WO2002004642A1 - Nouveau polypeptide et adn correspondant - Google Patents

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WO2002004642A1
WO2002004642A1 PCT/JP2001/005970 JP0105970W WO0204642A1 WO 2002004642 A1 WO2002004642 A1 WO 2002004642A1 JP 0105970 W JP0105970 W JP 0105970W WO 0204642 A1 WO0204642 A1 WO 0204642A1
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WO
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protein
present
dna
salt
cells
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Application number
PCT/JP2001/005970
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shuji Hinuma
Shoji Fukusumi
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel human-derived peptide, a partial peptide thereof, a DNA encoding them, and the like.
  • the present invention relates to a novel peptide characterized by having a structure similar to an analgesic peptide.
  • receptors for analgesic peptides are known: three types ⁇ , ⁇ , and four types of nocicept in receptor ORL-1. All four of these are seven transmembrane receptors and their intracellular signals are known to decrease cAMP. It is also known that many analgesic peptides excised from four types of analgesic peptide precursors show cross-reactivity to these receptors.
  • analgesic action is known as a sensory function.
  • immobility forced Tony state
  • loss of corneal reflex loss of corneal reflex
  • eating behavior enhanced grooming
  • promotion of learning effects and suppression of sexual behavior induction
  • endocrine function promotion of prolactin secretion, promotion of GH secretion, suppression of LH secretion, suppression of TSH secretion, regulation of ACTH secretion, regulation of vasopressin secretion, promotion of insulin secretion, enhancement of MSH action, etc.
  • autonomic functions are related to body temperature control, blood pressure control, respiratory control, gastric secretion, gastric motility, intestinal peristalsis, and sleep.
  • analgesic peptides identified as partial structures of proopiomelanocortin, preproenkephalin A or preproenkephalin B, and nocicept identified as an endogenous ligand for the orphan receptor ORL-1
  • nocicept identified as an endogenous ligand for the orphan receptor ORL-1
  • No analgesic peptide is known in mammals other than Chin (nocicept in).
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, prepared a primer and used RT-PCR to convert human testis poIy (A) 3 ⁇ 4NA to ⁇ , The cDNA having the base sequence was successfully cloned.
  • the present inventors have found that the polypeptide encoded by the obtained cDNA is a useful precursor of an analgesic peptide, and as a result of further study based on these findings.
  • the present invention has been completed.
  • a drug comprising the protein or salt thereof according to (1) above, or the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof according to (2) above,
  • An analgesic method for a mammal which comprises administering to the mammal an effective amount of the receptor antagonist described in (14) above,
  • a mammal characterized in that an effective amount of the protein or salt thereof according to (1) above, or the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof according to (2) is administered to the mammal. Pain relief methods,
  • (21) a method for the analgesia of a mammal, which comprises administering an effective amount of the DNA described in the above (3) to the mammal;
  • the protein or a salt thereof according to the above (1) which contains the protein or a salt thereof according to the above (1), or the partial peptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof according to the above (2).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the analgesic peptide-like protein of the present invention obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the analgesic peptide-like protein of the present invention found in Example 1.
  • FIG. 3 shows a comparison of the amino acid sequences of the novel analgesic peptide-like proteins of the present invention with known analgesic peptides.
  • new analgesic peptide means a peptide consisting of a partial amino acid sequence consisting of the 50th amino acid sequence (Tyr) to the 73rd amino acid sequence (Lys) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Tyr 50th amino acid sequence
  • Lys 73rd amino acid sequence
  • the protein of the present invention is a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, an analgesic peptide-like protein).
  • the protein of the present invention can be used, for example, in all cells (eg, spleen cells) of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, bushes, sheep, whales, horses, monkeys, etc.) , Nerve cells, glial cells, knee / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg , Macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, ruptures Bone cells, mammary cells, liver cells or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells), or any tissue in which those cells are present
  • amino acid sequence substantially the same as SEQ ID NO: 1 is, for example, about 40% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homologous amino acid sequence.
  • the protein of the present invention containing an amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as described above; Preferred is a protein having an activity substantially the same as that of the protein containing the amino acid sequence represented by formula (1).
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 or “the same or substantially the same as the amino acid represented by SEQ ID NO: 1”
  • a protein or a salt thereof containing the amino acid sequence of the present invention may be simply referred to as “the protein of the present invention” in some cases.
  • Substantially the same activity includes, for example, cell stimulating activity via receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease in PH, etc., and analgesic activity (action).
  • cell stimulating activity via receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease in PH, etc.
  • analgesic activity action.
  • Substantially the same means that their activities are the same in nature.
  • cell stimulating activity through receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential Fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, decrease in pH, etc., and analgesic activity (action) are preferably equivalent (eg, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the molecular weight of may be different.
  • the protein of the present invention includes (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1 to 20, preferably about 1 to 9, Preferably an amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted; (2) one or more (eg, about 1 to 20; preferably 1 to 9) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , More preferably several (one or two) amino acid sequences to which amino acid has been added, and 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, 1 to 20 amino acids).
  • a so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which about, preferably about 1 to 9, and more preferably several (one or two) amino acids have been substituted with other amino acids, is also included.
  • the position of the deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually has a C-terminus of a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (—C 00 ⁇ ).
  • the terminus may be an amide (one CO NH 2 ) or an ester (one COOR).
  • the R of the ester group for example, methyl, Echiru, n- propyl, I an isopropyl or n- butyl C ⁇ such as - e alkyl group, for example, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl such as cyclohexyl group, for example, phenyl, C 6 such Hina Fuchiru - 1 2 Ariru group, e.g., benzyl, such as phenethyl phenylene Lou C i-2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • ⁇ - Nafuchiru (: I 2 in addition to C 7 _ i 4 Ararukiru group such as an alkyl group, such as pivaloyl Ruo carboxymethyl group that will be widely used as an oral ester. '
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or lipoxyl group) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a lipoxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups main Chionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, such as Asechiru groups - such as 6 Ashiru group) is protected with a protecting, N-end was cut in vivo and produced Appropriate glutamine oxidized daryumil groups and substituents on the side chains of amino acids in the molecule (for example, mono-OH, —SH, amino groups, imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.) protecting group (e.g., formyl group, those protected by such Asechiru groups (such as Bok 6 Ashiru group), or sugar chains are also conjugated proteins such so-called glycoproteins bound..
  • Amino group protecting groups main Chionin residues of N-terminal e.g., formyl group, such as Asechiru groups - such as 6 Ashiru group
  • amino acids in the molecule for example, mono-OH,
  • Partial peptide of protein (hereinafter, not only partial peptide of protein containing amino acid sequence identical or substantially identical to amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also amide or ester or salt thereof May be collectively referred to as a partial peptide of the protein of the present invention).
  • cellular stimulated activity e.g. via receptor Arakidon acid release, Asechirukorin free, change in intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP P production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential change, intracellular Any peptide may be used as long as it has a protein phosphorylation, a decrease in pH, etc., and an analgesic activity (action).
  • a partial peptide having an amino acid sequence from the 50th (Tyr) to the 73rd (Lys) is preferably used.
  • the partial peptide of the present invention has substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is substantially the same as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Partial peptides having an activity are preferable. Examples of substantially equivalent activities include, for example, receptor-mediated cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, lowering of pH, etc.) and analgesic activity (action). Substantially the same means that their activities are the same in nature.
  • receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, inositol monophosphate production
  • receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, cell C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, decrease in pH, etc.
  • analgesic activity action
  • the quantitative factors such as the degree of the activity and the molecular weight of the protein be different.
  • the partial peptides of the present invention also include those that are (antagonistic) inhibitory forms of the protein of the present invention, that is, those that have the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more. Most preferably, a partial peptide of a protein having a homology of about 95% or more is used. More specifically, one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, About 1 to 20 amino acids, preferably about 1 to 9 amino acids, and more preferably several (1 or 2) amino acids, and 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the C-terminus of the partial peptide of the present invention is usually a hydroxyl group (-COOH) or carboxylate (-COO-). CONH 2 ) or ester (one COOR) (R is as defined above).
  • partial peptide of the present invention may be any of the above partial peptides wherein the amino group of the N-terminal methionine residue is protected by a protecting group (for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group.
  • Dartamyl group generated by cleavage of the end side in vivo and pyroglutamine oxidation, substitution group on the side chain of amino acid in the molecule for example, 1OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group , A guanidino group, etc.
  • suitable protecting groups for example, formyl group, acetyl group, etc.
  • sugar chains are also conjugated peptides such as glycopeptides bound.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced by a known protein purification method from the cells, tissues or plasma of the above-described human warm-blooded animal, or contains a DNA encoding the protein described below. It can also be produced by culturing the transformant obtained. In addition, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described below or according thereto.
  • a partial peptide thereof, a salt thereof or an amide thereof a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzylhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and P-methylbenzhydrylamine resin.
  • AM resin 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-1-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4-' (2 ', 4'- Dimethoxyphenyl Fmoc aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected can be subjected to various known condensation methods according to the sequence of the target protein.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein, its partial peptide, or an amide thereof. .
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HO Bt, HO OB t), or the symmetric acid anhydride or HOB t ester or H ⁇ OB It can be added as a t-ester to the resin after the protected amino acid has been activated in advance.
  • a racemization inhibitor eg, HO Bt, HO OB t
  • the symmetric acid anhydride or HOB t ester or H ⁇ OB It can be added as a t-ester to the resin after the protected amino acid has been activated in advance.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction For example, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, black form, trifluoroethanol, dimethylsulfoxide, DMF, dimethylsulfoxide, pyridine, black form, dioxane, methylene chloride, tetrahydrofuran, acetonitrile, ethyl acetate, N-methylpyrrolidone or an appropriate mixture thereof is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C.
  • the amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, the condensation reaction is repeated without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, B oc, sulfur amyloxycarbonyl, isopolnyloxycarponyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 11 Z, Br—Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthalyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphen Nylphosphinochioil, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the carboxyl-protecting group include an alkyl ester (for example, an ester group such as methyl, ethyl, propyl, petil, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl), and benzyl.
  • Esters 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl ester, phenacine ester, benzyloxycarponyl hydrazide, benzoyl-butoxycarponyl hydrazide, trityl hydrazide and the like are used.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a carbon-derived group such as a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group is used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tributyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz l, C l 2 - Bz l, 2- two Torobenjiru, B r- Z, as a protecting group of imidazo Ichiru histidines such tertiary butyl is used
  • Tos 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Tr't, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t)] and the like.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • Trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or this Acid treatment with a mixed solution thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia are also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 t: to about 40 ° C.
  • cation scavengers such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, and 1,2-ethanedithiol is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tribubutan is substituted with the above 1,2-ethanedithiol, In addition to deprotection by acid treatment in the presence of 1,4-butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • Protection and protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, elimination of the protective groups, activation of the functional groups involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Another method for obtaining an amide form of a protein is to first protect the carboxy-terminal amino acid by amidating and protecting the amino group, and then extend the peptide (protein) chain to the desired length on the amino group side. After that, a protein in which only the N-terminal ⁇ -amino group protecting group of the peptide chain was removed and a protein in which only the C-terminal protecting group of lipoxyl group was removed were produced. In a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. The crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • the ⁇ -hydroxyl group of the carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then an ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of a protein.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be prepared by a known peptide synthesis method. Or by cleaving the protein of the present invention with a suitable peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the protein of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Further, it may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA.
  • the vector used in the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the mRNA can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include: (1) a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (2) a sequence.
  • No. 2 hybridizes to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, cell stimulating activity via receptor ichi (eg, arachidonic acid Emigration, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, p DNA encoding proteins having angiogenesis activity (action), cell proliferation, migration, and differentiation activity (action) are used.
  • receptor ichi eg, arachidonic acid Emigration, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intra
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably 80% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Above, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more DNA containing a base sequence having homology of about 95% or more is used.
  • Hybridization can be performed by a known method or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • Highly stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 70 ° C.
  • the conditions of ⁇ 65 are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. No.
  • a DNA encoding a partial peptide having the amino acid sequence from the 19th (Asp) to the 73rd (Lys) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for example, SEQ ID NO: 2
  • the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence of the 50th position (Tyr) to the 73rd position (Lys) of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 For example, a DNA having the nucleotide sequence at positions 148 to 219 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
  • the protein of the present invention is used as a means for cloning the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, the protein of the present invention and the partial peptide thereof may be simply referred to as the protein of the present invention).
  • the present invention uses a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the encoding DNA to amplify the target DNA from the DNA library or the like by PCR, or incorporates the DNA into an appropriate vector.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide may be used as it is or, if desired, digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired. it can.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on its 3' end. These translation start codon and translation stop codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the DNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide can be obtained, for example, by (i) cutting out a DNA fragment of interest from the DNA encoding the protein of the present invention; Promoter DNA fragment into appropriate expression vector It can be manufactured by connecting one downstream.
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSHl9, pSH15
  • bacteriophage such as phage ⁇
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, paculovirus, etc., ⁇ 1-11, ⁇ 1, ⁇ Rc / CMV, pRc / RSV
  • pc DNA I / Neo is used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the SRa promoter, the SV40 promoter, the LTR promoter, the CMV promoter, the HSV-TK promoter, and the like can be mentioned.
  • the host is Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, etc., and if the host is Bacillus, SPOL promoter, SP02 flop Romo - evening - and p en p promoter, if the host is a yeast, PH05 flop port motor, PGK promoter one, GAP promoter, etc. ADH promoter are preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter, and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • the selection marker one, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [Mesotorekise Ichito (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, PhoA, a signal sequence, an OmpA signal sequence, and the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, and the like are included in the host.
  • the host is yeast, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.If the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Are available respectively.
  • a transformant can be produced by introducing a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed into a cell.
  • a host for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH1 [Procedures of the world's academy of sciences of the United States (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA221 [Journalo] Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Molecular Biology, Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. are used.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis M11114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (198 4) 3 is used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces' bomb (Sdiizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036 ⁇ Pichia pastoris is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of the night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brass icae, cells derived from Estigineim acrea, and the like are used.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vitro, 13, 213-2 17, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-1, COS-7, Vero cells, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhf r-) cells), L cells, myeloid cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB3T3 cells, Sp-2 / O cells, and the like.
  • CHO cells, CHO (dhfr_) cells, 293 cells and the like are preferable.
  • Transformation of yeast is carried out, for example, according to the method described in Methliods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991).
  • Insect cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology (Bio / Technology), 6, 47-55 (1988).
  • Bio / Technology Bio / Technology
  • To transform animal cells for example, see Cell Engineering Separate Volume 8 This can be performed according to the method described in Kokutokoru, 263-267 (1 995) (published by Shujunsha).
  • Examples of the method for introducing the expression vector into cells include the calcium phosphate method [Graham FL and van der Eb AJ virology (yirology) 52, 456-467 (1973)], the DEAE-dextran method [So immediate ayrac LM and Danna KJ PROCESS — JINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF OB SCIENCES OF THE USE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7575-7578, 1981), Lipofection Law [Malone RW et al. Prossings of the National Academy of Sciences of the United States (Pro Natl. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081, 1989] Electroporation CNuemann E. et a 1. Empo, Journal (EMB0 J.) 1, 841-845 (1982)].
  • a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein of the present invention can be obtained.
  • a method for stably expressing the protein of the present invention using animal cells there is a method of selecting cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome by clone selection. Specifically, transformants can be selected using the above-mentioned selection techniques as an indicator. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained by using the selection method as described above.
  • the dh fr gene is used as a selective agent
  • the DNA encoding the protein of the present invention can be intracellularly transferred together with the dh fr gene by cultivating the MTX concentration gradually and selecting a resistant strain. A higher expression cell line can be obtained by amplification.
  • the above transformant is cultured under conditions in which a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be expressed, and the protein of the present invention or a partial peptide thereof is produced and accumulated, whereby the present invention is obtained.
  • a protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation. It contains carbon sources, nitrogen sources, minerals, etc. necessary for growing.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • the inorganic or organic substance such as, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like are used, respectively.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experimen in Molecular Genetics (Molecular Genetics)] Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972).
  • a drug such as 3j8-indolylacrylic acid can be added to make the promotion work efficiently.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, the medium may be Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Processings of the National Academy.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) "or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al. Proc. Of the National Academy of the Sciences of the U.S.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8. Culture is usually performed at about 20 X to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium used was Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). And the like to which additives such as the above are appropriately added are used.
  • the pH of the medium Preferably, it is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 952)), DMEM medium (Virology, Volume 8, 39 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medica reassociation] —Chillon (The Journal of the American Medical Association at 19), Volume 19, 5 19 (1967), 199 Medium [Proceding of the 'Society' for the Bio Logical 'medicine' (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73 volumes, 1 (1950)), etc. are used.
  • the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • CH ⁇ (dhfr-) cells and the dhfr gene are used as selection markers, it is preferable to use a DMMEM medium containing dialysed fetal serum containing almost no thymidine.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are crushed by centrifugation, a method of obtaining a crude extract of the protein of the present invention by centrifugation or filtration may be appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark; sometimes abbreviated as TM hereinafter).
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
  • Purification of the protein of the present invention contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation-purification methods.
  • Known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, and the like. Methods that mainly use differences in molecular weight, such as gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, methods that use differences in charge, such as ion-exchange chromatography, and specific affinity, such as affinity chromatography.
  • a method that utilizes the difference in hydrophobicity, such as hydrophobic chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography, and a method that utilizes the difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing, are used.
  • the thus obtained protein of the present invention when obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto. It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • An antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is an antibody capable of recognizing the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention). If present, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can be produced using the protein of the present invention as an antigen according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant to enhance antibody production during administration May be given.
  • Administration can usually be performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975) 3].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier.
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse
  • the monoclonal antibody bound to the solid phase is added to the antibody.
  • Hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, proteins labeled with radioactive substances, enzymes, etc.
  • Monoclonal antibodies can be selected according to known methods or modifications thereof. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free culture medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 t :, preferably about 37.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is formed, and a warm blood animal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and the immunized animal contains the polyclonal antibody of the present invention. It can be produced by collecting the product and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixture ratio of carrier and hapten are determined by the antibody against hapten immunized by cross-linking with the carrier. If it can be efficiently performed, any kind may be cross-linked at any ratio.For example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ psiloglopurine, hemocyanin, etc. in a weight ratio of 1 hapten to 1 hapten A method of binding at a ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used. Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • Antibody separation and purification can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the monoclonal antibody separation and purification described above.
  • Antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes DNA or DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention. Any oligonucleotide or derivative thereof having a nucleotide sequence complementary to the mRNA nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence thereof and having an action of suppressing the expression of the protein or partial peptide may be used. It may be antisense DNA.
  • the complementary nucleotide sequence is, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, of the entire nucleotide sequence or partial nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention, More preferably, a nucleotide sequence having a homology of about 80% or more, and still more preferably about 90% or more, can be mentioned.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention is about 40% or more.
  • An antisense DNA having a homology of preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is, for example, a receptor Cell stimulating activity through the evening (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, Phosphorylation of intracellular proteins, lowering of pH, etc.) and having analgesic effects.
  • a receptor Cell stimulating activity through the evening e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential
  • the protein of the present invention can be used for various uses.
  • the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof may be abbreviated as the protein of the present invention
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be abbreviated as the DNA of the present invention
  • An antibody against the protein of the present invention sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • the use of antisense DNA will be described.
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention are useful as medicaments such as analgesics.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention is used as the above-mentioned medicament, for example, tablets, capsules, elixirs, and microcapsules coated with sugar, if necessary, orally, or water or It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with other pharmaceutically acceptable solutions, or suspensions.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • the DNA of the present invention is used, the DNA is used alone, or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, and the like, and then used in a conventional manner. Thus, it can be administered.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sucrose, lactose or sucrose Sweetening agents such as cinnamon, flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • dissolution aid such as an alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, poly ethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (e.g., polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0 etc.) You may use together.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in warm-blooded animals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, puppies, dogs, cats, cats,
  • the dose of the protein or DNA that can be administered to mammals such as dogs and monkeys varies depending on the symptoms, etc. However, in the case of oral administration, it is generally the usual adult (60 kg). ),
  • the effective component per day is from about 0.1 mg to about 100 mg, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target tissues, symptoms, administration method, etc.
  • the amount of the active ingredient per day is about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg. It is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 Okg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce warm-blooded mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bush, elephants, magpies, cats, dogs, monkeys, etc.). ) Can detect an abnormality (gene abnormality) in the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof. Therefore, the DNA of the present invention is useful as an agent for genetic diagnosis of various diseases related to the protein of the present invention.
  • warm-blooded mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bush, elephants, magpies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the well-known Northern Hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proc. Implemented by Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) be able to.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention. In particular, it can be used for quantification by a sandwich immunoassay.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as a monoclonal antibody), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. .
  • nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • Radioisotopes if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C]
  • the enzyme large preferably stable and specific activity
  • fluorescent substances for example, fluorescamine, fluorescein isothiocynate, etc.
  • luminescent substances For example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody (secondary reaction), and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • primary reaction and the secondary reaction
  • the mass of the protein and the like can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • B / F separation Measure the amount of labeling of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody, and B / F separation is performed using polyethylene glycol.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the result of an antigen-antibody reaction in gel or in solution The amount of insoluble sediment that has been measured is determined. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing scattering of laser is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Furthermore, it can be used to prepare an antibody column used for purifying the protein of the present invention and to detect the protein of the present invention in each fraction at the time of purification.
  • the present invention provides
  • a method for screening a receptor gonist or an gonist which is characterized by comparing the test compound with a test compound.
  • the amount of the protein of the present invention bound to a cell or the like containing a receptor or receptor, and a cell mediated by the receptor Stimulatory activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular c AMP generation, intracellular c GMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, pH decrease, etc.
  • analgesic action are measured and compared.
  • the present invention provides
  • (2a) (i) contacting the labeled protein of the present invention with a receptor-containing cell or a cell membrane fraction thereof; and (ii) labeling the protein of the present invention and a test compound with a receptor.
  • a receptor which is characterized by measuring the amount of the labeled protein of the present invention bound to the cell or its cell membrane fraction when contacting the cell containing the same or its cell membrane fraction, and comparing it.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation
  • the present invention provides a method for screening for a receptor agonist or an gonistorist, which measures and compares the analgesic activity and phosphorylation of intracellular proteins and a decrease in pH.
  • a compound that binds to a receptor and inhibits the binding of the protein of the present invention to the receptor can be selected as a receptor agonist or antagonist.
  • a cell stimulating activity that binds to a receptor and mediated through the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP
  • a cell stimulating activity that binds to a receptor and mediated through the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP
  • Compounds that have the activity of promoting the production, production of intracellular cGMP, production of inositol phosphates, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, lowering of pH), analgesic action, etc. as receptor agonists
  • a compound having an activity of suppressing the cell stimulating activity can be selected as a receptor gonist.
  • test compounds which have been found to have an activity of inhibiting the binding of the protein of the present invention to the receptor, cell stimulating activity via the receptor (for example, Arachidonic acid release, acetilco Phosphorus release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, generation of intracellular cAMP, generation of intracellular cGMP, production of inositol monophosphate, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease in pH, etc.
  • a compound having an activity such as analgesic action can be selected as a receptor agonist, and a compound having no such activity can be selected as a receptor agonist.
  • an analgesic peptide receptor ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) derived from a human or a warm-blooded animal is preferably used.
  • Receptors for these receptors and the protein of the present invention can be obtained according to known protein purification methods, and after cloning the DNA encoding the receptor according to known genetic engineering techniques, According to the method for expressing a protein of the present invention, a desired receptor can also be obtained.
  • partial peptide of the receptor a partial peptide obtained by appropriately cleaving a full-length receptor can be used.
  • the protein labeled present invention for example, [3 Eta], c 1 2 5 eta, [1 4 c], of the present invention which may be used, such as proteins of the present invention labeled with a [3 5 s]
  • the cells containing the receptor used in the screening method those similar to those listed as the host cells used to express the protein of the present invention can be used. Among them, CHO cells and the like are preferable.
  • the cells containing Receptu can be produced using DNA encoding Receptu in accordance with known methods, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL8 cell line BONE, 18, 159-169, 1996)
  • OK cell line American Journal of Physiology
  • the cells can be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell membrane fraction of the cells containing the receptor is a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after crushing the cells.
  • Cells can be disrupted by crushing the cells using a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing using a Waring Plender ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing using ultrasonic waves, or pressing the cells while applying pressure using a French press. Crushing by ejecting from a narrow nozzle is one example.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for 30 minutes to 2 minutes. Centrifuge for time and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor or the protein of the present invention and a large amount of membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor in a cell containing the receptor or in a cell membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • Test compounds include, for example, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound.
  • the reaction between the protein of the present invention and receptor can be usually performed at about 37 ° C for several hours.
  • the cell containing the receptor of the present invention or a cell membrane fraction thereof, or the receptor of the receptor or the receptor thereof, or A receptor preparation is prepared by suspending the partial peptide in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer which does not inhibit the binding of the protein of the present invention to the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer. Either may be used.
  • CHAPS In order to reduce non-specific binding, CHAPS, T Surfactants such as ween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can also be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, bacit'lasin, aprotinin, E-64 (manufactured by Protein Research Laboratories), and papstatin are added for the purpose of suppressing receptor degradation and ligand degradation by proteases. You can also.
  • the protein and the receptor of the present invention are immobilized in an incubator, that is, in a state where the cells are grown, or using cells fixed with dartalaldehyde / paraformaldehyde. Can be combined.
  • a medium, Hank's solution, or the like is used as the buffer. Then, a certain amount (for example, in the case of 2000 CiZmmo1, about 10,000 c ⁇ ! To 1000000 cpm) of the labeled protein of the present invention (for example, about 10000 cpm) is added to 0.01 m1 to 10 m1 of the receptor solution. , [125 1] a protein) of the present invention labeled the addition, the coexistence of test compound simultaneous to 10- 4 M ⁇ 10- 1Q M. A reaction tube containing a large excess of the unlabeled protein of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB).
  • NBS non-specific binding amount
  • the reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably at 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • After the reaction was filtered through a glass fiber filter paper, etc. and washed with the same buffer q.s., residual radioactivity in the glass fiber filter paper (e.g., [125 1] quantity) liquid scintillation counter evening one or ⁇ one count Measure in the evening.
  • a manifold or a cell harvester can be used, but the use of a cell harvester is desirable for increasing efficiency.
  • the specific binding amount (B—NSB) Test compounds that account for less than 50% of the count (B.-NSB) can be selected as candidate agonists or antagonists.
  • the cell stimulating activity via the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation) , Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, pH decrease, etc.
  • analgesic activity etc.
  • cells containing the receptor are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. The products produced are quantified according to the respective methods.
  • Substances that serve as indicators of cell stimulating activity are difficult to assay due to the degrading enzyme contained in the cells, and the inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay.
  • activities such as cAMP production inhibition can be detected as production inhibiting effects on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • the analgesic effect can be measured according to a known method.
  • the cells containing the receptor can be converted into a cell stimulating activity through the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Changes in concentration, production of intracellular cAMP, production of intracellular cGMP, production of inositol phosphate, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease in pH, etc.)
  • the test compound can be selected as a candidate receptor agonist compound.
  • the cells containing the receptor may have a cell stimulating activity through the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP).
  • a cell stimulating activity through the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP.
  • the screening kit of the present invention contains a protein of the present invention, preferably a cell containing a receptor or a cell membrane fraction thereof.
  • a protein of the present invention preferably a cell containing a receptor or a cell membrane fraction thereof.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following. [Screening reagent]
  • a protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof, which is labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof is dissolved in PBS containing 0.1% serum albumin (manufactured by Sigma) to a concentration of 0.1 ImM, and stored at ⁇ 2 ° C.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening for receptor agonists or angiogonists.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that inhibits the binding between the protein of the present invention and a receptor, and specifically, cell stimulation through the receptor.
  • Activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH
  • Compounds having an action such as analgesic action or a salt thereof (so-called receptor agonist), or a cell stimulating activity via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration) Fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuation
  • Intracellular phosphorylation of proteins such as a decrease in H
  • the receptor agonist has all or a part of the physiological activity of the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity.
  • it is useful as a medicine such as an analgesic.
  • a receptor antagonist can suppress all or a part of the physiological activity of the protein of the present invention, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity.
  • the above-mentioned Receptor Angonist or Receptoragonist is used as the above-mentioned medicine, for example, it is orally administered as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., if necessary.
  • it can be used parenterally in the form of an injection, such as a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • a carrier, a flavoring agent, an excipient, a vehicle, a preservative which is a physiologically acceptable carrier for the receptor antagonist or receptor agonist.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • an alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, poly ethylene glycol, etc.
  • nonionic surfactants e.g., polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0 etc.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidant antioxidant
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in warm-blooded animals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, pests, pests, cats,
  • the dose of this receptor agonist which can be administered to mammals such as dogs and monkeys varies depending on the symptoms and the like, but in the case of oral administration, it is generally a normal adult (60 kg).
  • the amount of the active ingredient per day is about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 mg, more preferably about 1.0 to 2 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target tissue, symptoms, administration method, etc.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the dosage of the receptor antagonist is different depending on the symptoms and the like.
  • oral administration generally, in an adult (as 6 O kg), about 0.1 to 10 mg of the active ingredient per day is usually used.
  • Omg preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target tissue, symptoms, administration method, etc.
  • injection usually in adults (with a body weight of 6 O kg)
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the protein of the present invention or a salt thereof is cleaved by a proteinase present in a living body and inactivated. Therefore, by using the protein of the present invention and a proteinase that degrades the protein of the present invention, the protein of the present invention can be obtained.
  • a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades protein can be selected.
  • the compound having the activity of inhibiting the proteinase can promote the activity of the protein of the present invention independent of cell-to-cell contact by preventing inactivation of the protein of the present invention in a living body. It can be expected as a drug such as a drug.
  • the present invention provides a method for screening a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof, which comprises using the protein of the present invention.
  • the present invention provides
  • the present invention is characterized in that, after incubating the protein of the present invention with a proteinase or a test compound that degrades the protein of the present invention, the protein is compared with the case where the protein is contacted with cells containing a receptor. It is intended to provide a method for screening a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades a protein or a salt thereof.
  • the cell stimulating activity via receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, intracellular protein phosphorylation, decrease in pH), analgesic activity, etc. It is characterized by measuring and comparing.
  • the present invention provides
  • the receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol
  • analgesia It can be selected as its salt.
  • a human or warm-blooded animal analgesic peptide receptor ( ⁇ , ⁇ ) is used.
  • the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to a known method for purifying a protein, and after cloning the DNA encoding the receptor according to a known genetic engineering technique, The desired receptor can also be obtained according to the protein expression method described in (1).
  • the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention those similar to those listed above as the host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. And CHO cells are preferred.
  • the cells containing Receptu can be produced using DNA encoding Receptu in accordance with known methods, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL 8 cell line BONE, 18, 159-169, 1996)
  • OK cell line American * Journal of PHYSIOLOGY 253, E221-E227, 1987).
  • the cell when a cell containing receptor is used, the cell can be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the same ones as described above can be used as the cell membrane fraction of the cells containing the receptor.
  • Test compounds include, for example, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound.
  • the incubation of the proteinase with the protein of the present invention can be usually performed for several hours at about 37 ° C.
  • the reaction between the reaction mixture and the cells containing the receptor can be performed usually at about 37 ° C. for several hours.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, cell Phosphorylation of internal proteins, decrease in pH, etc.
  • analgesia can be measured in the same manner as described above.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention and the proteinase of the present invention that degrades the protein, and preferably further contains cells containing a receptor.
  • screening kit of the present invention examples include the following. [Screening reagent]
  • the C HO cells containing such receptions evening one against the protein of the present invention passaged 5 X 1 0 5 Konoana 1 2 well plates, 2 at 37, 5% C_ ⁇ 2, 9 5% air Cultured for days.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof ⁇ ⁇ Proteinase preparation that degrades the protein of the present invention
  • Proteinase that degrades the protein of the present invention Proteinase that degrades the protein of the present invention
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that inhibits a proteinase that degrades the protein of the present invention and suppresses inactivation of the protein of the present invention by the proteinase. Accordingly, the compound is capable of stimulating cell stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor independent of cell-cell contact (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production). , Intracellular c-GMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Decrease in pH, etc.) It is useful as a low toxic drug.
  • cell stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor independent of cell-cell contact (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production).
  • Intracellular c-GMP production
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out in the same manner as the above-mentioned receptor gonist / anginist gonist.
  • the protein of the present invention can specifically bind to an analgesic peptide receptor ( ⁇ , ⁇ ,) (hereinafter abbreviated as Recept) of a warm-blooded animal (a mammal such as a human).
  • Recept an analgesic peptide receptor
  • a compound that promotes or inhibits intracellular signal transduction after the protein of the present invention binds to the receptor by constructing a ligand-receptor binding system using the protein of the present invention and the receptor.
  • the salt can be screened.
  • the present invention provides a method for screening for a compound or a salt thereof which promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention to a receptor, characterized by using the protein of the present invention.
  • the present invention provides
  • intracellular signaling transfer after binding of the protein of the present invention to the receptor is measured and compared. It is characterized by the following.
  • the present invention provides
  • the protein of the present invention and a receptor And the protein-stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP A compound that promotes the production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, pH reduction, etc.) after binding of the protein of the present invention to a receptor.
  • the protein of the present invention does not inhibit the binding of the protein of the present invention to the receptor and does not inhibit the cell stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, A compound having an activity of inhibiting intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH reduction, etc. And its salts that inhibit intracellular signal transduction after binding to Recept.
  • the present screening method is a method for selecting a compound that does not affect the binding of the protein of the present invention to the receptor and that modulates (promotes or suppresses) intracellular signal transduction after receptor binding.
  • the test compound used in the method it is desirable to use a compound that has not been selected as a receptor agonist or an antagonist in the above-described receptor agonist / antagonist screening method.
  • an analgesic peptide receptor ( ⁇ , ⁇ , n) of a warm-blooded animal (a mammal such as a human) or the like is used.
  • the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to a known protein purification method, and after cloning the DNA encoding the receptor according to a known genetic engineering technique, The desired receptor can also be obtained according to the method for expressing protein in E. coli.
  • partial peptide of the receptor a partial peptide obtained by appropriately cleaving the full-length receptor can be used.
  • Cells containing the receptor used in the screening method of the present invention include, as host cells used for expressing the protein of the present invention described above. The same ones as described above can be used, and among them, CHO cells and the like are preferable.
  • the cells containing Receptu can be produced using DNA encoding Receptu in accordance with known methods, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL8 cell line BONE, 18, 159-169, 1996)
  • OK cell line American journal of physiology (AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987).
  • the cell when a cell containing receptor is used, the cell can be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell membrane fraction of the cells containing the receptor the same as described above can be used.
  • Test compounds include, for example, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • the reaction between the protein of the present invention and the cells containing the receptor can usually be performed at about 37 for several hours.
  • the cell stimulating activity of the protein of the present invention through the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP
  • the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP
  • intracellular cGMP production inositol phosphate production
  • cell membrane potential fluctuation intracellular protein phosphorylation, pH decrease, etc.
  • the protein of the present invention stimulates the cell stimulating activity through the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, If intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, decrease in pH, etc.) are promoted, the test compound is treated as a receptor. It can be selected as a compound or a salt thereof that promotes intracellular signal transduction after binding.
  • the test compound when the test compound is added, Cell stimulating activity through Sep-Ichi (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca2 + concentration, generation of intracellular cAMP, generation of intracellular cGMP, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, cell (Eg, phosphorylation of internal proteins, decrease in pH, etc.), the test compound can be selected as a compound that promotes intracellular signal transmission after receptor binding, or a salt thereof.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention, preferably a cell containing a receptor.
  • screening kit of the present invention examples include the following. [Screening reagent]
  • CHO cells containing the receptor for the protein of the present invention are subcultured in 12-well plates at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 2 days at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof
  • Cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, PH, etc.
  • Cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, PH, etc.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signaling after receptor binding.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound obtained by binding the protein of the present invention to a receptor.
  • Cell stimulating activity through the evening eg arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorus of intracellular protein A compound that promotes oxidation, lowering of pH, etc.
  • a compound that inhibits the cell stimulating activity or a salt thereof eg arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorus of intracellular protein A compound that promotes oxidation, lowering of pH, etc.
  • a compound that inhibits the cell stimulating activity or a salt thereof eg
  • the compound or its salt that promotes intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention to receptor is useful as a safe and low-toxic drug such as an analgesic, for example.
  • Antisense DNA which can suppress the expression of DNA or mRNA or the protein of the present invention, can suppress the function of the protein of the present invention or the DNA encoding the protein, which exerts the above-mentioned effects in vivo. .
  • the antisense DNA When used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out in the same manner as the aforementioned therapeutic / prophylactic agent for various diseases containing the protein or DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
  • the present invention relates to a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). And a non-human mammal having the same.
  • a drug for gene therapy comprising the recombinant vector described in (4).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, and the lipofection method It can be produced by introducing the target exogenous DNA of the present invention by a coagulation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA introduction method and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transfected animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germinal cells with a known cell fusion method.
  • mice for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, green egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal models, and easy to breed especially mice (for example, pure strains such as C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc.)
  • mice for example, pure strains such as C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc.
  • rat eg, Wistar, SD etc.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention which has been isolated and extracted from mammals.
  • mutant DNA of the present invention a mutation is made to the base sequence of the original DNA of the present invention (for example, , Mutation, etc.), specifically, DNA in which a base has been added, deleted, substituted with another base, or the like is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention.
  • a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species from the target animal.
  • the human DNA of the present invention when introduced, it is derived from various mammals having the DNA of the present invention having a high homology to the human DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • the present invention is achieved by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA-transfected mammal that highly expresses the above DNA can be produced.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters of DNA derived from viruses include, for example, promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus).
  • viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus.
  • Various mammals humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • birds include albumin, insulin II, perovrakin II, eras ichie, erythropoietin, Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, 1 ⁇ 10 1 14.
  • Collagen type I and II cyclic AMP-dependent protein kinase] 3 I-subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor Yuichi tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie 2) ), Sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, KATPase), neurofilament light chain, meta-oral thionein I and IIA, meta-oral proteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H- ras, renin, dopamine / 3-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1 o; (EF-1 ⁇ ), ⁇ -actin, ⁇ and / 3 myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable
  • cytomegalovirus promoter 1 which can be highly expressed in the whole body, human polypeptide A chain elongation factor 1a (EF-1 ⁇ ) promoter, a human and a chicken / 3-actin promoter, and the like can be used.
  • EF-1 ⁇ human polypeptide A chain elongation factor 1a
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RN ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the DNA-transfected mammal (generally referred to as Yuichi Mineta-1).
  • a sequence of each DNA derived from birds can be used, and preferably, SV40 terminator of simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter overnight region and the translation region or in the translation region for the purpose of further expressing the target DNA. It is also possible depending on the purpose to connect 3 ′ downstream of the above.
  • the normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from DNAs derived from various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, and humans) and from various commercially available genomic DNA libraries. Prepared by known methods from all or part of the genomic DNA or from RNA from various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, human, etc.) The obtained cDNA can be obtained as a raw material.
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by the point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a DNA-introduced animal by a conventional DNA engineering technique in which it is linked to the downstream of the promoter and, if desired, to the upstream of the transcription termination site.
  • DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all progeny of the produced animal will retain the DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the DNA has the DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the DNA is stably maintained by mating.
  • the introduction of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage ensures that the DNA of the present invention is present in excess in all of the germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have an excessive amount of the DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. .
  • the progeny of such animals that have inherited the DNA will have an excess of the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of the endogenous normal protein by promoting the function of endogenous normal DNA. It may develop hypertension and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, the hyperfunction of the protein of the present invention and the pathological mechanism of a disease associated with the protein of the present invention are examined. It is possible to elucidate and examine treatment methods for these diseases.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. It is.
  • the non-human mammal having the extraneous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the DNA is stably maintained by mating.
  • the target DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately achieved by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur and can be used as a model animal for the disease.
  • using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action). Further, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. Is also available.
  • other possible uses of the two types of DNA-introduced animals of the present invention include, for example,
  • a protein specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transfected mammal of the present invention or analyzing the protein tissue expressed by DNA. Analysis of the relationship with
  • each organ is taken out from the DNA-introduced animal of the present invention, and after minced, free DNA-introduced cells are obtained by treatment with trypsin or other proteolytic enzyme, and the cells are cultured or systematized. It is possible.
  • the protein producing cell of the present invention can be specified, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormalities can be examined. Thus, the protein of the present invention and an effective research material for elucidating its action can be obtained. Becomes
  • the DNA-introduced animal of the present invention in order to use the DNA-introduced animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a refractory inactive type of the protein of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method of the therapeutic agent for the disease by using a quantitative method and the like. Further, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the protein of the present invention using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention. (6) Creating knockout animals
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the embryonic stem cell according to (1) which is a cell having a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli as a reporter gene.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to a DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, wherein the DNA of the present invention is artificially mutated to suppress the expression of DNA, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • Examples of a method for artificially mutating the DNA of the present invention include, for example, deleting part or all of the DNA sequence by inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. This can be done by doing By these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (] 3-galactosidase gene), cat ( A DNA sequence that disrupts the function of exons by introducing a repo allele gene represented by the chloramphenicylacetyltransferase gene) or terminates transcription of the gene in the intron between exons (eg, polyA addition signal) to prevent synthesis of the complete messenger RNA
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome
  • Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or the DNA sequence on the targeting vector and the DNA in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing by a PCR method using the sequence as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used. It may be newly established according to the method of man. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which C57BLZ6 mice or C57BL / 6 mice have been obtained, the number of eggs collected has been reduced by crossing with DBA / 2. Those established using F1) of 6 and DBAZ2 can also be used favorably.
  • BDF 1 mice have a high number of eggs In addition to the advantage, it has C57BL / 6 mouse as a background, so ES cells obtained using this can be cross-crossed with C57BL / 6 mouse when a disease model mouse is created. It can be used advantageously because the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Many early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method of determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be cited as an example.
  • G-banding method requires about 10 6 cells to the type analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), the first selection of ES cells at the early stage of culture The determination can be performed by gender discrimination, and since the selection of male cells is enabled at an early stage, the labor required in the initial stage of culture can be greatly reduced.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% Culture at about 37 with air or 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air.
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001
  • trypsin Z 0.1-5mM EDTA preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such subculture is usually performed every 11 to 13 days. At this time, cells are observed, and if morphologically abnormal cells are found, it is desirable to discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured in monolayers at high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • MJ Evans and MH Kaufnia Nature, Vol. 292, p. 154, 1981; GR Martin Proc. 'Science' USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 78, pp. 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Observatory, and 'Experimental Morphology', Vol. 87, 27, 1985
  • the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is useful in the cytobiological examination of the protein of the present invention in the mouth of in vivo.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. .
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the evening-getting vector of the present invention. Knocking out the DNA of the present invention by homologous recombination in which the DNA sequence in which the DNA has been inactivated replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. Can be.
  • a cell in which the DNA of the present invention has been knocked out is a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a evening targeting vector.
  • the primer used was the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used in the first step. It can be determined by analysis by the PCR method.
  • the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by homologous gene recombination, and the cell line is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention, and mated with individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention.
  • a homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg cell by a microinjection method. Compared to non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and plural homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is the DNA of the present invention. It is very useful for creating non-expressed non-human mammals. Further, since the protein-deficient mouse of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the reporter gene is coded because the reporter gene exists under the control of the promoter of the protein of the present invention.
  • the activity of the protein promoter of the present invention can be detected. For example, when a portion of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a 3-galactosidase gene (1acZ) derived from Escherichia coli, a tissue expressing the protein of the present invention originally 3-galactosidase is expressed instead of the protein of the invention.
  • the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate of j3-galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-3-indolyl i3-galactovyranoside (X-gal). It is possible to observe the expression state of the protein in the animal body of the animal. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartartaldehyde or the like, washed with dal becco's phosphate buffered saline (PBS), and then stained with a staining solution containing X-ga1.
  • PBS dal becco's phosphate buffered saline
  • RNA may be detected.
  • Such an animal lacking the expression of the protein of the present invention is extremely useful for screening for a substance that activates or inactivates the promoter of the protein of the present invention. Can greatly contribute to the investigation of the cause of the disease or the development of therapeutic drugs.
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the human-derived protein of the present invention.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of primer 0 PR used in Example 1 described later.
  • the transformant Escherichia coli JM1 09 / pTAOPI5 obtained in Example 1 was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number IFO 16451 on July 4, 2000, in Ibaraki. 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Prefecture 1 Chuo No. 6 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposit No. FERM BP-7229
  • IFO Fermentation Research Institute
  • Amplification by PCR was performed using human testis cDNA purchased from Clonetech, Inc. as type II, using the following two types of synthetic DNA.
  • the PCR reaction solution was cDNA solution 21, 0.5 ⁇ 10PF (10 n), 0.51 OPR (10 ⁇ ), 2.51 attached 10x reaction solution, 2.5 1 dNTP (lOni), 0.5 1 Klen Ta (Clonetech) and 16.5 1 distilled water were added to make a total of 25 1.
  • the reaction solution was subjected to a PCR reaction using a Thermal Cycler 9600.
  • the PCR conditions consisted of denaturation at 95 ° C for 2 minutes, followed by a cycle of 98 ° C for 10 seconds, 65T for 20 seconds, and 72 ° C for 20 seconds, repeated 38 times.
  • the PCR product was purified using the Qiagen PCR purification Kit and sequenced directly. Obtained (SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequence predicted from the DNA sequence shown in FIG. 1 was shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1).
  • an amino acid sequence, Tyr—Gly_Gly—Phe—Leu which showed a highly conserved pituitary-derived analgesic peptide was found (FIG. 3).
  • the obtained DNA was prepared, introduced into the pCR2 vector using a TA closing kit (Invitrogen), and transformed into E. coli JM109 to obtain E.coii JM109 / pTA0PI5.
  • the protein of the present invention and the DNA encoding the same are useful as drugs such as analgesics. Further, the protein of the present invention and DNA encoding the same are useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention. Furthermore, anti-protein against the protein of the present invention Since the body can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for detection, quantification, neutralization, and the like of the protein of the present invention in a test solution.

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Description

新規ポリペプチドおよびその DN A 技術分野
本発明はヒト由来の新規ペプチド、 その部分ペプチドおよびそれらをコードす る DN Aなどに関する。 特に鎮痛ペプチドに類似の構造を有することを特徴とす る新規のペプチドに関する。 背景技術
1975年に最初の鎮痛ペプチドとして Me t一エンケフアリンと L e u—ェ ンケフアリンが単離されて以来、 現在までに、 共通して Ty r— G 1 y— G 1 y 一 Phe— Me t/Le uのアミノ酸配列を持つ多くの鎮痛ペプチドが単離同定 されている。 これらのペプチドはプレブ口才ピオメラノコルチン （ネイチヤー （ N ture) 、 297巻、 335— 339頁 （1982) ) 、 プレプロエンケ フアリン A、 あるいはプレプロエンケフアリン Bの部分構造として同定されてい る （ネイチヤー （Na tur e) , 297巻、 431— 434頁 （1982) ； ネイチヤー （Na tur e) , 306巻、 611— 614頁 （ 1983 ) ) ) 。 これらのペプチドは細胞膜上の特異的な受容体 （オビエート受容体） に結合する ことによりその情報を細胞に伝える。 これまでこのような鎮痛ペプチドの多くは 、 その生理活性に基づいて組織抽出物等から単離されその構造が決定されてきた 。 また最近では受容体を利用して組織抽出物等からさまざまな生理活性物質ゃホ ルモンを単離することもなされるようになってきた。 その一例としてォーファン 受容体 0 R L— 1の内因性リガンドとして同定されたノシセプチン （noc i cep t in ) が知られておりノシセプチン前駆体から切り出されるペプチド、 ノシセプチン (nociceptin： FGGFTGARKSARKLANQ) も鎮痛ペプチドと考えられている。
一方、 最近のゲノムや cDNAの配列解析の急速な進展により、 膨大な DNA 情報が入手可能になつた。 これらの D N Aの中にはこれまで未知であつた生理活 性物質をコードするものが含まれているものと推定される。 し力、しながらゲノム DN A配列や Expressed Se uence Tag (EST) から、 未知の生理活性物質を探 そうとしても、 類似した配列はまったく無関係なタンパクの遺伝子や非翻訳領域 の D NA配列にも見出され、 さらには偽遺伝子の存在の可能性もあるため、 それ らの中からどれが本当の生理活性物質であるかどうかを確定することは困難であ つ 7こ。
鎮痛ペプチドの受容体としては現在までに、 三種類 δ、 κ、 の受容体さらに nocicept in受容体 O R L— 1の四種類が知られている。 これら四種類はすべて七 回膜貫通受容体でありその細胞内シグナルは c AM Pの低下であることが知られ ている。 また四種類の鎮痛ぺプチド前駆体から切り出される多くの鎮痛ぺプチド はこれらの受容体に交差反応性を示すことが知られている。
一方これらの鎮痛ぺプチドの生理活性に関してはさまざまな報告がある。 まず 知覚機能としては鎮痛作用が知られている。 また運動機能および行動においては 無動 （力夕トニー状態） 、 角膜反射の消失、 摂食行動、 グルーミングの亢進、 学 習効果の促進、 性行動誘発抑制が知られている。 さらに内分泌機能においてはプ ロラクチン分泌の促進、 GH分泌の促進、 L H分泌の抑制、 T S H分泌の抑制、 A C TH分泌の調節、 バソプレツシン分泌の調節、 インスリン分泌の促進、 M S H作用の増強等が知られている。 その他にも自律機能においては体温調節、 血圧 調節、 呼吸調節、 胃液分泌、 胃運動、 腸の蠕動、 睡眠などに関係していることが 報告されている。
以上のように鎮痛ぺプチドに関しては多くの非常に重要な生理作用が報告され ている。 しかしプロォピオメラノコルチン、 プレプロエンケフアリン A、 あるい はプレプロエンケフアリン Bの部分構造として同定されている鎮痛ペプチド、 さ らにはォーファン受容体 O R L— 1の内因性リガンドとして同定されたノシセプ チン. (nocicept in) 以外に哺乳動物では鎮痛ペプチドは知られていない。
そこで、 未知のヒト由来の鎮痛ペプチドを見出し、 それを利用した新たな生理 活性物質を含有してなる疾患の予防、 治療、 診断薬の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 プライマ 一を作製し、 ヒト精巣 poIy (A) ¾NAを錶型とする R T— P C Rにより、 新規な塩 基配列を有する cDNAをクローニングすることに成功した。 そして、 本発明者 らは、 得られた c D N Aにコードされているポリべプチドが有用な鎮痛ぺプチド の前駆体であることを見出し、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結 果本発明を完成するにいたった。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩、
(3) Ge nB an k受託番号 AC 002107 (配列番号： 5 ) に記載の塩基 配列を有する DNAを除く、 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （2) 記載 の部分ペプチドをコードする塩基配列を有する D N Aを含有する D N A、
(4) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する上記 （3) 記載の DNA、
(5) 上記 （4) 記載の DNAを含有する組換えべクタ一、
(6) 上記 （5) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(7) 上記 （6) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク質また は上記 （2) 記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特 徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造方法 、
(8) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部 分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してな る医薬、
(9) 上記 （3) 記載の DNAを含有してなる医薬、
(10) 鎮痛作用を有する上記 （8) または上記 （9) 記載の医薬、
(1 1) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗 体、
(12) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いるこ とを特徵とするレセプ夕一ァゴニス卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング方 法、
(13) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する レセプターァゴニス卜またはアン夕ゴニス卜のスクリーニング用キッ卜、 および
(14) 上記 （12) 記載のスクリーニング方法または上記 （13) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られるレセプターァゴニストまたはアンタゴニス 卜、
(15) 上記 （14) 記載のレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニストを含有 してなる医薬、
(16) 鎮痛作用を有する上記 （15) 記載の医薬、
(17) 上記 （14) 記載のレセプ夕一ァゴニストの有効量を哺乳動物に投与す ることを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法、
(18) 鎮痛剤を製造するための上記 （14) 記載のレセプタ一ァゴニストの使 用、
(19) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の有効量を 哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法、
(20) 鎮痛剤を製造するための上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の使用、
(21) 上記 （3) 記載の DN Aの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とす る哺乳動物の鎮痛方法、
(22) 鎮痛剤を製造するための上記 （3) 記載の DNAの使用等を提供する。 さらには、 本発明は、
(23) (i) レセプターまたはその部分ペプチドに、 上記 （1) 記載のタンパ ク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩を接触させた場合と、 （ii) レセプターまた はその部分ペプチドに、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上 記 （2) 項記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩および試験化合物を接触させた場合において、 該レセプターまたはその部 分ペプチドと上記 （1) 項記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 項記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と の結合量を測定し、 比較することを特徴とする上記 （12) 記載のスクリーニン グ方法、
(24) (i) レセプタ一を含有する細胞またはその細胞膜画分に、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を接触させた場合と、 （ii) レ セプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、 上記 （1) 記載のタンパク質 もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩および試験化合物を接触させた場合において、 該 レセプ夕—を含有する細胞またはその細胞膜画分と上記 （1) 記載のタンパク質 もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩との結合量を測定し、 比較することを特徴とする 上記 （12) 項記載のスクリーニング方法、
(25) (i) レセプターを含有する細胞に、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くはその塩、 または上記 （2) E載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩を接触させた場合と、 （ii) レセプターを含有する細 胞に、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部 分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化 合物を接触させた場合において、 該レセプターを含有する細胞におけるレセプ夕 一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト ールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下な ど） などの活性を測定して、 比較することを特徴とする第 （12) 項記載のスク リーニング方法、
(26) 上記 （12) および上記 （23) 〜 （25) のいずれかに記載のスクリ 一二ング方法または上記 （13) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られ るレセプ夕ーァゴニス卜を含有してなる医薬、
(27) 鎮痛剤である上記 （26) 記載の医薬、
(28) 上記 （12) および上記 （23) 〜 （25) のいずれかに記載のスクリ 一二ング方法または上記 （13) 項記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れるレセプ夕一アン夕ゴニストを含有してなる医薬、
(29) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いるこ とを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 項記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と レセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物または その塩のスクリーニング方法、
(30) (i) レセプ夕一を含有する細胞に、 上記 （1) 記載のタンパク質もし くはその塩、 または上記 （2) 項記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩を接触させた場合と、 （ii) レセプターを含有する 細胞に、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 項記載 の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試 験化合物を接触させた場合において、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその 塩、 または上記 （4) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩とレセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を測定し、 比較 することを特徴とする上記 （29) 記載のスクリーニング方法、
(31) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する 上記 （1) 項記載のタンパク質もしくはその塩、 または上記 （2) 記載の部分べ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩とレセプターとの 結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ 一二ング用キッ卜、
(32) 上記 （29) 〜 （30) 記載のスクリーニング方法または上記 （31) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記 （1) 記載のタンパク質も しくはその塩、 または上記 （2 ) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩とレセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促 進または阻害する化合物またはその塩等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明の鎮痛ぺプチド様夕ンパク質をコードする c D N Aの塩基配列を示す。
図 2は実施例 1で見出された本発明の鎮痛ぺプチド様タンパク質のアミノ酸配 列を示す。
図 3は本発明の新規鎮痛ぺプチド様タンパク質と既知の鎮痛ぺプチドとのアミ ノ酸配列の比較を示す。 図中、 「新規鎮痛ペプチド」 は配列番号： 1で表される アミノ酸配列の第 5 0番目 （T y r ) 〜第 7 3番目 （L y s ) からなる部分アミ ノ酸配列からなるぺプチドを意味する。 発明を実施するための最良の形態
本発明のタンパク質は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質 （好ましくは、 鎮痛ペプチド 様タンパク質） である。
本発明のタンパク質は、 例えば、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラッ ト、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 ゥマ、 サルなど） のあら ゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メ サンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊辦芽 細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細 胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞な ど） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （ 例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底核、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳 ) 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副 腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸、 十二指腸） 、 血管、 心臓、 胸腺 、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋 などに由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク質であってもよい 配列番号： 1と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好まし くは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以 上の相同性を有するァミノ酸配列などがあげられる。
配列番号： 1と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質と しては、 上記のとおり配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
以下、 本明細書において、 「配列番号： 1で表されるアミノ酸と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質」 または 「配列番号： 1で表 されるアミノ酸と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質またはその塩」 を単に 「本発明のタンパク質」 と略称する場合がある。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細 胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 P Hの低下など） 、 鎮痛活性 （作用） など があげられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示 す。 したがって、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離 、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質 のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛活性 （作用） などが同等 （例、 約 0. 5〜 2倍程度） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク質の分子量 などの量的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明のタンパク質には、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0個程度、 好ましくは 1〜9個程度、 さらに 好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列 番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0個程度 、 好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （例えば 1〜 2 0個程度、 好ましくは 1〜 9個程度、 さらに好まし くは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されている場合、 その欠失または 置換の位置としては、 特に限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパク質 は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカルボキシレート（—C 00 ~) であるが、 C末端がアミド （一 C O NH 2 ) またはエステル （一 C O O R ) であってもよい。
ここでエステル基の Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 ィ ソプロピルもしくは n—ブチルなどの C^— eアルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひーナ フチルなどの C 6— 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー C i— 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー（：ぃ 2 アルキル基などの C 7 _ i 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用され るピバロイルォキシメチル基などが用いられる。 '
本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （または力ルポキシレ一卜 ) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメ チォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの —6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した ダル夕ミル基がピ口グルタミン酸化したもの、 分子内のァミノ酸の側鎖上の置換 基 （例えば、 一 OH、 — SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァ ニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ( 卜 6 ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タン パク質などの複合タンパク質なども含まれる。 . 本発明のタンパク質の部分ペプチド （以下、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質の部分べ プチドのみならず、 そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を総称して、 本発明のタンパク質の部分ペプチドと称する場合がある） としては、 前記した本 発明のタンパク質と同質の活性、 例えば、 レセプターを介する細胞剌激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細 胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下など） 、 鎮痛活性 （作用） など を有するペプチドであれば何れのものであってもよい。
具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の第 19番目 （As p) 〜 第 73番目 （Ly s) のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列の第 50番目 （Ty r) 〜73番目 （Ly s) のアミノ酸 配列を有する部分ぺプチドなどが好ましく用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドとしては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有する部分ペプチドが好ましい 実質的に同質の活性としては、 例えば、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細 胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下など） 、 鎮痛活性 （作用） など があげられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示 す。 したがって、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離 、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質 のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛活性 （作用） が同等 （例、 約 0. 5〜2倍 程度） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
また、 これら本発明の部分ペプチドには、 本発明のタンパク質の （拮抗） 阻害 型である、 すなわち、 本発明のタンパクの有する活性を阻害する活性を有するも のも含まれる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに 好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するタンパ ク質の部分ペプチドが用いられ、 より具体的には、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0個程度、 好ましくは 1〜9個 程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸 配列、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0個程度、 好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 2 0個程度、 好ましくは 1〜 9個程度、 さら に好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァ ミノ酸配列を含有するタンパク質の部分部分ペプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドの C末端は通常力ルポキシル基 （一 C O OH) ま たはカルポキシレート（一 C O O—) であるが、 前記した本発明のタンパク質の ごとく、 C末端がアミド （― C ONH 2) またはエステル （一 C O O R) (Rは 前記と同意義を示す） であってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した部分ペプチドにおいて、 N末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成し たダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置 換基 （例えば、 一 OH、 — S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グ ァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの _ 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖 ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 とりわけ生理学的 に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例え ば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸 、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩な どが用いられる。
本発明のタンパク質またはその塩は、 前述したヒ卜ゃ温血動物の細胞、 組織ま たは血漿から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、 後 述するタンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つても製造することができる。 また、 後述のタンパク質合成法またはこれに準じ て製造することもできる。
ヒトゃ温血動物の細胞、 組織または血漿から製造する場合、 ヒトゃ温血動物の 細胞または組織のホモジナイズ上清および血漿を硫安沈澱、 エタノール沈澱、 酸 抽出、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ヒドロキシァ パタイトク口マトグラフィ一、 逆相クロマトグラフィー、 レクチンカラムクロマ トグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合 わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのァ ミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そ のような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキ シメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4 一 （2'，4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一' (2' , 4' -ジメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげる ことができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護 したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従 レ 、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に 各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を 実施し、 目的のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得す る。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν—ェチル 一 N'—（3—ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t ) とと もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B t エステルあるいは H〇 O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なったのちに樹脂に添加することができる。 保護アミノ酸の活性化や樹脂との 縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質縮合反応に使用しうることが知られ ている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド、 N 一メチルピロリドン、 クロ口ホルム、 トリフルォロエタノール、 ジメチルスルホ キシド、 D M F、 ジメチルスルホキシド、 ピリジン、 クロ口ホルム、 ジォキサン 、 塩化メチレン、 テトラヒドロフラン、 ァセトニトリル、 酢酸ェチル、 N-メチ ルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はタン パク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 ° (：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導 体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結 果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すこ とにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得 られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ 酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕ーシャリーアミル ォキシ力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキ シカルボニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフル ォロアセチル、 フタリル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエ ニルホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。 カルボキシル基の保護基 としては、 例えばアルキルエステル (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチ ル、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどのエステル基） 、 ベンジルエステル、 4 —ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4—クロ口べンジ ルエステル、 ベンズヒドリルエステル、 フエナシンエステル、 ベンジルォキシカ ルポニルヒドラジド、 夕一シャリ一ブトキシカルポニルヒドラジド、 トリチルヒ ドラジドなどが用いられる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが用いられる。 また 、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル 基、 卜ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 C l 2— Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4-メトキシ- 2， 3， 6 -トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum 、 Bo c、 T r 't、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2, 4， 5-トリクロ口フエノール、 2, 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール 、 パラニトロフエノ一ル、 HONB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシ フタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の 活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 t：〜 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フ ェノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフ イド、 1， 4一ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールのようなカチオン 捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用い られる 2， 4ージニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリ ブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—ェ タンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護 以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によつ ても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルポキシ末端アミノ 酸の《—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （夕 ンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α—ァミノ 基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除 去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で 縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた 保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の 粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆 使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得 ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキ シル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク質の アミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。 本発明のタンパク質の部分べプチドまたはその塩は、 公知のぺプチドの合成法 に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のタンパク質を構成し得 る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる 。 公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、 以下の①〜⑤に記載された 方法があげられる。
( M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i、 ペプチド シンセシス （Pept ide Synthes is) , Interscience Publ ishers, New York (1966年）
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New Y ork (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島洽明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1 977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の夕ンパ ク質を精製単離することができる。 上記方法で得られるタンパク質が遊離体であ る場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得 られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードする D NAとしては、 前述した本発明のタンパク 質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいずれ でもよい。 ライプラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 · 組織より mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Poly merase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅する こともできる。 具体的には、 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ ク質をコードする D NAとしては、 例えば、 ①配列番号： 2で表わされる塩基配 列を有する D NA、 ②配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAにハイ ブリダィズし、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同 質の活性、 例えば、 レセプ夕一を介する細胞剌激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細 胞内 c GM P生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 血管新生活性 （作用） 、 細胞増殖 ·遊走 ·分 化活性 （作用） などを有するタンパク質をコードする D NAなどが用いられる。 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイプリダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 4 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ま しくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ る。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニンク （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な 条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜 6 5 の条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
本発明の部分べプチドをコードする D N Aとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。
具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の第 19番目 （As p) 〜 第 73番目 （Lys) のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードする DNA としては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列の第 55〜219番目、 配 列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 50番目 （Tyr) 〜73番目 （Ly s) のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば 、 配列番号： 2で表わされる塩基配列の第 148〜219番目の塩基配列を有す る D N Aなどが用いられる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のタンパク質およ びその部分ペプチドを単に本発明のタンパク質と称する場合がある） をコードす る DN Aのクローニングの手段としては、 本発明のタンパク質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて、 PCR法によって前 記 DNAライブラリ一等から目的とする DNAを増幅するか、 または適当なべク 夕一に組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域を有する D N A断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼーシヨン によって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モ レキユラ一 ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , C old Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明の夕ンパク質またはその部分べプチドをコ一ドする D NAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ 一を付加したりして使用することができる。 該 DNAはその 5 '末端側に翻訳開 始コドンとしての ATGを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳 終止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。 本発明の夕ンパク質またはその部分べプチドをコードする D N Aの発現べク夕 —は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質をコードする DNAから目的とする D NA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモータ 一の下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322, p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9， p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファ一ジ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス , パキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ1— 11、 ρΧΤ 1、 ρ Rc/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I /N e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモータ一、 LTRプ ロモ—夕—、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモータ一などがあげられる これらのうち、 CMVプロモ一ター、 S Rひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプ 口モータ一、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモーター、 l ppプロモーター などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモー夕一、 SP02プ ロモ—夕—、 p e n pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プ 口モーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモー夕一などが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて d h ί r遺伝子を選択マ一力一として 使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 タンパク質の N端末側に 付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA，シグナル配列、 O mp A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合 は、 MFa ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞であ る場合には、 例えばインシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグ ナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを細胞に導入することによって形質転換体を製造することができる。 宿主としては、 例えばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆 虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia col i ) Kl 2 · DH1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ*ナショナル ·アカデミー ·ォ ブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ 'リサ一 チ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 〔ジ ヤーナル ·ォブ ·モレキュラー ·ノ ィォロジ一 （Journal of Molecular Biology ) 〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル ·ォプ ·モレキ ユラ— .バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネティッ クス （Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えばバチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) M 1 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 , 207— 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (198 4)3 などが用いられる。
酵母としては、 例えばサッカロマイセス ·セレビシェ （Saccliarofflyces cerevi siae) AH22, AH22R -， NA87 - 1 1A, DKD- 5D, 20B— 1 2、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ （Sdiizosaccharomyces pombe) NCYC 1 913， NCYC 2036, ピキア ·パストチス （Pichia pastoris) などが用 いられる。 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brass icae由来の細胞または Est igineim acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴィトロ （in Vitro) , 13, 213-2 17, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 （ Nature) 、 315巻、 592頁 （1985) 〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 1、 COS— 7、 Ve r o細胞 、 チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺 伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dhf r— ) 細胞 と略記） 、 L細胞、 ミエ口一マ細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞、 C127細胞 、 BALB3T3細胞、 S p- 2 /O細胞などが用いられる。 これらの中でも C HO細胞、 CHO (dh f r_) 細胞、 293細胞などが好ましい。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 ( 1972 )やジーン （Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド .ジエネラ ル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 ( 1979)などに記載の方法に従って行なわれる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （Metli ods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991)に記載の方法に従 つて行なわれる。
昆虫細胞や昆虫を形質転換するには、 例えばバイオ/テクノロジー （Bio/Tecli no logy) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験プ 口トコ一ル， 263— 267 (1 995) (秀潤社発行） に記載の方法に従って行 なうことができる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 〔Gr aham F. L. and van der Eb A. J.ヴイロロジ一 （yirology) 52, 456-467 (197 3) 〕 、 DEAE— d e x t r an法 〔So即 ayrac L.M. and Danna K. J. プロシ —ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ •ザ'ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7575-7578, 1981〕 、 リポフエクション法 〔Malone R. W. et al. プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナシ ョナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081, 1989〕 、 電気穿孔法 CNuemann E. et a 1. ェンポ，ジャーナル （EMB0 J.) 1, 841-845 (1982) 〕 等があげられる。 このようにして、 本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する発現べク ターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のタンパク質を安定に発現させる方法として は、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をク ローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マ一力一を指 標にして形質転換体を選択することができる。 さらに、 このように選択マ一力一 を用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより 本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 dh f r遺伝子を選択マ一力一として用いた場合、 MTX濃度を徐々に 上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 dh f r遺伝子とともに、 本発明 のタンパク質をコードする DNAを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細 胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aが発現可能な条件下で培養し、 本発明のタンパク質またはその部分べプチ ドを生成、 蓄積せしめることによって、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチド またはそれらの塩を製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカ一、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどがそれぞれ用いられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進 因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) ， ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ ·イン ·モレキュラー ·ジェネティックス （Journal of Experiments in Molecu lar Genetics) ， 43 1— 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモー夕一を効率よく働かせるため に、 例えば 3 j8—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バ一クホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 「プロシ一ジングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ .ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)」 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシージングズ- ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 があ げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20 X 〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Inse ct Medium (Grace, T.C. C.，ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非働化し た 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは 約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間 行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) 、 1 2 2巻、 5 0 1 ( 1 9 5 2 )〕 、 DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) 、 8巻、 3 9 6 ( 1 9 5 9 )〕 、 R P M I 1 6 4 0培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン · メディカ レ'ァソシェ——シヨン (The Journal of the American Medical Associ at ion) 1 9 9巻、 5 1 9 ( 1 9 6 7 )〕 、 1 9 9培地 〔プロシ一ジング ·ォブ · ザ'ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) 、 7 3卷、 1 ( 1 9 5 0 )〕 などが 用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °C で約 1 5〜7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に、 C H〇 （d h f r— ) 細胞および d h f r遺伝子を選択マーカーとして 用いる場合、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地 を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壌した のち、 遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 (登録商標。 以下、 TMと略称する場合がある） などの界面活性 剤が含まれていてもよい。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体 あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上 清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、 公知の分離-精 製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法と しては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として 分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利 用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する 方法、 疎水クロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィ一などの疎 水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な どが用いられる。
かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方 法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ た場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のタンパク質を、 精製前または精製後に適当 なタンパク修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリぺプ チドを部分的に除去することもできる。 タンパク修飾酵素としては、 例えば、 ト リプシン、 キモ卜リプシン、 アルギニルェンドぺプチダ一ゼ、 プロティンキナー ゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアッセィなどにより測定することができる。
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本 発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明のタンパ ク質と略記する場合がある） を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであつてもよい。
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある ) は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法 に従って製造することができる。
〔モノク口一ナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナ一ル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行なうこと ができる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスおよび ラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクロ一ナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 .後記の標識化タンパク質と抗血清と を反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうこ とができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔 ネイチヤー （Nature), 256、 495 (1975)3 に従い実施できる。 融合促進剤として は、 例えば、 ポリエチレングリコ一ル （PEG) やセンダイウィルスなどがあげ られるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0、 AP— 1な どがあげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （ 脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃 度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°Cで 1〜10分間インキュ ベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが用いられる。 モノクロ一ナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0 培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるい はハイプリドーマ培養用無血清培地 ( S FM- 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを 用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 t：、 好ましくは約 3 7 であ る。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は 、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナ一ル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈澱法、 等電点沈澱法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができ る。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） とキャリア一タン パク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動 物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリクローナル抗体含有物を採取し て、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリア一夕ンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュ.バントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体の分離精製 と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のタンパク質または部分べプチドをコ一ドする D NAまたは mR NAに 相補的な塩基配列を有するアンチセンス D NAとしては、 本発明のタンパク質ま たは部分べプチドをコ一ドする D N Aまたは m R N Aの塩基配列またはその一部 の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、 該タンパク質または部分べプチドの発現 を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその誘導体であれば、 いず れのアンチセンス D N Aであってもよい。
相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明のタンパク質または部分ペプチドをコ ―ドする D NAまたは mR NAの全塩基配列または部分塩基配列と約 4 0 %以上 、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。 特に、 本発明の D NA または m R N Aの全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードす る部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） と約 4 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアンチセンス D NAが好適である。 これらのアンチセ ンス D NAは、 公知の D NA合成装置などを用いて製造することができる。 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩は、 例えば、 レセプ 夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下 など） 、 鎮痛作用などの作用を有している。 したがって、 本発明のタンパク質、 その部分ぺプチドまたはそれらの塩はさまざまな用途に用いることができる。 以下に、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （本発明の タンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質をコードする D NA ( 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質に対する抗体 （本 発明の抗体と略記する場合がある） およびアンチセンス D N Aの用途を説明する 。
( 1 ) 各種疾病の治療 ·予防剤などの医薬
本発明のタンパク質および本発明の D N Aは、 鎮痛剤等の医薬として有用であ る。
本発明のタンパク質または本発明の D N Aを上記の医薬として使用する場合は 、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイク 口カプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用で きる。 例えば、 本発明のタンパク質あるいは D NAを生理学的に認められる担体 、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認め られた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造すること ができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得ら れるようにするものである。 本発明の D NAを用いる場合は、 該 D NAを単独あ るいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソ シェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に 従って投与することができる。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビト一ル、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例え ば、 エタノールなど) 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリ エチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プ ロカインなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一 ルなど) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止 剤などと配合してもよい。 調整された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 プ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなどの哺乳動物） に対して投与することができる 該タンパク質または D NAの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投 与の場合、 一般的に通常成人 （6 0 k gとして） においては、 一日につき有効成 分を約 0. l m g〜： L 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、 より好ましく は約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投 与対象、 対象組織、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の 形では通常成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき有効成分を約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . 1 ~ 2 O m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の 場合も、 6 Okg当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 温血哺乳動物 （例え ば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを コードする DNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができる。 したがって、 本発明の DN Aは、 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の遺伝子診断剤とし て有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼ一シヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) 、 第 5巻、 874〜879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスェ一 (Proceedings of the National Academy of Sciences of USA) 、 第 86巻、 2766〜 2770頁 （ 1989年） ） などにより実施することができる。
(3) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および （ii) 被 検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同 時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定するこ とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。 また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 モノクローナ ル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか 、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そ のものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが、 上記酵素としては 、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 j3—ガラクトシダーゼ、 β— ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素などが、 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセン イソチオシァネートなどが、 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノー ル誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。 さらに、 抗体 あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。 抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース などの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラスなどが用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応させ ( 1次反応） 、 さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ （2次反応） た のち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明の夕 ンパク質量等を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行って も、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤お よび不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法 による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は 必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上 の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の夕ンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原と（F) と抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し （ B / F分離) 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B /F分離をポリエチレンダリ コール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量僅かであり、 少量の沈降物 しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメトリ一など が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGY 」 Vol. 70 (Immunochemical Techniaues (Part A) ) > 同書 Vol. 73 (Imunoc eniic al Techniaues (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniaues (Part 0 ) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D : Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Ant ibodies an d General Immunoassay Methods) ) ^ 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデミ ックプレス社発行） などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の夕ンパク質の濃度を定量することに よって、 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の診断を行なうことができる。 さらに、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 さらに、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。
( 4 ) 医薬候補化合物のスクリーニング (A) レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリ一ニング方法 本発明のタンパク質と該レセプ夕ーを用いたリガンド ·レセプ夕一結合アツセ ィ系を構築することによって、 本発明のタンパク質と同様の作用を有する医薬候 補化合物のスクリーニングや、 本発明のタンパク質の作用を阻害する医薬候補化 合物のスクリーニングを行なうことができる。 すなわち、 本発明は、 本発明の夕 ンパク質を用いるレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング 方法を提供する。
より具体的には、 本発明は、
( 1 ) ( i ) レセプ夕一またはその部分ペプチドに、 本発明のタンパク質を接触 させた場合と （Π) レセプ夕一またはその部分ペプチドに、 本発明のタンパク質 および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするレセプ夕 ーァゴニス卜またはアン夕ゴニス卜のスクリーニング方法、 および
( 2 ) ( i ) レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、 本発明のタン パク質を接触させた場合と （ii) レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画 分に、 本発明のタンパク質および試験化合物を接蝕させた場合との比較を行なう ことを特徴とするレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング 方法を提供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i) の場合 における、 例えば、 レセプターまたはレセプ夕一を含有する細胞等に対する本発 明のタンパク質の結合量、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキド ン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AMP生 成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内夕 ンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などを測定して、 比較するこ とを特徴とするものである。
より具体的には、 本発明は、
( l a) ( i ) 標識した本発明のタンパク質を、 レセプ夕一またはその部分ぺプ チドに接触させた場合と、 （i i) 標識した本発明のタンパク質および試験化合物 を、 レセプ夕一またはその部分ペプチドに接触させた場合における、 標識した本 発明のタンパク質の該レセプ夕ーまたはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対 する結合量を測定し、 比較することを特徴とするレセプターァゴニストまたはァ ン夕ゴニス卜のスクリーニング方法、
(2 a) (i) 標識した本発明のタンパク質を、 レセプターを含有する細胞また はその細胞膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識した本発明のタンパク質およ び試験化合物を、 レセプ夕一を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた 場合における、 標識した本発明のタンパク質の該細胞またはその細胞膜画分に対 する結合量を測定し、 比較することを特徴とするレセプターァゴニストまたはァ ン夕ゴニス卜のスクリーニング方法、 および
(2 b) ( i) 本発明のタンパク質を、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させた 場合と、 （ii) 本発明のタンパク質および試験化合物を、 レセプターを含有する 細胞に接触させた場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァ ラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下など） 、 鎮痛作用などを測定し、 比較す ることを特徴とするレセプターァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニン グ方法を提供する。
上記の （l a) または （2 a) のスクリーニング方法において、 レセプターに 結合して、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害する化合物がレセプ 夕一ァゴニストまたはアンタゴニストとして選択できる。
上記 （2 b) のスクリーニング方法において、 レセプ夕一に結合し、 該レセプ 夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下 など） を促進する活性、 鎮痛作用などを有する化合物をレセプ夕一ァゴニストと して選択することができ、 一方、 該細胞刺激活性を抑制する活性を有する化合物 をレセプ夕一アン夕ゴニストとして選択することができる。
また、 上記の （1 a) または （2 a) のスクリーニング方法において、 本発明 のタンパク質とレセプターとの結合を阻害する活性が認められた試験化合物の中 で、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコ リン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生 成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などの活性を有する化合物をレセプターァゴニスト として選択することができ、 これらの活性を有しない化合物をレセプ夕一アン夕 ゴニストとして選択することができる。
本発明のスクリ一二ング方法に用いられるレセプ夕一としてはヒトあるいは温' 血動物由来の鎮痛ペプチド受容体 （δ、 κ、 β ) などが好ましく用いられる。 これらのレセプターおよび本発明のタンパク質に対するレセプ夕一は、 公知の タンパク質の精製方法に従って入手することができ、 また、 公知の遺伝子工学的 手法に従って該レセプタ一をコードする D NAをクローニングした後、 前記した 本発明のタンパク質の発現方法に従って目的とするレセプ夕一を入手することも できる。
該レセプタ一の部分ペプチドとしては、 全長レセプ夕一を適当に切断して得ら れる部分ペプチドを用いることができる。
標識した本発明のタンパク質としては、 例えば、 〔3Η〕 、 c1 2 5 η 、 〔1 4 c〕 、 〔3 5 s〕 などで標識した本発明のタンパク質などを用いることができる 本発明のスクリ一二ング方法に用いられる上記レセプ夕一を含有する細胞とし ては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞として列 記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C HO細胞などが 好ましい。 レセプ夕一を含有する細胞は、 レセプ夕一をコードする D NAを用い て、 公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って 製造することができる。 また、 上記レセプ夕一を含有する細胞として、 C L 8細 胞株 （ボーン （BONE) , 18, 159-169, 1996) 、 O K細胞株 （アメリカン ·ジャ ーナル ·ォブ ·フィジオロジー （AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221- E227, 1987) などの株化細胞を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法において、 レセプターを含有する細胞を用いる場 合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化することができる。 固定化方法は、 公知の方法に従って行うことができる。 上記レセプ夕一を含有する細胞の細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公 知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法と しては、 Potter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリング プレンダーゃポリトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フ レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破 砕などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法 などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （ 500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上 清をさらに高速 （15000 rpm〜30000 rpm) で通常 30分〜 2時間 遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一ま たは本発明のタンパク質と、 細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が 多く含まれる。
該レセプターを含有する細胞やその細胞膜画分中のレセプターの量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好 適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一 ロットで大量の試料を測定できるようになる。
試験化合物としては、 例えばタンパク質、 非タンパク質性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられ、 これ ら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質とレセプ夕一との 反応は、 通常約 37 °Cで数時間行なうことができる。
具体的には、 上記の （l a) または （2 a) のスクリーニング方法を実施する には、 まず、 本発明のレセプ夕一を含有する細胞またはその細胞膜画分、 あるい はレセプ夕一またはその部分ペプチドを、 スクリーニングに適したバッファ一に 懸濁することによりレセプター標品を調製する。 バッファーには、 11約4〜1 0 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファー などの、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害しないバッファ一であ ればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 T w e e n - 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなど の界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによる レセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で、 PMSF、 ロイぺプチン、 バシト' ラシン、 ァプロチニン、 E—64 (タンパク質研究所製） 、 ぺプスタチンなどの プロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 一方、 細胞が固定化細胞の場合、 培養器に固定化させたまま、 つまり細胞を生育させた状態で、 あるいはダルタル アルデヒドゃパラホルムアルデヒドで固定した細胞を用いて、 本発明のタンパク 質とレセプターを結合させることができる。
この場合、 該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられる。 そして、 0.01 m 1〜 10m 1の該レセプ夕一溶液に、 一定量 （例えば、 2000 C i Zmmo 1の場合、 約 10000 c ρπ！〜 1000000 c pm) の標識した本発明の夕 ンパク質 （例えば、 〔1251〕 で標識した本発明のタンパク質） を添加し、 同時 に 10— 4M〜10— 1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識の本発明のタンパク質を加えた反応チューブも用意 する。 反応は 0°Cから 50°C、 望ましくは 4でから 37°Cで 20分から 24時間 、 望ましくは 30分から 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適 量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性 （例えば、 〔1251〕 の量） を液体シンチレーシヨンカウン夕一またはァ一カウン夕一で測 定する。 濾過には、 マ二ホールドやセルハーべス夕一を用いることができるが、 セルハーべスターを用いることが効率を上げるために望ましい。 拮抗する物質が ない場合のカウント（BQ)から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B 。― NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が、 例えばカウ ン卜 （B。一 NSB) の 50 %以下になる試験化合物をァゴニストまたはアン夕 ゴニスト候補化合物として選択することができる。
また、 上記 （2b) のスクリーニング方法を実施するためには、 レセプターを 介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下など） 、 鎮痛作用などの活性を公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定する ことができる。
具体的には、 まず、 レセプターを含有する細胞をマルチウエルプレート等に培 養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞 に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時 間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物 をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （ （例えば 、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動 、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） の生成が、 細胞が含有する分 解酵素によつて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセ ィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フォルス コリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用 として検出することができる。
鎮痛作用の測定は公知の方法に準じて測定することができる。
上記 （2 b ) のスクリーニング方法において、 試験化合物を添加した際にレセ プタ一を含有する細胞が、 該レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P 生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内 タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用の上昇などを示した場合、 該試験化合物をレセプターァゴニスト候補化合物として選択することができる。 一方、 試験化合物を添加した際にレセプターを含有する細胞が、 該レセプ夕ーを 介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用の低下などを示した場合、 該試験化合物をレセプ夕一アンタゴニスト 候補化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 好ましくはさらに 、 レセプターを含有する細胞もしくはその細胞膜画分等を含有するものである。 本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌 し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
②レセプ夕一標品
本発明のタンパク質に対するレセプ夕一などを含有する CHO細胞を、 12穴 プレー卜に 5 X 105個 穴で継代し、 37°C、 5 %C02、 95 % a i rで 2 日間培養したもの。
③標識した本発明の夕ンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を 〔3H〕 、 [125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したもの。
④本発明のタンパク質標準液
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を 0.1%ゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで 0. ImMとなるように溶解し、 —2 o°cで保存したもの。
〔測定法〕
① 12穴組織培養用プレートにて培養した組換え型レセプ夕一を含有する C HO 細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 /z lの測定用緩衝液を各 穴に加える。
② 10 〜 10 Mの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 5 nMの標識した本 発明のタンパク質を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を 知るためには試験化合物のかわりに 10 Mの本発明のタンパク質を 5 1加 えておく。
③反応液を除去し、 l.m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 した本発明のタンパク質を 0. 5mlの 0.2N N a〇H— 1 % S D Sで溶解 し、 4mlの液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。 なお、 〔1251〕 で標識されている場合は、 夜体シンチレ一夕一と混合することなしに直接ガンマ —カウン夕一で測定できる。
ΡΜΒ= 100 X (B-NS Β) / (Β。一 NSB)
ΡΜΒ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の結合量
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量 以上のとおり、 本発明のタンパク質はレセプターァゴニストまたはアン夕ゴニ ストをスクリーニングするための試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害する化 合物であり、 具体的には、 該レセプタ一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+濃度の変動、 細胞内 cAMP 生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内 タンパク質のリン酸化、 pHの低下など） 、 鎮痛作用などの作用を有する化合物 またはその塩 （いわゆる、 レセプ夕一ァゴニスト） 、 あるいは該レセプターを介 する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 Hの低下など） 、 鎮痛作用を有しない化合物またはその塩 （いわゆる、 レセプ夕一アン夕ゴニス卜 ) である。
レセプターァゴニストは、 本発明のタンパク質が有する生理活性の全部または 一部を有しているので、 該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用であ る。 例えば、 鎮痛剤などの医薬として有用である。
一方、 レセプターアンタゴニストは、 本発明のタンパク質が有する生理活性の 全部または一部を抑制することができるので、 該生理活性を抑制する安全で低毒 性な医薬として有用である。 上記レセプ夕一アン夕ゴニストまたはレセプ夕ーァゴニストを上記の医薬とし て使用する場合は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリ キシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 上記レセプターアンタゴニストまたはレセプ夕 —ァゴ二ストを生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤
、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量 形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤における有効成 分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガン卜、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例え ば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリ エチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プ ロカインなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコー ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止 剤などと配合してもよい。 調整された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなどの哺乳動物） に対して投与することができる 該レセプ夕一ァゴニス卜の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与 の場合、 一般的に通常成人 （60kgとして） においては、 一日につき有効成分 を約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは 約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与 対象、 対象組織、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形 では通常成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき有効成分を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
該レセプターアン夕ゴニストの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口 投与の場合、 一般的に通常成人 （6 O kgとして） においては、 一日につき有効 成分を約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好まし くは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は 投与対象、 対象組織、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤 の形では通常成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき有効成分を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(B) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼ阻害剤のスクリーニング方 法およびスクリーニング用キット
本発明のタンパク質またはその塩は生体内に存在するプロティナーゼによって 切断され、 失活すると考えられる。 したがって、 本発明のタンパク質および本発 明のタンパク質を分解するプロティナーゼを用いることによって、 本発明のタン パク質を分解するプロティナーゼを阻害する活性を有する化合物を選択すること ができる。
該プロティナ一ゼを阻害する活性を有する化合物は、 生体内における本発明の タンパク質の失活を防ぐことにより、 細胞間接触に依存しない発明のタンパク質 の活性を促進することができるので、 例えば、 鎮痛剤などの医薬として期待でき る。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明の タンパク質を分解するプロティナ一ゼを阻害する活性を有する化合物またはその 塩のスクリ一ニング方法を提供する。
より具体的には、 本発明は、
( 1 ) ( i ) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明のタンパク 質とをィンキュベートした後、 レセプタ一を含有する細胞に接触させた場合と、
(i i) 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼおよび試験化合物と本発明 のタンパク質とをインキュベートした後、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させ た場合との比較を行なうことを特徵とする本発明のタンパク質を分解するプロテ イナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提 供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i) の場合 における、 例えば、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細 胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などの活性を測定して、 比較するこ とを特徴とするものである。
より具体的には、 本発明は、
( l a ) ( i ) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明のタンパ ク質とをィンキュベートした後、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させた場合と
(i i) 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼおよび試験化合物と本発明 のタンパク質とをインキュベートした後、 レセプターを含有する細胞に接触させ た場合における、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離 、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質 のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などの活性を測定し、 比較することを 特徴とする本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する活性を有す る化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 "る。
上記のスクリーニング方法において、 該レセプターを介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細 胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質の.リン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などの活性を 促進する試験化合物を本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する 活性を有する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプ夕一としては、 ヒトあるいは 温血動物の鎮痛ペプチド受容体 （δ、 ίΐ ) が用いられる。
本発明のタンパク質に対するレセプ夕一は、 公知のタンパク質の精製方法に従 つて入手することができ、 また、 公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプター をコードする D N Αをクローニングした後、 前記した本発明のタンパク質の発現 方法に従って目的とするレセプターを入手することもできる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプターを含有する細胞とし ては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞として列 記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C H O細胞などが 好ましい。 レセプ夕一を含有する細胞は、 レセプ夕一をコードする D NAを用い て、 公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って 製造することができる。 また、 上記レセプターを含有する細胞として、 C L 8細 胞株 （ボーン （BONE) , 18, 159-169, 1996) 、 O K細胞株 （アメリカン *ジャ ーナル ·ォブ ·フィジオロジー （AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221- E227, 1987) などの株化細胞を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法において、 レセプ夕一を含有する細胞を用いる場 合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化することができる。 固定化方法は、 公知の方法に従って行うことができる。
上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画分としては、 前記したものと同様の ものを用いることができる。
試験化合物としては、 例えばタンパク質、 非タンパク質性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられ、 これ ら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 本発明のスクリーニング方法において、 プロティナ一ゼと本発明のタンパク質 とのインキュベートは、 通常数時間、 約 3 7 °Cで行なうことができる。 また、 こ の反応混合物とレセプ夕一を含有する細胞との反応は、 通常数時間、 約 3 7 °Cで 行なうことができる。
レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成 、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などの測定は前記と同様にして行なうことができる。 本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質および本発明のタン パク質を分解するプロティナーゼを、 好ましくはさらに、 レセプ夕一を含有する 細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solut ion (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0. 4 5〃mのフィルタ一で濾過滅菌 し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
②レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプ夕一などを含有する C HO細胞を、 1 2穴 プレートに 5 X 1 0 5個ノ穴で継代し、 3 7 、 5 % C〇2、 9 5 % a i rで 2 日間培養したもの。
③本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 ④本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼ標品
本発明のタンパク質を分解するプロテナーゼ
〔測定法〕
①本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明のタンパク質とを約 3 7 °Cで数時間インキュベートする。
②本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼおよび試験化合物と本発明の夕 ンパク質とを約 3 7 °Cで数時間インキュベートする。
③上記①ぉよび②で得られる反応混合物を、 それぞれ本発明のタンパク質に対す るレセプターを含有する細胞と約 3 7 °Cで数時間培養する。
④次いで、 該レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリ ン酸化、 p Hの低下など） 、 鎮痛作用などを前記の方法に従って測定する。 以上のとおり、 本発明のタンパク質は本発明のタンパク質を分解するプロティ ナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするための 試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害し 、 該プロティナーゼによる本発明のタンパク質の失活を抑制する化合物である。 したがって、 該化合物は、 細胞間接触に依存しない本発明のタンパク質による該 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p H の低下など） 、 鎮痛作用などの活性を促進することができ、 例えば鎮痛剤などの 安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記したレセプ夕ーァゴニス 卜/アン夕ゴニストと同様にして実施することができる。
( C) 本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のタンパク質は、 温血動物 （ヒトなどの哺乳動物） の鎮痛ペプチド受容 体 （δ、 κ、 ) (以下、 レセプ夕一と略記する） に特異的に結合することがで きるので、 本発明のタンパク質と該レセプ夕ーを用いたリガンド ·レセプター結 合アツセィ系を構築することによって、 本発明のタンパク質が該レセプ夕一に結 合した後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニングを行なうことができる。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明の タンパク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、 本発明は、
( 1 ) ( i ) レセプターを含有する細胞に、 本発明のタンパク質を接触させた場 合と （i i) レセプタ一を含有する細胞に、 本発明のタンパク質および試験化合物 を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタンパク質とレセ プ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその 塩のクリーニング方法を提供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i) の場合 における、 例えば本発明のタンパク質とレセプターが結合した後の細胞内シダナ ル伝達などを測定して、 比較することを特徴とするものである。
より具体的には、 本発明は、
( l a ) ( i ) 本発明のタンパク質を、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させた 場合と、 （i i) 本発明のタンパク質および試験化合物を、 レセプターを含有する 細胞に接触させた場合における、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァ ラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c A M P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） を測定し、 比較することを特徴と する本発明のタンパク質とレセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記 （l a ) のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質とレセプタ —との結合を阻害せず、 本発明の夕ンパク質による該レセプタ一を介する細胞刺 激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度 の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など） を促進する化 合物を、 本発明のタンパク質とレセプタ一との結合後の細胞内シグナル伝達を促 進する化合物またはその塩として選択することができる。 一方、 本発明のタンパ ク質とレセプターとの結合を阻害せず、 本発明のタンパク質による該レセプター を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト一 ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの低下など ) を阻害する作用を有する化合物を、 本発明のタンパク質とレセプ夕一との結合 後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物またはその塩として選択することがで さる。
すなわち、 本スクリーニング方法は、 本発明のタンパク質とレセプターとの結 合に影響を与えず、 レセプター結合後の細胞内シグナル伝達を調節 （促進または 抑制） する化合物を選択する方法であるので、 本スクリーニング方法に用いる試 験化合物としては、 前記したレセプ夕ーァゴニス卜/アンタゴニス卜のスクリー ニング方法において、 レセプ夕一ァゴニス卜またはアンタゴニストとして選択さ れなかった化合物を用いるのが望ましい。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプターとしては、 温血動物 （ヒ トなどの哺乳動物） の鎮痛ペプチド受容体 （δ、 κ、 n ) などが用いられる。 本発明のタンパク質に対するレセプ夕一は、 公知のタンパク質の精製方法に従 つて入手することができ、 また、 公知の遺伝子工学的手法に従って該レセプター をコードする D NAをクローニングした後、 前記した本発明の夕ンパク質の発現 方法に従って目的とするレセプ夕一を入手することもできる。
該レセプ夕一の部分ペプチドとしては、 全長レセプ夕一を適当に切断して得ら れる部分ペプチドを用いることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプ夕一を含有する細胞とし ては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞として列 記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C HO細胞などが 好ましい。 レセプ夕一を含有する細胞は、 レセプ夕一をコードする D NAを用い て、 公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク質の発現方法などに従って 製造することができる。 また、 上記レセプ夕一を含有する細胞として、 C L 8細 胞株 （ポ一ン （BONE) ， 18, 159-169, 1996) 、 O K細胞株 （アメリカン ·ジャ ーナル ·ォブ ·フィジオロジー （AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221- E227, 1987) などの株化細胞を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法において、 レセプ夕一を含有する細胞を用いる場 合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化することができる。 固定化方法は、 公知の方法に従って行うことができる。
上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画分としては、 前記と同様のものが用 いられる。
試験化合物としては、 例えば、 タンパク質、 非タンパク質性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられ、 こ れら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質とレセプターを含 有する細胞との反応は、 通常約 3 7でで数時間行なうことができる。
上記 （l a ) のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質による該レ セプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 p Hの 低下など） の測定は前記と同様にして行なうことができる。
上記 （l a ) のスクリーニング方法において、 試験化合物を添加した際に、 本 発明のタンパク質によるレセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成 、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タン パク質のリン酸化、 p Hの低下など） が促進された場合、 該試験化合物をレセプ ター結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩として選択する ことができる。 一方、 試験化合物を添加した際に、 本発明のタンパク質によるレ セプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 C a2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの 低下など） が阻害された場合、 該試験化合物をレセプ夕一結合後の細胞内シグナ ル伝達を促進する化合物またはその塩化合物として選択することができる。 本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質を、 好ましくはさら に、 レセプターを含有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものがあげられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 のフィルタ一で濾過滅菌 し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
②レセプ夕ー標品
本発明のタンパク質に対するレセプターを含有する CHO細胞を、 12穴プレ 一卜に 5 X 105個/穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95% a i rで 2日間 培養したもの。
③本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩
〔測定法〕
細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 Ca 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 PHの低下など） を前 記の方法に従って測定する。
以上のとおり、 本発明のタンパク質はレセプ夕一結合後の細胞内シグナル伝達 を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための試薬とし て有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質とレセプ夕一が結合した後のレセプ 夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 pHの低下 など） を促進する化合物またはその塩、 あるいは該細胞刺激活性を阻害する化合 物またはその塩である。
本発明のタンパク質とレセプ夕一が結合した後の細胞内シグナル伝達を促進す る化合物またはその塩は、 例えば、 鎮痛剤などの安全で低毒性な医薬として有用 である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記したレセプタ一ァゴニス ト/アンタゴニストと同様にして実施することができる。
(4) アンチセンス DNA
本発明のタンパク質をコードする DNAまたは mRNAに相補的に結合し、 該
D NAもしくは mRNAや本発明のタンパク質の発現を抑制することができるァ ンチセンス DN Aは、 生体内において上記の作用を発揮する本発明のタンパク質 またはそれをコードする D N Aの機能を抑制することができる。
該アンチセンス DNAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記した本 発明のタンパク質または DNAを含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同様にして 実施することができる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。
(5) DNA導入動物の作製
さらに本発明は、 本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の外 来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNAと略 記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、 (3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えべクタ一、 および
(5) 第 （4) 記載の組換えべクタ一を含有してなる遺伝子治療用医薬などを提 供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA導入動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする本発明の外来性 DNAを導入することによって 作出することができる。 また、 該 DNA導入方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを導入し、 細胞培養、 組織培養 などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞 融合法により融合させることにより本発明の D N A導入動物を作出することもで きる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモッ卜、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57 BL/6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 1系統， BDF 1 系統， B6D 2 F 1系統， BALB/c系統， I CR系統など） またはラット （ 例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ卜哺乳動物の他にヒ卜などがあげられる。
本発明の外来性 D N Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いつたん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の D N Aをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた D NAなどが用いられ、 また、 異常 D NAも含まれる。
該異常 D NAとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる D NAを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る D NAなどが用いられる。
本発明の外来性 D NAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に導入させるにあた つては、 該 D NAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを導入させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト D N Aを結合した D NAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の D N Aを高発現する D N A導入哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の D NA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス （例 、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cゥ ィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する D NAのプロモー夕一 、 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット 、 マウスなど） および鳥類 （ニヮトリなど） 由来のものとしては、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 エンド セリン、 筋クレアチンキナ一ゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S 一トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l， 1^ 1 0ぉょび 14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナー ゼ ]3 Iサブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファターゼ 、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na, K-A TP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （T PO) 、 ポリペプチド鎖延長因子 1 o; (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび /3 ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブ リン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド P コンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン (：、 平滑筋 ァクチン、 プレブロェ ンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられるが、 好まし くは全身で高発現することが可能なサイ卜メガロウィルスプロモータ一、 ヒトポ リペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 α) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモーターなどを用いることができる。
上記べクタ一は、 DNA導入哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Αの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来、 各種哺乳動物および鳥類由来の各 DN Aの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ一 などが用いられる。
その他、 目的 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプライシングシ グナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部などをプロモーター 領域の 5 '上流、 プロモ一夕一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 '下流に 連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ卜、 マウス、 ヒ卜など） 由来の DNA および市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DN Aの全てあるいは一 部として、 または各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハ ムスター、 ラット、 マウス、 ヒトなど） 由来の RNAより公知の方法により調製 された cDNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNA は、 上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変 異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は D N A導入動物において発現しうる DNAコンストラクトとして 、 前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる 通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の DN Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽細胞お よび体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA導入後の作出動物の胚 芽細胞において、 本発明の DNAが存在することは、 作出動物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の D N Aを保持することを意味する
DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべて に本発明の DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DNAを導入させた非ヒト哺乳動物は、 交配により DNA を安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環境で継 代飼育することが出来る。 受精卵細胞段階における本発明の DN Aの導入により 、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の DN Aが過剰に存在す るように確保される。 DNA導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の DN Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の 全てに本発明の DNAを過剰に有することを意味する。 DNAを受け継いだこの 種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の DN Aを過剰に有 する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この 雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明の夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DNA転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により D N Aを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼育環境で継 代飼育することが出来る。 さらに、 目的 DNAを前述のプラスミドに組み込んで 原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコンストラクトは、 通 常の D N A工学的手法によって作製することができる。 受精卵細胞段階における 本発明の異常 DNAの導入は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存 在するように確保される。 D NA導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の 異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D NAを有することを意味する。 D NAを受け継いだこの 種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有 する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この 雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継 代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D NA導入動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D NAを導入させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の D NA導入動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A導入哺乳動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析する 、 または D NAにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本発 明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性に ついての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
⑤本発明の変異夕ンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA導入動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることが でき、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳 細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二 次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA導入動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素処理により、 遊離した D NA導入細胞を取得し、 その培 養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 そ れらの異常を調べることなどができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明の ための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA導入動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の D N A導入動物ま たは本発明の外来性 D N A発現べクタ一を用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。 (6) ノックアウト動物の作出
さらに、 本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 および本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞、
(2) レポ一ター遺伝子として大腸菌由来の 3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子を有す る細胞である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) レポーター遺伝子が本発明のタンパク質のプロモーターの制御下で発現し うる第 （6) 項記載の動物、
(8) レポーター遺伝子が大腸菌由来 ]3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子である第 （7 ) 項記載の動物、
(9) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の動物、
(10) ゲッ歯動物がマウスである第 （9) 項記載の動物、 および
(11) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明のタンパク質のプロモータ一活性を促進す る化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の D N Aに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックァゥト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l ac Z (]3—ガラクトシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポ一夕一遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 （ 例えば、 polyA付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセンジャー RN Aを合 成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA 配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する） を、 例え ば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発 明の DNA上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダ ィゼ一シヨン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッ ティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列を プライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別 することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の E V an sと Kau f ma nの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば 、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されて いるが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的 に遺伝的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BLZ 6マウスや C 57 BL/ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善し た BDF 1マウス （C 57 BL/6と DBAZ2との F 1) を用いて樹立したも のなども良好に用いうる。 BDF 1マウスは、 採卵数力 ί多く、 力つ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C 57 BL/ 6マウスを背景に持つので、 これを用い て得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BL/6マウス とバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えること が可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィ一ダ一細胞上で L I F (1-1000 0 U/m 1 ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空 気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 で培養するなどの方 法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0. 001 一 0. 5 %トリプシン Z 0. 1— 5 mM ED T A、 好ましくは約 0. 1 %トリプシ ン /ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞 上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なう が、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその. 培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufni an, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシ一デ イングス 'ォブ'ナショナル 'ァカデ、ミ一 'ォブ 'サイエンス 'ユーエスエー （ Pro Natl. Acad. Sci. USA) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら 、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジー 'アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフ ォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本 発明の DNA発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生 物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知の方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別す ることが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕ーゲッティングベクターの本発明の DNAが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DNAを ノックアウトさせることができる。
本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析またはター ゲッティングベクタ一上の DNA配列と、 夕ーゲッティングベクタ一に使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ卜哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D NA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D NA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D NAの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NAを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1、 ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一卜およびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発明の夕 ンパク質発現不全マウスは、 本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物 活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾 病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用で ある。
また、 本発明のタンパク質の構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換された本発 明のタンパク質発現動物では、 レポーター遺伝子が本発明のタンパク質のプロモ —ターの支配下に存在するので、 レポ一ター遺伝子がコードする物質の発現をト レースすることにより、 本発明の夕ンパク質のプロモーターの活性を検出するこ とができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする D NA領域の一部を大腸 菌由来の) 3—ガラクトシダーゼ遺伝子 ( 1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明のタンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに 3—ガラ クトシダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4—クロ口— 3—イン ドリル一 i3—ガラク卜ビラノシド （X— g a l ) のような j3—ガラクトシダーゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動 物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタン パク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 ダル べッコリン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D T A/ P B S溶液で洗浄することによって、 ]3—ガラクトシダーゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする m
R NAを検出してもよい。
このような本発明のタンパク質発現不全動物は、 本発明のタンパク質のプロモ 一夕 を活性化または不活化する物質をスクリーニングする上で極めて有用であ り、 本発明のタンパク質発現不全に起因する各種疾患の原因究明または治療薬の 開発に大きく貢献することができる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C - I U B Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA デォキシリポ核酸
cDNA 相補 デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SD S ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Le u ロイシン
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸 L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) 力ルポキサミド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
To s ： p -トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1
C 12— B z 1 2, 6ージクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1— Z 2一クロ口べンジルォキシカルボニル
B r - Z 2一プロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—プ卜キシカルポニル
DNP ジニトロフエノール
T r t 卜 Uチル Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9一フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ·· 1—ヒドロキシベンズ卜リァゾール
HOOB t ： 3， 4ージヒドロー 3—ヒドロキシ一 4ーォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン -2, 3-ジカルポキシイミド
DCC ： N, N' —ジシクロへキシルカルポジイミド - 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
後述の実施例 1で用いられたプライマ一 OP Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー 0 P Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
Ge nB an k受託番号 AC 002107に記載の塩基配列を示す。
実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia col i) JM1 09/pTAOPI5は、 財団法人発酵研究所 （I FO) に 2000年 7月 4日から寄託番 号 I FO 16451として、 茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一 （旧 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) に 2000年 7月 17日から寄託 番号 FERM BP— 7229として、 寄託されている。 実施例
以下に、 実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれに 限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキユラ 一 'クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 ヒ卜精巣 c DNA画分からの P C R法による新規鎮痛ぺプチド前駆体 cDNAの取得
クローンテック社より購入したヒト精巣 cDNAを铸型として、 以下の 2種類 の合成 DN Aを用いて、 PCRによる増幅を行った。
' 0PF： 5 ' -CTCAGTGGCTGAAGGCACATGCGTCAC-3 ' (配列番号： 3 )
0PR： 5 ' -GGGAGGCTTAGGCTTGGCTCATTTGAA-3 ' (配列番号： 4 )
PCRの反応液は cDNA溶液 2 1、 0.5^ 1 0PF (10 n ) 、 0. 5 1 OP R (10 βΜ) 、 2· 5 1添付の 10 x反応液、 2.5 1 dNTP (lOni) 、 0.5 1 Klen Ta (クローンテック社） 、 16.5 1 蒸留水を加えて合計 25 1にした。 反応液を Thermal Cycler 9600を用いて P C R反応にかけた。 PCRの条件は 9 5°C · 2分の変性の後、 98°C · 10秒、 65T · 20秒、 72°C · 20秒のサ イクルを 38回繰り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 250 b p の PCR産物の増幅を確認した後、 PCR産物を Qiagen PCR purification Kit を用いて精製し、 直接配列決定を行ったところ図 1で示す配列が得られた （配列 番号： 2) 。 図 1の DNA配列から予測されるアミノ酸配列は図 2に示すもので あった （配列番号： 1) 。 得られた配列を既知の配列と比較したところ、 下垂体 由来の鎮痛ぺプチドで高い保存性を示すアミノ酸配列、 Ty r— G l y_G l y — Ph e— L e uを見出した （図 3) 。 また、 得られた D NAを調製し T Aクロ 一ニングキッ卜 (インビトロゲン社） をもちいて p CR 2ベクタ一に導入し、 大 腸菌 J M109を形質転換して E. coii JM109/pTA0PI5を得た。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質およびそれをコードする DNAは、 鎮痛剤などの医薬とし て有用である。 また、 本発明のタンパク質およびそれをコードする DNAは、 本 発明のタンパク質の活性を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスクリー ニングのための試薬として有用である。 さらに、 本発明のタンパク質に対する抗 体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本 発明のタンパク質の検出、 定量、 中和等に使用することができる。

Claims

請求の範囲
I. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2. 請求項 1記載のタンパク質の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩。
3. 請求項 1記載のタンパク質または請求項 2記載の部分ペプチドをコードする 塩基配列を有する DNAを含有する DNA。 但し、 配列番号： 5で表される塩基 配列を有する DN Aを除く。 '
4. 配列番^: 2で表わされる塩基配列を有する請求項 3記載の DNA。
5. 請求項 4記載の DNAを含有する組換えベクター。
6. 請求項 5記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
7. 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質または請求 項 2記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造方法。
8. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分ぺプ チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬
9. 請求項 3記載の DNAを含有してなる医薬。
10. 鎮痛作用を有する請求項 8または 9記載の医薬。
I I. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分べ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
12. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分べ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特 徵とするレセプターァゴニス卜またはアン夕ゴニス卜のスクリーニング方法。
13. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分べ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有するレセプ ターァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キッ卜。
14. 請求項 12記載のスクリーニング方法または請求項 13記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られるレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニスト。
15. 請求項 14記載のレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニストを含有して なる医薬。
16. 鎮痛作用を有する請求項 15記載の医薬。
17. 請求項 14記載のレセプ夕ーァゴニス卜の有効量を哺乳動物に投与するこ とを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法。
18. 鎮痛剤を製造するための請求項 14記載のレセプ夕一ァゴニス卜の使用。
19. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 または請求項 2記載の部分べ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の有効量を哺乳動 物に投与することを特徴とする哺乳動物の鎮痛方法。
20. 鎮痛剤を製造するための請求項 1記載のタンパク質もしくはその塩、 また は請求項 2記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩の使用。
21. 請求項 3記載の DNAの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする哺 乳動物の鎮痛方法。
22. 鎮痛剤を製造するための請求項 3記載の DN Aの使用。
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MADELEINE COCHET ET AL.: "Characterization of the structual gene and putative 5'-regulatory sequences for human proopiomelanocortin", NATURE, vol. 297, 1982, pages 335 - 339, XP002947244 *
MASAHURA NODA ET AL.: "Isolation and structual organization of the human preproenkaphalin gene", NATURE, vol. 297, 1982, pages 431 - 434, XP002947245 *
SABURO HORIKAWA ET AL.: "Isolation and structual organization of the human preproenkaphalin B gene", NATURE, vol. 306, 1983, pages 611 - 614, XP002947246 *
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