WO2002020829A1 - Medio de cultivo y método para la identificación de microorganismos gram-negativos - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the field of microbiological diagnosis, and more specifically to the identification or differentiation of Gram-negative bacteria.
- Prior Art The microbiological diagnosis of Gram-negative bacteria is of crucial importance for the health of man, animals and the preservation of the environment, since many of them, such as E. coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, cause serious diseases in man.
- different culture media have been developed for identification and counting. Beginning in the 90s, new culture media begin to develop, which use chromogenic and / or fluorogenic substrates to more accurately identify some of these pathogens.
- the medium contains potent inhibitors of microorganisms such as violet crystal and bile salts, and requires the use of a TRIS buffer, which makes the medium more complex and more inhibitory, even for some organisms of interest.
- TRIS buffer a complex mixture of protein hydrolysates.
- the medium does not identify organisms of great interest, such as Pseudomonas, E. coli 0157: H7, among others.
- the invention consists of a selective culture medium for E. coli differentiation, especially serotypes 0157 and / or 011, which employs a chromogenic substrate for the enzyme -galactosidase.
- a selective culture medium for E. coli differentiation especially serotypes 0157 and / or 011
- a chromogenic substrate for the enzyme -galactosidase With the purpose of increasing the differential capacity of the method, other chromogenic substrates were used, for ⁇ -glucosidase which is hydrolyzed by a large number of coliform bacteria and for ⁇ -glucuronidase which is hydrolyzed by E. coli from serogroups other than 0157 and 011.
- 4,277,561 patented a method of bacteriological analysis and a means for the detection of Salmonella.
- the method is based on the ability of Salmonella to ferment glucuronic acid or its salts and not produce the enzyme ⁇ -galactosidase.
- the medium also contained nutrients, a fluorogenic or chromogenic compound for the enzyme ⁇ -galactosidase, glucuronic acid or one of its salts and pH indicator.
- This culture medium also contains inhibitors of different genera and species of Salmonella, such as bright green and sodium deoxycholate, which can inhibit other Gram-negative organisms.
- the culture medium requires the addition of sodium glucuronate as a supplement after sterilization. According to Denis et al., The specificity of this medium is less than 94% (93.3%) (Denis, et al, Revue francaise des shareholderss, December 1994, No. 271). Tuompo and collaborators in 1998 patented a method and culture medium for the identification of Salmonella, based on the use of melibiosa, mannitol and sorbitol and beta-glucuronidases substrates (US Patent No. 5,786,167).
- Butchner patented in 1996 a means and method for the isolation and presumptive identification of several bacteria, in particular, those that cause urinary sepsis or urinary infections.
- US Patent No. 5,541, 082 The method bases its principle, on distinguishing them by colonial morphology and color.
- the medium contains an opaque protein material, two or more arylsulfatasas, galactosidases, glucuronidases, tryptophan oxidases and tyramine oxidases chromogenic substrates, in addition, it is not specific for Gram-negative bacteria that are indicators of food and water quality.
- organisms of great clinical and health importance cannot be properly identified, among them, E. coli 0157: 1-17, Serratia, Citrobacter, Aeromonas, among others.
- spot tests are needed additional to confirm some of the microorganisms, and always as a presumptive diagnosis.
- KAI A. Hengstler et al. (KAI A. Hengstler, Rainer Hammann and Anne Marie Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Medium for Detection and Presumptive Identification of Urinary Tract Pathogens. Journal of Clinical Microbiology, Nov., 1997, p. 2773-2777) evaluated the CHROMagar Orientation medium , for the detection and presumptive identification of pathogens in urine samples.
- the medium allowed the detection of several species of microorganisms of interest due to colony coloration, including pink to red (E. coli), Violet blue (Klebsiella spp), Blue-red (Enterobacter spp, Rosa (Enterobacter spp.
- Citrobacter freundii Citrobacter freundii, Proteus mirabilis
- Blue Serratia spp.
- Blue-violet Cisobacter freundii and koseri
- Colorless to beige with half carmelite Morganella morganii, Proteus mirabilis and vulgaris
- Blue with half carmelite Proteus vulgaris
- Colorless in Carmelite medium Enterococcus spp.
- Bright blue Streptococcus agalactiae
- Green blue Enterococcus spp.
- Light pink Tinaphylococcus saprophyticus
- the same microorganism cannot be identified correctly, since it does not respond to a single color pattern, so it can be affirmed that the identification cannot be done only by the attributes of the colony or the environment, and therefore other tests are required, such This is the case of Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp.
- the media do not allow a correct identification, since different species have the same coloration, as in the case of Enterobacter spp., Citrobacter freundii and Proteus Mirabilis, which all appear pink.
- a pH indicator is included in the medium, which allows the color of the medium to change, as the sugar around the colony is hydrolyzed, which takes the colors provided by the chromogenic substrates.
- the main components are: 6-chloro-3- indolyl galactosidase, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronidase, sorbitol and red phenol.
- bile salts sodium lauryl sulfate, sodium deoxycholate, polyglycol ether and acriflavin-derived antibiotics are included.
- Salmonella typhi cannot be differentiated from Salmonella no typhi, and its confirmatory identification is difficult and for some strains impossible, because in the middle, it can appear as white colonies, as it happens with other Gram-negative bacteria , such as Proteus.
- IPTG ⁇ -galactosidase
- the method is performed by incubating the sample at 40 ° C, and not at the temperature recommended by most of the organisms and institutions that regulate the microbiological tests (44 ° C), which can lead to problems of non-standardized procedures and confusions to the laboratory workers. Disclosure of the Invention
- the objective of the present invention is to provide a new culture medium for the identification and / or differentiation of Gram-negative microorganisms of interest in clinical and veterinary microbiological diagnosis, food quality control and food monitoring. pollution of the environment and a method for its use.
- the novelty of the invention is that the laboratory is provided with a culture medium capable of differentiating a considerable amount of Gram-negative organisms of interest for diagnosis on a single plate (determination), based on differences in at least 10 colony colors of different sizes, and at least 5 different types of halos for their colors and sizes.
- the medium allows simultaneous evaluation of E.coli, E. coli O157. ⁇ 7, Salmonella typhi and non typhi, and even among them, Klebsiellas, Shigellas and among them; Serratia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Citrobacter and Aeromonas.
- Some microorganisms appear with colors of this medium, such as Salmonella typhi and schotmueler ⁇ , which appear orange, Aeromonas hydrophila, pale green, Pseudomonas aeruginosa orange-pink, Shigella sonnei, reddish violet and flexneri translucent from orange to yellow, Serratia odor ⁇ fera of greenish violet color. Finally, Proteus and Providencia, appear as colorless.
- Some responses of the microorganisms to be detected were also unexpected, when using phenol red as an indicator, specifically, the colonies of Shigella sonnei of blue color, irregular borders and half of strawberry pink color, Pseudomonas aeruginosa-co ⁇ on ⁇ as of beige color greenish and medium pink and Salmonella beige or colorless and half strawberry pink.
- new combinations of elements are provided that allow obtaining well-differentiated halos, not previously described for the organisms described above. Among these elements are siliceous earth, skim milk, starches and activated carbon, which in the established proportions are added to the environment.
- Substances that, together with the ingredients described in the previous paragraph, and mixed together, guarantee the appearance of different colorations in the colonies and halos chosen from propylene glycol (5 to 15 mL / L), neutral red (up to 0.05 g / L), phenol red (up to 0.05 g / L), magenta glucuronidase (0.05 to 0.25 g / L), X-gal (0.03 to 0.1 g / L) and MUG (up to 0.07 g / L), are part of the novelty, because in these combinations and proportions they guarantee the appearance of colorations in the colonies and halos previously not described.
- the advantages of the proposed medium and method, described in the present invention, are detailed below: -
- the medium allows not only the differentiation of coliforms in general, but specifically among most of them, those of greater diagnostic importance in the case of the clinic and food.
- the medium is not sterilized and its preparation is simple.
- the method allows that during its use, the media are incubated in a wide temperature range, even higher than 40 ° C, since the duration of this stage is only 18 hours and the medium does not suffer deterioration
- Substances that can cause their rapid deterioration are not used, both for their ability to oxidize, and on the contrary, contain substances that help preserve their viability, and even protect cells from damage by chemical agents, such as coal, milk, starch and siliceous earth.
- DETAILED DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a culture medium for the identification of Gram-negative microorganisms, which comprises a mixture of components that provide the appearance of halos of different colors and sizes, said mixture is constituted by siliceous soil, milk Skim, starches and bacteriological charcoal.
- the medium of the invention further comprises a mixture of nutritional bases, substances that guarantee the appearance of different colorations in the colonies, substances that guarantee the inhibition of Gram-positive organisms and substances that provide the solid matrix necessary for the growth and development of colonies
- the components that provide the appearance of halos of different colors and sizes are found therein in amounts between 8 to 20 g / L, particularly each of them are in the following quantities: soil 2 to 10 g / L siliceous skim milk 2 to 20 g / L starches up to 4 g / L bacteriological charcoal up to 4 g / L Likewise, the nutrient base mixture is used in amounts between 10 and 38 g / L and is made of:
- the culture medium of the invention also has substances that guarantee the appearance of different colorations in the colonies, which are selected from the group consisting of propylene glycol, which is used in amounts between 5 and 15 mL / L; neutral red, which is used in amounts up to 0.05 g / L; phenol red, which is used in amounts up to 0.05 g / L; magenta glucuronide, which is used in amounts between 0.05 and 0.25 g / L; X-gal, which is used in amounts between 0.03 and 0.1 g / L and MUG, which is used in amounts up to 0.07 g / L.
- the substances that guarantee the inhibition of the Gram-positive organisms that said medium contains are found in amounts between 0.1 and 1 g / L, preferably using sodium deoxycholate.
- the culture medium of the invention additionally possesses substances provided by the solid matrix for the growth and development of the colonies, which are constituted by a combination of the components that provide the appearance of halos of different colors and sizes, particularly siliceous earth, milk Skim, starches and bacteriological charcoal with agar, in proportions ranging from 0.75: 1 to 2: 1.
- the invention also relates to a method for the identification of Gram-negative microorganisms, which is based on the differentiation of the organisms of interest by the appearance of at least 10 characteristic colors of the regular and irregular colonies, and halos of al minus 5 different characteristic colors and sizes.
- the identification of the different organisms is carried out as follows:
- Shigella sonnei for the appearance of reddish violet colonies, very irregular edges and yellow halo
- Shigella flexner ⁇ due to the appearance of translucent colonies of orange to yellow, mucoid and half orange to yellow
- - Pseudomonas aeruginosa due to the appearance of orange-pink colonies, transparent halo and greenish fluorescence before 24 hours and greenish color after 24 hours;
- the culture medium is prepared by mixing 30 to 50 grams of the mixture of the components with 1 liter of distilled or deionized water, stirring and boiling until complete dissolution of the agar, subsequently cooling to 45-50 ° C and adding the propylene glycol in amounts between 5 and 15 mL, stirring and distributing in plates by constant agitation, sowing the microorganisms or sample of interest and incubating at a temperature between 30 to 45 ° C for up to 18 hours, and identifying the microorganisms by the color characteristics of the colonies, of its center, halo, edges and in the case that is required, by the color of the culture medium.
- the medium On an industrial scale the medium is prepared from the mixture of dehydrated ingredients, previously ground and sieved. The mixing is carried out in homogenizers for 0.5 to 6 hours. A sample is taken and the pH is checked. The pH is adjusted from 6.6 to 7.4 with sodium carbonate, mixed again for 0.5 to 6 hours. Once the pH has been checked again, the medium is subjected to physicochemical and functional control, and if satisfactory results are obtained, it is packaged in bottles of different volumes.
- a small volume of distilled or deionized water is first poured, taken from the total volume of 1 L, necessary for the preparation of the medium and mix with 10 mL of propylene glycol. Subsequently, the dehydrated ingredients are weighed and added, starting with the fastest hydrating agents, such as the nutritional bases in amounts of 10 to 30 g, specifically, the 2 to 15 g / L peptones, the 2 to 3 triptonas 15 g / L and yeast extract from 2 to 8 g / L.
- the fastest hydrating agents such as the nutritional bases in amounts of 10 to 30 g, specifically, the 2 to 15 g / L peptones, the 2 to 3 triptonas 15 g / L and yeast extract from 2 to 8 g / L.
- ingredients that provide the appearance of halos in the amount of 8 to 20 g / L, specifically skim milk, 2 to 20 g / L, starches up to 4 g / L, activated carbon up to 4 are added g / L and finally the siliceous earth from 2 to 10 g / L. Subsequently, most of the ingredients that guarantee the appearance of colorations are added, such as neutral red in amounts up to 0.05 g / L or phenol red in amounts up to 0.05 g / L; magenta glucuronidase in amounts from 0.005 to 0.02 g / L; X-gal from 0.003 to 0.005 g / L and MUG up to
- the Gram-positive inhibitor substances are added, preferably sodium deoxycholate in an amount of 0.1 to 1 g / L.
- the agar is added in a ratio of 0.5: 1 to 1, 5: 1 with respect to the sum of the amounts of milk, starches, coal and siliceous earth.
- the mixture is left standing for several minutes and then the rest of the water is added until 1 liter is completed, stirring the components well and allowed to stand for an interval of up to 15 min. for the agar to swell.
- the temperature begins to rise, always stirring the mixture until it boils and until the agar is completely melted.
- the mixture is cooled to 45-50 ° C, propylene glycol is added in amounts of 5 to 15 mL, constant stirring is continued and distributed on plates, always stirring.
- the plates are inoculated with the test samples, by any of the established methods, preferably by surface flooding or striatum.
- Example No. 1 1000 g of the dried dehydrated culture medium was prepared with the following composition: g / 1000 g of medium
- Red Violet Bile Agar Prepared at a concentration of 38.5 g / L of deionized water, stirred and heated with stirring until boiling, cooled to 45-
- S.S Agar Prepared at a concentration of 60 g / L in deionized water, stirred and heated with stirring until boiling, cooled to 45-50 ° C and distributed on plates.
- Table No. 2 shows the growth characteristics of different microorganisms, as well as the counts at dilutions 10 -5 and 10 "6 .
- the formulation was formed by weighing the ingredients separately in an Erlenmeyer flask in amounts to prepare 100 mL of medium, the ingredients were used in concentrations according to Example No.1 with the exception of the siliceous soil, of which a concentration of 2 g / L 100 mL of deionized water previously mixed with 1 mL of propylene glycol was added. The pH value was adjusted to 6.94 and subsequent preparation was performed as described in example No.1.
- the medium was formulated by weighing the ingredients separately in an Erlenmeyer flask, according to the concentrations described in Example 1, with the exception of the Margenta Glucuronide substrate, of which a concentration of 1.5 ⁇ g / mL was used, the subsequent preparation was carried out according to example No.2 and the behavior of a group of enterobacteria in the formulation was observed as shown in table No. 6. Table No. 6 Characteristics of the growth of enterobacteria in the medium.
- the functionality of the formulation can be observed with a large group of certified strains of the Enterobacteriaceae family. Typical reactions of the medium for inoculated species of interest were easily observed.
- the medium was formulated by weighing the ingredients separately in an Erlenmeyer flask, according to the concentrations described in Example 1, with the exception of replacing the Margenta Glucuronide substrate with the MUG fluorogenic substrate, of which a concentration of 0.05 g was used. / L, the subsequent preparation was carried out according to example No.2.
- Escherichia coli ATCC 25922 Orange Violet with halo Blue reddish edges, regular fluorescent
- the medium was formulated with the following guide ⁇ somposicic n:
- Agar 15 The ingredients were weighed in an Erlenmeyer, 1 L of deionized water was added, mixed with 10 mL of propylene glycol, the pH was adjusted to 7.0, heated with stirring until boiling and placed 15 minutes in an autoclave without pressure.
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Abstract
La invención consiste en un nuevo medio de cultivo y en un método para la identificación de microorganismos Gram negativos basados en la diferenciación de éstos por la aparición de al menos 10 colores diferentes de las colonias, que pueden ser regulares o irregulares, y de halos de al menos 5 diferentes coloraciones y tamaños. Dicho medio comprende una mezcla de componentes que propician la aparición de halos de colores y tamaños distintos, constituida por tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón activado. El medio de la invención comprende además una mezcla de bases nutritivas, sustancias que garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias, sustancias que garantizan la inhibición de los microorganismos Gram positivos y sustancias que proporcionan la matriz sólida necesaria para el crecimiento y desarrollo de las colonias.
Description
MEDIO DE CULTIVO Y MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS GRAM-NEGATIVOS
Sector Técnico La presente invención, se relaciona con el campo del diagnóstico microbiológico, y más específicamente con la identificación o diferenciación de bacterias Gram- negativas. Técnica Anterior El diagnóstico microbiológico de las bacterias Gram-negativas reviste de una importancia crucial para a salud del hombre, los animales y la preservación del ambiente, ya que muchas de ellas, tales como E. coli, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, provocan serias enfermedades en el hombre. Desde hace más de 100 años, se han desarrollado diferentes medios de cultivo para su identificación y recuento. A partir de la década de los 90, comienzan a desarrollarse nuevos medios de cultivo, que emplean sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos para identificar de manera más certera algunos de estos patógenos.
Es así, que Ferguson en 1994 (Patente No. US 5,358,854), protegió una invención consistente en un medio de cultivo y reactivos cromogénicos para la identificación y diferenciación de E. coli y coliformes. La esencia de la invención consistía en emplear un sustrato para la enzima beta -galactosidasa que producía un precipitado ¡nsoluble de un primer color y un sustrato beta glucuronidasa que provocaba la aparición de un segundo color. El medio sólo permite la diferenciación de coliformes en general, pero no entre ellos. Alain Rambach patentó en 1993 (Patente No. US 5,194,374) un medio para el aislamiento de Salmonella basado en la capacidad de éste microorganismos e metabolizar los polioles e identificar su degradación con ayuda de un indicador de pH y en presencia de un sustrato cromogénico beta galactosidasa. El medio no permite la identificación de una amplia variedad de géneros y especies de coliformes de gran interés diagnóstico.
En ese año, F. Denis y col. (Évaluation d'un nouveau milieu avec substrats chromogénes pour recherché de salmonellas dans les coprocultures: le milieu SMID., Revue frangaise des laboratories, decembre 1994, No. 271 , pp. 19-22)
presentaron la evaluación de un medio cromogénico para el aislamiento y la pre- identificación de Salmonella. El medio comprendía 2 sustratos cromogénicos, uno que brindaba un color azul a las colonias basado en la actividad β-galactosidasa, y otro que brindaba un color rojo a las colonias de Salmonella, basado en la degradación del glucuronato, que se combinaba con un indicador de color.
Con ayuda del medio, se pueden diferenciar la Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B y Salmonella typhimurium, Proteus, Citrobacter, E. coli y Enterobacter. El medio contiene inhibidores potentes de los microorganismos como el cristal violeta y las sales biliares, y requiere de empleo de un tampón de TRIS, lo que hace más complejo el medio y más inhibitorio, incluso para algunos organismos de interés. Por otra parte, se emplea polífona, mezcla compleja de hidrolizados de proteína. Por último, el medio no permite identificar organismos de gran interés, tales como Pseudomonas, E. coli 0157:H7, entre otros. Rambach en 1997 patentó un medio de cultivo y el método para la detección de las cepas enterohemorrágicas de E. coli (Solicitud de Patente WO 97/39103). La invención consiste en un medio de cultivo selectivo para la diferenciación E. coli, en especial de los serotipos 0157 y/o 011, que emplea un sustrato cromogénico para la enzima -galactosidasa. Con el propósito aumentar la capacidad diferencial del método empleó otros sustratos cromogénicos, para β-glucosidasa que es hidrolizado por un gran número de bacterias coliformes y para β-glucuronidasa que es hidrolizado por E. coli de serogrupos diferentes de 0157 y 011. Este medio de cultivo no posibilita la diferenciación de otras bacterias Gram-negativas y, Wallace y Jones reportaron que algunas cepas de E. coli y Citrobacter pueden dar resultados falsos-positivos (Wallace and Jones, J. Appl. Bacteriol., 1996, 81 : 663-668). Rambach años después, en 1998, patentó nuevamente un medio de cultivo para la detección de E. coli (Patente No. US 5,846,761), basado en el empleo de un sustrato cromogénico derivado del ácido indolyl-glucurónico y sus sales. Este medio específico no permite la identificación de cepas de E. coli 057: H7 ni de otros coliformes. En 1995 Monget y colaboradores (Patente No. US 4,277,561) patentaron un método de análisis bacteriológico y un medio para la detección de Salmonella. El método se basa en la capacidad de las Salmonella de fermentar el ácido glucurónico o sus sales y no producir la enzima β-galactosidasa. El medio contenía además nutrientes,
un compuesto fluorogénico o cromogénico para la enzima β-galactosidasa, ácido glucurónico o una de sus sales e indicador de pH.
Este medio de cultivo contiene también inhibidores de los géneros y especies diferentes de Salmonella, tales como verde brillante y desoxicolato de sodio, lo que puede inhibir a otros organismos Gram-negativos. El medio de cultivo precisa de la adición del glucuronato de sodio como suplemento después de esterilización. Según Denis y colaboradores, la especificidad de este medio es menor del 94 % (93,3 %) (Denis, et al, Revue francaise des laboratoires, décembre 1994, No. 271). Tuompo y colaboradores en 1998 patentaron por su parte un método y un medio de cultivo para la identificación de Salmonella, basado en la utilización de melibiosa, manitol y sorbitol y de sustratos beta-glucuronidasas (Patente No. US 5,786,167). El resto de los coliformes era identificado por su color carmelita, azul o verde, en dependencia del sustrato cromogénico empleado. Con este método, los autores no lograban diferenciar adecuadamente los coliformes de mayor interés entre sí. Miller y colaboradores en 1999 (Patente No. US 5,871 ,944 de 1999), patentaron un medio para diferenciar Salmonella usando lactosa y celobiosa para suprimir la aparición de precipitados negros en el medio, lo que permite detectar la presencia o ausencia de Salmonella. El medio requiere del empleo de un buffer de TRIS, peptonas y extracto de carne, X-gal y otros ingredientes. Ese medio sólo es apropiado para algunas bacterias Gram negativas, como Salmonella y Shigella, éstas últimas sólo se diferencian como tal, y no entre ellas. Butchner patentó en 1996 un medio y un método para el aislamiento y la identificación presuntiva de varias bacterias, en particular, aquellas que causan sepsis urinarias o infecciones urinarias. (Patente No. US 5,541 ,082). El método basa su principio, en distinguirlas por la morfología colonial y el color.
El medio contiene un material proteico opaco, dos o más sustratos cromogénicos arylsulfatasas, galactosidasas, glucuronidasas, triptófano oxidasas y tiramino oxidasas, además, no resulta específico para las bacterias Gram negativas que son indicadores de la calidad de los alimentos y aguas. Por otra parte, con su empleo, organismos de gran importancia clínica y sanitaria no pueden ser debidamente identificados, entre ellos, E. coli 0157:1-17, Serratia, Citrobacter, Aeromonas, entre otros. Además, se necesitan de pruebas de "spot"
adicionales para confirmar algunos de los microorganismos, y siempre como diagnóstico presuntivo.
Quesada Muñiz y Rodríguez Martínez obtuvieron protección (Certificado de Autor de Invención No. 20000083) para una formulación que incluye una mezcla de hidrolizados de proteínas, proteínas, alcoholes y otros elementos que permite, además de identificar los organismos de interés, tales como E. coli y Salmonella, la identificación de Pseudomonas aeruginosa en menos de 24 h. Sin embargo este medio es incapaz de posibilitar la identificación de otros organismos Gram-negativos de interés que crecen como colonias incoloras. Roth y colaboradores en 1993, protegieron un método y un medio cromogénico para la identificación y diferenciación de coliformes totales y E. coli. (Patente No. US 5, 393,662). El medio se compone de sustratos con los grupos cromóforos diferentes. Este medio no posibilitaba la identificación y recuento de E. coli 0157:1-17, Salmonella y otras enterobacterias no coliformes. Shigella sonnei provoca resultados falsos positivos ya que en él crecen las colonias con las mismas características de color que E. coli.
En 1997, KAI A. Hengstler y col. (KAI A. Hengstler, Rainer Hammann and Anne Marie Fahr. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Médium for Detection and Presumptive Identification of Urinary Tract Pathogens. Journal of Clinical Microbiology, Nov., 1997, p. 2773-2777) evaluaron el medio CHROMagar Orientation, para la detección e identificación presuntiva de patógenos en muestras de orina. El medio permitió la detección de varias especies de microorganismos de interés por la coloración de las colonias, entre ellos, de rosado a rojo (E. coli), Azul violeta (Klebsiella spp), Azul-rojo (Enterobacter spp , Rosa (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), Azul (Serratia spp.), Azul-violeta (Citrobacter freundii y koseri), Incoloras a beige con medio carmelita (Morganella morganii, Proteus mirabilis y vulgaris), Azul con medio carmelita (Proteus vulgaris), incoloras en medio carmelita (Enterococcus spp.), Azul brillante (Streptococcus agalactiae), Azul verdes (Enterococcus spp.) y Rosa claro (Staphylococcus saprophyticus). Como se puede apreciar del estado del arte conocido, un mismo microorganismo no puede ser identificado correctamente, ya que no responde a un solo patrón de color, por lo que se puede afirmar que la identificación no se puede realizar sólo por los atributos de la colonia o del medio, y por lo tanto se requieren de otras pruebas, tal
es el caso de Proteus mirabilis, Enterobacter, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Enterococcus spp. En otro aspecto, los medios no posibilitan una correcta identificación, ya que diferentes especies presentan la misma coloración, como el caso de Enterobacter spp., Citrobacter freundii y Proteus Mirabilis, que aparecen todas de color rosa.
En marzo de 1998, Roth y colaboradores, patentaron una invención (Patente No. US 5,726,031) en la que se reporta un medio de ensayo y un método cuantitativo para la identificación y diferenciación de material biológico en una muestra a ensayar. Este medio emplea un sustrato cromogénico específico a uno de los materiales biológicos que le otorga una coloración a ese material, un segundo sustrato cromogénico que es específico para un segundo tipo de material biológico y le posibilita obtener una segunda coloración diferente a la primera a colonias de otra especie, y un tercer material biológico a ensayar que degrada uno de los dos sustratos. Tanto el primero como el segundo material biológico degradan un azúcar, y el tercer material biológico no degrada ese azúcar.
En el medio se incluye un indicador de pH, que permite el cambio del color del medio, al ser hidrolizado el azúcar alrededor de la colonia, que toma los colores que aportan los sustratos cromogénicos. Los componentes principales son: el 6-cloro-3- indolyl galactosidasa, 5-bromo-4-cloro-3-indolyl glucuronidasa, sorbitol y fenol rojo. Además, se incluyen las sales biliares, lauril sulfato de sodio, desoxicolato de sodio, éter de poliglicol y antibióticos derivados de la acriflavina.
Se prevé en la composición el uso de un inductor de las reacciones enzimáticos (isopropyl-beta.-D-thiogalactopiranosido), agares, pectinas, carrageninas, alginatos, xantina y peptonas. Esta solución técnica puede ser considerada como el análogo más cercano a la presente invención.
Los inconvenientes de la mencionada solución técnica pueden ser agrupados como sigue:
- La Salmonella typhi no puede ser diferenciada de las Salmonella no typhi, y su identificación confirmativa es difícil y para algunas cepas imposible, debido a que en el medio, ésta puede aparecer como colonias blancas, tal y como sucede con otras bacterias Gram-negativas, tales como Proteus.
- En los casos en que en una misma placa crecen varias especies, es muy difícil identificar las zonas amarillas características de la mayoría de las
Salmonellas, ya que esta se produce por la acidificación del medio y puede haber superposición de las reacciones en el medio.
- Para la identificación y recuento de otros Gram-negativos no coliformes, tales como Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, entre otros, se precisa del uso de otros ensayos.
- Al igual que para los medios convencionales, se necesitan como mínimo de 24 a 48 horas para identificar los organismos de interés.
- Los componentes que deben promover el crecimiento de los organismos de interés en el medio, no son suficientes para permitir el desarrollo temprano (antes de 24 h) de las reacciones de identificación, por lo que se precisa del uso de un inductor para la enzima β-galactosidasa (IPTG).
- El dodecilsulfato de sodio, la acriflavina y los antibióticos en el medio, lo hacen más complejo a la preparación y de mayor costo. Su estabilidad se restringe por la presencia de antibióticos que se adicionan como suplementos.
- El método se realiza incubando la muestra a 40 °C, y no a la temperatura recomendada por la mayoría de los organismos e instituciones que regulan los ensayos microbiológicos (44 °C), yo que puede traer problemas de procedimientos no estandarizados y confusiones a los laboratoristas. Divulgación de la Invención
El objetivo de la presente invención consiste en proveer un nuevo medio de cultivo para la identificación y/o diferenciación de microorganismos Gram-negativos de interés en el diagnóstico microbiológico en la clínica y la veterinaria, el control de calidad de alimentos y el monitoreo de la contaminación del ambiente y un método para su empleo.
La novedad de la invención consiste en que se provee al laboratorio de un medio de cultivo capaz de diferenciar una cantidad considerable de organismos Gram- negativos de interés para el diagnóstico en una sola placa (determinación), sobre la base de diferencias en al menos 10 colores de las colonias de diferentes tamaños, y de al menos 5 tipos de halos diferentes por sus colores y tamaños.
Por primera vez, el medio permite evaluar simultáneamente la E.coli, E. coli O157.Η7, las Salmonella typhi y no typhi, e incluso entre ellas, las Klebsiellas, las
Shigellas y entre ellas; Serratia, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Citrobacter y Aeromonas.
Algunos microorganismos aparecen con coloraciones propias de este medio, tales como Salmonella typhi y schotmuelerí, que aparecen color naranja, Aeromonas hydrophila de color verde pálido, Pseudomonas aeruginosa naranja-rosado, Shigella sonnei de color violeta rojizo y la flexneri traslúcidas de naranja a amarillo, Serratia odorífera de color violeta verdoso. Por último, Proteus y Providencia, aparecen como incoloras. Rasgos inesperados de este medio resultaron los halos característicos de determinados microorganismos, como el caso de Pseudomonas aeruginosa con halo grande transparente, Shigella sonnei con halo amarillo, Klebsiella pneumoniae con halo beige rosado, Serratia con halo transparente y pequeño y Aeromonas hidrophila con un halo transparente y Salmonella typhimuríum con halo naranja. Resultaron inesperadas también algunas respuestas de los microorganismos a detectar, al emplear el rojo fenol como indicador, específicamente, las colonias de Shigella sonnei de color azul, bordes irregulares y medio de color rosado fresa, Pseudomonas aeruginosa-co\on\as de color beige verdoso y medio de color rosado y Salmonella
de color beige o incoloras y medio de color rosado fresa. Por otra parte, se brindan nuevas combinaciones de elementos que permiten obtener halos bien diferenciados, no descritos con anterioridad para los organismos antes expuestos. Entre estos elementos se encuentran tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón activado, que en las proporciones establecidas son adicionados al medio. Las sustancias que, conjuntamente con los ingredientes descritos en el párrafo anterior, y mezclados entre sí, garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias y los halos, escogidos entre el propilenglicol (de 5 a 15 mL/L), rojo neutro (hasta 0,05 g/L), rojo fenol (hasta 0,05 g/L), magenta glucuronidasa (de 0,05 a 0,25 g/L), X-gal (de 0,03 a 0,1 g/L) y MUG (hasta 0,07 g/L), forman parte de la novedad, pues en esas combinaciones y proporciones garantizan la aparición de coloraciones en las colonias y halos antes no descritas.
Las cantidades en que se encuentran las tres bases nutritivas que emplea el medio con respecto a los inhibidores del crecimiento de los organismos Gram-negativos,
ofrecen una nueva combinación capaz de promover el crecimiento de organismos competitivos.
Las ventajas del medio y del método propuestos, descritos en la presente invención, se detallan a continuación: - El medio permite no sólo la diferenciación de los coliformes en general, sino específicamente entre la mayoría de ellos, los de mayor importancia diagnóstica en el caso de la clínica y de los alimentos.
- Se pueden identificar simultáneamente una gran variedad antes no descrita de géneros y especies diferentes en una sola placa, con el consecuente ahorro de recursos de laboratorio, reducción del tiempo de preparación de materiales y economía de personal.
- El medio no se esteriliza y su preparación es sencilla.
- El método permite que durante su empleo, se incuben los medios en un amplio rango de temperatura, incluso superior a los 40 °C, ya que la duración de esta etapa, es sólo de 18 horas y el medio no sufre deterioro
- El alto contenido de sólidos en el medio, la naturaleza de sus componentes, y su pH, garantizan la preservación del mismo por períodos de tiempo suficientes como para mantener una reserva en el laboratorio, listos para su empleo. - Hasta el momento, no se han reportado reacciones de falsos positivos o falsos negativos de los microorganismos ensayados, respondiendo todos a los patrones de identificación que propone el medio, o sea, los colores de las colonias, centros, halos y bordes son característicos y no varían.
- No se emplean sustancias que pueden provocar su rápido deterioro, tanto por su capacidad de oxidarse, y por el contrario, contiene sustancias que ayudan a preservar su viabilidad, e incluso protegen las células de daños por agentes químicos, como el caso del carbón, leche, almidón y tierra silícea.
- Con el método se logra la diferenciación, no sólo de Salmonella typhi de no typhi, sino de algunas de ellas entre sí. - Al identificar los organismos fundamentalmente en la zona de crecimiento, o sea por el color de la colonia y su centro, de su halo y su morfología, se depende menos de manera significativa de las reacciones de cambio de color en el medio, que pueden confundirse o solaparse, al enfrentarse a muestras
contaminadas con una amplia gama de organismos de diferentes especies y géneros, como el caso de las aguas fuertemente contaminadas o putrefactas. - No se precisan de ensayos adicionales para identificar organismos de interés sanitario, tales como Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella. - Las bases nutritivas empleadas en las cantidades propuestas, conjuntamente con la presencia de protectores y teniendo en consideración la concentración de los inhibidores, posibilitan un rápido crecimiento y recuperación, antes de 24 horas de todos los organismos de interés. Divulgación detallada de la invención La presente invención proporciona un medio de cultivo para la identificación dé microorganismos Gram-negativos, el cual comprende una mezcla de componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños, dicha mezcla está constituida por tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón bacteriológico. El medio de la invención comprende además una mezcla bases nutritivas, sustancias que garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias, sustancias que garantizan la inhibición de los organismos Gram-positivos y sustancias que proporcionan la matriz sólida necesaria para el crecimiento y desarrollo de las colonias.
Dentro del medio de cultivo de la invención, los componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños se encuentran en el mismo en cantidades entre 8 a 20 g/L, particularmente cada uno de ellos se encuentran en las siguientes cantidades: tierra silícea de 2 a 10 g/L leche descremada de 2 a 20 g/L almidones hasta 4 g/L carbón bacteriológico hasta 4 g/L Asimismo, la mezcla de bases nutritivas se emplea en cantidades entre 10 y 38 g/L y está compuesta por:
Peptonas de 2 a 15 g/L Triptonas de 2 a 15 g/L
Extracto de levadura de 2 a 8 g/L
El medio de cultivo de la invención posee además sustancias que garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias, las cuales son seleccionadas del grupo consistente en propilenglicol, el cual se emplea en cantidades entre 5 y 15 mL/L; rojo neutro, el cual se emplea en cantidades hasta 0,05 g/L; rojo fenol, el cual se emplea en cantidades hasta 0,05 g/L; magenta glucurónido, el cual se emplea en cantidades entre 0,05 y 0,25 g/L; X-gal, el cual se emplea en cantidades entre 0,03 y 0,1 g/L y MUG, el cual se emplea en cantidades hasta 0,07 g/L. Igualmente, las sustancias que garantizan la inhibición de los organismos Gram- positivos que dicho medio contiene, se encuentran en cantidades entre 0,1 y 1 g/L, utilizándose preferiblemente el desoxicolato de sodio.
El medio de cultivo de la invención posee adicionalmente sustancias que proporciona la matriz sólida para el crecimiento y desarrollo de las colonias, las que se constituyen por combinación de los componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños, particularmente tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón bacteriológico con agar, en proporciones que van desde 0,75:1 hasta 2:1.
La invención también se relaciona con un método para la identificación de microorganismos Gram-negativos, el cual se basa en la diferenciación de los organismos de interés por la aparición de al menos 10 colores característicos de las colonias regulares e irregulares, y de halos de al menos 5 diferentes coloraciones características y tamaños.
En dicho método, la identificación de los diferentes organismos se realiza como sigue:
- E. coli por la aparición de colonias de color violeta azulado intenso y halo azul y medio de color naranja, y en determinados casos, fluorescencia de color azul;
- E. coli O157:H7 por la aparición de colonias de color violeta azulado o verdoso y medio de color rosado;
- Shigella sonnei por la aparición de colonias de color violeta rojizo, bordes muy irregulares y halo amarillo; - Shigella flexnerí por la aparición de colonias traslúcidas de color de naranja a amarillo, mucoides y medio de color naranja a amarillo;
- Pseudomonas aeruginosa por la aparición de colonias de color naranja-rosado, halo transparente y fluorescencia verdosa antes de 24 horas y color verdoso después de 24 horas;
- Klebsiella pneumoniae por la aparición de colonias de color violeta rojizo, mucoides con halo beige rosado en ocasiones;
- Serratia odorífera y Serratia marcencens por la aparición de colonias de color violeta verdoso y halo muy pequeño transparente;
- Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia spp. por la aparición de colonias pequeñas, incoloras y color del medio naranja - Salmonella enteritidis por la aparición de colonias de color rojo y bordes regulares;
- Salmonella cholerasuiss por la aparición de colonias de color rojo y bordes irregulares;
- Salmonella typhimurium por la aparición de colonias de color rojo y halo de color naranja variable; - Salmonella schotmuelleri por la aparición de colonias de color naranja, traslúcidas y medio de color naranja a amarillo;
- Salmonella Typha por la aparición de colonias de color naranja y medio de color amarillo;
- Enterobacter aerogenes y cloacae por la aparición de colonias de color violeta claro o violeta verdoso y centro de color violeta más intenso;
- Citrobacter freundii por la aparición de colonias de color violeta oscuro y centro de color violeta más intenso, colonias pequeñas;
- Aeromonas hydrophila por la aparición de colonias de color verde claro y halo transparente y amplio. En el método de la invención, la identificación de los diferentes organismos al emplear rojo fenol, se realiza como sigue:
- E. coli por la aparición de colonias de color azul y medio de color rosado y en el caso de emplear MUG, fluorescencia de color azul;
- Shigella sonnei-co\on\as de color azul, bordes irregulares y medio de color rosado fresa;
- Pseudomonas aeruginosa-co\on\as de color beige verdoso y medio de color rosado;
- Salmonella typhimuríum-co\on\as de color beige o incoloras y medio de color rosado fresa.
El medio de cultivo se prepara mezclando de 30 a 50 gramos de la mezcla de los componentes con 1 litro de agua destilada o desionizada, agitando y ebullendo hasta disolución completa del agar, enfriando posteriormente a 45-50 °C y adicionacionando el propilenglicol en cantidades entre 5 y 15 mL, agitando y distribuyendo en placas mediante agitación constante, sembrando los microorganismos o muestra de interés e incubando a temperatura entre 30 a 45 °C por espacio de hasta 18 horas, e identificando los microorganismos por las características del color de las colonias, de su centro, halo, bordes y en el caso que se requiera, por el color del medio de cultivo.
A escala industrial el medio se prepara a partir de la mezcla de los ingredientes deshidratados, previamente molinados y tamizados. La mezcla se realiza en homogeneizadores por espacio de 0,5 a 6 horas. Se toma una muestra y se comprueba el pH. El pH se ajusta de 6,6 a 7,4 con carbonato de sodio, se mezcla nuevamente por espacio de 0,5 a 6 horas. Una vez comprobado nuevamente el pH, el medio se somete a control fisicoquímico y funcional, y de obtenerse resultados satisfactorios, se envasa en frascos de diferentes volúmenes. En el laboratorio, o en forma de medio listo para el uso, se procede como sigue: En un matraz de Erlenmeyer, se vierte primeramente un pequeño volumen de agua destilada o desionizada, tomado del volumen total de 1 Litro, necesario para la preparación del medio y se mezcla con 10 mL de propilenglicol. Seguidamente, se pesan y adicionan los ingredientes deshidratados, comenzando por los agentes que más rápido se hidratan, tales como las bases nutritivas en cantidades de 10 a 30 g, específicamente, las peptonas de 2 a 15 g/L, las triptonas de 2 a 15 g/L y el extracto de levadura de 2 a 8 g/L. A continuación se añaden la los ingredientes que proporcionan la aparición de halos en cantidad de 8 a 20 g/L, específicamente la leche descremada, de 2 a 20 g/L, los almidones hasta 4 g/L, el carbón activado de hasta 4 g/L y finalmente la tierra silícea de 2 a 10 g/L. Con posterioridad se adicionan la mayoría de los ingredientes que garantizan la aparición de las coloraciones, tales como el rojo neutro en cantidades de hasta 0,05 g/L o el rojo fenol en cantidades de hasta 0,05 g/L; el magenta glucuronidasa en
cantidades de 0,005 a 0,02 g/L; el X-gal de 0,003 a 0,005 g/L y el MUG de hasta
0,002 g/L.
A continuación se adicionan las sustancias inhibidoras de los organismos Gram- positivos, preferiblemente el desoxicolato de sodio en cantidad de 0,1 a 1 g/L. Por último se adiciona el agar en una proporción de 0,5:1 a 1 ,5:1 con respecto a la suma de las cantidades de leche, almidones, carbón y tierra silícea.
Todos los ingredientes finalmente deben sumar entre 30 y 50 g.
La mezcla se deja en reposo por varios minutos y con posterioridad se le adiciona el resto del agua hasta completar 1 litro, agitando bien los componentes y se deja reposar por un intervalo de hasta 15 min. para que el agar se hinche.
Se comienza a elevar la temperatura, siempre agitando la mezcla hasta ebullición y hasta lograr la completa fusión del agar.
Se enfría la mezcla hasta 45-50 °C, se adiciona el propilenglicol en cantidades de 5 a 15 mL, se continúa la agitación constante y se distribuye en placas, siempre agitando.
Las placas se inoculan con las muestras de ensayo, por cualquiera de los métodos establecidos, preferiblemente por inundación de superficie o estriado.
A continuación se presentan algunos ejemplos de ejecución.
Ejemplo No. 1 Se prepararon 1000 g del medio de cultivo deshidratado en polvo con la siguiente composición: g/1000 g de medio
Peptona de músculo de bovino 118,5
Triptona de caseína 118,5 Extracto de levadura 94,8
Leche descremada en polvo 237,0
Dichos componentes fueron previamente tamizados.
En la composición se incluyó el desoxicolato de sodio en calidad de inhibidor
(23,7 g). Se preparó una premezcla de 47,4 g de tierra silícea, con 1 ,2 g de X-gal y 0,7 g de rojo neutro y 3,0 g de Magenta glucurónido. Con posterioridad se mezclaron todos los ingredientes con agar como agente gelificante en cantidad de 355 g y carbonato de sodio en cantidad de 1 g. Una vez lograda la uniformidad de la composición y
ajustado el pH a 7,0, ésta se envasó en frascos herméticamente cerrados con 21 g de la composición.
Paralelamente el propilenglicol se envasó en frascos por 5 mL. El contenido de cada frasco de la composición se vertió en un matraz de Erlenmeyer que contenía una mezcla de agua desionizada y el contenido del frasco de propilenglicol, se agitó, dejándola remojar por 10 minutos, se procedió a ebullir por 3 minutos, se enfrió hasta la temperatura de 45 °C y se distribuyó en placas de Petri. Una vez gelificada la composición, se procedió a evaluar sus características y desempeño. La evaluación fisicoquímica y organoléptica se muestra en la tabla No. 1 Tabla No.1 Evaluación fisicoquímica y organoléptica
Se evaluó con cepas certificadas la diferenciación de las colonias y la promoción del crecimiento en comparación con medios generales y diferenciales para el microorganismo en cuestión, estos fueron:
Agar Violeta Rojo Bilis: Preparado a una concentración de 38,5 g/L de agua desionizada, se agitó y calentó con agitación hasta ebullición, se enfrió hasta 45-
50°C y se distribuyó en placas.
Agar S.S.: Preparado a una concentración de 60 g/L en agua desionizada, se agitó y calentó con agitación hasta ebullición, se enfrió hasta 45-50 °C y se distribuyó en placas.
En la tabla No. 2 se pueden observar las características del crecimiento de diferentes microorganismos, así como, los recuentos a las diluciones 10-5 y 10"6.
Estos resultados son satisfactorios, tanto en el medio objeto de la presente invención, como en los controles utilizados, no existiendo inhibición alguna de
especies de Salmonella y Shigella. Se demostró superioridad en cuanto al crecimiento de Shigella sonnei, respecto al Agar S.S., lo que se evidenció además por el número y tamaño de las colonias. En cuanto a la diferenciación de las diferentes especies se logró en todos los casos respuestas características de cada especie.
Un ensayo similar se realizó con especies del grupo coliformes, utilizando como control el medio Agar Violeta Rojo Bilis, según se muestra en la tabla No. 3.
Tabla No. 2 Diferenciación y promoción del crecimiento del medio de cultivo desarrollado según la invención (Salmonella y Shigella)
UFC/mL: Unidades formadoras de colonias por cada mL de dilución 10 "^ Igualmente se llevaron a cabo los recuentos de estos dos microorganismos en el medio objeto de la invención y en el medio control utilizado. Se logró la diferenciación de los microorganismos por sus colores y morfología característica en ambos casos. Se inocularon un grupo de cepas por estrías hasta obtener colonias aisladas en la superficie del medio, lo que permitió la diferenciación de otras 5 especies según la tabla No.4. Tabla No. 4 Diferenciación de otras especies Gram-negativas en el medio
Ejemplo No.2
Se conformó la formulación pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer en cantidades para preparar 100 mL de medio, se utilizaron los ingredientes en concentraciones según el ejemplo No.1 con excepción de la tierra silícea, de la cual se utilizó una concentración de 2 g/L. Se añadieron 100 mL de agua desionizada mezclada previamente con 1 mL de propilenglicol. Se ajustó el valor de pH a 6,94 y la preparación posterior se realizó según se describe en el ejemplo No.1.
Se inocularon por estrías hasta obtener colonias aisladas, cepas de microorganismos que producen un halo traslúcido en los alrededores de las colonias. Se incubaron 24 h a 37 °C. Los resultados se observan en la tabla No. 5. Tabla No. 5 Resultados de la formulación con 2 g/L de tierra silícea
Se observó una buena diferenciación de los microorganismos por color y morfología, siendo bien visible el halo traslúcido alrededor de las colonias.
Ejemplo No.3
Se formuló el medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer, según las concentraciones descritas en el ejemplo 1 , con excepción del sustrato Margenta Glucurónido, del cual se utilizó una concentración de 1 ,5 μg/mL,
la posterior preparación se realizó según el ejemplo No.2 y se observó el comportamiento de un grupo de enterobacterias en la formulación según se muestra en la tabla No. 6. Tabla No. 6 Características del crecimiento de enterobacterias en el medio.
Ejemplo No. 4
Se formuló el medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer, según las concentraciones descritas en el ejemplo 1 , con excepción de la sustitución del sustrato Margenta Glucurónido por el sustrato fluorogénico MUG, del cual se utilizó una concentración de 0,05 g/L, la posterior preparación se realizó según el ejemplo No.2.
Se inocularon por estrías hasta obtener colonias aisladas un grupo de microorganismos según se observa en la tabla No. 7. Tabla No. 7 Evaluación de la formulación con MUG
Microorganismo Color del Color de las Morfología de medio colonias las colonias aisladas
Escherichia coli ATCC 25922 Naranja Violeta con halo Bordes rojizo azul, fluorescentes regulares
Escherichia coli 0157.Η7 ATCC Naranja Violeta oscuro, sin Bordes 35150 rojizo halo regulares
Salmonella typhimurium ATCC Rojas Rojo Bordes algo 14028 irregulares
Ejemplo No.5
Se formuló el medio con la si guíente < somposicic n:
Ingrediente g/L
Peptona 5
Triptona 5
Extracto de levadura 4 x-gal 0,05
Magenta-glucuronido 0,1
Desoxicolato 1
Almidón insoluble 4
Rojo fenol 0,018
Agar 15
Los ingredientes se pesaron en un Erlenmeyer, se adicionó 1 L de agua desionizada, mezclada con 10 mL de propilenglicol, se ajustó el pH a 7.0, se calentó con agitación hasta ebullición y se colocó 15 minutos en un autoclave sin presión.
Se dejó enfriar hasta 45-50 °C y se distribuyó en placas Petri.
Se inocularon cepas de enterobacrterias por estrías hasta obtener colonias aisladas.
Los resultados se observan en la tabla No. 8.
Tabla No. 8 Evaluación de la formulación con almidón y rojo fenol
Claims
1. Medio de cultivo para la identificación de microorganismos Gram-negativos, caracterizado porque comprende una mezcla de componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños constituida por tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón bacteriológico, y que comprende además una mezcla bases nutritivas, sustancias que garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias, sustancias que garantizan la inhibición de los organismos Gram-positivos y sustancias que proporcionan la matriz sólida necesaria para el crecimiento y desarrollo de las colonias.
2. Medio de cultivo según la reivindicación 1 caracterizado porque los componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños se encuentran en el medio en cantidades entre 8 a 20 g/L, particularmente cada uno de ellos se encuentran en las siguientes cantidades: tierra silícea de 2 a 10 g/L leche descremada de 2 a 20 g/L almidones hasta 4 g/L carbón bacteriológico hasta 4 g/L
3. Medio de cultivo según la reivindicación 1 caracterizado porque la mezcla de bases nutritivas se emplea en cantidades entre 10 y 38 g/L y está compuesta por: Peptonas de 2 a 15 g/L
Triptonas de 2 a 15 g/L Extracto de levadura de 2 a 8 g/L
4. Medio de cultivo según la reivindicación 1 caracterizado porque las sustancias que garantizan la aparición de diferentes coloraciones en las colonias son seleccionadas del grupo consistente en propilenglicol, el cual se emplea en cantidades entre 5 y 15 mL/L; rojo neutro, el cual se emplea en cantidades hasta 0,05 g/L; rojo fenol, el cual se emplea en cantidades hasta 0,05 g/L; magenta glucurónido, el cual se emplea en cantidades entre 0,05 y 0,25 g/L; X-gal, el cual se emplea en cantidades entre 0,03 y 0,1 g/L y MUG, el cual se emplea en cantidades hasta 0,07 g/L.
5. Medio de cultivo según la reivindicación 1 caracterizado porque las sustancias que garantizan la inhibición de los organismos Gram-positivos se encuentran en cantidades entre 0,1 y 1 g/L, utilizándose preferiblemente el desoxicolato de sodio.
6. Medio de cultivo según las reivindicación 1 caracterizado porque las sustancias que proporciona la matriz sólida para el crecimiento y desarrollo de las colonias, es la combinación de los componentes que proporcionan la aparición de halos de diferentes colores y tamaños, particularmente tierra silícea, leche descremada, almidones y carbón bacteriológico con agar, en proporciones de 0,75:1 a 2:1.
7. Método para la identificación de microorganismos Gram-negativos, caracterizado por la diferenciación de los organismos de interés por la aparición de al menos 10 colores característicos de las colonias regulares e irregulares, y de halos de al menos 5 diferentes coloraciones características y tamaños.
8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la identificación de los diferentes organismos se realiza como sigue: - E. coli por la aparición de colonias de color violeta azulado intenso y halo azul y medio de color naranja, y en determinados casos, fluorescencia de color azul;
- E. coli O157:H7 por la aparición de colonias de color violeta azulado o verdoso y medio de color rosado; - Shigella sonnei por la aparición de colonias de color violeta rojizo, bordes muy irregulares y halo amarillo;
- Shigella flexneri por la aparición de colonias traslúcidas de color de naranja a amarillo, mucoides y medio de color naranja a amarillo; - Pseudomonas aeruginosa por la aparición de colonias de color naranja-rosado, halo transparente y fluorescencia verdosa antes de 24 horas y color verdoso después de 24 horas;
- Klebsiella pneumoniae por la aparición de colonias de color violeta rojizo, mucoides con halo beige rosado en ocasiones;
- Serratia odorífera y Serratia marcencens por la aparición de colonias de color violeta verdoso y halo muy pequeño transparente;
- Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia spp. por la aparición de colonias pequeñas, incoloras y color del medio naranja - Salmonella enterítidis por la aparición de colonias de color rojo y bordes regulares;
- Salmonella cholerasuiss por la aparición de colonias de color rojo y bordes irregulares;
- Salmonella typhimurium por la aparición de colonias de color rojo y halo de color naranja variable;
- Salmonella schotmuelleri por la aparición de colonias de color naranja, traslúcidas y medio de color naranja a amarillo;
- Salmonella Typha por la aparición de colonias de color naranja y medio de color amarillo; - Enterobacter aerogenes y cloacae por la aparición de colonias de color violeta claro o violeta verdoso y centro de color violeta más intenso;
- Citrobacter freundii por la aparición de colonias de color violeta oscuro y centro de color violeta más intenso, colonias pequeñas; - Aeromonas hydrophila por la aparición de colonias de color verde claro y halo transparente y amplio.
9. Método para la identificación de microorganismos Gram-negativos, según la reivindicación 7, caracterizado porque la identificación de los diferentes organismos al emplear rojo fenol, se realiza como sigue:
- E. coli por la aparición de colonias de color azul y medio de color rosado y en el caso de emplear MUG, fluorescencia de color azul; - Shigella sonne/-colonias de color azul, bordes irregulares y medio de color rosado fresa;
- Pseudomonas aerag/nosa-colonias de color beige verdoso y medio de color rosado; - Salmonella typhimurium-colonlas de color beige o incoloras y medio de color rosado fresa;
10. Método para la identificación de microorganismos Gram-negativos, según la reivindicación 7, caracterizado porque el medio se prepara mezclando de 30 a 50 gramos de dicho medio con 1 litro de agua destilada o desionizada, agitando y ebullendo hasta disolución completa del agar, enfriando posteriormente a 45-50 °C y adicionacionando el propilenglicol en cantidades entre 5 y 15 mL, agitando y distribuyendo en placas mediante agitación constante, sembrando los microorganismos o muestra de interés e incubando a temperatura entre 30 a 45 °C por espacio de hasta 18 horas, e identificando los microorganismos por las características del color de las colonias, de su centro, halo, bordes y en el caso que se requiera, por el color del medio de cultivo.
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