WO2001038517A1

WO2001038517A1 - Gene exprimant une proteine capable de capturer un metal

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Publication number: WO2001038517A1
Application number: PCT/JP2000/007518
Authority: WO
Inventors: Atsuo Tanaka; Mitsuyoshi Ueda
Original assignee: Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2001-05-31
Also published as: JP2003284556A

Description

明細金属捕捉能タンパク質を発現する遺伝子技術分野

本発明は、細胞表層に金属を捕捉することができる夕ンパク質を発現することができる遺伝子、該遺伝子を含む組換えべクタ一、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体の用途に関する。背景技術

工場などから発生する産業廃液中には、生態系に対し有毒な重金属が含まれており、そのまま排水すると環境汚染をもたらすため、河川等に排出する前にこれを除去することが必要である。その一方、これらの産業廃液中には、多くの有用な重金属も含まれている場合もあるため、廃棄せずに資源の有効利用することが可能である。

従来より、微生物、藻類の中には、特定の重金属を蓄積する能力を有するものが存在するため、これを利用して廃液中の重金属を回収することも試みられ、植物バイオマス、カビ、クロレラなどを用いた方法が提案されている（特開平 1卜 221460号公報、特開平 9-108568号公報及び特開平 6-238162号公報）。

しかしながら、これらの微生物に吸着された重金属は、回収の際に容易に沈降しないため、回収が困難であり必ずしも満足できるものではない。しかも、微生物細胞内部に重金属が取り込まれると、通常は微生物自身に対し毒性となるため、重金属の高濃度存在下では生育できない。従って、高濃度重金属溶液に対しては上記微生物で処理することができない。発明の開示

本発明は、細胞表層に金属を捕捉することができるタンパク質を発現することができる遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体、及び該形質転換体の用途を提供することを目的とする。本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、金属捕捉能を有するポリべプチドをコ一ドする DNAを含む融合遺伝子を構築し、これを宿主に導入して金属捕捉能を有する宿主を作製することに成功し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有するポリべプチド及び細胞表層局在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含む融合遺伝子である。分泌シグナルペプチド（例えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むもの）をコードする DNAとしては配列番号 1で表される塩基配列を含むものが挙げられ、金属捕捉能を有するポリペプチド（例えば配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むもの）をコードする DNAとしては配列番号 3で表される塩基配列を含むものが挙げられ、細胞表層局在タンパク質（例えば配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含むもの）をコードする DNAとしては配列番号 5で表される塩基配列を含むものが挙げられる。具体的には、上記融合遺伝子として配列番号 7で表される塩基配列を含むものが挙げられる。

さらに、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターである。

さらに、本発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体である。形質転換体としては、形質転換酵母、形質転換動物細胞、形質転換植物細胞、形質転換粘菌又は形質転換昆虫細胞が挙げられる。

さらに、本発明は、上記形質転換体を含む環境浄化剤又は金属回収剤である。さらに、本発明は、上記形質転換体が充填されたカラム又は該カラムを含む環境浄化装置である。

さらに、本発明は、金属により汚染された環境物質に、上記形質転換体を添加することを特徴とする環境浄化方法、又は金属により汚染された環境物質を、上記カラム若しくは装置で処理することを特徴とする環境浄化方法である。

さらに、本発明は、金属により汚染された環境物質に上記形質転換体を添加し、添加後の形質転換体をキレート剤で処理することを特徴とする金属の回収方法である。

上記環境物質としては、例えば海水若しくは淡水、廃水、排ガス又は土壌が挙げられ、キレー卜剤としてはエチレンジアミンテトラ酢酸が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願平成 1 1年第 330226号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。本発明の融合遺伝子は、分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有するポリぺプチド、細胞表層局在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含むものであり、金属捕捉能を有するポリべプチドを細胞表層に発現し得る遺伝子である。

本発明者は、細胞表層、すなわち細胞膜や細胞壁に着目して、これらの領域に輸送局在化するタンパク質のアドレスとなる情報の利用（細胞表層工学）を考えた。細胞表層工学（Ce l l Sur f ace Engineer i ng) とは、細胞表層に輸送局在化されるタンパク質の分子情報を活用して、外来タンパク質を細胞膜の外側や細胞壁に夕ーゲッティングさせ、細胞表層へ新機能を付与する操作を意味する（図 1 )。本発明は、細胞表層にタンパク質を輸送させる分泌シグナル配列、金属捕捉能を有するポリペプチド（金属捕捉能タンパク質ともいう）及び細胞表層局在タンパク質を同一の遺伝子上にコードする融合遺伝子を構築し（図 2 )、該融合遺伝子を宿主に発現させることにより、宿主の細胞表層に金属捕捉機能を付与することとしたものである（図 1；)。

1 . 本発明の融合遺伝子の構築

( 1)分泌シグナルペプチド

分泌シグナルペプチド（分泌シグナル又は分泌シグナル配列ともいう）は、一般に細胞外（ペリブラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）の N-末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むぺプチドであり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。

本発明においては、金属捕捉能タンパク質を酵母の細胞外に移動及び発現させることができる分泌シグナルであれば、特に限定されるものではない。例えば、分泌シグナル配列としては、ひ -ファクタ一前駆体のプレブ口リーダー配列（配列番号 2 )、酵母のひ -又は a -ァグルチニンのシグナル配列、グルコアミラーゼの分泌シグナル等が挙げられる。なお、金属捕捉能タンパク質の活性を保持する限り、分泌シグナルの一部または全部が金属捕捉能タンパク質の N-末端に残ってもよレ^本発明においては、 α -ファクター前駆体のプレブ口リーダ一配列をコードする DNA (配列番号 1 ) が好ましい。該 DNAは、酵母のデ一夕ベースから入手した配列をもとにしてプライマ一を設計し、酵母ゲノム DNAを銬型とする PCRで増幅することによって調製される。

(2)金属捕捉能を有するポリぺプチド

本発明において、金属捕捉能とは、ポリペプチド自身が金属分子を吸着又は捕獲させる機能を意味する。捕捉とは、化学的結合（共有結合、イオン結合等）によるもの及び物理的吸着によるもののいずれをも意味する。このような機能を有するペプチド配列は（H i s) _6ηで表されるものが挙げられる。ここで、 η は特に限定されるものではなく任意に設定することができる。 η= 1 (すなわち 6個の H i s (配列番号 4) ) でも十分である。 H i sは、「CAT」又は「CAC」によりコードされるため、いずれかのコドンを選択して DNA 配列を任意に設計し合成することができる（例えば配列番号 3 )。その際、ベクターとの連結が可能となるように、適当な制限酵素部位を有する配列を設計しておくことが好ましい。なお、合成は、通常の化学合成により行われる。

(3)細胞表層局在タンパク質

細胞表層局在タンパク質は、本発明の融合遺伝子を導入する宿主の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。細胞表層とは、宿主の最も外側の膜（例えば細胞壁、細胞膜等）の内部、細胞膜の最外層と外界との境界面、及び細胞の最外層からリンカ一又はアンカ一を介して突き出た領域のいずれをも意味する。

細胞表層局在タンパク質としては、フロキュリン、ァグルチニン、リポプロテイン等のタンパク質のほか、 CWP と呼ばれるタンパク質群が挙げられるが、酵母サッカロミセス ·セレピシェ Uscctiiiromycss cere visiae) で最も機能解析が進んでいる凝集性細胞間接着分子であるァグルチニンが好ましい。ァグルチニンは、細胞同士が接合するときに誘導発現するものである。このタンパク質には α接合型細胞で発現する α -ァグルチニン及び a接合型細胞で発現する a-ァグルチニンが知られており、いずれも細胞壁に結合して活性部位が細胞の最外層から突き出ている。そして、この 2つの分子を介して細胞間接着が起こる。

α -ァグルチニンは、 AG a l遺伝子にコードされるタンパク質であり、 a-ァグルチニンは、 AGA1遺伝子にコードされるコア部分と AGA2遺伝子にコードされる小サブユニットとがジスルフイド結合を介して連結した複合体タンパク質である。ひ-ァグルチニンと、 a-ァグルチニンのコア部分とは、それぞれともに GPI (グリコシルフォスファチジルイノシトール）アンカー付着シグナル配列と呼ばれる疎水性領域が、ァグルチニンを構成するアミノ酸配列の C末端側に含まれている (図 3 )。 GPIアンカ一シグナル配列とは、 GPIアンカ一によって認識される配列 (通常、細胞表層局在夕ンパク質の C末端又はその近傍に位置する配列）であり、その認識により GPIアンカ一シグナル配列が切断されて、細胞表層局在タンパク質は GPIアンカ一と結合する。

本発明において、細胞表層局在タンパク質をコードする DNAとしては、好ましくは酵母の細胞表面に提示されるタンパク質（例えばひ -又は a -ァグルチニン）をコードする DNA (主に、 C末端側半分の領域をコードする DNA) が挙げられる。好適には、 650個のアミノ酸配列を有する α -ァグルチニンのアミノ酸配列のうち、第 331番目から第 650番目までのアミノ酸（図 3、配列番号 6 )、すなわち C末端から 320アミノ酸の配列をコ一ドする DNA (配列番号 5 ) が用いられる。この 320 個のアミノ酸配列中には 4個所の糖鎖結合部位が存在する。そして、細胞表層局在タンパク質と GP Iアンカ一との結合が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ C (PI- PLC) と呼ばれる酵素により切断された後に、 α -ァグルチニンの糖鎖やダリカン（PI- PLCによって切断された後の付着したまま残された GPI アンカー断片内に存在する）と、細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、 α -ァグルチニンの C末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。

従って、上記 320アミノ酸領域をコードする DNAは本発明において特に有用である。上記 320個のアミノ酸をコードする DNA (配列番号 5 ) は、酵母のデ一夕ベースをもとに作成したプライマーを用いて酵母ゲノムを铸型とする PCRで増幅することにより得た断片を含むプラスミド ΡΥΕ322から得ることができる。但し、上記 DNAには、 3'側の非翻訳領域が連結されていてもよい。

(4) DNAの連結上記分泌シグナルペプチドをコードする DNA、金属捕捉能を有するポリべプチドをコードする DNA及び細胞表層局在タンパク質をコードする DNAをそれぞれリガーゼで処理して、融合遺伝子を作製する。あるいは、後述の通り（「2 . 組換えベクターの作製」の項を参照）、上記各 DNAを 1つのプラスミドに順次連結する方法を採用してもよい。

(5)塩基配列の決定

上記のようにして構築された融合遺伝子の塩基配列の決定は、マキサム-ギルバートの化学修飾法、又はジデォキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができる。但し、通常は自動塩基配列決定機を用いて配列決定が行われる。例えば、 Perkin Elmer社製の蛍光ダイデォキシターミネ一夕一を含有する PRI SM シークェンシングキット等を使って反応を行い、 App l i ed B i osys t em 社製のォー卜シークェンサ一（モデル AB I 373)等で塩基配列を決定する。

配列番号 7に本発明の融合遺伝子の塩基配列を例示する。但し、本発明の融合遺伝子は、上記分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有するポリペプチド及び細胞表層局在タンパク質をコードする限り、配列番号 7に示す塩基配列に限定されるものではない。

一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成によって、又は構築された遺伝子を錶型とした PCRによって、あるいは該塩基配列を有する DNA 断片をプローブとしてハイプリダイズさせることによって、本発明の遺伝子を得ることができる。さらに、部位特異的変異誘発等によって上記タンパク質又はべプチドをコードする修飾された DNA、例えば同一のアミノ酸をコードする別のコドン（縮重コドン）に改変された DNAを合成することもできる。

なお、遺伝子に変異を導入するには、 Kunke l法、 Gapped dup l ex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば Mu t an卜 K (TAKARA社製）や Mu t an t- G (TAKARA社製））などを用いて、あるいは、 TAKARA社の LA PCR i n v i o Mu t agenes i s シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。

2 . 組換えべクタ一の作製本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクタ一は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファ一ジ DNA等が挙げられる。

プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, PUC 1 18, pUC 1 19, pUC 18, pl)C 19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB l l O, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば pYE22m、 pYGA2270 , YE l 3, YEp24, YCp50 等）などが挙げられ、ファージ DNAとしては；ファージ（Charon4A、 Cha ron2 1A, EMBL3、 EMBL4、 A gt lO, A gt l K λ ZAP 等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクター、さらに T iプラスミド等を用いることもできる。

ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニンダサイトに挿入してベクタ一に連結する方法などが採用される。

但し、このような出発材料のプラスミドを適当な制限酵素で処理し、得られる制限酵素部位に、別のプラスミドから得られたシグナル配列をコードする DNA、金属結合能ポリペプチドをコードする DNA、及び細胞表層タンパク質をコードする DNAを順次連結して組換えべクタ一を作製することもできる。このような操作を行う場合は、出発プラスミドとして、例えば pYE22m、 pYGA2270等が挙げられる。本発明の融合遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、オペレーター、プ口モーター、夕一ミネ一ター、本発明の融合遺伝子のほか、所望によりシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有するものを連結することができる。例えば、 GAPDH (グリセルアルデヒド 3 ' -リン酸デヒドロゲナ一ゼ）プロモー夕一及び又は GAPDHターミネータ一等をベクターに連結することができる。なお、選択マ一力一としては、例えば酵母選択マーカ一（例えば TRP、 LEU2等）、大腸菌の選択マーカ一（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）が挙げられる。本発明においては、プラスミド PYGA2270又は pYE2mの GAPDHプロモーターと GAPDHターミネ一ターの配列との間に、分泌シグナル配列をコードする DNA、金属捕捉能を有するポリべプチドをコードする DNA、及びひ-ァグルチニンの C末端から 320アミノ酸をコードする DNAを挿入することにより本発明の組換えベクターを得ることができる。

3. 形質転換体の作製

本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の融合遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（£s die ' c!iia co J 等のエッシェリヒァ属、バチルス ·ズブチリス、Bacillus subti 1 is)等のバチルス属、シユードモナス · プチダ iPseudom as put i da)等のシュ一ドモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス ·セレビシェ {Saccharoinyces cerevisiae) 、シゾサッカロミセス ' ホンべ (Scliizosaccl roiwces pombe)等の酵母が挙^られ、 COS細胞、 CH0細胞等の動物細胞が挙げられ、 Sf9等の昆虫細胞が挙げられ、 Physarum polycephalum等の菌が挙げられ、さらに植物細胞が挙げられる。なお、本発明では、凝集性の酵母を宿主として用いることも可能である。凝集性の酵母としては、サッカロミセス - ジァス夕テイクス Saccharomyces diasiaiicus) ATCC60715, 同 ATCC60712、サッカロミセス 'セレビシェ "3ccl romyc6s cerevisiae) IF01953, 同 CG1945、同 HF7Cが挙げられる。「凝集性」とは、液体中に浮遊又は分散して存在する酵母等が、集合して塊（集合体）を作る性質を意味する。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。但し、本発明において細菌を宿主とする場合は、細胞表層局在タンパク質としてリポプロティン等を使用することが好ましい。

大腸菌としては、例えばエッシェリヒァ*コリ (Escherichia colA DH5 α , Y1090 などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス · ズブチリス（ C // 5 5 ϋ Λ〃 / / などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば t rpプロモーター、 l acプロモー夕一、 P_Lプロモ一夕一、 P_Rプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。 t ac プロモータ—などのように、人為的に設計改変されたプロモータ一を用いてもよレ^

細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌に DNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S. N. e t al. ： Pro Nat l. Acad. Sc i. , USA, 69： 21 10 ( 1972) ) , エレクトロボレ一ション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば GAPDHプロモータ一、 gal lプロモー夕一、 gal 10プロモ一ター、ヒートショックタンパク質プロモーター、 MF a lプロモーター、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 A0X1プロモ一ター等を用いることができる。

酵母への組換えべクタ一の導入方法は、酵母に DNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクト口ポレーシヨン法（Becker, D. M. e t al. ： Methods. Enzymol. , 194 : 182 ( 1990) )、スフエロプラスト法（Hinnen, A. e t al. ： Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA, 75： 1929 (1978) )、酢酸リチウム法（I toh， H. ： J. Bac terio l. , 153： 163 (1983) )等が挙げられる。

動物細胞（原生動物細胞を含む。以下同じ。）を宿主とする場合は、サル細胞 COS- 7、 Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CH0細胞）、マウス L細胞、ラット GH3、ヒ卜 FL細胞などが用いられる。プロモ一夕一として SR aプロモータ一、 SV40プロモーター、 LTRプロモー夕一、 CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウィルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレ一ション法、リン酸カルシウム法、リポフエクション法等が挙げられる。

昆虫細胞を宿主とする場合は、 Sf9 細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えべクタ一の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーション法などが挙げられる。

粘菌を宿主とする場合は、 Physarum polycepha lumなどが甩られる。粘菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシヨン法などが挙げられる。

宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては特に限定されるものではなく、例えばァカザ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ゥリ科、ヒルガオ科、アブラナ科等に属する植物が挙げられる。その他、らんそう、クロレラ等を宿主として使用することができる。

上記組換えべクタ一は、通常の形質転換方法、例えばァグロパクテリゥム法、パーティクルガン法、 PEG 法、エレクトロボレ一シヨン法等によって植物中に導入することができる。

例えばァグロパクテリゥム法を用いる場合は、構築した植物用発現べクタ一を適当なァグロパクテリゥム、例えばァグロパクテリゥム，チュメファシエンス {Agrobac t erium t umefaciens) LBA4404 株に導入し、この株をリーフディスク法 (内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル， 1990, 27- 3 1卯，講談社サイェンティフィック，東京）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。

また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロ卜プラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えば PDS- 1000 (B I 0-RAD社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は 450〜2000ps i程度の圧力、 4〜 1 2cm程度の距離で行う。

植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーシヨン法等で培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルス、腫瘍組織、シュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。

遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、 PCR 法、サザンハイブリダィゼ —シヨン法、ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法等により行うことができる。例えば、形質転換体から DNAを調製し、 MA特異的プライマ一を設計して PCRを行う。 PCR は、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を 1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマ一を用いて PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。

遺伝子は、プラスミドの形態で導入してもよく、宿主の遺伝子に挿入することにより導入してもよく、宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。

上記形質転換体を、プロモーターを活性化させる条件で培養又は栽培すると、その細胞表層に金属捕捉能タンパク質が発現される。なお、金属捕捉能タンパク質が細胞表層に固定されていることの確認は、該夕ンパク質に対する抗体及び FITC標識抗体を用いる免疫抗体法で行うことができる。

4 . 本発明の形質転換体を充填したカラム、及び該カラムを含む装置

本発明の形質転換体は、連続反応又は回分式培養において繰り返し使用できる点で担体に固定化されていることが好ましい。「担体」とは、本発明の形質転換体 (例えば形質転換酵母）を固定化することができる物質を意味し、好ましくは、水又は特定の溶媒に対して不溶性の物質を意味する。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体等の発泡体又は樹脂が挙げられる。担体は、形質転換体の増殖及び活性の維持に有利である点、及び死滅した細胞を速やかに脱離させる点で、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは細胞によって異なるが、多孔質内に入り込んで増殖できる大きさが適当であり、 50 π！〜 1, 000 i m が好ましい。但し、これらの大きさに限定されるものではない。また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率等を考慮すると、球状又は立方体状が好ましく、大きさは、球状の場合は直径が 2mii！〜 50龍、立方体状の場合は 2nm！〜 50匪角が好ましい。

「固定化」とは、形質転換体が遊離の状態ではなく、担体に結合若しくは付着し、又は担体内部に取り込まれた状態等をいう。形質転換体の固定化には、例えば、担体結合法、架橋法及び包括法等の公知の方法を適用することができる。凝集性の酵母の固定化には、担体結合法が最適である。担体結合法としては、ィォン交換性の樹脂に吸着させる化学的吸着法又は物理的吸着法が挙げられる。

形質転換の宿主として凝集性酵母を用いると、該酵母は、担体に固定化されているにもかかわらず増殖可能であり、活性が低下すると自然に脱落していく性質を有している。このため、担体に結合した酵母は、生菌数がほぼ一定に保たれ、活性が高いという特徴を有する。従って、上記酵母の担体への結合は物理的吸着が最も好ましい。凝集性又は接着性の細胞と前記多孔質の担体とを混合して培養することにより、細胞は多孔質体の開口部に入りこみ、担体に付着する。

このようにして得られる固定化された形質転換体（特に酵母が好ましい）を、担体に付着した状態のまま浮遊状態で培養するか、あるいはカラムに充填して、いわゆるバイオリアクターとして用いることができる。カラムとしては、例えば通常のゲルろ過、イオン交換クロマ卜グラフィ一等に使用されているものと同様のものを用いることができる。また、上記カラムを、ポンプ、回収容器、金属検出計などと組み合わせて、金属回収用装置として使用することができる。

5 . 環境浄化剤及び金属の回収剤本発明の形質転換体は、その細胞表層に金属を捕捉（吸着）することができるため、環境浄化剤又は金属の回収剤として使用することができる。本発明の形質転換体により吸着しうる重金属としては、例えば銅、コバルト、ニッケル、カドミゥム、マンガン、ガリウム、亜鉛、金、水銀、ウランなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、その他のレアメタルも回収の対象となる。

( 1) 海水、淡水又は廃水からの回収

上記金属が含まれる海水若しくは淡水（河川、池、湖）又は廃水（生活廃水、厨房廃水、工場廃水等）に、本発明の形質転換体を添加する。

金属との反応は、固定化された形質転換体をカラムにつめ、あるいは、攪拌槽にいれて、連続的又は回分的に行われる。

① 回分式の処理法

本発明の形質転換体の添加量は、金属の濃度により適宜定めることができ、特に限定されるものではないが、 I OO Mの金属濃度あたり、菌体乾燥重量で 5〜6 g /し好ましくは 5. 5g/L程度である。この際、重金属含有水溶液は、塩分濃度 10 〜100mM、 pH7~8 に調節することが好ましい。なお、廃水の温度は、 20〜40で、好ましくは 25〜35°Cである。形質転換体を添加した後、 20〜60分ィンキュベートして金属を吸着させる。

② 連続式の処理法

本発明の回収剤を用いて重金属含有水溶液から重金属を分離、回収するには、この金属回収剤を例えばカラムに充てんし、あらかじめ ρΗ 7〜 8程度に調整した重金属含有水溶液を通過させることができる。

上記処理により、水溶液中の重金属は形質転換体に吸着され、分離、除去される。次に、このように重金属を吸着した形質転換体から重金属を回収するため、化学処理を行う。化学処理剤としては、金属キレート剤、例えば 5mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA) 等が挙げられる。

(2) 排ガスからの回収

本発明において金属を回収する排ガスとしては特に限定されるものではない。例えば、工場から出されるガス等が挙げられる。

工場から出されるガスは、煙突から排出する前のガスを集ガス機で回収する。そして、得られた回収ガスを本発明のカラム又は装置に通過させる処理を行う。金属捕捉能の測定

反応終了後、遠心分離器による分離操作および蒸留操作ゃ晶析操作等により分離され、金属が単離されるため、反応の経時変化を例えば HPLCなどでモニターすることにより金属捕捉能を測定する。

本発明において連続的に又はバッチで繰り返し培養しても、活性が低下した又は死滅した細胞はカラムから脱離していくので、活性が落ちることはなく、有効に利用することができる。

(3)土壌中からの回収

① 回分式又は連続式

金属を土壌から回収するには、金属を含む土壌を水などに懸濁したのち遠心し、その上清を採取する。その後は、上記回分式又は連続式を適用して金属を回収する。

② 植物体からの回収

本発明においては、植物体に再生された形質転換体を用いて土壌中の金属を回収することができる。すなわち、金属が含まれる土壌に形質転換植物体を植えて栽培すると、植物の根が土壌中の金属を吸収し、植物体中の細胞に金属が捕捉されることとなる。捕捉された後は、植物体をすりつぶして細胞懸濁液とし、上記化学処理を適用して金属を回収する。図面の簡単な説明

図 1は、金属捕捉能を付与した細胞のモデル図である。

図 2は、本発明の遺伝子の構築図である。

図 3は、ァグルチニンの分子構造を示す図である。

図 4は、本発明の組換えべクタ一の構築プロセスを示す図である。

図 5は、ヒスチジンポリペプチド（H i s) ₆をコードする DNAを合成するためのプライマーを示す図である。

図 6は、プラスミド pGP匪 6を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

〔実施例 1〕ヒスチジンポリべプチドを細胞表層に直接提示 ·発現させるための遺伝子構築

本発明の融合遺伝子の構築は、以下の通り行った（図 4)。

市販のプラスミド PRS406 (4381bp) (STRATAGENE社製： Sikorski, R. S. and P. Hieter, 1989, Genetics 122: 19-27) をと ΛοΙで切断した後、 4330bpの DNA 断片をァガロース電気泳動にかけて溶出した。次に、ヒスチジンポリべプチド（His) ₆をコードする DNAを導入するために、以下の配列を有する 1つの合成プライマー（HIS03 及び HIS04 ; 図 5) をァニールさせて、上記電気泳動溶出した DNA断片と連結し、プラスミド pRS406-H(4349bp)を得た。

HIS03： 5' gatcccatcaccatcaccatcac 3' (配列番号 8 )

HIS04： 3' ggtagtggtagtggtagtgagct 5' (配列番号 9 )

ひ -ファクターの前駆体のプレプロリーダー配列の DNA断片（MFひ卜 ss) を市販の PUC19に組み込んだプラスミド pUC19 - a (Inokuchi, K. et al. , 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3185-3193) を铸型にして、以下の 2つのプライマーを用いて PCRを行い、 MF a卜 ss、すなわち酵母 5. cerevisiaeの αファクタ一の前駆体のプレプロリーダー配列の DNA断片を増幅した。

5' gatttctagaatgagatttccttcaatttt 3' (配列番号 10)

(下線部は Xbal認識部位）

5' ccaagcggatcctct tct tttatccaaagataccccttc 3' (配歹 U番号 12)

(下線部は認識部位）

PCRは、以下の反応組成液により、 94°C, 40秒 Z48°C, 40秒 Z72 ， 40秒の反応を 1サイクルとしてこれを 25サイクル行った。反応液組成：

プライマー \n\ (50 Μ)

ポリメラ一ゼ \H \

ポリメラ一ゼバッファ' 10^ 1

dNTPs (lOmM) In 1

全量 100/i l (H₂0で調整）

PRS406-Hを BaniU及びで切断してァガロース電気泳動を行い、溶出された DNA断片（4337bp) を、上記増幅したプレブ口リーダー配列の DNA断片（264bp) と連結して PRS406HM (4601bp)を作製した。

次に、 α-ァグルチニンの C末端側の 320個のアミノ酸をコ一ドする DNAと、 446 塩基からなる α-ァグルチニンの 3'-非翻訳領域を含む DNA断片を得るために、プラスミド pYE22 (Murai, T. et aし 1997, Ap l. Environ. Microbiol. 63:

1362- 1366)から TwI と Kpnlの 2つの制限酵素で処理して

断片を切り出し、この断片を、 PRS406-Hを Xho\及び Κριήで処理した ΏιοΙ-ΚρηΙ断片（4586bp) と連結して PRS406- AHM(5999bp) を作製した。最後に、プラスミド pYE22m

(Sawai-Hatanaka, H. et al. , 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1221-1228) から 5adl及び al を用いて切り出した 5. cereWs/aeのダリセルアルデヒド-

3' -リン酸デヒドロゲナ一ゼ（GAPDH) のプロモーター DNA断片を、 pRS406- AHMから 5adl と ^1を用いて切り出した DNA断片と連結して、ヒスチジンポリべプチド（His)₆を細胞表層に直接提示 ·発現するためのプラスミド pGPMH6 (7068bp)を作製した（図 6)。

このプラスミドに組み込まれた融合遺伝子、すなわち酵母 S. cerevisiaeの a- ファクタ一の前駆体のプレプロリーダー配列、ヒスチジンポリペプチド（His)₆ をコードする DNA配列、並びに α-ァグルチニンの C末端側の 320個のアミノ酸をコードする DNA及び 446塩基からなる 3'-非翻訳領域の DNA配列により構成される融合遺伝子の塩基配列を配列番号 7に示す。

このベクターを酵母に導入すると、酵母細胞表層にヒスチジンポリべプチド (His) ₆を容易に発現提示することが可能である。

〔実施例 2〕細胞表層にヒスチジンポリペプチド（His) _fiを発現提示する酵母の作製

酵母表面で安定にヒスチジンポリペプチド（His) ₆を発現提示させるために、プラスミド PGPMH6 を、栄養選択マーカ一遺伝子内に 1箇所存在する制限酵素

で切断して直鎖状にした。得られた DNA 断片を、酢酸リチウム法で酵母は cereW ae MT8- 1)に導入し、相同組換えにより染色体 DNAに組み込んだ。続いて酵母をトリブトファン、ヒスチジン、アデニン及びロイシンを含む SD-U寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。この酵母は、 pGPMH6の遺伝子を有しており、 5. ce eW5' MT8- 1 (PGPMH6)と名付けた。得られた酵母を YPD液体培地で 30でで 24時間培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、 1次抗体として RGS(HIS)₄抗体を、 2次抗体として FITCラベルした抗 IgG抗体を用いて蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、形質転換酵母 S. cerevisiae MT8-1 (pGPMH6)の菌体には FITC の蛍光が見られたが、対照として用いた 5. cerevisiaem%-\には蛍光は認められなかつた。これにより、形質転換された酵母の細胞表層でヒスチジンポリぺプチド（His)₆ が提示 ·発現していることが確かめられた。

〔実施例 3〕細胞の機能評価

(1) 重金属捕捉能の測定

形質転換酵母を YPD培地 10ml中、 30°Cで 24時間前培養し、その前培養液の一部（1ml) をさらに新鮮 YPD培地 100ml に添加し、 30°Cで 24時間本培養した。この菌体を 0. D. (Optical density) が 10となるまで培養し、 20mlの培養液を分取した後遠心を行って菌体を集めた。

この集めた菌体に ΙΟΟμΜの各重金属溶液 10mlを加えてよく懸濁した後、 30で、 220rpmで 2時間振盪した。遠心して菌体と上清に分離し、さらに菌体を 10ml の脱イオン水で洗浄し、遠心分離により洗浄水と菌体に分離した。前記上清と洗浄水を集めて、 ICP— AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy)を用いて金属イオン濃度を求め、上清及び洗浄水中に存在する金属イオン量を指標として菌体に捕捉された金属イオン量を算出した。一方、菌体を 5mMの EDTA(pH8.0) 10mlで懸濁し（氷上で 15分）、遠心分離により上清を得、この上清について、前記と同様にして金属イオン濃度を求め、菌体に捕捉された金属イオン量を測定した。

硝酸銅、硫酸銅、塩化銅溶液に対する酵母の捕捉能を測定した結果、対照株（6 nmo l/mg dry ce l l ) に比べて有意の捕捉能を示し、最大 14- 16nmo l/mg dry ce l l の値を得た。この値は、大腸菌で報告されている値（Sousa, C. e t al. , 1998, J. Bac ter i o l. , 180 : 2280-2284) と比べて約 2倍の捕捉能を示した。また、銅、二ッケル、カドミウムイオンについて調べた結果、硝酸銅、硫酸銅及び塩化銅の捕捉能と同様の捕捉能（最大 14- 16nniol/ing d ry ce l l ) を得た。これらの値は酵母の培養培地の pHに影響を受けるが、培地に 50mM HEPES (pH7. 8)を添加することでその影響を防ぐことが可能である。また、酵母の細胞表層から回収された金属ィオンの量と前記上清及び洗浄水から算出された金属イオンの量とがほぼ同程度であったことから、細胞表層からの金属イオンの回収は、菌体の EDTA (pH8. 0)処理により可能であることが分かった。

(2) 重金属耐性能の獲得

本発明の金属捕捉能を有する酵母と対照酵母について、各種濃度の重金属 (CuSO,) 存在下での生存率を測定した。すなわち、各培養時間ごとにサンプルを採取して、 0D₆₍₎。の増加を測定した。

その結果、対照酵母では 2mMの銅イオン濃度で死滅するのに対し、本発明の酵母（ヒスチジンポリペプチドを細胞表層に提示するもの）は、 2 以上でも生育することができた。しかも、 4 という高濃度の金属イオン存在下でも生育することが可能であった。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。産業上の利用可能性

本発明により、細胞表層に金属を捕捉することができる夕質を発現するとができる遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、言. を含む形質転換体が提供される。本発明の形質転換体は重金属を捕捉することができるため、環境浄化剤及び金属回収剤として有用である。配列表フリーテキス卜

配列番号 3 ：合成 DNA

配列番号 4 ：合成ペプチド

配列番号 8 ：合成 DNA

配列番号 9 ：合成 DNA

配列番号 10：合成 DNA

配列番号 Π :合成 DNA

Claims

請求の範囲

I . 分泌シグナルべプチド、金属捕捉能を有するポリべプチド及び細胞表層局在タンパク質をそれぞれコードする DNAを含む融合遺伝子。

2. 分泌シグナルぺプチドが配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項 1記載の融合遺伝子。

3. 分泌シグナルペプチドをコードする DNA が配列番号 1で表される塩基配列を含むものである請求項 1又は 2記載の融合遺伝子。

4. 金属捕捉能を有するポリべプチドが配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項 1記載の融合遺伝子。

5. 金属捕捉能を有するポリペプチドをコードする DNA が配列番号 3で表される塩基配列を含むものである請求項 1又は 4記載の融合遺伝子。

6. 細胞表層局在タンパク質が配列番号 6で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項 1記載の融合遺伝子。

7. 細胞表層局在タンパク質をコードする DNA が配列番号 5で表される塩基配列を含むものである請求項 1又は 6記載の融合遺伝子。

8. 配列番号 7で表される塩基配列を含む、細胞表層に金属捕捉能タンパク質を発現することができる融合遺伝子。

9. 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

1 0. 請求項 9記載の組換えベクターを含む形質転換体。

I I. 形質転換体が形質転換酵母、形質転換動物細胞、形質転換植物細胞、形質転換粘菌又は形質転換昆虫細胞である請求項 10記載の形質転換体。

1 2. 請求項 10又は 11記載の形質転換体を含む環境浄化剤。

1 3. 請求項 10又は 11記載の形質転換体を含む金属回収剤。

14. 請求項 10又は 11記載の形質転換体が充填されたカラム。

1 5. 請求項 14記載のカラムを含む環境浄化装置。

1 6. 金属により汚染された環境物質に、請求項 10又は 11記載の形質転換体を添加することを特徴とする環境浄化方法。

1 7. 金属により汚染された環境物質を、請求項 14記載のカラム又は請求項 15 記載の装置で処理することを特徴とする環境浄化方法。

. 環境物質が海水若しくは淡水、廃水、排ガス又は土壌である請求項 16又は 17記載の環境浄化方法。

. 金属により汚染された環境物質に請求項 10又は 1 1記載の形質転換体を添加し、添加後の形質転換体をキレー卜剤で処理することを特徴とする金属の回収方法。

. 環境物質が海水若しくは淡水、廃水、排ガス又は土壌である請求項 19記載の回収方法。

. キレー卜剤がエチレンジアミンテトラ酢酸である請求項 19又は 20記載の回収方法。