WO2001038517A1 - Gene exprimant une proteine capable de capturer un metal - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a gene capable of expressing a protein capable of capturing metal on the cell surface, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the vector, and uses of the transformant.
- a gene capable of expressing a protein capable of capturing metal on the cell surface a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the vector, and uses of the transformant.
- Industrial effluents generated from factories and the like contain heavy metals that are toxic to ecosystems, and if drained as it is, would cause environmental pollution. It is necessary to remove these before discharging to rivers. On the other hand, these industrial effluents may also contain many useful heavy metals, so that resources can be used effectively without disposal.
- the present invention provides a gene capable of expressing a protein capable of capturing a metal on a cell surface, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the vector, and a use of the transformant. With the goal.
- the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, constructed a fusion gene containing DNA encoding a polypeptide having a metal-capturing ability, and introduced this into a host to produce a fusion gene. We succeeded in producing a host capable of capturing and completed the present invention.
- the present invention is a fusion gene containing a DNA encoding a secretory signal peptide, a polypeptide having a metal capturing ability, and a DNA encoding a cell surface localization protein.
- a DNA encoding a secretory signal peptide for example, one containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
- examples of a DNA encoding a secretory signal peptide include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a polypeptide having metal-capturing ability (eg,
- the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and includes a cell surface localization protein (for example, an amino acid represented by SEQ ID NO: 6).
- the DNA encoding the amino acid sequence (containing the amino acid sequence) contains a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
- the fusion gene includes a gene containing the nucleot
- the present invention is a recombinant vector containing the above gene.
- the present invention is a transformant containing the above-mentioned recombinant vector.
- the transformant include a transformed yeast, a transformed animal cell, a transformed plant cell, a transformed slime mold and a transformed insect cell.
- the present invention is an environmental purification agent or a metal recovery agent containing the transformant. Furthermore, the present invention is a column packed with the transformant or an environmental purification device including the column.
- the present invention is a method for recovering a metal, comprising adding the transformant to an environmental substance contaminated with a metal, and treating the transformant after the addition with a chelating agent.
- the fusion gene of the present invention contains a secretory signal peptide, a polypeptide having a metal-capturing ability, and a DNA encoding a cell surface-localized protein, and a polypeptide having a metal-capturing ability is added to the cell surface. It is a gene that can be expressed.
- the secretory signal sequence include a prebub leader sequence of an eukaryotic factor-one precursor (SEQ ID NO: 2), a signal sequence of yeast o- or a-agglutinin, and a glucoamylase secretion signal.
- SEQ ID NO: 2 an eukaryotic factor-one precursor
- yeast o- or a-agglutinin a signal sequence of yeast o- or a-agglutinin
- glucoamylase secretion signal glucoamylase secretion signal.
- the DNA (SEQ ID NO: 1) encoding the prebub leader sequence of ⁇ -factor precursor preferable.
- the DNA is prepared by designing a primer based on the sequence obtained from the yeast database, and amplifying it by PCR using yeast genomic DNA as type II.
- the cell surface localization protein refers to a protein immobilized on the cell surface of a host into which the fusion gene of the present invention is introduced and present on the cell surface.
- the cell surface is defined as the interior of the host's outermost membrane (eg, cell wall, cell membrane, etc.), the interface between the outermost layer of the cell membrane and the outside world, and the region protruding from the outermost layer of the cell via a linker or anchor. Means both.
- Proteins localized on the cell surface include proteins such as flocculin, agglutinin, and lipoproteins, as well as a group of proteins called CWP.Aggregative cell indirect, which is the most functionally analyzed in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Agglutinin, a landing molecule, is preferred. Agglutinin is inducibly expressed when cells join together. This protein is known to be ⁇ -agglutinin expressed in ⁇ -mating cells and a-agglutinin expressed in a-mating cells, both of which bind to the cell wall and protrude from the outermost layer of the cell. ing. And cell-cell adhesion occurs through these two molecules.
- ⁇ -agglutinin is a protein encoded by the AGal gene
- a-agglutinin is a disulfide bond between the core portion encoded by the AGA1 gene and the small subunit encoded by the AGA2 gene. It is a complex protein.
- Both the hyaglutinin and the core of a-agglutinin contain a hydrophobic region called GPI (glycosylphosphatidylinositol) anchor attachment signal sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence constituting agglutinin. ( Figure 3).
- the GPI anchor signal sequence is a sequence recognized by the GPI anchor (usually a sequence located at or near the C-terminus of the protein located at the cell surface), and the GPI anchor signal sequence is cleaved by the recognition. Then, the cell surface localized protein binds to the GPI anchor.
- the DNA encoding the cell surface localization protein is preferably a DNA encoding a protein (eg, sph- or a-agglutinin) displayed on the cell surface of yeast (mainly the C-terminal half). DNA encoding the region).
- a protein eg, sph- or a-agglutinin
- DNA encoding the region.
- the amino acid sequence from the 331st to the 650th amino acid (FIG. 3, SEQ ID NO: 6), that is, the sequence of 320 amino acids from the C-terminal, is DNA (SEQ ID NO: 5) is used. There are four sugar chain binding sites in this 320 amino acid sequence.
- the DNA is then synthesized by chemical synthesis, by PCR using the constructed gene as type III, or by hybridization using a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe.
- the gene of the invention can be obtained.
- a modified DNA encoding the above protein or peptide for example, a DNA modified to another codon (degenerate codon) encoding the same amino acid can also be synthesized by site-directed mutagenesis or the like.
- a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method similar thereto can be employed.
- a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis for example, Mutant K (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)
- TAKARA Mutations are introduced using the LA PCR invio Mutagenes is series kit.
- the recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating (inserting) the gene of the present invention into an appropriate vector.
- the vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
- Examples of the plasmid DNA include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, PUC118, pUC119, pUC18, pl) C19) and Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUBllO, pTP5). And yeast-derived plasmids (eg, pYE22m, pYGA2270, YEl3, YEp24, YCp50, etc.).
- Examples of the phage DNA include: phage (Charon4A, Charon2 1A, EMBL3, EMBL4, AgtlO, Agtl K ⁇ ZAP etc.).
- animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vectors such as baculovirus, and Ti plasmid can also be used.
- the vector of the present invention includes an operator, a promoter, a promoter, a fusion gene of the present invention, and, if desired, a cis-element, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and a ribosome binding sequence.
- SD sequence can be linked.
- GAPDH glycosylase dehydrogenase
- GAPDH terminator can be ligated to the vector.
- selection markers include yeast selection markers (eg, TRP, LEU2, etc.) and Escherichia coli selection markers (drug resistance genes such as dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, and neomycin resistance gene).
- yeast selection markers eg, TRP, LEU2, etc.
- Escherichia coli selection markers drug resistance genes such as dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, and neomycin resistance gene.
- the method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria.
- a method using calcium ions Cohen, S. N. et al .: Pro Natl. Acad. ScI., USA, 69: 2110 (1972)
- an electro-volatilization method and the like can be mentioned.
- the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast, and examples thereof include GAPDH promoter, gal promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, and MF al promoter. , A PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, an A0X1 promoter, and the like.
- Physarum polycepha lum and the like are used.
- Examples of a method for introducing a recombinant vector into slime mold include an electroporation method.
- the plant, plant organ, or plant tissue itself may be used as it is, may be used after preparing a section, or may be used after preparing a protoplast. Good.
- the sample thus prepared can be processed using a gene transfer device (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
- the treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
- Whether or not the gene has been integrated into the host can be confirmed by a PCR method, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, or the like. For example, prepare DNA from transformants, design an MA-specific primer, and perform PCR. PCR can be performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid. After that, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis, stained with bromide TC, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a single band. You can confirm that it has been converted.
- amplification products can be detected by performing PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like. Further, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and confirming the amplification product by fluorescence or enzyme reaction can also be adopted.
- the transformant of the present invention is preferably immobilized on a carrier because it can be used repeatedly in a continuous reaction or batch culture.
- “Carrier” means a substance capable of immobilizing the transformant of the present invention (eg, a transformed yeast), and preferably It means a substance that is insoluble in water or a specific solvent.
- foams or resins such as polyvinyl alcohol, polyurethane foam, polystyrene foam, polyacrylamide, polyvinyl formal resin porous body, silicon foam, cellulose porous body and the like can be mentioned.
- the carrier is preferably a porous carrier in that it is advantageous for maintaining the growth and activity of the transformant, and quickly removes dead cells.
- the yeast When a flocculant yeast is used as a host for transformation, the yeast can grow even though it is immobilized on a carrier, and has the property of dropping off naturally when its activity decreases. For this reason, the yeast bound to the carrier is characterized in that the viable cell count is kept almost constant and the activity is high. Accordingly, the binding of the yeast to the carrier is most preferably physical adsorption.
- the binding of the yeast to the carrier is most preferably physical adsorption.
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Description
明 細 金属捕捉能タンパク質を発現する遺伝子 技術分野
本発明は、 細胞表層に金属を捕捉することができる夕ンパク質を発現すること ができる遺伝子、該遺伝子を含む組換えべクタ一、 該ベクターを含む形質転換体、 及び該形質転換体の用途に関する。 背景技術
工場などから発生する産業廃液中には、 生態系に対し有毒な重金属が含まれて おり、 そのまま排水すると環境汚染をもたらすため、 河川等に排出する前にこれ を除去することが必要である。 その一方、 これらの産業廃液中には、 多くの有用 な重金属も含まれている場合もあるため、 廃棄せずに資源の有効利用することが 可能である。
従来より、 微生物、 藻類の中には、 特定の重金属を蓄積する能力を有するもの が存在するため、 これを利用して廃液中の重金属を回収することも試みられ、 植 物バイオマス、 カビ、 クロレラなどを用いた方法が提案されている (特開平 1卜 221460号公報、 特開平 9-108568号公報及び特開平 6-238162号公報)。
しかしながら、 これらの微生物に吸着された重金属は、 回収の際に容易に沈降 しないため、 回収が困難であり必ずしも満足できるものではない。 しかも、 微生 物細胞内部に重金属が取り込まれると、通常は微生物自身に対し毒性となるため、 重金属の高濃度存在下では生育できない。 従って、 高濃度重金属溶液に対しては 上記微生物で処理することができない。 発明の開示
本発明は、 細胞表層に金属を捕捉することができるタンパク質を発現すること ができる遺伝子、 該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体、 及び該形質転換体の用途を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 金属捕捉能を有 するポリべプチドをコ一ドする DNAを含む融合遺伝子を構築し、 これを宿主に導 入して金属捕捉能を有する宿主を作製することに成功し、 本発明を完成するに至 つた。
すなわち、 本発明は、 分泌シグナルペプチド、 金属捕捉能を有するポリべプチ ド及び細胞表層局在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含む融合遺伝子であ る。 分泌シグナルペプチド (例えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むも の) をコードする DNAとしては配列番号 1で表される塩基配列を含むものが挙げ られ、 金属捕捉能を有するポリペプチド (例えば配列番号 4で表されるアミノ酸 配列を含むもの) をコードする DNAとしては配列番号 3で表される塩基配列を含 むものが挙げられ、 細胞表層局在タンパク質 (例えば配列番号 6で表されるアミ ノ酸配列を含むもの) をコードする DNAとしては配列番号 5で表される塩基配列 を含むものが挙げられる。 具体的には、 上記融合遺伝子として配列番号 7で表さ れる塩基配列を含むものが挙げられる。
さらに、 本発明は、 上記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、 本発明は、 上記組換えベクターを含む形質転換体である。 形質転換体 としては、 形質転換酵母、 形質転換動物細胞、 形質転換植物細胞、 形質転換粘菌 又は形質転換昆虫細胞が挙げられる。
さらに、 本発明は、 上記形質転換体を含む環境浄化剤又は金属回収剤である。 さらに、 本発明は、 上記形質転換体が充填されたカラム又は該カラムを含む環 境浄化装置である。
さらに、 本発明は、 金属により汚染された環境物質に、 上記形質転換体を添加 することを特徴とする環境浄化方法、 又は金属により汚染された環境物質を、 上 記カラム若しくは装置で処理することを特徴とする環境浄化方法である。
さらに、本発明は、 金属により汚染された環境物質に上記形質転換体を添加し、 添加後の形質転換体をキレート剤で処理することを特徴とする金属の回収方法で ある。
上記環境物質としては、 例えば海水若しくは淡水、 廃水、 排ガス又は土壌が挙 げられ、 キレー卜剤としてはエチレンジアミンテトラ酢酸が挙げられる。
以下、 本発明を詳細に説明する。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本 国特許出願平成 1 1年第 330226号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含 する。 本発明の融合遺伝子は、 分泌シグナルペプチド、 金属捕捉能を有するポリぺプ チド、 細胞表層局在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含むものであり、 金 属捕捉能を有するポリべプチドを細胞表層に発現し得る遺伝子である。
本発明者は、 細胞表層、 すなわち細胞膜や細胞壁に着目して、 これらの領域に 輸送局在化するタンパク質のアドレスとなる情報の利用 (細胞表層工学) を考え た。 細胞表層工学 (Ce l l Sur f ace Engineer i ng) とは、 細胞表層に輸送局在化さ れるタンパク質の分子情報を活用して、 外来タンパク質を細胞膜の外側や細胞壁 に夕ーゲッティングさせ、 細胞表層へ新機能を付与する操作を意味する (図 1 )。 本発明は、 細胞表層にタンパク質を輸送させる分泌シグナル配列、 金属捕捉能 を有するポリペプチド (金属捕捉能タンパク質ともいう) 及び細胞表層局在タン パク質を同一の遺伝子上にコードする融合遺伝子を構築し (図 2 )、 該融合遺伝子 を宿主に発現させることにより、 宿主の細胞表層に金属捕捉機能を付与すること としたものである (図 1;)。
1 . 本発明の融合遺伝子の構築
( 1)分泌シグナルペプチド
分泌シグナルペプチド (分泌シグナル又は分泌シグナル配列ともいう) は、 一 般に細胞外 (ペリブラズムも含む) に分泌されるタンパク質 (分泌性タンパク質) の N-末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むぺプチドであり、 通常、 分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に 除去される。
本発明においては、 金属捕捉能タンパク質を酵母の細胞外に移動及び発現させ ることができる分泌シグナルであれば、 特に限定されるものではない。 例えば、 分泌シグナル配列としては、 ひ -ファクタ一前駆体のプレブ口リーダー配列(配列 番号 2 )、酵母のひ -又は a -ァグルチニンのシグナル配列、 グルコアミラーゼの分 泌シグナル等が挙げられる。なお、 金属捕捉能タンパク質の活性を保持する限り、
分泌シグナルの一部または全部が金属捕捉能タンパク質の N-末端に残ってもよ レ^本発明においては、 α -ファクター前駆体のプレブ口リーダ一配列をコードす る DNA (配列番号 1 ) が好ましい。 該 DNAは、 酵母のデ一夕ベースから入手した 配列をもとにしてプライマ一を設計し、 酵母ゲノム DNAを銬型とする PCRで増幅 することによって調製される。
(2)金属捕捉能を有するポリぺプチド
本発明において、 金属捕捉能とは、 ポリペプチド自身が金属分子を吸着又は捕 獲させる機能を意味する。 捕捉とは、 化学的結合 (共有結合、 イオン結合等) に よるもの及び物理的吸着によるもののいずれをも意味する。 このような機能を有 するペプチド配列は (H i s) 6ηで表されるものが挙げられる。 ここで、 η は特に限 定されるものではなく任意に設定することができる。 η= 1 (すなわち 6個の H i s (配 列番号 4) ) でも十分である。 H i sは、 「CAT」 又は 「CAC」 によりコードされるため、 いずれかのコドンを選択して DNA 配列を任意に設計し合成することができる(例 えば配列番号 3 )。 その際、 ベクターとの連結が可能となるように、 適当な制限酵 素部位を有する配列を設計しておくことが好ましい。 なお、 合成は、 通常の化学 合成により行われる。
(3)細胞表層局在タンパク質
細胞表層局在タンパク質は、 本発明の融合遺伝子を導入する宿主の細胞表層に 固定され、 細胞表層に存在するタンパク質をいう。 細胞表層とは、 宿主の最も外 側の膜 (例えば細胞壁、 細胞膜等) の内部、 細胞膜の最外層と外界との境界面、 及び細胞の最外層からリンカ一又はアンカ一を介して突き出た領域のいずれをも 意味する。
細胞表層局在タンパク質としては、 フロキュリン、 ァグルチニン、 リポプロテ イン等のタンパク質のほか、 CWP と呼ばれるタンパク質群が挙げられるが、 酵母 サッカロミセス ·セレピシェ Uscctiiiromycss cere visiae) で最も機能解析が進 んでいる凝集性細胞間接着分子であるァグルチニンが好ましい。ァグルチニンは、 細胞同士が接合するときに誘導発現するものである。 このタンパク質には α接合 型細胞で発現する α -ァグルチニン及び a接合型細胞で発現する a-ァグルチニン が知られており、 いずれも細胞壁に結合して活性部位が細胞の最外層から突き出
ている。 そして、 この 2つの分子を介して細胞間接着が起こる。
α -ァグルチニンは、 AG a l遺伝子にコードされるタンパク質であり、 a-ァグル チニンは、 AGA1遺伝子にコードされるコア部分と AGA2遺伝子にコードされる小 サブユニットとがジスルフイ ド結合を介して連結した複合体タンパク質である。 ひ-ァグルチニンと、 a-ァグルチニンのコア部分とは、 それぞれともに GPI (グ リコシルフォスファチジルイノシトール) アンカー付着シグナル配列と呼ばれる 疎水性領域が、 ァグルチニンを構成するアミノ酸配列の C末端側に含まれている (図 3 )。 GPIアンカ一シグナル配列とは、 GPIアンカ一によって認識される配列 (通常、細胞表層局在夕ンパク質の C末端又はその近傍に位置する配列)であり、 その認識により GPIアンカ一シグナル配列が切断されて、 細胞表層局在タンパク 質は GPIアンカ一と結合する。
本発明において、 細胞表層局在タンパク質をコードする DNAとしては、 好まし くは酵母の細胞表面に提示されるタンパク質 (例えばひ -又は a -ァグルチニン) をコードする DNA (主に、 C末端側半分の領域をコードする DNA) が挙げられる。 好適には、 650個のアミノ酸配列を有する α -ァグルチニンのアミノ酸配列のうち、 第 331番目から第 650番目までのアミノ酸 (図 3、 配列番号 6 )、 すなわち C末端 から 320アミノ酸の配列をコ一ドする DNA (配列番号 5 ) が用いられる。 この 320 個のアミノ酸配列中には 4個所の糖鎖結合部位が存在する。 そして、 細胞表層局 在タンパク質と GP Iアンカ一との結合が、 ホスファチジルイノシトール特異的ホ スホリパーゼ C (PI- PLC) と呼ばれる酵素により切断された後に、 α -ァグルチニ ンの糖鎖やダリカン (PI- PLCによって切断された後の付着したまま残された GPI アンカー断片内に存在する) と、 細胞壁を構成する多糖類とが共有結合すること により、 α -ァグルチニンの C末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。
従って、 上記 320アミノ酸領域をコードする DNAは本発明において特に有用で ある。 上記 320個のアミノ酸をコードする DNA (配列番号 5 ) は、 酵母のデ一夕 ベースをもとに作成したプライマーを用いて酵母ゲノムを铸型とする PCRで増幅 することにより得た断片を含むプラスミ ド ΡΥΕ322から得ることができる。但し、 上記 DNAには、 3'側の非翻訳領域が連結されていてもよい。
(4) DNAの連結
上記分泌シグナルペプチドをコードする DNA、 金属捕捉能を有するポリべプチ ドをコードする DNA及び細胞表層局在タンパク質をコードする DNAをそれぞれリ ガーゼで処理して、 融合遺伝子を作製する。 あるいは、 後述の通り (「2 . 組換え ベクターの作製」の項を参照)、 上記各 DNAを 1つのプラスミドに順次連結する方 法を採用してもよい。
(5)塩基配列の決定
上記のようにして構築された融合遺伝子の塩基配列の決定は、マキサム-ギルバ ートの化学修飾法、 又はジデォキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行 うことができる。但し、通常は自動塩基配列決定機を用いて配列決定が行われる。 例えば、 Perkin Elmer社製の蛍光ダイデォキシターミネ一夕一を含有する PRI SM シークェンシングキット等を使って反応を行い、 App l i ed B i osys t em 社製のォー 卜シークェンサ一 (モデル AB I 373)等で塩基配列を決定する。
配列番号 7に本発明の融合遺伝子の塩基配列を例示する。 但し、 本発明の融合 遺伝子は、 上記分泌シグナルペプチド、 金属捕捉能を有するポリペプチド及び細 胞表層局在タンパク質をコードする限り、 配列番号 7に示す塩基配列に限定され るものではない。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定すると、 その後は化学合成によって、 又 は構築された遺伝子を錶型とした PCRによって、あるいは該塩基配列を有する DNA 断片をプローブとしてハイプリダイズさせることによって、 本発明の遺伝子を得 ることができる。 さらに、 部位特異的変異誘発等によって上記タンパク質又はべ プチドをコードする修飾された DNA、 例えば同一のアミノ酸をコードする別のコ ドン (縮重コドン) に改変された DNAを合成することもできる。
なお、 遺伝子に変異を導入するには、 Kunke l法、 Gapped dup l ex法等の公知の 手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。 例えば部位特異的突然変異 誘発法を利用した変異導入用キット (例えば Mu t an卜 K (TAKARA社製) や Mu t an t- G (TAKARA社製))などを用いて、あるいは、 TAKARA社の LA PCR i n v i o Mu t agenes i s シリーズキッ トを用いて変異の導入が行われる。
2 . 組換えべクタ一の作製
本発明の組換えベクターは、 適当なベクターに本発明の遺伝子を連結(挿入)す ることにより得ることができる。 本発明の遺伝子を挿入するためのベクタ一は、 宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、 例えば、 プラスミ ド DNA、 フ ァ一ジ DNA等が挙げられる。
プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド (例えば pBR322, pBR325, PUC 1 18, pUC 1 19, pUC 18, pl)C 19等)、枯草菌由来のプラスミ ド(例えば pUB l l O, pTP5 等)、 酵母由来のプラスミ ド (例えば pYE22m、 pYGA2270 , YE l 3, YEp24, YCp50 等)などが挙げられ、 ファージ DNAとしては; ファージ (Charon4A、 Cha ron2 1A, EMBL3、 EMBL4、 A gt lO, A gt l K λ ZAP 等) が挙げられる。 さらに、 レトロウイ ルス又はワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、 バキュロウィルスなどの昆虫 ウィルスベクター、 さらに T iプラスミ ド等を用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、 まず、 精製された DNAを適当な制 限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニンダサ イ トに挿入してベクタ一に連結する方法などが採用される。
但し、 このような出発材料のプラスミドを適当な制限酵素で処理し、 得られる 制限酵素部位に、 別のプラスミドから得られたシグナル配列をコードする DNA、 金属結合能ポリペプチドをコードする DNA、 及び細胞表層タンパク質をコードす る DNAを順次連結して組換えべクタ一を作製することもできる。 このような操作 を行う場合は、 出発プラスミ ドとして、 例えば pYE22m、 pYGA2270等が挙げられる。 本発明の融合遺伝子は、 その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み 込まれることが必要である。 そこで、 本発明のベクターには、 オペレーター、 プ 口モーター、 夕一ミネ一ター、 本発明の融合遺伝子のほか、 所望によりシスエレ メント、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 リボソ ーム結合配列 (SD配列) などを含有するものを連結することができる。 例えば、 GAPDH (グリセルアルデヒド 3 ' -リン酸デヒドロゲナ一ゼ) プロモー夕一及び 又は GAPDHターミネータ一等をベクターに連結することができる。 なお、 選択マ 一力一としては、 例えば酵母選択マーカ一 (例えば TRP、 LEU2等)、 大腸菌の選択 マーカ一 (ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子、 ネオマイシ ン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子) が挙げられる。
本発明においては、 プラスミド PYGA2270又は pYE2mの GAPDHプロモーターと GAPDHターミネ一ターの配列との間に、 分泌シグナル配列をコードする DNA、金属 捕捉能を有するポリべプチドをコードする DNA、及びひ-ァグルチニンの C末端か ら 320アミノ酸をコードする DNAを挿入することにより本発明の組換えベクター を得ることができる。
3. 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、 本発明の組換えベクターを、 本発明の融合遺伝子が発 現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。 ここで、 宿主と しては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。 例えば、 大腸菌(£s die ' c!iia co J 等のエッシェリヒァ属、 バチルス ·ズブチリ ス、Bacillus subti 1 is)等のバチルス属、 シユードモナス · プチダ iPseudom as put i da)等のシュ一ドモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス ·セレビ シ ェ {Saccharoinyces cerevisiae) 、 シ ゾサ ッ カ ロ ミ セ ス ' ホ ン べ (Scliizosaccl roiwces pombe)等の酵母が挙^られ、 COS細胞、 CH0細胞等の動物 細胞が挙げられ、 Sf9等の昆虫細胞が挙げられ、 Physarum polycephalum等の 菌 が挙げられ、 さらに植物細胞が挙げられる。 なお、 本発明では、 凝集性の酵母を 宿主として用いることも可能である。 凝集性の酵母としては、 サッカロミセス - ジァス夕テイクス Saccharomyces diasiaiicus) ATCC60715, 同 ATCC60712、 サ ッカロミセス 'セレビシェ "3ccl romyc6s cerevisiae) IF01953, 同 CG1945、 同 HF7Cが挙げられる。 「凝集性」 とは、 液体中に浮遊又は分散して存在する酵母 等が、 集合して塊 (集合体) を作る性質を意味する。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、 本発明の組換えベクターが該細菌中で自 律複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボゾーム結合配列、 本発明の遺伝 子、 転写終結配列により構成されていることが好ましい。 また、 プロモーターを 制御する遺伝子が含まれていてもよい。 但し、 本発明において細菌を宿主とする 場合は、 細胞表層局在タンパク質としてリポプロティン等を使用することが好ま しい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒァ*コリ (Escherichia colA DH5 α , Y1090
などが挙げられ、 枯草菌としては、 例えばバチルス · ズブチリス ( C // 5 5 ϋ Λ〃 / / などが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
プロモーターは、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いて もよい。 例えば t rpプロモーター、 l acプロモー夕一、 PLプロモ一夕一、 PRプロ モーターなどの、 大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。 t ac プロモータ—などのように、 人為的に設計改変されたプロモータ一を用いてもよ レ^
細菌への組換えベクターの導入方法は、 細菌に DNAを導入する方法であれば特 に限定されるものではない。 例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S. N. e t al. : Pro Nat l. Acad. Sc i. , USA, 69: 21 10 ( 1972) ) , エレクトロボレ一シ ョン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、 プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特 に限定されず、 例えば GAPDHプロモータ一、 gal lプロモー夕一、 gal 10プロモ一 ター、 ヒートショックタンパク質プロモーター、 MF a lプロモーター、 PH05プロ モー夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 A0X1プロモ 一ター等を用いることができる。
酵母への組換えべクタ一の導入方法は、 酵母に DNAを導入する方法であれば特 に限定されず、 例えばエレクト口ポレーシヨン法(Becker, D. M. e t al. : Methods. Enzymol. , 194 : 182 ( 1990) )、スフエロプラスト法(Hinnen, A. e t al. : Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA, 75: 1929 (1978) )、 酢酸リチウム法(I toh, H. : J. Bac terio l. , 153: 163 (1983) )等が挙げられる。
動物細胞 (原生動物細胞を含む。 以下同じ。) を宿主とする場合は、 サル細胞 COS- 7、 Vero、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 (CH0細胞)、 マウス L細胞、 ラ ット GH3、 ヒ卜 FL細胞などが用いられる。 プロモ一夕一として SR aプロモータ一、 SV40プロモーター、 LTRプロモー夕一、 CMVプロモーター等が用いられ、 また、 ヒトサイ トメガロウィルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。 動物細 胞への組換えベクターの導入方法としては、 例えばエレクトロポレ一ション法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、 Sf9 細胞などが用いられる。 昆虫細胞への組換
えべクタ一の導入方法としては、 例えばリン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン 法、 エレクト口ポレーション法などが挙げられる。
粘菌を宿主とする場合は、 Physarum polycepha lumなどが甩 られる。 粘菌へ の組換えベクターの導入方法としては、 例えばエレクトロポレーシヨン法などが 挙げられる。
宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。 本発明において形質転換の対象となる植物は、 植物体全体、 植物器官(例えば 葉、 花弁、 茎、 根、 種子等)、 植物組織(例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、 維管 束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。 形質転換に用いられる植物としては特に限定されるものではなく、 例えばァカザ 科、 ナス科、 イネ科、 マメ科、 バラ科、 キク科、 ユリ科、 ナデシコ科、 ゥリ科、 ヒルガオ科、 アブラナ科等に属する植物が挙げられる。 その他、 らんそう、 クロ レラ等を宿主として使用することができる。
上記組換えべクタ一は、 通常の形質転換方法、 例えばァグロパクテリゥム法、 パーティクルガン法、 PEG 法、 エレクトロボレ一シヨン法等によって植物中に導 入することができる。
例えばァグロパクテリゥム法を用いる場合は、 構築した植物用発現べクタ一を 適当なァグロパクテリゥム、 例えばァグロパクテリゥム ,チュメファシエンス {Agrobac t erium t umefaciens) LBA4404 株に導入し、 この株をリーフディスク法 (内宮博文著,植物遺伝子操作マニュアル, 1990, 27- 3 1卯,講談社サイェンティフ ィック,東京)等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、 形質転換植物を得るこ とができる。
また、 パーティクルガン法を用いる場合は、 植物体、 植物器官、 植物組織自体 をそのまま使用してもよく、 切片を調製した後に使用してもよく、 プロ卜プラス トを調製して使用してもよい。 このように調製した試料を遺伝子導入装置 (例え ば PDS- 1000 (B I 0-RAD社)等) を用いて処理することができる。 処理条件は植物又 は試料により異なるが、 通常は 450〜2000ps i程度の圧力、 4〜 1 2cm程度の距離で 行う。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、 形質転換は、 組換えベクターをパー
ティクルガン法、 エレクトロポレーシヨン法等で培養細胞に導入する。 形質転換の結果得られるカルス、 腫瘍組織、 シュート、 毛状根などは、 そのま ま細胞培養、 組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、 また従来知られ ている植物組織培養法を用い、 適当な濃度の植物ホルモン (オーキシン、 サイト カイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 エチレン、 ブラシノライド等) の投与な どにより植物体に再生させることができる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、 PCR 法、 サザンハイブリダィゼ —シヨン法、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法等により行うことができる。 例 えば、 形質転換体から DNAを調製し、 MA特異的プライマ一を設計して PCRを行 う。 PCR は、 前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行う ことができる。 その後は、 増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、 ポリアク リルアミドゲル電気泳動又はキヤピラリー電気泳動等を行い、 臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、 そして増幅産物を 1本のバンドとして検出するこ とにより、 形質転換されたことを確認することができる。 また、 予め蛍光色素等 により標識したプライマ一を用いて PCRを行い、 増幅産物を検出することもでき る。 さらに、 マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、 蛍光又は酵素反 応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
遺伝子は、 プラスミドの形態で導入してもよく、 宿主の遺伝子に挿入すること により導入してもよく、 宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込ま れてもよい。
上記形質転換体を、 プロモーターを活性化させる条件で培養又は栽培すると、 その細胞表層に金属捕捉能タンパク質が発現される。 なお、 金属捕捉能タンパク 質が細胞表層に固定されていることの確認は、 該夕ンパク質に対する抗体及び FITC標識抗体を用いる免疫抗体法で行うことができる。
4 . 本発明の形質転換体を充填したカラム、 及び該カラムを含む装置
本発明の形質転換体は、 連続反応又は回分式培養において繰り返し使用できる 点で担体に固定化されていることが好ましい。 「担体」 とは、本発明の形質転換体 (例えば形質転換酵母) を固定化することができる物質を意味し、 好ましくは、
水又は特定の溶媒に対して不溶性の物質を意味する。 例えば、 ポリビニルアルコ ール、 ポリウレタンフォーム、 ポリスチレンフォーム、 ポリアクリルアミド、 ポ リビニルフォルマール樹脂多孔質体、 シリコンフォーム、 セルロース多孔質体等 の発泡体又は樹脂が挙げられる。 担体は、 形質転換体の増殖及び活性の維持に有 利である点、 及び死滅した細胞を速やかに脱離させる点で、 多孔質の担体が好ま しい。 多孔質体の開口部の大きさは細胞によって異なるが、 多孔質内に入り込ん で増殖できる大きさが適当であり、 50 π!〜 1, 000 i m が好ましい。 但し、 これら の大きさに限定されるものではない。 また、 担体の形状は問わない。 担体の強度、 培養効率等を考慮すると、 球状又は立方体状が好ましく、 大きさは、 球状の場合 は直径が 2mii!〜 50龍、 立方体状の場合は 2nm!〜 50匪角が好ましい。
「固定化」 とは、 形質転換体が遊離の状態ではなく、 担体に結合若しくは付着 し、 又は担体内部に取り込まれた状態等をいう。 形質転換体の固定化には、 例え ば、 担体結合法、 架橋法及び包括法等の公知の方法を適用することができる。 凝 集性の酵母の固定化には、 担体結合法が最適である。 担体結合法としては、 ィォ ン交換性の樹脂に吸着させる化学的吸着法又は物理的吸着法が挙げられる。
形質転換の宿主として凝集性酵母を用いると、 該酵母は、 担体に固定化されて いるにもかかわらず増殖可能であり、 活性が低下すると自然に脱落していく性質 を有している。 このため、 担体に結合した酵母は、 生菌数がほぼ一定に保たれ、 活性が高いという特徴を有する。 従って、 上記酵母の担体への結合は物理的吸着 が最も好ましい。 凝集性又は接着性の細胞と前記多孔質の担体とを混合して培養 することにより、 細胞は多孔質体の開口部に入りこみ、 担体に付着する。
このようにして得られる固定化された形質転換体 (特に酵母が好ましい) を、 担体に付着した状態のまま浮遊状態で培養するか、 あるいはカラムに充填して、 いわゆるバイオリアクターとして用いることができる。 カラムとしては、 例えば 通常のゲルろ過、 イオン交換クロマ卜グラフィ一等に使用されているものと同様 のものを用いることができる。 また、 上記カラムを、 ポンプ、 回収容器、 金属検 出計などと組み合わせて、 金属回収用装置として使用することができる。
5 . 環境浄化剤及び金属の回収剤
本発明の形質転換体は、 その細胞表層に金属を捕捉 (吸着) することができる ため、 環境浄化剤又は金属の回収剤として使用することができる。 本発明の形質 転換体により吸着しうる重金属としては、 例えば銅、 コバルト、 ニッケル、 カド ミゥム、 マンガン、 ガリウム、 亜鉛、 金、 水銀、 ウランなどが挙げられるが、 こ れらに限定されるものではなく、 その他のレアメタルも回収の対象となる。
( 1) 海水、 淡水又は廃水からの回収
上記金属が含まれる海水若しくは淡水 (河川、 池、 湖) 又は廃水 (生活廃水、 厨房廃水、 工場廃水等) に、 本発明の形質転換体を添加する。
金属との反応は、 固定化された形質転換体をカラムにつめ、 あるいは、 攪拌槽 にいれて、 連続的又は回分的に行われる。
① 回分式の処理法
本発明の形質転換体の添加量は、 金属の濃度により適宜定めることができ、 特 に限定されるものではないが、 I OO Mの金属濃度あたり、 菌体乾燥重量で 5〜6 g /し 好ましくは 5. 5g/L程度である。 この際、 重金属含有水溶液は、 塩分濃度 10 〜100mM、 pH7~8 に調節することが好ましい。 なお、 廃水の温度は、 20〜40で、 好ましくは 25〜35°Cである。形質転換体を添加した後、 20〜60分ィンキュベート して金属を吸着させる。
② 連続式の処理法
本発明の回収剤を用いて重金属含有水溶液から重金属を分離、 回収するには、 この金属回収剤を例えばカラムに充てんし、 あらかじめ ρΗ 7〜 8程度に調整した 重金属含有水溶液を通過させることができる。
上記処理により、 水溶液中の重金属は形質転換体に吸着され、 分離、 除去され る。 次に、 このように重金属を吸着した形質転換体から重金属を回収するため、 化学処理を行う。 化学処理剤としては、 金属キレート剤、 例えば 5mMエチレンジ アミンテトラ酢酸 (EDTA) 等が挙げられる。
(2) 排ガスからの回収
本発明において金属を回収する排ガスとしては特に限定されるものではない。 例えば、 工場から出されるガス等が挙げられる。
工場から出されるガスは、 煙突から排出する前のガスを集ガス機で回収する。
そして、 得られた回収ガスを本発明のカラム又は装置に通過させる処理を行う。 金属捕捉能の測定
反応終了後、 遠心分離器による分離操作および蒸留操作ゃ晶析操作等により分 離され、金属が単離されるため、反応の経時変化を例えば HPLCなどでモニターす ることにより金属捕捉能を測定する。
本発明において連続的に又はバッチで繰り返し培養しても、 活性が低下した又 は死滅した細胞はカラムから脱離していくので、 活性が落ちることはなく、 有効 に利用することができる。
(3)土壌中からの回収
① 回分式又は連続式
金属を土壌から回収するには、金属を含む土壌を水などに懸濁したのち遠心し、 その上清を採取する。 その後は、 上記回分式又は連続式を適用して金属を回収す る。
② 植物体からの回収
本発明においては、 植物体に再生された形質転換体を用いて土壌中の金属を回 収することができる。 すなわち、 金属が含まれる土壌に形質転換植物体を植えて 栽培すると、 植物の根が土壌中の金属を吸収し、 植物体中の細胞に金属が捕捉さ れることとなる。 捕捉された後は、 植物体をすりつぶして細胞懸濁液とし、 上記 化学処理を適用して金属を回収する。 図面の簡単な説明
図 1は、 金属捕捉能を付与した細胞のモデル図である。
図 2は、 本発明の遺伝子の構築図である。
図 3は、 ァグルチニンの分子構造を示す図である。
図 4は、 本発明の組換えべクタ一の構築プロセスを示す図である。
図 5は、 ヒスチジンポリペプチド (H i s) 6をコードする DNAを合成するためのプ ライマーを示す図である。
図 6は、 プラスミ ド pGP匪 6を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ヒスチジンポリべプチドを細胞表層に直接提示 ·発現させるた めの遺伝子構築
本発明の融合遺伝子の構築は、 以下の通り行った (図 4)。
市販のプラスミド PRS406 (4381bp) (STRATAGENE社製: Sikorski, R. S. and P. Hieter, 1989, Genetics 122: 19-27) を と ΛοΙで切断した後、 4330bpの DNA 断片をァガロース電気泳動にかけて溶出した。 次に、 ヒスチジンポリべプチ ド(His) 6をコードする DNAを導入するために、 以下の配列を有する 1つの合成プ ライマー (HIS03 及び HIS04 ; 図 5) をァニールさせて、 上記電気泳動溶出した DNA断片と連結し、 プラスミ ド pRS406-H(4349bp)を得た。
HIS03: 5' gatcccatcaccatcaccatcac 3' (配列番号 8 )
HIS04: 3' ggtagtggtagtggtagtgagct 5' (配列番号 9 )
ひ -ファクターの前駆体のプレプロリーダー配列の DNA断片(MFひ卜 ss) を市販 の PUC19に組み込んだプラスミ ド pUC19 - a (Inokuchi, K. et al. , 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3185-3193) を铸型にして、 以下の 2つのプライマーを用いて PCRを行 い、 MF a卜 ss、すなわち酵母 5. cerevisiaeの αファクタ一の前駆体のプレプロリ ーダー配列の DNA断片を増幅した。
5' gatttctagaatgagatttccttcaatttt 3' (配列番号 10)
(下線部は Xbal認識部位)
5' ccaagcggatcctct tct tttatccaaagataccccttc 3' (配歹 U番号 12)
(下線部は 認識部位)
PCRは、 以下の反応組成液により、 94°C, 40秒 Z48°C, 40秒 Z72 , 40秒の反応 を 1サイクルとしてこれを 25サイクル行った。
反応液組成:
プライマー \n\ (50 Μ)
ポリメラ一ゼ \H \
ポリメラ一ゼバッファ' 10^ 1
dNTPs (lOmM) In 1
全量 100/i l (H20で調整)
PRS406-Hを BaniU及び で切断してァガロース電気泳動を行い、 溶出され た DNA断片 (4337bp) を、 上記増幅したプレブ口リーダー配列の DNA断片(264bp) と連結して PRS406HM (4601bp)を作製した。
次に、 α-ァグルチニンの C末端側の 320個のアミノ酸をコ一ドする DNAと、 446 塩基からなる α-ァグルチニンの 3'-非翻訳領域を含む DNA断片を得るために、 プ ラスミ ド pYE22 (Murai, T. et aし 1997, Ap l. Environ. Microbiol. 63:
1362- 1366)から TwI と Kpnlの 2つの制限酵素で処理して
断片を切り 出し、この断片を、 PRS406-Hを Xho\及び Κριήで処理した ΏιοΙ-ΚρηΙ断片(4586bp) と連結して PRS406- AHM(5999bp) を作製した。 最後に、 プラスミ ド pYE22m
(Sawai-Hatanaka, H. et al. , 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1221-1228) から 5adl及び al を用いて切り出した 5. cereWs/aeのダリセルアルデヒド-
3' -リン酸デヒドロゲナ一ゼ (GAPDH) のプロモーター DNA断片を、 pRS406- AHMか ら 5adl と ^1を用いて切り出した DNA断片と連結して、ヒスチジンポリべプチ ド (His)6を細胞表層に直接提示 ·発現するためのプラスミ ド pGPMH6 (7068bp)を 作製した (図 6)。
このプラスミドに組み込まれた融合遺伝子、 すなわち酵母 S. cerevisiaeの a- ファクタ一の前駆体のプレプロリーダー配列、 ヒスチジンポリペプチド (His)6 をコードする DNA配列、並びに α-ァグルチニンの C末端側の 320個のアミノ酸を コードする DNA及び 446塩基からなる 3'-非翻訳領域の DNA配列により構成され る融合遺伝子の塩基配列を配列番号 7に示す。
このベクターを酵母に導入すると、 酵母細胞表層にヒスチジンポリべプチド (His) 6を容易に発現提示することが可能である。
〔実施例 2〕細胞表層にヒスチジンポリペプチド (His) fiを発現提示する酵母
の作製
酵母表面で安定にヒスチジンポリペプチド (His) 6を発現提示させるために、 プ ラスミド PGPMH6 を、 栄養選択マーカ一遺伝子内に 1箇所存在する制限酵素
で切断して直鎖状にした。 得られた DNA 断片を、 酢酸リチウム法で酵母 は cereW ae MT8- 1)に導入し、 相同組換えにより染色体 DNAに組み込んだ。 続 いて酵母をトリブトファン、 ヒスチジン、 アデニン及びロイシンを含む SD-U寒天 培地で培養し、 生育してきた酵母を選択した。 この酵母は、 pGPMH6の遺伝子を有 しており、 5. ce eW5' MT8- 1 (PGPMH6)と名付けた。 得られた酵母を YPD液体培 地で 30でで 24時間培養し、 遠心分離して培地と菌体とに分離し、 1次抗体とし て RGS(HIS)4抗体を、 2次抗体として FITCラベルした抗 IgG抗体を用いて蛍光染 色し、 蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、 形質転換酵母 S. cerevisiae MT8-1 (pGPMH6)の菌体には FITC の蛍光 が見られたが、対照として用いた 5. cerevisiaem%-\には蛍光は認められなかつ た。これにより、形質転換された酵母の細胞表層でヒスチジンポリぺプチド(His)6 が提示 ·発現していることが確かめられた。
〔実施例 3〕 細胞の機能評価
(1) 重金属捕捉能の測定
形質転換酵母を YPD培地 10ml中、 30°Cで 24時間前培養し、 その前培養液の一 部 (1ml) をさらに新鮮 YPD培地 100ml に添加し、 30°Cで 24時間本培養した。 こ の菌体を 0. D. (Optical density) が 10となるまで培養し、 20mlの培養液を分取 した後遠心を行って菌体を集めた。
この集めた菌体に ΙΟΟμΜの各重金属溶液 10mlを加えてよく懸濁した後、 30で、 220rpmで 2時間振盪した。 遠心して菌体と上清に分離し、 さらに菌体を 10ml の 脱イオン水で洗浄し、 遠心分離により洗浄水と菌体に分離した。 前記上清と洗浄 水 を 集 め て 、 ICP— AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy)を用いて金属イオン濃度を求め、上清及び洗浄水中に存在する金属 イオン量を指標として菌体に捕捉された金属イオン量を算出した。 一方、 菌体を 5mMの EDTA(pH8.0) 10mlで懸濁し (氷上で 15分)、 遠心分離により上清を得、 こ
の上清について、 前記と同様にして金属イオン濃度を求め、 菌体に捕捉された金 属イオン量を測定した。
硝酸銅、 硫酸銅、 塩化銅溶液に対する酵母の捕捉能を測定した結果、 対照株 (6 nmo l/mg dry ce l l ) に比べて有意の捕捉能を示し、 最大 14- 16nmo l/mg dry ce l l の値を得た。 この値は、 大腸菌で報告されている値 (Sousa, C. e t al. , 1998, J. Bac ter i o l. , 180 : 2280-2284) と比べて約 2倍の捕捉能を示した。 また、 銅、 二 ッケル、 カドミウムイオンについて調べた結果、 硝酸銅、 硫酸銅及び塩化銅の捕 捉能と同様の捕捉能 (最大 14- 16nniol/ing d ry ce l l ) を得た。 これらの値は酵母 の培養培地の pHに影響を受けるが、 培地に 50mM HEPES (pH7. 8)を添加することで その影響を防ぐことが可能である。 また、 酵母の細胞表層から回収された金属ィ オンの量と前記上清及び洗浄水から算出された金属イオンの量とがほぼ同程度で あったことから、 細胞表層からの金属イオンの回収は、 菌体の EDTA (pH8. 0)処理 により可能であることが分かった。
(2) 重金属耐性能の獲得
本発明の金属捕捉能を有する酵母と対照酵母について、 各種濃度の重金属 (CuSO,) 存在下での生存率を測定した。 すなわち、 各培養時間ごとにサンプルを 採取して、 0D6()。の増加を測定した。
その結果、 対照酵母では 2mMの銅イオン濃度で死滅するのに対し、 本発明の酵 母 (ヒスチジンポリペプチドを細胞表層に提示するもの) は、 2 以上でも生育 することができた。 しかも、 4 という高濃度の金属イオン存在下でも生育する ことが可能であった。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 そのまま参考として 本明細書に取り入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 細胞表層に金属を捕捉することができる夕 質を発現する とができる遺伝子、 該遺伝子を含む組換えベクター、 言. を含む形質転
換体が提供される。 本発明の形質転換体は重金属を捕捉することができるため、 環境浄化剤及び金属回収剤として有用である。 配列表フリーテキス卜
配列番号 3 :合成 DNA
配列番号 4 :合成ペプチド
配列番号 8 :合成 DNA
配列番号 9 :合成 DNA
配列番号 10:合成 DNA
配列番号 Π :合成 DNA
Claims
請 求 の 範 囲
I . 分泌シグナルべプチド、金属捕捉能を有するポリべプチド及び細胞表層局 在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含む融合遺伝子。
2. 分泌シグナルぺプチドが配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むもの である請求項 1記載の融合遺伝子。
3. 分泌シグナルペプチドをコードする DNA が配列番号 1で表される塩基配 列を含むものである請求項 1又は 2記載の融合遺伝子。
4. 金属捕捉能を有するポリべプチドが配列番号 4で表されるアミノ酸配列 を含むものである請求項 1記載の融合遺伝子。
5. 金属捕捉能を有するポリペプチドをコードする DNA が配列番号 3で表さ れる塩基配列を含むものである請求項 1又は 4記載の融合遺伝子。
6. 細胞表層局在タンパク質が配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含むも のである請求項 1記載の融合遺伝子。
7. 細胞表層局在タンパク質をコードする DNA が配列番号 5で表される塩基 配列を含むものである請求項 1又は 6記載の融合遺伝子。
8. 配列番号 7で表される塩基配列を含む、細胞表層に金属捕捉能タンパク質 を発現することができる融合遺伝子。
9. 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
1 0. 請求項 9記載の組換えベクターを含む形質転換体。
I I. 形質転換体が形質転換酵母、 形質転換動物細胞、 形質転換植物細胞、 形質 転換粘菌又は形質転換昆虫細胞である請求項 10記載の形質転換体。
1 2. 請求項 10又は 11記載の形質転換体を含む環境浄化剤。
1 3. 請求項 10又は 11記載の形質転換体を含む金属回収剤。
14. 請求項 10又は 11記載の形質転換体が充填されたカラム。
1 5. 請求項 14記載のカラムを含む環境浄化装置。
1 6. 金属により汚染された環境物質に、請求項 10又は 11記載の形質転換体を 添加することを特徴とする環境浄化方法。
1 7. 金属により汚染された環境物質を、 請求項 14記載のカラム又は請求項 15
記載の装置で処理することを特徴とする環境浄化方法。
. 環境物質が海水若しくは淡水、 廃水、 排ガス又は土壌である請求項 16又 は 17記載の環境浄化方法。
. 金属により汚染された環境物質に請求項 10又は 1 1記載の形質転換体を添 加し、 添加後の形質転換体をキレー卜剤で処理することを特徴とする金属の 回収方法。
. 環境物質が海水若しくは淡水、 廃水、 排ガス又は土壌である請求項 19記 載の回収方法。
. キレー卜剤がエチレンジアミンテトラ酢酸である請求項 19又は 20記載の 回収方法。
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