WO2002038168A2 - Verwendung von selektin-bindenden wirkstoffen zur behandlung von entzündlichen- und tumor-erkrankungen - Google Patents

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Definitions

  • Fragments and facial expressions for the treatment and prophylaxis of inflammatory diseases for the treatment and prophylaxis of inflammatory diseases, for
  • the invention relates to the use of selectin-binding active substances, in the form of pregnancy proteins or their fragments, of liposomes which contain Ca-binding compounds, of mucin fragments which originate or are derived from natural sources, or of mimicry compounds , which mimic sialylated carbohydrate structures of the Lewis type (sLe), or their combinations, for the treatment and prophylaxis of diseases in the course of which inflammatory processes play a role, such as autoimmune diseases, transplants and arteriosclerosis.
  • Inflammatory diseases in the sense of the invention can be infectious or non-infectious in nature.
  • the invention also relates to the use of these active substances for the partial or complete prevention of the metastasis of tumors, it being possible for the active substances to be administered prophylactically or in connection with, for example, surgical removal of the primary tumor or a biopsy.
  • the subject is also the use of these active ingredients for the prophylaxis of tumor diseases.
  • the use of the active compounds according to the invention relates to both human medicine and veterinary medicine.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions according to claims 10-18, which contain these active ingredients.
  • Lewis carbohydrate structures bind to the lectin domain of these selectins and thus inhibit cell adhesion from the bloodstream. It is also known that a better blockade of the selectins, for example with di- and trivalent sLe x peptides [(sLe x ) 2 peptides and (sLe x ) 3 peptides] and with sLe x liposomes, the several Lewis carbohydrate residues have as part of the membrane can be achieved. The multivalence of these carbohydrate-selectin bonds results in an improved inhibition of the adhesion of cells to the selectin (s).
  • the literature also describes that mucins carrying sLe a or sLe x bind to E-selectin and inhibit leukocyte adhesion or the adhesion of tumor cells to E-selectin [K. Zang et al. , Tumor Biology 18: 175-187 (1997); T. Sawada et al. , Int. J. Cancer 57: 901-907 (1994)].
  • the mucins are high molecular weight glycoproteins.
  • the object of the present invention was to find alternative compounds which inhibit the adhesion of cells from the blood stream to activated endothelial cell tissue of the blood vessels or to find compounds which show a more effective inhibitory effect by binding more specifically and with higher affinity to activated endothelial cell tissue than those in the prior art inhibitors previously described in the art.
  • the compounds are said to be suitable as active ingredients for the prophylaxis and therapy of inflammatory diseases and tumor diseases.
  • human or animal pregnancy proteins are extremely efficient inhibitors of the adhesion of cells from the blood stream to activated vascular endothelium. This function is new and is hereinafter referred to as an activity in the sense of the invention. They bind specifically and with high affinity to selectins.
  • pregnancy proteins used are those which are formed by the placenta during pregnancy.
  • Such proteins are in particular the human pregnancy proteins, preferably gonadotropic hormones, such as, for example, FSH (membrane stimulating hormone), LH (luteinizing hormone) hCG (human choriogonadotropin), or fetoprotein, transferrin, glycodeline, in particular glycodelin A (PP 14) or their fragments .
  • gonadotropic hormones such as, for example, FSH (membrane stimulating hormone), LH (luteinizing hormone) hCG (human choriogonadotropin), or fetoprotein, transferrin, glycodeline, in particular glycodelin A (PP 14) or their fragments
  • the proteins and glycoproteins isolated from human or animal amniotic fluid or serum or urine can be used as well as synthetically produced proteins or partial peptides which can be correspondingly glycosylated and have the same properties as the native proteins formed by the placenta during pregnancy.
  • the functional effect of the pregnancy proteins in the sense is attributed to a special glycosylation not previously known for these proteins.
  • the pregnancy protein ppl4 is described and it is shown that ppl4 from the urine, serum and amniotic fluid of pregnant women has a comparable activity in the sense of the invention and can be used.
  • pregnancy proteins which are obtained from different sources, [as shown in examples 1, 2 and 4 for hCG, transferrin and ⁇ -fetoprotein (table 1 and table example 4)] surprisingly have different high activities in the sense of the invention.
  • hCG and ⁇ -fetoprotein from the serum of pregnant women have a high activity and from the amniotic fluid the highest activity, while the urinary hCG pregnant woman is not suitable due to a low activity in the sense of the invention. Only transferrin obtained from the amniotic fluid is active in the sense of the invention.
  • the proteins can also be obtained from pregnancy-associated cell cultures that are derived from the placenta, such as trophoblast cultures that have not been changed or that can be obtained by enrichment, stimulation with the aid of suitable molecules and / or transfection of suitable genes that produce the desired pregnancy proteins or parts thereof, including the suitable glycosylations, express, are obtained.
  • pregnancy-associated cell cultures that are derived from the placenta, such as trophoblast cultures that have not been changed or that can be obtained by enrichment, stimulation with the aid of suitable molecules and / or transfection of suitable genes that produce the desired pregnancy proteins or parts thereof, including the suitable glycosylations, express, are obtained.
  • hCG which is isolated from throphoblast cell cultures / cell lines, is suitable for the use according to the invention.
  • the pregnancy proteins used according to the invention can also be coupled to suitable biological or chemical carrier molecules or particles, such as, for example, proteins, bacteriophages or liposomes, preferably liposomes containing Ca-complexing compounds.
  • suitable biological or chemical carrier molecules or particles such as, for example, proteins, bacteriophages or liposomes, preferably liposomes containing Ca-complexing compounds.
  • the liposomes used according to the invention are preferably in the form of single- or multi-layer vesicles and consist of a base lipid, preferably phosphatidylcholine, and the anchor lipid, preferably phosphatidylethanolamine, and contain, as an additional active component, a Ca-binding or calcium complexing compound, for example ethylenediaminetetraacetic acid - acid (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid - acid
  • the carbohydrate ligand is bound to the anchor lipid, for example, via a spacer, which can be a polyethylene glycol chain, a peptide or an alkyl group.
  • a spacer which can be a polyethylene glycol chain, a peptide or an alkyl group.
  • sLe x -polyethylene glycol 2000 -distearylphosphoethanolamine is used for this.
  • Charge carriers such as diacetyl phosphate and membrane stabilizers such as
  • glycoliposomes The preparation of such glycoliposomes is known to the person skilled in the art.
  • liposomes which contain Ca-binding compounds and which carry antibodies, antibody fragments, peptides or other proteins or their fragments, for example pregnancy proteins, which bind to selectin can also be used.
  • Liposomes containing Ca-binding compounds and carrying mimicry compounds that mimic sLe structures can also be used.
  • the liposomes according to the invention show a considerably higher inhibitory effect than the “empty” glycoliposomes described in the literature.
  • EDTA glycoliposomes according to Example 4 show a multiple increase in the inhibitory effect of tumor cell binding compared to glycoliposomes of the same composition, but without included EDTA.
  • low molecular weight fragments of mucins from natural sources, e.g. the body's own fluids or cell cultures, to inhibit the adhesion of cells from the bloodstream to activated endothelial cells.
  • the mucins are high-molecular glycoproteins that can trigger immunological reactions, their use as an adhesion blocker in the clinic is problematic. These problems can be avoided by using the low molecular weight fragments according to the invention which have sialylated carbohydrate structures of the Lewis type and are made from natural mucins. The low molecular fragments surprisingly show better inhibition than the mucins described in the literature.
  • the mucin fragments according to the invention are produced, for example, by enzymatic cultivation. Alternatively, the mucin fragments according to the invention can also be produced synthetically.
  • the mucins can also be coupled to suitable biological or chemical carrier molecules or particles, such as, for example, proteins, bacteriophages or liposomes, preferably liposomes containing Ca-complexing compounds.
  • the object of the invention is achieved in a further embodiment by the use of compounds which mimic the carbohydrate structures of the Lewis type (so-called mimicry compounds) and which bind to selectins with high specificity and affinity and are obtained with the aid of molecules which obtain the Recognize Lewis type carbohydrate structure.
  • Such compounds can be, for example, linear or circular peptides, antibodies or antibody fragments or other protein structures such as, for example, protein scaffolds with variable proportions, which act in a similar way to antibody fragments.
  • Mimicry compounds in the form of mimicry peptides, antibodies, antibody fragments, proteins with variable proportions are produced by:
  • Hybrid, semi-synthetic or synthetic antibody gene libraries and donors immunized or non-immunized from gene libraries for example by means of the phage display technique or the ribosome display technique with the help of substances that specifically recognize Lewis-type carbohydrates (eg antibodies or lectins that are not selectins), recombinant antibody fragments such as single-chain antibody fragments (scFv) or Fab fragments that bind the carbohydrate-binding regions of these substances and thus the carbohydrates imitate, produce or select from the Lewis type,
  • Lewis-type carbohydrates eg antibodies or lectins that are not selectins
  • recombinant antibody fragments such as single-chain antibody fragments (scFv) or Fab fragments that bind the carbohydrate-binding regions of these substances and thus the carbohydrates imitate, produce or select from the Lewis type
  • mimicry compounds are preferably produced with the aid of an sLe x - or an sLe a -specific antibody which imitates the carbohydrate sLe x or sLe a as a mimicry molecule.
  • the mimicry compounds according to the invention have so far been described neither as substances per se nor for use according to the invention. They effectively prevent the binding of tumor cells and leukocytes to the selectins and can therefore be used for the prophylaxis or therapy of inflammatory diseases and tumor diseases.
  • the mimicry compounds for use according to the invention are coupled to liposomes, preferably to liposomes which contain Ca-complexing compounds such as EDTA.
  • the mimicry compounds can be linear or circular peptides, the latter often having a higher serum stability, or alternatively the relatively stable inverse or retro-inverse peptides.
  • Antibodies or antibody fragments, single-chain (scFv) or Fab antibody fragments are also used according to the invention, human antibody fragments having the great advantage that they generally do not induce an immune response against mouse or other foreign antibodies which bind the antibodies and thus can neutralize the antibodies after a short time, which is why the human antibody fragments can also be used repeatedly.
  • scFv single-chain
  • Fab antibody fragments having the great advantage that they generally do not induce an immune response against mouse or other foreign antibodies which bind the antibodies and thus can neutralize the antibodies after a short time, which is why the human antibody fragments can also be used repeatedly.
  • proteins are also used, preferably with a basic structure (scaffold) of a human protein in combination with variable sections (for example affibodies) which are essentially responsible for the molecular mimicry.
  • a basic structure for example affibodies
  • variable sections for example affibodies
  • One way to obtain these molecules is to select the molecules using phage display technology, using an antibody against the sLe x as the antigen and the molecules that bind the carbohydrate-specific binding site of the antibody from the corresponding ones Libraries isolated:
  • ribosome display or comparable technologies are also suitable for extracting the mimicry molecules.
  • Protein-based mimicry molecules can also be constructed using molecular modeling and recombinantly produced using molecular biological methods. Mimicry molecules that are not based on proteins can also be obtained by combinatorial chemistry and / or molecular modeling.
  • the libraries are, for example: peptide libraries that represent linear or circular peptides; antibody libraries made synthetically, semi-synthetically, or from human material from healthy donors or patients; Libraries that represent a scaffold protein with randomized variable regions, such as the Affibodies.
  • the sLe x , sLe a or other Lewis-type carbohydrates which are responsible for the adhesion of the tumor cells or leukocytes, can also be used to obtain mimicry structures the activated endothelium are responsible for the purposes of the patent.
  • the selection can be obtained with the help of a specific elution through a large excess of the corresponding carbohydrates, with the advantage of shortening the test times.
  • the mimicry molecules have several advantages: the production of carbohydrates is very expensive and complex; Mimicry peptides that lack a carbohydrate modification, on the other hand, can be produced more quickly and more cheaply synthetically or biologically, for example by molecular biological methods coupled to bacteriophages; Antibody fragments and other proteins can be produced faster and cheaper recombiantly in bacteria or animal cells.
  • Mimicry molecules can have a higher affinity for the selectins. The inhibition potential is therefore higher.
  • multimeric mimicry entities are created in the form of molecules or particles: for example by multiple coupling of the mimicry molecules to carrier proteins, such as HSA; multiple expression of the mimicry molecules as fusion proteins with bacterial coat proteins on bacteriophages; by coupling the mimic molecules to lipids and incorporation into liposomes.
  • the mimicry compounds can also be coupled to suitable biological or chemical carrier molecules or particles, such as, for example, proteins, bacteriophages or liposomes, preferably liposomes containing Ca-complexing compounds.
  • selectin-specific antibodies or antibody fragments which are coupled to liposomes, preferably to liposomes which contain Ca-complexing compounds, such as EDTA, for example, are advantageously used to inhibit the adhesion of cells from the blood stream to activated vascular endothelium.
  • Such antibodies are known.
  • an antibody e.g. the monoclonal, commercially available antibody BBA2 from R & D Systems can be used. It is also no problem for the person skilled in the art to produce selectin-specific antibodies.
  • the inhibition of cell adhesion can also be achieved by peptides or other proteins which are coupled to liposomes and at the same time contain Ca-complexing compounds.
  • the advantages of this embodiment are: a multimerization of the bonds and thereby an increase in affinity due to the avidity effect, which leads to the fact that the inhibition of the tumor cells or leukocytes expressing the Lewis type carbohydrates on the activated endothelial cells is increased many times in comparison to individual antibodies direct human scFv or Fab, which have been isolated from the antibody libraries by the selection techniques described above and which are in principle monomeric antibody fragments, can be used directly.
  • the advantage here is the reduced immune response against human antibody fragments, an integration into the liposome membrane.
  • a lateral mobility of the ligands capable of binding in the membrane enables adaptation to the arrangement of selectins for effective binding.
  • a rigid scaffold eg rigid protein structure
  • the compounds described above are very well suited as active ingredients for the prophylaxis and therapy of diseases, in the course of which inflammatory processes play a role, owing to their described cell adhesion inhibition.
  • the compounds can be used individually or in combination with one another to reinforce one another. It is of course also possible to further improve the action of the compounds according to the invention by suitable formulations, for example by adding immunostimulatory or immuninhibitory compounds, such as lymphokines, cytokines, chemokines or adjuvants.
  • compositions based on these active ingredients are prepared by customary methods known in pharmaceutical engineering with customary pharmaceutical auxiliaries.
  • the compounds according to the invention are used for
  • prophylaxis to prevent or reduce metastasis in risk situations such as, for example, surgery of tumors or biopsies if a tumor is suspected.
  • Prophylaxis to prevent or reduce metastasis in the event of suspected tumor disease.
  • prophylaxis to prevent or reduce metastasis in the event of a tumor.
  • prophylaxis to prevent or reduce metastasis in the event of surgery in connection with the minimal residual tumor disease.
  • Treatment of autoimmune diseases f) Reduction of tissue damage in connection with surgery, transplantation, ischemia and reperfusion g) Treatment of diseases in the early stages of pregnancy h) Reduction of atheriosclerotic vascular changes, e.g. Restenosis.
  • Example 1 The invention is explained in more detail by the following examples, without restricting it to these examples:
  • Example 1 Example 1 :
  • Example la Isolation of hCG from amniotic fluid
  • HCG is formed by the syncytiotrophoblast after implantation of the fertilized egg and secreted into the bloodstream and amniotic fluid of the pregnant woman.
  • Amniotic fluid samples from the chromosome analysis (500ml) are dialyzed against PBS.
  • 1 mg mouse itiAK rabbit anti human chorionic gonadotropin, DAKO (rabbit anti human choriogonadotropin, DAKO) directed against the ⁇ -subunit of hCG is bound to the appropriate amount of CNBr-Sepharose.
  • a chromatography column is filled with the anti hCG-Sepharose obtained, which serves for the immunoadsorption of hCG.
  • the hCG is isolated using 100 mM citrate buffer and further purified using FPLC by anion exchange chromatography on Resource Q.
  • HCG consists of an ⁇ and a ⁇ subunit.
  • trophoblasts also form free ⁇ and ⁇ chains.
  • the free ß chain accounts for about 2-3% of the intact hCG and, like this, reaches a maximum in the 10th week of pregnancy. In contrast, the free ⁇ chain increases continuously during pregnancy and reaches its maximum in the third trimester. With the immunoadsorption column directed against the ß chain of the hCG, the entire molecule and free ß chains are isolated.
  • Free ⁇ chains are isolated with a second antibody column, loaded with monoclonal antibodies directed against the ⁇ chain of the hCG. With the help of gel filtration on Superdex 75, the free ß chains become intact Whole molecule separated and isolated. The purity of the preparation is checked by SDS-PAGE and silver staining.
  • E-selectin is immobilized on 96-well titer plates, or the expression of E-selectin on activated endothelial cells from the vein of human umbilical cords (HUVEC) is induced by stimulation with cytokines. HUVEC endothelial cells are also cultured in 96-well microtiter plates.
  • E-selectin (R&D Systems) (5 / xg / ml) is immobilized by overnight incubation at 4 ° C. The plates are washed with a calcium-containing phosphate buffer (Ca-PBS) and blocked with 1% bovine serum albumin (RSA) for 1 hour at room temperature. Amnion-hCG (0.005-InMol / well) is added and preincubated for 30 minutes at room temperature. Then lxl0 5 51 Cr-labeled HepG2 hepatoma cells adhering to E-selectin are added and it is incubated for a further 30 minutes at room temperature.
  • Ca-PBS calcium-containing phosphate buffer
  • RSA bovine serum albumin
  • the unbound cells are then removed by washing 3 times with Ca-PBS and the bound cells are quantified after lysis with 0.1N sodium hydroxide solution by radioactivity measurement.
  • the carbohydrate-binding domain of E-selectin-blocking monoclonal antibodies BBA2 (R&D Systems), EDTA for removing Ca from the test system and the selective but little affinity-binding monovalent tetrasaccharide sialyl Lewis x (sLex) are used as controls and are used in parallel in the test series leads.
  • HUVEC are isolated from the vein of fresh human umbilical cords, used up to the 3rd passage and cultured in 96-well titer plates for testing to confluence. By adding 0.2 ng IL-1ß [per well, the expression induced on HUVEC. It reaches a maximum after 4 hours. At this time, an adhesion test / adhesion inhibition test is carried out analogously to that described for immobilized E-selectin.
  • Table 1 shows the effectiveness of hCG isolated from different sources in both test systems.
  • the IC 50 values (inhibitor concentration for 50% inhibition of adhesion) are given.
  • Trophoblast cultures but not from urine, are at least 10 4 times more effective than sLe x .
  • Example 2 Isolation of HCG from the Serum and Testing Analogous to Example Ib
  • HCG is continuously secreted into the serum during pregnancy. The maximum is reached in the first trimester. 500 ml serum pool from pregnant women from the 1st trimester are dialyzed twice against H 2 0 and then against 20 mM NaH 2 P0 4 . The isolation of the serum hCG is carried out analogously to the isolation of the amnion hCG. In the adhesion inhibition test analogous to Example 1b, an approximately 3-fold lower effect compared to the amnion-hCG is measured, but a 10 4- fold increase compared to the monovalent tetrasaccharide sLe x . 1 shows the inhibition of HepG2 cell adhesion as a function of the serum CG concentration.
  • Example 3 Isolation of Glycodelin A (Amnion-PP14) and testing analogous to Example Ib
  • glycodelin A from amniotic fluid is essentially carried out according to a procedure in which the pooled amniotic fluid samples are dialyzed against water and then 50 mM NH 4 HCO 3 .
  • This product • is separated chromatographically on a DEAE-Sepharose column.
  • the glycodelin A-containing fraction is further purified on a Superdex 75 column and then on an octyl-Sepharose column.
  • glycodelin A was purified on a Resource-Phe column using an isopropanol / phosphate buffer mixture as solvent.
  • Glycodelin A can be purified using immunoadsorption chromatography.
  • 1 mg anti-Glycodelin A mAK (mouse anti human glycodelin, DNA Diagnostik Nord GmbH) is bound to CNBr-Sepharose.
  • the material is poured into a 5 ml chromatography column.
  • the immunoadsorption column thus prepared is loaded with 500 ml of amniotic fluid dialyzed against 20 mM Na 2 HP0 4 (pH 7.0).
  • Glycodelin A is eluted with 100 mM citrate buffer. The purity of the preparation is checked by SDS-PAGE and silver staining.
  • Fig. 2 shows the inhibition of HepG2 cell adhesion to activated HUVEC as a function of the glycodelin A concentration
  • the trophoblast culture line was purchased and not genetically modified. The isolation is carried out analogously to the extraction of the pregnancy proteins from Examples 1 to 3.
  • Phosphatidylcholine, (PC; 7.44 mg), Sialy-Lewis x -polyethyl- englykoll 2000 -distearylphosphoethanolamine (sLex-Peg2000 DSPE; 1.26 mg) and dimyristoyl-phosphatidylethanolamine (DMPE; 0.22 mg) are used as a chloroform solution mixed, the solvent removed on a rotary evaporator and the lipid film obtained after thorough drying with 1 ml EDTA solution resuspended. After shaking vigorously for several hours, multilayer vesicles (MLV) are obtained, which can be used after repeated washing with phosphate-buffered, isotonic saline (PBS; pH 7.4) and subsequent centrifugation.
  • MLV multilayer vesicles
  • MLV from Example 5a are sonicated to produce single-layer vesicles (SUN) until a homogeneous solution with an average vesicle diameter of around 100 nm is reached. After centrifugation (16000 g / 10 min) the supernatant containing the liposomes is separated and used. Excess EDTA is separated off by gel chromatography (Sephadex G50), the subsequent size and content determination is carried out as described in Example 4a, and results in a liposome population with a diameter of 85 nm (PI 0.2).
  • MLV from Example 5a are repeatedly extruded in a suitable manner to produce single-layer vesicles (LUVET) (e.g. with a LiposoFast extruder through two polycarbonate filters with a pore diameter of 100 nm) until a homogeneous solution with an average vesicle diameter of around 100 nm is reached.
  • LVET single-layer vesicles
  • Excess EDTA is separated off by gel chromatography (Sephadex G50).
  • the content of PC and PE is determined with the HPTLC.
  • the size determination by means of quasi-elastic light scattering measurement gives a diameter of 114 nm (PI 0.02).
  • the liposomal PC content is about 85% of the MLV suspension used.
  • Example 5d Carrying out the adhesion inhibition test with EDTA glycolipsomes according to Example 5c
  • E-selectin immobilized in a microtiter plate 50 ⁇ l, with 5 ⁇ g / ml in buffer containing Tris / calcium
  • liposomes from example 5c
  • 100,000 MT3 breast cancer cells that were labeled 51-chromium, each well mixed and for Incubated for 1 hour at 4 ° C.
  • the unbound cells are washed off and the number of bound cells after lysis with NaOH is quantified using the radioactive measurement. Tumor cell binding is inhibited by 95.6%. The inhibition is therefore increased by 64% compared to liposomes of the same composition, but without EDTA.
  • the one antibody gene The library consists of more than 10 10 phages, each with different combinations of the variable regions of the 1 heavy and light chains of human antibodies with partially randomized hypervariable regions, which are linked to a peptide piece (linker) and are covalently linked to a phage coat protein (pIII). It is derived from another antibody gene library (Griffiths, A. et al., 1994, EMBO J., 13: 3245-3260).
  • the second, smaller gene library consists of scFv, which were pre-selected for active folding of the antibody fragments.
  • the first library comes from the Dr.G.Winter laboratory and the second from the Dr. I.
  • the washed beads were then blocked with 30% FCS in cell culture medium for 1 h at RT and incubated with 5 * 10 12 phages of the antibody libraries for 2.5 h at RT.
  • stringent washing steps up to 20 times PBS / 0.1% Tween20 and then 20 times PBS
  • the scFv phages that bind the binding site of the antibody were specifically eluted with 100 ⁇ g / ml sLe x - polyacrylamide conjugates (Synthesome) and then with trypsin (proteolytic Selection method).
  • the scFv phage without specific elution by sLe x -Carbohydrates by trypsinisation were eluted directly. Between the rounds of selection, the eluted phages in the bacteria were replicated with helper phages and again selected. Two to three rounds of selection were carried out.
  • the selected peptides and antibody fragments were tested in ELISA tests for their binding to various sLe x -specific antibodies and E-selectin and for control to other IgM and IgG antibodies.
  • the forms of peptides and antibody fragments coupled to phages were used, which had previously been purified by a polyethylene glycol precipitation carried out in 96-well plates.
  • the potential mimicry peptides and mimicry scFv were examined in ELISA inhibition tests to determine whether they specifically inhibit the binding of the sLe x -specific antibodies to sialyl Lewisx polyacrylamide.
  • E-selectin (50 ⁇ l, containing 5 ⁇ g / ml in a buffer containing Tris / calcium) immobilized in a microtiter plate is mixed with bacteriophages which contain the mimicryptides according to Example 5 in the form of fusion proteins with the phage coat protein pVIII in a high unspecified amount.
  • bacteriophages which contain the mimicryptides according to Example 5 in the form of fusion proteins with the phage coat protein pVIII in a high unspecified amount.
  • 100,000 MT3 breast cancer cells which were labeled with 51 crom, each well and incubated for 1 hour at 4 ° C.
  • the unbound cells are washed off and the number of bound cells after lysis with NaOH is quantified using the radioactive measurement.
  • tumor cell binding is almost completely inhibited, similar to the experiments with the glycoliposomes.
  • the invention relates to the use of selectin-binding active substances, in the form of pregnancy proteins or their fragments, of liposomes which contain diCa-binding compounds, of mucin fragments which originate or are derived from natural sources, or of mimicry compounds which are sialylated Imitating carbohydrate structures of the Lewis type (sLe), or their combinations, for the treatment and prophylaxis of diseases, in the course of which inflammatory processes play a role play such as autoimmune diseases, transplants and arteriosclerosis.
  • Inflammatory diseases in the sense of the invention can be infectious or non-infectious in nature.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Selektin-bindenden Wirkstoffen, in Form von Schwangerschaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, die Calcium-bindende Verbindungen enthalten, aus nativen Quellen stammenden Muzin-Fragmenten oder davon abgeleitet sind oder Mimikry-Verbindungen, die sialylierte Kohlenhydratstrukturen vom Lewis-Typ imitieren, oder deren Kombinationen, zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrank-ungen, in deren Verlauf entzündliche Prozesse eine Rolle spielen, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, Trans-plantationen und Arteriosklerose. Entzündungserkrankungen im Sinne der Erfindung können infektiöser oder nichtinfek-tiöser Natur sein.Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser Wirkstoffe zur teilweisen oder vollständigen Verhinderung der Metastasierung von Tumoren, wobei die Gabe der Wirk-stoffe prophylaktisch oder im Zusammenhang mit beispiels-weise einer operativen Entfernung des Primärtumors oder einer Biopsie erfolgen kann. Gegenstand ist daneben auch die Verwendung dieser Wirkstoffe zur Prophylaxe von Tumor-erkrankungen.

Description

Verwendung von Selektin-bindenden
Schwangerschaftsproteinen, Liposomen, nativen Muzin-
Fragmenten und Mimikr -Verbindungen zur Behandlung und Prophylaxe von entzündlichen Erkrankungen, zur
Verhinderung der Metastasierung und zur Prophylaxe von Tumorerkrankungen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Selektin- bindenden Wirkstoffen, in Form von Schwanger- schaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, die Ca-bindende Verbindungen enthalten, von Muzin-Fragmenten, die aus natürlichen Quellen stammen oder abgeleitet sind, oder von Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ (sLe) imitieren, oder deren Kombinationen, zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, in deren Verlauf entzündliche Prozesse eine Rolle spielen, wie beispielsweise Autoi munerkrankungen, Transplantationen und Arteriosklerose. Entzündungserkrankungen im Sinne der Erfindung können infektiöser oder nichtinfektiöser Natur sein.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieser Wirkstoffe zur teilweisen oder vollständigen Verhinderung der Metastasierung von Tumoren, wobei die Gabe der Wirkstoffe prophylaktisch oder im Zusammenhang mit beispielsweise einer operativen Entfernung des Primärtumors oder einer Biopsie erfolgen kann. Gegenstand ist daneben auch die Verwendung dieser Wirkstoffe zur Prophylaxe von Tumorerkrankungen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe bezieht sich sowohl auf die Humanmedizin als auch auf die Veterinärmedizin.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel gemäß der Ansprüche 10-18, die diese Wirkstoffe beinhalten.
Aus der Literatur ist bekannt, dass Peptide und Liposomen mit sialylierten Lewis x- oder sialylierten Lewis a- Kohlenhydrat-Liganden (sLex oder sLea) die Adhäsion von Leukozyten oder Tumorzellen an E- oder P-Selektine (Oberflächenproteine, die von aktivierten vascularen Endothel- zellen exprimiert werden) hemmen [vgl. z.B. Sh. A. DeFrees et.al., J. Am.Chem. Soc . 118 (1996), 6101-6104; R. Stahn et al., Glycobiology Vol. 8, No. 4 (1998), 311-319]. Lewis- Kohlenhydrat-Strukturen binden an die Lektindomäne dieser Selektine und hemmen damit die Zelladhäsion aus dem Blutström. Es ist weiterhin bekannt, dass eine bessere Blockade der Selektine z.B. mit di- und trivalenten sLex- Peptiden [ (sLex) 2-Peptiden und (sLex) 3-Peptiden] und mit sLex-Liposomen, die mehrere Lewis-Kohlenhydratreste als Bestandteil der Membran aufweisen, erreicht werden kann. Die Multivalenz dieser Kohlenhydrat-Selektin-Bindungen bewirkt eine verbesserte Hemmung der Adhäsion von Zellen an das/die Selektin(e) .
In der Literatur wird auch beschrieben, dass sLea-oder sLex-tragende Muzine an E-Selektin binden und die Leukozytenadhäsion oder die Adhäsion von Tumorzellen an E- Selektin hemmen [K. Zang et al . , Tumor Biology 18 (1997), 175-187); T. Sawada et al . , Int. J. Cancer 57 (1994), 901- 907] . Bei den Muzinen handelt es sich um hochmolekulare Glykoproteine . Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, alternative Verbindungen aufzufinden, die die Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktiviertes Endothelzellgewebe der Blutgefäße hemmen oder Verbindungen aufzufinden, die eine effektivere Hemmwirkung zeigen, indem sie spezifischer und mit höherer Affinität an aktiviertes Endothelzellgewebe binden als die im Stand der Technik bisher beschriebenen Inhibitoren. Die Verbindungen sollen als Wirkstoffe zur Prophylaxe und Therapie entzündlicher Erkrankungen und von Tumorerkrankungen geeignet sein.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass humane oder tierische Schwangerschaftsproteine äußerst effiziente Inhibitoren der Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktiviertes Gefäßendothel sind. Diese Funktion ist neu und wird im weiteren als Aktivität im Sinne der Erfindung bezeichnet. Sie binden spezifisch und hochaffin an Selektine .
Im Sinne der Erfindung werden als Schwangerschaftsproteine solche eingesetzt, die während der Schwangerschaft von der Plazenta gebildet werden. Solche Proteine sind insbesondere die humanen Schwangerschaftsproteine, vorzugsweise gonadotrope Hormone, wie z.B. FSH (Folikel stimulierendes Hormon) , LH (Luteinisierendes Hormon) hCG (humanes Choriogonadotropin) , oder -Fetoprotein, Transferrin, Glycodeline, insbesondere Glycodelin A (PP 14) oder deren Fragmente . Gemäß der Erfindung können die aus humanem oder tierischem Fruchtwasser oder Serum oder Urin isolierten Proteine und Glykoproteineeingesetzt werden sowie synthetisch hergestellte Proteine oder Teilpeptide, die entsprechend glykosyliert sein können und die gleichen Eigenschaften wie die während der Schwangerschaft von der Plazenta gebildeten nativen Proteine haben. Die funktionelle Wirkung der Schwangerschaftsproteine im Sinne der Erfindung wird auf eine besondere, bisher für diese Proteine nicht bekannte Glykosylierung zurückgeführt. In den Beispielen wird das Schwangerschaftsprotein ppl4 beschrieben und gezeigt, dass ppl4 aus dem Urin, Serum und dem Fruchtwasser Schwangerer eine vergleichbare Aktivität im Sinne der Erfindung hat und eingesetzt werden kann.
Andere Schwangerschaftsproteine, die aus unterschiedlichen Quellen gewonnen sind, haben [wie in den Beispielen 1, 2 und 4 für hCG, Transferrin und α-Fetoprotein (Tabelle 1 und Tabelle Beispiel 4) gezeigt] überraschenderweise unterschiedliche hohe Aktivitäten im Sinne der Erfindung. So hat im Sinne der Erfindung hCG und α-Fetoprotein aus dem Serum Schwangerer eine hohe und aus dem Fruchtwasser die höchste Aktivität, während das urinäre hCG Schwangerer aufgrund einer geringen Aktivität im Sinne der Erfindung nicht geeignet ist. Nur aus dem Fruchtwasser gewonnenes Transferrin ist im Sinne der Erfindung der Erfindung aktiv.
Die Proteine können auch aus schwangerschaftsassoziierten Zellkulturen, die sich von der Plazenta ableiten, wie beispielweise Trophoblastenkulturen, die nicht verändert wurden oder die durch Anreicherung, Stimmulation mit Hilfe geeigneter Moleküle und/oder Transfektion geeigneter Gene, die die gewünschten Schwangerschaftsproteine oder Teile dieser, einschließlich der geeigneten Glykosylierungen, exprimieren, gewonnen werden. Beispielsweise hCG, das aus Throphoblasten-Zellkulturen/Zellinien isoliert wird, ist für den erfindungsgemäßen Einsatz geeignet.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Schwangerschaftsproteine können auch an geeignete biologische oder chemische Trägermoleküle oder Partikel, wie beispielsweise Proteine, Bakte- riophagen oder Liposomen, vorzugsweise Ca-komplexierende Verbindungen enthaltende Liposomen, gekoppelt sein. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Liposomen, die an Selekin binden und Ca-bindende Verbindungen, insbesondere EDTA, enthalten und die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ in Form von Glycolipi- den, Glycoproteinen oder Glycopeptiden als Bestandteil der Liposomenmembran tragen, zur effizienten Hemmung der Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktiviertes Endothelzellgewebe der Blutgefäße eingesetzt. Die erfindungsgemäßen eingesetzten Liposomen liegen bevorzugt als ein- oder mehrschichtige Vesikel vor und bestehen aus einem Ba- sislipid, vorzugsweise Phosphatidylcholin, und dem Anker- lipid, vorzugsweise Phosphatidylethanolamin, und enthalten als zusätzliche Wirkkomponente eine Ca-bindende oder Ca- komplexierende Verbindung, z.B. Ethylendiamintetraessig- säure (EDTA) . An das Ankerlipid ist der Kohlenhydratligand beispielsweise über einen Spacer, der eine Polyethylen- glykolkette, ein Peptid oder eine Alkylgruppe sein kann, gebunden. Vorzugsweise findet hierfür sLex-polyethylengly- koll2000-distearylphosphoethanolamin Verwendung. Als zusätzliche Membrankomponenten kommen Ladungsträger wie Diacetyl- phosphat und Membranstabilisatoren wie Cholesterol in Betracht .
Die Herstellung derartiger Glycoliposomen ist dem Fachmann bekannt .
Erfindungsgemäß können auch Liposomen, die Ca-bindende Verbindungen enthalten und Antikörper, Antikörper-Fragmente, Peptide oder andere Proteine oder deren Fragmente, z.B. Schwangerschaftsproteine tragen, welche an Selektin binden, eingesetzt werden. Ebenso können Liposomen, die Ca-bindende Verbindungen enthalten und Mimikry-Verbindungen tragen, die sLe-Strukturen imitieren, verwendet werden. Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen Liposomen eine beträchtlich höhere Hemmwirkung als die in der Literatur beschriebenen „leeren 'Glycoliposomen. So zeigen beispielsweise EDTA-Glycoliposomen gemäß Beispiel 4 eine um ein vielfaches gesteigerte Hemmwirkung der Tumorzellbindung im Vergleich zu Glykoliposomen der gleichen Zusammensetzung, jedoch ohne eingeschlossene EDTA.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden niedermolekulare Fragmente von Muzinen aus natürlichen Quellen, z.B. körpereigenen Flüssigkeiten oder Zellkulturen, zur Hemmung der Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktivierte Endothelzellen eingesetzt.
Da es sich bei den Muzinen um hochmolekulare Glykoproteine handelt, die immunologische Reaktionen auslösen können, ist ihre Verwendung als Adhäsionsblocker in der Klinik problematisch. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen niedermolekularen Fragmente, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ aufweisen, und aus natürlichen Muzinen hergestellt werden, können diese Probleme vermieden werden. Die niedermolekularen Fragmente zeigen überraschenderweise eine bessere Hemmung als die in der Literatur beschriebenen Muzine .
Die, erfindungsgemäße Muzinfragmente werden beispielsweise durch enzymatischen Anbau hergestellt . Alternativ können die erfindungsgemäßen Muzinfragmente auch synthetisch hergestellt werden.
Die Herstellung derartiger Muzinfragmente durch enzymatischen Abbau ist dem Fachmann bekannt, ebenfalls die Synthese der Fragmente einschließlich entsprechender Glykosylierungen. Erfindungsgemäß können die Muzine auch an geeignete biologische oder chemische Trägermoleküle oder Partikel, wie beispielsweise Proteine, Bakteriophagen oder Liposomen, vorzugsweise Ca-komplexierende Verbindungen enthaltende Liposomen, gekoppelt sein.
Die Aufgabe der Erfindung wird in einer weiteren Ausführungsform durch die Verwendung von Verbindungen gelöst, die die KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren (sogenannte Mimikry-Verbindungen) , und mit hoher Spezifität und Affinität an Selektine binden und mit Hilfe von Molekülen gewonnen werden, die die KohlenhydratStruktur vom Lewis Typ erkennen. Solche Verbindungen können beispielsweise lineare oder zirkuläre Peptide, Antikörper oder Antikörperfragmente oder andere Proteinstrukturen wie beispielsweise Protein- Scaffolds mit variablen Anteilen, die ähnlich wie Antikorperfragmente wirken, sein.
Mimikry-Verbindungen in Form von Mimikry-Peptiden, Antikörpern, Antikorperfragmenten, Proteinen mit variablen Anteilen werden hergestellt, indem man:
a. mit der Hybridomtechnik mit Hilfe von Substanzen, die Kohlenhydrate vom Lewis Typ spezifisch erkennen (z.B. Antikörper oder Lektine, die keine Selektine sind) , monoklonale Antikörper, die die kohlenhydrat-bindenden Regionen dieser Substanzen binden und somit die
' Kohlenhydrate vom Lewis-Typ imitieren, herstellt bzw. selektionert,
b. aus genomischen. Hybrid-, semisynthetischen oder synthetischen Antikδrper-Genbibliotheken sowie aus Genbibliotheken immunisierter oder nicht-immunisierter Spender beispielsweise mittels der Phagen-Display- Technik oder der Ribosomen-Display- echnik mit Hilfe von Substanzen, die Kohlenhydrate vom Lewis Typ spezifisch erkennen (z.B. Antikörper oder Lektine, die keine Selektine sind) , rekombinante Antikörperfragmente wie beispielsweise single-chain Antikörperfragmente (scFv) oder Fab Fragmente, die die kohlenhydrat- bindende Regionen dieser Substanzen binden und somit die Kohlenhydrate vom Lewis-Typ imitieren, herstellt bzw. selektioniert,
c. aus synthetischen Peptid-Genbibliotheken beispielsweise mittels Phagen-Display-Technik oder Ribosomen- Display-Technik mit Hilfe von Substanzen, die Kohlenhydrate vom Lewis Typ spezifisch erkennen (z.B. Antikörper oder Lektine) , lineare oder zirkuläre Peptide, die die kohlenhydrat-bindende Regionen dieser Substanzen binden und somit die Kohlenhydrate vom Lewis-Typ imitieren, herstellt bzw. selektioniert,
d. aus Protein-Genbibliotheken, die Proteine mit synthetischen oder semisynthetischen variablen Anteilen darstellen, beispielsweise mittels Phagen-Display- Technik oder Ribosomen-Display-Technik mit Hilfe von Substanzen, die Kohlenhydrate vom Lewis Typ spezifisch erkennen (z.B. Antikörper oder Lektine, die keine Selektine sind) , Proteine, die die kohlenhydrat- bindende Regionen dieser Substanzen binden und somit die Kohlenhydrate vom Lewis-Typ imitieren, herstellt bzw. selektioniert, und eine den Antikörpern, Proteinen oder Peptiden nach a-d oder geeigneten Teilpep- tiden oder abgeleiteten Peptiden, beispielsweise durch Zirkularisierung, Mutationen, in Form inverser oder retroinverser Peptide, oder repetitiven Konstrukten nach an sich bekannten Verfahren erzeugt . Erfindungsgemäß bevorzugt werden Mimikry-Verbindungen mit Hilfe eines sLex- oder eines sLea-spezifischen Antikörpers hergestellt, der das Kohlenhydrat sLex oder sLea als Mimikry-Molekül imitiert .
Die erfindungsgemäßen Mimikry-Verbindungen sind bisher weder als Substanzen an sich, noch für den erfindungsgemäßen Einsatz beschrieben. Sie verhindern effektiv die Bindung von Tumorzellen und Leukozyten an die Selektine und können somit zur Prophylaxe oder Therapie von entzündlichen Erkrankungen und Tumorerkrankungen eingesetzt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Mimikry-Verbindungen zum erfindungsgemäßen Einsatz an Liposomen gekoppelt, vorzugsweise an Liposomen, die Ca-komplexierende Verbindungen, wie beispielsweise EDTA, enthalten.
Wie bereits dargestellt, können die Mimikry-Verbindungen lineare oder zirkuläre Peptide sein, wobei die letzteren häufig eine höhere Serumstabilität aufweisen, oder alternativ die relativ stabilen inversen oder retroinversen Peptide. Auch Antikörper oder Antikörper-Fragmente, single- chain (scFv) oder Fab Antikörperfragmente werden erfindungsgemäß eingesetzt, wobei humane Antikörperfragmente den großen Vorteil haben, dass sie in der Regel keine I munant- wort gegen Maus- oder andere Fremdantikδrper induzieren, welche die Antikörper bindet und damit nach kurzer Zeit die Antikörper neutralisieren kann, weshalb die humanen Antikörperfragmente auch wiederholt eingesetzt werden können. Eine Tatsache, die für die Hemmung von Entzündungsreaktionen und die Verhinderung oder Verminderung von Metastasierungen von Vorteil ist. Auch andere Proteine finden Verwendung, bevorzugt mit einem Grundgerüst (Scaffold) eines humanen Proteins in Kombination mit variablen Abschnitten (z.B. Affibodies) , die im wesentlichen für das molekulare Mimikry verantwortlich sind. Eine Möglichkeit, diese Moleküle zu gewinnen, ist dabei eine Selektion der Moleküle mit Hilfe der Phagen-Display Technologie, indem man einen Antikörper gegen das sLex als Antigen verwendet und die Moleküle, die die kohlenhydrat- spezifische Bindungsstelle des Antikörpers binden, aus den entsprechenden Bibliotheken isoliert:
- Neben der Phagen-Display Technologie sind auch Ribo- somen-Display oder vergleichbare Technologien geeignet die Mimikry Moleküle zu gewinnen. Mimikry Moleküle auf Proteinbasis können auch mit Hilfe des molekularen Modelling konstruiert und durch molekular biologische Methoden rekombinant hergestellt werden. Mimikry Moleküle die nicht auf Proteinen basisieren können auch durch kombinatorische Chemie und/ oder molekulares Modelling gewonnen werden.
Bei den Bibliotheken handelt es sich beispielsweise um: Peptid-Bibliotheken, die lineare oder zirkuläre Peptide darstellen; um Antikörper-Bibliotheken, die synthetisch, semi-synthetisch oder aus humanem Material gesunder Spender oder Patienten hergestellt werden; Bibliotheken, die ein Scaffoldprotein mit ran- domisierten variablen Regionen darstellen, wie beispielsweise den Affibodies.
- Neben sLex-spezifischen Mausantikörpern können für die Gewinnung von Mimikry-Strukturen auch Lektine, andere Antikörper oder Antikörperfragmente humanen oder tierischen Ursprunges, die sLex, sLea oder andere Kohlenhydrate vom Lewis Typ erkennen, die für die Adhäsion der Tumorzellen oder Leukozyten an das aktivierte Endothel im Sinne des Patentes verantwortlich sind, verwendet werden. Die Gewinnung in den Selektionen kann dabei mit Hilfe einer spezifischen Elution durch einen großen Überschuß der entsprechenden Kohlenhydrate erfolgen, mit dem Vorteil die Versuchszeiten zu verkürzen. Zur Isolierung der Mimikry-Moleküle mit der höchsten Affinität ist es jedoch vorteilhaft keine spezifische Elution einzubauen.
Die Selektionen von Mimikry-Peptiden und humanen scFv- Antikörperfragmenten, die das sLex imitieren, sind in den Beispielen näher aufgeführt .
Die Mimikry-Moleküle haben mehrere Vorteile : die Herstellung von Kohlenhydraten ist sehr teuer und aufwendig; Mimikry-Peptide, denen eine Kohlenhydrat- modifikation fehlt, können dagegen schneller und günstiger synthetisch oder biologisch, beispielsweise durch molkeular biologische Methoden an Bakteriophagen gekoppelt, hergestellt werden; Antikörperfragmente und andere Proteine können schneller und günstiger rekombiant in Bakterien oder tierischen Zellen hergestellt werden.
Mimikry-Moleküle können eine höhere Affinität gegenüber den Selektinen aufweisen. Damit ist das Inhibie- rungspotential höher.
Um die Affinität weiter zu erhöhen, werden multimere Mimikry-Entitäten in Form von Molekülen oder Partikeln geschaffen: beispielsweise durch multiple Kopplung der Mimikry-Moleküle an Trägerproteine, wie beispielsweise HSA; multiple Expression der Mimikry-Moleküle als Fusionsproteine mit Bakterienhüllproteinen auf Bakteriophagen; durch Kopplung der Mimiky-Moleküle an Lipide und Einbau in Liposomen. Diese Moleküle oder Partikel mit multiplen Mimikry- Molekülen sind den ursprünglichen monomeren Kohlenhydraten vom Lewis-Typ in der gewünschten Inhibition der Zell- adhesionen in in vitro Tests analog zu den oben beschriebenen um Größenordnungen überlegen.
Erfindungsgemäß können die Mimikry-Verbindungen auch an geeignete biologische oder chemische Trägermoleküle oder Partikel, wie beispielsweise Proteine, Bakteriophagen oder Liposomen, vorzugsweise Ca-komplexierende Verbindungen enthaltende Liposomen, gekoppelt sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden vorteilhafterweise zur Inhibition der Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktiviertes Gefäßendothel Selektin- spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente eingesetzt, die an Liposomen gekoppelt sind, vorzugsweise an Liposomen, die Ca-komplexierende Verbindungen, wie beispielsweise EDTA, enthalten. Solche Antikörper sind bekannt. Als Antikörper kann z.B. der monoklonale, kommerziell angebotene Antikörper BBA2 der Firma R & D Systems eingesetzt werden. Es stellt für den Fachmann auch kein Problem dar, Selektin-spezifische Antikörper, herzustellen.
Analog kann die Inhibition der Zelladhäsion auch durch Peptide oder andere Proteine erreicht werden, die an Liposomen gekoppelt sind und gleichzeitig Ca-komplexierende Verbindungen enthalten.
Die Vorteile dieser Ausführungsform sind: eine Multimerisierung der Bindungen und dadurch eine Erhöhung der Affinität durch den Aviditätseffekt, der dazu führt, dass die Inhibition der die Lewis Typ Kohlenhydrate exprimierenden Tumorzellen oder Leukozyten an die aktivierten Endothelzellen um ein vielfaches verstärkt wird im Vergleich zu einzelnen Antikörpern es können direkt humane scFv oder Fab, die durch die oben beschriebenen Selektionstechniken aus den Antikδrperbibliotheken isoliert wurden und im Prinzip monomere Antikorperf agmente sind, eingesetzt werden. Der Vorteil hierbei ist die verringerte Immunreaktion gegen humane Antikorperfragmente, eine Integration in die Liposomenmembran. Durch eine laterale Beweglichkeit der bindungsfähigen Liganden in der Membran wird eine Anpassung an die Anordnung von Selektinen zur effektiven Bindung möglich. Dagegen können bei Ankopplung der Liganden an ein starres Gerüst (z.B. rigide Proteinstruktur) sterische Hinderungen auftreten, die eine Reduktion der Inhibitionseffektivität bewirken können,
Die vorstehend beschriebenen Verbindungen sind aufgrund ihrer beschriebenen Zelladhäsionshemmung als Wirkstoffe zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen, in deren Verlauf entzündliche Prozesse eine Rolle spielen, sehr gut geeignet . Dabei können die Verbindungen einzeln oder sich verstärkend in Kombinationen miteinander eingesetzt werden. Es ist selbstverständlich auch möglich, durch geeignete Formulierungen, beispielsweise durch Zusatz immunstimulato- rischer oder immuninhibitorischer Verbindungen, wie Lympho- kinen, Zytokinen, Chemokinen oder Adjuvantien, die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen noch zu verbessern.
Die Herstellung der auf diesen Wirkstoffen basierenden pharmazeutischen Mittel erfolgt nach üblichen, in der galenischen Technik bekannten Verfahren mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen. Insbesondere finden die erfindungsgemäßen Verbindungen Anwendung zur
a) Prophylaxe zur Verhinderung oder Minderung der Metastasierung in Risikosituationen wie beispielsweise bei Operationen von Tumoren oder Biopsien bei Tumorverdacht . b) Prophylaxe zur Verhinderung oder Minderung der Metastasierung im Falle eines Verdachtes auf Tumorerkrankung . c) Prophylaxe zur Verhinderung oder Minderung der Metastasierung im Falle einer Tumorerkrankung. d) Prophylaxe zur Verhinderung oder Minderung der Metastasierung im Falle eines operativen Eingriffs im Zusammenhang mit der Minimalen Residualen Tumorerkrankung . e) Behandlung von Autoimmunerkrankungen f) Verminderung von Gewebeschädigungen im Zusammenhang mit Operationen, Transplantationen, Ischämie und Reperfusion g) Behandlung von Erkrankungen im Frühstadium von Schwangerschaften h) Verminderung von atheriosklerotischen Gefäßveränderungen, wie z.B. Restenosen.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert, ohne sie auf diese Beispiele einzuschränken: Beispiel 1 :
Isolierung von Amnion- hCG und Testung der Fähigkeit zur Hemmung der Zelladhäsion am Beispiel der Inhibition der Bindung von HepG2—Hepatom-Zellen an E-Selektin und an aktivierten Endothelzellen aus der Vene humaner Nabelschnüre (HUVEC) .
Beispiel la; Isolierung von hCG aus dem Fruchtwasser
HCG wird vom Synzytiotrophoblasten nach der Implantation der befruchteten Eizelle gebildet und in den Blutkreislauf und das Fruchtwasser der Schwangeren sezerniert. Fruchtwasserproben aus der Chromosomenanalyse (500ml) werden gegen PBS dialysiert . 1 mg Maus itiAK Kaninchen anti human choriongonadotropin, DAKO (Kaninchen anti human choriogonadotropin, DAKO) , gerichtet gegen die ß- Untereinheit des hCG wird an die entsprechende Menge CNBr- Sepharose gebunden. Mit der erhaltenen anti hCG-Sepharose wird eine Chromatographiesäule gefüllt, die zur Immunadsorption von hCG dient. Mittels 100 mM Citratpuffer wird das hCG isoliert und weiter mittels FPLC durch Anionenaustauschchromatographie an Resource Q aufgereinigt . HCG besteht aus einer α- und einer ß- Untereinheit, neben dem intakten hCG werden vom Trophoblasten auch freie α- und ß-Ketten gebildet. Die freie ß-Kette macht etwa 2-3% des intakten hCG aus und erreicht wie dieses ein Maximum in der 10. Schwangerschaftswoche. Die freie α-Kette nimmt demgegenüber während der Schwangerschaft kontinuierlich zu und erreicht im 3. Trimenon das Maximum. Mit der Immunadsorptionssäule gerichtet gegen die ß-Kette des hCG werden so das Gesamtmolekül und freie ß-Ketten isoliert. Freie α-Ketten werden mit einer zweiten Antikörpersäule, beladen mit monoklonalen Antikörpern, die gegen α-Kette des hCG's gerichtet sind, isoliert. Mit Hilfe der Gelfiltration an Superdex 75 werden die freien ß-Ketten vom intakten Gesamtmolekül abgetrennt und isoliert . Die Reinheit der Präparation wird durch SDS-PAGE und Silberfärbung geprüft.
Beispiel lb; Durchführung des Adhäsionshemmtests
Nachfolgend beschriebener Adhäsionstest wird in vitro zur Testung der Wirkstoffe verwendet. Dazu wird entweder rekombinantes E-selektin an 96 well-Titerplatten immobilisiert, oder die Expression von E-Selektin auf aktivierten Endothelzellen aus der Vene humaner Nabelschnüre (HUVEC) durch Stimulation mit Cytokinen induziert. HUVEC Endothelzellen werden ebenfalls in 96 well-Mikrotiterplatten kultiviert .
E-Selektin (R & D Systems) (5/xg/ml) wird durch Inkubation über Nacht bei 4°C immobilisiert. Die Platten werden mit einem Kalzium-haltigen Phosphatpuffer (Ca-PBS) gewaschen und mit l%igem Rinderserumalbumin (RSA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Amnion-hCG (0, 005-lnMol/well) wird zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert . Dann werden lxl05 51Cr-markierte HepG2- Hepatom-Zellen, die an E-Selektin adhärieren, zugegeben und es wird für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert . Anschließend werden die ungebundenen Zellen durch 3maliges waschen mit Ca-PBS enfernt und die gebundenen Zellen nach Lyse mit 0,1N Natronlauge durch Radioaktivitätsmessung quantifiziert. Als Kontrollen werden die kohlenhydratbindende Domäne von E-Selektin blockierende monoklonale Antikörper BBA2 (R&D Systems) , EDTA zur Entfernung von Ca aus dem TestSystem und das selektiv, aber wenig affin bindende monovalente Tetrasaccharid Sialyl Lewis x (sLex) verwendet und in den Versuchsserien parallel mitge ührt .
HUVEC werden aus der Vene frischer humaner Nabelschnüre isoliert, bis zur 3. Passage verwendet und in 96 well Titerplatten zur Testung bis zur Konfluenz kultiviert. Durch Zugabe von 0,2 ng IL-lß [pro well wird die Expression auf HUVEC induziert. Sie erreicht nach 4 Stunden ein Maximum. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Adhäsions- test/Adhäsionshemmtest analog dem für immobilisiertem E- Selektin beschriebenen durchgeführt .
Tabelle 1 zeigt die Wirksamkeit von hCG isoliert aus verschiedenen Quellen in beiden TestSystemen. Es sind die IC 50-Werte (Hemmstoffkonzentration für 50%ige Adhäsionshemmung) angegeben.
Tabelle 1
Figure imgf000019_0001
Es wird deutlich, dass hCG aus Amnion, Serum und
Trophoblastkulturen, ni Lcc]ht aber aus Urin mindestens 104fach wirksamer sind als sLex.
Beispiel 2: Isolierung von HCG aus dem Serum und Testung analog Beispiel lb
HCG wird während der Schwangerschaft kontinuierlich in das Serum sezerniert. Im ersten Trimenon wird das Maximum erreicht. 500ml Serumpool von Schwangeren aus dem 1. Trimester werden 2x gegen H20 und anschließend gegen 20 mM NaH2P04 dialysiert. Die Isolierung des Serum hCG's erfolgt analog zur Isolierung des Amnion hCG's. Im Adhäsionshemmtest analog Beispiel lb wird eine etwa 3fach niedrigere Wirkung im Vergleich zum Amnion-hCG gemessen jedoch eine 104 fache Steigerung gegenüber dem monovalenten Tetrasaccharid sLex. Fig. 1 .zeigt die Inhibition der HepG2-Zelladhäsion in Abhängigkeit von der Serum- CG Konzentration.
Beispiel 3; Isolierung von Glycodelin A (Amnion- PP14) und Testung analog Beispiel lb
Die Vorreinigung von Glycodelin A aus Amnionflüssigkeit vollzieht sich im wesentlichen nach einer Vorschrift,, bei der die gepoolten Fruchtwasserproben gegen Wasser und anschließend 50 mM NH4HCO3 dialysiert werden. Dieses Produkt • wird an' einer DEAE-Sepharose-Säule chromatographisch aufgetrennt. Die Glycodelin A-haltige Fraktion wird an einer Superdex 75-Säule und anschließend an einer Oktyl- Sepharose-Säule weiter gereinigt. Nach dem hydrophoben Interaktionschromatograpieschritt an Oktyl-Sepharose wurde Glycodelin A an einer Resource-Phe Säule mit einem Iso- propanol/ Phosphatpuffergemisch als Lösemittel gereinigt.
Alternativ • kann Glycodelin A mit Hilfe der Immunadsorptionschromatographie gereinigt werden. Dazu werden 1 mg anti-Glycodelin A mAK (Maus anti human glycodelin, DNA Diagnostik Nord GmbH) an CNBr-Sepharose gebunden. , Das Material wird in eine 5 ml Chromatographiesäule gefüllt. Die so hergestellte Immunadsorptionssäule wird mit 500 ml gegen 20 mM Na2HP04 (pH 7.0) dialysiertes Fruchtwasser beladen. Glycodelin A wird mit 100 mM Citratpuffer eluiert. Die Reinheit der Präparation wird durch SDS-PAGE und Silberfärbung geprüft.
Im Adhäsionshemmtest analog Beispiel lb wird eine zum Amnion-hCG vergleichbare Effektivität gemessen. Diese Aktivität \ ist vergleichbar für ppl4 aus dem Urin und dem Serum Schwangerer und aus dem Fruchtwasser. Fig. 2 zeigt die- Inhibition der HepG2-Zelladhäsion an aktivierte HUVEC in Abhängigkeit von der Glycodelin A-Konzentration
Beis iel 4 ; Testun von Schwangerschaftsproteinen aus
Figure imgf000022_0001
Die Trophoblastenkulturlinie wurde käuflich erworben und nicht gentechnisch verändert. Die Isolierung erfolgt analog der Gewinnung der Schwangerschaftsproteine aus Beispielen 1 bis 3.
Beispiel 5; Herstellung und Testung von Glykoliposomen, die EDTA enthalten
Beispiel 5a;
Phosphatidylcholin, (PC; 7,44 mg), Sialy-Lewisx-polyethyl- englykoll2000-distearylphosphoethanolamin (sLex-Peg2000 DSPE; 1,26 mg) und Dimyristoyl-phosphatidylethanolamin (DMPE; 0,22 mg) werden als Chloroform-Lösung gemischt, das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene Lipidfilm nach eingehender Trocknung mit 1 ml EDTA-Lösung resuspendiert. Nach intensiven mehrstündigen Schütteln werden mehrschichtige Vesikel (MLV) erhalten, die nach mehrmaligem Waschen mit phosphatgepufferter, isotonischer Kochsalzlösung (PBS; pH 7.4) und anschließender Zentrifugation verwendet werden können.
Beispiel 5b;
MLV aus Beispiel 5a werden zur Herstellung von einschichtigen Vesikeln (SUN) beschallt, bis eine homogene Lösung mit einem mittleren Vesikeldurchmesser um 100 nm erreicht ist. Nach Zentrifugation (16000 g/10 min) wird der die Liposomen enthaltende Überstand abgetrennt und verwendet. Überschüssiges EDTA wird durch GelChromatographie (Sephadex G50) abgetrennt, die nachfolgende Größen- und Gehaltsbestimmung erfolgt wie in Beispiel 4a beschrieben, und ergibt eine Liposomenpopulation mit einem Durchmesser von 85 nm (PI 0,2) .
Beispiel 5c;
MLV aus Beispiel 5a werden zur Herstellung von einschichtigen Vesikeln (LUVET) in geeigneter Weise wiederholt extrudiert (z. Bsp. mit einem LiposoFast- Extrüder durch zwei Polycarbonat-Filter mit Porendurchmesser von 100 nm) , bis eine homogene Lösung mit einem mittleren Vesikeldurchmesser um 100 nm erreicht ist. Überschüssiges EDTA wird durch Gelchromatographie (Sephadex G50) abgetrennt. Der Gehalt an PC und PE wird mit der HPTLC bestimmt. Die Größenbestimmung mittels quasielastischer Lichtstreuungsmessung ergibt einen Durchmesser von 114 nm (PI 0,02). Der Gehalt an liposomalem PC beträgt etwa 85 % der eingesetzten MLV-Suspension. Beispiel 5d; Durchfühung des Adhäsionshemmtests mit EDTA- Glycolipsomen gemäß Beispiel 5c
In einer Mikrotiterplatte immobilisiertes E-Selektin (50 μl, mit 5μg/ml in Tris/Calzium-haltige Puffer) wird mit Liposomen aus Beispiel 5c versetzt, und anschließend mit 100000 MT3 Brustkrebszellen, die 51-Crom markiert waren, je well versetzt und für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die ungebundenen Zellen werden abgewaschen und die Zahl der gebundenen Zellen nach Lyse mit NaOH über die Radioaktivmessung quantifiziert. Die Tumorzellbindung wird zu 95,6 % gehemmt. Die Hemmung ist damit um 64 % gesteigert gegenüber Liposomen gleicher Zusammensetzung, jedoch ohne EDTA.
Beispiel 5e:
1 x 10 s HUVEC-Zellen werden mit TNF α stimuliert und nach 4 Stunden/37°C mit Liposomen aus Beispiel 5c versetzt. Anschließend werden 100000 MT3 Brustkrebszellen, die 51- Crom markiert waren, je well zugegeben. Nach 1 Stunden bei 4°C werden die ungebundenen Zellen abgewaschen und die Zahl der gebundenen Zellen über die Radioaktivmessung nach NaOH- Lyse quantifiziert. Die Tumorzellbindung wird zu 61,6 % gehemmt. Die Hemmung ist damit um 37,8 % gesteigert gegenüber Liposomen gleicher Zusammensetzung, jedoch ohne EDTA.
Beispiel 6; Mimikry Moleküle
Herstellung von sLex-imitierenden humanen rekombinanten Antikörperfragmenten aus Antikörper-Genbibliotheken mit Hilfe der Phagen-Display-Technik
Es wurden zwei verschiedene synthetische Antikörper-Genbibliotheken verwendet, die humane Single-chain Antikörperfragmente (scFv) darstellen. Die eine Antikörper-Gen- bibliothek besteht aus mehr als 1010 Phagen mit jeweils verschiedenen Kombinationen der variablen Regionen der1 schweren und leichten Ketten humaner Antikörper mit zum Teil randomisierten hypervariablen Regionen, welche mit einem Peptidstück (Linker) verbunden sind und kovalent an ein Phagenhüllprotein (pIII) gebunden sind. Sie leitet sich aus einer anderen Antikörper-Genbibliothek ab (Griffiths,A. et al . , 1994, EMBO J. , 13: 3245-3260). Die zweite, kleinere Genbibliothek besteht aus scFv, die auf aktive Faltung der Antikörperfragmente vorselektioniert wurden. Die erste Bibliothek stammt aus dem Labor Dr.G.Winter und die zweite aus dem Labor Dr. I .Tomlinson (jeweils MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) . Die spezifischen Phagen wurden in 2-3 Runden selektioniert (Phagen-Panning) unter Verwendung der proteolytischen Selektionsmethode mit dem Helferphagen KM13 (Kristensen, P. und Winter, G., Folding & Design, 3:321, 1998). Als Antigen diente der gereinigte sLex-spezifische Mausantikδrper CSLEX1 (Becton Dickinson) . Es wurden 3μg des Antikörpers über Nacht bei 4°C und anschließend für 1 h bei RT an 200 μl anti-Maus-IgG- Dynabeads (Deutsche Dynal, Hamburg) gebunden. Die gewaschenen Beads wurden anschließend mit 30% FKS in Zellkulturmedium für 1 h bei RT blockiert und mit 5* 1012 Phagen der Antikörper- Bibliotheken 2.5 h bei RT inkubiert. Nach stringenten Waschschritten (bis zu 20 mal PBS/ 0.1% Tween20 und darauffolgend 20 mal PBS) wurden die scFv-Phagen, die die Bindungsstelle des Antikörpers binden durch 100μg/ ml sLex- Polyacrylamidkonjugate (Synthesome) spezifisch eluiert und anschließend mit Trypsin (proteolytische Selektionsmethode) behandelt. Alternativ wurden die scFv-Phagen ohne spezifische Elution durch sLex-Kohlenhydrate durch Trypsinbe- handlung (Proteolytische Selektionsmethode) direkt eluiert. Zwischen den Selektionsrunden wurden die eluierten Phagen in den Bakterien mit Helferphagen vermehrt und erneut selektioniert. Es wurden 2 bis 3 Selektionsrunden durchgeführt .
Identifizierung von Peptiden mit Hilfe einer Peptid- Genbibliothek, die sLex imitieren
Analog dem Beispiel zur Generierung von scFv Antikörperfragmenten wurde in mehreren Selektionsrunden aus verschiedenen eigenen Peptid-Genbibliotheken, die randomisierte Peptide unterschiedlicher Länge darstellen (7-12 Aminosäuren; mit und ohne flankierende oder multiple interne Cysteine, die eine Zirkularisation der Peptide über Schwefelbrückenbindungen ermöglichen; 01igino,L., et al . , J Biol Chem 272:29046, 1997) und die 106 bis 108 verschiedene kurze Peptide an das Phagenhüllprotein pIII gekoppelt besitzen, spezifisch bindende Peptide gewonnen. Die zirkulären Peptide haben dabei bekanntermaßen im Vergleich zu den linearen Peptiden eine höhere Stabilität und teilweise Affinität. Die Selektion und Testung erfolgte wie in der Generierung der Sialyl-Lewisx imitierenden scFv mit 3 Runden der Selektion.
Spezifitätstests der Mimikry-Peptide und Mimikry-scFv
Die selektionierten Peptide und Antikörper-Fragmente wurden in ELISA-Tests auf ihre Bindung an verschiedene sLex- spezifische Antikörper und E-Selektin sowie zur Kontrolle an andere IgM und IgG-Antikörper getestet. Hierfür wurden die an Phagen gekoppelte Formen der Peptide und Antikörper- Fragmente verwendet, die zuvor durch eine in 96-Well Platten durchgeführte Polyethylenglykol-Fällung gereinigt wurden. Die potentiellen Mimikry-Peptide und Mimikry-scFv wurden in ELISA-Inhibitionstests daraufhin untersucht, ob sie die Bindung der sLex-spezifischen Antikörper an Sialyl- Lewisx-Polyacrylamid spezifisch hemmen. Dabei wurde das Sialyl-Lewisx-Polyacrylamid (0,5 μg/Well) auf ELISA-Platten durch Antrocknen immobilisiert, und die Bindung der monoklonalen Antikörper durch die Mimikry-Peptide oder Mimikry-scFv in Form der synthetisierten Peptide oder gereinigten scFv alleine oder gekoppelt an Phagen konzentrationsabhängig inhibiert.
Beispiel 7
Inhibition der Bindung- von Tumorzellen an E-Selektin durch Mimikry-Peptide und Mimikry-scFv
In einer Mikrotiterplatte immobilisiertes E-Selektin (50 μl ,mit 5μg/ml in Tris/Calzium-haltigem Puffer) wird mit Bakteriophagen versetzt, die die Mimikry- eptide gemäß Beispiel 5 in Form von Fusionsproteinen mit dem Phagenhüllprotein pVIII in hoher nicht näher bestimmter 'Kopienzahl auf der Oberfläche der Bakteriophagen vorliegen haben, und anschließend mit 100000 MT3 Brustkrebszellen, die 51-Crom markiert waren, je well versetzt und für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die ungebundenen Zellen werden abgewaschen und die Zahl der gebundenen Zellen nach Lyse mit NaOH über die Radioaktivmessung quantifiziert. Die Tumorzellbindung ist je nach Mimikry-Peptid ähnlich den Versuchen mit den Glykoliposomen fast vollständig gehemmt.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Selektin- bindenden Wirkstoffen, in Form von Schwangerschaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, diCa-bindende Verbindungen enthalten, von Muzin-Fragmenten, die aus natürlichen Quellen stammen oder abgeleitet sind, oder von Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ (sLe) imitieren, oder deren Kombinationen, zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, in deren Verlauf entzündliche Prozesse eine Rolle spielen, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, Transplantationen und Arteriosklerose. Entzündungserkrankungen im Sinne der Erfindung können infektiöser oder nichtinfektiöser Natur sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Selektin-bindenden Schwangerschaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, die an Selektin binden und Calcium-bindende Verbindungen enthalten, von Muzin-Fragmenten, die aus natürlichen Quellen stammen oder davon abgeleitet sind oder Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren, oder deren Kombinationen, zur Hemmung der Adhäsion von Zellen aus dem Blutstrom an aktiviertes Endothelzellgewebe der Blutgefäße.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
EDTA-enthaltende Liposomen verwendet werden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass
Liposomen eingesetzt werden, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ als Bestandteil der Liposomenmembran tragen.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass
Liposomen eingesetzt werden, die Antikörper, Antikörper-Frangmente, Petpide oder andere Proteine, tragen, die Selektin binden.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Liposomen eingesetzt werden, die Selektin- bindende Schwangerschaftsproteine tragen.
6. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass
Liposomen eingesetzt werden, die Mimikry-Verbindungen tragen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren.
7. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Schwangerschaftsproteine gonadotrope Hormone, - Fetoprotein, Transferrin, Glycodeline, oder deren Fragmente eingesetzt werden.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Hemmung der Adhäsion von Tumorzellen oder Leukozyten.
9. Verwendung von Selektin-bindenden Schwangerschaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, die an Selektin binden und die Calcium- bindende Verbindungen enthalten, von Muzin-Fragmenten, die aus natürlichen Quellen stammen, oder davon abgeleitet sind oder Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren, oder deren Kombinationen, zur Behandlung und Prophylaxe von entzündlichen Erkrankungen.
10. Verwendung von Selektin-bindenden Schwangerschaftsproteinen oder deren Fragmenten, von Liposomen, die an Selektin binden und die Calcium- bindende Verbindungen enthalten, von Muzin-Fragmenten, die aus natürlichen Quellen stammen, oder davon abgeleitet sind oder Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren, oder deren Kombinationen, zur teilweisen oder vollständigen Verhinderung der Metastasierung oder zur Prophylaxe von Tumorerkrankungen.
11. Pharmazeutisches Mittel, umfassend als Wirkstoff ein oder mehrere Selektin-bindende Schwangerschaftsproteine oder deren Fragmente sowie pharmazeutisch übliche Hilfsstoffe.
12. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwangerschaftsproteine gonadotrope Hormone, α- Fetoprotein, Transferrin, Glycodeline, oder deren Fragmente sind.
13. Pharmazeutisches Mittel umfassend als Wirkstoff Liposomen, die an Selektin binden und Calcium-bindende Verbindungen enthalten, sowie pharmazeutisch übliche Hilfsstoffe.
14. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen EDTA enthalten.
15. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen als Bestandteil der Liposomenmembran sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ tragen.
16. Pharmazeutische Mittel auch Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Antikörper, Antikörper-Fragmente Peptide oder andere Proteine tragen, die Selektin binden.
17. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Selektin-bindende
Schwangerschaftsproteine tragen.
18. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Mimikry-Verbindungen tragen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren.
19. Pharmazeutisches Mittel, umfassend als Wirkstoff ein oder mehrere Fragmente von Muzinen, die aus nativen Quellen stammen oder davon abgeleitetet sind, sowie pharmazeutisch übliche Hilfsstoffe.
20. Pharmazeutisches Mittel, umfassend als Wirkstoff eine oder mehrere Mimikry-Verbindungen, die sialylierte KohlenhydratStrukturen vom Lewis-Typ imitieren, sowie pharmazeutisch übliche Hilfsstoffe.
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