WO2002036257A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung von lipidvesikeln - Google Patents

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WO2002036257A1
WO2002036257A1 PCT/EP2001/012595 EP0112595W WO0236257A1 WO 2002036257 A1 WO2002036257 A1 WO 2002036257A1 EP 0112595 W EP0112595 W EP 0112595W WO 0236257 A1 WO0236257 A1 WO 0236257A1
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WO
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lipid
line
phase
liquid phase
polar
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PCT/EP2001/012595
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Hermann Katinger
Karola Vorauer-Uhl
Andreas Wagner
Günter KREISMAYR
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Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the particularly gentle production of vesicles, in particular lipid vesicles, on a laboratory and industrial scale.
  • the invention further relates to the vesicles and vesicle preparations produced using this method.
  • vesicle preparations include both pure lipid vesicles, also called liposomes, as well as lipid vesicles that are labeled with cell-specific markers such as e.g. Antibodies or antibody fragments, in particular Fab 'and F (ab'), are equipped and are usually referred to as immunoliposomes, or lipid vesicles which are equipped with viral coat proteins or surface antigens, for example hemagglutinin, and are usually referred to as virosomes.
  • lipid vesicles have become known which contain both viral antigens and specific marker molecules in the vesicle membrane.
  • the vesicles generally contain an aqueous phase, which in the simplest case is pure water, aqueous buffer systems, e.g. PBS, or a physiological saline solution.
  • aqueous buffer systems e.g. PBS
  • a physiological saline solution e.g. water, aqueous buffer systems, e.g. PBS, or a physiological saline solution.
  • the vesicles usually contain one or more desired substances, for example a physiologically active substance, a medicinal substance, a special dye or else nucleic acid material.
  • lipid vesicles The simplest and most widespread category of lipid vesicles are the liposomes. They are mostly made up of phospholipids, which spontaneously form into membrane structures when dispersed in aqueous systems. Part of the aqueous system is enclosed by these structures during the vesicle formation. In practice, those liposomes are usually preferred whose vesicle membrane, like natural membranes, is designed as a lipid double layer (“bi-layer”). Since Bangham's first presentation of liposomes in 1964 (J. Mol. Biol. 1 3: 238-252, 1 965), a number of different liposome preparation techniques have been established.
  • Another method that uses spontaneous vesicle formation during the phase transition from organic to inorganic phase is the solvent injection method.
  • the "self-assembly" process spontaneous vesicle formation during the phase transition from organic to inorganic phase takes place during the injection of the lipids dissolved in an organic phase into a vigorously stirred aqueous (or other suitable polar) phase.
  • This method is very simple, but has the major disadvantage that very inhomogeneous and large liposomes are produced at higher lipid concentrations. This method was first described by Batzri and Korn (Biochimica et Biophysica Acta, 298: 1 01 5-1019, 1 973).
  • EP 253 619 describes a method according to the last-mentioned solvent injection method, in which an organic phase with dissolved lipids is injected under pressure into a high-speed homogenizer and is dispersed therein by vigorous stirring with strong turbulence in an aqueous phase, whereupon liposomes are formed.
  • One possible disadvantage of this method is that strong shear forces, cavitation and locally-temporarily very considerable temperature increases are generated in the homogenizer. Such effects can trigger oxidation reactions on unsaturated fatty acid residues as well as other undesirable reactions which at least damage lipids as well as substances or active substances that are sensitive to shear forces, oxidation or temperature, and in some circumstances can even make them unusable for further use.
  • WO 00/29103 also discloses a method in which lipid vesicles are generated from a lipid-containing and an aqueous liquid stream by means of suitable mixing devices and using high shear forces.
  • the present invention on the other hand, which essentially represents a further development of the solvent injection method, no longer has the disadvantages of the known methods, but instead permits the deliberate setting of a narrow size distribution of liposomes of a desired size with an extremely gentle production method.
  • the method according to the invention enables continuous operation and simple scaling up for the industrial production of sterile and / or pyrogen-free lipid vesicle preparations, but also scaling down for microproduction, ie the production of very small amounts of lipid vesicles, for example for the purpose of scientific research.
  • the object of the invention is to provide a process for particularly gentle production of lipid vesicles which can be reduced or enlarged, in particular continuously, on a production scale, which reproducibly delivers homogeneously distributed vesicle preparations and, in a preferred embodiment, allows the production of germ-free and / or pyrogen-free vesicle preparations.
  • the present invention also encompasses the liposomes that can be produced or produced using this method and the cosmetic or pharmaceutical products based on these liposomes and their use for cosmetic, medical and / or diagnostic purposes.
  • the polar, generally aqueous, phase is pumped from a storage container into a line system with one or more lines connected to it.
  • Each line through which the polar phase flows and leads away from the reservoir contains a predetermined one Place at least one, possibly several, very precisely designed, laterally arranged bores or openings that extend through the pipe wall and on the outside are connected to at least one, possibly several, feed pipes for pressure-controlled feeding of the lipid phase dissolved in a suitable solvent, in particular ethanol is or are.
  • the desired lipid structures are formed in the area where the two phases meet due to a controllably controllable "soap assembly" effect on vesicles of previously unattainable uniform size and narrow size distribution.
  • neither ultrasound nor a homogenizer are required for vesicle formation or for setting the desired vesicle size.
  • the filtration processes known from the prior art (“extrusion processes”) for setting a vesicle size that is as uniform as possible can also advantageously be replaced by the present invention.
  • the vesicle size and size distribution can be found According to the invention, this is mainly controlled by the dosing pressure: the higher the dosing pressure of the lipid phase supplied, the smaller the vesicles and the sharper or narrower the size distribution of the resulting lipid vesicles in the native lipid vesicle preparation, even at high lipid concentrations.
  • water-soluble active ingredients can be included in liposomes, but also those that are introduced in the organic phase and introduced into the aqueous system together with the lipids, such as those as described in EP 0 253 61 9 or US 5,834.01 6 are known.
  • the aqueous system can be water, physiological saline, PBS or any suitable buffer.
  • the substances presented in the organic, largely apolar phase are either fully or partially integrated into the lipid double membrane or are closely attached to it through lipophilic interactions. It is also possible to present the desired substances or active substances in both phases, that is to say both in the polar and in the organic, lipid-containing phase, and to load them with liposomes.
  • both discontinuous and continuous process control can be selected.
  • a predetermined volume of polar phase is circulated in the system, i.e. returned to the original vessel and loaded again with lipid-containing phase.
  • the polar solution is successively enriched with lipid vesicles.
  • the polar phase is not recirculated but, after the lipid-containing phase has been metered in and the spontaneous vesicle formation has taken place, it is collected as a vesicle suspension in an external collecting container.
  • the vesicle sizes or size distributions of both vesicle suspensions are not influenced by the different process modes.
  • polar buffer phase is placed in the external collecting container and, on the other hand, the usual amount of supplied lipid (and preferably also organic solvent) per volume unit flows past.
  • the polar / aqueous phase is increased by two to ten times.
  • the volumetric product yield (amount of liposomally incorporated, preferably active ingredient-containing, polar phase) can be increased in proportion to the amount of lipid phase supplied.
  • the liposomal substances to be incorporated are lipophilic and are introduced together with the lipids in the organic phase, a 100% or at least approximately 100% yield can also be achieved without recirculation, that is to say all or almost the total amount of the desired substance present, for example a drug, is later contained in the lipid vesicles.
  • vesicle sizes and size distributions described here were determined by means of flow cytometry, adapted according to Vorauer-Uhl et al., Cytometry 39 (2): 1 66-71 (2000). In contrast to conventional static or dynamic laser light scattering, this method measures the vesicles individually in a capillary system (10,000 - vesicles per measurement). This method enables reliable characterization of both homogeneous and heterogeneous vesicle populations.
  • the polar phase and the lipid-containing phase are transported separately from one another and fed to a phase crossing region, which is preferably designed in the form of a cross-flow module.
  • the lipid-containing phase flows into the likewise flowing polar phase via at least one laterally arranged opening in the line system of the polar phase, preferably within the cross-flow module.
  • the lipid vesicles formed when the two phases meet are either returned together with the polar (eg aqueous) phase into the starting container or conveyed on to a collecting container.
  • the lipid vesicles are formed spontaneously in the phase crossing area, ie in the area where the polar and lipid-containing phases meet.
  • the liquid flow is fed to the opening or the openings, at least as laminar as possible, preferably as laminar as possible.
  • the liquid in the crossover area of the phases is neither stirred nor is a homogenizer or other mechanical stirring or dispersing aid used.
  • the lipid-containing phase is fed into the polar / aqueous phase under relatively low pressure and thus with little eddy formation, the lipid phase presumably emerging from the line opening as a type of spray and interacting very rapidly with the polar phase.
  • the "soap assembly" process of the lipid vesicles can be controlled by regulating the inflow rates and flow rates of both the polar and the lipid-containing phase and by varying the metering pressure for feeding or "spraying" the lipid-containing phase. With increasing dosing pressure, the resulting lipid vesicles become smaller and at the same time their size distribution becomes narrower.
  • lipid vesicle preparations can be produced in different production scales - from experimental or laboratory sizes to industrial dimensions. Since the vesicle formation does not take place continuously in a stirred vessel, but in a core of the line system, preferably in the cross-flow module mentioned, the process parameters according to the invention keep the essential process parameters constant, such as the metering pressure of the lipid-containing phase, flow volume of the polar phase, and volume ratio between polar and lipid-containing ones Phase and lipid concentration of the lipid-containing phase, always
  • the throughput volume can also be flexibly adapted to different production requirements.
  • the manufacturing principle also allows the phase dispersion that arises in the phase crossing area, for example in the cross-flow module, to be at least partially circulated and, if necessary several times in succession, to be fed again to the phase crossing area and loaded with a lipid-containing phase.
  • Substances in the lipid vesicles can also be increased by increasing the volume fraction of the lipid-containing phase and introducing larger volumes of lipid-containing phase into the stream of the polar solution per unit of time. Downstream from the phase crossing area, the resulting phase dispersion can be diluted with a polar solvent, for example with the carrier medium of the polar phase, in order to increase the stability of the liposome preparation, if necessary.
  • a polar solvent for example with the carrier medium of the polar phase
  • the present invention also includes an apparatus for making lipid vesicles.
  • it consists of a first storage container for the polar phase and a separate second storage container for the largely apolar, lipid-containing phase; a collecting container for receiving the vesicle preparation produced; a line system which leads from the first storage container (polar phase) to the collecting container and which has at least one point on the or each line a defined, laterally arranged opening or bore for the entry of the lipid-containing phase; a further line system which leads from the second reservoir (lipid-containing phase) to at least one of these lateral openings or bores of the first line system; as well as means for generating the required liquid flows, flow profiles and pressures for the controlled transport of the phases and the resulting phase dispersion.
  • That part of the line system for the polar phase which has the at least one lateral opening and the associated part of the line system for the iipid-like phase are preferably located in a cross-flow module, which can be a technically prefabricated unit which can be easily and quickly connected as a connecting core can be integrated into the pipe system of the two phases. It is preferred that at least within this cross-flow module, the supply lines for the polar and lipid-containing phase consist of stable and chemically resistant material, for example made of stainless steel or hard plastic, and are connected to one another in a sealed and non-slip manner, for example by welding.
  • the first storage container can also act as a collection container, with at least part of the line system leading away from the storage container being circulated and re-opening into the storage container, so that at least part of the polar phase circulates and includes newly formed lipid vesicles is returned to the storage container / collecting container.
  • FIG. 1A shows a schematic illustration (in plan view) of a
  • Cross-flow module with a liquid line for the polar phase (shown vertically) and a side line for the lipid-containing one
  • Phase (shown horizontally); Flow directions are indicated by arrows; 1B shows a cross-sectional view of the cross-current module of FIG. 1A; 1 C shows a cross-sectional view of a cross-flow module with a T-shaped arrangement of the feed lines for the polar and lipid-containing phase;
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the device according to the invention for (eg continuous) operation without returning the polar phase or phase dispersion
  • Fig. 3 shows a schematic representation of the device of Fig. 2 for (e.g. discontinuous) operation with feedback of the polar
  • FIG. 4 shows size distributions of liposome preparations produced by the direct process without reflux (curve B) and by a circulating process (curve A) with recycling of the phase dispersion into the starting container and subsequent loading with it
  • Lipid phase (ordinate: percent of the lipid vesicle population; abscissa:
  • 6 shows size distributions of liposome preparations (10 ⁇ mol DPPC / ml polar phase), produced at different dosing pressures (0.3, 1.2 and 2 bar) of the lipid-containing phase (ordinate: percent of the lipid vesicle population; abscissa: diameter of the lipid vesicles in nm); 7 shows the size distributions within liposome preparations as a function of the ratio of the amount of lipid used (in ⁇ mol) per part by volume (in ml) of the polar phase (5, 10 and 20 ⁇ mol / ml) under otherwise constant conditions (ordinate: percent of Lipid vesicle population; abscissa: diameter of the lipid vesicles in nm); 8 shows the reproducibility of the vesicle size distribution under the same conditions for three test series (ordinate: percent of the lipid vesicle population; abscissa: diameter of the lipid vesicles in nm); 9 shows a comparison of
  • FIG. 1 1 shows the size distribution of the lipid vesicles in two liposome preparations, produced with cross-flow modules (250 ⁇ m bore) with a production volume of 0.3 L (curve A) and a production volume of 2.5 L (curve B).
  • Curve A percent of the lipid vesicle population
  • abscissa diameter of the lipid vesicles in nm
  • Fig. 1 2 shows flow / pressure curves of 92 vol.% Ethanol at 55 ° C
  • Fig. 1 3 shows flow rates of PBS as polar phase with different
  • Line diameters (6, 8 and 1 0 mm; pump: peristaltic pump type Ismatec SA0702).
  • Aqueous medium for example pure water, PBS (phosphate-buffered, physiological saline solution), physiological saline solution or another suitable and pharmaceutically acceptable solution are preferred as the carrier medium for the polar phase, both for cosmetic and for pharmaceutical preparations, in particular those for medical applications Buffers, optionally used with conventional additives such as preservatives, fragrances, dyes, and the like.
  • PBS phosphate-buffered, physiological saline solution
  • physiological saline solution or another suitable and pharmaceutically acceptable solution
  • Buffers optionally used with conventional additives such as preservatives, fragrances, dyes, and the like.
  • the carrier medium of the lipid-containing phase is preferably selected from those atoxic, pharmaceutically permissible, organic solvents or solvent mixtures which are well suited for dissolving the lipids or lipid mixtures selected for the respective intended use and any additional substances.
  • additional substances can be, for example, viral, fusogenic peptides such as influenza hemagglutinin, or cell-specific markers such as antibody fragments, or lipophilic active ingredients such as econazole and the like.
  • Lower alcohols (1-6 carbon atoms), such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, are suitable as preferred solvents.
  • the lipid vesicles of the present invention are not limited to certain lipids or lipid compositions. Depending on the intended use, they can contain simple and / or complex lipids, in particular phospholipids, glycolipids, derivatized lipids, other natural or synthetic lipids of a cationic, anionic and / or charge-neutral nature. Such lipids are known in the prior art. Lipoproteins or lipopolysaccharides can also be incorporated into the membrane of the lipid vesicles using the production method according to the invention. Membrane stabilizing agents such as cholesterol or cholesterol derivatives or polyethylene glycol and its derivatives can be added.
  • lipid vesicle as it is meant in the context of the present invention encompasses both pure lipid vesicles, also formed exclusively from lipids, also known as liposomes, as well as lipid vesicles, which contain cell-specific markers, for example cytokines, growth hormones, antibodies or Antibody fragments that are populated and often referred to as immunoliposomes, or lipid vesicles that are populated with viral proteins or antigens, for example hemagglutinin, and are usually referred to as virosomes.
  • lipid vesicles can contain both viral antigens and specific markers in the vesicle membrane.
  • “Native lipid vesicle preparation” is understood here to mean a lipid vesicle suspension which, under low-shear or low-shear force conditions, has only arisen directly and without the action of additional aids such as, for example, ultrasound or mechanical stirring or dispersing aids, by the collision of the polar and lipid-containing phases according to the invention, and with Exception of any subsequent dilution with a polar solvent - no further post-treatment, in particular no post-treatment to set a desired vesicle size or vesicle size distribution, has been subjected.
  • additional aids such as, for example, ultrasound or mechanical stirring or dispersing aids
  • “Desired substance” means any chemical substance or compound with which lipid vesicles can be loaded, the substance either adhering to the outside of the vesicle membrane and / or being integrated into the vesicle membrane and / or being enclosed in the interior of the lipid vesicles, and can be brought to a desired target location in vitro and / or in vivo with the aid of the lipid vesicles
  • This substance can be any test substance for, for example, scientific purposes, or a pharmaceutically active substance, an active pharmaceutical ingredient, a placebo, a substance for cosmetic purposes, a dye , a radioactive-labeled or fluorescent-labeled compound for therapeutic or diagnostic applications, or another chemical compound or mixture of chemical compounds.
  • FIGS. 1A, 1B and 1C The principle on which the invention is based, of the polar (eg aqueous) phase and the lipid phase meeting, is shown schematically in FIGS. 1A, 1B and 1C.
  • An internally hollow liquid line 2 which transports the organic lipid phase in the direction of the horizontal arrow, is connected to the outside of a likewise internally hollow liquid line 1, which transports the polar (aqueous) phase.
  • the line 2 can cross the line 1 (cross-current module), as shown schematically in Fig. 1 A and 1 B, or with its end face directly attached to the side wall of the line 1 tight and non-slip, z. B. welded, as shown in Fig. 1 C schematically.
  • the core of the present invention is a device for producing the lipid vesicles, as is shown by way of example in FIGS. 2 and 3.
  • a liquid line 2 lipid phase
  • a line 1 polar phase
  • they can also be arranged parallel to one another or else in a T-shape and connected to one another, as shown, for example, in FIG. 1C.
  • the two lines have at least one common opening 3, for example a bore, in the region of their common contact surface, which connects the interiors of the two lines 1 and 2 and allows the passage of liquid.
  • the lipid phase flowing through the line 2 is fed under moderate excess pressure of preferably 0.1 to 15 bar into the polar phase flowing past the opening 3.
  • the common opening 3 is arranged such that the organic liquid phase from the line 2 passes through the opening 3 transversely, preferably essentially perpendicularly, to the direction of flow of the polar liquid phase flowing in line 1 and, preferably in the form of a spray, into the the polar liquid phase flowing past the opening 3 can penetrate.
  • Essentially vertical means that the feeding or spraying of the lipid phase does not take place in or against the direction of flow of the polar phase, but at right angles to it, so that the lipid phase blocks the flow of the polar liquid phase from the side, So penetrated from the outer edge towards the center. It also means that if a spray characteristic is present, as shown schematically in Figures 1A to 1C, only a part of the sprayed lipid phase actually penetrates it at a right angle to the direction of flow of the polar phase, while the predominant part deviates more or less from it. In the area of the common opening 3, the lines 1 and 2 are free of additional devices, in particular free of stirring or dispersing aids.
  • FIG. 2 shows an example of an arrangement of the device according to the invention for carrying out a continuous or semi-continuous production process for lipid vesicles, without returning the vesicle suspension formed to the starting container. Since this type of production essentially consists of a single process step, namely the Merging the lipid phase and the polar phase, this process is also referred to below as a "one-step process”.
  • the polar phase is conveyed from a first reservoir 5 by means of a pump 6, which preferably operates with as little pulsation as possible and generates as little cavitation and shear forces as possible, through the liquid line 1 in the direction of the crossflow module 4 and further into the collecting container 7, the pump 6 between the reservoir 5 and the cross-flow module 4 is arranged.
  • the pump 6 is preferably set such that there is a laminar or approximately laminar flow in the line 1 between the storage container 5 and the collecting container 7 at least in the vicinity before and after the opening 3. It is also preferable to ensure that no air bubbles are trapped in line 1, which could reduce the yield of intact vesicles and thus the degree of inclusion of active ingredient from the polar phase.
  • the polar phase When flowing through the cross-flow module 4, the polar phase is loaded with the organic, lipid-containing phase, the lipid-containing phase being fed under pressure through the opening 3 essentially perpendicular to the direction of flow of the polar phase. It can be seen that the lipids already precipitate within the cross-flow module 4 and close to vesicles, enclosing a part of the polar phase including any substances dissolved therein.
  • the volumes and flow velocities of the lipid-containing and polar phases should preferably be coordinated with one another in such a way that unused excesses of one of the two phases are largely avoided.
  • the lipid-containing phase is pumped from a second reservoir 8 with a pump 9 through a filter 10 and a check valve or other pressure-blocking valve into an intermediate container 11.
  • the intermediate container 1 1 is connected to a pressure source 1 3 via an interposed filter 1 2, for example a pressure container which preferably contains an inert gas, for example nitrogen gas, under pressure and with the aid of which the lipid-containing phase from the intermediate container 1 1 can be regulated Valve is pressed in the direction of cross flow module 4.
  • the lipid-containing phase can be conveyed from the intermediate container 11 via the line 2 to the crossflow module 4 by means of a pump.
  • a controllable valve in line 2 is opened and the lipid-containing phase is pressed or pumped through opening 3 into line 1 and thus into the polar phase.
  • a sampling device 1 4 can also be provided downstream of the cross-flow module 4.
  • FIG. 3 shows the arrangement from FIG. 2 with a return of the phase dispersion created in the cross-flow module 4 into the first storage container 5 (circulating method). Downstream from the cross-flow module 4, at least part of the phase dispersion is branched off in front of the collecting container 7 by a lock 15, for example a valve, a slide, a clamp or the like, is returned to the first storage container 5 via a return line 1 ′ and by means of pump 6 again fed to the cross-flow module 4, where it is loaded again with the lipid-containing phase.
  • a lock 15 for example a valve, a slide, a clamp or the like
  • the device according to the invention can be operated germ-free and pyrogen-free according to known methods of sterile technology. It can be thermally or chemically sterilized, for example, and the starting materials (polar phase, lipid-containing phase, optionally compressed air or inert gas) can be fed to the respective storage containers 5, 8, the crossflow module 4 and the subsequent collecting container 7 via suitable sterile filter systems.
  • the native lipid vesicle preparations produced in this way then no longer need to be subjected to a further disinfection step.
  • the size distribution within the vesicle preparations is decisively influenced by two factors in the method according to the invention: on the one hand by the amount of lipid and / or solvent added to each volume part of the polar phase and on the other hand by the metering pressure. It can be seen from FIGS. 5 and 6 that by increasing the dosing pressure the average diameter of the lipid vesicles decreases and the size distribution within the vesicle population scatters less and is therefore more homogeneous. Under the process conditions of FIG. 6, for example, two thirds of all liposomes produced have a diameter of 100 to 200 nm.
  • the difference between the process conditions of FIG. 5 and FIG. 6 mainly consists in the amount of lipid used per unit volume of the polar phase .
  • 20 ⁇ mol lipid per ml polar phase was used, in FIG. 6, however, only 10 ⁇ mol / ml.
  • Increasing the dosing pressure not only increases the process efficiency, but also increases the spread of the vesicles generated (Fig. 5A) with an increased amount of lipid (per unit volume of the polar phase).
  • the penetration depth of the "spray" into the polar phase must be increased so that the observed, reproducible phenomenon can be derived from this.
  • comparative experiments have shown that the aforementioned lipid effect could not be eliminated by varying the flow rate of the polar phase.
  • the best values with regard to homogeneity of the vesicles were achieved, at least when using DPPC as the sole bilayer-forming lipid component, at lipid concentrations of 10 ⁇ mol / ml and below.
  • the metered volume of the organic phase in the case of ethanol is preferred so that the calculated final concentration of ethanol (when using ethanol with a purity> 90% by volume) in the vesicle dispersion present downstream of the crossflow module 4 10% by volume, preferably not exceeding 7.5% by volume.
  • Exceeding this final concentration can adversely affect the stability, homogeneity and size of the lipid vesicles formed in the collecting container 7.
  • degrees of inclusion of from 1 0 to 15% by weight of the total amount of the added macromolecule dissolved in the aqueous phase can be achieved under these conditions of the one-step process (without recycling).
  • the mixing ratio of the dosed lipid-containing phase to the polar phase flowing past is set to a value which is within the vesicle dispersion, for example by two to ten times, the preferred limit values of 7.5 vol.% Ethanol and 10 ⁇ mol lipid per 1 ml of the polar phase mentioned above , exceeds.
  • the highly concentrated vesicle suspension can then be diluted with a polar solvent, preferably the carrier medium of the polar phase, to the preferred final concentration of 7.5-1 0% by volume of ethanol, in order - if necessary - to ensure the stability and homogeneity of the preparation even for one ensure a longer period of time (e.g. for storage purposes).
  • the dilution can take place in line 1 downstream of the crossflow module, or only in the collecting container 7. It has been shown that the degree of inclusion, in particular for proteins, could be increased many times over in this way. Thus, by increasing the dosing volume of the lipid phase by a factor of three, a directly proportional increase in the degree of inclusion by approximately three times, for example from 10-1.5% by weight of recombinant h-SOD to 30-50% by weight of rh-SOD, was achieved become. An increase in the mixing ratio to five to ten times the limit values preferred in the non-modified process could result in a further increase in yield, so that a degree of utilization resulted which approximately corresponded to the theoretically possible. It is essential, however, that the lipid vesicles produced maintain the characteristic size distribution, as can be seen, for example, in FIG. 9, despite the increased mixing ratio, which was originally not to be expected or foreseen.
  • the mixing ratio can be increased by increasing the dosing pressure of the lipid phase and optionally additionally by increasing the diameter of the opening 3 and / or by increasing the number of openings 3. It is also possible to divide the inflow of the lipid phase and to connect two or more lines 2 to line 1 via contact areas with openings 3.
  • the experiments have shown that a change (enlargement) of the hole diameter of the opening 3 from, for example, 1 50 to 250 ⁇ m enables a massive increase in the throughput of the ethanolic phase (FIG. 1 2), but apparently no significant effects on the average size or Size distribution of the lipid vesicles entails (Fig. 10).
  • other diameters can also be used
  • Opening 3 can be selected. Diameters in the range of 50-1,500 ⁇ m have proven to be suitable. It is of course also possible, and particularly advantageous on a larger scale for production purposes, to divide the liquid flow of the polar phase and to provide two or more lines 1 so that the number of contact areas and openings 3 can be increased even further. In order to coordinate the volume flows and flow velocities of the polar and lipid-containing phases with one another, it is advantageous to measure the achievable flows depending on the pump setting and the selected line cross-sections in previous experiments and, as for example in Fig. 1 3 for a device on a laboratory scale, graphically. The process temperature for vesicle production is of course dependent on the chemical nature of the lipids used and on the possible thermal sensitivity of the substance to be enclosed. However, it is always above the phase transition temperature of the lipids used.
  • native vesicle preparations can be produced in a single process step, in which at least 60% of all lipid vesicles (FIGS. 4-1), possibly more than 70% (FIG. 6) of all lipid vesicles, have a desired, predeterminable diameter which is within a spread of at most 250 nm, preferably at most 1 00 nm.
  • the term "scattering width" means a size interval of the width mentioned, within which the diameters of these at least 60 or 70% of all vesicles are distributed, ie "scattering".
  • vesicle preparations can also be produced just as well, in which at least 60% or at least 70% of all vesicles have a diameter in the range from 500 to 600 nm (scattering range 100 nm) or 500 to 750 nm (scattering range 250 nm).
  • Example 1 Incorporation of recombinant human superoxide dismutase
  • rh-SOD in lipid vesicles
  • Recombinant human superoxide dismutase (rh-SOD) is a protein with a molecular weight of around 32,000 Daltons.
  • WO96 / 14083 reports in detail on the advantages of a liposomal encapsulation of this protein and the medical applications made possible by it. Since this protein is dissolved in the polar phase and does not interact with the lipid membranes, the rh-SOD is incorporated "passively".
  • the lipid composition in this case DPPC, cholesterol and stearylamine in a ratio of 7: 2: 1 ⁇ mol / ml
  • lipid mixtures as in this example, are more suitable for stable vesicle formation than the use of a single lipid component alone.
  • a mixture of bilayer-forming lipid e.g. DPPC, DOPC, DMPC
  • cholesterol and stearylamine was always used.
  • the lipid-containing organic phase (98 mg DPPC / ml ethanol) is pump-free in a cross-flow module through a bore with a diameter of 250 ⁇ m and a pressure of 1.5 bar by means of pressure overlay from the nitrogen gas bottle into the flowing polar phase (1 6 mg rh- SOD / ml PBS) and the vesicle dispersion formed is transferred to the collection container.
  • Silicone hoses are used as transport lines for the polar and for the lipid-containing phase.
  • the inner diameter of the hose line for conveying the polar phase from the storage container to the crossflow module and from the crossflow module to the collecting container is 1 0 mm, the one for the promotion of the lipid phase from the intermediate container to the cross-flow module is 1.6 mm.
  • a peristaltic pump of the Ismatec SA 0702 type is used as the pump for the transport of the polar phase, 999 is selected as the pump setting (see Fig. 1 3), corresponding to a pump output of 2600 ml / min with the hose diameter of 1 0 mm used; the lipid-containing phase is preferably pump-free to the cross-flow module by pressure superimposition using compressed air or inert gas, in this example using nitrogen gas.
  • Example 1 The procedure is as in Example 1, any deviations are listed in Table 1 below.
  • the experimental arrangement for the recirculation method corresponds to the device which is shown schematically in FIG. 3, that for the one-step method corresponds to the device according to FIG. 2.
  • the results are shown in Tables 1 and 4.
  • Table 1 Comparison of the vesicle size distribution in the one-step and recirculating procedure
  • the size distribution is almost identical in both cases, with more than 60% of all vesicles formed having a diameter of 100 to 200 nm.
  • Example 3 Influence of the dosing pressure of the lipid-containing phase on size
  • Example 1 Size distribution of the lipid vesicles Example 1 is repeated without rhSOD and with the following modifications:
  • the polar phase is circulated (recirculated).
  • Dosing pressures of 1.2 and 2.4 bar and 2.5 and 4.5 bar for the lipid-containing phase are compared with one another.
  • Table 2a Comparison of the vesicle size distribution of liposome batches (20 ⁇ mol lipid / ml polar phase) with different dosing pressures
  • Example 4 Influence of the dosing pressure of the lipid-containing phase on the size and size distribution of the lipid vesicles
  • Example 1 is repeated without rhSOD and with the following modifications:
  • the polar phase is circulated (recirculated).
  • Three experimental batches of the same lipid concentration are compared with one another, with dosing pressures of 0.3, 1.2 and 2.0 bar being tested for feeding the lipid-containing phase into the polar phase.
  • the polar phase contains a constant 200 ml of PBS
  • the lipid phase contains 1470 mg of DPPC in 1 5 ml of ethanol (92 vol.%)
  • Corresponding to 10 ⁇ mol DPPC (molecular weight of DPPC 734) per 1 ml of polar phase.
  • the lipid-containing phase is conveyed with the aid of a gear pump of the Gather P 1 51 33 type.
  • the results are shown in Table 3 and in FIG. 6.
  • Table 3 Size comparison of the vesicles from liposome batches (10 ⁇ mol lipid / ml polar phase) produced with dosing pressures of 0.3, 1.2, 2.0 bar
  • Example 5 Comparison of vesicle sizes from test batches with different lipid concentrations
  • Example 1 is repeated without rhSOD and with the following modifications:
  • the lipid-containing phase contains 734, 1 470 or 2940 mg DPPC, corresponding to the calculated concentrations of 5, 10 and 20 ⁇ mol DPPC per 1 ml polar phase.
  • the results are shown in Table 4 and Fig. 7.
  • Example 6 Reproducibility of the size distributions of lipid vesicles
  • Table 5 and Fig. 8 three separate vesicle preparations are shown, which were produced under identical conditions and in which almost the same size distributions of the lipid vesicles are present.
  • the vesicle preparations were prepared according to Example 1, but without rhSOD; Any deviations from this are listed in Table 5 below.
  • the polar phase is circulated (recirculated).
  • Example 7 Modified one-step process with increased dosing volume of the lipid phase and subsequent dilution of the resultant
  • Vesicle dispersion Example 1 is repeated with the following modifications: Using a device according to FIG. 2, two parts by volume (200 ml) of the polar phase (PBS) and in the storage container are container a volume part (1 00 ml) PBS presented. In the 100 ml PBS of the
  • Phase dispersion is passed into the collection container, where the
  • Table 6 Comparison of the vesicle size distribution in the one-step process with normal and increased dosing volume of the lipid phase per volume of the polar phase
  • Example 7a Modified single-stage process with increased dosing volume of the lipid phase and subsequent dilution of the vesicle dispersion formed.
  • Example 1 is repeated with the following modifications:
  • two, four or six parts by volume (200 ml, 400 ml or 600 ml) of the polar phase (PBS) are placed in the collecting container and one part by volume (100 ml) PBS is placed in the storage container.
  • 1,600 mg rh-SOD are dissolved in the 100 ml PBS of the storage container.
  • the flow rate of the polar phase is controlled so that the entire amount of lipid / ethanol solution is introduced into one part by volume (100 ml) of the polar phase.
  • phase dispersion resulting from the cross-flow module is passed on to the collection container, where the excess ethanol is immediately compensated for by the polar solvent PBS.
  • rh-SOD be 450 to 600 mg ( ⁇ 3 in lipid amount) included in the ⁇ lipid vesicles. This corresponds to an incorporation rate of 28 to 38%, based on the total amount of rh-SOD, or 40 to 45% for 5-fold and 55 to 60% for 7-fold dosing.
  • This method variant includes about 3, 5 or 7 times the amount of protein compared to the method according to Example 1.
  • the vesicle size distribution achieved with this method is shown in Table 6a below and in FIG. 9A.
  • Table 6a Comparison of the vesicle size distribution in the one-step process with normal and increased dosing volume of the lipid phase per volume of the polar phase
  • Example 8 Comparison of the vesicle size distribution depending on the hole size of the hole in the cross-flow module
  • Example 1 is repeated without rhSOD; Any deviations from this are listed in Table 7 below.
  • the polar phase is circulated (recirculated). The results are Fig. 10 and in
  • Table 7 reproduced. Table 7: Vesicle size comparison when using cross-flow modules with different bore diameters
  • the diameter of the metering opening in the cross-flow module does not appear to have any significant influence on the size and size distribution of the lipid vesicles produced. Further tests have shown that in particular bores with diameters in the range from 50 to 1,500 ⁇ m appear to be suitable for the purposes of the present invention. Smaller bore diameters are difficult to produce mechanically and are therefore less of an option.
  • Example 9 Comparison of the vesicle size distribution on the 0.3 and 2.5 liter scale Example 7 is repeated, 300 ml of polar phase being used in a first test batch (as in Example 7) and 2500 ml of polar phase being used in a second test batch under otherwise identical conditions become.
  • the lipid and ethanol concentrations correspond to those given in Example 7, with the liquid volume of the ethanolic lipid phase naturally also being higher by the same factor in the 2500 ml test batch (ie 1 87.5 ml).
  • Table 8 Vesicle size distribution when scaled up
  • Example 1 0 Determination of pressure / flow curves for the liquid phases
  • the flow (volume flow) of ethanol (92 vol.%) was measured at a temperature of 45 - 55 ° C through the supply line for the
  • Lipid phase or through the subsequent hole in the cross-flow module Lipid phase or through the subsequent hole in the cross-flow module.
  • a silicone hose with an internal diameter of 1.6 mm was used as the supply line from the pump to the cross flow module.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln, mit einer Leitung (1) für den Transport einer polaren Flüssigkeitsphase, einer Leitung (2) für den Transport einer lipidhältigen organischen Flüssigkeitsphase, einem Sammelbehälter (7) zur Aufnahme erzeugter Lipidvesikel, sowie Mitteln zur Förderung der Flüssigkeitsphasen durch die Leitungen (1) und (2), wobei die Leitung (1) mit ihrere Aussenseite an mindestens einer Stelle eine gemeinsame, flüssigkeitsdurchlässige Öffnung (3) vorhanden ist, die den Innenraum der Leitung (2) mit dem Innenraum der Leitung (1) verbindet. Leitungen (1) und (2) sind im Bereich der Öffnung (3) frei von Rühr- oder Dispergierhilfen. Die Erfindung bezieht sich weiters auf ein Verfahren zur schonenden Herstellung von Lipidvesikeln, worin die Lipidphase senkrecht zur Strömungsirchtung der polaren Phase unter Druck in diese eingespruht wird, worauf sich spontan und ohne Einwirkung von mechanischen Rühr- oder dispergierhilfen Lipidvesikel mit enger Grössenverteilung bilden.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR HERSTELLUNG VON LIPIDVESIKELN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur besonders schonenden Herstellung von Vesikeln, insbesondere Lipidvesikeln, im Labor- und Industriemassstab. Die Erfindung bezieht sich weiters auf die mit diesem Verfahren hergestellten Vesikel und Vesikelpräparationen.
STAND DER TECHNIK
Im Stand der Technik sind zahlreiche unterschiedliche Vesikelpräparati- onen bekannt. Sie umfassen sowohl reine Lipidvesikel, auch Liposomen bezeichnet, als auch Lipidvesikel, die mit zell-spezifischen Markern wie z.B. Antikörpern oder Antikörperfragmenten, insbesondere Fab' und F(ab') , bestückt sind und meist als Immunoliposomen bezeichnet werden, oder Lipidvesikel, die mit viralen Hüllproteinen oder Oberflächenantigenen, beispielsweise Hämagglutinin, bestückt sind und üblicherweise als Virosomen bezeichnet werden. Darüber hinaus sind auch Lipidvesikel bekannt geworden, welche sowohl virale Antigene als auch spezifische Markermoleküle in der Vesikelmembran enthalten. Die Vesikel enthalten im Allgemeinen eine wäss- rige Phase, die im einfachsten Fall reines Wasser, wässrige Puffersγsteme, wie z.B. PBS, oder eine physiologische Kochsalzlösung sein kann. Für pharmazeutische und medizinische Anwendungen einschliesslich diagnostischer Anwendungen enthalten die Vesikel jedoch zumeist eine oder mehrere gewünschte Substanzen, beispielsweise einen physiologisch aktiven Wirkstoff, einen Arzneistoff, einen speziellen Farbstoff oder auch Nukleinsäure- material.
Die einfachste und am weitesten verbreitete Kategorie von Lipidvesikeln sind die Liposomen. Sie sind zumeist aus Phospholipiden aufgebaut, die sich spontan zu Membranstrukturen formieren, wenn sie in wässrigen Systemen dispergiert Werden. Dabei wird ein Teil des wässrigen Systems von diesen Strukturen im Zuge der Vesikelbildung eingeschlossen. In der Praxis sind meist solche Liposomen bevorzugt, deren Vesikelmembran wie natürliche Membranen als Lipid-Doppelschicht ("bi-layer") ausgebildet ist. Seit der erstmaligen Präsentation von Liposomen durch Bangham 1964 (J.Mol. Biol. 1 3:238-252, 1 965) wurden eine Reihe von verschiedenen Liposomen-Präparationstechniken etabliert. Dazu gehören Verfahren, bei denen Lipide zusammen mit dem gewünschten Wirkstoff in einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel vermischt und anschliessend mit Ultraschall beschallt werden, wodurch sich Vesikel formieren. In anderen Verfahren, beispielsweise nach Stegman et al. (EMBO Journal 6:2651 -2659, 1987) wird das Lösungsmittel durch Dialyse oder mittels Microcarriern langsam entfernt, wobei sich ebenfalls spontan Vesikel ausbilden, die einen Teil der wässrigen Phase einschliessen.
Bekannte Hochdruckhomogenisations-, Microfluidizer- und Ultraschallverfahren zur Herstellung von Liposomen zeichnen sich durch Nutzung der im Prozess entstehenden Scherkräfte und Kavitationseffekte aus, um Lipidvesikel definierter Grosse zu erzielen. Kavitationseffekte führen lokal zu sehr hohen Drücken und Temperaturen. Liposomen, insbesondere ungesättigte Fettsäurereste der Lipide, können dadurch oxidativ geschädigt werden und damit ihre Stabilität verändern. Aus diesem Grund müssen solchen Verfahren Anti- oxidanzien oder andere schützende Ingredienzien zugesetzt und/oder das ganze Verfahren unter Ausschluss von Sauerstoff, beispielsweise in einer Stickstoffatmosphäre, durchgeführt werden, wie z.B. in EP 0 253 61 9 oder US 5,834,01 6 beschrieben. Die Herstellung der Lipidvesikel erfolgt in diesen Verfahren in mehreren Zyklen.
Weiters kann man durch sogenannte "Extrusion" grosse Volumina von Liposomen mit definierter Grosse herstellen. Bei der Extrusion werden vorgefertigte Lipidmembranstrukturen, beispielsweise im Handel erhältliche grosse ( > 500 nm) Liposomen, mit hohem Druck durch Membranen mit definierter Porengrösse gepresst und so auf den gewünschten Durchmesser eingestellt. Dabei müssen, ähnlich wie bei Hochdruckhomogenisation und Ultraschallmethoden mehrere Zyklen durchlaufen werden, um eine enge Grössenverteilung des Endprodukts zu erhalten. Ein möglicher Nachteil dieser Methode besteht in erheblichen Produktverlusten, die durch Aufbrechen und Wiederverschliessen der Vesikel im Zuge der Passage durch die Membranen entstehen. Produktverluste von weit über 50 Prozent können bei diesem
Verfahren durchaus vorkommen, wie eigene Vergleichsversuche gezeigt haben.
Eine andere Methode, die sich der spontanen Vesikelbildung beim Phasenübergang von organischer zu anorganischer Phase bedient, ist die Lösungsmittelinjektionsmethode. Der "self-assembly"-Prozess (spontane Anordnung der Lipide zu Vesikeln) findet während der mit einer feinen Nadel durchgeführten Injektion der in einer organischen Phase gelösten Lipide in eine kräftig gerührte wässrige (oder andere geeignete polare) Phase statt. Diese Methode ist sehr einfach, hat jedoch den grossen Nachteil, dass bei höheren Lipidkonzentrationen sehr inhomogene und grosse Liposomen produziert werden. Diese Methode wurde erstmals von Batzri und Korn (Biochimica et Biophysica Acta, 298: 1 01 5-1019, 1 973) beschrieben.
EP 253 619 beschreibt ein Verfahren nach der zuletzt genannten Lösungsmittelinjektionsmethode, bei dem eine organische Phase mit gelösten Lipiden unter Druck in einen Hochgeschwindigkeitshomogenisator injiziert und darin durch heftiges Rühren unter starken Turbulenzen in einer wässrigen Phase dispergiert wird, worauf Liposomen gebildet werden. Als möglicher Nachteil dieser Methode ist zu sehen, dass im Homogenisator starke Scher- kräfte, Kavitation und örtlich-temporär ganz beträchtliche Temperaturerhöhungen erzeugt werden. Durch derartige Effekte können Oxidationsreaktionen an ungesättigten Fettsäureresten sowie andere unerwünschte Reaktionen ausgelöst werden, die sowohl Lipide als auch Scherkraft-, oxidations- oder temperaturempfindliche Substanzen oder Wirkstoffe zumindest schädigen, unter Umständen sogar für die weitere Verwendung unbrauchbar machen können.
Ein ähnliches Verfahren wird auch in US 4,895,452 beschrieben, bei welchem multi- oder paucilamellare Vesikel in einer eigenen Mischkammer erzeugt werden, in welche die Flüssigkeitsströme der polaren und der lipid- hältigen Phasen tangential injiziert werden, um auf diese Weise möglichst hohe Scherkräfte und Durchmischung zu erzielen. Auch WO 00/29103 offenbart ein Verfahren, bei dem Lipidvesikel aus einem lipidhältigen und einem wässrigen Flüssigkeitsstrom mittels geeigneter Mischeinrichtungen und unter Einsatz hoher Scherkräfte erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung hingegen, welche im Wesentlichen eine Weiterentwicklung der Lösungsmittelinjektionsmethode darstellt, weist die Nachteile der bekannten Verfahren nicht mehr auf, sondern erlaubt bei extrem schonender Herstellungsweise das gezielte Einstellen einer engen Grössenverteilung von Liposomen einer gewünschten Grosse. Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren einen kontinuierlichen Betrieb sowie eine einfache Massstabsvergrösserung für die industrielle Produktion keimfreier und/oder pyrogenfreier Lipidvesikelpräparationen, aber auch eine Massstabsverkleinerung für die Mikroproduktion, d.h. die Produktion von Kleinstmengen von Lipidvesikeln, beispielsweise zum Zwecke der wissenschaftlichen Forschung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der Erfindung ist es, ein im Produktionsmassstab verkleiner- oder vergrösserbares, insbesondere kontinuierliches, Verfahren zur besonders schonenden Herstellung von Lipidvesikeln bereitzustellen, welches reprodu- zierbar homogen verteilte Vesikelpräparationen liefert und in einer bevorzugten Ausführungsform die Erzeugung keimfreier und/oder pyrogenfreier Vesikelpräparationen gestattet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die mit diesem Verfahren herstellbaren oder hergestellten Liposomen und die kosmetischen oder pharmazeutischen Produkte auf Basis dieser Liposomen sowie deren Verwendung zu kosmetischen, medizinischen und/oder diagnostischen Zwecken.
Anders als bei der bekannten Ethanol-lnjektionsmethode wird die polare, im Regelfall wässrige, Phase gemäss der vorliegenden Erfindung aus einem Vorratsbehälter in ein daran anschliessendes Leitungssystem mit einer oder mehreren Leitungen gepumpt. Jede von der polaren Phase durchströmte, vom Vorratsbehälter wegführende Leitung enthält an einer vorbestimmten Stelle mindestens eine, gegebenenfalls mehrere, sehr exakt ausgeführte, seitlich angeordnete Bohrungen bzw. Öffnungen, die durch die Leitungswand hindurchreichen und an der Aussenseite mit mindestens einer, gegebenenfalls mehreren, Zufuhrleitungen zur druckgesteuerten Einspeisung der in einem geeigneten Lösungsmittel, insbesondere Ethanol, gelösten Lipidphase verbunden ist bzw. sind.
Im Gegensatz zur klassischen Ethanol-Injektionsmethode gibt es bei der erfindungsgemässen Vorrichtung jedoch keine Injektionsnadel, welche in die wässrige Phase hineinreicht, sondern die mindestens eine Zufuhrleitung für die Lipidphase endet erfindungsgemäss an der mindestens einen Bohrung bzw. Öffnung des vom Vorratsbehälter wegführenden Leitungssystems für die wässrige Phase, sodass keine Turbulenzen oder Scherkräfte erzeugenden
Hindernisse oder Barrieren in das Innere der Leitungen hineinragen. Durch die druckgesteuerte Einspeisung der Lipidphase in die, vorzugsweise laminar, vorbeiströmende polare/wässrige Phase bilden sich im Bereich des Aufeinandertreffens der beiden Phasen die gewünschten Lipidstrukturen durch einen kontrolliert steuerbaren "seif assembly" Effekt zu Vesikeln bisher nicht erzielbar einheitlicher Grosse und schmaler Grössenverteilung aus.
Erstaunlicherweise und völlig unerwartet hat sich dabei ausserdem gezeigt, dass bei der erfindungsgemässen Methode weder höhere Lipidkon- zentrationen noch höhere Ethanolkonzentrationen die Vesikelbildung und die Verteilung der Vesikelgrössen zu beeinflussen scheinen. Dies steht in einem gewissen Widerspruch zur bestehenden Meinung der Fachwelt, dass die Vesikelformation von der Lipidkonzentration, der Ethanolkonzentration, den Strömungsgeschwindigkeiten der wässrigen und der organischen Phase sowie von der Rührgeschwindigkeit der Homogenisiervorrichtung abhängen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden weder Ultraschall noch Homogenisator zur Vesikelformation oder zur Einstellung der gewünschten Vesikelgrösse benötigt. Auch die aus dem Stand der Technik bekannten Filtrationsverfahren ( " Extrusionsverfahren") zur Einstellung einer möglichst einheitlichen Vesikelgrösse können durch die vorliegende Erfindung vorteilhaft ersetzt werden. Die Vesikelgrösse und Grössenverteilung lassen sich erfin- dungsgemäss nämlich vor allem über den Dosierdruck steuern: je höher der Dosierdruck der zugeführten Lipidphase, desto kleiner die Vesikel und desto schärfer bzw. enger ist die Grössenverteilung der entstandenen Lipidvesikel in der nativen Lipidvesikelpräparation, selbst bei hohen Lipidkonzentrationen. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich nicht nur wasserlösliche Wirkstoffe in Liposomen einschliessen, sondern auch solche, die in der organischen Phase vorgelegt werden und zusammen mit den Lipiden in das wässrige System eingebracht werden, wie beispielsweise solche, wie sie aus EP 0 253 61 9 oder US 5,834,01 6 bekannt sind. In diesen Fällen kann das wässrige System Wasser, physiologische Kochsalzlösung, PBS oder ein beliebiger, geeigneter Puffer sein. Die in der organischen, weitgehend apolaren, Phase vorgelegten Substanzen werden bei der Ausbildung der Lipidvesikel entweder ganz oder teilweise in die Lipiddoppelmembran integriert oder lagern sich durch lipophile Wechselwirkungen eng an diese an. Es ist auch möglich, in beiden Phasen, d.h. sowohl in der polaren als auch in der organischen, lipidhältigen Phase gewünschte Substanzen oder Wirkstoffe vorzulegen und damit Liposomen zu beladen.
Beim vorliegenden Verfahren kann sowohl eine diskontinuierliche als auch eine kontinuierliche Prozessführung gewählt werden. Bei der diskontinu- ierlichen Verfahrensweise wird ein vorgegebenes Volumen an polarer Phase im System zirkuliert, d.h. ins Ausgangsgefäss zurückgeführt und neuerlich mit lipidhältiger Phase beladen. Durch die Zufuhr der lipidhältigen Phase wird die polare Lösung sukzessive mit Lipidvesikeln angereichert. Beim kontinuierlichen Prozess wird die polare Phase nicht rezirkuliert sondern sie wird nach erfolgter Zudosierung der lipidhältigen Phase und der spontanen Vesikelbildung als Vesikelsuspension in einem externen Sammelbehälter aufgefangen. Die Vesi- kelgrössen bzw. Grössenverteilungen beider Vesikelsuspensionen werden durch die unterschiedlichen Verfahrensmodi nicht beeinflusst.
Eine Weiterentwicklung des kontinuierlichen Verfahrens besteht darin, dass einerseits polare Pufferphase im externen Sammelbehälter vorgelegt wird und andererseits die sonst übliche Menge an zugeführtem Lipid (und vorzugsweise auch an organischem Lösungsmittel) je Volumenseinheit vorbeiströmen- der polarer/wässriger Phase um das Zwei- bis Zehnfache erhöht wird. Dadurch kann die volumetrische Produktausbeute (Menge an liposomal inkorporierter, vorzugsweise wirkstoffhältiger, polarer Phase) proportional zur Menge an zugeführter Lipidphase gesteigert werden. Im Falle, dass die liposomal zu inkorporierenden Substanzen lipophil sind und zusammen mit den Lipiden in der organischen Phase vorgelegt werden, ist eine hundertprozentige oder zumindest annähernd hundertprozentige Ausbeute auch ohne Rezirkulierung erzielbar, d.h. die gesamte oder nahezu die gesamte Menge an vorgelegter gewünschter Substanz, beispielsweise eines Arzneistoffes, ist später in den Lipidvesikeln enthalten.
Die hierin beschriebenen Vesikelgrössen und Grössenverteilungen wurden mittels Flow-Cytometrie, adaptiert nach Vorauer-Uhl et al., Cytometrie 39(2) : 1 66-71 (2000), ermittelt. Bei dieser Methode werden, im Unterschied zur konventionellen statischen oder dynamischen Laser-Lichtstreuung, die Vesikel in einem Kapillarsystem einzeln vermessen (pro Messung 10.000 - Vesikel) . Durch diese Methode können sowohl homogene als auch heterogene Vesikelpopulationen zuverlässig charakterisiert werden.
Erfindungsgemäss werden die polare Phase und die lipidhältige Phase getrennt voneinander transportiert und einem Phasen-Kreuzungsbereich zugeleitet, der vorzugsweise in Form eines Kreuzstrommoduls ausgebildet ist. Das Einströmen der lipidhältigen Phase in die ebenfalls fliessende, polare Phase erfolgt über zumindest eine seitlich angeordnete Öffnung im Leitungssystem der polaren Phase, vorzugsweise innerhalb des Kreuzstrommoduls. Die beim Aufeinandertreffen der beiden Phasen entstehenden Lipidvesikel werden zusammen mit der polaren (z.B. wässrigen) Phase entweder in den Ausgangsbehälter zurückgeführt oder in einen Sammelbehälter weiterbefördert. Die Formierung der Lipidvesikel erfolgt spontan im Phasenkreuzungsbereich, d.h. im Bereich des Aufeinandertreffens der polaren und der lipidhältigen Phasen. Um unerwünschte Kavitationseffekte und/oder Scherkräfte sowie damit einhergehende örtliche Temperaturerhöhungen weitestgehend zu vermeiden, wird der Flüssigkeitsstrom zumindest der polaren Phase vorzugsweise möglichst laminar der Öffnung bzw. den Öffnungen zugeleitet. Bei besonders empfindlichen Substanzen oder Substanzgemischen kann es von Vorteil sein, auch flussabwärts vom Kreuzungsbereich der Phasen ein scherkraftarmes Fliessverhalten der entstandenen Phasendispersion anzustreben. Im Gegensatz zu den bekannten Lipid/Ethanol-Injektionsmethoden wird gemäss vorliegender Erfindung die Flüssigkeit im Kreuzungsbereich der Phasen weder gerührt noch wird ein Homogenisator oder eine sonstige mechanische Rühr- oder Dispergierhilfe eingesetzt. Die Einspeisung der lipidhältigen Phase in die polare/wässrige Phase erfolgt unter relativ niedrigem Druck und somit mit geringer Wirbelbildung, wobei die Lipidphase vermutlich als eine Art Sprühnebel aus der Leitungsöffnung austritt und sehr rasch mit der polaren Phase in Wechselwirkung tritt. Durch Regelung der Zuflussraten und Fliessgeschwindigkeiten sowohl der polaren als auch der lipidhältigen Phase und durch Variation des Dosierdrucks zum Einspeisen bzw. "Einsprühen" der lipidhältigen Phase ist der "seif assembly"-Prozess der Lipidvesikel steuerbar. Mit steigendem Dosierdruck werden die entstehenden Lipidvesikel kleiner und gleichzeitig wird deren Grössenverteilung enger.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung sind Lipidvesikelpräparationen in unterschiedlichen Produktionsmassstäben - von Versuchs- bzw. Laborgrössen bis zu industriellen Dimensionen - herstellbar. Da die Vesikelbildung nicht in einem gerührten Gefäss, sondern in einem Kernstück des Leitungssystems, vorzugsweise in dem erwähnten Kreuzstrommodul, kontinuierlich stattfindet, werden bei erfindungsgemässer Herstellung unter Konstanthaltung der wesentlichen Prozessparameter wie Dosierdruck der lipidhältigen Phase, Strömungsvolumen der polaren Phase, Volumsverhältnis zwischen polarer und lipidhältiger Phase und Lipidkonzentration der lipidhältigen Phase, immer
Präparationen von einheitlicher und reproduzierbarer Qualität hinsichtlich Produkteinschlussrate, Vesikelgrösse und Vesikelgrößenverteilung produziert, unabhängig vom gewählten Produktionsmassstab. Mit der Wahl entsprechender Leitungsquerschnitte und/oder einer Erhöhung der Zahl und/oder des Durchmessers der Öffnung(en) im Leitungssystem der polaren Phase kann ausserdem das Durchsatzvolumen flexibel an verschiedene Produktionsvorgaben angepasst werden. Das Herstellungsprinzip erlaubt es auch, die im Phasenkreuzungsbereich z.B. im Kreuzstrommodul, entstehende Phasendispersion zumindest teilweise im Kreis zu führen und, gegebenenfalls mehrmals hintereinander, erneut dem Phasenkreuzungsbereich zuzuführen und mit lipidhältiger Phase zu beladen. Die Einschlussrate (Ausnutzungsgrad) der in der polaren Phase gelösten
Substanzen in die Lipidvesikel kann auch dadurch gesteigert werden, dass man den Volumensanteil der lipidhältigen Phase erhöht und pro Zeiteinheit grössere Volumina lipidhältiger Phase in den Strom der polaren Lösung einbringt. Stromabwärts vom Phasenkreuzungsbereich kann die entstandene Phasendispersion mit einem polaren Lösungsmittel, beispielsweise mit dem Trägermedium der polaren Phase, verdünnt werden, um - falls erforderlich - die Stabilität der Liposomenpräparation zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln. Sie besteht im Prinzip aus einem ersten Vorrats- behälter für die polare und einem davon getrennten, zweiten Vorratsbehälter für die weitgehend apolare, lipidhältige Phase; einem Sammelbehälter zur Aufnahme der erzeugten Vesikelpräparation; einem Leitungssystem, welches vom ersten Vorratsbehälter (polare Phase) zum Sammelbehälter führt und welches an mindestens einer Stelle der bzw. jeder Leitung eine definierte, seitlich angeordnete Öffnung oder Bohrung zum Eintritt der lipidhältigen Phase aufweist; einem weiteren Leitungssystem, welches vom zweiten Vorratsbehälter (lipidhältige Phase) zu mindestens einer dieser seitlichen Öffnungen bzw. Bohrungen des ersten Leitungssystems führt; sowie Mittel zur Erzeugung der erforderlichen Flüssigkeitsströme, Strömungsprofile und Drücke für den kontrollierten Transport der Phasen und der entstehenden Phasendispersion.
Bevorzugt befinden sich jener Teil des Leitungssystems für die polare Phase, der die mindestens eine seitliche Öffnung aufweist sowie der damit verbundene Teil des Leitungssystems für die iipidhäitige Phase in einem Kreuzstrommodul, welches eine technisch vorgefertigte Einheit sein kann, die sich einfach und rasch als verbindendes Kernstück in das Leitungssystem der beiden Phasen integrieren lässt. Es ist bevorzugt, dass zumindest innerhalb dieses Kreuzstrommoduls die Zufuhrleitungen für die polare und die lipidhältige Phase aus stabilem und chemisch widerstandsfähigem Material, beispielsweise aus Edelstahl oder Hartkunststoff, bestehen und dicht und unverrutsch- bar, beispielsweise durch Schweissen, miteinander verbunden sind. Für dis- kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Betrieb kann der erste Vorratsbehälter ausserdem gleichzeitig als Sammelbehälter fungieren, wobei zumindest ein Teil des vom Vorratsbehälter wegführenden Leitungssystem im Kreis geführt wird und wieder in den Vorratsbehälter mündet, sodass wenigstens ein Teil der polaren Phase zirkuliert und inklusive neu gebildeter Lipidvesikel in den Vorratsbehälter/Sammelbehälter zurückgeführt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Fig. 1 A zeigt eine schematische Darstellung (in Draufsicht) eines
Kreuzstrommoduls mit einer Flüssigkeitsleitung für die polare Phase (vertikal dargestellt) und einer seitlichen Zuleitung für die lipidhältige
Phase (horizontal dargestellt); Fliessrichtungen werden durch Pfeile angedeutet; Fig. 1 B zeigt eine Querschnittsansicht des Kreuzstrommoduls der Fig. 1 A; Fig. 1 C zeigt eine Querschnittsansicht eines Kreuzstrommoduls mit T-förmi- ger Anordnung der Zufuhrleitungen für die polare und lipidhältige Phase;
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemässen Vorrichtung für einen (z. B. kontinuierlichen) Betrieb ohne Rückführung der polaren Phase bzw. Phasendispersion; Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung aus Fig. 2 für einen (z.B. diskontinuierlichen) Betrieb mit Rückführung der polaren
Phase bzw. Phasendispersion in den Vorratsbehälter; Fig. 4 zeigt Grössenverteilungen von Liposomenpräparationen hergestellt nach dem Direktverfahren ohne Rücklauf (Kurve B) und nach einem zirkulierenden Verfahren (Kurve A) mit Rückführung der Phasendispersion in den Ausgangsbehälter und anschliessender weiterer Beladung mit
Lipidphase (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse:
Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 5 und Fig. 5A zeigen Grössenverteilungen in Liposomenpräparationen (20 μmol DPPC/ml polare Phase) hergestellt bei verschiedenen Dosierdrücken ( 1 .2 bar und 2.4 bar bzw. 2.5 und 4.5 bar) der lipidhältigen Phase (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm);
Fig. 6 zeigt Grössenverteilungen von Liposomenpräparationen (10 μmol DPPC/ml polare Phase), hergestellt bei verschiedenen Dosierdrücken (0.3, 1 .2 und 2 bar) der lipidhältigen Phase (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 7 zeigt die Grössenverteilungen innerhalb von Liposomenpräparationen in Abhängigkeit vom Verhältnis der eingesetzten Lipidmenge (in μmol) pro eingesetztem Volumensteil (in ml) der polaren Phase (5, 1 0 und 20 μmol/ml) bei ansonsten konstanten Bedingungen (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 8 zeigt die Reproduzierbarkeit der Vesikelgrössenverteilung unter gleichbleibenden Bedingungen für drei Versuchsreihen (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 9 zeigt einen Vergleich der Grössenverteilung der Lipidvesikel zwischen einem einstufigen Direktverfahren (Kurve A) und einem Verfahren (Kurve
B) mit erhöhtem Mischungsverhältnis (Dosiervolumen der Lipidphase pro Volumenseinheit polarer Phase) und anschliessender Verdünnung der Phasendispersion (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 9A zeigt einen Vergleich der Grössenverteilung der Lipidvesikel zwischen drei Verfahren mit erhöhtem Mischungsverhältnis (Dosiervolumen der Lipidphase pro Volumenseinheit polarer Phase) und anschliessender Verdünnung der Phasendispersion (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 10 zeigt die Grössenverteilung der Lipidvesikel in zwei Liposomenpräparationen, hergestellt mit Kreuzstrommodulen mit Bohrungen von 1 50 und 250 μm Durchmesser (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 1 1 zeigt die Grössenverteilung der Lipidvesikel in zwei Liposomenpräparationen, hergestellt mit Kreuzstrommodulen (250 μm Bohrung) mit einem Produktionsvolumen von 0.3 L (Kurve A) und einem Produktionsvolumen von 2.5 L (Kurve B). (Ordinate: Prozent der Lipidvesikelpopulation; Abszisse: Durchmesser der Lipidvesikel in nm); Fig. 1 2 zeigt FlussJDruck-Kurven von 92 Vol. % Ethanol bei 55 ° C bei
Verwendung eines Kreuzstrommoduls mit Bohrungen von 150, 200 und 250 μm Durchmesser;
Fig. 1 3 zeigt Flussraten von PBS als polarer Phase bei unterschiedlichen
Leitungsdurchmessern (6, 8 und 1 0 mm; Pumpe: Schlauchquetschpumpe Type Ismatec SA0702) .
DETAILLIERTE BESCHEIBUNG DER ERFINDUNG
Als Trägermedium der polaren Phase werden sowohl für kosmetische als auch für pharmazeutische Präparationen, insbesondere solche für medizinische Anwendungen, bevorzugt wässrige Systeme, beispielsweise reines Wasser, PBS (Phosphat-gepufferte, physiologische Kochsalzlösung), physiolo- gische Kochsalzlösung oder ein anderer geeigneter und pharmazeutisch zulässiger Puffer, gegebenenfalls mit üblichen Zusätzen wie Konservierungsstoffen, Duftstoffen, Farbstoffen, und dergleichen eingesetzt.
Das Trägermedium der lipidhältigen Phase wird bevorzugt aus solchen atoxischen, pharmazeutisch zulässigen, organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen ausgewählt, die sich gut zum Lösen der für den jewiligen Einsatzzweck gewählten Lipide oder Lipidmischungen und der gegebenenfalls zusätzlichen Substanzen eignen. Solche zusätzlichen Substanzen können z.B. virale, fusogene Peptide wie etwa Influenza-Hämagglutinin, oder zell-spezifische Marker wie z.B. Antikörperfragmente, oder lipophile Wirkstoffe wie z.B. Econazol und dergleichen sein. Als bevorzugte Lösungsmittel kommen niedrige Alkohole ( 1 - 6 Kohlenstoffatome), wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol in Frage, wobei diese Lösungs- mittel einzeln, im Gemisch und/oder gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Puffer eingesetzt werden können.
Die Lipidvesikel der vorliegenden Erfindung sind nicht auf bestimmte Lipide oder Lipidzusammensetzungen beschränkt. Sie können je nach beab- sichtigter Verwendung einfache und/oder komplexe Lipide, insbesondere Phospholipide, Glycolipide, derivatisierte Lipide, andere natürliche oder synthetische Lipide kationischer, anionischer und/oder ladungsneutraler Natur enthalten. Solche Lipide sind im Stand der Technik bekannt. Es können auch Lipoproteine oder Lipopolysaccharide mit der erfindungsgemässen Herstel- lungsmethode in die Membran der Lipidvesikel eingebaut werden. Membranstabilisierende Agenzien wie Cholesterol oder Cholesterolderivate bzw. Polyethylenglykol und dessen Derivate können zugesetzt werden.
Der Begriff " Lipidvesikel", wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemeint ist, umfasst sowohl reine, ausschliesslich aus Lipiden gebildete, Lipidvesikel, auch als Liposomen bezeichnet, als auch Lipidvesikel, die mit zell-spezifischen Markern, beispielsweise Zytokinen, Wachstumshormonen, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, bestückt sind und häufig als Immuno- liposomen bezeichnet werden, oder Lipidvesikel, die mit viralen Proteinen bzw. Antigenen, beispielsweise Hämagglutinin, bestückt sind und üblicher- weise als Virosomen bezeichnet werden. Darüber hinaus können Lipidvesikel sowohl virale Antigene als auch spezifische Marker in der Vesikelmembran enthalten.
Unter " nativer Lipidvesikelpräparation " ist hierin eine Lipidvesikel- suspension zu verstehen, die unter scherkraftarmen oder scherkraftfreien Bedingungen unmittelbar und ohne Einwirkung zusätzlicher Hilfsmittel wie z.B. Ultraschall oder mechanischer Rühr- oder Dispergierhilfen nur durch das erfindungsgemässe Aufeinandertreffen der polaren und lipidhältigen Phasen entstanden ist und - mit Ausnahme einer allfälligen nachfolgenden Verdünnung mit einem polaren Lösungsmittel - keiner weiteren Nachbehandlung, insbesondere keiner Nachbehandlung zur Einstellung einer gewünschten Vesikelgrösse oder Vesikelgrössenverteilung, unterzogen worden ist. Mit „gewünschter Substanz" ist eine beliebige chemische Substanz oder Verbindung gemeint, mit der sich Lipidvesikel beladen lassen, wobei die Substanz entweder aussen an der Vesikelmembran haftet und/oder in die Vesikelmembran integriert und/oder im Innenraum der Lipidvesikel einge- schlössen ist, und mit Hilfe der Lipidvesikel an einen gewünschten Zielort in vitro und/oder in vivo gebracht werden kann. Diese Substanz kann irgendeine Testsubstanz für beispielsweise wissenschaftliche Zwecke, oder eine pharmazeutisch aktive Substanz, ein medikamentöser Wirkstoff, ein Placebo, eine Substanz für kosmetische Zwecke, ein Farbstoff, eine radioaktiv- markierte oder fluoreszenz-markierte Verbindung für therapeutische oder diagnostische Anwendungen, oder eine andere chemische Verbindung oder Mischung von chemischen Verbindungen sein.
Das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip des Aufeinandertreffens der polaren (z. B. wässrigen) Phase und der Lipidphase ist schematisch in Fig. 1 A, Fig. 1 B und Fig. 1 C dargestellt. Eine im Inneren hohle Flüssigkeitsleitung 2, welche die organische Lipidphase in Richtung des horizontalen Pfeils transportiert, ist mit der Aussenseite einer ebenfalls im Inneren hohlen Flüssigkeitsleitung 1 verbunden, welche die polare (wässrige) Phase transportiert. Im Bereich der Kontaktstelle zwischen den beiden Leitungen befindet sich mindestens eine Bohrung oder Öffnung 3, welche durch die Seitenwand der Leitung 1 und durch die angrenzende Seiten- oder Stirnwand der Leitung 2 hindurchreicht und eine flüssigkeitsdurchlässige Verbindung zwischen dem Inneren der Leitung 1 und dem Inneren der Leitung 2 herstellt. Dabei kann die Leitung 2 die Leitung 1 überkreuzen (Kreuzstrommodul), wie in Fig. 1 A und 1 B schematisch dargestellt, oder mit ihrer Stirnseite direkt an der Seitenwand der Leitung 1 dicht und unverrutschbar befestigt, z. B. angeschweisst, sein, wie in Fig. 1 C schematisch dargestellt.
Kernstück der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Herstellung der Lipidvesikel, wie sie beispielhaft in Fig. 2 und Fig. 3 dargestellt ist. In einem Kreuzstrommodul 4 ist eine Flüssigkeitsleitung 2 (Lipidphase) mit einer Leitung 1 (polare Phase) so verbunden, dass sie mit ihren Aussenseiten eine gemeinsame Kontaktfläche bilden und gegebenenfalls einander überlagern, wobei es unerheblich ist, in welchem Winkel sich die beiden Leitungen überlagern oder überkreuzen. Prinzipiell können sie auch parallel oder aber T- förmig zueinander angeordnet und miteinander verbunden sein, wie beispielsweise in Fig. 1 C dargestellt. Wesentlich ist jedoch, dass die beiden Leitungen im Bereich ihrer gemeinsamen Kontaktfläche mindestens eine gemeinsame Öffnung 3, beispielsweise eine Bohrung aufweisen, welche die Innenräume der beiden Leitungen 1 und 2 miteinander verbindet und den Durchtritt von Flüssigkeit erlaubt. Durch die Öffnung 3 wird die durch die Leitung 2 fliessende Lipidphase unter massigem Überdruck von vorzugsweise 0. 1 bis 1 5 bar in die an der Öffnung 3 vorbeiströmende polare Phase eingespeist. Dabei ist die gemeinsame Öffnung 3 so angeordnet ist, dass die organische Flüssigkeitsphase aus der Leitung 2 quer, vorzugsweise im wesentlichen senkrecht, zur Fliessrichtung der in Leitung 1 fliessenden polaren Flüssigkeitsphase durch die Öffnung 3 hindurchtreten und, bevorzugt in Form eines Sprühnebels, in die an der Öffnung 3 vorbeiströmende polare Flüssigkeitsphase eindringen kann.
" Im wesentlichen senkrecht" bedeutet dabei, dass das Einspeisen bzw. Einsprühen der Lipidphase nicht in oder gegen die Strömungsrichtung der polaren Phase erfolgt, sondern quer dazu in einem, vorzugsweise rechten, Winkel, sodass die Lipidphase den Strom der polaren Flüssigkeitsphase von der Seite, also vom Aussenrand, her in Richtung Mitte hin penetriert. Es bedeutet ausserdem, dass im Falle des Vorliegens einer Sprühnebelcharakteristik, wie in den Abbildungen 1 A bis 1 C schematisch dargestellt, nur ein Teil der eingesprühten Lipidphase tatsächlich in einem rechten Winkel zur Strömungsrichtung der polaren Phase in diese eindringt, während der überwiegen- de Teil mehr oder weniger stark davon abweicht. Im Bereich der gemeinsamen Öffnung 3 sind die Leitungen 1 und 2 frei von zusätzlichen Einrichtungen, insbesondere frei von Rühr- oder Dispergierhilfen.
Fig. 2 zeigt beispielhaft eine Anordnung der erfindungsgemässen Vorrichtung zur Durchführung eines kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Herstellungsverfahrens für Lipidvesikel, ohne Rückführung der entstehenden Vesikelsuspension in den Ausgangsbehälter. Da diese Art der Herstellung im Wesentlichen aus einem einzigen Verfahrensschritt besteht, nämlich aus der Zusammenführung der Lipidphase und der polaren Phase, wird dieses Verfahren im Nachfolgenden auch als "einstufiges Verfahren " bezeichnet.
Die polare Phase wird aus einem ersten Vorratsbehälter 5 mittels einer Pumpe 6, die vorzugsweise möglichst pulsationsarm arbeitet und möglichst wenig Kavitation und Scherkräfte erzeugt, durch die Flüssigkeitsleitung 1 in Richtung Kreuzstrommodul 4 und weiter in den Sammelbehälter 7 gefördert, wobei die Pumpe 6 zwischen dem Vorratsbehälter 5 und dem Kreuzstrommodul 4 angeordnet ist. Im Betrieb ist die Pumpe 6 vorzugsweise so eingestellt, dass in der Leitung 1 zwischen dem Vorratsbehälter 5 und dem Sam- melbehälter 7 wenigstens im Nahbereich vor und nach der Öffnung 3 eine laminare oder annähernd laminare Strömung vorliegt. Es ist vorzugsweise ausserdem darauf zu achten, dass keine Luftblasen in der Leitung 1 eingeschlossen werden, die die Ausbeute an intakten Vesikeln und damit den Einschlussgrad an Wirkstoff aus der polaren Phase schmälern könnten. Beim Durchströmen des Kreuzstrommoduls 4 wird die polare Phase mit der organischen, lipidhältigen Phase beladen, wobei die lipidhältige Phase unter Druck durch die Öffnung 3 im wesentlichen senkrecht zur Fliessrichtung der polaren Phase eingespeist wird. Es zeigt sich, dass die Lipide bereits innerhalb des Kreuzstrommoduls 4 präzipitieren und sich zu Vesikeln schliessen, wobei sie einen Teil der polaren Phase samt gegebenenfalls darin gelösten Substanzen einschliessen.
Vorzugsweise sind die Volumina und Strömungsgeschwindigkeiten der lipidhältigen und der polaren Phase so aufeinander abzustimmen, dass ungenutzte Überschüsse einer der beiden Phasen weitestgehend vermieden werden. Die lipidhältige Phase wird aus einem zweiten Vorratsbehälter 8 mit einer Pumpe 9 über einen Filter 10 und ein Rückschlag- oder sonstiges drucksperrendes Ventil in einen Zwischenbehälter 1 1 gepumpt. Der Zwischenbehälter 1 1 ist in diesem Beispiel über einen zwischengeschalteten Filter 1 2 mit einer Druckquelle 1 3 verbunden, beispielsweise einem Druckbehälter, der bevorzugt ein Inertgas, beispielsweise Stickstoffgas, unter Druck enthält und mit dessen Hilfe die lipidhältige Phase vom Zwischenbehälter 1 1 über ein regelbares Ventil in Richtung Kreuzstrommodul 4 gepresst wird. Falls aufgrund der Lipidzusammensetzung und/oder der Wahl der liposomal einzuschliessenden Substanz kein Oxidationsschutz nötig ist, kann auch Pressluft eingesetzt werden. Alternativ dazu kann die lipidhältige Phase mittels einer Pumpe vom Zwischenbehälter 1 1 über die Leitung 2 zum Kreuzstrommodul 4 befördert werden. Sobald die polare Phase die Öffnung 3 im Kreuzstrommodul 4 passiert, wird ein regelbares Ventil in der Leitung 2 geöffnet und die lipidhältige Phase durch die Öffnung 3 in die Leitung 1 und damit in die polare Phase gepresst bzw. gepumpt. Zur Prozess- und Qualitätskontrolle kann zudem stromabwärts vom Kreuzstrommodul 4 eine Probe- entnahmevorrichtung 1 4 vorgesehen sein.
In Fig. 3 wird die Anordnung aus Fig. 2 mit einer Rückführung der im Kreuzstrommodul 4 entstehenden Phasendispersion in den ersten Vorratsbehälter 5 (zirkulierendes Verfahren) dargestellt. Stromabwärts vom Kreuzstrommodul 4 wird zumindest ein Teil der Phasendispersion durch eine Sperre 1 5, beispielsweise ein Ventil, einen Schieber, eine Klemme oder dergleichen, vor dem Sammelbehälter 7 abgezweigt, über eine Rücklaufleitung 1 ' in den ersten Vorratsbehälter 5 rückgeführt und mittels Pumpe 6 wieder dem Kreuzstrommodul 4 zugeleitet, wo sie erneut mit lipidhältiger Phase beladen wird. Sobald die gewünschte Endkonzentration an Lipid oder Lipidvesikeln in der polaren Phase erreicht und/oder die lipidhältige Phase aufgebraucht ist, wird die Zirkulation gestoppt und die entstandene Phasendispersion entweder in den Sammelbehälter 7 übergeführt oder im Vorratsbehälter 5 gesammelt. Die erfindungsgemässe Vorrichtung, wie sie beispielhaft in den Figuren 2 und 3 dargestellt ist, kann nach bekannten Methoden der Steriltechnik keimfrei und pyrogenfrei betrieben werden . Sie kann beispielsweise thermisch oder chemisch sterilisiert werden und die Ausgangsmaterialien (polare Phase, lipidhältige Phase, gegebenenfalls Pressluft oder Inertgas) können über geeignete Sterilfiltersysteme den jeweiligen Vorratsbehältern 5, 8, dem Kreuzstrommodul 4 und dem anschliessenden Sammelbehälter 7 zugeführt werden. Die auf diese Weise hergestellten, nativen Lipidvesikel-Präparationen brauchen dann keinem weiteren Entkeimungsschritt mehr unterzogen zu werden. Die Grössenverteilung innerhalb der Vesikelpräparationen wird beim erfindungsgemässen Verfahren von zwei Faktoren massgeblich beeinflusst: einerseits von der je Volumensteil der polaren Phase zudosierten Menge an Lipid und/oder Lösungsmittel und andererseits vom Dosierdruck. Aus Fig. 5 und Fig. 6 ist zu ersehen, dass durch Erhöhung des Dosierdrucks der mittlere Durchmesser der Lipidvesikel abnimmt und die Grössenverteilung innerhalb der Vesikelpopulation weniger streut und somit homogener ist. Unter den Verfahrensbedingungen der Fig. 6 haben beispielsweise zwei Drittel aller erzeugten Liposomen einen Durchmesser von 100 bis 200 nm. Der Unter- schied zwischen den Verfahrensbedingungen der Fig. 5 und der Fig. 6 besteht vor allem in der eingesetzten Lipidmenge je Volumenseinheit der polaren Phase. In Fig. 5 und Fig. 5A wurden 20 μmol Lipid pro ml polarer Phase eingesetzt, in Fig. 6 hingegen nur 1 0 μmol/ml. Es hat sich gezeigt, dass es bei geringeren Dosierdrücken von Vorteil ist, bei der gewählten Lipidzusam- mensetzung (Ergebnisse Fig. 4 bis 1 1 ) nicht mehr als 10 μmol Lipid pro ml polarer Phase zuzudosieren, um homogene Vesikelpräparationen mit geringer Streuung in der Grössenverteilung zu erhalten. Durch Erhöhung des Dosierdrucks lässt sich aber nicht nur die Verfahrenseffizienz steigern, sondern auch bei gesteigerter Lipidmenge (je Volumenseinheit der polaren Phase) eine geringe Streubreite der erzeugten Vesikel erreichen (Fig. 5A) .
Aus Fig. 7 ist ersichtlich, dass mit steigendem Lipidanteil je Volumenseinheit polarer Phase, ausgedrückt in μmol eingesetzten Lipids pro ml eingesetzter polarer Phase, bei konstanten Bedingungen der übrigen Prozessparameter die durchschnittliche Grosse der Lipidvesikel und die Streuung der Grössenverteilung zunimmt. Diesem Effekt kann man jedoch durch Erhöhung des Dosierdrucks der lipidhältigen Phase entgegenwirken, sodass sich, wie in Fig. 9 dargestellt, trotz beträchtlicher Erhöhung des Lipidanteils dennoch eine hervorragende Homogenität und Grössenverteilung der Lipidvesikel ergibt. Eine Erklärungsmöglichkeit für dieses Phänomen könnte darin bestehen, dass bei höheren Dosierdrücken der auf die polare Phase einwirkende "Sprühnebel" der lipidhältigen Phase noch feiner ist und daher eine grössere Oberfläche aufweist. Ausserdem dürfte auch die Eindringtiefe des "Sprühnebels" in die polare Phase erhöht sein, sodass sich insgesamt daraus das beobachtete, reproduzierbare Phänomen ableiten lässt. Vergleichsversuche haben jedenfalls ergeben, dass durch Variation der Fliessgeschwindigkeit der polaren Phase der zuvor erwähnte Lipideffekt nicht aufgehoben werden konnte. Die besten Werte hinsichtlich Homogenität der Vesikel wurden, zumindest bei Verwendung von DPPC als alleiniger Bilayer-bildender Lipidkomponente, bei Lipid- konzentrationen von 10 μmol/ml und darunter erzielt.
Weiters ist es bevorzugt, das zudosierte Volumen der organischen Phase im Falle von Ethanol als Lösungsmittel so zu wählen, dass die kalku- lierte Endkonzentration an Ethanol (bei Verwendung von Ethanol mit einer Reinheit > 90 Vol%) in der stromabwärts vom Kreuzstrommodul 4 vorliegenden Vesikeldispersion 10 Vol. %, vorzugsweise 7.5 Vol. % nicht übersteigt. Eine Überschreitung dieser Endkonzentration kann die Stabilität, Homogenität und Grosse der gebildeten Lipidvesikel im Sammelbehälter 7 ungünstig beein- flussen. Bei Makromolekülen, wie beispielsweise Proteinen, sind unter diesen Bedingungen des einstufigen Verfahrens (ohne Rückführung) Einschlussgrade von 1 0 bis 1 5 Gew. % der Gesamtmenge des zugesetzten, in der wässrigen Phase gelösten Makromoleküls erreichbar.
Eine erhebliche Ausbeutesteigerung lässt sich aber mittels einer bevor- zugten Ausführungsform dieses Verfahrens erreichen. Dabei wird das
Mischungsverhältnis an zudosierter lipidhältiger Phase zu vorbeiströmender polarer Phase auf einen Wert eingestellt, der die oben erwähnten bevorzugten Grenzwerte von 7.5 Vol. % Ethanol und 10 μmol Lipid je 1 ml der polaren Phase in der Vesikeldispersion weit, beispielsweise um das Zwei- bis Zehn- fache, überschreitet. Anschliessend kann die hochkonzentrierte Vesikel- suspension mit einem polaren Lösungsmittel, bevorzugt dem Trägermedium der polaren Phase, bis zu der bevorzugten Endkonzentration von 7.5 - 1 0 Vol. % Ethanol verdünnt werden, um - falls erforderlich - die Stabilität und Homogenität der Präparation auch für einen längeren Zeitraum (beispielsweise für Lagerungszwecke) sicher zu stellen. Die Verdünnung kann bereits in der Leitung 1 stromabwärts vom Kreuzstrommodul, oder erst im Sammelbehälter 7 erfolgen. Es hat sich gezeigt, dass auf diese Weise der Einschlussgrad insbesondere für Proteine um ein Vielfaches gesteigert werden konnte. So konnte durch Erhöhung des Dosiervolumens der Lipidphase um das Dreifache eine direkt proportionale Steigerung des Einschlussgrades um ebenfalls ca. das Dreifache, beispielsweise von 1 0-1 5 Gew. % rekombinanter h-SOD auf 30-50 Gew. % rh-SOD, erzielt werden. Eine Erhöhung des Mischungverhältnisses auf das Fünf- bis Zehnfache der im nicht-modifizierten Verfahren bevorzugten Grenzwerte konnte eine weitere Ausbeutesteigerung bewirken, sodass ein Ausnutzungsgrad resultierte, der dem theoretisch möglichen annähernd entsprach. Wesentlich ist dabei aber, dass die erzeugten Lipidvesikel trotz des erhöhten Mischungsverhältnisses die charakteristische Grössenverteilung, wie sie beispielsweise in Fig. 9 erkennbar ist, beibehalten, was ursprünglich keineswegs zu erwarten oder vorherzusehen war.
Die Erhöhung des Mischungsverhältnisses kann durch Erhöhung des Dosierdrucks der Lipidphase und gegebenenfalls zusätzlich durch Vergrösserung des Durchmessers der Öffnung 3 und/oder durch eine Erhöhung der Anzahl an Öffnungen 3 bewerkstelligt werden. Es ist auch möglich, den Zustrom der Lipidphase zu teilen und zwei oder mehr Leitungen 2 mit der Leitung 1 über Kontaktflächen mit Öffnungen 3 zu verbinden. Die Versuche haben gezeigt, dass eine Veränderung (Vergrösserung) des Lochdurchmessers der Öffnung 3 von beispielsweise 1 50 auf 250 μm zwar eine massive Steigerung des Durchsatzes an ethanolischer Phase ermöglicht (Fig. 1 2), jedoch offenbar keine wesentlichen Auswirkungen auf die durchschnittliche Grosse oder Grössenverteilung der Lipidvesikel mit sich bringt (Fig. 10). Es können daher je nach Anwendungszweck auch andere Durchmesser der
Öffnung 3 gewählt werden. Als geeignet haben sich Durchmesser im Bereich von 50 - 1 500 μm erwiesen. Es ist natürlich auch möglich und insbesondere für Produktionszwecke in grösserem Massstab vorteilhaft, den Flüssigkeitsstrom der polaren Phase zu teilen und zwei oder mehr Leitungen 1 vorzu- sehen, um so die Anzahl der Kontaktflächen und Öffnungen 3 noch weiter erhöhen zu können. Zur gezielten Abstimmung der Volumensströme und Fliessgeschwindigkeiten der polaren und der lipidhältigen Phase aufeinander ist es von Vorteil, in vorausgehenden Experimenten die erreichbaren Flüsse in Abhängigkeit zur Pumpeneinstellung und den gewählten Leitungsquerschnitten zu messen und, wie beispielsweise in Fig. 1 3 für eine Vorrichtung im Labormassstab, graphisch darzustellen. Die Verfahrenstemperatur für die Vesikelherstellung ist naturgemäss von der chemischen Natur der eingesetzten Lipide und von der möglichen thermischen Empfindlichkeit der einzuschliessenden Substanz abhängig. Sie liegt aber stets über der Phasenübergangstemperatur der eingesetzten Lipide.
Mit dem erfindungsgmässen Verfahren sind native Vesikelpräparationen in einem einzigen Verfahrensschritt herstellbar, in denen zumindest 60 % aller Lipidvesikel (Figuren 4 -1 1 ), gegebenenfalls mehr als 70 % (Fig. 6) aller Lipidvesikel, einen gewünschten, vorbestimmbaren Durchmesser aufweisen, der innerhalb einer Streubreite von maximal 250 nm, vorzugsweise von maximal 1 00 nm, liegt. Unter dem Begriff "Streubreite" ist in diesem Zusammenhang ein Grössenintervall der genannten Breite gemeint, innerhalb dessen die Durchmesser dieser zumindest 60 oder 70 % aller Vesikel verteilt liegen, also "streuen" . Es lassen sich dementsprechend erfindungsgemässe Vesikelpräpa- rationen herstellen, worin mindestens 60 % aller Vesikel einen Durchmesser im Bereich von beispielsweise 1 00 - 200 nm (Streubreite = 1 00 nm), oder mindestens 70 % einen Durchmesser im Bereich von 100 - 350 nm (Streubreite = 250 nm) aufweisen. Genausogut lassen sich aber auch Vesikelpräparationen herstellen, worin mindestens 60 % oder mindestens 70 % aller Vesikel einen Durchmesser im Bereich von 500 - 600 nm (Streubreite 1 00 nm) oder 500 - 750 nm (Streubreite 250 nm) aufweisen. Das Verfahren lässt sich sowohl hinsichtlich der gewünschten Lipidzusammensetzung als auch hinsichtlich der optimalen Vesikelgrösse und der zu inkorporierenden Substanzen weitgehend an die verschiedensten Bedürfnisse kosmetischer, diagnostischer oder medizinisch-therapeutischer Anwendungen anpassen. Im Nachfolgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert. Beispiel 1 : Inkorporation von rekombinanter humaner Superoxiddismutase
(rh-SOD) in Lipidvesikel Rekombinante humane Superoxiddismutase (rh-SOD) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von rund 32000 Dalton. Über die Vorteile einer liposomalen Verkapselung dieses Proteins und die dadurch ermöglichten medizinischen Anwendungen wird in WO96/14083 ausführlich berichtet. Da dieses Protein in der polaren Phase gelöst ist und nicht mit den Lipidmembranen interagiert, wird die rh-SOD „passiv" inkorporiert.
Einstufiges Verfahren (schematisch dargestellt in Fig. 2):
In 1 00 ml PBS ( 1 1 5 mg Na2HP04v 20 mg KH2PO4; 800 mg NaCI; 20 mg KCI pH 7.2 - 7.4) als polarer Phase werden 1 600 mg rh-SOD und in 7.5 ml Ethanol (Konzentration: 92 Vol. %) als organischer Phase werden 1 0 μmol/ml (bezogen auf das Volumen der polaren Phase) Bilayer-bildendes Lipid, beispielsweise 734 mg DPPC (Dipalmitoyl-phosphatidylcholin), zusammen mit 2.86 μmol/ml ( 1 1 0 mg) Cholesterol und 1 .43 μmol/ml (38.5 mg) Stearylamin, gelöst. Die Lipidzusammensetzung, in diesem Fall DPPC, Cholesterol und Stearylamin im Verhältnis von 7:2: 1 μmol/ml, kann jedoch sowohl hinsichtlich der Auswahl der Lipidkomponenten als auch hinsichtlich der Mengenverhält- nisse der Lipidkomponenten zueinander variieren. Für viele Liposomenformu- lierungen sind jedenfalls Lipidgemische, wie in diesem Beispiel, zur stabilen Vesikelbildung besser geeignet als die Verwendung einer einzelnen Lipid- komponente allein. In den nachfolgenden Beispielen wurde stets eine Mischung aus Bilayer-bildendem Lipid (z. B. DPPC, DOPC, DMPC), Cholesterol und Stearylamin eingesetzt.
Die lipidhältige organische Phase (98 mg DPPC/ml Ethanol) wird in einem Kreuzstrommodul über eine Bohrung mit 250 μm Durchmesser mit einem Druck von 1 .5 bar pumpenfrei mittels Drucküberlagerung aus der Stickstoff-Gasflasche in die vorbeiströmende polare Phase (1 6 mg rh-SOD/ml PBS) eingespeist und die entstandene Vesikeldispersion in den Sammelbehälter überführt. Als Transportleitungen für die polare und für die lipidhältige Phase werden Silikonschläuche verwendet. Der Innendurchmesser der Schlauchleitung für die Förderung der polaren Phase vom Vorratsbehälter zum Kreuzstrommodul und vom Kreuzstrommodul zum Sammelbehälter beträgt 1 0 mm, derjenige für die Förderung der Lipidphase vom Zwischenbehälter bis zum Kreuzstrommodul beträgt 1 .6 mm. Als Pumpe für die Beförderung der polaren Phase kommt eine Schlauchquetschpumpe vom Typ Ismatec SA 0702 zum Einsatz, als Pumpeneinstellung (siehe Fig. 1 3) wird 999 gewählt, entsprechend einer Pumpleistung von 2600 ml/min bei dem verwendeten Schlauchdurchmesser von 1 0 mm; die lipidhältige Phase wird vorzugsweise pumpenfrei durch Drucküberlagerung mittels Pressluft oder Inertgas, in diesem Beispiel mittels Stickstoffgas, zum Kreuzstrommodul befördert. Im Überstand der Präparation werden 14 bis 14.5 mg rh-SOD/ml gemessen. Demnach sind 1 50 bis 200 mg rh-SOD in die Liposomen eingeschlossen worden. Das entspricht einem Einschlussgrad von 9.5 -1 2.5 % der ursprünglich in PBS gelösten Menge an rh-SOD. Analoge Vergleichsversuche mit DOPC (Dioleoyl-phosphatidylcholin) und DMPC (Dimyristoyl-phosphatidylcholin) haben sehr ähnliche Ergebnisse erbracht (Resultate nicht dargestellt).
Beispiel 2: Vergleich von einstufigem Verfahren (ohne Rücklauf) und
Verfahren mit Rücklauf
Es wird gemäss Beispiel 1 vorgegangen, allfällige Abweichungen sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angeführt. Die Versuchsanordnung für das Rezirkulationsverfahren entspricht der Vorrichtung, die schematisch in Fig. 3 dargestellt ist, jene für das einstufige Verfahren entspricht der Vorrichtung gemäss Fig. 2. Die Resultate sind in Tabelle 1 und Fig. 4 wiedergegeben.
Tabelle 1 : Vergleich der Vesikelgrössenverteilung im einstufigen und rezirkulierenden Verfahren
Figure imgf000026_0001
*VF = Verfahren
Es zeigt sich, dass die Grössenverteilung in beiden Fällen nahezu identisch ist, wobei mehr als 60% aller gebildeten Vesikel einen Durchmesser von 1 00 bis 200 nm aufweisen.
Beispiel 3: Einfluss des Dosierdrucks der lipidhältigen Phase auf Grosse und
Grössenverteilung der Lipidvesikel Beispiel 1 wird ohne rhSOD und mit folgenden Modifikationen wiederholt: Die polare Phase wird im Gegensatz zu Beispiel 1 im Kreis geführt (rezirku- liert) . Die Lipidphase enthält insgesamt 1 470 mg DPPC, entsprechend 20 μmol DPPC (Molekulargewicht von DPPC = 734) pro 1 ml polarer Phase. Dosierdrücke von 1 .2 und 2.4 bar sowie 2.5 und 4.5 bar für die lipidhältige Phase werden miteinander verglichen.
Tabelle 2: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung von Liposomenbatches (20 μmol Lipid/ml polare Phase) mit unterschiedlichen Dosierdrücken
Figure imgf000026_0002
Die Vesikelgrössen wurden in diesem und allen anderen hierin beschriebenen
Experimenten mittels Flow-Cytometrie, adaptiert nach Vorauer-Uhl et al.
(Cytometrie 39(2): 1 66-71 , 2000) ermittelt. Die Resultate sind in Tabelle 2 und 2a und in Fig. 5 und 5A wiedergegeben.
Tabelle 2a: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung von Liposomenbatches (20 μmol Lipid/ml polare Phase) mit unterschiedlichen Dosierdrücken
Figure imgf000027_0001
Beispiel 4: Einfluss des Dosierdrucks der lipidhältigen Phase auf Grosse und Grössenverteilung der Lipidvesikel Beispiel 1 wird ohne rhSOD und mit folgenden Modifikationen wiederholt: Die polare Phase wird im Gegensatz zu Beispiel 1 im Kreis geführt (rezirkuliert). Drei Versuchsansätze gleicher Lipidkonzentration werden miteinander verglichen, wobei Dosierdrücke von 0.3, 1 .2 und 2.0 bar für die Einspeisung der lipidhältigen Phase in die polare Phase getestet werden. Die polare Phase enthält jeweils konstant 200 ml PBS, die Lipidphase enthält jeweils 1470 mg DPPC in 1 5 ml Ethanol (92 Vol. %), entsprechend 1 0 μmol DPPC (Molekulargewicht von DPPC = 734) pro 1 ml polarer Phase. Befördert wird die lipidhältige Phase in diesem Beispiel mit Hilfe einer Zahnradpumpe vom Typ Gather P 1 51 33. Die Resultate sind in Tabelle 3 und in Fig. 6 wiedergegeben. Tabelle 3: Grössenvergleich der Vesikel aus Liposomenbatches ( 1 0 μmol Lipid/ml polare Phase) hergestellt mit Dosierdrücken von 0.3, 1 .2, 2.0 bar
Figure imgf000028_0001
Beispiel 5 : Vergleich von Vesikelgrössen aus Versuchsansätzen mit unterschiedlicher Lipidkonzentration
Beispiel 1 wird ohne rhSOD und mit folgenden Modifikationen wiederholt:
Die lipidhältige Phase enthält 734, 1 470, bzw. 2940 mg DPPC, entsprechend den kalkulierten Konzentrationen von 5, 1 0 und 20 μmol DPPC pro 1 ml polare Phase. Die Resultate sind in Tabelle 4 und Fig. 7 wiedergegeben.
Tabelle 4: Vesikelgrössenvergleich von Liposomenbatches mit unterschiedlicher Lipidkonzentration
Figure imgf000028_0002
Beispiel 6: Reproduzierbarkeit der Grössenverteilungen von Lipidvesikeln
In Tabelle 5 und Fig . 8 sind drei separate Vesikelpräparationen dargestellt, die unter identischen Bedingungen hergestellt wurden und in denen nahezu gleiche Grössenverteilungen der Lipidvesikel vorliegen. Die Vesikelpräparationen wurden gemäss Beispiel 1 , jedoch ohne rhSOD hergestellt; allfällige Abweichungen davon sind in der nachfolgenden Tabelle 5 angeführt. Die polare Phase wird im Gegensatz zu Beispiel 1 im Kreis geführt (rezirkuliert) .
Tabelle 5: Reproduzierbarkeit der Grössenverteilung von Lipidvesikeln (Dosierdruck 1 .6 bar)
Figure imgf000029_0001
Zahnradpumpe Modell Gather P1 5133
Beispiel 7: Modifiziertes einstufiges Verfahren mit erhöhtem Dosiervolumen der Lipidphase und nachfolgendem Verdünnen der entstandenen
Vesikeldispersion Beispiel 1 wird mit folgenden Modifikationen wiederholt: Unter Verwendung einer Vorrichtung gemäss Fig. 2 werden im Sammelbehälter zwei Volumensteile (200 ml) der polaren Phase (PBS) und im Vorrats- behälter ein Volumensteil ( 1 00 ml) PBS vorgelegt. In den 1 00 ml PBS des
Vorratsbehälters werden 1 600 mg rh-SOD gelöst. Es wird nun - im Vergleich zu Beispiel 1 - die dreifache Lipidmenge (2205 mg Lipid) in der dreifachen
Menge (22.5 ml) Ethanol (Konzentration: 92 Vol. %) gelöst. Die Strömungsgeschwindigkeit der polaren Phase wird so gesteuert, dass die gesamte Menge an Lipid/Ethanol-Lösung in den einen Volumensteil ( 1 00 ml) der polaren Phase eingebracht wird. Die im Kreuzstrommodul entstehende
Phasendispersion wird in den Sammelbehälter weitergeleitet, wo der
Überschuss an Ethanol sofort durch das vorgelegte polare Lösungsmittel PBS ausgeglichen wird. Durch dieses Verfahren werden 450 bis 600 mg rh-SOD in den Lipidvesikeln eingeschlossen. Das entspricht einer Inkorporationsrate von
28 bis 38 % bezogen auf die Gesamtmenge an vorgelegter rh-SOD.
Damit wird mit dieser Verfahrensvariante etwa die 3-fache Menge an Protein im Vergleich zum Verfahren nach Beispiel 1 eingeschlossen. Die mit diesem Verfahren erzielte Vesikelgrössenverteilung ist in der nachfolgenden Tabelle 6 sowie in Fig. 9 wiedergegeben. Wie aus Fig. 9 zu ersehen ist, übertrifft die mit dieser Präparationstechnik erhaltene Grössenverteilung der Lipidvesikel sogar jene aus dem nicht-modifizerten einstufigen Verfahren in Bezug auf die Homogenität und den Anteil an Vesikeln mit einem Durchmesser im Bereich von 1 00-200 nm .
Tabelle 6: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung im einstufigen Verfahren bei normalem und erhöhtem Dosiervolumen der Lipidphase je Volumen der polaren Phase
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Beispiel 7a: Modifiziertes einstufiges Verfahren mit erhöhtem Dosiervolumen der Lipidphase und nachfolgendem Verdünnen der entstandenen Vesikeldispersion Beispiel 1 wird mit folgenden Modifikationen wiederholt:
Unter Verwendung einer Vorrichtung gemäss Fig. 2 werden im Sammelbehälter zwei, vier oder sechs Volumensteile (200 ml, 400 ml oder 600 ml) der polaren Phase (PBS) und im Vorratsbehälter ein Volumensteil- ( 1 00 ml) PBS vorgelegt. In den 100 ml PBS des Vorratsbehälters werden 1 600 mg rh-SOD gelöst. Es wird nun - im Vergleich zu Beispiel 1 - die drei-, fünf- oder siebenfache Lipidmenge (2205, 3670, bzw. 51 38 mg Lipid) in der drei-, fünf- bzw. siebenfachen Menge (22.5, 37.5 bzw. 52.5 ml) Ethanol (Konzentration: 92 Vol. %) gelöst. Die Strömungsgeschwindigkeit der polaren Phase wird so gesteuert, dass die gesamte Menge an Lipid/Ethanol-Lösung in den einen Volumensteil ( 100 ml) der polaren Phase eingebracht wird. Die im
Kreuzstrommodul entstehende Phasendispersion wird in den Sammelbehälter weitergeleitet, wo der Überschuss an Ethanol sofort durch das vorgelegte polare Lösungsmittel PBS ausgeglichen wird. Durch dieses Verfahren werden 450 bis 600 mg (bei 3-facher Lipidmenge), 640 bis 720 mg (bei 5-facher Lipidmenge) bzw. 880 bis 960 mg (bei 7-facher Lipidmenge) rh-SOD in den ■ Lipidvesikeln eingeschlossen. Das entspricht einer Inkorporationsrate von 28 bis 38 %, bezogen auf die Gesamtmenge an vorgelegter rh-SOD, bzw. 40 bis 45% bei der 5-fach und 55 bis 60% bei der 7-fach Dosierung. Damit wird mit dieser Verfahrensvariante etwa die 3, 5, bzw. 7-fache Menge an Protein im Vergleich zum Verfahren nach Beispiel 1 eingeschlossen . Die mit diesem Verfahren erzielte Vesikelgrössenverteilung ist in der nachfolgenden Tabelle 6a sowie in Fig.9A wiedergegeben.
Tabelle 6a: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung im einstufigen Verfahren bei normalem und erhöhtem Dosiervolumen der Lipidphase je Volumen der polaren Phase
Figure imgf000032_0001
Beispiel 8: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung in Abhängigkeit zur Lochgrösse der Bohrung im Kreuzstrommodul
Beispiel 1 wird ohne rhSOD wiederholt; allfällige Abweichungen davon sind in der nachfolgenden Tabelle 7 angeführt. Die polare Phase wird im Gegensatz zu Beispiel 1 im Kreis geführt (rezirkuliert). Die Resultate sind Fig. 10 und in
Tabelle 7 wiedergegeben. Tabelle 7: Vesikelgrössenvergleich bei Verwendung von Kreuzstrommodulen mit unterschiedlichen Bohrungsdurchmessern
Figure imgf000033_0001
Aus den Resultaten ist zu entnehmen, dass der Durchmesser der Dosier- Öffnung im Kreuzstrommodul, zumindest im Bereich der getesteten Durchmesser, keinen wesentlichen Einfluss auf die Grosse und die Grössenverteilung der erzeugten Lipidvesikel zu haben scheint. Weitere Versuche haben ergeben, dass insbesondere Bohrungen mit Durchmessern im Bereich von 50 bis 1 500 μm für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als geeignet erscheinen. Kleinere Bohrungsdurchmesser lassen sich mechanisch nur schwer herstellen und kommen daher weniger in Frage.
Beispiel 9: Vergleich der Vesikelgrössenverteilung im 0.3 und 2.5 Liter Massstab Beispiel 7 wird wiederholt, wobei in einem ersten Versuchsansatz 300 ml an polarer Phase (wie in Beispiel 7) und einem zweiten Versuchsansatz 2500 ml an polarer Phase unter ansonsten identischen Bedingungen eingesetzt werden. Die Lipid- und Ethanolkonzentrationen entsprechen jenen, die in Beispiel 7 angeführt sind, wobei im 2500 ml Versuchsansatz natürlich auch das Flüssigkeitsvolumen der ethanolischen Lipidphase um den selben Faktor höher ist (d.h. 1 87.5 ml) . Tabelle 8: Vesikelgrössenverteilung bei Massstabsvergrösserung
Figure imgf000034_0001
Beispiel 1 0: Ermittlung von Druck/Fluss-Kurven für die Flüssigkeitsphasen
Um die Flüssigkeitsströme der polaren und der ethanolischen Lipidphase aufeinander abstimmen zu können, wurden mit den verwendeten Pumpen entsprechende Fluss- bzw. Druck/Fluss-Kurven ermittelt und in Form von
Diagrammen dargestellt. Zum Einsatz kamen einerseits eine Schlauchquetschpumpe Modell Ismatec SA 0702 (für den Transport der polaren Phase) und andererseits eine Zahnradpumpe Modell Gather P1 51 33 (für den Transport der ethanolischen Lipidphase). Alternativ wurde für den Transport der ethanolischen Lipidphase auch die pumpenfreie Drucküberlagerung mit Stickstoff angewandt. a) Aufnehmen einer Druck/Fluss-Kurve für die Ethanol-Phase
In der nachfolgenden Tabelle 9 sind die für die Zahnradpumpe ermittelten
Werte aufgelistet und in Fig. 1 2 graphisch dargestellt.
Gemessen wurde der Fluss (Volumensstrom) von Ethanol (92 Vol. %) bei einer Temperatur von 45 - 55 ° C durch die Zufuhrleitung für die
Lipidphase bzw. durch die anschliessende Bohrung im Kreuzstrommodul. Als Zufuhrleitung von der Pumpe bis hin zum Kreuzstrommodul wurde ein Silikonschlauch mit 1 .6 mm Innendurchmesser eingesetzt. Es wurden drei Kreuzstrommodule mit jeweils einer einzigen Bohrung verwendet, wobei die Bohrungen Nennweiten von 1 50 m, 200 μm oder 250 μm aufwiesen.
Nachdem es sich gezeigt hatte, dass mittels Drucküberlagerung des Zwischenbehälters (gemäss Fig. 2 und Fig. 3) unter Verwendung von Pressluft oder Stickstoffgas die lipidhältige Phase mindestens ebenso genau und gleichmässig in das Kreuzstrommodul gefördert werden kann, wurde diese pumpenfreie Methode für das erfindungsgemässe Herstellungsverfahren als einfache und wartungsfreie Alternative zur Förderung mittels Zahnradpumpe ebenso verwendet.
b) Aufnehmen einer Flußkurve für die polare Phase Als polare Phase wurde PBS eingesetzt. Die verwendete Pumpe war eine Schlauchquetschpumpe vom Typ Ismatec SA 0702, als Zufuhrleitung von der Pumpe bis zum Kreuzstrommodul wurde ein Silikonschlauch eingesetzt. Drei verschiedene Schlauchdurchmesser wurden getestet: 6, 8 und 1 0 mm Innendurchmesser. Die Schläuche waren blasenfrei gefüllt. Die Angaben zur Pumpeneinstellung beziehen sich auf die an der Pumpe vorhandene Skalierung zur Wahl der Pumpleistung. Die ermittelten Werte sind nachfolgend in Tabelle 10 sowie in Fig. 1 3 dargestellt Tabelle 9 : Druck/Fluss-Kurve für ethanolische Phase
Figure imgf000036_0001
Tabelle 1 0: Eichkurve für PBS-Flüsse mittels Schlauchquetschpumpe
Figure imgf000037_0001
* ID = Innendurchmesser

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln, welche folgende Bestandteile enthält: eine im Inneren hohle Leitung ( 1 ) für den Transport einer polaren Flüssigkeitsphase, eine im Inneren hohle Leitung (2) für den Transport einer lipidhältigen organischen Flüssigkeitsphase, einen Sammelbehälter (7) zur Aufnahme erzeugter Lipidvesikel, sowie Mittel zur Förderung der Flüssigkeitsphasen durch die Leitungen ( 1 ) und (2), dadurch gekennzeichnet, dass die Leitung ( 1 ) mit ihrer Aussenseite an mindestens einer Stelle an die Leitung (2) angrenzt und dort mit der Leitung (2) eine gemeinsame Kontaktfläche bildet, dass in der Kontaktfläche mindestens eine gemeinsame Öffnung (3) vorhanden ist, die flüssigkeitsdurchlässig ist und das Innere der Leitung (2) mit dem Inneren der Leitung ( 1 ) verbindet und dass die gemeinsame Öffnung (3) so angeordnet ist, dass die organische Flüssigkeitsphase aus der Leitung (2) im wesentlichen senkrecht zur Fliessrichtung der in Leitung ( 1 ) fliessenden polaren Flüssigkeitsphase durch die Öffnung (3) hindurchtreten und, vorzugsweise in Form eines Sprühnebels, in die an der Öffnung (3) vorbeiströmende polare Flüssigkeitsphase eindringen kann. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Innere der Leitungen ( 1 ) und (2) im Bereich der gemeinsamen Öffnung (3) frei von zusätzlichen Einrichtungen, insbesondere frei von Turbulenzen oder Scherkräfte erzeugenden Hindernissen, Rühr- oder Dispergierhilfen ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Öffnung (3) kleiner ist als der Innendurchmesser der
Leitungen ( 1 ) und (2), und vorzugsweise im Bereich von 50 - 1 500 μm liegt.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Leitungen (1 ) und (2) im Bereich der Kontaktfläche und der Öffnung (3) entweder parallel oder einander überkreuzend angeordnet sind, oder dass die Leitung (2) mit einem Ende stirnseitig, vorzugsweise T- förmig, an die Aussenwand der Leitung ( 1 ) angrenzt.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Leitungen ( 1 ) und (2) zumindest im Bereich der gemeinsamen Kontaktfläche aus chemisch und mechanisch widerstandsfähigem Material, insbesondere aus Edelstahl oder einem geeigneten Hartkunststoff, gefertigt sind.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Leitungen ( 1 ) und (2) im Bereich der Kontaktfläche als vorgefertigte Einheit, insbesondere als Kreuzstrommodul (4), ausgebildet sind.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass stromabwärts von der Öffnung (3) eine Leitung ( V) von der Leitung ( 1 ) abzweigt und die Leitung ( 1 ) im Bereich der Abzweigung oder stromabwärts davon eine regelbare Sperre ( 1 5) enthält, mit deren Hilfe zumindest ein Teil des Flüssigkeitsstromes von der Leitung (1 ) in die Leitung (V) umgelenkt werden kann.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Förderung der Flüssigkeitsphasen eine Pumpe (6) umfassen, die in der Leitung ( 1 ) zwischen Vorratsbehälter (5) und Öffnung (3) angeordnet ist und die polare Flüssigkeitsphase aus dem Vorratsbehälter (5) heraus durch die Leitung ( 1 ) in Richtung zur Kontaktfläche mit der Öffnung (3) und weiter in den Sammelbehälter (7) und/oder über eine Leitung ( 1 ') zumindest teilweise wieder in den Vorratsbehälter (5) zurück befördert.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Förderung der Flüssigkeitsphasen eine Pumpe (9) umfassen, mit deren Hilfe die lipidhältige Phase aus einem Vorratsbehälter (8), gegebenenfalls über ein Filter ( 1 0), in einen Zwischen- behälter ( 1 1 ), sowie gegebenenfalls weiter durch die Leitung (2) und die
Öffnung (3) hindurch in die Leitung ( 1 ) befördert wird.
1 0. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Förderung der Flüssigkeitsphasen eine Druckquelle (1 3) umfassen, die mit einem Zwischenbehälter ( 1 1 ), gegebenenfalls über ein zwischengeschaltetes Filter ( 1 2), verbunden ist und welche mittels Drucküberlagerung durch Druckluft oder ein unter Druck stehendes Inertgas eine pumpenfreie Förderung der lipidhältigen Phase vom Zwischenbehälter (1 1 ) über die Leitung (2) durch die Öffnung (3) hindurch ermöglicht. 1 . Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei oder mehr Leitungen ( 1 ) und/oder zwei oder mehr Leitungen (2) umfasst, die zwei oder mehr gemeinsame Kontaktflächen mit jeweils mindestens einer gemeinsamen Öffnung (3) bilden. 2. Verfahren zur Herstellung von Lipidvesikeln durch druckgesteuertes Dosieren einer lipidhältigen Flüssigkeitsphase in eine strömende polare Flüssigkeitsphase, insbesondere unter Verwendung einer Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1 - 1 1 , wobei die polare Flüssigkeitsphase durch eine Leitung befördert wird, welche zumindest an einer Stelle ihrer Seitenwand eine Öffnung enthält, durch welche die lipidhältige
Flüssigkeitsphase unter Druck und in im wesentlichen senkrechter Richtung zur Fliessrichtung der polaren Flüssigkeitsphase gepresst und in die an der Öffnung vorbeiströmende polare Flüssigkeitsphase dosiert, insbesondere gesprüht, wird, worauf sich spontan und ohne Einwirkung mechanischer Rühr- oder Dispergierhilfen die Lipidvesikel bilden. 3. Verfahren nach Anspruch 1 2, worin die polare Flüssigkeitsphase vor Erreichen der Seitenwandöffnung eine laminare oder annähernd laminare Strömung aufweist. 4. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 1 3, worin die lipidhältige Flüssig- keitsphase mit einem Druck von 0.1 bis 1 5, vorzugsweise 0.3 bis 5 bar, durch die Öffnung hindurch in die vorbeiströmende polare Flüssigkeitsphase dosiert wird.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 1 4, worin die lipidhältige Flüssigkeitsphase in einer Menge von 1 - 100 μmol, vorzugsweise 2.5 - 25 μmol Lipid pro 1 ml polarer Flüssigkeitsphase, bezogen auf die Gesamtmenge an eingesetzter polarer Phase, zudosiert wird.
1 6. Verfahren nach Anspruch 1 5, worin nur ein Teil, vorzugsweise 1 0 - 50 Vol. % , der gesamten polaren Flüssigkeitsphase durch die Leitung hindurch zur Öffnung und - nach Beladung mit lipidhältiger Flüssigkeitsphase - als konzentrierte Vesikeldispersion weiter zu einem Sammelbehälter befördert wird, während der übrige Teil der polaren Flüssigkeitsphase zur Verdünnung der konzentrierten Vesikeldispersion verwendet und vorzugsweise im Sammelbehälter vorgelegt wird.
1 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 6, worin die lipidhältige Flüssigkeitsphase Ethanol als Lösungsmittel enthält und in einer Menge der polaren Flüssigkeitsphase zudosiert wird, die eine Endkonzentration von maximal 1 0 Vol. %, vorzugsweise maximal 7.5 Vol. % Ethanol in der polaren Flüssigkeitsphase ergibt.
1 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 7, worin zumindest ein Teil der polaren Flüssigkeitsphase nach Beladung mit lipidhältiger Flüssigkeitsphase rezirkuliert und einer neuerlichen Beladung mit lipidhältiger Flüssigkeitsphase zugeführt wird.
1 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 8, worin die polare Flüssigkeitsphase und/oder die lipidhältige Flüssigkeitsphase zumindest eine gewünschte Substanz, insbesondere einen pharmazeutischen Wirkstoff, zur Beladung der Lipidvesikel enthält.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 9, worin zumindest 60 % der entstehenden Lipidvesikeln einen Durchmesser von 1 00 bis 350 nm aufweisen.
21 . Native Lipidvesikelpräparation, erhältlich in einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 2 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, aller in der Präparation vorhandenen Lipidvesikel einen Durchmesser aufweisen, der innerhalb einer
5 Streubreite von maximal 250 nm, vorzugsweise von maximal 100 nm, liegt.
22. Native Lipidvesikelpräparation gemäss Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Streubreite 250 nm beträgt und mindestens 60 % der Lipidvesikel einen Durchmesser im Bereich von 1 00 - 350 nm
10 aufweisen.
23. Native Lipidvesikelpräparation gemäss Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Streubreite 1 00 nm beträgt und mindestens 60 % der Lipidvesikel einen Durchmesser im Bereich von 100 - 200 nm aufweisen.
15 24. Native Lipidvesikelpräparation gemäss einem der Ansprüche 21 bis 23, als Träger für kosmetische, diagnostische oder medizinisch-therapeutische Agenzien.
25. Native Lipidvesikelpräparation gemäss einem der Ansprüche 21 bis 23, zur Verwendung in der Kosmetik, Diagnostik oder medizinischen Therapie. 0 26. Native Lipidvesikelpräparation gemäss einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidvesikel ein kosmetisch, diagnostisch oder therapeutisch einsetzbares Agens enthalten.
27. Native Lipidvesikelpräparation gemäss einem der Ansprüche 21 bis 26, als Bestandteil einer kosmetisch, diagnostisch oder therapeutisch 5 einsetzbaren Zubereitung.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005060658A1 (en) * 2003-12-18 2005-07-07 Velocys, Inc. In situ mixing in microchannels
US6925766B2 (en) 2003-02-05 2005-08-09 Ibco Srl Multilayer slip resistant sheet material
WO2007073919A2 (en) 2005-12-28 2007-07-05 Nowicky Wassili Method and kit for the detection of cancer
DE102006054192A1 (de) * 2006-03-17 2007-09-20 Novosom Ag Effizientes Verfahren zur Beladung von amphoteren Liposomen mit Nukleinsäure-Wirkstoffen
DE102006015271A1 (de) * 2006-04-01 2007-10-11 Lohmann & Rauscher Gmbh & Co. Kg Biguanidhaltige Liposomen
EP2601965A1 (de) 2011-12-06 2013-06-12 Apeiron Biologics AG Zusammensetzungen zur Prävention oder Behandlung von Nebenwirkungen von EGFR-Hemmung
US8524274B2 (en) 2004-10-18 2013-09-03 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Liposomal composition comprising an active ingredient for relaxing smooth muscle, the production of this composition and the therapeutic use thereof

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU756196B2 (en) * 1998-11-13 2003-01-09 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
AU2003225689B2 (en) * 2002-03-05 2009-03-26 Transave, Inc. Methods for entrapment of bioactive agent in a liposome or lipid complex
ATE485031T1 (de) 2002-06-28 2010-11-15 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
US7718189B2 (en) * 2002-10-29 2010-05-18 Transave, Inc. Sustained release of antiinfectives
US7879351B2 (en) 2002-10-29 2011-02-01 Transave, Inc. High delivery rates for lipid based drug formulations, and methods of treatment thereof
PT1581236E (pt) * 2002-10-29 2013-12-24 Insmed Inc Libertação prolongada de anti-infecciosos
TWI395591B (zh) * 2004-04-01 2013-05-11 Oncothyreon Inc 黏液性糖蛋白（ｍｕｃ-１）疫苗
AT500143A1 (de) * 2004-04-22 2005-11-15 Sanochemia Pharmazeutika Ag Cholinesterase-inhibitoren in liposomen sowie deren herstellung und verwendung
AU2006274413B2 (en) * 2005-07-27 2013-01-10 Arbutus Biopharma Corporation Systems and methods for manufacturing liposomes
US20120021042A1 (en) * 2005-09-15 2012-01-26 Steffen Panzner Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
EP3067046B1 (de) * 2005-12-08 2020-03-25 Insmed Incorporated Antiinfektive zusammensetzungen auf lipidbasis zur behandlung von lungeninfekten
CN101330923B (zh) 2005-12-12 2015-01-07 Ac免疫有限公司 治疗性疫苗
EP2012750B1 (de) * 2006-04-06 2018-02-21 Insmed Incorporated Verfahren für koazervationsinduzierte liposomale verkapselung und formulierungen daraus
WO2008012062A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Antigenic proteoliposomes and method of manufacture
US20100196455A1 (en) 2007-05-04 2010-08-05 Transave, Inc. Compositions of Multicationic Drugs for Reducing Interactions with Polyanionic Biomolecules and Methods of Use Thereof
US9114081B2 (en) 2007-05-07 2015-08-25 Insmed Incorporated Methods of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
US9119783B2 (en) 2007-05-07 2015-09-01 Insmed Incorporated Method of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
US9333214B2 (en) 2007-05-07 2016-05-10 Insmed Incorporated Method for treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
AU2008308679B2 (en) * 2007-10-02 2015-01-29 Marina Biotech, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
US7745667B2 (en) * 2008-04-07 2010-06-29 Velocys Microchannel apparatus comprising structured walls, chemical processes, methods of making formaldehyde
CA2739046A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 Marina Biotech, Inc. Process and compositions for liposomal and effective delivery of nucleic acids
WO2011140627A1 (en) 2009-11-04 2011-11-17 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
WO2011120023A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting survivin gene expression uses thereof
EP2374535A1 (de) * 2010-04-06 2011-10-12 Bühler AG Verfahren und Vorrichtungen zur Vesikelbildung, insbesondere unter Verwendung von Block-Coplymeren
WO2011133584A2 (en) 2010-04-19 2011-10-27 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hras gene expression and uses thereof
WO2011139843A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Multi-sirna compositions for reducing gene expression
CA2816171A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Mindinvest Holdings Ltd. Liposomal drug composition containing a polymeric guanidine derivative
EP2668201A2 (de) 2011-01-28 2013-12-04 Sanofi Pasteur SA Immunologische zusammensetzungen mit hiv-gp41-polypeptidderivaten
US20140328759A1 (en) 2011-10-25 2014-11-06 The University Of British Columbia Limit size lipid nanoparticles and related methods
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
JP6133883B2 (ja) 2011-11-04 2017-05-24 日東電工株式会社 薬物送達用の脂質ナノ粒子の生成方法
CA2856742A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
SI2852391T1 (sl) 2012-05-21 2022-04-29 Insmed Incorporated Sistemi za obravnavo pljučnih infekcij
CN103536533B (zh) * 2012-07-17 2018-01-02 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种水溶性药物脂质体制备方法
WO2014048976A1 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Vaxdyn Sl Anti-acinetobacter baumannii immunogens
CA2891487A1 (en) 2012-11-29 2014-06-05 Insmed Incorporated Stabilized vancomycin formulations
CA2906732C (en) 2013-03-15 2023-08-08 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
DK3466432T3 (da) 2014-05-15 2020-09-28 Insmed Inc Fremgangsmåder til behandling af pulmonale non-tuberkuløse mykobakterielle infektioner
CA2977827C (en) * 2015-03-19 2023-10-17 University Of Connecticut Systems and methods for continuous manufacturing of liposomal drug formulations
US20210284998A1 (en) 2016-10-03 2021-09-16 Precision Nanosystems Inc. Compositions for Transfecting Resistant Cell Types
JP2021513508A (ja) 2018-02-12 2021-05-27 インテアールエヌエー テクノロジーズ ビー．ヴイ．ＩｎｔｅＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ． 抗がんマイクロｒｎａ及びその脂質製剤
WO2019191627A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Insmed Incorporated Methods for continuous manufacture of liposomal drug products
EP3773502A4 (de) 2018-04-06 2022-05-18 UCAR Health GmbH Behandlung von krebs durch guanidiniumderivate
AU2019362031A1 (en) * 2018-10-19 2021-04-08 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger RNA
EP3711749A1 (de) 2019-03-19 2020-09-23 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Verfahren zur herstellung von lipidnanopartikeln
GB202011367D0 (en) 2020-07-22 2020-09-02 Micropore Tech Limited Method of preparing liposomes
GB2600468A (en) 2020-10-30 2022-05-04 Excivion Ltd Adjuvant composition
DE102020214601A1 (de) 2020-11-19 2022-05-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen und hergestellte Flüssigkeit
EP4119220A1 (de) 2021-07-16 2023-01-18 Andreas Jahn Vorrichtung und verfahren zur bildung von organischen nanopartikeln

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4895452A (en) * 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
US5000887A (en) * 1988-05-17 1991-03-19 Liposome Technology, Inc. Preparation of uniform-size liposomes
WO2000029103A1 (en) * 1998-11-13 2000-05-25 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4206197A (en) 1975-11-26 1980-06-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Chemical encapsulation and distribution
AU598002B2 (en) 1986-07-15 1990-06-14 Cilag Ltd. Method of preparing single bilayered liposomes
EP0892638B1 (de) 1996-04-04 2002-11-13 Cilag AG Topische vitamin d zusammensetzung auf liposomenbasis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4895452A (en) * 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
US5000887A (en) * 1988-05-17 1991-03-19 Liposome Technology, Inc. Preparation of uniform-size liposomes
WO2000029103A1 (en) * 1998-11-13 2000-05-25 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6925766B2 (en) 2003-02-05 2005-08-09 Ibco Srl Multilayer slip resistant sheet material
WO2005060658A1 (en) * 2003-12-18 2005-07-07 Velocys, Inc. In situ mixing in microchannels
US7470408B2 (en) 2003-12-18 2008-12-30 Velocys In situ mixing in microchannels
US8524274B2 (en) 2004-10-18 2013-09-03 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Liposomal composition comprising an active ingredient for relaxing smooth muscle, the production of this composition and the therapeutic use thereof
WO2007073919A2 (en) 2005-12-28 2007-07-05 Nowicky Wassili Method and kit for the detection of cancer
DE102006054192A1 (de) * 2006-03-17 2007-09-20 Novosom Ag Effizientes Verfahren zur Beladung von amphoteren Liposomen mit Nukleinsäure-Wirkstoffen
DE102006015271A1 (de) * 2006-04-01 2007-10-11 Lohmann & Rauscher Gmbh & Co. Kg Biguanidhaltige Liposomen
WO2007115635A1 (de) * 2006-04-01 2007-10-18 Lohmann & Rauscher Gmbh & Co. Kg Biguanidhaltige liposomen
EP2601965A1 (de) 2011-12-06 2013-06-12 Apeiron Biologics AG Zusammensetzungen zur Prävention oder Behandlung von Nebenwirkungen von EGFR-Hemmung
WO2013083695A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 Apeiron Biologics Ag Compositions for preventing or treating adverse reactions of egfr inhibition

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