅産物をＳｔｙＩおよびＲｓａＩで消化することによっ
    て得ることができる請求項１４記載のＤＮＡ構築物。
  16. 【請求項１６】 該酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントが、以下の配
    列： 【化２】 を有するｕｒａ４ポーズ・エレメントである請求項１３ないし１５いずれか１項
    記載のＤＮＡ構築物。
  17. 【請求項１７】 該酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントが、以下の配
    列： 【化３】 を有するｎｍｔ２ポーズ・エレメントである請求項１３ないし１５いずれか１項
    記載のＤＮＡ構築物。
  18. 【請求項１８】 該ポリアデニル化シグナルが図１のＤＮＡ配列のＳｔｕＩ
    部位に挿入されている請求項１２ないし１７いずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
  19. 【請求項１９】 該酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントが図１のＤＮ
    Ａ配列のＸｈｏＩ部位に挿入されている請求項１２ないし１８いずれか１項記載
    のＤＮＡ構築物。
  20. 【請求項２０】 該酵母遺伝子がその天然発生状態でイントロンを含んでい
    ない請求項１０ないし１９いずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
  21. 【請求項２１】 該酵母遺伝子がサッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces
    pombe）のｕｒａ４遺伝子である請求項２０記載のＤＮＡ構築物。
  22. 【請求項２２】 該イントロンがｕｒａ４遺伝子のＳｔｕＩ部位に導入され
    ている請求項２７記載のＤＮＡ構築物。
  23. 【請求項２３】 その中に合成イントロンが挿入されている単一酵母レポー
    ター遺伝子を含み、ここに該合成イントロンが完全レポーター遺伝子の転写を妨
    害している際に効力がない酵母ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ構築物。
  24. 【請求項２４】 該合成イントロンが、該ポリアデニル化シグナルの下流に
    酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメントの挿入に好適な制限部位を有する請求
    項２３記載のＤＮＡ構築物。
  25. 【請求項２５】 該合成イントロンが、ＳｔｕＩ部位に挿入された該ポリア
    デニル化シグナルを有する以外は図１に示す配列を含む請求項２４記載のＤＮＡ
    構築物。
  26. 【請求項２６】 該ポリアデニル化シグナルの下流の制限部位が図１の配列
    のＸｈｏＩ部位である請求項２５記載のＤＮＡ構築物。
  27. 【請求項２７】 該ポリアデニル化シグナルが酵母ｕｒａ４遺伝子からのも
    のである請求項２３ないし２６いずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
  28. 【請求項２８】 該ポリアデニル化シグナルが： （ａ）以下のプライマー： 【化４】 を用いてｕｒａ４ ＤＮＡを増幅させ、ついで （ｂ）工程（ａ）の増幅産物をＳｔｙＩおよびＲｓａＩで消化することによっ
    て得ることができる請求項２７記載のＤＮＡ構築物。
  29. 【請求項２９】 該単一酵母レポーター遺伝子がその天然発生状態でイント
    ロンを有していない請求項２５ないし２８いずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
  30. 【請求項３０】 該単一酵母レポーター遺伝子がエス・ポンベ（S. pombe）
    のｕｒａ４遺伝子である請求項２９記載のＤＮＡ構築物。
  31. 【請求項３１】 該合成イントロンがｕｒａ４遺伝子のＳｔｕＩ部位内に導
    入されている請求項３０記載のＤＮＡ構築物。
  32. 【請求項３２】 該酵母細胞が該レポーター遺伝子の機能性ゲノム・コピー
    を欠いている請求項９ないし３１いずれか１項記載のＤＮＡ構築物で形質転換し
    た酵母細胞。
  33. 【請求項３３】 該レポーター遺伝子がｕｒａ４であって、該ＤＮＡ構築物
    が請求項２１、２２、３０または３１いずれか１項記載のものである請求項３２
    記載の酵母細胞。
  34. 【請求項３４】 エス・ポンベ（S．pombe）である請求項３２または３３記
    載の酵母細胞。
  35. 【請求項３５】 （ａ）請求項２１または２２記載のＤＮＡ構築物で形質転
    換したｕｒａ４−サッカロミセス株を準備し、 （ｂ）所望により変異原を含んでいてもよい、ウラシルを省略した培地上で該
    株を培養して、ｕｒａ４＋表現型への復帰突然変異体を同定し、 （ｃ）シス−作用またはトランス−作用突然変異の存在について該復帰突然変
    異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）工程（ｃ）で同定したトランス−作用突然変異を含む復帰突然変
    異体からのゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリー、および／または
    、（ｉｉ）工程（ａ）のサッカロミセス株からのゲノム・フラグメントのプラス
    ミド・ライブラリーを調製し、 （ｅ）（ｉ）工程（ｄ）（ｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工
    程（ａ）で準備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）
    （ｉｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトラ
    ンス−作用突然変異を含むサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、 （ｆ）ウラシルの不存在下で、および／または、ウラシルおよび５−ＦＯＡの
    存在下で工程（ｅ）の形質転換体を培養することによってｕｒａ４−またはｕｒ
    ａ４＋表現型の存在について工程（ｅ）の形質転換体をスクリーニングすること
    からなり、 ここに、ｕｒａ４−表現型を示す工程（ｅ）（ｉ）のいずれの形質転換体は酵
    母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコ
    ードするＤＮＡの突然変異変異型を含み、一方ｕｒａ４−表現型を示す工程（ｅ
    ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母における転写の終結をモジュレートする
    ことができるトランス−作用因子をコードするＤＮＡを含むであろうことを特徴
    とする、酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作
    用因子を同定する方法。
  36. 【請求項３６】 シス−作用突然変異の存在を、該復帰突然変異体から請求
    項２１または２２記載のＤＮＡ構築物を単離し、サッカロミセスのｕｒａ４−株
    を単離したＤＮＡ構築物で形質転換し、ついでｕｒａ４＋表現型への復帰につい
    てスクリーニングすることによって決定する請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 （ａ）野生型表現型を示す請求項３０または３１記載のＤ
    ＮＡ構築物で形質転換したｕｒａ４−サッカロミセス株を準備し、 （ｂ）所望により変異原を含んでいてもよい、ウラシルおよび５−ＦＯＡを含
    む培地上で該株を培養して、ｕｒａ４−表現型への復帰突然変異体を同定し、 （ｃ）シス−作用またはトランス−作用突然変異の存在について該復帰突然変
    異体をスクリーニングし、 （ｄ）（ｉ）工程（ｃ）で同定したトランス−作用突然変異を含む復帰突然変
    異体からゲノム・フラグメントのプラスミド・ライブラリー、および／または、
    （ｉｉ）工程（ａ）のサッカロミセス株からゲノム・フラグメントのプラスミド
    ・ライブラリーを調製し、 （ｅ）（ｉ）工程（ｄ）（ｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工
    程（ａ）で準備したサッカロミセス株に、および／または、（ｉｉ）工程（ｄ）
    （ｉｉ）のプラスミド・ライブラリーの各メンバーを工程（ｃ）で同定したトラ
    ンス−作用突然変異を含むサッカロミセス復帰突然変異体に形質転換し、 （ｆ）ウラシルの不存在下で、および／または、ウラシルおよび５−ＦＯＡの
    存在下で工程（ｅ）の形質転換体を培養することによってｕｒａ４＋またはｕｒ
    ａ４−表現型の存在について工程（ｅ）の形質転換体をスクリーニングすること
    からなり、 ここに、ｕｒａ４−表現型を示す工程（ｅ）（ｉ）のいずれの形質転換体は酵
    母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子をコ
    ードするＤＮＡの突然変異変異型を含み、一方ｕｒａ４＋表現型を示す工程（ｅ
    ）（ｉｉ）のいずれの形質転換体は酵母における転写の終結をモジュレートする
    ことができるトランス−作用因子をコードするＤＮＡを含むであろうことを特徴
    とする、酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作
    用因子を同定する方法。
  38. 【請求項３８】 該シス−作用突然変異の存在を、該復帰突然変異体から請
    求項３０または３１記載のＤＮＡ構築物を単離し、サッカロミセスのｕｒａ４− 株を単離したＤＮＡ構築物で形質転換し、ついでウラシルおよび５−ＦＯＡを含
    む培地上で培養することによってｕｒａ４−表現型の維持を確認することによっ
    て決定する請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 工程（ｂ）において、該株をエチジウム・ブロマイドの存
    在下で培養する請求項３５ないし３８いずれか１項記載の方法。
  40. 【請求項４０】 該ｕｒａ４−サッカロミセス株がエス・ポンベである請求
    項３５記載の方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３５ないし４０いずれか１項記載の方法によって同
    定した酵母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用
    因子。
  42. 【請求項４２】 請求項４１記載のトランス−作用因子をコードする核酸。
  43. 【請求項４３】 （ａ）請求項１ないし６いずれか１項記載の方法を行い、 （ｂ）請求項３０または３１記載のＤＮＡ構築物で形質転換したｕｒａ４−サ
    ッカロミセス株を工程（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードする遺伝子
    を含むプラスミドで形質転換し、ついで （ｃ）ウラシルの不存在下、および／または、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存
    在下の培地で培養することによってｕｒａ４−表現型への復帰について工程（ｂ
    ）の形質転換体をスクリーニングすることからなる、酵母における転写の終結を
    モジュレートすることができるトランス−作用因子を同定する方法。
  44. 【請求項４４】 （ａ）請求項１ないし６いずれか１項記載の方法を行い、 （ｂ）請求項２１または２２記載のＤＮＡ構築物で形質転換したｕｒａ４−サ
    ッカロミセス株を工程（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードする遺伝子
    を含むプラスミドで形質転換し、ついで （ｃ）ウラシルを含まない培地上で培養することによってｕｒａ４＋表現型へ
    の復帰について工程（ｂ）の形質転換体をスクリーニングすることからなる、酵
    母における転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子を同
    定する方法。
  45. 【請求項４５】 （ａ）請求項３５ないし４０いずれか１項記載の方法を行
    い、 （ｂ）ＧＡＬ１０遺伝子の転写終結シグナル中に欠陥を有するサッカロミセス
    株を工程（ａ）で同定したトランス−作用因子をコードするＤＮＡ分子を含むプ
    ラスミドで形質転換し、ついで （ｃ）ガラクトースの存在下で該形質転換体を培養することによって野生型表
    現型への復帰について該形質転換体をスクリーニングすることからなる、酵母に
    おける転写の終結をモジュレートすることができるトランス−作用因子を同定す
    る方法。
  46. 【請求項４６】 （ａ）真核生物遺伝子からの推定ポリメラーゼＩＩポーズ
    ・エレメントを含むＤＮＡフラグメントを該ポリアデニル化シグナルの下流の請
    求項３０または３１記載のＤＮＡ構築物に挿入し、 （ｂ）請求項３０または３１記載のＤＮＡ構築物を組込んだプラスミドで形質
    転換したサッカロミセスのｕｒａ４−株を工程（ａ）で調製したＤＮＡ構築物を
    含むプラスミドで形質転換し、ついで （ｃ）ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下の培地上で培養することによってｕ
    ｒａ４−表現型への復帰についてスクリーニングする工程からなり、 ここに、ｕｒａ４−表現型が該挿入フラグメントがポリメラーゼＩＩポーズ活
    性を有することを示すことを特徴とする、真核生物遺伝子からポリメラーゼＩＩ
    ポーズ・エレメントを同定する方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４６記載の方法によって同定した酵母ポリメラーゼ
    ＩＩポーズ・エレメント。
  48. 【請求項４８】 エス・ポンベのｎｍｔ２遺伝子から単離され、かつ、以下
    のヌクレオチド配列： 【化５】 またはその相補体を有する請求項４７記載の酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレ
    メント。
  49. 【請求項４９】 以下のヌクレオチド配列： 【化６】 またはその相補体を有する酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメント。
  50. 【請求項５０】 請求項４９記載の酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメン
    トを含むＤＮＡ分子。
  51. 【請求項５１】 以下のヌクレオチド配列： 【化７】 またはその相補体を有する酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメント。
  52. 【請求項５２】 請求項５１記載の酵母ポリメラーゼＩＩポーズ・エレメン
    トを含むＤＮＡ分子。
  53. 【請求項５３】 ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因
    子によって調節されるプロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子また
    は逆選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を準備し； 該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかにイン−フ
    レーム（in-frame）で融合したＣｓｔＦ６４タンパク質またはそのＣ−末端フラ
    グメントを含む第１のハイブリッドタンパク質をコードする第１のハイブリッド
    ＤＮＡ配列を該宿主細胞中で発現させ； 該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかにイン−フ
    レームで融合した相互作用タンパク質またはそのフラグメントを含む第２のハイ
    ブリッドタンパク質をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列を、第１の融合
    タンパク質が該転写因子の活性化ドメインを含む場合には該第２の融合タンパク
    質は該転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含み、第１の融合タンパク質が転写因子
    のＤＮＡ結合ドメインを含む場合には第２の融合タンパク質は活性化ドメインを
    含むように、該宿主細胞中で発現させ； 試験下で宿主細胞を化合物の試料と接触させ；ついで 該宿主細胞中のいずれかのレポーター遺伝子産物の生成を検出するか、または
    逆選択マーカー遺伝子の発現の欠失について正の選抜を適用するかのいずれかに
    よって、相互作用タンパク質またはそのフラグメントに対するＣｓｔＦ６４タン
    パク質またはそのＣ−末端フラグメントのいずれかの結合を検出することからな
    る、ＣｓｔＦ６４タンパク質のＣ−末端ドメインに結合すると以前に同定された
    相互作用タンパク質に対するサッカロミセス・ポンベのＣｓｔＦ６４タンパク質
    の結合を阻害、向上または破壊することができる化合物を同定する方法。
  54. 【請求項５４】 相互作用タンパク質がエス・ポンベのｒｅｓ２タンパク質
    である請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 相互作用タンパク質がエス・ポンベのｄｐｈ１タンパク質
    である請求項５３記載の方法。
  56. 【請求項５６】 相互作用タンパク質がＳＰＣＣ１６Ａ１１.１４と呼ばれ
    るエス・ポンベ遺伝子によってコードされるタンパク質である請求項５３記載の
    方法。
  57. 【請求項５７】 相互作用タンパク質がＳＰＣＣ８３０.０１と呼ばれるエ
    ス・ポンベ遺伝子によってコードされるタンパク質である請求項５３記載の方法
    。
  58. 【請求項５８】 相互作用タンパク質がＳＰＡＣ１９Ａ８.１２と呼ばれる
    エス・ポンベ遺伝子によってコードされるＰＳＵ１−様タンパク質である請求項
    ５３記載の方法。
  59. 【請求項５９】 相互作用タンパク質がＳＰＡＣ５７Ａ７.１２と呼ばれる
    エス・ポンベ遺伝子によってコードされるＨｓｐ７０−様タンパク質である請求
    項５３記載の方法。
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