ES2220829T3 - Procedimiento y dispositivo para la preparacion de vesiculas lipidicas. - Google Patents
Procedimiento y dispositivo para la preparacion de vesiculas lipidicas.Info
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Abstract
Dispositivo para la preparación de vesículas lipídicas, que contiene los siguientes componentes: un conducto hueco (1) en el interior para el transporte de una fase líquida polar, un conducto hueco (2) en el interior para el transporte de una fase líquida orgánica que contiene lípidos, un recipiente colector (7) para recoger vesículas lipídicas producidas, así como medios para transportar las fases líquidas a través de los conductos (1) y (2), caracterizado porque el conducto (1) está conectado con el conducto (2) a través de una abertura (3) común que deja pasar líquido, estando la abertura (3) común dispuesta de tal manera que la fase líquida orgánica pueda ingresar desde el conducto (2) a través de la abertura (3), esencialmente en forma perpendicular a la dirección de flujo de la fase líquida polar que fluye en el conducto (1) y pueda penetrar preferentemente de forma de niebla pulverizada en la fase líquida polar que fluye en el lado de la abertura (3), y en el que, además, los conductos (1) y (2) en el ámbito de la abertura (3) común están exentos de instalaciones que generen turbulencias o fuerzas de cizallamiento.
Description
Procedimiento y dispositivo para la preparación
de vesículas lipídicas.
La invención se refiere a un procedimiento y a un
dispositivo para la preparación especialmente moderada de vesículas,
en particular, vesículas lipídicas, a escala industrial y de
laboratorio.
En el estado de la técnica se conocen numerosas
preparaciones diferentes de vesículas. Comprenden tanto vesículas
lipídicas puras, que también se denominan liposomas, como vesículas
lipídicas que están equipadas con marcadores específicos de células
como, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, en
particular, Fab' y F(ab')_{2} y la mayoría de las veces se
denominan inmunoliposomas, o vesículas lipídicas que están equipadas
con proteínas de envoltura viral o con antígenos superficiales, por
ejemplo, hemaglutinina, y que usualmente se denominan virosomas.
Además, también se conocieron vesículas lipídicas que contienen
tanto antígenos virales como moléculas marcadoras específicas en la
membrana vesicular. En general, las vesículas contienen una fase
acuosa que en el caso más simple puede ser agua pura, sistemas
reguladores acuosos como, por ejemplo, PBS o una solución
fisiológica de cloruro de sodio. Sin embargo, para usos
farmacéuticos y medicinales, incluyendo usos para diagnóstico, las
vesículas la mayoría de las veces contienen una o varias sustancias
deseadas, por ejemplo, un principio fisiológicamente activo, una
sustancia medicamentosa, un colorante especial o también material de
ácidos nucleicos.
La categoría más simple y más difundida de
vesículas lipídicas son los liposomas. En su mayoría, están
sintetizados a partir de fosfolípidos que espontáneamente forman
estructura de membrana cuando son dispersados en sistemas acuosos.
De esta manera, una parte del sistema acuoso es encerrada por estas
estructuras en el transcurso de la formación de vesículas. En la
práctica, la mayoría de las veces se prefieren aquellos liposomas
cuya membrana vesicular esté formada como membranas naturales como
capa doble lipídica ("bi-layer").
Desde la primera presentación de liposomas por
Bangham 1964 (J. Mol. Biol. 13:238-252, 1965) se
establecieron una serie de diversas técnicas de preparación de
liposomas. A éstas pertenecen procedimientos en los que se mezclan
lípidos juntamente con el principio activo deseado en un disolvente
acuoso apropiado y, a continuación, se radian con ultrasonido, por
lo que se forman vesículas. En otros procedimientos, por ejemplo,
según Stegman y col. (EMBO Journal 6:2651-2659,
1987), se elimina lentamente el disolvente mediante diálisis o por
micro-transportadores, por lo que también
espontáneamente se forman vesículas que encierran una parte de la
fase acuosa.
Los procedimientos conocidos de homogeneización a
alta presión, por micro-fluidizantes o por
ultrasonido para la preparación de liposomas se destacan por el
aprovechamiento de las fuerzas de cizallamiento y los efectos de
cavitación que se forman durante el proceso, para lograr la
formación de vesículas lipídicas de un tamaño definido. Los efectos
de cavitación localmente conducen a presiones y temperaturas muy
altas. Los liposomas, en particular, restos de ácidos grasos no
saturados, pueden ser dañados de forma oxidativa por esto y, de esta
manera, puede alterarse su estabilidad. Por esta razón, en tales
procedimientos deben adicionarse antioxidantes u otros componentes
protectores y/o todo el procedimiento debe llevarse a cabo con
exclusión de oxígeno, por ejemplo, en una atmósfera de nitrógeno
como, por ejemplo, está descrito en los documentos EP 0253619 o US
5,834,016. En estos procedimientos, la preparación de las vesículas
lipídicas se efectúa en varios ciclos.
Además, por la llamada "extrusión" pueden
prepararse grande volúmenes de liposomas de tamaño definido. En la
extrusión se presionan estructuras de membranas lipídicas
previamente preparadas, por ejemplo, liposomas disponibles en el
mercado (> 500 nm), con gran presión a través de membranas con un
tamaño de poros definido y así se ajustan al diámetro deseado. Para
esto, de forma similar a la homogeneización a alta presión y a los
procedimientos por ultrasonido, deben recorrerse varios ciclos para
obtener una distribución estrecha de tamaños en el producto final.
Una desventaja posible de este procedimiento consiste en pérdidas
considerables de producto, que se producen por la apertura y el
nuevo cierre de las vesículas en el transcurso del pasaje a través
de las membranas. En este procedimiento realmente pueden producirse
pérdidas de producto de más del 50 por ciento, como lo han
demostrado ensayos comparativos propios.
Otro procedimiento para la preparación de
vesículas lipídicas de distribución uniforme de tamaños se describe
en el documento US 5,000,887. Aquí se disuelven lípidos en un
disolvente miscible con agua, por ejemplo, etanol, y se adiciona un
medio acuoso hasta alcanzar una relación de mezcla en la que
comienza la formación de vesículas. A continuación, se aumenta la
relación de agua respecto al disolvente, manteniendo constante el
volumen de la mezcla, hasta que se formen vesículas de tamaño
uniforme, pudiéndose ajustar el tamaño medio de las vesículas
mediante la variación de la fuerza iónica y la elección de la
composición lipídica.
Otro procedimiento que se sirve de la formación
espontánea de vesículas en la transición de fases de la fase
orgánica a la fase inorgánica, es el procedimiento de inyección de
disolvente. El procedimiento de auto-ensamblado
(disposición espontánea de los lípidos en vesículas) tiene lugar
durante la inyección, efectuada con una aguja fina, de los lípidos,
disueltos en una fase orgánica, en una fase acuosa (u otra fase
polar apropiada) fuertemente agitada. Este procedimiento es muy
sencillo, sin embargo, tiene la gran desventaja de que a
concentraciones mayores de lípidos se producen liposomas grandes y
nada homogéneos. Este procedimiento fue descrito por primera vez por
Batzri y Korn (Biochimica et Biophysica Acta, 298:
1015-1019, 1973).
El documento EP 253619 describe un procedimiento
según el procedimiento de inyección de disolvente, mencionado en
último término, en el que en un homogeneizador de alta velocidad se
inyecta a presión una fase orgánica con lípidos disueltos y se
dispersa por fuerte agitación con fuertes turbulencias en una fase
acuosa, con lo que se forman liposomas. Se debe ver como posible
desventaja de este procedimiento que en el homogeneizador se
producen altas fuerzas de cizallamiento, efectos de cavitación y de
forma local y temporaria, aumentos considerables de temperatura. Por
tales efectos pueden desencadenarse reacciones de oxidación en
restos de ácidos grasos no saturados y otras reacciones indeseadas
que pueden al menos dañar, o incluso, en ciertas condiciones pueden
inutilizar para el uso posterior tanto lípidos como sustancias o
principios activos susceptibles a fuerzas de cizallamiento, a
oxidación o a temperaturas elevadas.
En el documento US 4,895,452 también se describe
un procedimiento similar, en el que se producen vesículas
multilaminares o de escasas láminas, en una cámara de mezcla propia,
en la que se inyectan de forma tangencial las corrientes líquidas de
las fases polares y las que contienen los lípidos, para lograr de
esta manera fuerzas de cizallamiento lo más altas posibles y un buen
mezclado.
El documento WO 00/29103 también da a conocer un
procedimiento en el que se producen vesículas lipídicas a partir de
una corriente que contiene lípidos y una corriente líquida acuosa
mediante dispositivos mezcladores apropiados y usando altas fuerzas
de cizallamiento.
En cambio, la presente invención, que en esencia
representa una etapa posterior de desarrollo a partir del
procedimiento de inyección de disolventes, ya no presenta las
desventajas de los procedimientos conocidos, sino permite, mediante
una manera moderada de preparación, el ajuste selectivo de una
estrecha distribución de tamaños de liposomas de un tamaño deseado.
Además, el procedimiento conforme a la invención posibilita un
funcionamiento continuo, así como un fácil aumento de la escala para
la producción industrial de preparaciones de vesículas lipídicas
exentas de gérmenes y/o de piretógenos, pero también una reducción
de la escala para la micro-producción, es decir, la
producción de cantidades mínimas de vesículas lipídicas, por
ejemplo, para el fin de la investigación científica.
El objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento para la preparación de vesículas lipídicas de manera
especialmente moderada, cuya escala de producción pueda reducirse o
aumentarse, en particular, de forma continua, que provea
preparaciones de vesículas repartidas de manera reproduciblemente
homogénea y en una realización preferida permita la producción de
preparaciones de vesículas exentas de gérmenes y/o de pirógenos.
A diferencia del conocido procedimiento de
inyección de etanol, se bombea una fase polar, normalmente acuosa,
conforme a la presente invención, a partir de un recipiente de
reserva hacia un sistema contiguo de conductos con uno o varios
conductos. Cada conducto a través del cual fluye la corriente de la
fase polar, que se aleja del recipiente de reserva, contiene al
menos una perforación o abertura, dado el caso, varias perforaciones
o aberturas, realizadas de manera muy exacta, dispuestas en posición
lateral, que atraviesan completamente la pared del conducto y del
lado externo está(n) unida(s) con al menos uno, dado el caso,
varios conductos de suministro para la alimentación a presión de la
fase lipídica disuelta en un disolvente apropiado, en particular,
etanol.
Sin embargo, en contraste con el procedimiento
clásico de inyección de etanol, en el dispositivo conforme a la
invención no hay aguja de inyección que esté introducida en la fase
acuosa, sino que el al menos un conducto de suministro para la fase
lipídica conforme a la invención termina en la al menos una
perforación o abertura del sistema de conductos para la fase acuosa
que se aleja del recipiente de reserva, de manera que en el interior
de los conductos no penetren ningún obstáculo o barrera que
ocasionen turbulencias o fuerzas de cizallamiento. Mediante la
alimentación conducida por presión de la fase lipídica en la fase
polar/ acuosa que pasa en corriente preferentemente laminar, en el
ámbito del encuentro de ambas fases se forman las estructuras
lipídicas deseadas mediante el efecto de
"auto-ensamblado" dirigible de manera
controlada, formando vesículas de un tamaño uniforme y una
distribución estrecha de tamaños, hasta ahora no logrados.
De manera asombrosa y completamente inesperada,
además se demostró que en el procedimiento conforme a la invención
parecen no influir en la formación de vesículas y en la distribución
de los tamaños de vesículas ni concentraciones mayores de lípidos ni
concentraciones mayores de etanol. Esto está en una cierta
contradicción con la opinión establecida en la materia, que la
formación de vesículas depende de la concentración de lípidos, de la
concentración de etanol, de las velocidades de corriente de la fase
acuosa y de la fase orgánica, así como de la velocidad de agitación
del dispositivo de homogeneización.
Conforme a la presente invención, no se necesitan
ni ultrasonido ni homogeneizador para la formación de vesículas o
para ajustar el tamaño deseado de vesículas. También los
procedimientos de filtración ("procedimiento de extrusión"),
conocidos del estado de la técnica para ajustar un tamaño lo más
uniforme posible de las vesículas pueden ser reemplazados
ventajosamente por la presente invención. Porque el tamaño de
vesículas y la distribución de tamaños, a saber, pueden dirigirse
conforme a la invención mediante la presión de adición: mientras más
alta sea la presión de alimentación de la fase lipídica
suministrada, menor será el tamaño de las vesículas y más precisa o
estrecha será la distribución de tamaños de las vesículas lipídicas
formadas en la preparación lipídica nativa, aún a altas
concentraciones de lípidos.
Mediante el procedimiento conforme a la invención
no sólo pueden encerrarse principios activos hidrosolubles en
liposomas, sino también aquellos que se incluyen en la fase orgánica
y son introducidos en el sistema acuoso juntamente con los lípidos
como, por ejemplo, tales que se conocen de los documentos EP 0253619
o US 5,834,016. En estos casos el sistema acuoso puede ser agua,
solución fisiológica de cloruro de sodio, PBS o cualquier tampón
apropiado. Las sustancias incluidas en la fase orgánica altamente
apolar, durante la formación de las vesículas lipídicas o bien, son
integradas completamente o parcialmente en la membrana lipídica
doble o bien se depositan íntimamente unidas en ésta por
interacciones lipófilas. También es posible incluir en ambas fases,
es decir, tanto en la fase polar como en la fase orgánica que
contiene lípidos, sustancias o principios activos deseados y cargar
con éstos los liposomas.
Para el presente procedimiento puede
seleccionarse tanto una conducción continua como discontinua del
procedimiento. En el caso de la manera de proceder discontinua, se
hace circular un volumen pre-establecido de fase
polar en el sistema, es decir, se conduce de vuelta al recipiente
inicial y se carga nuevamente con fase que contiene lípidos. Por el
suministro de fase que contiene lípidos se enriquece sucesivamente
la solución polar con vesículas lipídicas. En el proceso continuo no
se hace recircular la fase polar, sino que, después de la adición de
la fase que contiene lípidos y de la formación espontánea de
vesículas, se recoge en un recipiente colector externo como
suspensión de vesículas. Los diferentes modos de proceder no
influyen sobre los tamaños de las vesículas ni en las distribuciones
de tamaños de ambas suspensiones de vesículas.
Una variante del procedimiento continuo consiste
en colocar, por un lado, fase polar de tampón en el recipiente
colector y, por el otro lado, aumentar la cantidad usual de lípido
adicionado (y, preferentemente, también de disolvente orgánico) al
doble, hasta diez veces, por cada unidad de volumen de fase polar/
acuosa que pasa fluyendo. Así se puede incrementar el rendimiento
volumétrico de producto (cantidad de fase polar con liposomas
incorporados, que preferentemente contiene principio activo), de
forma proporcional a la cantidad de fase lipídica suministrada. En
el caso de que las sustancias que se han de incorporar en liposomas
sean lipófilas y que se incluyan junto con los lípidos en la fase
orgánica, puede lograrse un rendimiento del cien por ciento o de al
menos aproximadamente el cien por ciento, también sin la
recirculación, es decir, que la cantidad total o casi la cantidad
total de sustancia deseada adicionada, por ejemplo, una sustancia
medicamentosa, esté contenida luego en las vesículas lipídicas.
Los tamaños de vesículas y la distribución de
tamaños aquí descritos fueron averiguados mediante citometría de
flujo, adaptada por Vorauer-Uhl y col., Cytometrie
39(2): 166-71 (2000). En este procedimiento,
a diferencia de la dispersión estática o dinámica convencional de
rayos láser, las vesículas se miden individualmente en un sistema
capilar (10000 vesículas por medición). Mediante este procedimiento
pueden caracterizarse de manera fiable tanto poblaciones homogéneas
como heterogéneas de vesículas.
Conforme a la invención, se transportan la fase
polar y la fase que contiene lípidos de forma separada y se conducen
hacia un ámbito de cruce de fases que preferentemente está
configurado en forma de un módulo de corrientes cruzadas. La entrada
de la corriente de la fase que contiene lípidos en la fase polar,
que también fluye, se efectúa a través de al menos una abertura
dispuesta lateralmente en el sistema de conductos de la fase polar,
preferentemente, dentro del módulo de corrientes cruzadas. Las
vesículas lipídicas que se forman al encontrarse ambas fases son
conducidas juntas con la fase polar (por ejemplo, acuosa) o bien,
hacia el recipiente inicial, o bien se siguen transportando hacia un
recipiente colector. La formación de las vesículas lipídicas se
produce espontáneamente en el ámbito del cruce de fases, es decir,
en el ámbito del encuentro de la fase polar y la fase que contiene
los lípidos. Para evitar en alto grado efectos de cavitación y/ o
fuerzas de cizallamiento indeseados, así como los aumentos locales
de temperatura que los acompañan, preferentemente se conduce la
corriente de líquido de al menos la fase polar de forma en lo
posible laminar hacia la abertura o las aberturas. En el caso de
sustancias o mezclas de sustancias especialmente susceptibles puede
ser ventajoso aspirar a que también corriente abajo del ámbito del
cruce de las fases haya un comportamiento de flujo de la dispersión
de fases formada que genere poca fuerza de cizallamiento.
En contraste con los procedimientos de inyección
lípido/ etanol conocidos, conforme a la presente invención, en el
ámbito del cruce de las fases ni se agita el líquido, ni se usa un
homogeneizador u otro dispositivo auxiliar mecánico de agitación o
dispersión. La alimentación de la fase que contiene lípidos en la
fase polar/ acuosa se efectúa a presión relativamente baja y por lo
tanto con poca formación de remolino, saliendo la fase lipídica
probablemente en forma de una especie de niebla pulverizada de la
abertura del conducto y entra muy rápidamente en interacción con la
fase polar. Regulando las tasas de alimentación y las velocidades de
flujo tanto de la fase polar como de la fase que contiene lípidos y
variando la presión de adición para alimentar o "adicionar por
pulverización" la fase que contiene lípidos, puede controlarse el
proceso de "auto-ensamblado" de las vesículas
lipídicas. Al aumentar la presión de adición, las vesículas
lipídicas que se forman serán más pequeñas y al mismo tiempo también
se estrecha la distribución de tamaños.
Con ayuda de la presente invención, pueden
efectuarse las preparaciones de vesículas lipídicas a diferentes
escalas de producción, desde la escala de ensayos, es decir, de
laboratorio, hasta dimensiones industriales. Como la formación de
las vesículas no se lleva a cabo en un recipiente agitado, sino en
una pieza central del sistema de conductos, preferentemente, en el
módulo de corrientes cruzadas mencionado, en la preparación conforme
a la invención, manteniendo constantes los parámetros esenciales del
procedimiento, como la presión de adición de la fase que contiene
lípidos, el volumen de flujo de la fase polar, la relación entre los
volúmenes de la fase polar y de la fase que contiene lípidos y la
concentración de lípidos de la fase que contiene lípidos, siempre se
producen preparaciones de calidad uniforme y reproducible, en cuanto
a la tasa de inclusión de producto, el tamaño de vesículas y la
distribución de tamaños de vesículas, independientemente de la
escala de producción elegida. Con la elección de secciones
transversales de conducto correspondientes y/o el aumento del número
y/o del diámetro de la(s) abertura(s) en el sistema
conductor de la fase polar, además puede adecuarse de forma flexible
el rendimiento de volumen a diversas normas de producción.
El principio de la preparación también permite
conducir al menos parcialmente en circuito cerrado la dispersión de
fases que se forma en el ámbito del módulo de corrientes cruzadas y,
dado el caso, conducirla varias veces consecutivas nuevamente al
ámbito del cruce de fases y cargarla con fase que contiene
lípidos.
También puede aumentarse la tasa de inclusión en
las vesículas lipídicas (grado de aprovechamiento) de las sustancias
disueltas en la fase polar, aumentando la proporción de volumen de
la fase que contiene lípidos e introduciendo mayores volúmenes de
fase que contiene lípidos por unidad de tiempo en la corriente de
solución polar. Corriente abajo del ámbito del cruce de las fases
puede diluirse la dispersión de fases formada con un disolvente
polar, por ejemplo, con el vehículo de la fase polar, para aumentar
la estabilidad de la preparación de liposomas, si fuera
necesario.
La presente invención también comprende un
dispositivo para la preparación de vesículas lipídicas. En principio
está compuesto por un primer recipiente de reserva para la fase
polar y un segundo recipiente de reserva separado, para la fase
altamente apolar que contiene lípidos; un recipiente colector para
recibir la preparación de vesículas formada; un sistema conductor
que conduce desde el primer recipiente de reserva (fase polar) hasta
el recipiente colector y que al menos en un lugar del conducto o de
cada conducto, presenta una abertura o perforación definida,
dispuesta en posición lateral, para la entrada de la fase que
contiene lípidos; otro sistema conductor que conduce desde el
segundo recipiente de reserva (fase que contiene lípidos) hasta al
menos una de esas aberturas o perforaciones laterales del primer
sistema conductor; así como medios para producir las corrientes
necesarias de los líquidos, perfiles de corriente y presiones, para
el transporte controlado de las fases y de la dispersión de fases
que se forma.
Preferentemente, aquella parte del sistema
conductor para la fase polar que presenta la al menos una abertura
lateral, así como la parte del sistema conductor de la fase que
contiene lípidos con la que está conectada, se encuentran en un
módulo de corrientes cruzadas que puede ser una unidad técnicamente
pre-fabricada que puede integrarse fácil y
rápidamente como pieza central de unión en el sistema conductor de
ambas fases. Se prefiere que al menos dentro de este módulo de
corrientes cruzadas los conductos de alimentación de la fase polar y
de la fase que contiene lípidos sean de material resistente y
estable frente a las sustancias químicas, por ejemplo, de acero
inoxidable o plástico rígido y estén unidos de forma ajustada y no
deslizable, por ejemplo, mediante una soldadura. En el
funcionamiento discontinuo o semi-continuo, además,
el primer recipiente de reserva puede servir simultáneamente de
recipiente colector, conduciéndose al menos una parte del sistema
conductor, que se aleja del recipiente de reserva, en circuito
cerrado, de manera que nuevamente desemboque en el recipiente de
reserva para que al menos una parte de la fase polar circule, e
incluyendo vesículas lipídicas nuevas formadas, sea retornada al
recipiente de reserva/ recipiente colector.
La figura 1A muestra una representación
esquemática (vista en planta) de un módulo de corrientes cruzadas
con un conducto de líquido para la fase polar (representado de forma
vertical) y un conducto lateral de alimentación para la fase que
contiene lípidos (representado de forma horizontal); los sentidos
del flujo están indicados por flechas;
La figura 1B muestra una vista en sección
transversal del módulo de corrientes cruzadas de la figura 1A;
La figura 1C muestra una vista en sección
transversal de un módulo de corrientes cruzadas con disposición en
forma de T de los conductos de alimentación para la fase polar y la
fase que contiene lípidos;
La figura 2 muestra una representación
esquemática del dispositivo conforme a la invención para un
funcionamiento (por ejemplo, continuo) sin retorno de la fase polar
o sea, de la dispersión de fases;
La figura 3 muestra una representación
esquemática del dispositivo de la figura 2 para un funcionamiento
(por ejemplo, discontinuo) con retorno de la fase polar o sea, de la
dispersión de fases, al recipiente de reserva,
La figura 4 muestra distribuciones de tamaños de
preparaciones de liposomas, preparadas mediante el procedimiento
directo sin retorno (curva B) y mediante un procedimiento circulante
(curva A) con retorno de la dispersión de fases hacia el recipiente
inicial y subsiguiente carga posterior con fase lipídica (ordenada:
porcentaje de la población de vesículas; abscisa: diámetro de las
vesículas lipídicas en nm);
Las figuras 5 y 5A muestran distribuciones de
tamaños en preparaciones de liposomas (20 \mu moles DPPC
(dipalmitoil-fosfatidilcolina)/ml de fase polar)
preparadas a diferentes presiones de adición (1,2 bar y 2,4 bar o
2,5 y 4,5 bar) de la fase que contiene lípidos (ordenada: porcentaje
de la población de vesículas, abscisa: diámetro de las vesículas
lipídicas en nm);
La figura 6 muestra las distribuciones de tamaños
de las preparaciones de liposomas (10 \mu moles de DPPC/ ml de
fase polar), preparadas a diferentes presiones de adición (0,3, 1,2
y 2 bar) de la fase que contiene lípidos (ordenada: porcentaje de la
población de vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas
lipídicas en nm);
La figura 7 muestra las distribuciones de tamaños
dentro de preparaciones de liposomas, dependiendo de la relación de
la cantidad de lípidos usada (en \mu moles) por parte en volumen
(en ml) de la fase polar (5, 10 y 20 \mu moles/ml) con las demás
condiciones constantes (ordenada: porcentaje de la población de
vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas lipídicas en
nm);
La figura 8 muestra la reproducibilidad de la
distribución de tamaños de vesículas en condiciones constantes, para
tres series de ensayos (ordenada: porcentaje de la población de
vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas lipídicas en
nm);
La figura 9 muestra una comparación de la
distribución de tamaños de vesículas lipídicas entre un
procedimiento directo de una etapa (curva A) y un procedimiento
(curva B) con relación de mezcla aumentada (volumen de adición de la
fase lipídica por unidad de volumen de fase polar) y subsiguiente
dilución de la dispersión de fases (ordenada: porcentaje de la
población de vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas
lipídicas en nm);
La figura 9A muestra una comparación de la
distribución de los tamaños de las vesículas lipídicas entre tres
procedimientos con relación de mezcla aumentada (volumen de adición
de la fase lipídica por unidad de volumen de fase polar) y dilución
subsiguiente de la dispersión de fases (ordenada: porcentaje de la
población de vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas
lipídicas en nm);
La figura 10 muestra la distribución de tamaños
de las vesículas lipídicas en dos preparaciones de liposomas,
preparadas con módulos de corrientes cruzadas con perforaciones de
150 y 250 \mum de diámetro (ordenada: porcentaje de la población
de vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas lipídicas
en nm).
La figura 11 muestra la distribución de tamaños
de las vesículas lipídicas en dos preparaciones de liposomas,
preparadas con módulos de corrientes cruzadas (perforación de 250
\mum) de un volumen de producción de 0,3 l (curva A) y un volumen
de producción de 2,5 l (curva B). (Ordenada: porcentaje de la
población de vesículas lipídicas; abscisa: diámetro de las vesículas
lipídicas en nm);
La figura 12 muestra curvas de flujo/ presión con
etanol al 92% en volumen, a 55ºC, usando un módulo de corrientes
cruzadas con perforaciones con diámetros de 150, 200 y 250
\mum;
La figura 13 muestra tasas de flujo de PBS como
fase polar, a diferentes diámetros de conducto (6, 8 y 10 mm; bomba:
bomba peristáltica del tipo Ismatec SA0702).
Como vehículo de la fase polar, tanto para
preparaciones cosméticas como para preparaciones farmacéuticas, en
particular, tales para usos medicinales, preferentemente, se usan
sistemas acuosos, por ejemplo, agua pura, PBS (solución fisiológica
de cloruro de sodio con tampón fosfato), solución fisiológica de
cloruro de sodio u otro tampón apropiado y aceptable en farmacia,
dado el caso, con los aditivos usuales, como conservantes,
aromatizantes, colorantes y similares.
El vehículo de la fase que contiene lípidos
preferentemente se selecciona entre tales disolventes o mezclas de
disolventes orgánicos atóxicos, farmacéuticamente aceptables que
sean bien apropiados para disolver los lípidos o mezclas de lípidos
elegidos para el respectivo fin de uso, y las sustancias, dado el
caso, adicionales. Tales sustancias adicionales pueden ser, por
ejemplo, péptidos virales fusogénicos, como, por ejemplo,
hemaglutinina de influenza o marcadores específicos de células como,
por ejemplo, fragmentos de anticuerpos o principios activos
lipófilos como, por ejemplo, econazol y similares. Como disolventes
preferidos, entran en consideración alcoholes inferiores (de 1 a 6
átomos de carbono), como metanol, etanol,
n-propanol, isopropanol, n-butanol,
pudiéndose usar estos disolventes solos, en mezcla y/o, dado el
caso, juntos con un tampón apropiado.
Las vesículas lipídicas no están limitadas a
determinados lípidos o composiciones de lípidos. Según el propósito
del uso, pueden contener lípidos simples y/o complejos, en
particular, fosfolípidos, glucolípidos, lípidos derivatizados, otros
lípidos naturales o sintéticos, de naturaleza catiónica, aniónica
y/o neutral. Tales lípidos son conocidos en el estado de la técnica.
También pueden introducirse lipoproteínas o
lipo-polisacáridos en la membrana de las vesículas
lipídicas, mediante el procedimiento de preparación conforme a la
invención. Pueden adicionarse agentes estabilizantes de la membrana,
como colesterol o derivados de colesterol o polietilenglicol y sus
derivados.
El concepto "vesícula lipídica", como se
entiende dentro del marco de la presente invención, comprende tanto
vesículas lipídicas puras, formadas exclusivamente por lípidos,
también denominadas liposomas, como vesículas lipídicas que están
equipadas con marcadores específicos de células, por ejemplo,
citoquinas, hormonas de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos, y con frecuencia son denominados inmunoliposomas, o
vesículas lipídicas que están equipadas con proteínas virales o
antígenos, por ejemplo, hemaglutinina y usualmente son denominadas
virosomas. Además, las vesículas lipídicas pueden contener tanto
antígenos virales como marcadores específicos en la membrana
vesicular.
Por "preparación nativa de vesículas
lipídicas" se debe entender una suspensión de vesículas lipídicas
que se formó en condiciones de baja fuerza de cizallamiento o
exentas de fuerza de cizallamiento, inmediatamente y sin la acción
de medios auxiliares adicionales como, por ejemplo, ultrasonido o
dispositivos auxiliares mecánicos de agitación o dispersión, sólo
por el encuentro conforme a la invención de la fase polar con la
fase que contiene lípidos y sin haber sido sometida a otro
tratamiento posterior, con excepción de una dilución subsiguiente en
todo caso con un disolvente polar, en particular, sometida a ningún
tratamiento posterior para el ajuste de un tamaño de vesículas o una
distribución de tamaños de vesículas deseados.
Con "sustancia deseada" se quiere indicar
cualquier sustancia química o compuesto con los que se pueden cargar
vesículas lipídicas, o bien, adhiriendo la sustancia de forma
externa a la membrana vesicular y/o integrándola a la membrana
vesicular y/o encerrándola en el espacio interno de la vesícula
lipídica, y con ayuda de la vesícula lipídica puede ser llevada a un
lugar meta deseado in vitro y/o in vivo. Esta
sustancia puede ser cualquier sustancia para ensayo, por ejemplo,
para fines científicos, o una sustancia de efecto farmacéutico, un
principio activo medicamentoso, un placebo, una sustancia para fines
cosméticos, un colorante, un compuesto marcado de forma radioactiva
o fluorescente para fines terapéuticos o de diagnóstico, u otro
compuesto químico o mezcla de compuestos químicos.
El principio en que se basa la invención, del
encuentro de la fase polar (por ejemplo, acuosa) y la fase lipídica,
está representado de forma esquemática en las figuras 1A, 1B y 1C.
Un conducto de interior hueco de líquidos 2, que transporta la fase
orgánica lipídica en el sentido de la flecha horizontal, está
conectado con el lado externo con un conducto, también de interior
hueco, de líquido 1, que transporta la fase polar (acuosa). En el
ámbito del lugar de contacto entre ambos conductos se encuentra al
menos una perforación o abertura 3 que atraviesa la pared lateral
del conducto 1 y atraviesa la pared lateral o frontal limitante del
conducto 2 y forma una conexión que deja pasar líquido, entre el
interior del conducto 1 y el interior del conducto 2. Aquí el
conducto 2 puede cruzar el conducto 1 (módulo de corrientes
cruzadas) como está representado de forma esquemática en las figuras
1A y 1B, o puede estar fijado directamente con su lado frontal a la
pared lateral del conducto 1, de manera ajustada y no deslizable,
por ejemplo, mediante una soldadura, como está representado de forma
esquemática en la figura 1C.
El núcleo de la presente invención es un
dispositivo para la preparación de las vesículas lipídicas, como
está representado a manera de ejemplo en las figuras 2 y 3. En un
módulo de corrientes cruzadas 4, un conducto de líquido 2 (fase
lipídica) está conectado con un conducto 1 (fase polar) de tal
manera que forman una superficie común de contacto con sus lados
externos y, dado el caso, se superponen uno al otro, no siendo
relevante en qué ángulo se superponen o cruzan ambos conductos. En
principio, también pueden estar dispuestos y estar conectados de
forma paralela el uno respecto al otro, o en forma de T, como está
representado en la figura 1C. Sin embargo, es esencial que ambos
conductos en el ámbito de su superficie común de contacto al menos
presenten una abertura común 3, por ejemplo, una perforación, que
conecte los espacios interiores de ambos conductos 1 y 2 y permita
el pasaje de líquido. A través de la abertura 3 se suministra la
fase lipídica, que fluye a través del conducto 2, a una
sobre-presión moderada, preferentemente, de 0,1 a 15
bar, a la corriente de fase polar que pasa fluyendo al lado de la
abertura 3. La abertura común 3 está dispuesta de tal manera que la
fase líquida orgánica pueda introducirse desde el conducto 2, a
través de la abertura 3, a la fase de líquido polar que fluye al
lado de la abertura 3, de forma transversal, preferentemente, de
forma esencialmente perpendicular a la dirección del flujo de la
fase polar que fluye en el conducto 1, preferentemente, de forma de
una niebla pulverizada.
"Esencialmente perpendicular" aquí significa
que la alimentación o pulverización de la fase lipídica no se
efectúa en el sentido de la corriente o contra el sentido de la
corriente de la fase polar, sino de forma transversal a ésta,
preferentemente, formando un ángulo recto, de manera que la fase
lipídica penetre en la corriente de la fase líquida polar desde el
costado, es decir, desde el borde externo hacia el medio. Además,
significa que, en el caso de que exista una característica de niebla
pulverizada, como está representado esquemáticamente en las figuras
1A hasta 1C, sólo una parte de la fase lipídica adicionada por
pulverización realmente penetra en la fase polar formando un ángulo
recto respecto a la dirección de la corriente, mientras que la parte
preponderante se aparta de éste en mayor o menor grado. En el ámbito
de la abertura común 3, los conductos 1 y 2 están exentos de
instalaciones adicionales, en particular, exentos de dispositivos
auxiliares de agitación o de dispersión.
La figura 2 muestra a manera de ejemplo una
disposición del dispositivo conforme a la invención para llevar a
cabo un procedimiento de preparación continuo o
semi-continuo para vesículas lipídicas, sin retorno
de la suspensión de vesículas que se forma al recipiente inicial.
Como este tipo de preparación esencialmente está compuesto por un
único paso de procedimiento, es decir, la unión de la fase lipídica
y la fase polar, en lo sucesivo este procedimiento también se
denominará "procedimiento de una etapa".
Se conduce la fase polar a partir de un primer
recipiente de reserva 5, mediante una bomba 6, que preferentemente
trabaje con el menor impulso posible y produzca la menor cantidad
posible de cavitación y fuerzas de cizallamiento, a través del
conducto de líquido 1, en dirección hacia el módulo de corrientes
cruzadas 4 y siguiendo hasta el recipiente colector 7, estando
dispuesta la bomba 6 entre el recipiente de reserva 5 y el módulo de
corrientes cruzadas 4. Durante el funcionamiento, la bomba 6
preferentemente está ajustada de tal manera que en el conducto 1,
entre el recipiente de reserva 5 y el recipiente colector 7, por lo
menos en el ámbito circundante de la abertura 3, exista una
corriente laminar o aproximadamente laminar. Preferentemente, además
se debe cuidar de que no se incluyan burbujas de aire en el conducto
1 que podrían reducir el rendimiento de vesículas intactas y con
ello el grado de inclusión de principio activo de la fase polar. Al
fluir la corriente a través del módulo de corrientes cruzadas 4, la
fase polar es cargada de la fase orgánica que contiene lípidos,
alimentándose la fase que contiene lípidos a presión a través de la
abertura 3 de forma esencialmente perpendicular a la dirección del
flujo de la fase polar. Se demuestra que los lípidos ya precipitan
dentro del módulo de corrientes cruzadas 4 y se cierran formando
vesículas, encerrando una parte de la fase polar junto con
sustancias que, dado el caso, están disueltas en ésta.
Preferentemente, se deben adecuar los volúmenes y
las velocidades de corriente de la fase que contiene lípidos y de la
fase polar de tal manera, que se eviten en alto grado excesos que no
se usen de una de ambas fases. Se bombea la fase que contiene
lípidos desde el segundo recipiente de reserva 8 con una bomba 9 a
través de un filtro 10 y una válvula de retención u otra válvula
bloqueadora de presión, hacia un recipiente intermedio 11. El
recipiente intermedio 11 en este ejemplo está conectado a través de
un filtro intermedio 12 con una fuente de presión 13, por ejemplo,
un recipiente de presión que preferentemente contiene un gas inerte,
por ejemplo, gas nitrógeno, a presión y con cuya ayuda se presiona
la fase que contiene lípidos desde el recipiente intermedio 11, a
través de una válvula regulable hacia el módulo de corrientes
cruzadas 4.
En el caso de que debido a la composición de
lípidos y/o la elección de la sustancia que se ha de incluir en los
liposomas no se necesite una protección contra la oxidación, también
puede usarse aire comprimido. Alternativamente a esto, puede
transportarse la fase que contiene lípidos mediante una bomba desde
el recipiente intermedio 11 a través del conducto 2 hacia el módulo
de corrientes cruzadas 4. Ni bien la fase polar pasa por la abertura
3 del módulo de corrientes cruzadas 4, se abre una válvula regulable
en el conducto 2 y se presiona la fase que contiene lípidos a través
de la abertura 3 hacia el conducto 1 y con ello se la introduce
dentro de la fase polar presionando o bombeando. Además, para el
control del proceso y de la calidad, puede estar previsto un
dispositivo de muestreo 14 corriente abajo del módulo de corrientes
cruzadas 4.
En la figura 3 se representa la disposición de la
figura 2 con un retorno de la dispersión de fases que se forma en el
módulo de corrientes cruzadas 4 hacia el primer recipiente de
reserva 5 (procedimiento circulante). Corriente abajo del módulo de
corrientes cruzadas 4 se desvía al menos una parte de la dispersión
de fases mediante una barrera 15, por ejemplo, una válvula, un
pasador, una pinza o similares, antes del recipiente colector 7, se
retorna a través de un conducto de retroceso 1' hacia el primer
recipiente de reserva 5, y mediante la bomba 6 se conduce nuevamente
hacia el módulo de corrientes cruzadas 4, donde se carga nuevamente
con fase que contiene lípidos. Ni bien se alcanza la concentración
final deseada de lípidos o vesículas de lípido en la fase polar, y/o
esté agotada la fase que contiene lípidos, se detiene la circulación
y, o bien, se transfiere la dispersión de fases formada al
recipiente colector 7, o bien se recolectan en el recipiente
colector 5. El dispositivo conforme a la invención, como está
representado a manera de ejemplo en las figuras 2 y 3, puede
funcionar según procedimientos conocidos de la técnica de
esterilización, exento de gérmenes y de piretógenos. Por ejemplo,
puede ser esterilizado de forma térmica o química y pueden
conducirse los materiales de partida (fase polar, fase que contiene
lípidos, dado el caso, aire comprimido o gas inerte) a través de
sistemas apropiados de filtros esterilizantes hacia los respectivos
recipientes de reserva 5, 8, hacia el módulo de corrientes cruzadas
4 y hacia el recipiente colector contiguo 7. Las preparaciones
nativas así preparadas ya no necesitan ser sometidas a ningún otro
paso esterilizante.
La distribución de tamaños dentro de las
preparaciones de vesículas en el procedimiento conforme a la
invención es influenciada decisivamente por dos factores: por un
lado, por la cantidad de lípido y/o disolvente adicionados por cada
parte en volumen de la fase polar y, por el otro lado, por la
presión de adición. En la figura 5 y la figura 6 se puede ver que
aumentando la presión de adición se reduce el diámetro medio de las
vesículas lipídicas y se dispersa menos la distribución de tamaños
dentro de la población de vesículas y de esta manera ésta es más
homogénea. Entre las condiciones del procedimiento de la figura 6,
por ejemplo, dos tercios de todos los liposomas producidos tienen un
diámetro de 100 hasta 200 nm. La diferencia entre las condiciones de
procedimiento de la figura 5 y las de la figura 6 ante todo consiste
en la cantidad de lípido usada por unidad de volumen de la fase
polar. En las figuras 5 y 5A se adicionaron 20 \mu moles de
lípidos por ml de fase polar, en cambio, en la figura 6 sólo 10
\mu moles/ ml. Se demostró que a presiones menores de adición es
ventajoso no adicionar más de 10 \mu moles de lípidos por ml de
fase polar a la composición de lípidos seleccionada (resultados de
las figuras 4 a 11) para obtener preparaciones homogéneas de
vesículas con una dispersión baja de distribución de tamaños. Pero
por el aumento de la presión de adición no sólo puede aumentarse la
eficiencia del procedimiento, sino que también a una cantidad de
lípidos aumentada (por unidad de volumen de la fase polar) puede
lograrse una baja amplitud de dispersión de las vesículas producidas
(figura 5A).
En la figura 7 se puede ver que con una
proporción creciente de lípidos por unidad de volumen de fase polar,
expresado en \mu moles de lípido adicionado por ml de fase polar
usada, en condiciones constantes de los demás parámetros del
procedimiento, aumenta el tamaño medio de las vesículas lipídicas y
la dispersión de distribución de tamaños. Pero se puede
contrarrestar este efecto mediante el aumento de la presión de
adición de la fase que contiene lípidos, de manera que, como está
representado en la figura 9, a pesar de un aumento considerable de
la proporción de lípidos, igual resulte una excelente homogeneidad y
distribución de tamaños de las vesículas lipídicas. Una posibilidad
de explicar este fenómeno podría consistir en que a mayores
presiones de adición la "niebla pulverizada" de la fase que
contiene lípidos, que actúa sobre la fase polar, sea más fina aún y
por ello presente una superficie mayor. Además, también podría estar
aumentada la profundidad de penetración de la "niebla
pulverizada" en la fase polar, de manera que en total podría
deducirse de esto el fenómeno reproducible observado. En todo caso,
ensayos comparativos dieron por resultado que por la variación de la
velocidad de flujo de la fase polar no pudo suprimirse el efecto
lipídico antes mencionado. Los mejores valores, en cuanto a la
homogeneidad de las vesículas, al menos usando DPPC como componente
único formador de capas dobles, pudieron lograrse a concentraciones
de lípidos de 10 \mu moles/ ml y menos.
Además, en el caso de etanol como disolvente se
prefiere seleccionar de tal manera el volumen de la fase orgánica
adicionada que la concentración final de etanol (usando etanol con
una pureza \geq 90% en volumen) en la dispersión de vesículas, que
se encuentra corriente abajo del módulo de corrientes cruzadas 4, no
supere el 10% en volumen, preferentemente, no supere el 7,5% en
volumen. Una superación de esta concentración final puede influir
desfavorablemente en la estabilidad, la homogeneidad y el tamaño de
las vesículas lipídicas formadas que están en el recipiente colector
7. En el caso de macromoléculas como, por ejemplo, proteínas, en
estas condiciones del procedimiento de una etapa (sin retorno)
pueden alcanzarse grados de inclusión de 10 a 15% en peso de la
cantidad total de las macromoléculas adicionadas, disueltas en la
fase acuosa.
Pero mediante una realización preferida de este
procedimiento puede lograrse un aumento considerable del
rendimiento. Aquí se ajusta la relación de mezcla de la fase que
contiene lípidos adicionada, respecto a la fase polar que pasa
fluyendo, a un valor que supere los valores límite preferidos
mencionados de 7,5% en volumen de etanol y 10 \mu moles de lípidos
por ml de la fase polar en la dispersión de vesículas, por ejemplo,
al doble, hasta diez veces mayor. A continuación, puede diluirse la
suspensión de vesículas altamente concentrada con un disolvente
polar, preferentemente, con el vehículo de la fase polar, hasta la
concentración final preferida de 7,5-10% en volumen,
para asegurar la estabilidad y la homogeneidad de la preparación
también para un lapso de tiempo mayor (por ejemplo, con fines de
almacenamiento), si fuera necesario. Ya puede efectuarse la dilución
en el conducto 1, corriente abajo del módulo de corrientes cruzadas,
o sólo luego en el recipiente colector 7.
Se demostró que de esta manera pudo aumentarse
mucho el grado de inclusión, en particular, para proteínas. Así, por
el aumento del volumen adicionado de fase lipídica al triple pudo
lograrse un aumento proporcional del grado de inclusión también a
aproximadamente el triple, por ejemplo, de 10-15% en
peso de h-SOD (peróxido dismutasa humana)
recombinante a 30-50% en peso de
rh-SOD. Un aumento de la relación de mezcla al
quíntuple hasta diez veces, de los valores límite preferidos en el
procedimiento no modificado pudo dar por resultado un nuevo aumento
del rendimiento, de manera que resultó un grado de aprovechamiento
que correspondía aproximadamente al teóricamente posible. Pero aquí
es esencial que a pesar de la relación de mezcla aumentada, las
vesículas lipídicas producidas conserven la distribución
característica de tamaños como, por ejemplo, se puede reconocer en
la figura 9, lo que originalmente no podía esperarse o preverse de
ninguna manera.
El aumento de la relación de mezcla puede
efectuarse mediante el aumento de la presión de adición de la fase
lipídica y, dado el caso, adicionalmente por el aumento del diámetro
de la abertura 3 y/o por un incremento del número de aberturas 3.
También es posible dividir la corriente de alimentación de la fase
lipídica y conectar dos o más conductos 2 con el conducto 1 a través
de superficies de contacto con aberturas 3. Los ensayos han mostrado
que una modificación (agrandamiento) del diámetro del orificio de la
abertura 3 de, por ejemplo, 150 a 250 \mum, posibilita un aumento
masivo del rendimiento de fase etanólica (figura 12) pero
evidentemente no ocasiona efectos considerables sobre el tamaño
medio o la distribución de tamaños de las vesículas lipídicas
(figura 10). Por ello, según el fin del uso, también pueden
seleccionarse otros diámetros de la abertura 3. Diámetros en el
intervalo de 50-1500 \mum demostraron ser
apropiados. Desde luego, también es posible y conveniente, en
particular, para fines de producción a escala mayor, dividir la
corriente de líquido de la fase polar y prever dos o más conductos 1
para poder así aumentar aún más la cantidad de superficies de
contacto y aberturas 3.
Para la adecuación selectiva unos a otros de los
volúmenes de las corrientes y de las velocidades de flujo de la fase
polar y de la fase que contiene lípidos, es conveniente medir en
experimentos previos los flujos alcanzables, dependiendo del ajuste
de las bombas y de las secciones transversales seleccionadas de los
conductos y hacer representaciones gráficas como, por ejemplo, se
efectuó en la figura 13 para un dispositivo a escala de laboratorio.
La temperatura del procedimiento para la preparación de las
vesículas depende naturalmente de la naturaleza química de los
lípidos usados y de la posible susceptibilidad térmica de la
sustancia que se ha de incluir. Pero se encuentra siempre por encima
de la temperatura de transición de fases de los lípidos usados.
Con el procedimiento conforme a la invención
pueden prepararse preparaciones nativas de vesículas en un solo paso
de procedimiento, en las que al menos el 60% de todas las vesículas
lipídicas (figuras 4-11), dado el caso, más del 70%
(figura 6) de todas las vesículas lipídicas, presentan un diámetro
deseado, previamente determinable, que se encuentra dentro de una
amplitud de dispersión máxima de 250 nm, preferentemente, de un
máximo de 100 nm. Con el concepto "amplitud de dispersión" en
este contexto quiere decirse un intervalo de tamaños de la amplitud
enunciada, dentro del cual se encuentran distribuidos los diámetros
del 60 ó 70% de todas las vesículas, es decir, se "dispersan".
De acuerdo con esto, pueden producirse preparaciones de vesículas
conforme a la invención en las que al menos el 60% de todas las
vesículas presenten un diámetro en el intervalo de, por ejemplo,
100-200 nm (amplitud de dispersión = 100 nm) o al
menos el 70% presenten un diámetro en el intervalo de
100-350 nm (amplitud de dispersión = 250 nm). Pero
de igual manera pueden producirse preparaciones de vesículas en las
que al menos el 60% o al menos el 70% de todas las vesículas
presenten un diámetro en el intervalo de 500-600 nm
(amplitud de dispersión de 100 nm), o de 500-750 nm
(amplitud de dispersión de 250 nm). El procedimiento puede adecuarse
en alto grado tanto en cuanto a la composición deseada de lípidos
como en cuanto al tamaño óptimo de vesículas y a las sustancias que
se han de incorporar, a las necesidades más diversas de usos
cosméticos, diagnósticos o medicinales-terapéuticos.
A continuación la invención es explicada en más detalle con la ayuda
de ejemplos.
La peróxido dismutasa humana recombinante
(rh-SOD) es una proteína con un peso molecular de
aproximadamente 32000 Dalton. En el documento WO 96/14083 se informa
detalladamente acerca de las ventajas de una encapsulación en
liposomas de esta proteína y las aplicaciones medicinales
posibilitadas mediante ésta. Como esta proteína está disuelta en la
fase polar y no interactúa con las membranas lipídicas, se incorpora
la rh-SOD de manera "pasiva".
En 100 ml de PBS (115 mg de Na_{2}HPO_{4}, 20
mg de KH_{2}PO_{4}; 800 mg de NaCl; 20 mg de KCl, pH
7,2-7,4) como fase polar, se disuelven 1600 mg de
rh-SOD y en 7,5 ml de etanol (concentración: 92% en
volumen) como fase orgánica, se disuelven 10 \mu moles/ ml
(respecto al volumen de fase polar) de un lípido formador de doble
capa, por ejemplo, 734 mg de DPPC
(dipalmitoil-fosfatidilcolina) junto con 2,86 \mu
moles/ ml (110 mg) de colesterol y 1,43 \mu mol/ ml (38,5 mg) de
estearilamina. Sin embargo, la composición de lípidos, en este caso,
DPPC, colesterol y estearilamina en la relación 7:2:1 \mu moles/
ml, puede variar en cuanto a la selección de los componentes
lipídicos, así como en cuanto a las relaciones de las cantidades de
los componentes lipídicos unos respecto a otros. En todo caso, para
muchas formulaciones de liposomas es más apropiado el uso de mezclas
de lípidos como en este ejemplo, para la formación estable de
vesículas, que el uso de un solo componente lipídico individual. En
los siguientes ejemplos siempre se usó una mezcla de lípido formador
de capa doble (por ejemplo, DPPC, DOPC, DMPC), colesterol y
estearilamina.
Se alimenta la fase orgánica que contiene lípidos
(98 mg de DPPC/ ml de etanol) en un módulo de corrientes cruzadas, a
través de una perforación de 250 \mum de diámetro, con una presión
de 1,5 bar, sin bomba, mediante superposición por presión del tubo
de gas nitrógeno, en la fase polar que fluye (16 mg de
rh-SOD/ ml de PBS), y se transfiere la dispersión
vesicular formada al recipiente colector. Como conductos
transportadores para la fase polar y para la fase que contiene
lípidos se usan tubos flexibles de silicona. El diámetro interno del
tubo flexible para el transporte de la fase polar desde el
recipiente de reserva al módulo de corrientes cruzadas y del módulo
de corrientes cruzadas al recipiente colector, asciende a 10 mm, el
del conducto transportador de la fase lipídica del recipiente
intermedio al módulo de corrientes cruzadas asciende a 1,6 mm. Como
bomba para el transporte de la fase polar se usa una bomba
peristáltica del tipo Ismatec SA 0702, como graduación de bomba
(véase la figura 13) se elige 999, correspondiente a una potencia de
bombeo de 2600 ml/ min al diámetro del tubo flexible usado de 10 mm;
la fase lipídica preferentemente es transportada sin bomba al módulo
de corrientes cruzadas, mediante superposición de presión por aire
comprimido o gas inerte, en este ejemplo, mediante gas nitrógeno. En
el sobrenadante de la preparación se miden 14 a 14,5 mg de
rh-SOD/ ml. Por tanto, fueron incluidos 150 a 200 mg
de rh-SOD en los liposomas. Esto corresponde a un
grado de inclusión de 9,5-12,5% de la cantidad de
rh-SOD originalmente disuelta en el PBS. Ensayos
comparativos análogos con DOPC
(dioleoil-fosfatidilcolina) y DMPC
(dimiristoil-fosfatidilcolina) dieron resultados muy
similares (no se representan los resultados).
Se procede conforme al ejemplo 1, las
desviaciones que ocurren en todos los casos están expuestas en la
siguiente tabla 1. La disposición del ensayo para el procedimiento
de la recirculación corresponde al dispositivo que está representado
de forma esquemática en la figura 3, la disposición para el
procedimiento de una etapa corresponde al dispositivo conforme a la
figura 2. Los resultados están reproducidos en la tabla 1 y en la
figura 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se demuestra que la distribución de tamaños en
ambos casos es casi idéntica, presentando más del 60% de todas las
vesículas formadas un diámetro de 100 a 200 nm.
Se repite el ejemplo 1 sin rh-SOD
y con las siguientes modificaciones: en contraste con el ejemplo 1,
se conduce la fase polar en circuito cerrado (se recircula). La fase
lipídica en total contiene 1470 mg de DPPC, correspondiente a 20
\mu moles de DPPC (peso molecular del DPPC = 734) por 1 ml de fase
polar. Se comparan entre sí presiones de adición de 1,2 y 2,4 bar,
así como de 2,5 y 4,5 bar para la fase que contiene lípidos.
En este y en todos los otros experimentos
descritos aquí se averiguaron los tamaños de vesículas mediante
citometría de flujo, adaptada según Vorauer-Uhl y
col. (Cytometrie 39(2): 166-71, 2000). Los
resultados están reproducidos en las tablas 2 y 2a y en las figuras
5 y 5a.
Se repite el ejemplo 1 sin rh-SOD
y con las siguientes modificaciones: En contraste con el ejemplo 1,
se conduce la fase polar en circuito cerrado (se recircula). Se
comparan entre sí tres preparaciones de ensayo con igual
concentración de lípidos, ensayándose las presiones de adición de
0,3, 1,2 y 2,0 bar para la alimentación de la fase que contiene
lípidos a la fase polar. La fase polar respectivamente contiene de
forma constante 200 ml de PBS, la fase lipídica respectivamente
contiene 1470 mg de DPPC en 15 ml de etanol (92% en volumen),
correspondiente a 10 \mu moles de DPPC (peso molecular del DPPC =
734) por 1 ml de fase polar. En este ejemplo se transporta la fase
que contiene lípidos mediante una bomba de engranajes del tipo
Gather P 15133. Los resultados están reproducidos en la tabla 3 y en
la figura 6.
Se repite el ejemplo 1 sin rh-SOD
y con las siguientes modificaciones: la fase que contiene lípidos
contiene 734, 1470 y 2940 mg de DPPC, correspondientes a las
concentraciones calculadas de 5, 10 y 20 \mu moles de DPPC por 1
ml de fase polar. Los resultados están reproducidos en la tabla 4 y
en la figura 7.
En la tabla 5 y en la figura 8 están
representadas tres preparaciones separadas de vesículas, que fueron
preparadas en condiciones idénticas y en las que existen
aproximadamente iguales distribuciones de tamaños de las vesículas
lipídicas. Las preparaciones de vesículas fueron preparadas conforme
al ejemplo 1 pero sin rh-SOD: las desviaciones en
todos los casos están expuestas en la siguiente tabla 5. En
contraste con el ejemplo 1, se conduce la fase polar en circuito
cerrado (se recircula).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se repite el ejemplo 1 con las siguientes
modificaciones:
Usando un dispositivo conforme a la figura 2, en
el recipiente colector se colocan dos partes en volumen (200 ml) de
la fase polar (PBS) y en el recipiente de reserva se coloca una
parte en volumen (100 ml) de PBS. En los 100 ml de PBS en el
recipiente de reserva se disuelven 1600 mg de
rh-SOD. En comparación con el ejemplo 1, ahora se
disuelve la triple cantidad de lípidos (2205 mg de lípidos) en la
triple cantidad (22,5 ml) de etanol (concentración: 92% en volumen).
Se controla de tal manera la velocidad de corriente de la fase polar
que la cantidad total de solución de lípido/ etanol sea introducida
en una parte en volumen (100 ml) de la fase polar. La dispersión de
fases que se forma en el módulo de corrientes cruzadas es conducida
al recipiente colector, donde se compensa en seguida el exceso de
etanol con en disolvente polar PBS colocado. Mediante este
procedimiento se incluyen 450 a 600 mg de rh-SOD en
las vesículas lipídicas. Esto corresponde a una tasa de
incorporación de 28 a 38%, respecto a la cantidad total de
rh-SOD colocado.
De esta manera, con esta variante del
procedimiento se incluye la triple cantidad de proteína, en
comparación con el procedimiento según el ejemplo 1. La distribución
de tamaños de vesículas lograda mediante este procedimiento está
representada en la siguiente tabla 6, así como en la figura 9. Como
se puede ver en la figura 9, la distribución de tamaños de vesículas
lipídicas preparadas mediante esta técnica de preparación incluso
supera a las del procedimiento en una etapa no modificado, en cuanto
a la homogeneidad y a la proporción de vesículas con un diámetro en
el intervalo de 100-200 nm.
Se repite el ejemplo 1 con las siguientes
modificaciones:
Usando un dispositivo conforme a la figura 2 en
el recipiente colector se colocan dos, cuatro o seis partes en
volumen (200 ml, 400 ml o 600 ml) de la fase polar (PBS) y en el
recipiente de reserva se coloca una parte en volumen (100 ml) de
PBS. En los 100 ml de PBS del recipiente de reserva se disuelven
1600 mg de rh-SOD. Entonces, en comparación con el
ejemplo 1, se disuelven la cantidad triple, quíntuple o séptuple de
lípido (2205, 3670 ó 5138 mg de lípidos) en la cantidad triple,
quíntuple o séptuple (22,5, 37,5 ó 52,5 ml) de etanol
(concentración: 92% en volumen). Se controla la velocidad de
corriente de la fase polar de tal manera, que se introduzca la
cantidad total de solución de lípido/ etanol en una cantidad en
volumen (100 ml) de la fase polar. Se sigue conduciendo la
dispersión de fases que se forma en el módulo de corrientes cruzadas
hacia el recipiente colector, donde el exceso de etanol se compensa
en seguida con el disolvente polar PBS colocado. Mediante este
procedimiento se incluyen 450 hasta 600 mg (con triple cantidad de
lípidos), 640 a 720 mg (con cantidad quíntuple de lípidos) u 880
hasta 960 mg (con cantidad séptuple de lípidos) de
rh-SOD en las vesículas lipídicas. Esto corresponde
a una tasa de incorporación de 28 a 38%, respecto a la cantidad
total de rh-SOD colocado o de 40 a 45% para la
dosificación quíntuple y 55 a 60% para la dosificación séptuple.
De esta manera, con esta variante del
procedimiento se incluye aproximadamente la cantidad triple,
quíntuple o séptuple de proteína, en comparación con el
procedimiento según el ejemplo 1. La distribución de tamaños de
vesículas lograda mediante este procedimiento está reproducida en la
siguiente tabla 6a, así como en la figura 9a.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se repite el ejemplo 1 sin
rh-SOD, las desviaciones de todos los casos están
expuestas en la siguiente tabla 7. En contraste con el ejemplo 1, se
conduce la fase polar en circuito cerrado (se recircula). Los
resultados están reproducidos en la figura 10 y en la tabla 7.
De los resultados se desprende que el diámetro de
la abertura de adición en el módulo de corrientes cruzadas, al menos
en el intervalo de los diámetros ensayados, parece no influir
mayormente en el tamaño y en la distribución de tamaños de las
vesículas lipídicas producidas. Otros ensayos dieron por resultado
que especialmente perforaciones con diámetros en el intervalo de 50
a 1500 \mum parecen ser apropiados para los fines de la presente
invención. Diámetros menores de perforaciones sólo pueden realizarse
difícilmente de forma mecánica y por ello entran en consideración en
menor grado.
Se repite el ejemplo 7, usándose en una primera
preparación de ensayo 300 ml de fase polar (como en el ejemplo 7) y
en una segunda preparación de ensayo 2500 ml de fase polar, por lo
demás, en condiciones idénticas. Las concentraciones de lípido y de
etanol corresponden a las que se indican en el ejemplo 7, desde
luego, aumentándose en la preparación de ensayo con 2500 ml también
el volumen de líquido de la fase lipídica etanólica por el mismo
factor (es decir, 187,5 ml).
Para poder ajustar una a la otra las corrientes
de la fase polar y de la fase lipídica etanólica, con las bombas
usadas fueron determinadas las curvas correspondientes de flujo, es
decir de presión/ flujo y se representaron en forma de diagramas.
Por un lado, se usó una bomba peristáltica de modelo Ismatec SA 0702
(para el transporte de la fase polar) y, por el otro lado, una bomba
de engranajes de modelo Gather P15133 (para el transporte de la fase
lipídica etanólica). Alternativamente, para el transporte de la fase
lipídica etanólica también se usó la superposición de presión
mediante nitrógeno, exenta de bomba.
a) Establecimiento de una curva de presión/ flujo
para la fase etanólica. En la siguiente tabla 9 están enunciados en
una lista los valores averiguados para la bomba de engranajes y en
la figura 12 están representados en forma gráfica.
Se midió el flujo (corriente volumétrica) de
etanol (92% en volumen) a una temperatura de
45-55ºC, a través del conducto de alimentación, o
sea, a través de la subsiguiente perforación en el módulo de
corrientes cruzadas. Como conducto de alimentación desde la bomba
hasta el módulo de corrientes cruzadas se usó un tubo flexible de
silicona con un diámetro interno de 1,6 mm. Se usaron tres módulos
de corrientes cruzadas, respectivamente con una única perforación,
en los que las perforaciones presentaban los diámetros nominales de
150 \mum, 200 \mum y 250 \mum.
Después de que se demostró que mediante la
superposición del recipiente intermedio (conforme a las figuras 2 y
3) con presión mediante aire comprimido o gas nitrógeno puede
transportarse la fase que contiene lípidos al menos de manera
igualmente precisa y uniforme hacia el módulo de corrientes
cruzadas, se usó también este procedimiento exento de bomba para el
procedimiento de preparación conforme a la invención, como
alternativa sencilla y exenta de mantenimiento, al transporte
mediante bomba de engranajes.
b) Establecimiento de una curva de flujo para la
fase polar. Como fase polar se usó PBS. La bomba usada fue una bomba
peristáltica del tipo Ismatec SA 0702, como conducto de alimentación
desde la bomba hasta el módulo de corrientes cruzadas se usó un tubo
flexible de silicona. Se ensayaron tres diferentes diámetros de tubo
flexible: de 6, 8 y 10 mm de diámetro interno. Los tubos flexibles
estaban llenados sin burbujas. Las indicaciones para la graduación
de la bomba se refieren a la escala presente en la bomba para
seleccionar el rendimiento de bombeo. Los valores averiguados están
representados a continuación en la tabla 10, así como en la figura
13.
Claims (20)
1. Dispositivo para la preparación de vesículas
lipídicas, que contiene los siguientes componentes: un conducto
hueco (1) en el interior para el transporte de una fase líquida
polar, un conducto hueco (2) en el interior para el transporte de
una fase líquida orgánica que contiene lípidos, un recipiente
colector (7) para recoger vesículas lipídicas producidas, así como
medios para transportar las fases líquidas a través de los conductos
(1) y (2), caracterizado porque el conducto (1) está
conectado con el conducto (2) a través de una abertura (3) común que
deja pasar líquido, estando la abertura (3) común dispuesta de tal
manera que la fase líquida orgánica pueda ingresar desde el conducto
(2) a través de la abertura (3), esencialmente en forma
perpendicular a la dirección de flujo de la fase líquida polar que
fluye en el conducto (1) y pueda penetrar preferentemente de forma
de niebla pulverizada en la fase líquida polar que fluye en el lado
de la abertura (3), y en el que, además, los conductos (1) y (2) en
el ámbito de la abertura (3) común están exentos de instalaciones
que generen turbulencias o fuerzas de
cizallamiento.
cizallamiento.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque los conductos (1) y (2) en el ámbito de
la abertura (3) común están exentos de obstáculos productores de
turbulencias o fuerzas de cizallamiento, dispositivos auxiliares
agitadores o dispersantes.
3. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el diámetro de la abertura (3) es menor
que el diámetro interno de los conductos (1) y (2) y
preferentemente, se encuentra en el intervalo de 50 a 1500
\mum.
4. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado porque los conductos (1) y (2) en el
ámbito de la abertura (3) común están dispuestos de forma paralela o
cruzándose, o porque el conducto (2) limita con el lado frontal,
preferentemente, en forma de T, con la pared externa del conducto
(1).
5. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los conductos (1) y (2), al
menos en el ámbito de la abertura (3) común, están manufacturados a
partir de un material química y mecánicamente resistente, en
particular, de acero inoxidable o un plástico rígido apropiado.
6. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los conductos (1) y (2) en
el ámbito de la abertura (3) común están configurados en forma de
unidad prefabricada, en particular, como módulo de corrientes
cruzadas (4).
7. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque corriente abajo de la
abertura (3) se desvía un conducto (1') del conducto (1) y el
conducto (1) en el ámbito del desvío o corriente arriba de éste
contiene una barrera regulable (15) con cuya ayuda puede desviarse
al menos una parte de la corriente líquida del conducto (1) hacia el
conducto (1').
8. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los medios para el
transporte de las fases líquidas comprenden una bomba (6) que está
dispuesta en el conducto (1), entre el recipiente de reserva (5) y
la abertura (3) y transporta la fase líquida polar desde el
recipiente de reserva (5) a través del conducto (1) en dirección
hacia la superficie de contacto con la abertura (3), siguiendo hacia
el recipiente colector (7) y/o mediante un conducto (1') se retorna
al menos parcialmente al recipiente de reserva (5).
9. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque los medios para transportar
las fases líquidas comprenden una bomba (9) con cuya ayuda se
transporta la fase que contiene lípidos desde un recipiente de
reserva (8), dado el caso, a través de un filtro (10) a un
recipiente intermedio (11), así como, dado el caso, a través del
conducto (2) y la abertura (3) hacia el conducto (1).
10. Dispositivo según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado porque los medios para transportar las
fases líquidas comprenden una fuente de presión (13) que está
comunicada con un recipiente intermedio (11), dado el caso, a través
de un filtro (12) conectado de forma intermedia, y que mediante la
superposición de presión por aire comprimido o un gas inerte bajo
presión posibilita el transporte exento de bomba de la fase que
contiene lípidos desde el recipiente intermedio (11) a través del
conducto (2) mediante la abertura (3).
11. Dispositivo según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque comprende dos o más
conductos (1) y/o dos o más conductos (2), que presentan dos o más
aberturas (3) comunes.
12. Procedimiento para preparar vesículas
lipídicas con distribución de tamaños controlable mediante la
adición controlada por presión de una fase líquida que contiene
lípidos a una fase líquida polar que fluye, usando un dispositivo
conforme a las reivindicaciones 1-11,
transportándose la fase líquida polar a través de un conducto que al
menos en un lugar de la pared lateral contiene una abertura, a
través de la cual se adiciona a presión y esencialmente en dirección
perpendicular a la dirección de flujo de la fase líquida polar, en
particular, pulverizando, una fase líquida que contiene lípidos a la
fase líquida polar que fluye al lado de la abertura, por lo que de
forma espontánea y sin la acción de dispositivos auxiliares de
agitación o dispersión por un "auto-ensamblado"
dirigible de forma controlada se forman vesículas lipídicas con una
distribución estrecha de tamaños.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la fase líquida polar, antes de alcanzar la abertura de la
pared lateral, presenta una corriente laminar o aproximadamente
laminar.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 12 ó
13, en el que se adiciona la fase líquida que contiene lípidos con
una presión de 0,1 a 15, preferentemente, de 0,3 a 5 bar, a través
de la abertura a la fase líquida polar que fluye.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que se adiciona la fase líquida que
contiene lípidos en una cantidad de 1-100
\mumoles, preferentemente, de 2,5-25 \mumoles de
lípidos por 1 ml de fase líquida polar, respecto a la cantidad total
de fase polar usada.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que sólo una parte, preferentemente, 10-50% en
volumen, de la cantidad total de fase líquida polar es transportada
a través del conducto hacia la abertura y, después de cargarla con
fase líquida que contiene lípidos, se sigue transportando como
dispersión vesicular concentrada hacia un recipiente colector,
mientras que la otra parte de la fase líquida polar se usa para
diluir la dispersión vesicular concentrada y, preferentemente, se
coloca en el recipiente colector.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que la fase líquida que contiene
lípidos contiene etanol como disolvente, y se adiciona a la fase
líquida polar de tal manera que resulte una concentración final de
un máximo de 10% en volumen, preferentemente, de un máximo de 7,5%
en volumen de etanol en la fase líquida polar.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 17, en el que al menos una parte de la fase
líquida polar, después de ser cargada con fase líquida que contiene
lípidos, es recirculada y es conducida hacia una nueva carga con
fase líquida que contiene lípidos.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 18, en el que la fase líquida polar y/o la
fase líquida que contiene lípidos al menos contiene una sustancia
deseada, en particular, un principio activo farmacéutico para cargar
las vesículas lipídicas.
20. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 19, en el que al menos el 60% de las vesículas
lipídicas que se forman presentan un diámetro de 100 hasta 350
nm.
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