WO2002017957A1

WO2002017957A1 - Preparations de solutions stabilisees sur une longue periode de temps

Info

Publication number: WO2002017957A1
Application number: PCT/JP2001/007600
Authority: WO
Inventors: Yasushi Sato
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2002-03-07
Also published as: EP1930024A3; EP1329224A4; AU2006235962A1; AU8260701A; HK1057168A1; US7998929B2; CA2420850A1; EP1930024A2; AU2001282607B2; CN1449292A; KR20030027077A; CN1204921C; US20040037803A1; EP1329224A1; NZ524482A

Description

明細書

長期安定化溶液製剤技術分野

本発明は G— CSF (顆粒球コロニー刺激因子）溶液製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少なく、かつ G— CS Fのメチォニン残基酸化体生成率の低い、安定化させた G— CSF製剤に関する。背景技術

G— CSFは、好中球の前駆細胞に作用し、その増殖ならびに分化成熟を促進する分子量約 2万の糖夕ンパク質である。

本出願人によって、口腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株を培養することにより高純度のヒト G— CSFが精製されて以来、これを契機に、ヒト G_C S F遺伝子のクローニングに成功し、現在では遺伝子工学的方法によって微生物や動物細胞で組換えヒト G— C S Fを大量に生産することが可能になった。また、本願出願人はこの精製した G— C S Fの製剤化に成功し、これを感染防御剤として市場に製品を供給している（特許第 2116515号）。

G—CSFは極めて微量で使用され、通常成人一人当たり、 0. 1〜1000 g (好ましくは 5〜500 g) の G— CSFを含有する製剤を 1〜7回/週の割合で投与する。しかしながら、この G— CSFは例えば注射用アンプル、注射器等の器壁に対し吸着性を示す。また、 G— CSFは不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重合あるいは酸化等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招く。

従来、これらの影響を防ぐために、剤形として主に凍結乾燥製剤が選択され、種々の処方設計がなされてきた。例えば、（a) トレオニン、トリブトファン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、システィン、シスチン、メチォニンから選ばれる少なくとも 1種のアミノ酸；（b) 少なくとも 1種の含硫還元剤；又は（c) 少なくとも 1種の酸ィ匕防止剤；からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む製剤（特許第 2577744号）等が提案されている。また、安定化剤としてポリソルべ一トなどの界面活性剤を含む G— C S F製剤がある (特開昭 6 3— 1 4 6 8 2 6号）。

また、マルトース、ラフイノ一ス、スクロース、トレハロース又はアミノ糖を含有した G— C S F凍結乾燥製剤も報告されている（特表平 8— 5 0 4 7 8 4号)。しかし、凍結乾燥の工程は、工業的には生産コストの増大を招き、さらに機械トラブルによる危険性の増大を伴うことになる。さらに、凍結乾燥製剤は使用時に純水（注射用滅菌水）に溶解して使用しなければならないという手間がかかる、という問題があった。

一方、従来市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミを除去する等のために非常に煩雑な工程を必要とする等の問題があった。

しかしながら、このようなタンパク質を添加しない場合には、 G— C S Fのメチォニン残基の酸化体の生成が多くなり、品質劣化をもたらすというという問題があった。

以上の理由から、安定化剤としてタンパク質を含有せず、しかも長期の保存にも安定な、凍結乾燥製剤に代わる G— C S Fの溶液製剤が求められている。発明の開示

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤として特定ァミノ酸を組み合わせて添加することによって、長期保存後でも G— C S F残存率が高く、かつ G— C S Fのメチォニン残基の酸化体生成率の低い G— C S F 溶液製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。

すなわち、本発明は、安定化剤として、実質的にタンパク質を含まず、また安定化剤として、少なくとも一種のァミノ酸又はその塩を含む G— C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、アミノ酸がグリシン、グルタミン酸ナトリウム、アルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上である、前記 G— C S F 溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、アミノ酸がアルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上である、前記 G— C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、アミノ酸がヒスチジン又はその塩である、前記 G— CSF溶液製剤を提供する

本発明はさらにメチォニンをさらに含む、前記 G— C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらにアミノ酸の添加量が 0. 01重量％〜10重量％である前記 G-CS F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、ヒスチジン又はその塩の添加量が 0.01重量％〜10重量％である前記 G— C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、マンニトール及び/又は塩化ナトリウムをさらに含む前記 G 一 CSF溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、界面活性剤をさらに含む前記 G— C S F溶液製剤を提供する。本発明はさらに、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである前記 G_ C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、界面活性剤がポリソルベート 20及び/又は 80である前記 G-CS F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、 p Hが 5〜 7である前記 G— C S F溶液製剤を提供する。本発明はさらに、 pHが 5. 5〜6. 8である前記 G— CSF溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、 G— CS Fが CHO細胞から産生された G— CS Fである、前記 G— C S F溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、バイアル製剤又はプレフィルドシリンジ製剤である前記 G _ CSF製剤を提供する。

本発明はさらに、 40 °C— 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 9 0%以上であり、あるいは 25°C_6ヶ月間の安定性試験後における G— CSF 残存率が 97 %以上であり、あるいは 10 °C _ 1年間の安定性試験後における G 一 C S F残存率が 97 %以上であり、かつ 40 °C— 2週間の加速試験後 G— C S Fのメチォ二ン残基酸化体生成率が 1 %以下である、安定な G— CSF溶液製剤を提供する。

本発明はさらに、実質的に G— CSFのメチォニン残基酸化体を含まない、安定な G— CSF溶液製剤を提供する。ここで、「実質的に G— CSFのメチォ二ン残基酸化体を含まない」とは、前記 G— CSFのメチォニン残基酸化体が検出限界以下のものをいう。

本発明はさらに、安定化剤として、実質的にタンパク質を添加せず、また安定化剤として、少なくとも一種のアミノ酸又はその塩を添加することを含む G— C S F溶液製剤の安定化方法を提供する。

本発明はさらに、少なくとも一種のアミノ酸又はその塩の、安定化された G_ C S F溶液製剤の製造のための使用を提供する。

本発明の溶液製剤とは、製造工程で凍結乾燥の工程を含まず、溶液状態で長期保存可能な製剤をいう。発明を実施するための最良の態様

本発明の溶液製剤に使用する G— C S Fは高純度に精製されたヒト G— C S F であれば全て使用できる。具体的には、哺乳動物、特にヒトの G— CSFと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたものを含む。遺伝子組換え法によって得られる G— CSF には天然の G— CSFとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の 1または複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。本発明における G— CSFは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；ィースト菌；チヤィニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、 C 127細胞、 C〇 S細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、ィースト菌又は CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくは CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、 PEG等により化学修飾された G— CS Fも含む（国際特許出願公開番号 WO 90/1 28 74参照）。

本発明の G— C S F溶液製剤には好ましくは安定化剤としてヒ小血清アルブミンゃ精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。

本発明の G— CS F溶液製剤は、安定化剤として、少なくとも一種のアミノ酸又はその塩を含む。上記アミノ酸としては、グリシン、グルタミン酸ナトリウム、アルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上であることが好ましく、アルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上であることがより好ましく、ヒスチジン又はその塩であることが最も好ましい。本発明で用いるアミノ酸は、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリゥム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の製剤には、これらのアミノ酸の D―、

L—および D L一体を含み、より好ましいのは L一体ならびにその塩である。本発明の製剤に添加するアミノ酸の添加量は使用するアミノ酸の種類により、後述する試験方法を用いて好ましい範囲を定めることができる。一般には 0. 0

0 l.〜 1 0重量％、好ましくは 0. 0 1〜5重量％で、より好ましくは 0. 1〜 3重量％である。ヒスチジン又はその塩の場合には、通常 0. 0 1〜1 0重量％、好ましくは 0. 0 5〜3重量％で、より好ましくは 0. 1〜2重量％である。ヒスチジン塩酸塩の場合には、 40°C— 2週間加速試験では、試験した 0. 1〜1.

6重量％の範囲で極めて高い G— CS F残存率を示し、 0. 4重量％で最も高い残存率を示した。

本発明の G— CS F溶液製剤には、メチォニンを含むことが好ましい。メチォニンの添加量は好ましくは 0. 0 0 1〜5重量％、さらに好ましくは 0. 0 1〜 1重量％、最も好ましいのは 0. 1重量％である。メチォニンの添加により、 G -CS Fのメチォニン残基酸化体生成率を検出限界以下にすることが観察された。本発明者らは、特定の理論に拘束されるつもりはないが、 G— C S Fのメチォ二ン残基に代えて、添加されたメチォニンが酸化されることにより、 G— CS Fのメチォニン残基酸化体生成率を低くすると推測した。

本発明の製剤には等張化剤として、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビ! ル、イノシトール、グルコース、フラクト一ス、ラクト一ス、キシロース、マンノース、マルトース、シュ一クロース、ラフイノースなどの糖類や塩化ナトリゥム、塩ィ匕カリゥムなどの無機塩類を用いることができ、好ましくはマンニトールあるいは塩化ナトリゥム、特に好ましくはマンニトールを用いる。マンニトール等の糖類の添加量は製剤中に 0 . 1〜1 0重量％、さらに好ましくは 0 . 5〜6重量％である。塩化ナトリウム等の無機塩類の添加量は製剤中に 2 0〜2 0 O mM、好ましくは 5 0〜： L 5 O mMである。

本発明の製剤には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビ夕ン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレー卜、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレー卜等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、ポリォキシェチレンソルビ夕ンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノパルミテート、ポリオキシェチレンソルビタントリオレエ一ト、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビッ卜テトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビッ卜脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリォキシェチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェチレンラウリルェ一テル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレンポリォキシプロピレングリコールエーテル、ポリォキシェチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリォキシェチレンポリオキシプロピレンセポリォキシェチェレンノニルフエニルエーテル等のポリォキシェチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリォキシェチレン水素ヒマシ油)等のポリォキシェチレン硬ィ匕ヒマシ油；ポリォキシェチレンソルビットミツロウ等のポリォキシェチレンミツロウ誘導体；ポリォキシェチレンラノリン等のポリオキシェチレンラノリン誘導体；ポリォキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の H LB6〜18を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリォキシェチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10〜18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜18のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質；スフインゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数 12〜18 の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添加することができる。

好ましい界面活性剤はポリォキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート 20、 21、 40、 60、 65、 80、 81、 85であり、最も好ましいのはポリソルベート 20及び 80である。

本発明の G— C S F含有製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般には G— CSF 1重量部に対して 0. 0001〜10重量部であり、好ましくは G— CS F 1重量部に対して 0. 01〜5重量部であり、最も好ましくは G—CSF 1重量部に対して 0. 2〜2重量部である。具体的に、界面活性剤の添加量は、 0. 0001〜0. 5重量％の間で適宜選択することができる。

本発明の G -CS F溶液製剤の p Hは好ましくは 5〜 7であり、さらに好ましくは pHが 5. 5〜6. 8であり、さらに好ましくは pHが 6〜6. 7であり、最も好ましくは pHが 6. 5である。

本発明の G— CSF溶液製剤には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、 pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホモシスティン、チォクト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリセロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリゥム、ダル夕チオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリ.ソルピン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシァニソール、 α—トコフエロール、酢酸トコフエロール、 L—ァスコルピン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 Lーァスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム（E D T A) 、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化力リウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。

本発明の溶液製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム一リン酸二水素ナトリウム系）及び Ζ又はクェン酸緩衝液（好ましくはクェン酸ナトリゥムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって製造できる。

本発明の安定化された G _ C S F溶液製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。

本発明の G— C S F溶液製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはデイスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することもできる。

本発明の製剤中に含まれる G— C S Fの量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で 1〜1 0 0 0 g/m 1 , 好ましくは 1 0〜8 0 0 g /m 1、さらに好ましくは 5 0 〜5 0 0 g Zm 1である。

本発明の製剤は、感染症や癌の化学治療において、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤などの薬剤を投与する際に同時投与すると、患者の抵抗力、活性などといった免疫応答力に基づいた防御機能を改善することが判明しており、臨床上極めて有用である。従って、本発明の製剤はこれらの薬剤と併用投与することができる。本発明の G— CSF溶液製剤は後述の実施例に示すように、 40°C— 2週間の加速試験を行った後にも、極めて良好な G— CSF残存率を示す。また、 40°C 一 2週間の加速試験後にも、 G_C S Fのメチォニン残基酸化体生成率がほとんど観察されなかった。

本発明の G— CSF溶液製剤は、 40°C— 2週間の加速試験後における G— C SF残存率が 90%以上、好ましくは 93%以上であり、最も好ましくは 95% 以上であり、あるいは 25 °C— 6ヶ月間の安定性試験後における G— CS F残存率が 97%以上であり、あるいは 10°C— 1年間の安定性試験後における G— C S F残存率が 97 %以上であり、かつ 40 °C— 2週間の加速試験後 G— C S Fのメチォニン残基酸化体生成率が 1%以下、好ましくは検出限界以下であり、従来知られている G— CSF製剤に比べて極めて安定な製剤である。

本発明の検討の中で、溶液製剤を封入するバイアル、シリンジなどの容器条件 (製造ロット間の差など）によっては、ヒスチジンを添加したときにメチォニン残基酸化体が増加する現象が観察され、この現象は特にシリンジ容器で顕著であつた。このメチォニン残基酸化体の生成はメチォニンの添加によりほぼ完全に抑制された。従って、プレフィルドシリンジ製剤として供給する場合には、ヒスチジンなどのアミノ酸と、メチォニン又は既知の酸ィヒ防止剤などメチォニン残基酸化体の生成を抑制する薬剤を添加することにより、 G— CSFの残存率が極めて高く、また G— CSFのメチォニン残基酸化体生成率の低い、長期安定化製剤とすることができる。産業上の利用可能性

本発明の G— CSF溶液製剤は、短期加速試験後においても、長期保存後にお 'いても、等張化剤の種類や容器形態によらず、 G— CSFの残存率が極めて高く、また G— C S Fのメチォニン残基酸化体生成率をほぼ完全に抑制することのできる安定な製剤である。

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。実施例

実施例 1：各種アミノ酸の安定性に及ぼす効果

第 1表記載の処方となるよう所定量のアミノ酸、 0.01重量％ポリソルベート 20を含む 250 g /ni 1 G-CSF、 pH6.5調剤液を無菌濾過した後、ガラスバイアルに上記調剤液を lmLずつ無菌的に充填し、打栓を施した。

第 1表

：験試料 G-CSF 添加アミノ酸ポリソルベート -20 H

No. ^g/mL) (%) (%)

1 250 グリシン 5 0. 01 6. 5

2 250 ァラニン 4 0. 01 6. 5

3 250 プロリン 0. 6 0. 01 6. 5

4 250 ロイシン 0. 32 0. 01 6. 5

5 250 グルタミン酸ナトリウム 0. 32 0. 01 6. 5

6 250 ヒドロキシプロリン 0. 08 0. 01 6. 5

7 250 アルギニン塩酸塩 0. 4 0. 01 6. 5

8 250 リシン塩酸: 1 0. 01 6. 5

9 250 ヒスチジン塩酸塩 0. 4 0. 01 6. 5 このように、無菌的に調製 ·濾過を行い製造した第 1表記載の G-CSF製剤は、 40°Cの恒温槽において 2週間の加速に供された。未加速品試料、および、 40°C- 2週間加速品試料について、下記評価法 1を用いて、 40°C-2週間加速後の残存率

( ) を算出し。

評価法 1

C4逆相カラム（4.6ΠΙΠΙ Χ250ΙΪΙΠΙ、 300オングストローム）を用い、純水、ァセトニトリル、トリフルォロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトダラフィ一法により G-CSF含量を測定した。 G-CSFとして、 5 g相当量を注入し、ァセトニトリルのグラジェントにより G-CSFを溶出させ、 215nmの波長で分光学的に検出し、 G-CSF含量を測定した。

本方法で測定した G-CSF含量を用い、下記の式に基づき 40°C-2週間加速後の残存率）を算出した。 (加速品試料の G- CSF含量）

残存率（%) = X 100

(未加速品試料の G- CSF含量）その結果を第 2表に示す。

第 2表

被験試料アミノ酸 40°C- 2週間加速後の残存率

No. (%)

1 グリシン 92. 3

2 ァラニン 89. 6

3 プロリン 87. 1

4 ロイシン 83. 7

5 グルタミン酸ナトリウム 90. 2

6 ヒドロキシプロリン 89. 1

7 アルギニン塩酸塩 96. 3

8 リシン塩酸塩 85. 5

9 ヒスチジン塩酸塩 97. 0 このように、グリシン、グルタミン酸ナトリウム、アルギニン塩酸塩、及びヒスチジン塩酸塩の添加により 40°C-2週間加速において良好な残存率が観察され、特にアルギニン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩の添加により残存率が顕著に向上することが見いだされた。実施例 2 ：メチォニン添加の G-CSF酸ィヒ体生成に及ぼす効果

第 3表記載の処方となるよう所定量のメチォニン、 0 . 0 1重量％ポリソルベ一ト 20を含む 100 g /m 1 G-CSF, pH6.5調剤液を無菌濾過した後、ガラスバイアルに上記調剤液を lmLずつ無菌的に充填し、打栓を施した。

第 3表

被験試料 G-CSF Met ポリソルべ一ト- 20 H

No. ( g/mL) (%) (%)

10 100 0 0. 01 6. 5

11 100 0. 1 0. 01 6. 5

Met：メチォニンこのように、無菌的に調製 ·濾過を行い製造した第 3表記載の G-CSF製剤を、 25°Cの恒温槽において 5日間保存後、下記評価法 2を用いて G-CSF酸化体含量を算出した。

評価法 2

C4逆相カラム（4.6nmix250mm、 300オングストローム）を用い、純水、ァセ卜ニトリル、トリフルォロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトダラフィ一法により G-CSF含量を測定した。 G-CSFとして、 5 z g相当量を注入し、ァセトニトリルのグラジェントにより G-CSFを溶出させ、 215nmの波長で分光学的に検出し、 G-CSF酸化体のピーク面積、 G-CSF未変化体のピーク面積を測定した。

本方法で測定した各ピーク面積値を用い、下記の式に基づき G-CSF酸化体含量（％) を算出した。

( G-CSF酸化体ピーク面積）

G-CSF酸化体含量（%) = 100 Χ

(G-CSF酸化体ピーク面積) I (G-CSF未変化体ピーク面積）その結果を第 4表に示す。

第 4表

被験試料 G-CSF Met G-CSF酸化体含量

No- (%) (%)

lO 100 0 2. 7

11 100 0. 1 N. D.

Met：メチォニン

N. D. ：検出しないメチォニンの添加により、 G-CSF酸化体の生成を抑制しうることを見いだした実施例 3 ：ヒスチジン添加量の安定性に及ぼす効果

第 5表記載の処方となるよう所定量の塩酸ヒスチジン、 0.1重量％メチォ二ン、 0.01重量％ポリソルベート 20を含む 250 g Zm 1 G-CSF、 pH6.5調剤液を無菌濾過した後、ガラスバイアルに上記調剤液を ImLずつ無菌的に充填し、打栓を施した。

第 5表

被験試料 G-CSF His Met NaCl ポリソルベー卜- 20 PH

No. ^g/mL) (%) (%) (mM) (%)

12 250 0 0. 1 100 0. 01 6. 5

13 250 0. 1 0. 1 100 0. 01 6. 5

14 250 0. 4 0. 1 100 0. 01 6. 5

15 250 0. 8 0. 1 100 0. 01 6. 5

16 250 1. 6 0. 1 100 0. 01 6. 5

His：ヒスチジン塩酸塩として。

Met：メチォニン

NaCl：塩化ナトリウムこのように、無菌的に調製 ·濾過を行い製造した第 5表記載の G-CSF製剤は、 40°Cの恒温槽において 2週間の加速に供された。未加速品試料、および、 40°C- 2週間加速品試料について、前述の評価法 1を用いて、 40°C-2週間加速後の残存率（％) を算出した。

その結果を第 6表に示す。

第 6表

被験試料 Hi s 40°C_2週間加速後の残存率

No. (¾) (%)

12 0 85. 5

13 0. 1 97. 2

14 0. 4 99. 1

15 0. 8 97. 6

16 1. 6 98. 1

His：ヒスチジン塩酸塩として。このように、ヒスチジンの添加に伴い、飛躍的に残存率が向上し、短期加速試験における安定性向上が可能となった。

また、被験試料 N o . 1 2〜1 6はいずれも G— C S Fのメチォニン残基酸ィ匕体は検出限界以下であった。実施例 4 ：容器形態が安定性に及ぼす効果

第 7表記載の処方となるよう 0.4重量％塩酸ヒスチジン、 0.1重量％メチォニン、 0.01重量％ポリソルベート 20を含む 250 g /m 1 G-CSF, pH6.5 調剤液を無菌濾過した後、下記に示した容器形態に上記調剤液を ImLずつ無菌的に充填し、打栓を施した。

第 7表

被験試料 G-CSF Hi s Met NaCl ポリソルベー -卜- 20 H 容器形態

No. ^g/mL) (¾) (%) (mM) (%)

17 250 0 0 100 0. 01 6. 5 バイアル

18 250 0 0 100 0. 01 6. 5 シリンジ

19 250 0. 4 0. 1 100 0. 01 6. 5 バイアル

20 250 0. 4 0. 1 100 0. 01 6. 5 シリンジ

Hi s：ヒスチジン塩酸塩として。

Met：メチォニン

NaCl：塩化ナトリウム

シリンジ： Bec ton Di ckinson社製ガラスシリンジ（ハイパック SCF ImLロング）に上記調剤液を充填し、 Bec ton Di ckinson社製プランジャーストッパーひ \ィパック SCF) で密封打栓したもの。

バイアル：未処理白色ガラスバイアルに上記調剤液を充填し、ゴム栓で打栓したもの。このように、無菌的に調製 ·濾過を行い製造した第 7表記載の G-CSF製剤は、 40での恒温槽において 2週間の加速に供された。未加速品試料、および、 40°C- 2週間加速品試料について、前述評価法 1を用いて、 40°C-2週間加速後、 25°C-6 ヶ月保存後、 10°C-1年保存後の残存率（％) を算出した。

その結果、第 8表に示す。第 8表

被験試料 His 容器形態残存率 (%)

No. (¾) 40°C- 2週間 25°C- 6ヶ月 10°C- 1年保

加速後保存後存後

17 0 バイアル 92. 3 95. 4 96. 3

18 0 シリンジ 90. 8 93. 1 93. 3

19 0. 4 バイアル 98. 0 97. 7 98. 1

20 0. 4 シリンジ 99. 1 97. 9 98. 1

40°Cにおける短期加速試験だけでなく、 25°Cおよび 10°Cにおける長期保存試験においても、ヒスチジンの添加効果は顕著であり、ヒスチジンの添加により G-CSF製剤の長期保存安定性確保が可能であることが見いだされた。また、被験試料 N o . 1 9及び 2 0はいずれも G— C S Fのメチォニン残基酸化体は検出限界以下であった。これらの結果から、容器形態によらず、安定化された G-CSF 製剤の提供が可能であると考えられた。

なお、本検討の中で、溶液製剤を封入するバイアルやシリンジの製造ロット間の差により、ヒスチジン 0 . 4 %のみを添加したときにメチォニン残基酸化体が増加する現象が観察され、この現象は特にシリンジ容器で顕著であった。このメチォニン残基酸化体の生成はメチォニン 0 . 1 %の添加により検出限界以下となつた。実施例 5 ：等張化剤の安定性に及ぼす効果

第 9表記載の処方となるよう、所定の等張化剤（塩化ナトリウムまたは D-マン二] ^一ル）、 0.4重量％塩酸ヒスチジン、 0.1重量％メチォニン、 0.01重量％ポリソルベート 20を含む 250 g /ml G-CSF, pH6.5調剤液を無菌濾過した後、ガラスバイアルに上記調剤液を lmLずつ無菌的に充填し、打栓を施した。第 9表

被験試料 G-CSF His Met 等張化剤ポリソルべ一ト -20 H No. (%) (%) (%)

21 250 0. 0. 1 lOOmM NaC 1 0. 01 6. 5 22 250 0. 4 0. 1 2. 5%マンニトール 0. 01 6. 5

His：ヒスチジン塩酸塩として。 Met：メチォニン

NaCl：塩化ナトリウムこのように、無菌的に調製 ·濾過を行い製造した第 9表記載の G-CSF製剤は、 40°Cの恒温槽において 2週間の加速に供された。未加速品試料、および、 40°C- 2週間加速品試料について、前述評価法 1を用いて、 25°C-4ヶ月、 25°C-6ヶ月及び 10°C— 1年保存後の残存率（％) を算出した。

その結果を第 10表に示す。

第 1 0表

被験試料等張化剤残存率 (%)

No. 25°C-4ヶ月 25⁰C-6ヶ月 •10°C_1年

保存後保存後保存後

21 NaCl 97. 7 96. 4 97. 6

22 マンニトール 97. 4 97. 1 96. 7 また、被験試料 N o . 2 1及び 2 2はいずれも G— C S Fのメチォニン残基酸化体は検出限界以下であった。

以上の結果から等張化剤の種類によらず、良好な安定性確保が可能であることが判明した。

Claims

請求の範囲

1. 安定化剤として、実質的にタンパク質を含まず、また安定化剤として、少なくとも一種のアミノ酸又はその塩を含む G— C S F溶液製剤。

2. アミノ酸がグリシン、グルタミン酸ナトリウム、アルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上である、請求項 1記載の G _ C S F溶液

3. アミノ酸がアルギニン及びヒスチジン又はそれらの塩から選択される一種以上である、請求項 2記載の G— CSF溶液製剤。

4. アミノ酸がヒスチジン又はその塩である請求項 3記載の G— C S F溶液製剤。

5. メチォニンをさらに含む請求項 1〜4のいずれかに記載の G— CS F溶液製剤。

6. アミノ酸の添加量が 0. 01重量％〜10重量％である請求項 1〜5のいずれかに記載の G _ C S F溶液製剤。

7. ヒスチジン又はその塩の添加量が 0. 01重量％〜10重量％である請求項 6に記載の G— C S F溶液製剤。

8. マンニトール及び/又は塩化ナトリゥムをさらに含む請求項 1〜 7のいずれかに記載の G— C S F溶液製剤。

9. 界面活性剤をさらに含む請求項 1〜 8のいずれかに記載の G— C S F溶液製剤。

10. 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである請求項 9記載の G— CSF溶液製剤。

11. 界面活性剤がポリソルベート 20及び/又は 80である請求項 10記載の G— CSF溶液製剤。

12. pHが5〜7でぁる請求項l〜l 1のいずれかに記載の G— CSF溶液製剤。

13. pHが 5. 5〜6. 8である請求項 12記載の G— CSF溶液製剤。

14. G— CSFが CHO細胞から産生された G— CSFである請求項 1〜13 のいずれかに記載の G— C S F溶液製剤。

15. バイアル製剤又はプレフィルドシリンジ製剤である請求項 1〜14のいずれかに記載の G— C S F製剤。

16. プレフィルドシリンジ製剤である請求項 15記載の G—CSF製剤。

17. 40°C- 2週間の加速試験後における G_ C S F残存率が 90 %以上であり、あるいは 25 °C— 6ヶ月間の安定性試験後における G— C S F残存率が 9 7%以上であり、あるいは 10 ー1年間の安定性試験後にぉける0— 3 残存率が 97 %以上であり、かつ 40で— 2週間の加速試験後 G— CSFのメチォニン残基酸化体生成率が 1 %以下である、安定な G— C S F溶液製剤。

18. 実質的に G—CSFのメチォニン残基酸化体を含まない、安定な G—CS F溶液製剤。

19. 安定化剤として、実質的にタンパク質を添加せず、また安定化剤として、少なくとも一種のアミノ酸又はその塩を添加することを含む G— C S F溶液製剤の安定化方法。

20. 少なくとも一種のアミノ酸又はその塩の、安定化された G— CSF溶液製剤の製造のための使用。