WO2001027254A2 - Gentransfervektoren zur therapie von autoimmunerkrankungen und erkrankungen mit immunpathogenese - Google Patents

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Definitions

  • FIG. 4 graphically shows the result of the reduction in inflammation in the lungs, kidneys and liver in mouse cytomegalovirus-infected mice which were treated before infection with AdFasL-infected antigen presenting cells (APC).
  • B6-gld / gld- and B6- lprllpr-MM.se. were infected with mouse cytomegalovirus and treated 28 days after infection with APCs, either with Ad-CMVLacZ (FasL negative control), with mouse cytomegalovirus (APC + MCMV), with AdFasL (FasL positive control) or with mouse cytomegalovirus and AdFasL (MCMV + AdFasL) were infected.
  • Ad-CMVLacZ FesL negative control
  • APC + MCMV mouse cytomegalovirus
  • AdFasL FesL positive control
  • MCMV + AdFasL mouse cytomegalovirus and AdFa
  • eukaryotic promoter elements such as the CMV promoter and the SV40 promoter are represented by dark arrows, prokaryotic promoters such as the SP6 and the T7 promoter are represented by thin angled arrows.
  • Interfaces for selected restriction endonucleases such as Bam ⁇ l, EcoRI, Xh ⁇ l and HincfiR are marked with the identification of the nuclease. are marked by thin bars regulatory nucleic acid sequences such as the polyadenylation sequence of the SV40 virus (SV40polyA) and the LRES, the internal ribosome binding site.
  • the cells modified by means of the vectors according to the invention comprising the combination of nucleic acid sequences according to the invention, express antigens which are recognized by immunopathogenic immune cells.
  • immunopathogenic immune cells play a special role in the pathogenesis of a defined disease, since they specifically recognize (endogenous) antigens and coordinate an immune reaction against these antigens and the antigen-expressing cells.
  • the antigens introduced into the cells with the vectors according to the invention can be specific for certain diseases or specific for the attacked organ, tissue or the attacked cell type.
  • the vectors according to the invention additionally code for ligands which trigger apoptosis. These ligands that trigger apoptosis induce natural cell death in the immunopathogenic immune cells that recognize the antigens.
  • Retroviruses particularly suitable for the production of retroviral gene transfer vectors include representatives from the group of avian leukemia viruses, bovine leukemia viruses, mouse leukemia viruses, Mink-ce // ocw5-inducing viruses, mouse sarcoma viruses, Gibbon viruses. Leukemia viruses, feline leukemia viruses, reticuloendothelial viruses and Rous sarcoma viruses. Mouse leukemia viruses such as representatives 4070A and 1504A, Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten, are particularly suitable. Harvey's Sarcoma Virus and Rauscher (ATCC No.
  • the nucleic acids can include retroviral gene transfer vectors
  • the expanded packaging signal from Mo-MLV contains sequences beyond nucleotide 567, the start of the Gag / Pol gene (nucleotide 621) and ends beyond nucleotide 1560. Therefore, deletion of the sequence beyond nucleotide 567 allows a retroviral from the Mo-MLV
  • Rheumatoid artritis was one of the first systemic diseases that was attributed to autoimmune mechanisms. Essentially two aspects of rheumatoid artritis suggest a fundamental immune system disorder as the cause of the disease. First, the often very massive infiltration of lymphocytes, including CD4 + T cells, in the inflamed hypertrophic synovial tissue, and second, the production of large amounts of rheumatoid factor from B cells and plasma cells in the synovium. Rheumatoid factors are antibodies that are directed against structuring regions of the IgG heavy chain.
  • Antibodies against various autoantigens have been detected in prediabetic patients and those with recently diagnosed diabetes.
  • CD4 + and CD8 + T cells with different specificity were detected.
  • the gene therapy vectors within the scope of the invention described here carry functional areas or genes which code and express for antigenic proteins, protein fragments or epitopes and combinations of epitopes which represent targets for CD4 + and / or CD8 + T cells.
  • Antigenic proteins in the sense of this invention are those proteins which are recognized by T cells of persons with diabetes in connection with MHC class I or MHC class II on syngeneic cells.
  • the heat shock protein Hsp60 represents another target for activated immune cells in type I diabetes.
  • the vectors encode and express, for example, the area of AS 437-460
  • Caspases are a group of cysteine proteases. So far, 14 caspases have been identified in mammals (including humans). Caspases recognize motifs consisting of 4 amino acids, which they cut on the carboxyl side of the amino acid aspartate. Caspases are synthesized as zymogens, i.e. they are precursor proteins with a very low activity, which are activated by proteolytic cleavage. The activated enzymes are heterotetramers, each consisting of two identical cleaved subunits. Some caspases are activated by autoproteolytic cleavage, others by additional caspases.
  • the vectors according to the invention can comprise nucleic acid sequences which code for the protein TRAIL (APO-2L) which binds to the specific receptor molecules TRAIL-Rl (DR4), TRAIL-R2 (KILLER, DR5, TRICK2), TRAIL-R3 (LIT, DcRl ) and TRAIL-R4 (TRUNDD, DcR2) binds.
  • TRAIL has been detected naturally on a number of cells, such as type II interferon-stimulated monocytes, cytomegalovirus-infected fibroblasts, type I interferon and antigen-stimulated T cells or NK cells.
  • the vectors according to the invention either synthesize a single antisense RNA or a combination of different antisense RNAs which are specifically directed against individual adapter proteins.
  • the vectors express an antisense RNA which contains individual regions which are in each case specific for an adapter protein and, in combination, prevents the expression of several adapter proteins.
  • the prodrugs used must have significantly lower toxicity than the activated substances and must be good substrates for the activating enzymes. In addition, these substances must be sufficiently chemically stable under physiological conditions and have good pharmacological and pharmacokinetic properties. Depending on the type, some prodrugs are absorbed into the cells and converted intracellularly into the toxic substance. Other prodrugs are activated extracellularly. Accordingly, the prodrugs or the activated toxic substances must be easily absorbed by the cells.
  • sequences and functional regions can also be transcription termination and polyadenylation sequences.
  • Some very efficient poly-A signals for use in mammalian expression vectors are derived, for example, from the bovine growth hormone, the mouse ⁇ -globin, the SV40 early transcription unit and the herpes simplex thymidine kinase gene. Prokaryotic transcription terminators are described in detail and their incorporation shows diverse positive effects on gene expression. In eukaryotes identified a consensus sequence with the nucleotide sequence ATC AAA (A7T) TAG GAA GA in the termination region of 9 genes.
  • An internal ⁇ bosomal entry point can be used to express two or more genes under the transcriptional control of a consumable or regulable promoter.
  • IRES internal ⁇ bosomal entry point
  • the IRES of picornaviruses and the hepatitis C virus, the BiP (immunoglobulin heavy chain binding protein) are used.
  • retroviral 7i? ES sequences are used
  • Lymphocytes accessory cells and effector cells are the most prominent representatives of the acquired immune system. Lymphocytes are able to specifically recognize foreign antigens and to stimulate a specific humoral and cell-mediated immune response. Different subpopulations of lymphocytes are known which differ in the type of antigen recognition and the specific effector functions. B lymphocytes are the producers of antibodies. They recognize extracellular and antigens presented on the surface of cells and differentiate into antibody-secreting plasma cells after contact with an antigen. T lymphocytes, the mediators of the cell-mediated immune response, can be divided into several subtypes, of which the CD4 + T helper cells and the CD8 ⁇ cytotoxic T cells are most significant. Helpers and cytotoxic T cells have a restricted specificity for antigens.
  • the region coding for the thymidine kinase was first cloned into the vector pcDNA3 via the interfaces for Hz «dIII and BamKl. Then the fragment coding for crmA was used via them interfaces of Bam ⁇ l and Xhol. Finally, the nucleic acid fragment comprising the ERES was cloned between FasL and PLP via the recognition sequence for Bam ⁇ l.
  • the nucleic acid sequences of the two vectors pcDNA3-FasL-ERES-crmA and pcDNA3-TK-ERES-PLP are listed as SEQ ED NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Gentransfervektor, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nukleinsäuresequenz, kodierend für einen oder mehrere apoptoseauslösende(n) Liganden, eine zweite Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antigen(e) und gegebenenfalls, eine dritte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antiapoptosemolekül(e), und gegebenenfalls eine vierte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Suizidenzym(e).

Description

Gentransfervektoren zur Therapie von Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen mit Immunpathogenese
Die Erfindung betrifft einen Gentransfervektor, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nukleinsäuresequenz, kodierend für einen oder mehrere apoptoseauslösende(n) Liganden, eine zweite Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antigen(e) und gegebenenfalls, eine dritte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antiapoptosemolekül(e), und gegebenenfalls eine vierte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Suizidenzym(e).
Die Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Multiple Sklerose (MS) oder Diabetes (Typ 1 ) beruht auf einer unkontrollierten Aktivierung von Immunzellen, die gesunde
Zellen des Körpers angreifen und zerstören. Entscheidend beteiligt an der Pathogenese von
Autoimmunerkrankungen sind T-Lymphozyten, die Fragmente körpereigener Proteine im
Zusammenhang mit körpereigenen MHC (major histocompatibility com/?/ex)-Molekülen erkennen. T-Helferzellen (CD4" / CD8"), die eine Kombination aus Peptid und MHC Klasse II erkennen, haben eine Schlüsselfunktion in der Immunpathogenese, da sie durch Sekretion unterschiedlicher Zytokine die Induktion der autoreaktiver Antikörper und Immunzellen stimulieren. Proteine zellulären oder viralen Ursprungs, die in Zellen synthetisiert werden, werden intrazellulär in Proteasomen degradiert und zusammen mit MHC Klasse I Molekülen auf der Zelloberfläche den T-Lymphozyten präsentiert. Diese Zellen werden durch zytolytische T- Zellen (CD4" / CD8+) spezifisch erkannt und eliminiert.
Normalerweise werden T-Zellen, die körpereigene Proteine erkennen, entweder eliminiert
(klonale Deletion) oder inaktiviert (Anergie). Die Folge ist eine Toleranz gegen Zellen und
Strukturen des eigenen Körpers. Bei Autoimmunerkrankungen ist diese Toleranz gestört oder unzureichend. Autoimmunerkrankungen werden möglicherweise durch virale oder bakterielle Infektionen ausgelöst. Man nimmt an, daß aufgrund von Ähnlichkeiten zwischen erreger- und zelltypspezifischen Proteinen auch uninfizierte Zellen durch erregerspezifische Antikörper oder T-Zellen angegriffen werden. Im Zusammenhang mit chronisch persistierenden Virusinfektionen kommt es auch zu entzündlichen Prozessen, die zum Teil lebenswichtige Organe wie die Leber (Hepatitis) betreffen, obwohl die Immunantwort primär gegen erregerspezifische Strukturen gerichtet ist. In solchen Fällen spricht man von Immunpathogenese, da der Schaden und die Symptome primär durch das eigene Immunsystem und nicht durch den Erreger verursacht werden. Vergleichbares findet bei der Abstoßung von transplantierten Organen statt. Hier wird eine Kombination aus fremden MHC-Molekülen des Spenders, komplexiert mit prozessierten zellulären Proteinen, von den T-Zellen des Empfängers als fremd erkannt.
Eine Therapie von Autoimmunerkrankungen und anderen Erkrankungen mit Immunpathogenese erfolgt nach heutigem Wissen durch eine starke Immunsuppression und / oder durch Gabe regulatorisch wirksamer Zytokine wie beispielsweise Interferon-ß. Für die klassische Chemotherapie mit Immunsuppressiva stehen eine Vielzahl unterschiedlicher Präparate verschiedener Hersteller zur Verfügung, die sich im Anwendungsbereich und der Wirkungsweise gravierend unterscheiden. Ein besonders schwerwiegender Nachteil dieser Substanzen ist das Auftreten vielfältiger und zum Teil lebensbedrohlicher Nebenwirkungen (u.a. Nierenschädigung, Leberschädigung, Bauchspeicheldrüsenentzündung, Blutarmut, Fieber), die bei einer Vielzahl der Patienten beobachtet werden. Eine solche unspezifische Hemmung des Immunsystems (z.B. durch Cyclosporin oder FK506) führt nicht nur zu einer stark geschwächten Immunabwehr und damit zu einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionserkrankungen, sondern begünstigt auch die Entstehung von Tumoren. So ist beispielsweise nach Organtransplantationen, wo eine lebenslange Immunsuppression erforderlich ist, das Risiko, an Epstein-Barr-Virus-assoziierten Tumoren zu erkranken, um ein Vielfaches erhöht. Die Verwendung von Immuntherapeutika (z.B. Interferone) stellt eine deutliche Verbesserung zur klassischen Chemotherapie dar, da sie weniger Nebenwirkungen aufweist. Dennoch ist eine Heilung der Autoimmunerkrankungen auch mit diesen neuartigen Immuntherapeutika nicht möglich, da sie nicht spezifisch wirken.
Antigenpräsentierende Zellen (APCs) spielen eine wichtige Rolle sowohl in der Auslösung einer T-Zell-Antwort als auch in der Induktion einer T-Zell-Toleranz. Die Induktion einer umfassenden Aktivierung und Vermehrung von T-Zellen ist von zwei Signalen abhängig, die die T-Zelle empfangen muß. Das erste Signal wird durch den T-Zellrezeptor, der ein Antigen im Zusammenhang mit MHC auf der Oberfläche von APCs erkennt, in die T-Zelle geleitet. In Abwesenheit des zweiten Signals, des so genannten kostimulatorischen Signals, wird die T-Zelle anerg. Anergie beschreibt einen Zustand, in dem die T-Zellen weder reaktiv sind, noch sich vermehren. APCs sind außerdem in der Lage, die Funktion der T-Helferzellen zu beeinflussen und deren Eigenschaften entweder in Richtung Th(T-Helferzelle)l- oder Th2-Phänotyp zu lenken, und dadurch beispielsweise die Entstehung von Autoimmunerkrankungen zu begünstigen. Die Kombination der unterschiedlichen Funktionen der antigenpräsentierenden Eigenschaften der APCs entscheidet über des Profil der Antwort der T-Helferzelle. Daher können APCs steuern ob eine Immunantwort immunogen oder tolerogen verläuft.
Fas wird auf der Oberfläche von Zellen exprimiert und vermittelt Apoptose nach Wechselwirkung mit dem spezifischen Liganden FasL bzw. nach Bindung eines agonistisch wirksamen anti-Fas-Antikörpers. Der so genannte ,^ictivation-induced Cell Death" (AICD) von T-Zellen, d.h. deren programmierter Zelltod nach Aktivierung der Zellen, wird durch eine autokrine Rückkoppelung nach Wechselwirkung von Fas und FasL auf ein und der selben aktivierten T-Zelle ausgelöst, was die Bedeutung der Fas-assoziierten Apoptose für die Aufrechterhaltung der T-Zelltoleranz unterstreicht.
Die Fas-vermittelte Apoptose von APC spielt eine Rolle bei der Herabregulierung von Immunantworten. Aktivierte T-Zellen exprimieren erhöhte Mengen an Fas-Ligand und induzieren so Apoptose in den APCs. Andererseits exprimieren auch aktivierte Makrophagen Fas-Ligand und können ihrerseits Apoptose in den T-Zellen induzieren. So wird zum Beispiel eine große Menge von Fas-Ligand auf HIV-mfιzierten Makrophagen mit der Depletion von HIV-spezifischen CD4+ T-Zellen in Verbindung gebracht.
Die Bedeutung der Fas-abhängigen Apoptose für die Aufrechterhaltung der T-Zelltoleranz und der Vermeidung von Autoimmunerkrankungen wurde u.a. dadurch gezeigt, daß Mutationen, die die Gene für Fas bzw. den Liganden von Fas, FasL, betreffen, zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen in Iprllpr bzw. gld/gld-Mäusen führen, gldlgld bzw. Iprllpr bezeichnet Mäuse, die homozygot für inaktivierende Mutationen für FasL bzw. für Fas sind. Sowohl die klonale Deletion von T-Zellen in der Peripherie, sowie die Aufrechterhaltung der T-Zelltoleranz gegen körpereigene Antigene (Autoantigene) und Superantigene ist in /p/V pr-Mäusen gestört. Eine Korrektur des Fas-assoziierten Apoptose-Defektes in den T-Zellen durch ein künstlich in die Zellen eingebrachtes und exprimiertes Fas-Gen kann die Entstehung von Autoimmunerkrankungen in pr//pr-Mäusen verhindern.
Fas-vermittelte Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung immunprivilegierter Stellen im Körper. Der immunprivilegierte Zustand der Hoden und der vorderen Augenkammer erfordern eine starke Expression von Fas-Ligand auf den entsprechenden parenchymalen Zellen dieser Organe. In diesen Fällen wird angenommen, daß die Expression von Fas-Ligand auf den parenchymalen Zellen diese Gewebe vor der Zerstörung durch T-Zellen durch Induktion der Apoptose in den T-Zellen schützt. Eine Virusinfektion in der vorderen Augenkammer führt zu einer systemischen T-Zelltoleranz gegen das Virus. Es wird angenommen, das APCs, die den Fas-Liganden zusammen mit priviligierten Antigenen, die von den priviligierten Zellen stammen, auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, Apoptose von T-Zellen in der Peripherie des Körpers induzieren, und dadurch eine systemische T-Zelltoleranz verursachen.
Im Jahre 1998 wurde erstmals von Zhang et al. (Zhang et al. (1998) Nat Biotechnol 16:1045- 1049) die Induktion einer antigenspezifischen T-Zelltoleranz mittels Fas-Ligand (FasL) - produzierender antigenpräsentierender Zellen (APC) im Mausmodell gezeigt. Mittels antigenpräsentierender Zellen, die durch Infektion mit einem adenoviralen Vektor, der neben FasL auch für adenovirale Proteine kodierte, konnte in Mäusen eine T-Zelltoleranz erzeugt werden. Die T-Zelltoleranz war spezifisch für Adenovirusproteine und zeigte keinen Einfluß auf eine Infektion mit Maus-Zytomegalievirus. Mit den APCs behandelte Mäuse zeigten bei einer nachfolgende Infektion mit einem Adenovirus eine deutlich verlängerte Persistenz des Virus in der Leber, in Übereinstimmung mit einer reprimierten T-Zellantwort gegen adenovirusinfizierte Zellen. Ferner war die T-Zelltoleranz abhängig von der Funktion des Fas-Liganden, da in Fasnegativen Mäusen keine Toleranz induziert werden konnte. Ein Jahr später wurden von der selben Arbeitsgruppe Experimente zur Induktion einer T-Zelltoleranz gegen Alloantigene ebenfalls im Mausmodell veröffentlicht (Zhang et al. (1999) J Immunol 162:1423-1430). Wiederum ein Jahr später veröffentlichte die Arbeitsgruppe Experimente, die zeigten, daß mittels FasL-exprimierender antigenpräsentierender Zellen chronisch entzündliche Erkrankungen wie sie beispielsweise nach einer Infektion von Fas-defizienten Mäusen mit Maus-Zytomegalievirus auftreten, verhindert bzw. therapiert werden können (Zhang et al. (2000) J Clin Invest 105:813- 821). Auch in diesem experimentellen Ansatz beruhte die Therapie auf der Induktion einer antigenspezifischen, hier Maus-Zytomegalievirus-spezifischen, T-Zelltoleranz. Zhang et al. verwendete für die beschriebenen Experimente adenovirale Vektoren, die den Vorteil einer hohen Infektionsrate und eine gute Genexpression gewährleisten.
Adenovirale Vektoren besitzen aber gerade für die Anwendung am Menschen entscheidende Nachteile, an erster Stelle die Expression von antigenen viralen Proteinen, die Gentherapieansätze mit adenoviralen Vektoren bislang zum Scheitern brachten. Da adenovirale Vektoren regulatorische und Strukturproteine exprimieren, werden die transduzierten Zellen durch das Immunsystem unabhängig von den gezielt exprimierten Antigenen erkannt und eliminiert. Um diese Reaktion zu vermeiden wurden die im Experiment beschriebenen Mäuse zuvor mit entsprechenden FasL-positiven APCs, die adenovirale Proteine exprimierten, gegen adenovirale Proteine tolerant gemacht. Ein entsprechender Ansatz, das Immunsystem gegen einen potentiellen viralen Erreger tolerant zu machen, ist für Menschen ungeeignet.
Unberücksichtigt blieb bei den beschriebenen Experimenten das Problem der autokrinen Induktion der Apoptose durch Wechselwirkung der künstlich exprimierten FasL-Moleküle mit den entsprechenden Apoptoserezeptoren auf der Oberfläche der APCs. In den Experimenten von Zhang et al. (Zhang et al. (1998) Nαt Biotechnol 16:1045-1049; Zhang et al. (1999) J Immuno l 162:1423-1430; Zhang et al. (2000) J Clin Invest 105:813-821) wurden Fas-defiziente APCs mit den Fas-Ligand-exprimierenden Vektoren infiziert. Für eine effiziente therapeutische Anwendung ist es dringend erforderlich, die veränderten antigenpräsentierenden Zellen gegen eine autokrine Stimulation der Apoptose zu schützen und zugleich eine unkontrollierbare Immortalisierung oder gar eine Transformation der Zellen in die Richtung einer Tumorzelle vermeiden zu können.
Unberücksichtigt blieb in allen bisherigen Experimenten ferner die Problematik einer unbeabsichtigten Stimulation des Immunsystems durch die Expression des Antigens, für das eine T-Zelltoleranz induziert werden soll, ohne einer gleichzeitigen Expression apoptoseauslösender Liganden.
Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Mitteln zur Prävention oder Therapie von Autoirnmunerkrankungen und Erkrankungen mit Immunpathogenese. Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.
Figur 1 zeigt graphisch die Ergebnisse einer Infektion von Maus-Makrophagen mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert. Makrophagen von CD95-defϊzienten B6-Mäusen wurden gereinigt und mit Adenoviren infiziert, die entweder LacZ (AdLacZ, Ad/CV; FasL-Kontrolle) oder FasL (AdFasL, Ad/FL) exprimierten. (A) Mittels FACS wurde die Expression von FasL auf AdFasL-infizierten und nicht-infizierten Makrophagen untersucht. Das Histogramm zeigt die Anzahl der infizierten Zellen und die Stärke der FasL-Expression (Y-Achse, Zahl der fluoreszierenden Zellen; X-Achse, Stärke der Fluoreszenz, bestimmt mittels eines Fluoreszenzgekoppelten anti-FasL- Antikörpers). (B) 5 lCr-Freisetzungstest zur Bestimmung der Fähigkeit der infizierten, FasL-exprimierenden Zellen, die Apoptose in Zielzellen zu induzieren. Die mit den beiden unterschiedlichen Adenoviren infizierten Makrophagen bzw. nicht-infizierte Kontroll- Makrophagen wurden mit Chrom-markierten, Fas+ Zielzellen (A20-Zellen) inkubiert und die Lyse der Zielzellen durch die Freisetzung von 51 Chrom in den Kulturüberstand quantifiziert. Counts: Zahl der FasL-exprimierenden Zellen; FL2-H/PE: Stärke der FasL-Expression; Spezifische Lyse (%): Freisetzung von 51 Chrom, relativ zu einer Positivkontrolle mit maximaler 51 Chrom-Freisetzung durch Lyse der Zellen mittels SDS; E/T- Verhältnis: Verhältnis von Effektor-Zellen (infizierte Makrophagen) zu Zielzellen (A20-Zellen); M0-Ad/CV: Makrophagen, infiziert mit AdLacZ (Adenovirus, das LacZ exprimiert); M0 -Ad/FL: Makrophagen, infiziert mit Ad-FasL (Adenovirus, das FasL exprimiert); M0-FL: Makrophagen, transfiziert mit einem FasL-exprimierenden Plasmid;
Figur 2 zeigt graphisch das Ergebnis der Hemmung der allogenen Stimulation von T-Zellen durch FasL-exprimierende antigenpräsentierende Zellen. Makrophagen wurden von B6-lpr/lpr- Mäusen isoliert und mit Adenoviren infiziert, die entweder LacZ (AdLacZ) oder FasL (AdFasL) exprimierten. Die infizierten Makrophagen wurden entweder mit T-Zellen von (A) Fas- exprimierenden B6-+/+-Mäusen oder (B) Fas-defizienten B6-lpr/lpr-Mäusen kokultiviert und die Stimulation der T-Zellen durch den Einbau von 3H-Tymidin gemessen (Mixed Lymphocyte Reaktion, MLR). M0-CV: Makrophagen, infiziert mit AdLacZ (Adenovirus, das LacZ exprimiert); M0-FL: Makrophagen, infiziert mit Ad-FasL (Adenovirus, das FasL exprimiert). Figur 3 zeigt graphisch das Ergebnis einer quantitative Analyse der Entzündungsreaktion in der Lunge, der Niere und der Leber. B6+ + und B6-gld/gld-Mäuse wurden intraperitoneal mit Maus- Zytomegalievirus infiziert (1 x lO3 pfu) und anschließend der Grad der Entzündung und der Gewebeschädigung in der Lunge (obere Tafel), der Niere (mittlere Tafel) und der Leber (untere Tafel) nach einer relativen Skala von 0 (keine Entzündung bzw. Schädigung) bis 4 (stärkste Entzündung bzw. Schädigung) eingeteilt. Die Balken in der Darstellung repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung der Ergebnisse von mindestens 5 Mäusen zu jedem Untersuchungszeitpunkt.
Figur 4 zeigt graphisch das Ergebnis der Verringerung der Entzündungen in der Lunge, der Niere und der Leber in Maus-Zytomegalievirus-infizierten Mäusen, die vor der Infektion mit AdFasL-infizierten antigenpräsentierenden Zellen (APC) behandelt wurden. B6-gld/gld- und B6- lprllpr-MM.se. wurden mit Maus-Zytomegalievirus infiziert und 28 Tage nach der Infektion mit APCs behandelt, die entweder mit Ad-CMVLacZ (FasL-Negativkontrolle), mit Maus- Zytomegalievirus (APC + MCMV), mit AdFasL (FasL-Positivkontrolle) oder mit Maus- Zytomegalievirus und AdFasL (MCMV + AdFasL) infiziert wurden. Die Mäuse wurden alle drei Tage vier mal mit den APCs behandelt, und vier Wochen nach dem Beginn der APC-Therapie untersucht. Lunge, Niere und Leber wurden mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt und von drei unabhängigen Personen bewertet. Die Balken in der Darstellung repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung der Entzündungsreaktion der verschiedenen Organe für die unterschiedlich behandelten Mäuse. Lunge-gld bzw. Lunge-lpr: Lunge von B6-gld/gld bzw. /pr//pr-Mäusen; Leber-gld bzw. Leber-lpr: Leber von B6-gld/gld bzw. pr//pr-Mäusen; Niere-gld bzw. Niere-lpr: Niere von B6-gld/gld bzw. /pr//pr-Mäusen; APC-AdLacZ: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das LacZ exprimiert; APC+MCMV: antigenpräsentierende Zellen, infiziert mit Maus-Zytomegalievirus; APC-AdFasL: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; APC-AdFasL+MCMV: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit Maus-Zytomegalievirus und mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; * bezeichnet Mittelwerte, die bezüglich eines Konfidenzintervalls von 95 % (P < 0,05) signifikant von der Kontrollgruppe abweichen.
Figur 5 zeigt graphisch das Ergebnis eines Experimentes zu Ermittlung der Menge an reaktiven T-Zellen spezifisch für Maus-Zytomegalievirus von Zytomegalievirus (MCMV) -infizierten Mäusen, die vor der Infektion mit AdFasL-infizierten antigenpräsentierenden Zellen (APC) behandelt wurden. B6- pr//pr-Mäuse wurden mit Maus-Zytomegalievirus infiziert und wie in Figur 4 beschrieben mit unterschiedlichen APCs therapiert. Von den MCMV-infizierten Mäusen wurden 4 Wochen nach APC-Therapie Milzzellen isoliert. Die T-Zellen wurden in vitro mit MCMV-infizierten APCs stimuliert und nach 48 Stunden der IL-2-haltige Überstand isoliert. APC-AdLacZ: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das LacZ exprimiert; APC-AdFasL: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; APC-AdFasL+MCMV: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit Maus- Zytomegalievirus und mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; * bezeichnet Mittelwerte, die bezüglich eines Konfidenzintervalls von 95 % (P < 0,05) signifikant von der Kontrollgruppe abweichen.
Figur 6 zeigt graphisch das Ergebnis einer verringerter Produktion von Autoantikörpern in Zytomegalievirus (MCMV)-infizierten Mäusen, die vor der Infektion mit AdFasL-infizierten antigenpräsentierenden Zellen (APC) behandelt wurden. B6-gld/gld-Mäuse wurden mit Maus- Zytomegalievirus infiziert und wie in Figur 4 beschrieben mit unterschiedlichen APCs therapiert. Von den MCMV-infizierten Mäusen wurden 4 Wochen nach APC-Therapie Seren gewonnen. RF IgGl : Rheumafaktor; ds-DNA IgGl : Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA; APC- AdLacZ: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das LacZ exprimiert; APC-AdFasL: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; APC-AdFasL+MCMV: antigenpräsentierende Zellen infiziert mit Maus- Zytomegalievirus und mit einem Adenovirus, das FasL exprimiert; * bezeichnet Mittelwerte, die bezüglich eines Konfidenzintervalls von 95 % (P < 0,05) signifikant von der Kontrollgruppe abweichen.
Figur 7 zeigt humane Makrophagen, die mit einem Adenovirus, das LacZ exprimiert, infiziert wurden. Die virusinfizierten Makrophagen wurden mit einer X-Gal-Färbung identifiziert, die ß- Galaktosidase (LacZ) mittels deren katalytischen Eigenschaften in den infizierten Zellen nachweist.
Figur 8 zeigt graphisch die Ergebnisse eines Experimentes zum Nachweis des modulierenden Einflusses von IL-10 und Tumornekrosefaktor (TNF) auf die Funktion Dentritischer Zellen (DC) als antigenpräsentierende Zellen. Aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes wurden durch Behandlung mit IL-4 und GM-CFS in vitro Dentritische Zellen generiert. Die DCs wurden entweder mit TNF oder mit IL-10 behandelt und anschließend mit allogenen T-Zellen inkubiert und die Stimulation und Vermehrung der T-Zellen durch den Einbau von 3H-markiertem Thymidin gemessen. APC: antigenpräsentierende Zellen; DC (TNF): Dentritische Zellen, stimuliert mit Tumornekrosefaktor (TNF); DC (IL-10): Dentritische Zellen, stimuliert mit Interleukin-10 (IL-10); allo T cells: T-Zellen eines Spenders mit allogenem MHC-Muster, d.h. von den DCs abweichendem MHC-Muster. Die X-Achse zeigt die Menge an APCs, die in die Reaktion eingesetzt wurden. Die Y-Achse zeigt die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) als Maß für den Einbau des radioaktiv-markierten Nukleotids bzw. als Maß für die Stimulation der T-Zellen.
Figur 9 zeigt graphisch die Ergebnisse eines Experimentes zum Nachweis einer allogenspezifischen Suppression durch tolerisierende antigenpräsentierender Zellen (APC). Aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes wurden durch Behandlung mit IL-4 und GM-CFS in vitro Dentritische Zellen generiert. Die DCs wurden entweder mit TNF oder mit IL-10 behandelt und anschließend mit allogenen T-Zellen inkubiert. Fünf Tage später wurden die T- Zellen aus dieser Reaktion mit antigenpräsentierenden Zellen eines dritten allogenen Spenders inkubiert und die Stimulation und Vermehrung der T-Zellen durch den Einbau von 3H- markiertem Thymidin gemessen. A, B und C bezeichnen Spender mit unterschiedlichen (allogenen) MHC-Mustern; MLR: Mixed Lymphocyte Reaction. Die Y-Achse zeigt die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) als Maß für den Einbau des radioaktiv-markierten Nukleotids bzw. als Maß für die Stimulation der T-Zellen. Unter den einzelnen Balken ist die Zusammensetzung der ersten Stimulationsreaktion (1. MLR) und der zweiten Reaktion (2. MLR) angegeben.
Figur 10 zeigt schematisch den Aufbau der erfindungsgemäßen Vektoren (A) pcDNA3-TK- IRES-crmA und (B) pcDNA3-FasL-IRES-PLP,. Kodierende Leserahmen wie die Nukleinsäuresequenz für den Fas-Liganden (FasL), das Proteolipidprotein (PLP), die Thymidinkinase (TK) und crmA, sowie für Resistenzproteine wie Neomycin und Ampicilin sind mit hellen Pfeilen eingezeichnet. Regulatorisch aktive, eukaryotische Promotorelemente wie der CMV-Promotor und der SV40-Promotor sind durch dunkle Pfeile dargestellt, prokaryotische Promotoren wie der SP6- und der T7-Promotor sind durch dünne abgewinkelte Pfeile dargestellt. Schnittstellen für ausgewählte Restriktionsendonukleasen wie BamΑl, EcoRI, Xhόl und HincfiR sind mit der Kennzeichnung der Nuklease markiert. Durch dünne Balken markiert sind regulatorische Nukleinsäuresequenzen wie die Polyadenylierungssequenz der SV40- Virus (SV40polyA) und die LRES, die interne Ribosomenbindungsstelle.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" oder "Gentransfervektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Organismen und Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren in Zellen. Vektoren sind beispielsweise Viren, wie Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Pockenviren, Alphaviren oder Herpesviren. Vektoren sind beispielsweise auch Bakterien, wie Listerien, Shigellen, oder Salmonellen. Vektoren sind beispielsweise auch Liposomen oder nackte DNA, wie bakterielle Plasmide, von Viren abgeleitete Plasmide, Phagemide, Cosmide, Bakteriophagen oder künstlich hergestellte Nukleinsäuren wie artifizielle Chromosomen.
Der hier verwendete Ausdruck "Apoptoserezeptor" bezeichnet Polypeptide, die in der Zytoplasmamembran von Zellen lokalisiert sind, und die nach einer Wechselwirkung und Aktivierung durch einen spezifischen Liganden die Apoptose in der Zelle einleiten. Ein beispiel für Apoptoserezeptoren sind Polypeptide, die zur Unterfamilie von Tumornekrosefaktor- Rezeptoren gehören, die durch zytoplasmatische Todesdomänen gekennzeichnet sind, z.B. CD95 / Fas / Apol, TRAIL-Rl, TRAIL-R2 oder Apo3.
Der hier verwendete Ausdruck "Ligand" oder "apoptoseauslösender Ligand" oder "Apoptoseligand" bezeichnet ein membranständiges Polypeptid, das mit Apoptoserezeptoren wechselwirken kann. Durch die Bindung der Liganden an die Apoptoserezeptoren werden die Rezeptoren aktiviert und die Apoptose in den Zellen, die die Rezeptoren tragen, induziert. Apoptoseliganden sind beispielsweise CD95L / FasL / ApolL, TRAIL oder Apo3L.
Der hier verwendete Ausdruck "Antiapoptosemoleküle" bezeichnet Polypeptide, die in der Zelle die Apoptose hemmen. Diese Polypeptide können zellulären oder viralen Ursprungs sein. Antiapoptosemoleküle bezeichnen ferner Nukleinsäuremoleküle, umfassend Nukleinsäuren, die komplementär zu Nukleinsäuren sind, die für apoptoseauslösende Polypeptide kodieren.
Der hier verwendete Ausdruck "Antigen" bezeichnet Polypeptide, die entweder ein vollständiges Protein oder Teile eines Proteins umfassen, die einzelne oder mehrere T-Zell-Epitope einschließen, und nach proteolytischer Aufarbeitung durch die Zelle von MHC-Molekülen präsentiert und von T-Zellrezeptoren gebunden werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Suizidenzym" bezeichnet Polypeptide, die gering oder nicht toxische Substrate in toxische Substanzen umwandeln oder so verändern, daß sie von Enzymen der Zelle verwendet oder umgewandelt werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "IRES" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen von Viren, die eine Bindung von funktionell aktiven Ribosomen unabhängig von den zellulären Regulationssequen- zen wie beispielsweise der 5'-Cap-Struktur ermöglichen. IRES-Sequenzen sind durch eine starke Sekundär Struktur gekennzeichnet. IRES-Sequenzen wurden beispielsweise bei Picornaviren beschrieben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, in Fällen von Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen mit Immunpathogenese eine gezielte, antigenspezifische Immuntherapie zu ermöglichen. Einzelne T-Zell-Klone mit definierter Spezifität für zelluläre oder erregerspezifische Proteine sollen eliminiert und so eine immunologische Toleranz gegen ein Antigen erzeugt bzw. wieder hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft einen Gentransfervektor, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nukleinsäuresequenz, kodierend für einen oder mehrere apoptoseauslösende(n) Liganden, eine zweite Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antigen(e) und gegebenenfalls, eine dritte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antiapoptosemolekül(e), und gegebenenfalls eine vierte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Suizidenzym(e). Bevorzugt ist ein Gentransfervektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die ersten drei, oder alle vier, oder die ersten zwei und die vierte Nukleinsäuresequenzen. Ferner bevorzugt ist ein Gentransfervektor, umfassend zwei Nukleinsäuremoleküle, wobei die erste und zweite Nukleinsäuresequenz auf einem ersten Nuklemsäuremolekül und die dritte und vierte Nukleinsäuresequenz auf einem zweiten Nukleinsäuremolekül vorkommen. Besonders bevorzugt ist ein Gentransfervektor, wobei die erste und zweite Nukleinsäuresequenz so funktional miteinander verbunden ist, daß die Expression der zweiten Nukleinsäuresequenz von der Expression der ersten Nukleinsäuresequenz abhängig ist, und/oder die dritte und vierte Nukleinsäuresequenz so funktional miteinander verbunden ist, daß die Expression der vierten Nukleinsäuresequenz von der Expression der dπtten Nukleinsäuresequenz abhängig ist.
Die erfindungsgemäßen Gentransfervektoren können zur Therapie von Autoimmunerkrankungen und anderen Erkrankungen, die auf Immunpathogenese beruhen, verwendet werden. Immunpathogenese bedeutet eine Schädigung von Zellen, Geweben oder Organen durch zelluläre oder humorale Immunmechamsmen, d. h. durch Lymphozyten oder Antikörper oder Komplement-vermittelte Mechanismen. Die erfindungsgemäßen Vektoren können dazu verwendet werden, Zellen des Körpers ex vivo auf gentechnischem Wege zu verändern Durch diese Gentherapievektoren erhalten die zu modifizierenden Zellen eine Reihe neuer Eigenschaften, die sie dazu geeignet machen, Autoimmunerkrankungen und andere Erkrankungen, die auf Immunpathogenese beruhen, zu therapieren. Im Sinne dieser Erfindung bedeutet geeignet, daß die modifizierten Zellen in der Lage sind, die Immunzellen, die an der Pathogenese beteiligt sind, anzulocken, spezifisch zu erkennen und diese durch Auslösen der Apoptose zu zerstören.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können auf einer Vielzahl heute verfügbarer Vektorsysteme beruhen, die in der Lage sind, eine Reihe unterschiedlicher Gene bzw. funktioneller Bereiche zu tragen und die entsprechenden Genprodukte in eukaryoten Zellen zu expπmieren. Im Falle von Vektoren, die auf viralen Systemen basieren, werden Nukleinsäuresequenzen in diese Vektoren mit Hilfe von Verpackungszellimen oder anderen, in vztro-Systemen verpackt. Die Vektoren können dann entweder aktiv in die Zellen eindringen oder von ihnen aufgenommen werden. Nicht virale Vektoren werden über unterschiedliche, auf physikalischen und biologischen Mechanismen beruhende Verfahren des Transfers in die Zielzellen eingebracht. Eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Vektoren ist, daß in den modifizierten Zellen keine viralen oder sonstige mit dem Vektorsystem in Zusammenhang stehende Proteine synthetisiert werden, die für die Funktion der durch die Vektorsysteme modifizierten Zellen störend sein könnten. Eine Expression viraler oder sonstiger Proteine wäre dann im Sinne der Erfindung schädlich, wenn die modifizierten Zellen, die diese Proteine produzieren, von Immunzellen erkannt und zerstört werden. Im Sinne dieser Erfindung wäre diese Erkennung schädlich, wenn dadurch die natürliche Funktion des Immunsystems, virale oder bakterielle Erreger, entartete Zellen, oder sonstige normalerweise vom Immunsystem erkannte Zellen oder Erreger zu erkennen und zu zerstören, beeinträchtigt wird. Schädlich ist auch, wenn dadurch die Effizienz der Zellen, die immunpathogenen Immunzellen zu zerstören, eingeschränkt wird.
Die mittels der erfindungsgemäßen Vektoren, umfassend die erfindungsgemäße Kombination von Nukleinsäuresequenzen, modifizierten Zellen exprimieren Antigene, die von immunpathogenen Immunzellen erkannt werden. Diese immunpathogenen Zellen spielen für die Pathogenese einer definierten Erkrankung eine besondere Rolle, da sie spezifisch (körpereigene) Antigene erkennen und eine Immunreaktion gegen diese Antigene und die Antigen- exprimierenden Zellen koordinieren. Die mit den erfmdungsgemäßen Vektoren in die Zellen eingeführten Antigene können spezifisch für bestimmte Erkrankungen bzw. spezifisch für die angegriffenen Organ, Gewebe oder den angegriffenen Zelltyp sein. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren zusätzlich für apoptoseauslösende Liganden. Diese apoptoseauslösenden Liganden induzieren in den immunpathogenen Immunzellen, die die Antigene erkennen, den natürlichen Zelltod. Die erfindungsgemäßen Vektoren können für ein oder mehrere unterschiedliche apoptoseauslösende Liganden kodieren. Von den modifizierten Zellen werden nur solche Immunzellen, die das künstlich synthetisierte antigene Epitop erkennen und daher mit den modifizierten Zellen physikalisch in Kontakt treten, erkannt und zerstört.
Die Nukleinsäurensequenzen, die für die Auslösung der Apoptose verantwortlich sind (apoptoseauslösende Liganden), und die, welche für die antigenen Polypeptide kodieren (Antigene), können auf transkriptioneller Ebene so funktional gekoppelt bzw. miteinander verbunden sein, daß eine Expression der Antigene nicht ohne Expression der apoptoseauslösenden Liganden möglich ist. Die Sicherheit der erfindungsgemäßen Vektoren wird dadurch stark erhöht, da somit verhindert wird, daß es zu einer Erkennung der veränderten Zellen durch die krankmachen Immunzellen und dadurch zu deren Stimulation kommen kann, ohne daß in diesen Zellen gleichzeitig die Apoptose ausgelöst wird.
Die Nukleinsäuresequenzen der erfindungsgemäßen Vektoren können zusätzlich Gene bzw. funktionelle Bereiche tragen, die verhindern, daß die durch den erfindungsgemäßen Vektor veränderten Zellen selbst über autokrine Mechanismen die Apoptose einleiten und sich so selbst zerstören (Antiapoptosemoleküle). Dadurch wird die Effizienz der Vektoren und der veränderten Zellen stark erhöht. Die Gene oder funktionellen Bereiche kodieren entweder für Regulatoren der Aktivität apoptoseauslösender Faktoren oder sie verhindern deren Expression. Die erfindungsgemäßen Vektoren können gegebenenfalls zusätzlich Nukleinsäuresequenzen umfassen, die Polypeptide kodieren, die es ermöglichen, die gentechnisch modifizierten Zellen nach der Rückinfusion in den Körper falls gewünscht zu eliminieren (Suizidgene). Eine zu der funktionalen Koppelung der Nukleinsäuresequenzen, die für das Antigen und die apoptoseauslösenden Liganden kodieren, vergleichbare funktionale Koppelung, kann für die Nukleinsäuresequenzen vorliegen, die für die Antiapoptosemoleküle und die Suizidenzyme kodieren. Durch diese Koppelung wird sichergestellt, daß Zellen, die aufgrund der Antiapoptosemoleküle nicht mehr im Körper eliminiert werden können, durch die Funktion der Suizidenzyme entfernt werden können.
Die Nukleinsäuresequenzen für die Antiapoptosemoleküle und die Suizidenzyme können auf demselben Nukleinsäuremolekül liegen, auf dem die Nukleinsäuresequenzen für die apoptoseauslösenden Liganden und die Antigene liegen, oder sie können auf einem anderen Nukleinsäuremolekül liegen.
Die Erfindung betrifft ferner einen Gentransfervektor als therapeutisches Mittel. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Gentransfervektoren zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Prävention oder Therapie von Autoimmunerkrankungen, z.B. rheumatoide Artritis, systemische Lupus Erythematodes, Sjögren-Syndrom, Polymyositis, Dermatomyositis, Polymyalgica Rheumatica, Arteriitis Temporalis, Spondylarthropathien wie Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, Zöliakie, Autoimmun-Hepatitis, Diabetes mellitus Typ I, Nebenniereninsuffizienz, Thyroiditis, Psoriasis, Dermatitis, Herpetiformis, Pemphigus Vulgaris, Alopezie, Multiple Sklerose, Myastenia Gravis, oder zur Prävention oder Therapie von chronisch entzündlichen Prozessen, die auf Immunpathogenese beruhen, beispielsweise chronische Entzündungen nach viralen- oder bakteriellen Infektionen wie chronische Hepatitis bei Hepatitis- B-Virus- oder Hepatitis-C-Virus-Infektionen, oder Gehirnentzündung nach Infektion mit dem Masern- Virus, und zur Prävention- oder Therapie von Transplantatabstoßungen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Gentransfervektoren zur ex vivo Modifikation von eukaryotischen Zellen, insbesondere tierischen oder Säugerzellen, insbesondere humanen Zellen. Retrovirale Vektoren
Vorzugsweise sind die Gentransfervektoren retrovirale und insbesondere auf Lentiviren basierende Vektoren. Diese stellen eine geeignete Plattform für die Entwicklung effizienter Vektoren zur Übertragung von Nukleinsäuren in Zellen dar. Die Insertion eines gewünschten Fremdgens in einen geeigneten Vektor und die Verpackung in retrovirale Partikel kann mit bereits detailliert beschriebenen Methoden durchgeführt werden und ist Stand der Technik. Die erzeugten rekombinanten Viren werden anschließend isoliert und in vivo oder ex vivo mit den gewünschten Zielzellen inkubiert. Eine Vielzahl unterschiedlicher retroviraler Systeme wurde bislang beschrieben und eignet sich zum Transfer der erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen. Bevorzugt sind daher retrovirale und insbesondere lentivirale Gentransfervektoren zum Transfer der erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen in eukaryotische Zellen.
Erfindungsgemäße retrovirale Gentransfervektoren können auf der Basis unterschiedlicher Retroviren wie zum Beispiel der Retroviren vom Typ B, C oder D sowie der Spumaviren und Lentiviren basieren.
Repräsentative Vertreter geeigneter Retrovirusfamilien sind zum Beispiel solche, die in "RNA Tumor Viruses", auf den Seiten 2 - 7 beschrieben werden sowie eine Vielzahl von xenotrophen Retroviren, wie z.B. NZB-Xl, NZB-X2 und NZB9-1 und polytrophen Retroviren, wie z.B. MCF und MCF-MLV. Diese Retroviren können aus Lagerbeständen oder Sammlungen, wie z.B. der American Type Culture Collection ("ATCC"; Manassas, Va.) bezogen werden, oder sind aus biologischem Material unter Verwendung gängiger und publizierter molekularbiologischer Techniken isolierbar.
Für die Herstellung retroviraler Gentransfervektoren besonders geeignete Retroviren beinhalten Vertreter aus der Gruppe der Vogel-Leukämie- Viren, Rinder-Leukämie- Viren, Maus-Leukämie- Viren, Mink-ce// ocw5-induzierenden Viren, Maus-Sarkom- Viren, Gibbon-Leukämie-Viren, Katzen-Leukämie-Viren, retikuloendothelialen Viren und Rous-Sarkom- Viren. Besonders geeignet sind Maus-Leukämie-Viren wie z.B. die Vertreter 4070A und 1504A, Abelson (ATCC Nr. VR-999), Friend (ATCC Nr. VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nr. VR-590), Kirsten, Harvey- Sarkom- Virus und Rauscher (ATCC Nr. VR-998) sowie das Moloney-Maus-Leukämie-Virus (ATCC No. VR-190). Besonders geeignet sind auch das Rous-Sarkom- Virus einschließlich Bratislava, Bryan high titer (z.B., ATCC Nr. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659, und VR-728), Bryan Standard, Carr-Zilber, Engelbreth-Holm, Harris, Prague (z.B., ATCC Nr. VR-772, und 45033) und Schmidt-Ruppin (z.B., ATCC Nr. VR-724, VR-725, VR-354).
Bei speziellen, in der Erfindung beschriebenen Anwendungen können Bestandteile der Nukleinsäuremoleküle der retroviralen Gentransfervektoren auch von anderen als den aufgelisteten Retroviren stammen. Zum Beispiel können retrovirale Vektor long terminal repeat (LTR) Bereiche von dem Maus-Sarkom- Virus, die tRNA Bindungsstelle von dem Rous-Sarkom- Virus, das Verpackungssignal von dem Maus-Leukämie- Virus, und der Ursprung für die Zweitstrang-DNS-Synthese von dem Vogel-Leukämie- Virus stammen.
Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle für retrovirale Vektoren verwendet werden, die ein 5' LTR, eine tRNA-Bindungsstelle, ein Verpackungssignal, eine oder mehrere heterologe Sequenzen, einen Ursprung der Zweitstrang- DNS-Synthese und einen 3' LTR enthalten, wobei das Nukleinsäuremolekül keine für Gag / Pol oder Env-kodierenden Sequenzen enthält. LTR beinhalten drei Elemente, die U5, R und U3 Region. Diese Elemente beinhalten eine Vielzahl von Signalen, die für die biologische Aktivität von Retroviren bedeutsam sind, so zum Beispiel Promotor und Erc zαncer-Elemente, die in der U3-Region lokalisiert sind. LTRs können innerhalb eines Provirus anhand der charakteristischen Sequenzduplikationen an den Enden des Genoms eindeutig charakterisiert werden. Die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten 5' LTR beinhalten ein 5' Promotor Element und eine minimale LTR-Sequenz, welche eine Reverse Transkription und Integration der Vektor-Nukleinsäure in das Genom der Zielzelle ermöglicht. Der 3' LTR-Bereich beinhaltet ein Polyadenylierungssignal und LTR Sequenzen die für die Reverse Transkription und Integration der Vektor-Nukleinsäure in das Genom der Zielzelle erforderlich sind.
Die tRNA Bindungsstelle und der Ursprung der Zweitstrang-DNS-Synthese sind für die biologische Aktivität erforderlich, und die Identifikation dieser Komponenten ist Stand der Technik. Zum Beispiel binden retrovirale tRNAs mittels Watson-Crick-Basenpaarung an eine tRNA-Bindungsstelle, und werden mit dem retroviralen Genom in die Viruspartikel verpackt. Die tRNA dient dann der Reversen Transkriptase als Primer für die DNS Synthese. Die tRNA- Bindungssequenz befindet sich unmittelbar stromabwärts von dem 5 ' LTR und kann durch ihre Lokalisation leicht identifiziert werden. In gleicher Weise ist der Ursprung der Zweitstrang- DNS-Synthese für die Zweitstrang-DNS-Synthese von Retroviren von großer Bedeutung. Diese Region, die als Polyuridintrakt bezeichnet wird, ist direkt stromaufwärts des 3' LTR lokalisiert.
Zusätzlich zu dem 5' und 3' LTR, der tRNA-Bindungssequenz und dem Ursprung der Zweitstrang DNS Synthese, können die Nukleinsäuren retrovirale Gentransfervektoren ein
Verpackungssignal beinhalten, und zudem eine oder mehrere heterologe Sequenzen, die nachfolgend im Detail beschrieben werden.
Beispielsweise werden retrovirale Gentransfervektoren verwendet, die weder für Gag / Pol noch für Env-kodierende Nukleinsäuresequenzen aufweisen. Beispielsweise können retrovirale
Gentransfervektoren ohne für Gag / Pol oder Env-kodierende Sequenzen durch die Herstellung von Vektorkonstrukten erzeugt werden, die ein erweitertes Verpackungssignal besitzen. Der
Begriff "erweitertes Verpackungssignal" definiert eine Nukleotidsequenz, welche die für die spezifische Verpackung von Nukleinsäuren notwendige Minimalsequenz überschreitet. Die Verwendung der erweiterten Verpackungssequenz erlaubt die Herstellung höhertitriger
Virusstocks, die auf einer gesteigerten RNA Verpackung beruht. Beispielsweise, ist das minimale Verpackungssignal des Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Mo-MLV) von einer
Sequenz kodiert, die am Ende des 5' LTR beginnt und die Pst I Schnittstelle beinhaltet. Das erweiterte Verpackungssignal von Mo-MLV beinhaltet Sequenzen jenseits des Nukleotides 567, den Start des Gag / Pol-Gens (Nukleotid 621) und endet jenseits des Nukleotids 1560. Deshalb kann aus dem Mo-MLV durch Deletion der Sequenz jenseits Nukleotid 567 ein retroviraler
Gentransfervektor hergestellt werden, der kein erweitertes Verpackungssignal besitzt.
Zudem können Nukleinsäuresequenzen für retrovirale Gentransfervektoren verwendet werden, bei denen das Verpackungssignal die retrovirale Gag / Pol-Sequenz teilweise oder ganz überlagert, jedoch stromaufwärts des Startcodons des Gag / Pol-Gen vollständig deletiert oder trunkiert wurde. Weiterhin können Nukleinsäuresequenzen für retrovirale Gentransfervektoren verwendet werden, die ein Verpackungssignal enthalten, das im 5' Bereich vor dem Start des Gag / Pol-Gens erweitert ist. Falls diese retroviralen Vektoren verwendet werden, sollen vorzugsweise Verpackungszellinien zur Produktion der rekombinanten Viruspartikel eingesetzt werden, bei denen das 5' terminale Ende des Gag / Pol-Gens in einer Gag / Pol- Expressionskassette in der Art modifiziert wird, daß es einen im Gag-Gen modifizierten, von der wildtyp HΓV-1 -Gag-Sequenz abweichenden Codongebrauch aufweist. Zudem können Nukleinsäuresequenzen für retrovirale Gentransfervektoren verwendet werden, die ein 5' LTR, eine tRNA Bindestelle, ein Verpackungssignal, einen Ursprung der Zweitstrang DNS-Synthese und einen 3' LTR Bereich besitzen, wobei die Nukleinsäurese keine retrovirale Nukleinsäuresequenz stromaufwärts des 5' LTR besitzt. Diese Vektoren besitzen keine für Env- kodierende Sequenz stromaufwärts des 5' LTR. Weiterhin können Nukleinsäuresequenzen für retrovirale Gentransfervektoren verwendet werden, die ein 5' LTR, eine tRNA Bindungssequenz, ein Verpackungssignal, einen Ursprung der Zweitstrang DNS Synthese und ein 3' LTR besitzen, die jedoch keine retrovirales Verpackungssignal-Sequenz stromabwärts des 3' LTR beinhalten. Der hier verwendete Begriff "Verpackungssignal-Sequenz" definiert eine Sequenz, die für die Verpackung eines RNA-Genoms erforderlich ist.
Geeignete Verpackungszellinien zur Etablierung der oben genannten retroviralen Gentransfervektoren sind bereits verfügbar und wurden vielfach zur Herstellung von Zellinien (ebenso bezeichnet als Vektorzellini en) zur Produktion von rekombinanten Vektorpartikeln eingesetzt.
Unter den retroviralen Vektoren sind lentivirale Vektoren zum Transfer der erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen besonders geeignet, da sie in der Lage sind, Nukleinsäuresequenzen in eine Vielzahl ruhender und postmitotischer Zellen, wie exemplarisch neuronaler-, Leber-, Muskel- sowie hämatopoetischer Stammzellen einzubringen und zu exprimieren. Die lentiviralen Vektorpartikel können durch Tripelinfektion von Säugerzellen mit (i) einem Gag / Pol-Expressionsvektor, (ii) einem Transferkonstrukt, welches das Verpackungssignal, das/die fremden Nukleinsäuresequenzen sowie die flankierenden LTRs enthält und (iii) einem Expressionsvektor für ein Hüllprotein erzeugt werden. Hierbei können Hüllproteine unterschiedlicher amphotropher oder xenotropher Retroviren sowie anderer Viren verwendet werden, wie beispielsweise die Hüllproteine des Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Mo-MLV) und des MLV Isolates 4070A sowie das Vesikular-Stomatitis- Virus (VSV) G Glykoprotein oder das Rabies G Glykoprotein. In dieser Art hergestellte lentivirale Vektoren sind in der Lage, eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen stabil zu transfizieren. Lentivirale Vektoren, die den zentralen Polyuridintrakt und die Terminatorsequenz des HIV-Pol-Gens enthalten, weiseneine gesteigerte Transduktionseffizienz auf, die auf einer verbesserten nuklearen Translokation des Vektors beruht. Zur Verbesserung der Sicherheit lentiviraler Gentherapievektoren können unterschiedliche funktioneile Verpackungskonstrukte mit Deletionen in den akzessorischen Genen Vif, Vpr, Vpu und Nef von HIV-1 bzw. SIY-1 hergestellt werden. Weiterhin können funktioneile lentivirale Vektoren entwickelt werden, die das virale Transaktivatorprotein Tat nicht mehr benötigen. Zur Minimierung der Entstehung replikationskompetenter Rekombinanten können zudem selbstinaktivierende Vektorsysteme entwickelt werden, bei denen z.B. ein umfassender Bereich der U3 Region im 5' und / oder 3' LTR inklusive der TATA Box und der Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren SP1 und NF-κB innerhalb des Vektors deletiert wird. Durch diese Modifikationen wird ein großer Teil der viralen Transkriptionselemente entfernt. Durch die Deletion des U3 Bereiches wird zudem eine mögliche Interferenz zwischen dem im LTR befindlichen Promotor und internen Promotoren verhindert und die Gefahr der Aktivierung benachbarter zellulärer Gene am Integrationsort des lentviralen Vektors drastisch reduziert. Um die Rev-Abhängigkeit der lentiviralen Gag / Pol und Env-Gene zu umgehen, werden z.B. synthetisch hergestellte codonadaptierte HIV bzw. SIV Gag / Pol und Env-Gene verwendet. Alternativ können konstitutive Transportelemente (CTE) anderer Viren, wie z.B. exemplarisch das CTE des Mason-Pfitzer- Affen- Virus oder des Affenretrovirus Typ-1 (SRV-1) sowie das posttranskriptionelle regulatorische Element (PRE) des Hepatitis B Virus und das posttranskriptionelle direct repeat (DR) Element des Rous-Sarkom- Virus eingesetzt werden, um einen Rev-unabhängigen Export der HIV / SIV-Gag, Gag / Pol und Env-Gentranskripte zu ermöglichen. Diese Verfahren erlauben den Ausschluß des transaktiven Rev-Proteins aus den lentiviralen Vektoren, was zu einer erhöhten Sicherheit dieses Vektortyps beiträgt. Eine Zusammenstellung der derzeit aktuellen lentiviralen Vektorsysteme ist z.B. exemplarisch in dem Review von Buchschacher und Wong Staal (Buchschacher et al. (2000) Blood 95:2499-2504) wiedergegeben.
Neben retroviralen und lentiviralen Vektoren können eine Vielzahl anderer viraler und nicht viraler Gentransfervektoren verwendet werden, die ebenfalls zum Transfer der erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen einsetzbar sind. Da diese Vektorsysteme eingesetzt werden sollen, um therapeutisch verwendbare, gentechnisch veränderte Zellinien zu generieren, werden die viralen Vektorsysteme aus Sicherheitsgründen in der Art modifiziert, das sie nicht mehr in der Lage sind, lytisch zu replizieren. Vorzugsweise sind die Gentransfervektoren auf Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Pockenviren, Alphaviren oder Herpesviren basierende Vektoren. Adenovirale Vektoren
Die Herstellung rekombinanter adenoviraler Vektoren (Ad-Vektoren), einschließlich der El / E3, El / E4, und "gutless" Vektoren ist Stand der Technik und kann nach publizierten Protokollen durchgeführt werden. Beispielsweise kann (1) die gewünschte Nukleotidsequenz in ein pBHGl 1 Plasmid eingefügt werden, um rekombinante El / E3-deletierte Ad-Vektoren nach Transfektion von 293-Zellen und anschließender intrazellulärer Rekombination zu erzeugen; (2) die gewünschte Nukleotidsequenz zuerst in die El -Region eines aus einer Vielzahl von El- deletierten Ad-Vektoren integriert, mit einem Cläl verdauten H5dl l014 Vektor co-transfizieit und die rekombinanten, El / E4-deletierten Ad-Vektoren nach Transfektion von 293-E4-Zellen und anschließender intrazellulärer homologer Rekombination isoliert werden und (3) die gewünschte Nukleotidsequenz zusammen mit einer angemessenen Menge einer "Stujfer"- Sequenz z.B. die beispielsweise aus der DNS des Bakteriophagen Lambda entstammt, zuerst in das ArAd-Plasmid eingefügt werden, um nachfolgend eine effiziente Verpackung der rekombinanten "gutless" Adenovirus-Vektorgenome nach Transfektion in 293-Zellen und Infektion mit einem H5.CBALP-Helfervirus zu gewährleisten. Die Aufreinigung der rekombinanten "gutless" Adenovirus Vektorpartikel von kontaminierenden Helferviren kann, beispielsweise, aufgrund der im Vergleich zum Helfervirus geringeren Dichte der Vektorpartikel, durch Gleichgewichts- Sedimentation in einem Cäsiumchloridgradienten erfolgen.
Adeno-assoziierte Viren
Weiterhin können bereits verschiedene entwickelte Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektorsystems für den Gentransfer eingesetzt werden. Eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion von AAV-Vektoren ist publiziert und Stand der Technik.
In rekombinanten AAV-Vektoren werden gewöhnlich alle kodierenden Sequenzen durch die gewünschten heterologen Nukleinsäuresequenzen ersetzt. Die rekombinanten AAV werden durch Kotransfektion von einem AAV- Vektor, der das gewünschte Gen trägt, und einem Helfer AAV-Plasmid, das alle essentiellen AAV-Gene besitzt, in adenovirusinfizierte Zellen, die alle für die AAV-Replikation und die Produktion von Vektorpartikeln benötigten Helferfunktionen bereitstellen, hergestellt. Nachteile dieses Vektorsystems für die gentherapeutische Anwendung sind jedoch die geringen Titer rekombinanter Vektoren und mögliche Kontaminationen der Vektoren mit wildtyp AAV und infektiösen Helferviren. Weiterhin ist die Größe der in AAV- Vektoren zu integrierenden Fremdsequenzen auf 5 kb beschränkt.
Pockenviren
Alternative virale Vektorsysteme zum Transfer von Nukleinsäuren, die für ein gewünschtes Fremdgen kodieren, basieren auf Vertretern der Familie der Pockenviren, einschließlich der Vakzinia-Viren und Vogelpockenviren. Die Herstellung derartiger Vektorsysteme erfolgt wie nachfolgend exemplarisch für rekombinante Vakzinia-Viren beschrieben. Zuerst wird die für das gewünschte Gen kodierende DNS in der Art in einen geeigneten Vektor integriert, daß sie sich in Nachbarschaft zu einem Vakzinia-Promotor und einer flankierenden Vakzinia-DNS-Sequenz wie z.B. der kodierenden Sequenz für die Thymidinkinase (TK) befindet. Dieser Vektor wird dann in Zellen transfiziert und diese werden gleichzeitig mit Vakzinia-Viren infiziert. Durch eine homologe Rekombination wird dann das Insert mit dem Fremdgen in das virale Genom einrekombiniert. Die resultierenden TK-positiven Rekombinanten können durch Kultivierung der Viren auf Zellen in Anwesenheit von 5-Bromdeoxyuridin und anschließendes Isolieren von Plaques etabliert werden.
Alternativ können andere Vogelpockenviren, wie z.B. Fowlpox und Canarypox- Viren für den Gentransfer verwendet werden. Rekombinante Vogelpockenviren, die Immunogene von humanpathogenen Organismen exprimieren, können nach Verabreichung in Säugern eine protektive Immunantwort induzieren. Die Verwendung von Vogelpockenviren ist insbesondere für eine Anwendung am Menschen und anderen Säugern von Vorteil, da Vertreter der Gattung der Vogelpocken nur in empfänglichen Vogelarten, jedoch nicht in Säugerzellen produktiv replizieren. Methoden zur Herstellung rekombinanter Vogelpockenviren sind Stand der Technik und basieren auf genetischen Rekombinationsmechanismen, vergleichbar mit denjenigen, die zuvor für die Produktion rekombinanter Vakzinia-Viren beschrieben wurden.
Alphaviren
Von Vertretern der Gattung der Alphaviren, wie beispielsweise von Sindbis- und Semliki-Forest- Viren abgeleitete Vektoren können ebenfalls für den Transfer von Nukleotidsequenzen ausgewählter Gene eingesetzt werden. Die Herstellung und Verwendung von Vektoren auf der Basis des Sinbis- Virus ist Stand der Technik und mehrfach publiziert. Bakterien
Vorzugsweise sind die Gentransfervektoren ferner Bakterien, insbesondere Listeria monocytogenes (Δmpl, ΔactA, ΔplcB), Shigella flexneri (ΔaroA, ΔvirG) und Salmonella thypimurium. Ein vielversprechendes DNA-Deliverysystem zur Rekrutierung und Aktivierung von antigenspezifischen Zellen bedient sich bakterieller Suizidvektoren exemplarisch auf der Basis attenuierter Listeria monocytogenes (Δmpl, ΔactA, ΔplcB), Shigella flexneri (ΔaroA, ΔvirG) und Salmonella thypimurium Isolate. Die Herstellung und Verwendung derartiger bakterieller Gentransfersysteme ist detailliert publiziert und Stand der Technik. So sind "Suicide" Stämme von L. monocytogenes beispielsweise in der Lage gezielt professionelle antigenpräsentierende Zellen zu infizieren. Nach erfolgter Aufnahme der Bakterien in das Zytoplasma der Zielzelle werden diese, vermittelt durch ein Listeria-spezifisches Phagen Lysin zerstört, was zu einer Freisetzung der von den Bakterien transportierten Plasmid-DNA führt, die nachfolgend in den Zellkern gelangt. Wesentliche Vorteile dieses bakteriellen Systems liegen in der oralen Applikation der Bakterien und dem gezielten Einbringen von Plasmiden in APCs, die eine zentrale Rolle bei der Induktion einer zellulären Immunantwort einnehmen. Die Suicide Stämme der invasiven Bakterien Shigella flexneri und Salmonella thypimurium wurden durch Deletion von Genen attenuiert, die für die Produktion von Metaboliten der Zellwandsynthese essentiell sind. Diese Bakterienstämme lysieren nach Infektion von Säugerzellen aufgrund des Fehlens dieser Metaboliten.
Plasmid-DNS
Vorzugsweise sind die Gentransfervektoren ferner Plasmide. Nackte Plasmid-DNS eignet sich als Vektor für die erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen. Diese Expressionsvektoren enthalten exemplarisch folgende essentiellen Elemente: Einen oder mehrere starke konstitutive und / oder induzierbare Promotoren, einen Transkriptionsterminator, wie z.B. den des Rinderwachstumshormons, eine Antibiotika Resistenz oder einen anderen Marker zur Selektion des transformierten Organismus, die erste, zweite, und/oder dritte und/oder vierte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz und einen Replikationsursprung, der die Produktion in einem geeigneten Wirtsorganismus ermöglicht, insbesondere eignen sich eine zweite Generation von linearen DNS-Plasmiden, die sogenannten MLOGE-Transfektionsvektoren zum effizienten Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen. MIDGE-Vektoren bestehen aus beiden Strängen eines DNS-Polymers, das eine beliebige Anzahl der gewünschten kodierenden Sequenzen und der für Expression von Fremdgenen nötigen Promotor- und Terminatorsequenzen enthält und an beiden Enden mit Schleifen einzelsträngiger Desoxyribonukleotide in der Art verknüpft werden, daß ein kovalent geschlossenes Molekül entsteht. MLDGES beinhalten neben den für die medizinische Anwendung gewünschten Fremdgenen mit den für eine effiziente Expression erforderlichen Regulationseinheiten keine weiteren kodierenden Sequenzen, wie sie etwa für die Amplifikation und Selektion von üblichen DNS-Transfervektoren benötigt werden. So besitzen diese Vektoren beispielsweise keine Ori- Sequenzen, die potentielle Integrationsorte enthalten und keine kodierenden Sequenzen für Antibiotika als Selektionsmarker, die sich unter der Kontrolle von oftmals in Säugerzellen nicht vollständig abschaltbaren Promotoren befinden.
Die Effizienz dieses Systems zum Gentransfer und zur verbesserten Fremdgenexpression in Säuger und- Menschenzellen kann insbesondere durch die Anheftung einer heterologen Klasse von Peptiden, die sogenannte Kernlokalisationssignale (NLS, nuclear localisation sequences) beinhalten, gesteigert werden. Beispielsweise kann der Kernimport von MIDGE-ähnlichen Konstrukten durch das NLS des SV-T-Antigens verbessert und die Fremdgenexpression gesteigert werden. Weiterhin kann durch Koppelung der MIDGES mit gewebespezifischen Liganden ein spezifisches Targeting erzielt werden. Die MIDGES können zudem in Analogie zu nackter DNS mit einer Vielzahl von nicht-viralen Gentransfersystemen gekoppelt werden, um eine effizientere Aufnahme in die Zielzelle zu gewährleisten.
Weiterhin können Gentransfervektoren verwendet werden, die Bestandteile eukaryotischer DNS Transposons beinhalten. Transposons sind natürlich vorkommende genetische Elemente, die sich innerhalb eines Chromosoms von einer Position zu einer nächsten fortbewegen können. Exemplarisch können Vertreter der Tcl/mariner Familie, wie z.B. das sleeping beauty Transposon zur Herstellung geeigneter Vektoren für die Anwendung in Säugerzellen verwendet werden. Ein Vorteil dieser Vektoren ist, daß multiple regulatorische Sequenzen in die Vektoren integriert werden können. Diese Vektoren integrieren in das Wirtszellgenom und erlauben eine lang anhaltende Expression der gewünschten Fremdsequenzen.
Systeme zum Transfer von Nukleinsäuren in eukaryote Zellen
Weiterhin wurde eine Vielzahl von Methoden zum Gentransfer in Säugerzellen auf der Basis nicht viraler Systeme beschrieben. Die nicht viralen Vektoren werden oftmals in Kombination mit dem partikelvermittelten Gentransfer bzw. mit viralen Vektorsystemen eingesetzt. Kurz zusammengefaßt können die erfindungsgemäßen Kombinationen von Nukleinsäuresequenzen in einen oder eine Kombination aus mehreren konventionellen Gentransfervektor integriert werden, die geeignete Kontrolelemente für eine effiziente Expression des / der gewünschten Fremdgen(e) mit hohen Ausbeuten ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Vektoren können dann mit synthetischen Gentransfermolekülen wie z.B. polymeren DNS-bindenden Kationen wie Polylysin, Protamin und Albumin gekoppelt werden oder an Liganden gebunden werden, die ein spezifisches Zeil- Targeting vermitteln, wie z.B. Asialoorosomucoid, Insulin, Galaktose, Lactose oder Transferrin.
Die Effizienz der Aufnahme nackter DNS kann zudem durch den Einsatz biologisch abbaubarer Latexkügelchen gesteigert werden. Mit DNS-beladene Latexkügelchen werden aufgrund der, durch die Latexkügelchen vermittelten Endozytose mit gesteigerter Effizienz in die Zielzellen aufgenommen. Die Effizienz dieser Methode kann durch eine Erhöhung der Hydrophobizität und eine damit einhergehende verbesserte Disaggregation der Kügelchen im Endosom gesteigert werden, wodurch eine effizientere Freisetzung der DNS in das Zytoplasma bewirkt wird.
Zudem eignen sich auch verschiedene Kompositionen von Liposomen sowie immunstimulatorische rekonstituierte Influenza-Virosomen (ΓRTV, immunepotentiating reconstituted influenza virosomes) als Vehikel für den Transfer der erfindungsgemäßen Vektoren in Säuger- und humane Zellen (U.S. Pat. Nr. 5,879,685). Zudem können fremde Nukleinsäuresequenzen in einen Vektor mit geeigneten Kontrollsequenzen integriert, an synthetische Gentransfermoleküle wie polymere DNS-bindende Kationen (z.B. Polylysin, Protamin und Albumin) gebunden und mit Zelltargeting-Liganden wie Asialoorosomucoid, Insulin, Galaktose, Lactose oder Transferrin gekoppelt werden. Ein anderes Verabreichungssystem basiert auf der Verpackung von Sequenzen, die die gewünschten Gene unter der Kontrolle von unterschiedlichen gewebespezifischen bzw. konsumtiven Promotoren enthalten, in Liposomen. Weiterhin kann der Transfer der zuvor beschriebenen Nukleinsäuren durch Assoziation mit einem photopolymerisierten Hydrogelmaterials gesteigert werden. Eine andere gebräuchliche Methode zum Transfer von Nukleinsäuren ist die Verabreichung mittels einer tragbaren "Particle Gun ", sowie die Verwendung ionisierender Strahlung zur Aktivierung des Gentransfers. Andere Methoden zur Optimierung der Effizienz der viralen Vektortransduktion umfassen die Variation der "multiplicity of infection" (M.O.I.), Depletion von Ionen wie z.B. von Phospationen, Zugabe von polykationischen Substanzen wie z.B. Protamin Sulfat, Variation der Kontaktzeit, Temperatur, pH-Wert und gemeinsame Zentrifugation von Zellen und Virus- bzw. Vektorstocks.
Die beschriebenen Gentransfersysteme können zur genetischen Manipulation von isolierten humanen- bzw. Säugerzellen, insbesondere Antigen-präsentierenden Zellen (Monozyten, Makrophagen, Dendritischen Zellen, B-Zellen) benutzt werden. Falls retrovirale Gentransfervektoren zum Einsatz kommen, können die Zellen durch Stimulation in die S-Phase überfuhrt werden, um die Infektion dieser Zellen zu ermöglichen. Zellen die sich im ersten Viertel bis der Hälfte der S-Phase befinden, haben sich für eine retrovirale Transfektion als besonders empfindlich erwiesen.
Polypeptide mit antigenen Epitopen
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dadurch charakterisiert, daß sie Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für Proteine oder Teile von Proteinen oder Polypeptide kodieren, die von Immunzellen erkannt werden (Antigene). Immunzellen im Sinne der Erfindung sind Lymphozyten mit regulatorischen oder zytolytischen Eigenschaften, wie z.B. CD8+/CD4" T- Zellen oder CD87DC4+ T-Zellen oder CD87CD47CD56" Killer Zellen (NK-Zellen). Proteine oder Polypeptide im Sinne dieser Erfindung sind Proteine menschlicher oder tierischer Zellen. Diese Proteine oder Polypeptide befinden sich entweder auf der Oberfläche der angegriffenen Zellen, z.B. Glykoproteine auf Zellmembranen aufgrund ihrer Funktion, oder sie befinden sich im Inneren der Zellen, z.B. regulatorische Proteine. Diese Proteine oder Polypeptide werden in der Zelle aufbereitet und den Immunzellen des Körpers im Kontext von Klasse 1 oder Klasse 2 MHC-Molekülen präsentiert. Die Proteine oder Polypeptide im Sinne dieser Erfindung werden von den eigenen Immunzellen erkannt und führen zu einer Stimulation dieser Zellen, d.h. zu einer Vermehrung der Zellen, die durch die Freisetzung von Botenstoffen (LFN-γ, IL2, TNF, u.a.) oder durch die zytolytische Aktivität der immunzellen gemessen werden kann.
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für die Polypeptide kodieren, die ein oder mehrere lineare oder strukturelle Epitope aufweisen. Diese Epitope können nach Präsentierung über MHC-Moleküle von immunpathogenen T-Zellen erkannt werden. Diese Peptidbereiche und Epitope können auch im Kontext anderer, immunogener oder nicht immunogener Polypeptide kodiert und exprimiert werden, beispielsweise als Fusionsproteine oder in der Form von austauschbaren Kassetten in Proteinen, wobei die Kassetten für Bereiche oder Epitope oder Kombinationen von Epitopen der Proteine kodieren. Im Sinne dieser Erfindung sind Epitope der Proteine solche Bereiche der Proteine bzw. solche Aminosäuresequenzen, die von Immunzellen wie z.B. T-Zellen oder NK- Zellen erkannt werden. Diese Epitope können sowohl von Immunzellen gesunder Personen wie auch von Personen mit Autoimmunerkrankungen erkannt werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können beispielsweise zur Therapie von Autoimmunerkrankungen, von chronisch entzündlichen Prozesse, die auf Immunpathogenese beruhen und von Gewebe- und Organabstoßungsreaktionen verwendet werden. Z.B. sind viele Autoimmunerkrankungen bekannt, bei deren Entstehung autoreaktive T-Zellen, die körpereigene Proteine und Strukturen erkennen, beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Vektoren können Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für diese körpereigenen Proteine und Strukturen kodieren und exprimieren. Es kommen alle Erkrankungen für eine Therapie in Frage, bei denen T-Zellen an der Pathogenese beteiligt und die von den T-Zellen angegriffenen Proteine und Strukturen identifiziert sind.
Eine Gruppe von Autoimmunerkrankungen sind Rheumatologische Erkrankungen. Bei der Rheumatoiden Artritis werden beispielsweise die Gelenke angegriffen, klinische Komplikationen sind Gelenkdestruktionen, Nierenschädigungen und Amyloidose. Der Systemische Lupus Erythematodes betrifft und schädigt unterschiedliche Organe und Gewebe wie zum Beispiel das zentrale Nervensystem und die Niere. Das Sjögren-Syndrom betrifft exokrine Drüsen wie beispielsweise Speicheldrüsen. Polymyositis und Dermatomyositis sind
Autoimmunerkrankungen der Muskulatur und der Haut und führen zu Muskelschwäche und Lähmung. Polymyalgica Rheumatica und Arteriitis Temporaiis sind Entzündungserkrankungen der Gefäße und verursachen Muskelschwäche und Erblindung. Spondylarthropathien wie Morbus Bechterew betreffen wiederum die Gelenke und führen zur Einsteifung.
Eine weitere Gruppe von Autoimmunerkrankungen sind eine Reihe gastrointestinaler Erkrankungen. Morbus Crohn betrifft den gesamten Intestinaltrakt und führt zu Blutungen, Stenosen, Fisteln, und führt nicht selten zur Entstehung von Tumorerkrankungen. Colitis Ulcerosa ist eine entzündliche Erkrankung des Dickdarm und führt zu Perforation und Blutungen. Zöliakie betrifft sowohl Dünn- als auch Dickdarm und resultiert in Gewichtsverlust. Die Autoimmun-Hepatitis ist eine entzündliche Erkrankung der Leber mit der Folge der Leberzirrhose und Lebertransplantation.
Endokrinologische Erkrankungen können ebenfalls auf Autoimmunreaktionen zurückzuführen sein. Diabetes mellitus Typ I ist eine entzündliche Erkrankung der Bauchspeicheldrüse und führt zu Diabetes, Gefäßschädigungen z.B. mit Beeinträchtigung der Niere, des peripheren Nervensystems und der Augen, und erfordert in der weiteren Folge Nieren- und Pankreastransplantationen. Auch Nebenniereninsuffizienz und Thyroiditis sind Autoimmunerkrankungen mit T-Zellpathogenese. Zudem werden manche Hauterkrankungen der Gruppe der Autoimmunerkrankungen zugerechnet. Einige Beispiele sind Psoriasis, Dermatitis Herpetiformis, Pemphigus Vulgaris: Bei diesen Erkrankungen können Infektionen Komplikationen hervorrufen. Alopezie führt zu Haarverlust. Schließlich gibt es auch neurologische Erkrankungen, die auf Autoimmunreaktionen zurückgeführt werden müssen. Die Multiple Sklerose betrifft beispielsweise das zentrale und das periphere Nervensystem, Myastenia Gravis die Muskulatur. Bei beiden neurologischen Autoimmunerkrankungen können Lähmungen als Kompliktionen auftreten.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch zur Therapie von chronisch entzündlichen Prozesse, die auf Immunpathogenese beruhen, verwendet werden, beispielsweise chronische Entzündungen nach viralen- oder bakteriellen Infektionen wie chronische Hepatitis bei Hepatitis- B-Virus- oder Hepatitis-C-Virus-Infektionen oder Gehirnentzündung nach Infektion mit dem Masern- Virus.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können ferner zur Therapie von Gewebe- und Organabstoßungsreaktionen eingesetzt werden. Die Immunantwort gegen fremde Strukturen auf den Oberflächen der Zellen des zu transplantierenden Organs, die im Wesentlichen durch die MHC (major histocompatibility cow ?/e )-Moleküle, die auf allen Zellen vorhanden sind, gebildet werden, schließen in der Regel eine Transplantation von Geweben und Organen aus, wenn Spender und Empfänger nicht miteinander kompatibel sind oder wenn die Immunantwort des Spenders nicht unterdrückt wird. Kompatibel im Sinne von Organtransplantationen bedeutet, daß Spender und Empfänger so umfangreich in den verschiedenen Alellen für Klasse I und Klasse II MHC übereinstimmen, daß es zu keiner Entzündungsreaktion kommt.
T-Zellen erkennen normalerweise mit ihren T-Zellrezeptoren Bruchstücke von körperfremden Proteinen assoziiert mit körpereigenem MHC. T-Zellen, die körpereigene Bruchstücke von Proteinen mit körpereigenem MHC erkennen, werden über verschiedene Wege inaktiviert bzw. werden nicht aktiviert. Im Falle einer Immunantwort gegen ein zu transplantierendes Organ erkennen die T-Zellen des Empfängers die Kombination aus Antigen und fremdem MHC, selbst wenn das gleiche Antigen im Zusammenhang mit eigenem MHC nicht erkannt wird.
Die erfindungsgemäßen Vektoren, die im Zusammenhang einer Transplantation zum Zwecke der Induktion einer Toleranz gegen das zu transplantierende oder bereits transplantierte Organ eingesetzt werden, kodieren und exprimieren Proteine und Strukturen der zu transplantierenden oder bereits transplantierten Organtypen. Die Vektoren, die beispielsweise im Zusammenhang mit einer Pankreas-Transplantation eingesetzt werden, kodieren für charakteristische Proteine aus der Pankreas. Vektoren, die bei Nieren- oder Lebertransplantationen eingesetzt werden, kodieren für charakteristische Proteine von Leber- oder Nierenzellen. Die kodierten Proteine schließen auch solche Proteine ein, die nicht organspezifisch sind wie beispielsweise Endothelzellen, jedoch im transplantierten Organ vorhanden sind, und ein Ziel der entzündlichen Reaktion im Fall von Organabstoßung darstellen.
Nachfolgend wird für drei Autoimmunerkrankungen, die Multiple Sklerose, die Myastenia gravis, die Rheumatoide Artritis, und Diabetes Mellitus Typ I, beispielhaft die Auswahl möglicher antigener Proteine, die von den erfindungsgemäßen Vektoren kodiert und exprimiert werden können, näher beschrieben.
Multiple Sklerose
Die Multiple Sklerose (MS), eine Erkrankung des menschlichen zentralen Nervensystems, ist durch perivaskuläre Entzündungen und durch Demyelinisierung gekennzeichnet. Die Ansammlungen von aktivierten T-Zellen in den frühen MS-Läsionen sowie in den umgebenden, noch unauffälligen Bereichen des weißen Markkörpers unterstreicht die Rolle der zeilvermittelten Immunität (T-Zellen) für die Entstehung der Multiplen Sklerose. Untersuchungen an einem allgemein akzeptierten Tiermodell, der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), die durch Immunisierung mit Myelinkomponenten ausgelöst werden kann, haben gezeigt, daß EAE durch aktivierte, myelinspezifische T-Zellen von einem Tier auf das andere übertragen werden kann. In der Regel können in einem Patienten mit Multipler Sklerose Immunzellen gegen unterschiedliche Bestandteile des Myelins, Bestandteile von Astrozyten, und Proteine, die nicht aus Zellen des zentralen Nervensystems stammen, nachgewiesen werden. Außerdem erkennen unterschiedliche Immunzellen verschiedene Bereiche einer Komponente (Epitope), wobei eine Zunahme der Zahl an erkannten Epitopen mit der Verschlechterung der Erkrankung korreliert.
Das Myelin basische Protein (MBP) ist ein abtrennbarer und relativ einfach aufzureinigender Bestandteil des Myelins. Etwa 30 % des Myelins im zentralen Nervensystems (ZNS) bestehen aus MPB. MBP war der erste Proteinbestandteil des Myelins, für den entzündungsauslösende Eigenschaften nachgewiesen wurden. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope, einzeln oder in Kombination: AS 1 - 20, AS 7 - 26, AS 16 - 38, AS 38 - 55, AS 50 - 68, AS 61 - 82, AS 71 - 89, AS 83 - 102, AS 94 - 117, AS 108 - 131, AS 124 - 141, AS 131 - 145, AS 139 - 153, AS 148 - 162, AS 153 - 170, AS 80 - 102, AS 81 - 99, AS 82 - 100, AS 83 - 99 , AS 85 - 99, AS 86 - 99 , AS 159 - 169.
Das Myelin Proteolipid Protein (PLP) ist mit mehr als 50 % der größte Bestandteil des Myelins im zentralen Nervensystem. PLP ist ein Membranprotein mit stark hydrophoben Eigenschaften. Proliferationsexperimente identifizierten im Blut von Personen mit Multipler Sklerose vorwiegend CD4+ PLP spezifische T-Zellen. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope, einzeln oder in Kombination: AS 40 - 60, AS 89 - 106, AS 103 - 120, AS 125 - 143, AS 139 - 154, AS 1 - 275, AS 95 - 117, AS 139 - 151 und AS 185 - 206.
Das Myelin Oligodendrozyten Protein (MOG) ist ein kleinerer Bestandteil (0,01 - 0,05 %) des Myelins. MOG besitzt ein Molekulargewicht von 26 - 28 kDa und ist aus einer immunglobulinähnlichen variablen Domäne und zwei hydrophoben (potentiellen) Transmembrandomänen aufgebaut. Untersuchungen an Tiermodellen, wo MOG sowohl eine T- Zell-vermittelte entzündliche Reaktion wie auch demyelinisierende Antikörper induziert, und Untersuchungen bei Multipler Sklerose identifizierten das Glykoprotein als ein wichtiges Antigen bei demyelinisierenden Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope des MOG, einzeln oder in Kombination: AS 1- 22, AS 35 - 55, AS 36 - 45, AS 34 - 56, AS 43 - 57, AS 64 - 96, AS 92 - 106, AS 134 - 148, AS 1 - 26, AS 14 - 39, AS 27 - 50, AS 38 - 60, AS 50 - 74, AS 63 - 87, AS 76 - 100, AS 89 - 113, AS 101 - 125, AS 162 - 178, AS 168 - 182, AS 14 - 36.
Das Myelin-assoziierte basische Protein auf Oligodendrozyten (myelin-associated oligodendrocytic basic protein, MOBP) ist einer der Hauptbestandteile des Myelin. Patienten mit schubweise verlaufender Multipler Sklerose zeigen eine zelluläre Immunreaktion gegen MOBP. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope, einzeln oder in Kombination: AS 1 - 19, AS 11 - 29, AS 21 - 39, AS 31 - 49, AS 37 - 60, AS 41 - 59, AS 51 - 69, AS 83 - 99, AS 1- 60, AS 27 - 50.
Das Oligodendrozyten-spezifische Protein (OSP) repräsentiert etwa 7 % des gesamten Myelins. OSP ist ein Transmembranprotein mit einer Länge von 207 Aminosäuren. Ein Vergleich der Tertiärstruktur des OSP zeigte eine Homologie zum Peripheren Myelinprotein 22 im ZNS. In der Rückenmarksflüssigkeit von Personen, die an Multipler Sklerose mit schubweisem Verlauf erkrankt sind, konnten Antikörper gegen OSP nachgewiesen werden. Im Menschen konnten T- Zellen mit einer Spezifität für OSP gezeigt werden. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope, einzeln oder in Kombination: AS 52 - 71, AS 72 - 91, AS 82 - 101, AS 102 - 121, AS 132 - 151, AS 142 - 161, AS 182 - 201, AS 192 - 207.
Das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) ist Bestandteil des Myelins im zentralen und peripheren Nervensystem. MAG ist ein Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 100 kDa, aufgebaut aus fünf extrazellulären immunglobulinähnlichen Domänen, einer einzelnen Transmembrandomäne und einer zytoplasmatischen Domäne. Zwei durch alternatives Spleißen gebildete Isoformen (L und S-Form), sind beschrieben, die zu unterschiedlichen Zeiten der Myelinbildung nachgewiesen werden. MAG ist in den periaxonalen Membranen der myelinbildenden Schwann' sehen Zellen und Oligodendrozyten lokalisiert und wird mit Glia- Axon- Wechselwirkungen in Verbindung gebracht. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Epitope, einzeln oder in Kombination: AS 20 - 34, AS 124 - 137, AS 354 - 377, AS 570 - 582. Weitere Ziele für pathogene Immunzellen sind die nachfolgend beschriebenen Proteine. Das Glykoprotein PO als Bestandteil des peripheren Nervensystems und der Schwann'schen Zellen. PO besitzt ein Molekulargewicht von 30 kDa und stellt über 50 % der Masse des kompakten Myelins im peripheren Nervensystem dar. Das periphere Myelinprotein 22 (PMP-22 / PAS-II) besitzt ein Molekulargewicht von 22 kDa. PMP-22 ist nicht spezifisch für Schwann'sche Zellen, sondern wird auch in anderen Geweben wie der Lunge, des Magens und des Herzens exprimiert. pl70k / SAG (Schwann Cell Membrane Glykoprotein) ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 170 kDa. SAG wird von myelinisierenden und nicht-myelinisierenden Schwann'schen Zellen produziert. Oligodendrozyten-Myelin-Glykoprotein (OMgp) ist ein Glykoprotein mit Homologie zu MBP, das ausschließlich im zentralen Nervensystem exprimiert wird. Schwann Cell Myelin Protein (SMP) ist ein weiteres Glykoprotein, das von Schwann'schen Zellen gebildet wird und in Hühnern entdeckt wurde. Das Glykoprotein weist 44% Homologie zu MAG auf. Weitere Polypeptide, die als Ziele für autoimmunreaktive Zellen identifiziert wurden, sind die Transaldolase, SlOOß, Alpha B Crystallin, 2', 3' -cyclic Nucleotide 3' -Phosphodiesterase (CNP) und GFAP. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren beispielsweise ferner für diese Proteine oder Bruchstücke davon, insbesondere für Bereiche oder Kombinationen von Bereichen, die T-Zell-Epitope tragen.
Myastenia gravis Myastenia gravis, eine Autoimmunerkrankung, die zu fortschreitender Muskelschwäche führt, wird durch Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor auf Muskelzellen verursacht. Die Produktion der Autoantikörper ist abhängig von spezifischen T-Helferzellen. 10 % der Patienten mit Myastenia gravis leiden unter epithelialen Tumoren des Thymus. Die Tumorzellen synthetisieren mRNAs, die für die - und ε-Untereinheiten des Acetylcholinrezeptors kodieren, und können so möglicherweise T-Zellen im Thymus bzw. zirkulierende T-Zellen fälschlicherweise gegen Epitope des Acetylcholinrezeptors sensibilisieren. Möglicherweise ist aber auch der Mechanismus der Toleranzinduktion in den heranreifenden Thymozyten gestört. Mehrfach wurden Bereiche in den Untereinheiten des Acetylcholinrezeptors beschrieben, die Epitope für B- und T-Zellen darstellen. Exemplarisch kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren Untereinheiten des Acetylcholinrezeptors oder Fragmente dieser Untereinheiten, im besonderen folgende Bereiche, einzeln oder in Kombination: AS cd - 437, AS α3 - 181, AS α37 - 114, AS 37 - 181, AS α62 - 90, AS 73 - 90, AS α75 - 90, AS α75 - 115, AS αl30 - 178, AS αl38 - 167, AS αl44 - 156, AS l49 - 158, AS αl49 - 163, AS αl46 - 160, AS ε201 - 219.
Rheumatoide Arthritis
Die Rheumatoide Artritis war eine der ersten systemischen Erkrankungen, die auf Autoimmunmechanismen zurückgeführt wurde. Im Wesentlichen zwei Aspekte der Rheumatoiden Artritis lassen auf eine grundlegende Störung des Immunsystems als Ursache der Erkrankung schließen. Ersten, die oftmals sehr massiven Infiltrationen von Lymphozyten, einschließlich CD4+ T-Zellen, im entzündeten hypertrophen Synovialgewebe, und zweitens, die Produktion von großen Mengen Rheumafaktor von B-Zellen und Plasmazellen im Synovium. Rheumafaktoren sind Antikörper, die gegen strukturgebende Bereiche der schweren Kette des IgG gerichtet sind. Die konkreten Gewebeschädigungen in den Gelenken und in „extra-articular structures" wird durch die entzündlichen „pannus" und Anhäufungen von granulären Zellen, die als Rheumatoide Knoten bezeichnet werden, zurückgeführt. Das wichtigste Argument, das für eine Beteiligung von T-Zellen an der Entstehung der Rheumatoiden Artritis spricht, ist die starke Assoziation der Erkrankung mit bestimmten MHC Klasse II Haplotypen und die Beobachtung, daß die Erkrankung im Mausmodel durch isolierte T-Zellen adaptiv übertragen werden kann. Unterschiedlichste Antigene wurden als mögliche Ziele der autoreaktiven Immunzellen beschrieben, darunter Strukturen des Bindegewebes wie zum Beispiel Kollagen, Proteoglykane und Antigene auf Chondrozyten, Hitzeschock-Proteine und exogene virale oder bakterielle Antigene. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren beispielhaft für diese Proteine oder Bruchstücke davon, insbesondere für Bereiche oder Kombinationen von Bereichen, die T-Zell- Epitope tragen, beispielsweise Typ-II-Collagen (CII).
Diabetes mellitus Typl Diabetes mellitus Typ 1 ist eine Autoimmunerkrankung mit multifaktoriellen Ursachen, einschließlich genetischer Veranlagung. Die Zerstörung der insulinproduzierenden ß-Zellen wird durch T-Lymphozyten verursacht. Sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen sind an der Pathogenese beteiligt und beide Subtypen sind für die Entstehung der Entzündungsreaktion gleichermaßen notwendig. Experimente mit NOD-Mäusen, die ein Tiermodel für die Diabetes darstellen, identifizierten CD8+ T-Zellen als die funktionellen Effektorzellen. Durch Übertragung von CD8+ T-Zellen prädiabetischer NOD-Mäuse auf SCID-NOD-Mäuse, die zwar die genetische Prädisposition jedoch keine Immunzellen vorweisen, konnte die Erkrankung übertragen werden. Eine Reihe möglicher Autoantigene bei Diabetes wurde bereits identifiziert. In prädiabetischen Patienten und solchen mit einer kürzlich diagnostizierten Diabetes wurden Antikörper gegen verschiedene Autoantigene nachgewiesen. Außerdem wurden CD4+ sowie CD8+ T-Zellen mit zum Teil unterschiedlicher Spezifität nachgewiesen. Die Gentherapievektoren im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung tragen funktionelle Bereiche bzw. Gene, die für antigene Proteine, Proteinfragmente oder Epitope und Kombinationen von Epitopen kodieren und exprimieren, die Ziele für CD4+ und / oder CD8+ T-Zellen darstellen. Antigene Proteine im Sinne dieser Erfindung sind solche Proteine, die von T-Zellen von Personen mit Diabetes im Zusammenhang mit MHC-Klasse I bzw. MHC Klasse II auf syngenen Zellen erkannt werden.
Ein Ziel der Autoimmunmechanismen bei Diabetes Typ I ist die Tyrosin-Phosphatase IA-2. In Patienten mit Diabetes sind Autoantikörper gegen das Protein nachweisbar, die fast immer gegen die intrazelluläre Domäne des Proteins gerichtet sind. In Personen mit einer genetischen Prädisposition für Diabetes sind Autoantikörper gegen IA-2 ein deutlicher Marker für eine rasche Verschlechterung der Erkrankung. Als antigenes Ziel für T-Zellen bei Diabetes können die Vektoren das gesamte IA-2-Protein oder Proteinfragmente kodieren und exprimieren. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Bereiche, einzeln oder in Kombination, die als epitoptragende Bereiche im Zusammenhang mit MHC-DR4 identifiziert wurden: AS 654 - 674, AS 709 - 732, AS 753 - 771, AS 797 - 817, AS 854 - 872, AS 955 - 975.
Unter den möglichen Autoantigenen bei Diabetes Typ I sind das Insulin und sein Vorläufer, das Proinsulin, die einzigen Proteine, die ausschließlich in den Beta-Zellen synthetisiert werden. Autoantikörper gegen Proinsulin können in prädiabetischen und diabetischen Patienten nachgewiesen werden. Durch Transfer von proinsulinspezifischen T-Zellen kann in NOD- Mäusen eine Diabetes erzeugt werden, was die Bedeutung des Proinsulins als Ziel der zellulären Immunantwort zeigt. Als antigenes Ziel für T-Zellen bei Diabetes können die Vektoren die gesamte Alpha-Kette, die gesamte Beta-Kette, das verbindende Peptid, das gesamte Proinsulinprotein oder Proteinfragmente, einzeln oder in Kombination, kodieren und exprimieren. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Bereiche, die als epitoptragende Bereiche identifiziert wurden: AS 1 - 15 (pl-15) und AS 35 - 50 (p35-50), aus dem Bereich des verbindenden Peptides zwischen Alpha- und Beta-Kette; AS 6 - 80 (a6-80), aus dem Bereich der Alpha-Kette; AS 9 - 23 und AS 10 - 25 (b 10-25), aus dem Bereich der Beta-Kette.
Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (GAD65) ist eine der Zielstrukturen für Autoimmunreaktionen bei Patienten mit Diabetes Typ I. Mononukleäre Zellen im Blut von Patienten reagieren auf das Protein mit Zellteilung und über 70 % der Patienten besitzen zudem Antikörper gegen GAD65. Eine Kombination aus Antikörpern gegen GAD65 und IA-2 bei Personen, die aufgrund ihres MHC-Typs eine genetische Prädisposition für Diabetes aufweisen, ist ein starker Hinweis auf eine sich entwickelnde Diabetes Typ I. Als antigenes Ziel für T-Zellen bei Diabetes können die Vektoren das gesamte GAD65-Protein oder Proteinfragmente kodieren und exprimieren. Beispielhaft kodieren und exprimieren die erfindungsgemäßen Vektoren folgende Bereiche, einzeln oder in Kombination, die als epitoptragende Bereiche im Zusammenhang mit MHC-DQ8 identifiziert wurden: AS 1 - 60, AS 51 - 120, AS 101 - 115, AS 111 - 180, AS 171 - 240, AS 206 - 220, AS 231 - 300, AS 291 - 360, AS 351 - 420, AS 411 - 480, AS 431 - 445, AS 461 - 475, AS 471 - 530, AS 521 - 585, AS 536 - 550, AS 121 -140, AS 201 - 220, AS 231 - 250, AS 471 - 490. GAD65 ist auch ein Ziel von CD8+ T-Zellen. Vektoren können daher auch den Bereich AS 15 - 23 kodieren und exprimieren. Weitere mögliche Bereiche sind AS 505 - 519 und AS 521 - 535.
Das Hitzeschockprotein Hsp60 stellt ein weiteres Ziel für aktivierte Immunzellen bei Diabetes Typ I dar. Die Vektoren kodieren und exprimieren beispielsweise den Bereich der AS 437 - 460
(Peptid 277), der als T-Zellepitop in NOD-Mäusen identifiziert wurde. In Personen mit Diabetes und in gesunden Kontrollpersonen wurden eine Reihe von Epitopen bzw. Bereichen im HspόO-
Protein, die T-Zell-Epitope beinhalten, identifiziert. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren beispielhaft für das gesamte Hsp60-Protein oder Bruchstücke, insbesondere für nachfolgend beschriebene Bereiche oder Kombinationen von Bereichen, die T-Zell-Epitope tragen: AS 1 -
20, AS 16 - 35, AS 31 - 50, AS 46 - 65, AS 61 - 80, AS 106 - 125, AS 121 - 140, AS 136 -
155, AS 151 - 170, AS 166 - 185, AS 195 - 214, AS 240 - 259, AS 255 - 275, AS 271 - 290,
AS 286 - 305, AS 301 - 320, AS 346 - 365, AS 421 - 440, AS 436 - 455, AS 466 - 485, AS
511 - 530.
Weitere Ziele der Autoimmunreaktion bei Diabetes Typ I sind bislang noch nicht charakterisierte Proteine in der Zellmembran der Beta-Zellen. Als weiteres Antigen wurde das Inselzellprotein ICA69 und ein Protein mit einem Molekulargewicht von 38 kDa in den sekretorischen Granula (Roep et al (1991) Lancet 337:1439-1441) identifiziert. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren beispielhaft für diese Proteine oder Bruchstücke davon, insbesondere für Bereiche oder Kombinationen von Bereichen, die T-Zell-Epitope tragen.
Expression apoptoseauslösende Liganden
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dadurch charakterisiert, daß sie Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für einen oder mehrere apoptoseauslösende Liganden kodieren. Apoptose ist ein auf der Ebene der Gene kontrollierter Prozeß, der an der Regulation der Homeostase, der Entwicklung von Geweben und Organen sowie der Entfernung von nicht mehr notwendigen Zellen des Immunsystems beteiligt ist. Apoptose ist auch an der Eliminierung von Zellen beteiligt, die aufgrund von Schäden an ihren Chromosomen oder aufgrund einer Infektion mit viralen Erregern Veränderungen erfahren haben. Normale Zellen werden durch sogenannte „Überlebenssignale" vor der Apoptose bewahrt. Proapoptotische Signale, die durch Schäden oder Infektion ausgelöst werden, leiten jedoch eine Abfolge von Vorgängen ein, die mit dem Tod der Zellen enden. Zelltod durch Apoptose ist gekennzeichnet durch eine Verdichtung des Chromatins, einer Fragmentierung der chromosomalen DNA, einer Art Blasenbildung der Membran, einer Schrumpfung der Zelle, und schließlich einem Zerfall der toten Zelle im membranumschlossene Vesikel (apoptotische Körperchen).
In der Zelle existieren im Wesentlichen zwei Signalwege, die zur Auslösung der Apoptose führen. Beide Wege reagieren auf unterschiedliche Auslöser. Der für die vorliegende Erfindung relevante Weg führt über eine Stimulation von Apoptoserezeptoren auf der Oberfläche der Zellen, wie CD95/Fas/Apol, TRAIL oder Apo3, und einer Vermittlung durch Adaptermoleküle, wie beispielsweise FADD und TRADD, zur Aktivierung der regulatorisch wirksamen Caspase 8 (FLICE, Initiator caspase) und nachfolgender Caspasen wie beispielsweise die Caspase 3 (effector caspase), die die Apoptose auslösen. Andere Signale wie DNA-Schädigungen, Mangel an Wachstumsfaktoren, fehlende Zellanhaftung oder aktivierte Onkogene führen dagegen zur Induktion einer Signalkaskade, an der Faktoren aus Mitochondrien wie Cytochrom C, APAFl und Faktoren der Bcl-Familie beteiligt sind. Diese Kaskade führt zur Aktivierung der Caspase 9 (Initiator caspase) und in der Folge zur Aktivierung der Caspase 3.
Die Apoptoserezeptoren gehören zu einer Unterfamilie von sogenannten „Todesrezeptoren", die einen Teil der Tumomekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-Überfamilie bilden. Die Mitglieder dieser Familie sind durch zwei bis vier Kopien cysteinreicher extrazellulärer Domänen charakterisiert. Die Apoptoserezeptoren wiederum verfügen über intrazelluläre „Todesdomänen" (death domains, DD), die für die Weitervermittlung des Apoptosesignals unentbehrlich sind. Durch Adapterproteine wird das Apoptosesignal an die Caspasen übertragen, die schließlich über mehrere Stufen die Apoptose einleiten.
Bei den apoptoseauslösenden Liganden handelt es sich um membranständige oder lösliche Proteine, beispielsweise CD95L/FasL/ApolL, Apo2L/TRAIL oder Apo3L, die mit spezifischen Rezeptormolekülen, wie CD95/Fas/Apol, TRAIL oder Apo3, auf anderen oder der selben Zelle wechselwirken, und dadurch Apoptose in den rezeptortragenden Zellen auslösen. Die apoptoseauslösenden Liganden gehören beispielsweise zur Überfamilie der Tumornekrosefaktoren (TNF). Mitglieder der TNF -Familie sind durch strukturelle und biochemische Eigenschaften charakterisiert. Es handelt sich um Typ II Transmembranproteine, mit Ausnahme von Lymphotoxin (LT) α und ß, die durch proteolytische Spaltung auch in lösliche Liganden überführt werden können. Die Liganden treten als Trimere mit drei identischen Untereinheiten auf, die durch die Wechselwirkung mit ihren spezifischen Apoptoserezeptoren eine Trimerisierung dieser Rezeptoren verursachen.
Caspasen sind eine Gruppe von Cystein-Proteasen. Bislang wurden 14 Caspasen in Säugetieren (einschl. dem Menschen) identifiziert. Caspasen erkennen Motive bestehend aus 4 Aminosäuren, die sie an der Carboxylseite der Aminosäure Aspartat schneiden. Caspasen werden als Zymogene synthetisiert, d.h. es handelt sich Vorläuferproteine mit einer sehr geringen Aktivität, die durch proteolytische Spaltung aktiviert werden. Bei den aktivierten Enzymen handelt es sich um Heterotetramere, bestehend aus jeweils zwei identischen gespaltenen Untereinheiten. Manche Caspasen werden durch autoproteolytische Spaltung aktiviert, andere durch weitere Caspasen. Die sogenannten Initiator-Caspasen (Caspase 8 und Caspase 9) starten die Lawine von sich selbst verstärkender Caspaseaktivität, indem sie sogenannte Effektor-Caspasen (Caspase 3) durch proteolytische Spaltung aktivieren.
Adapterproteine stellen eine Verbindung zwischen den Effektoren (Caspasen) und den Regulatoren (Rezeptoren Bcl-2-Familie) der Apoptose dar. Die Adaptoren wechselwirken über homotypische Interaktionen mit den drei Gruppen von Faktoren physikalisch über sogenannte death domains (DD), death ejfector domains (DED) und caspase recruitment domains (CARD). Die erfindungsgemäßen Vektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die für apoptoseauslösende Liganden kodieren. Die Vektoren kodieren beispielsweise für den Liganden CD95L, der an das Rezeptormolekül CD95/Fas/Apo-l bindet. Bei CD95 handelt es sich um ein glykosiliertes Membranprotein (Typ I) mit einem Molekulargewicht von etwa 45 - 52 kDa (335 Aminosäuren). Durch differentielles Spleißen der Boten-RNA entstehen auch mehrere lösliche Formen des Proteins. Die Expression des CD95-Moleküls wird durch Interferon-γ (IFN-γ), durch TNF sowie durch die Aktivierung von T-Zellen stimuliert. Unter natürlichen Bedingungen wird die durch CD95-vermittelte Apoptose durch die Bindung mit dem natürlich Liganden CD95L (FasL, Apo-l-L) ausgelöst. CD95L ist ein zu TNF-verwandtes Membranprotein (Typ II), das durch proteolytische Spaltung ebenfalls als lösliche Form vorkommen und an CD95 binden kann. Die Wechselwirkung von CD95L an CD95 führt zu einer Ca2~-unabhängigen (d.h. unterschiedlich zur Auslösung durch Perforin/Granzyme) Apoptose der CD95 -tragenden Zellen.
Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für das Protein TRAIL (APO-2L) kodieren, das an die spezifischen Rezeptormoleküle TRAIL-Rl (DR4), TRAIL-R2 (KILLER, DR5, TRICK2), TRAIL-R3 (LIT, DcRl) und TRAIL-R4 (TRUNDD, DcR2) bindet. TRAIL wurde natürlicherweise auf einer Reihe von Zellen nachgewiesen wie beispielsweise Typ II Interferon-stimulierte Monozyten, Zytomegalievirus- infizierte Fibroblasten, Typ I Interferon- und Antigen-stimulierte T-Zellen oder NK-Zellen. TRAIL induziert Apoptose in einer Reihe von transformierten Tumorzellinien und aktivierten T- Zellen. Die mRNA, die für den Rezeptor TRAIL-R2 kodiert, konnte in verschiedensten Geweben nachgewiesen werden, wie zum Beispiel Milz, Thymus und Lymphozyten im peripheren Blut. Zellen und Gewebe, die mRNA für TRAIL-R2 exprimieren, sind sensitiv für TRAIL-vermittelte Apoptose.
Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für den APO-3 Liganden (Apo3L / TWEAK) kodieren. Apo3L ist ein Transmembranprotein vom Typ II mit einer Länge von 149 Aminosäuren. Der extrazelluläre Bereich von ApoL3 zeigt hohe Homologie zu TNF. Apo3L-mRNA wurde in den unterschiedlichsten lymphoiden und nicht- lymphoiden Geweben nachgewiesen. ApoL3 bindet an das Rezeptormolekül Apo3 (DR3, WSL- 1 , TRAMP, LARD) und induziert Apoptose in den rezeptortragenden Zellen. Der Rezeptor für Apo3L wird vornehmlich auf der Zelloberfläche von Lymphozyten exprimiert, beispielsweise auf unstimulierten ruhenden Lymphozyten im peripheren Blut (PBL), Phytohämagglutinin (PHA) -behandelten PBL, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen und B-Zellen. Die Induktion der Apoptose über Apo3L wird durch FADD / MORT1 vermittelt. Die ApoL3 -vermittelte Apoptose wird durch die viralen Caspaseinhibitoren CrmA des Kuhpockenvirus und durch das p35 Protein von Bakuloviren blockiert.
Hemmung der Apoptose in den gentechnisch modifizierten Zellen
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dadurch charakterisiert, daß sie gegebenenfalls Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für ein oder mehrere Antiapoptosemoleküle kodieren. Eine Wechselwirkung von CD95, TRAIL, TRAMP, TNF oder Lymphotoxin mit ihren spezifischen Rezeptoren kann nicht nur zwischen unterschiedlichen Zellen erfolgen, sondern auch auf einer Zelle und dadurch autokrin zum Auslösen der Apoptose führen. Ein Beispiel hierfür ist die Apoptose aktivierter Immunzellen, der sogenannte activation induced cell death, der zur Entfernung nicht mehr benötigter Immunzellen führt. T-Zellen, die über ihren T- Zellrezeptor zur Vermehrung angeregt wurden, exprimieren auf ihrer Zelloberfläche CD95, das mit CD95L auf der Membran wechselwirkt.
Um in den Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren modifiziert wurden, eine solche autokrine Induktion bzw. eine parakrine Induktion durch andere Zellen beispielsweise in Zellkultur bei der Modifikation der Ausgangszellen zu verhindern, können die Vektoren Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für intrazelluläre Inhibitoren der Apoptose kodieren (Antiapoptosemoleküle). Diese Inhibitoren wechselwirken entweder mit den unterschiedlichen Rezeptormolekülen in der Zellmembran, mit den Adaptermolekülen, die das Todessignal zwischen den Rezeptoren und des Caspasen übertragen, oder mit den Caspasen selbst. Diese Inhibitoren stammen entweder aus den Zellen selbst und sind an der Regulation der Apoptose beteiligt. Oder es handelt sich um virale Proteine, die eine Apoptose in virusinfizierten Zellen verhindern, bis ausreichend Virusnachkommen produziert und freigesetzt sind.
Eine Hemmung der Induktion der Apoptose kann auf den verschiedenen Stufen der Kaskade aus Rezeptoren, Adaptoren und Caspasen erfolgen. Besonders Viren haben zahlreiche Strategien erfunden, um sich gegen die Apoptose als Immunmechanismus zu verteidigen. Die vorliegende Erfindung nutzt diese viralen und zellulären Mechanismen, um die Zellen, die durch die Vektoren verändert wurden, vor autokriner Induktion der Apoptose zu schützen. Die erfindungsgemäßen Vektoren können beispielsweise Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für adenovirale Proteine aus der E3 -Region des Virus kodieren. Diese Proteine hemmen membrangebundene biochemische Prozesse, die bei der Aktivierung des TNFR induziert werden. Das Protein E3-14.7K hemmt die Freisetzung von Arachidonsäure durch Phospholipase A2 (PLA ) als Folge einer Stimulation über den TNF-Rezeptor. Die adenoviralen Proteine E3- 14.5K und E3-10.4K formen den Komplex RTD, der eine Translokation der PLA2 vom Zytoplasma an die Zellmembran in der Folge einer Stimulation des TNFR verhindert. RTD verursacht außerdem eine rasche Internalisierung und den lysosomalen Abbau von membrangebundenem CD95.
Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für Proteine kodieren, die hohe Homologie zu den DED-Domänen aufweisen. Diese Proteine werden FLEPs bzw. die viralen Proteine werden vFLIPs genannt. Durch eine homotypische Wechselwirkung der FLIPs/vFLIPs mit dem Adapterprotein FADD über die DED-Domänen, wird die Signalkaskade zwischen Rezeptoren und FADD einerseits und der Caspase 8 (FLICE) andererseits blockiert und dadurch die Apoptose verhindert.
Ferner können die erfindungsgemäßen Vektoren Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für die nachstehend beschriebenen Proteine kodieren. Die Proteine MC 159 (Bertin et al. (1997) Proc Natl Acad Sei U S A 94: 1172-1176) und MC160 des Molluscum Contagiosum Virus binden an FADD und verhindern damit eine Rekrutierung der Caspase 8 und FADD. Die Proteine BORFE2 (E 1.1) von Herpesvirus BHV-4 und E8 des Pferdeherpesvirus EHV-2 (Bertin et al. (1997) Proc Natl Acad Sei U S A 94:1172-1176) binden die inaktive Procaspase 8 und verhindern auf diese Weise eine Wechselwirkung mit FADD und damit eine Aktivierung. Die Proteine K13 von HHV-8 und ORF71 von Herpesvirus Saimiri besitzen ebenfalls DED- Domänen und funktionieren auf dem gleichen Wege. Ferner können virale Proteine kodiert werden, die Signalfaktoren (FADD, TRADD, TRAF) der Apoptosekaskade binden und dadurch inaktivieren. Das Protein E1B-19K von Adenovirus, das Homologie zum zellulären Protein Bcl- 2 aufweist, wechselwirkt mit FADD und blockiert dadurch die Signalübertragung von TNFR und CD95. Außerdem ist E1B-19K zudem in der Lage, Bcl-2 funktioneil zu ersetzen und eine Aktivierung über den Weg der Mitochondrien (via Caspase 9) zu verhindern. Das LMP-1- Protein von Epstein-Barr- Virus wechselwirkt mit verschiedenen TRAF-Molekülen (TNFR- associated factors) und blockiert dadurch die Signalübertragung vom TNFR. Außerdem bindet LMP-1 auch TRADD. Vermutlich aufgrund einer modifizierten Bindestelle für TRADD kommt es jedoch nicht zur Auslösung der Apoptose-Signalkaskade. LMP-1 induziert zusätzlich die Expression der antiapoptotischen Proteine A20, Bcl-2 und Mcl-1. Die erfindungsgemäßen Vektoren exprimieren ferner beispielsweise das LT-Protein von SV40, das über einen Proteinkinase C-vermittelten Weg eine Resistenz gegen Fas-induzierter Apoptose vermittelt. Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren beispielsweise für die Polyomaproteine ST und MT, die beide eine Resistenz gegen CD95- bzw. TNFR-vermittelte Apoptose vermitteln. Das ST-Protein erreicht dies durch Bindung und Hemmung des Proteins PP2A. Das MT-Protein aktiviert direkt Signalwege, die ein Überleben der Zelle fördern. Dazu gehört die PI3-Kinase, die in Folge das proapop totisch wirkende Protein Bad phosphoryliert und damit inaktiviert.
Inhibitoren von Caspasen können ebenfalls auf den erfindungsgemäßen Vektoren kodiert werden, um autokrine Induktion der Apoptose in den veränderten Zellen zu verhindern. Das p35 Protein der Baculoviren Autographica californica nuclear polyhedrosis Virus (AcNPV) und Bombyx mori NHV (BmNPV) wird in der frühen Phase der Virusvermehrung synthetisiert und verhindert Apoptose durch eine Reihe unterschiedlichster Stimuli. p35 blockiert die Induktion der Apoptose durch TNF- und CD95-Liganden. p35 wird von einer Reihe von Caspasen (Caspase 1, 3, 6, 7, 8 und 10) gespalten. Die Spaltprodukte werden aber nicht freigesetzt, sondern bleiben gebunden und bilden mit den Caspasen einen stabilen inhibitorischen Komplex. p35 kann beispielsweise von den erfindungsgemäßen Vektoren kodiert werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch für virale Proteine kodieren, die Homologie zu zellulären Serpinen aufweisen. Serpine sind chymotrypsinähnliche Serinproteasen und hemmen eine Reihe unterschiedlicher Caspasen. CrmA des Kuhpockenvirus hemmt die durch CD95L und TNFR induzierte Apoptose, indem es die Caspasen 1 und 8 blockiert. Die SPI-1 und SPI-2- Proteine des Hasenpockenvirus und das Protein B13R des Vacciniavirus weisen hohe Homologie zu CrmA auf und hemmen ebenfalls die Apoptose durch CD95L und TNF. Entsprechende antiapoptotische Eigenschaften haben die Proteine Serp-1 und Serp-2 des Myxomavirus und SPI- 4 des Hasenpockenvirus. Ferner können homologe Proteine zu zellulären cLAPs kodiert werden, wie beispielsweise vIAPs, oder zelluläre Proteine, wie beispielsweise FLAME- 1 oder I-FLICE.
Cydia pompnella granulosis Virus (CpGP), Orgyiapse audotsugata polyherdosis Virus (OpMNPV) und AcNPV kodieren für virale IAPs (vIAPs), die in der Signalkaskade oberhalb von p35 wirken. vIAPs binden und hemmen inaktive Procaspasen und Caspase 8, können aber nicht wie p35 bereits aktivierte Caspasen hemmen. cIAPs wechselwirken mit TRAF-Molekülen, können aber auch Apoptose durch nicht TNFR-assoziierte Prozesse verhindern. Notwendig für die antiapoptotische Aktivität ist ein konserviertes RTNG-Finger-Motiv und wenigstens ein sogenanntes BIR-Motiv (baculovirus IAP repeat). Bei FLAME- 1 handelt es sich um ein zelluläres Protein, das die Apoptose durch CD95 / TNF-Rezeptor hemmt (Srinivasula et al. (1997) J Biol Chem 272:18542-18545). FLAME-1 weist hohe Homologie zu Caspase 10 und Caspase 8 (FLICE) auf. Zwei benachbarte Regionen befinden sich im aminoterminalen Bereich und zeigen Homologie zu den DED-Domänen von FADD, die homotypische Wechselwirkungen mit anderen DED-Proteinen ermöglichen. Eine dritte benachbarte Region zeigt Homologie zur funktionellen Caspasedomäne der Caspasen 8 und 10. FLAME- 1 wechselwirkt direkt mit FADD, Caspase 8 und Caspase 9, besitzt jedoch keine Caspaseaktivität. FLAME-1 wirkt daher als dominant negativer Repressor der Apoptose durch CD95 / TNF-Rezeptor. Der inhibitorische Effekt ergibt sich aus der Blockierung des Rezeptorkomplex aus CD95 / TNR-Rezeptor / FADD durch das funktioneil inaktive FLAME- 1 -Protein. I-FLICE ist ein weiterer zellulärer Inhibitor (Hu et al. (1997) J Biol Chem 272:17255-17257), der von den erfindungsgemäßen Vektoren kodiert und exprimiert werden kann, um Apoptose in den gentherapeutisch veränderten Zellen zu verhindern. I-FLICE zeigt strukturelle Homologien zu FLICE / Caspase 8 und Caspase 10. Im aminoterminalen Bereich befinden sich zwei benachbarte Domänen mit Homologie zu DED- Domänen von FADD. Im carboxyterminalen Bereich existiert eine Domäne mit Homologie zu Caspasedomäne. I-FLICE zeigt jedoch keine Caspaseaktivität und wirkt als dominant negative Inhibitor der Apoptose durch CD95 / TNF-Rezeptor. Im Gegensatz zu FLAME- 1 bindet I- FLICE nur an FLICE / Caspase 8 und Caspase 10, jedoch nicht an FADD. I-FLAME wird daher nicht durch die Bindung von CD95L / TNF an den Rezeptorkomplex aus CD95 / TNR-Rezeptor / FADD rekrutiert. Der inhibitorische Effekt wird durch Komplexierung und dadurch Inaktivierung der Caspasen 8 und 10 bewirkt.
Eine Hemmung der Apoptose in den durch die erfindungsgemäßen Vektoren veränderten Zellen kann auch durch eine Hemmung der Expression der an der Induktion beteiligten Proteine (Apoptoserezeptoren, Adaptoren und Caspasen), z.B. über einen Antisense-Ansatz, erzeugt werden. Die von den erfindungsgemäßen Vektoren kodierten und synthetisierten Antisense-RNAs sind entweder ausschließlich gegen ein Protein in der Apoptose-Signalkette gerichtet und hemmen die Apoptose über einen bestimmten Weg, beispielsweise über membranassoziierte Rezeptoren oder über einen Mitochondrien-vermittelten Weg. Altemativ schließt die Antisense-KNA verschiedene Bereiche ein, die spezifisch für unterschiedliche Ziele in der Signalkaskade zur Auslösung der Apoptose sind. Diese unterschiedlichen Bereiche in der Antisense-RNA sind spezifisch für Rezeptorproteine, Adapterproteine, und / oder Caspasen. Die erfindungsgemäßen Vektoren synthetisieren entweder eine einzelne Antisense-RNA oder eine Kombination aus unterschiedlichen
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die spezifisch beispielsweise gegen einzelne Apoptoserezeptoren, Caspasen oder Adaptermolekülen gerichtet sind. Alternativ exprimieren die Vektoren eine einzige Antisense-RNA, die mehrere Bereiche enthält, die jeweils spezifisch für einzelne Apoptoserezeptoren, Caspasen oder Adaptermolekülen sind, und in Kombination die Expression mehrerer an der Apoptose beteiligter Proteine verhindert.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung tragen die Vektoren beispielsweise funktionelle Bereiche, die Antisense-RNA zu Apoptoserezeptoren in eukaryotischen Zellen synthetisieren. Durch eine Blockierung der Expression von Rezeptormolekülen, die proapoptotisch wirksame Signalkaskaden starten, wird eine autokrine Stimulation der Apoptose in der mit dem Gentherapievektor veränderten Zelle auf der frühesten Stufe blockiert.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können beispielsweise für CD95-spezifische Antisense-RNAs kodieren und die Expression von CD95/Fas blockieren. Durch die Blockierung von CD95 wird eine Induktion der Apoptose über CD95L/FasL verhindert. Die Gentherapievektoren kodieren und exprimieren beispielsweise TNFR-spezifische Antisense-RNAs, die eine Expression von TNFR blockieren und die Zelle vor TNF-vermittelte Apoptose schützen. Alternativ kodieren und exprimieren die Vektoren beispielsweise TRAIL-Rl bzw. TRALL-R2-spezifische Antisense- RNAs, die eine Expression der Rezeptoren TRAIL-Rl bzw. TRAIL-R2 verhindern. Dadurch werden die Zellen resistent gegen TRAIL-vermittelte Apoptose. Alternativ kodieren und exprimieren die Gentherapievektoren TRAMP -Rezeptor-spezifische Antisense-RNAs, die eine Expression von TRAMP-Rezeptor in den veränderten Zellen verhindern. Dadurch werden die Zellen resistent gegen TRAMP-vermittelte Apoptose. Die erfindungsgemäßen Vektoren können femer Nukleinsäuresequenzen umfassen, die beispielsweise Antisense-RNA zu Adapterproteinen in eukaryotischen Zellen kodieren. Da diese Adaptermoleküle eine Ebene unter den Apoptoserezeptoren funktionieren und ein Adaptermolekül von mehreren Apoptoserezeptoren genutzt wird, kann durch die Blockierung der Expression eines einzelnen Adapterproteins mehr als nur ein Apoptosesignalweg blockiert werden. Durch die Blockierung eines einzelnen Adaptermoleküls kann eine Resistenz gegen unterschiedliche apoptoseauslösende Liganden erreicht werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren synthetisieren entweder eine einzelne Antisense-RNA oder eine Kombination aus unterschiedlichen Antisense-RNAs, die spezifische gegen einzelne Adapterproteine gerichtet sind. Alternativ exprimieren die Vektoren eine Antisense-RNA, die einzelne Bereiche enthält, die jeweils spezifisch für ein Adapterprotein sind, und in Kombination die Expression mehrerer Adapterproteine verhindert.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung können die Gentherapievektoren beispielsweise FADD- spezifische Antisense-RNAs kodieren, die eine Expression von FADD verhindern. Durch eine Hemmung der FADD-Expression wird eine Signalübertragung durch die Apoptoserezeptoren CD95, TNFR, TRAIL-Rl, TRAIL-R2 und TRAMP blockiert. Die Zellen werden dadurch resistent gegen eine Induktion der Apoptose über CD95L, TNF, TRAIL und CD3. Femer können die Vektoren beispielsweise für TRADD-spezifische Antisense-RNAs kodieren, die eine Expression von TRADD verhindern. TRADD ist spezifisch an der Auslösung der Apoptose durch TNF / TNFR beteiligt. Eine Hemmung der Expression von TRADD blockiert dadurch spezifisch die Auslösung der Apoptose durch TNF / TNFR. Femer können die Vektoren APAFl -spezifische Antisense-RNAs kodieren. APAFl ist ein Adapterprotein, das bei der Auslösung der Apoptose über den Mitochondrien-assoziierten Weg eine zentrale Rolle spielt. APAFl wird zusammen mit Cytochrom C aus den Mitochondrien freigesetzt und assoziiert im Zytoplasma der Zelle mit dATP zu einem trimeren Komplex, der Caspase 9 aktiviert. Eine Hemmung der Synthese von APAFl führt zu einer Blockade der Apoptose über den Mitochondrien-assoziierten Weg.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung können die Gentherapievektoren femer Antisense-RNA gegen Caspasen, z.B. Caspase 1, 3, 8 oder 9, in eukaryotischen Zellen kodieren. Die erfindungsgemäßen Vektoren synthetisieren entweder eine einzelne Antisense-RNA oder eine Kombination aus unterschiedlichen Antisense-RNAs, die spezifische gegen einzelne Caspasen gerichtet sind. Alternativ exprimieren die Vektoren eine Antisense-RNA, die einzelne Bereiche enthält, die jeweils spezifisch für eine Caspase sind, und in Kombination die Expression mehrerer Caspasen verhindert.
Suizidenzyme
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind dadurch charakterisiert, daß sie gegebenenfalls Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für Suizidenzyme kodieren, durch die gentechnisch veränderte Zellen jederzeit, z.B. in vivo, eliminiert werden können. Die Suizidgene kodieren und exprimieren beispielsweise Enzyme, die biologische Substrate (Prodrugs), die von Außen dem Körper zugeführt werden, in toxische Substanzen umwandeln bzw. die Substanzen so modifizieren, daß diese von den Enzymen der Zelle als Substrate verwendet werden. Alternativ kodieren Suizidenzyme für an sich toxische Substanzen, jedoch ist die Expression dieser Gene in der gentechnisch veränderten Zelle strikt kontrolliert. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung sind die Gene für an sich toxische Substanzen in der Zelle stark reprimiert und werden nicht synthetisiert. Durch Zugabe von biologischen oder chemischen Substanzen werden die Gene, die für die toxischen Proteine kodieren, aktiviert und es kommt zum Absterben der Zellen. Die im Zusammenhang mit dieser Erfindung beschriebenen Vektoren kodieren bevorzugt für Suizidgene, die nicht oder wenig toxische Prodrugs in toxische Substanzen umwandeln.
Die verwendeten Prodrugs müssen deutlich geringere Toxizität aufweisen als die aktivierten Substanzen, und müssen gute Substrate für die aktivierenden Enzyme darstellen. Außerdem müssen diese Substanzen unter physiologischen Bedingungen ausreichend chemisch stabil sein, und gute pharmakologische und pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen. Je nach Typ werden einige Prodrugs in die Zellen aufgenommen und intrazellulär in die toxische Substanz umgewandelt. Andere Prodrugs werden extrazellulär aktiviert. Dementsprechend müssen die Prodrugs bzw. die aktivierten toxischen Substanzen leicht von den Zellen aufgenommen werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren kodieren und exprimieren beispielsweise für die Thymidinkinase (TK) des Herpes-Simplex-Virus (HSV). Die TK von HSV phosphoryliert Acyclovir zu Acyclovir-Diphosphat, das von zellulären Kinasen weiter phosphoryliert wird. Die Thymidinkinase der eukaryotischen Zelle kann aufgrund ihrer Substratspezifität Acyclovir nicht phosphorylieren, weshalb nicht-infizierte Zellen bzw. HSV-TK-negative Zellen resistent gegen Guanosinanaloga sind. Durch systemische Gabe von Acyclovir bzw. Gancyclovir können selektiv die HSV-infizierten bzw. Tymidinkinase-positiven Zellen, die beispielsweise mit den Therapievektoren dieser Erfindung verändert wurden, eliminiert werden.
Femer können die erfindungsgemäßen Vektoren für die Thymidinkinase von Varizella-Zoster- Virus (VZV) kodieren. Die TK von VZV ist in der Wirkung vergleichbar mit der TK von HSV, mit dem Unterschied, daß die TK von VZV 6-Methoxipurin-Arabinonukleosid verwendet.
Femer können die in dieser Erfindung genannten Vektoren Enzyme kodieren, die folgende Prodrug/Enzym-Systeme aktivieren: Carboxylesterase (CA) aktiviert Irinotecan; Cytosin- Desaminase (CD) aktiviert 5-Fluorocytosin (5-FC); Carboxypeptidase G2 (CPG2) aktiviert 2- Chloroethyl-2-Mesyloxyethyl-Aminobenzoyl-L-Glutaminsäure (CMDA) und CJS278H sowie die selbst-aktivierenden Prodmgs Doxorubicin und Daunorubicin; Cytochrom P450 (Cyt 450) aktiviert Cyclophosphamid (CP), Ifosfamid (IF), Ipomeanol und 2-Aminoanthracen (2-AA); Deoxycytidin-Kinase (dCK) aktiviert Cytosin-Arabinose (ara-C); Nitroreduktase (NR) aktiviert CB1954 (5-Aziridinyl-2,4-Dinitrobenzamid); Purin-Nukleosid-Phosphorylase (PNP) aktiviert 6- Methylpurin-2'-Deoxyribonukleosid (6-MePdR); Thymidin-Phosphorylase (TP) aktiviert 5'- Deoxy-5-Fluorouridin (5'-DFUR); Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (XGPRT) aktiviert 6-Thioxanthin (6-TX) und 6-Thioguanin (6-TG). Femer können die erfindungsgemäßen Vektoren für die bakterielle Uracil-Phosphoribosyltransferase kodieren, die 5-Fluoruracil aktiviert, oder für ein Fusionsprotein aus der Cytosin-Deaminase (FCY1) und Uracil- Phosphoribosyltransferase (FUR1) aus Saccharomyces cerevisiae, das Fluorocytosin (5-FC) aktiviert.
Erfindungsgemäße Vektoren zur Gentherapie
Die Erfindung betrifft einen Gentransfervektor, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nukleinsäuresequenz, kodierend für einen oder mehrere apoptoseauslösende(n) Liganden, eine zweite Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antigen(e) und gegebenenfalls, eine dritte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antiapoptosemolekül(e), und gegebenenfalls eine vierte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Suizidenzym(e). Besonders bevorzugt ist ein Gentransfervektor, wobei die erste und zweite Nukleinsäuresequenz so funktional miteinander verbunden ist, daß die Expression der zweiten Nukleinsäuresequenz von der Expression der ersten Nukleinsäuresequenz abhängig ist, d.h. die Expression der Antigene ist physikalisch an die Expression der apoptoseauslösenden Liganden gekoppelt und von diesen abhängig. Besonders bevorzugt ist femer ein Gentransfervektor, wobei die dritte und vierte Nukleinsäuresequenz so funktional miteinander verbunden ist, daß die Expression der dritten Nukleinsäuresequenz von der Expression der vierten Nukleinsäuresequenz abhängig ist, d.h. die Expression der Antiapoptosemoleküle ist immer an die Expression der Suizidenzyme gekoppelt und von diesen abhängig.
Antigenpräsentierende Zellen (APCs) können zur Behandlung von Erkrankungen wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, oder Erkrankungen, die auf einer Immunpathogenese beruhen, oder Erkrankungen, die auf einer Abstoßung transplantierter Gewebe oder Organe beruhen, mit einem der erfϊndungsgemäßen Vektoren behandelt werden. APCs können beispielsweise mit einem Gentransfervektor, umfassend Nukleinsäuresequenzen kodierend für für die Antigene, apoptoseauslösende Liganden, Antiapoptosemoleküle und für Suizidenzyme, behandelt werden. Femer können die APCs mit jeder Art von Kombinationen von Vektoren behandelt werden, beispielsweise mit mehreren der erfindungsgemäßen Vektoren, die für unterschiedliche Antigene kodieren. Die APCs können beispielsweise auch mit einer Kombination von erfindungsgemäßen Vektoren behandelt werden, die für Antigene kodieren, und erfindungsgemäßen Vektoren, die für Antiapoptosemoleküle kodieren. Kombinationen von Vektoren werden dann sinnvoll, wenn beispielsweise die einzelnen Nukleinsäurebereiche der Vektoren so groß sind, daß sie beispielsweise eine Herstellung oder eine Anwendung des Vektors negativ beeinflussen, oder wenn APCs mit Vektoren behandelt werden sollen, die unterschiedliche Antigene, Apoptoseliganden, Antiapoptosemoleküle oder Suizidenzyme kodieren.
Kontrollelemente zur Expression von Geninformationen
Die erfindungsgemäßen Gentransfervektoren umfassen Nukleinsäuren, die neben den ersten bis vierten vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen weitere Sequenzen und funktionelle Regionen z.B. zur Kontrolle und Steuerung der Expression von Genen z.B. in Säugerzellen enthalten können. Diese Sequenzen und funktionellen Regionen können Promotoren und/oder Promotorelemente sein, vorzugsweise virale Promotorsequenzen für die Expression von Gensequenzen in Säugerzellen. Einige Beispiele viraler Promotorsequenzen sind der frühe SV40 Promotor, der Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV) LTR Promotor, der humane Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) LTR Promotor, der Adenovirus major /αte-Promotor (Ad MLP) und der Herpes- Simplex-Virus (HSV) Promotor. Zudem sind auch Promotoren nichtviraler Gene, wie z.B. Promotoren der murinen 3-Phosphoglycerat-Kinase, des humanen Ubiquitin C und des murinen Metallotheionein Gens zur effizienten Expression von Gensequenzen in Säugern geeignet. Die Expression kann hierbei durch einen konsumtiven oder regulierbaren (induzierbaren) Promotor erfolgen. So kann exemplarisch in bestimmten Zelltypen, wie Hormon-stimulierbaren Zellen, ein Glukocorticoid-induzierbarer Promotor verwendet werden.
Die Expressionsraten können durch die Kombination oben genannter Promotorelemente mit sogenannten E/z/zα«cer-Elementen üblicherweise gesteigert werden. Hierbei weisen virale EMÄαHcer-Elemente oftmals eine besondere Effizienz auf, da sie gewöhnlicherweise ein breiteres Wirtsspektrum als Enhancer aus Säugerzellen aufweisen. Sehr effiziente Vertreter viraler Enhancer schließen den SV40 early-Gen-Enhancer und die Promotor/En/jαncer-Kombinationen aus dem LTR des Rous- Sarkom- Virus sowie des humanen Zytomegalievirus mit ein. Zudem können regulierbare Enhancer-Elemente verwendet werden, die z.B. nur in Gegenwart von Induktoren, wie Hormonen oder Metallionen aktiv sind.
Diese Sequenzen und funktionellen Regionen können femer Leader-Sequenzen und/oder Prozessierungssequenzen, z.B. eine Proteasespaltstelle, sein, vorzugsweise die adenovirale dreiteilige Leader-Sequenz sowie eine Vielzahl von Zeα er-Sequenzen von Säugerproteinen, wie der Leader des Erytropoietingens und der iPA-Leader, um eine effiziente Sekretion von Fremdproteinen aus Säugerzellen zu vermitteln.
Diese Sequenzen und funktionellen Regionen können femer Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen sein. Einige sehr effiziente poly-A-Signale für die Verwendung in Säugerexpressionsvektoren stammen beispielsweise von dem Rinder- Wachstumshormon, dem Maus-ß-Globin, der frühen SV40-Transkriptionseinheit und dem Herpes-Simplex- Thymidinkinase-Gen. Prokaryontische Transkriptionsterminatoren sind detailliert beschrieben und ihr Einbau zeigt vielfältige positive Effekte auf die Genexpression. In Eukaryonten wurde eine Konsensussequenz mit der Nukleotidabfolge ATC AAA (A7T) TAG GAA GA in der Terminationsregion von 9 Genen identifiziert.
Diese Sequenzen und funktionellen Regionen können femerTranslationskontrollelemente sein. So fördert eine optimale Kozak-Sequenz (CC(A/G)CcaugG) die Translationsinitiation eukaryontischer mRNAs. Den Purinen A oder G in Position -3 und dem G direkt oberhalb des Startcodons kommt hierbei eine besondere Bedeutung für die optimale Translationsinitiation zu.
Femer kann die Expressionseffizienz von cDNA-Gensequenzen, die keine Introns enthalten, in einigen Fällen durch Fusion eines Introns im 5' Bereich des ORF signifikant um das 10 - 20 fache gesteigert werden. Eine besondere Effektivität in unterschiedlichen Zellen besitzt hierbei, exemplarisch für eine Vielzahl unterschiedlicher Introns, ein synthetisches Intron-SIS, das durch die Fusion eines Adenovirus-Spleiß-Donors mit einem Immunglobulin-Gen-Spleiß-Akzeptor erzeugt wurde oder ein SV40 19S late mRNA Intron.
Femer kann die Translationsinitiation an dem korrekten Startcodon durch die Anwesenheit von zusätzlichen AUG-Codons in der 5' untranslatierten Region stark beeinträchtigt werden. Eine derartige Inhibition kann durch die Anwesenheit eines Translationsterminationscodons in-frame mit dem oberhalb gelegenen AUG minimiert werden. Zudem wird die Translation oft durch die Tendenz definierter Sequenzen in der 5Λ untranslatierten Regionen (UTR) zur Ausbildung von Sekundär Strukturen beeinträchtigt. Femer können sich destabilisierende Motive innerhalb von Fremdgensequenzen negativ auf die Expressionsraten auswirken. Vertreter derartiger Sequenzabfolgen sind exemplarisch AU-reiche Sequenzen im 3" UTR Bereich vieler instabiler Säuger mRNAs. Sehr effiziente destabilisierende Sequenzmotive sind UUAUUUAUU oder UUAUUUA(U/A)(U (JA). Zur Steigerung der Expression der gewünschten Fremdgene sollen diese Sequenzmotive entfernt bzw. inaktiviert werden.
Femer kann die Expressioneffizienz der gewünschten Nukleinsäuresequenz durch die Auswahl und Verwendung geeigneter, wirtsspezifischer Codons gesteigert werden (Codon Usage).
Gewöhnlicherweise beinhaltet ein Expressionsvektor eine Kombination aus einem Promotor, einem Polyadenylierungssignal und einer Transkriptionsterminationssequenz. Enhancer, introns mit funktionellen Splice Donor und Akzeptorstellen sowie Leadersequenzen können zudem, falls erforderlich, modular in die Konstrukte eingebaut werden. Expressionskonstrukte sind oft in einem Replikon enthalten, wie z.B. in extrachromosomalen Elementen (z.B. Plasmiden) die in der Lage sind stabil in einem Wirt, wie z.B. einer Säugerzelle zu überdauern. Säugerreplikationssysteme beinhalten solche, die von animalen Viren abgeleitet sind und trans- aktive Faktoren zur Replikation benötigen. Beispielsweise replizieren Plasmide, welche die Replikationssysteme von Papovaviren, wie z.B. SV40 oder Polyomaviren enthalten, in Anwesenheit des zugehörigen viralen T Antigens in extern hoher Kopienzahl. Weitere Beispiele für Säugerreplikons beinhalten solche, die von dem Rinderpapillomvirus und dem Epstein-Barr- Virus abgeleitet sind. Weiterhin kann ein Replikon zwei Replikationssysteme beinhalten, die ein Überdauern im Wirt gewährleisten, z.B. ein Replikationssystem für die Genexpression in Säugern und ein System für die Amplifikation des Vektors in Bakterien. Das Plasmid pMT2 ist ein Beispiel für einen derartigen Säuger/Bakterien Shuttle Vektor.
Regulation der Expression der apoptoseauslösenden Liganden Die Nukleinsäuresequenzen, die für apoptoseauslösende Liganden kodieren, können in der Weise reguliert werden, daß die Expression der Liganden an- und abgeschalten werden kann. Die Expression der apoptoseauslösenden Liganden kann in transduzierten Zellen vollständig abgeschalten werden. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Herstellung stabil vektorproduzierender Zellinien oder für die Erzeugung der Köderzellen. Da die meisten Zellen konstitutiv Apoptoserezeptoren auf der Oberfläche tragen, dazu gehören auch die zur Herstellung viraler Gentransfervektoren verwendbare Verpackungszellinien und die zu transduzierenden, antigenpräsentierenden Zellen, würde eine Transduktion dieser Zellen mit dem Gen für einen apoptoseauslösenden Liganden zur parakrinen und autokrinen Induktion der Apoptose fuhren. Durch eine Abschaltung der Expression des Liganden in den Verpackungslinien bzw. in den transduzierten Zellen in Kultur wird eine unspezifische Wechselwirkung zwischen diesen Zellen verhindert und eine Kultivierung ermöglicht.
Die Abschaltung der Expression der Liganden erfolgt vorzugsweise über die nachstehend beschriebenen Verfahren. 1. Mittels Verwendung des RevTet-Systems der Firma ClonTech, USA. 2. Eine andere Möglichkeit, die auf dem Prinzip der Doppelinfektion mit einem Expressionsvektor und einem Regulationsvektor beruht, basiert auf der Verwendung bakterieller Regulationssysteme in Eukaryoten. Das Gen für den apoptoseauslösenden Liganden steht unter der Kontrolle des starken prokaryotischen T7-Promotors. Da weder in der Verpackungslinie noch in den spater zu transduzierenden Zellen T7-Polymerase vorhanden ist, wird der Ligand nicht exprimiert Erst durch die Kotransduktion des Gens für die T7-Polymerase mittels eines zweiten Regulationsvektors kommt es in den doppelt transduzierten Zellen zur Expression des Liganden 3 Ein weiteres geeignetes System ist das Cre-loxP System des Bakteπophagen Pl
Koexpression von Antigenen und apoptoseauslösenden Liganden bzw. Antiapoptosemolekülen und Suizidenzymen
Vorzugsweise expnmieren die erfmdungsgemaßen Vektoren die Antigene bzw die Bestandteile von Antigenen, die von Immunzellen erkannt werden, nur in Zusammenhang mit den apoptotisch wirksamen Liganden Diese Koexpression wird durch eine Koppelung der Nukleinsäuresequenzen auf einem gemeinsamen Transkript erreicht Dadurch wird verhindert, daß die transduzierten Zellen durch die Präsentation von Bestandteilen des Antigens spezifische T-Zellen in vivo stimulieren ohne sie zu zerstören
Zur Expression von zwei oder mehr Genen unter der transkriptioneilen Kontrolle eines konsumtiven oder regulierbaren Promotors kann eine interne πbosomale Eintrittsstelle (IRES), verwendet werden Beispielsweise werden die IRES von Picornaviren und des Hepatitis-C- Virus, des BiP (immunoglobuhn heavv chain binding protein), oder retrovirale 7i?ES-Sequenzen verwendet
Eine weitere Möglichkeit zur Expression von zwei oder mehreren Genen unter der transkπptionellen Kontrolle eines starken Promotors besteht in der Verwendung von Sequenzen, die eine Verschiebung des πbosomalen Leserasters wahrend der Translation bedingen, wodurch ein Stopkodon überlesen wird. Üblicherweise bedingen diese frame shift-SignÜQ auf RNA Ebene, daß Die Ribosomen an einer spezifischen Stelle in den -1 Leserahmen (m 5" Orientierung) versetzt werden und in dem neuen Leserahmen die Translation vorsetzen Derartige -1 Frameshift Signale wurden bei einer Vielzahl unterschiedlicher Virusfamilien, wie beispielsweise Retroviren, Coronaviren, Astroviren, Totiviren, Podoviren, Siphoviren, Luteoviren und Dianthoviren beschrieben Exemplaπsch besteht die frame shift Sequenz des Rous Sarkom Virus (RSV) aus 2 essentiellen Komponenten Einer homopolymeren shpperv- Sequenz, bestehend aus der Sequenzabfolge (AAAUUUA) und einer wenige Nukleotide stromabwärts gelegenen RNA-Sekundarstruktur Aus dem Vergleich der s/z/τpery-Sequenzen unterschiedlicher Viren wurde folgende s ppery Consensus sequenz erstellt Sie besteht aus einer 7 Nukleotide umfassenden Sequenzabfolge, die 2 homopolymere Trippletts enthält (X- XXY-YYZ) (Brierley (1995) J Gen Virol 76 ( Pt 8):1885-1892).
Erfindungsgemäße Vektoren umfassen neben vektorspezifischen Nukleinsäuresequenzen, die beispielsweise die Vermehrung der Vektoren in Bakterien oder eukaryotischen Zellen ermöglichen, oder regulatorischen Nukleinsäuresequenzen, die eine Expression der kodierenden Bereiche ermöglichen, oder Nukleinsäuresequenzen, die eine Verpackung des Vektors bzw. eine Verpackung der Nukleinsäure in einen Vektor ermöglichen, beispielsweise auch Nukleinsäuren, die für ein oder mehrere Suizidenzyme und für ein oder mehrere Antiapoptosemoleküle kodieren. Die Expression der Antiapoptosemoleküle ist immer an die Expression der Suizidenzyme gekoppelt und von diesen abhängig.
Zielzellen zur Behandlung mit den therapeutisch wirksamen Nukleinsäuren Antigenpräsentierende Zellen (APC) Zur Therapie von Autoimmunerkrankungen oder von Erkrankungen mit Immunpathogenese werden syngene antigenpräsentierende Zellen von den Personen, die therapiert werden sollen, zur Herstellung der Köderzellen verwendet. Das MHC-Muster der anti genpräsentierenden und der reaktiven Zellen ist damit identisch und es werden nur solche T-Zellen angelockt und eliminiert, die autoagressiv reagieren oder die fremde Antigene im Zusammenhang mit eigenem MHC erkennen. Im Falle einer Behandlung bzw. Prävention von Transplantatabstoßungen werden antigenpräsentierende Zellen des Organspenders gereinigt. Diese Zellen sind allogen (anderes MHC-Muster) im Bezug auf den Empfänger. Hier müssen die T-Zellen erkannt und eliminiert werden, die zelluläre Antigene mit fremdem MHC vom Spender erkennen.
Lymphozyten, akzessorische Zellen und Effektorzellen stellen die prominentesten Vertreter des erworbenen Immunsystems dar. Lymphozyten sind in der Lage, fremde Antigene spezifisch zu erkennen und eine spezifische humorale und zellvermittelte Immunantwort zu stimulieren. Man kennt unterschiedliche Subpopulationen von Lymphozyten die sich in der Art der Antigenerkennung und den spezifischen Effektorfunktionen unterscheiden. B-Lymphozyten sind die Produzenten von Antikörpern. Sie erkennen extrazelluläre und und auf der Oberfläche von Zellen präsentierte Antigene und differenzieren nach Kontakt mit einem Antigen in Antikörper- sezemierende Plasmazellen. T-Lymphozyten, die Mediatoren der zeilvermittelten Immunantwort können in mehrere Subtypen unterteilt werden, von denen die CD4+ T-Helferzellen und die CD8^ zytotoxischen T-Zellen am bedeutsamsten sind. Helfer und zytotoxische T Zellen weisen eine restringierte Spezifität für Antigene auf. Sie erkennen nur Peptidantigene, die zusammen mit MHC Klasse II bzw. MHC Klasse I auf der Oberfläche einer körpereigenen Zelle präsentiert werden. Nach einer spezifischen Erkennung von einem spezifischen MHC Klasse II / Peptidkomplex sezemieren T-Helferzellen Zytokine, welche T-Zellen und andere Immunzellen, wie z.B. B-Zellen und Makrophagen zur Proliferation und Differenzierung anregen. Zytotoxische T Zellen (CTL) lysieren Zellen die Peptide körperfremder Proteine zusammen mit MHC Klasse I Proteinen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die sogenannten Suppressor T- Zellen sind dagegen ein Subtyp von T-Helferzellen, die Zytokine produzieren, welche bestimmte Immunfunktionen unterdrücken. Eine dritte Klasse von Lymphozyten, die natürlichen Killer (NK)-Zellen, sind Bestandteil der angeborenen Immunantwort zur Bekämpfung von Viren und intrazellulären Erregem.
Eine sehr wichtige Bedeutung für die Steuerung des Immunsystems besitzten antigenpräsentierende Zellen (APCs). Diese Zellen nehmen fremde Antigene auf, prozessieren sie in kleine Peptide und präsentieren sie zusammen mit MHC Proteinen auf ihrer Oberfläche.
Man unterscheidet zwei Klassen von APCs. Professionelle APCs präsentieren die generierten
Peptide auf MHC Klasse I und II Proteinen und exprimieren zudem kostimulatorische Proteine wie B7.1 und B7.2. Die wichtigsten Verteter dieser APCs sind dendritische Zellen und Makrophagen, aber auch B-Zellen. Diese Zellen stimulieren T-Helfer und zytotoxische T-Zellen, die mittels ihres T-Zellrezeptors mit MHC -Klasse II bzw. MHC Klasse I komplexierte Peptide erkennen. Dagegen werden nicht professionelle APC die zwar MHC /Peptidkomplexe jedoch keine kostimulatorischen Proteine präsentieren nur von bereits aktivierten T Zellen erkannt. Die professionellen APC sind die Hauptzielzellen, in welche die erfindungsgemäßen Vektoren, präferentiell ex vivo eingeschleust werden sollen.
Die Aufreinigung unterschiedlicher Populationen von Blutlymphozyten ist in einer Vielzahl von Publikationen beschrieben und Stand der Technik. Mononukleäre Zellen können z.B. aus dem peripheren Blut mittels Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation gereinigt werden. Weiterhin können andere auf der Antikörper vermittelten Erkennung von Immunzellen beruhende Methoden zur positiven und negativen Selektion von Zellpopulationen verwendet werden. Derartige Verfahren sind exemplarisch die immunomagnetische Selektion, "panning" an immobilisierte, monoklonale Antikörper, Antikörper/Komplement-vermittelte Zelllyse und Zellsortierung von fluoreszenzmarkierten Zellen. Ein geeigneter Oberflächenmarker für die Selektion von T-Zellen ist das CD3. Spezifsche T-Helfer Zellen werden anhand des CD4 und zytotoxische T-Zellen anhand des CD8 Markers selektioniert. Weitere T-Zellsubpopulationen können anhand der Marker CD30, CD45RA (naive T-Zellen) und CD45RO (aktivierte T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen) (vor)selektioniert werden. Aktivierte T-Zellen sind anhand des Markerproteins CD69 separierbar. Monozyten können mittels spezifischer Antiköφer (AK) gegen die Oberflächenmarker CD 14 und CD 11b, natürliche Killerzellen mittels anti-CD 16 AK und B Zellen mittels der Marker CD 19 und CD22 auf gereinigt werden. Die Reinigung von APCs kann mittels spezifischer Antiköφer gegen HLA-DR erfolgen.
Geeigete Methoden zur Separation von T-Zellen aus mononukleären Zellpopulationen beruhen z.B. auf der Rosettierung von T-Zellen mit roten Blutzellen von Schafen (SRBC). Diese Methode erlaubt zudem die Gewinnung von nicht rosettierenden Zellpopulationen (B- Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen). Neuraminidase oder 2-Aminoethylisothiouronium- Bromid (AET) behandelte SRBCs sind hierbei bevorzugt zu verwenden, da sie eine gesteigerte Bindung von T-Zellen aufweisen. Die unterschiedlichen T-Zellpopulationen können mittels der zuvor beschriebenen, auf der Erkennung von spezifischen Oberflächenmarkern durch Antiköφer beruhenden Methoden positiv bzw. separiert werden.
B-Zellen können exemplarisch sehr effizient unter Verwendung CD19-spezifischer Antiköφer nach den bereits beschriebenen Methoden aufgereinigt werden. Besonders geeignet sind die Methoden des cell-sorting mittels FACS und die Verwendung immunomagnetischer Kügelchen. Monozyten können exemplarisch durch Adhärenz an z.B. L-Leucinmethylester-Matrizes, Gradientensedimentation durch kolloidale Silikapartikel und Flowzytometrie gewonnen werden. Jedoch erfolgt bei den ersteren Methoden eine Aktiviemng der Monozyten. Eine weitere sehr geeignete Methode zur Reinigung großer Mengen nicht aktivierten Monozyten ist die Gegenstromzentrifugation unter Verwendung eines Elutriators (counterflow centrifugal elutriation, CCE).
Natürliche Killerzellen können exemplarisch aus Ficoll-Hypaque Gradienten-gereinigten Lymphozytenpopulationen durch negative Selektion mittels anti-CD3, anti-CD5, anti-CD19, anti-CD 14 und anti-Erythrozyten Antiköφer gewonnen werden. Immunzellen können auch durch Zytokinstimulation aus anderen Zellpopulationen erzeugt werden. Beispielsweise können weiße Blutköφerchen sowie differenzierte Vorläuferzellen und Stammzellen durch eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren stimuliert werden. Insbesondere die von aktivierten T Helferzellen und aktivierten Makrophagen produzierten Zytokine IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, GM-CSF, M-CSF, und G-CSF stimulieren myeloide Stammzellen, die dann zu pluripotenten Stammzellen, Granulozyten-Monozytenvorläuferzellen, eosinophilen Vorläuferzellen, Basophilen Vorläuferzellen, Megakaryocyten und rythroiden Vorläuferzellen differenzieren. Die Differenzierung wird moduliert durch Wachstumsfaktoren wie GM-CSF, H- 3, IL-6, IL- 1 1, und Erythropoietin (EPO). Pluripotente Stammzellen differenzieren dann in lymphoide Stammzellen, Knochenmarksstromazellen, Vorläufer T-Zellen, Vorläufer B-Zellen, Thymocyten, T-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen und B-Zellen. Diese Differenzierung wird moduliert durch Wachstumsfaktoren wie IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, und IL-5. Granulocyten-Monocyten- Vorläufer differenzieren zu Monocyten, Macrophagen, und Neutrophile. Diese Differenzierung wird durch die Wachstumsfaktoren GM-CSF, M-CSF, und IL-8 moduliert. Eosinophile Vorläufer differenzieren zu Eosinophilen. Dieser Vorgang wird durch GM-CSF und IL-5 moduliert. Die Differenzierung von basophilen Vorläufern in Mastzellen und Basophile wird durch GM-CSF, IL-4, und IL-9 stimuliert. Megakaryocyten produzieren nach Stimulation mit GM-CSF, EPO und IL-6 Blutplattchen. Erythroide Vorläuferzellen differenzieren, stimuliert durch EPO, in rote Blutzellen. Die Reinheit der gewonnenen Zellpopulationen wird durch FACS Analyse mittels spezifischer Antiköφer kontrolliert.
Der Anteil dendritischer Zellen im Blut beträgt weniger als 0,2%. Deshalb ist eine direkte Aufreinigung dieser Zellpopulation nicht notwendig. Jedoch können exemplarisch größere Mengen an dendritischen Zellen mit Hilfe von Zytokinen aus CD14-positiven Blutmonozyten generiert werden. Zur Differenzierung von dendritischen Zellen aus Monozyten werden die Zytokine TNF-α, GM-CSF und IL4 in geeigneten Konzentrationen verwendet. Diese Methode ist mehrfach publiziert und Stand der Technik.
Es ist möglich, die Gesamtheit der mononukleären Zellen in Zellkulturmedium aufzunehmen und unspezifisch zu stimulieren. Die B-Zellen werden beispielsweise mittels quervernetzender Antiköφer gegen den B-Zell-Rezeptor bzw. mittels Lektinen (Pokeweed Mitogen) oder IL-4 zur Proliferation angeregt. Beispielsweise können T-Lymphozyten präferenziell durch Inkubation mit einem CD3-bindenden Agens, wie dem monoklonalen Antiköφer OKT-3 stimuliert werden. Ein CD3-bindendes Agens ist ein Ligand der CD3-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen bindet. Der Ligand kann ein Antiköφer, wie z.B. OKT-3 sein, der in der Lage ist zwei oder mehrere CD3-Moleküle querzuvemetzen. Diese Quervernetzung induziert die Proliferation und Aktiviemng von CD3+ Zellen, wie z.B. T-Lymphozyten. Die Aktiviemng von T-Lymphozyten durch CD3-bindende Agentien kann zudem durch die Variation bestimmter Parameter, wie der Konzentration des bindenden Agens, der Inkubationszeit, der Zellzahl, der Inkubationstemperatur, und der Bindungsaffinität des Agens, der Affidität, und der Effizienz der Zellaktivierung gesteigert werden. Weiterhin können T-Zellen in periphären Blutmonozyten durch Phytohämaglutinin (PHA) stimuliert werden. Andere Lymphozytenstimulatoren sind exemplarisch das Tetanus Toxoid, Concanavalin A (Con A), Ionomycin und PMA.
Weiterhin sind insbesondere Nukleinsäuren, die nicht methylierte CpG-Motifsequenzen mit dem Sequenzmotiv Pur-Pur-CG-Pyr-Pyr enthalten, besonders geeignet um B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen von Säugern zu aktivieren. Hierbei können CpG-haltige bakterielle oder Insekten DNS, jedoch auch CpG-haltige synthetische Oligodesoxynukleotide (ODNs) mit einer minimalen Länge von 8 Nukleotiden zur Stimulation der obengenannten Zellpopulationen geeignet. Durch die Verwendung chemisch modifizierter und dadurch stablisierter Oligonukleotide, wie exemplarisch Phosphorothioat-verknüpfter ODNs, kann eine gesteigerte Wirkung erzielt werden. Säugerimmunzellen, wie exemplarisch B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen, werden direkt nach Kontakt mit CpG- haltigen Nukleinsäuren aktiviert, was sich in der gesteigerten Oberflächenexpression von MHC - Klasse II Molekülen und kostimulatorischen Molekülen sowie der gesteigerten Transkription von definierter Zytokin mRNAs und der Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IFN-γ, IL12, und IL6 äußert. Insbesondere kann die Modulation der immunologischen Eigenschaften von CpG haltigen ODNs durch gezielte Auswahl bzw. Veränderung der die CpG Motive flankierenden Sequenzen erzielt werden.
Die Proliferation der später zu transduzierenden Zellen ist einerseits notwendig, um beispielsweise eine Integration der retroviralen Vektoren in das zelluläre Genom zu ermöglichen. Andererseits führt die Vermehrung der Zellen nach der Transduktion mit einem retroviralen Vektor zu einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, daß diese Zellen von passenden T-Zellen erkannt werden. Zur Therapie von Autoimmunerkrankungen oder von Erkrankungen mit Immunpathogenese werden syngene antigenpräsentierende Zellen von den Personen, die therapiert werden sollen, zur Herstellung der Köderzellen verwendet. Das MHC-Muster der antigenpräsentierenden und der reaktiven Zellen ist damit identisch und es werden nur solche T-Zellen angelockt und eliminiert, die autoagressiv reagieren oder die fremde Antigene im Zusammenhang mit eigenem MHC erkennen. Im Falle einer Behandlung bzw. Prävention von Transplantatabstoßungen werden antigenpräsentierende Zellen aus dem peripheren Blut des Organspenders gereinigt. Diese Zellen sind allogen (anderes MHC-Muster) im Bezug auf den Empfänger. Hier müssen die T-Zellen erkannt und eliminiert werden, die zelluläre Antigene mit fremdem MHC vom Spender erkennen.
Kultivierung von APCs
Die Säuger- bzw. humanen Zellen können in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, dem zumindest ein definierter Wachstumsfaktor zugegeben wurde. Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren wurde beschrieben, die das Wachstum unterschiedlicher Zelltypen fördern. Typische Vertreter solcher Wachstumsfaktoren sind Zytokinmitogene wie IL-2, IL-10, IL-12, und IL-15, die z.B. das Wachstum und die Aktiviemng von Lymphozyten fördern. Andere Zelltypen werden insbesondere durch eine andere Klasse von Wachstumsfaktoren, wie Hormonen, einschließlich des humanen Schwangerschaftshormons chorionisches Gonadotropin (hCG) und des humanen Wachstumshormons. Die Auswahl geeigneter Wachstumsfaktoren für definierte Zellpopulationen ist detailliert beschrieben und Stand der Technik.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
Tierexperimentelle Daten
Transfektion von murinen antigenpräsentierenden Zellen (APC) mit dem Fas Ligand Gen mittels adenoviralem Gentransfer Bei Fas (CD95)-defizienten C57BL(B6)-Mäusen wurde eine Peritoneallavage durchgeführt und die Peritonealmakrophagen gewonnen. 5xl06 Makrophagen wurden pro Vertiefung einer 6- Lochplatte in komplettem DMEM-Medium über 24 Stunden kultiviert und anschliessend mit einem adenoviralen Vektor, der zur Expression des Fas Ligand- (FasL, CD95L) Gens führte (AdFasL), oder einem Kontrollvektor (AdLacZ, Expression der ß-Galactosidase) transfiziert Nach 48 Stunden wurden die transfizierten Makrophagen auf die Expression und die Funktionalität von FasL getestet. Es zeigte sich m der Facs-Analyse, daß annähernd 90% der mit AdFasL transfizierten Makropagen (AdFasL-APC) das FasL-Gen auf der Zelloberflache expπmierten, wahrend keine relevante FasL-Expression auf den Makrophagen, die mit AdLacZ transfiziert worden waren (AdLacZ-APC), feststellbar war (Fig 1 A) Um zu untersuchen, ob die FasL-Expression auch fünktionell ist, wurden AdFasL-transfizierte Makrophagen in einem Zytotoxizitätstest mit Fas-expπmierenden A20 Targetzellen eingesetzt. Hierbei zeigte sich eine konzentrationsabhangige Zytolyse der Targetzellen in den Kokulturen mit AdFaL-APC, wahrend keine, oder nur eine geπnge Spontanlyse in den Kokulturen von AdLacZ-APC und A20 Targetzellen nachweisbar war (Fig 1B)
Hemmung der allogenen Proliferation von T-Zellen durch Fas Ligand exprimierende APC
Um festzustellen, ob durch die FasL-Expression auf den AdFasL-APC die Interaktion mit T- Zellen moduliert und eine allogenspezifische T-Zell Antwort suppnmiert werden kann, wurden AdFasL-APC und AdLacZ-APC von B6-lpr/lpr Mäusen (H-2Db) genenert und in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) mit T-Zellen von Fas-defizienten MRL-lpr/lpr Mäusen (H-2Dk) oder Fas-expnmierenden MRL-+/+ Kontrollmausen (H-2Dk) kokultiviert Die allogene T-Zellprohferation wurde durch die Inkoφoration von [3H]-Thymιdιn ermittelt Es zeigte sich, daß die allogene Proliferation der H-2Dk T-Zellen in den Kokulturen mit H-2Db APC-FasL signifikant reduziert war im Vergleich zu den Kokulturen von H-2Dk T-Zellen mit H- 2Db APC-LacZ (Fig. 2A). Durch die Verwendung der Fas-defizienten T-Zellen von MRL-lpr/lpr Mäusen, konnte zudem demonstriert werden, daß dieser Suppressionseffekt auf der Interaktion von Fas mit Fas Ligand beruhte, also die funktionelle Expression der beiden Moleküle erforderte (Fig. 2B)
Therapeutische Anwendung Fas Ligand exprimierender antigenprasentierender Zellen in einem Mausmodell mit virusinduzierter Autoimmunerkrankung
Die Infektion von Fas Ligand defizienten C57/BL6 (B6)-gld/gld Mausen mit dem munnen Zytomegahevims (MCMV) induziert eine chronische autoimmune Entzundungsreaktion. Um zu Ubeφrüfen, ob auch eine antigenspezifische Suppression der T-Zellen durch AdFasL-APC in vivo erzielt werden kann, wurden AdFasL-APC und AdLacZ-APC m einem Mausmodell mit chronischer Autoimmunerkrankung therapeutisch getestet Im verwendeten Mausmodell wurde durch die intraperitoneale Infektion von Fas-defizienten B6-lpr/lpr Mäusen oder FasL- defizienten Bβ-gld/gld Mäusen mit lxl 06 PFU des Maus-Zytomegalievirus (MCMV) eine chronische Entzündungsreaktion in verschiedenen Organen induziert, während sich bei B6-+/+ Mäusen nach erfolgter Elimination virusinfizierter Zellen keine relevanten Organveränderungen nachweisen Hessen. Ursachse für die chronische Entzündung bei B6-lpr/lpr und B6-gld/gld Mäusen war nicht eine verzögerte Elimination virusinfizierter Zellen, sondern eine persistierende Aktiviemng von T-Zellen, die hauptsächlich für die entzündlichen Infiltrate in den Organen verantwortlich waren, weshalb dieses Mausmodell fuer die Übeφriifung der Wirksamkeit des neuen Therapiekonzeptes hervorragend geeignet war. Zudem zeigte die chronische Entzündung eine deutliche autoimmune Komponente, da vermehrt Autoantiköφer nachgewiesen werden konnten. Fig. 3 zeigt den histologischen Schweregrad der Entzündungsreaktion in der Lunge. Niere und Leber im Zeitverlauf bei MCMV-infizierten B6-+/+ und FasL-defizienten B6-gld/gld Mäusen.
Signifikante Besserung der MCMV-induzierten chronischen Entzündungsreaktion durch Behandlung mit Fas Ligand exprimierenden APC
28 Tage nach der MCMV-Infektion wurden B6-gld/gld und B6-lpr/lpr Mäuse mit AdLacZ-APC oder AdFasL-APC behandelt (1 x 106 APC i.p., jeden 3. Tag über 12 Tage). Zusätzlich wurde ein Teil dieser APC vor der Gabe in vitro mit MCMV gepulst. 4 Wochen nach Behandlungsbeginn wurden die Organe entnommen, und der Schweregrad der Entzündungsreaktion bestimmt (Fig. 4). Es zeigte sich eine signifikante Besserung der Entzündung bei den AdFasL-APC behandelten Bβ-gld/gld Mäusen, die durch ein vorheriges Pulsen der APC mit MCMV noch verstärkt wurde. Außerdem konnte demonstriert werden, daß der beobachtete therapeutische Effekt Fas-vermittelt war, da bei Fas-defizienten B6-lpr/lpr Mäusen keine Besserung nachweisbar war.
Signifikante Reduktion der MCMV-spezifischen T-Zellen in der Milz nach Behandlung mit Fas Ligand exprimierenden APC
Gleichzeitig wurde von den B6-gld/gld Mäusen auch die Milz entnommen und die Milzzellen mit MCMV-gepulsten APC von B6-Mäusen über 48 Stunden in einer gemischen Lymphozytenreaktion (MLR) kokultiviert. Es zeigte sich eine signifikante Reduktion der IL-2 Sekretion bei den Milzzellen der Tiere, die mit APC-AdFasL behandelt worden waren (Fig. 5). Somit konnte eine antigenspezifische Suppression der T-Zellen durch AdFasL-APC in vivo demonstriert werden.
Verminderte Produktion von Autoantikörpern bei MCMV -infizierten B6-gld/gld Mäusen durch Behandlung mit Fas Ligand exprimierenden APC Da MCMV-infizierte B6-gld/gld Mäuse hohe Konzentrationen von Autoantiköφern entwickeln, wurde untersucht, ob durch die Gabe von AdFasL-APC die Autoantiköφeφroduktion beeinflußt werden kann. Hierzu wurden die Spiegel von Rheumafaktor IgGl sowie anti -Doppelstrang-DNA IgGl Autoantiköφern im Serum von Mäusen bestimmt, die entweder mit AdLacZ-APC, AdFasL-APC oder MCMV-gepulsten AdFasL-APC behandelt worden waren. Es zeigte sich bei den mit AdFasL-APC behandelten Tieren eine signfikante Reduktion der Autoantiköφeφroduktion, wobei die Suppression durch vorheriges Pulsen der AdFasL-APC mit MCMV noch verstärkt werden konnte (Fig. 6).
Beispiel mit primären humanen Zellen Effektive Transfektion von primären humanen Makrophagen mit einem adenoviralen Vektor
Primäre, durch Leukapherese gewonnene Monozyten wurden in vitro über 7 Tage zu Makrophagen, oder durch Zugabe von IL-4 und GM-CSF zum Kulturmedium in Dendritische Zellen (DC) differenziert. Anschliessend wurden die Makrophagen und DC mit AdLacZ in unterschiedlichen Konzentrationen transfiziert. Es zeigte sich, daß sowohl Makrophagen als auch DC im Unterschied zu anderen Zellen (z.B. Fibroblasten oder murinen Makrophagen) deutlich schwieriger transfizierbar sind. Unter Verwendung einer hohen MOI (500) war jedoch bei ca. 30%o der Makrophagen nach 72 Stunden eine erfolgreiche Transfektion durch Nachweis der ß- Galactosidase über eine x-Gal-Färbung nachweisbar (Fig. 7). Durch die Verwendung verschiedener Zytokine sowie Lipofectamin konnte die Transfektionsrate deutlich gesteigert werden.
Hemmung der allogenen Proliferation von T-Zellen durch „tolerogene" Dendritische Zellen Unabhängig von der adenoviralen Transfektion wurde auch ein ,tolerogener' DC-Phänotyp untersucht. Andere Arbeitsgruppen hatten gezeigt, daß durch die Zugabe von IL-10 zur DC- Kultur am Tag 5 ein suppressiver DC-Phänotyp generiert wird, während die Zugabe von TNF zum gleichen Zeitpunkt zu einem stark aktivierenden DC-Phänotyp führt, was u.a. auf die unterschiedliche Expression kostimulierender Moleküle zurückgeführt wurde. Es wurde deshalb untersucht, ob sich diese beiden DC-Populationen in der Fähigkeit unterscheiden, eine allogene T-Zellstimulation in der MLR zu induzieren (Fig. 8). Es zeigte sich, daß IL-10 gereifte DC eine geringere Proliferation allogener T-Zellen induzieren, als mit TNF behandelte DC. Dieser Effekt konnte durch die Zugabe eines anti-Fas Antiköφers (Klon CH-11) noch verstärkt werden.
Nachweis einer allogenspezifischen Suppression durch tolerisierende APC
Um zu untersuchen,ob die beobachtete Suppression der T-Zellproliferation allogenspezifisch ist, wurden die T-Zellen 5 Tage nach Beginn der MLR gewonnen und in einer 2. MLR gegen APC eines dritten Spenders (,third party") eingesetzt (Fig. 9). Dabei konnte auch für die IL-10 gereiften DC eine allogenspezifische Suppression der T-Zellen demonstriert werden, da die Reaktion der T-Zellen, die initial mit IL-10 gereiften DC kokultiviert worden waren, auf die APC des dritten Spenders unbeeinträchtigt verlief.
Konstruktion erfindungsgemäßer Vektoren
Die Vektoren pcDNA3-TK-IRES-crmA (Fig. 10A) und pcDNA3-FasL-IRES-PLP (Fig. 10B) stehen exemplarisch für erfindungsgemäße Vektoren.
pcDNA3-FasL-IRES-PLP (Fig. 10A) umfaßt Nukleinsäuresequenzen, die beispielsweise für den apoptoseauslösenden Liganden FasL und exemplarisch für das Antigen Proteolipidprotein (PLP) kodieren. Beide Bereiche sind durch eine LRES-Sequenz in der Weise verbunden, daß das Antigen von der selben mRNA translatiert wird wie der apoptoseauslösende Ligand. Der Vektor basiert auf dem Klonierungsvektor pcDNA3. Die Nukleinsäurebereiche, die für FasL und für PLP kodieren, wurden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus RNA in cDNA umgeschrieben. Verfahren zur Isolierung der RNA aus Zellen und der Einsatz der PCR zum Umschreiben von spezifischen RNA-Molekülen in cDNA sind Stand der Technik. Die Oligonukleotide, die als Primer für die PCR verwendet wurden, umfassen an ihren 5 '-Enden Schnittstellen für Endonukleasen, die anschließend für die Klonierung der cDNAs in den Vektor pcDNA3 verwendet wurden. Der Bereich, der für FasL kodiert, wurde als erstes über die Schnittstellen für Hindϊll und BamHI in den Vektor pcDNA3 einkloniert. Anschließend wurde das für PLP-kodierende Fragment über sie Schnittstellen von BamHI und EcσRI eingesetzt. Zuletzt wurde über die Εrkennungssequenz für BamHI das Nukleinsäurefragment, das die IRΕS umfaßt, zwischen FasL und PLP einkloniert. Die Techniken zur Isolierung von Nukleinsäuren, der Spaltung von Nukleinsäuren und der Aufreinigung von Nukleinsäurespaltprodukten, sowie die Ligation einzelner Nukleinsäurefragmente und die Vermehrung der künstlich erzeugten Nukleinsäuren in Bakterien ist Stand der Technik.
pcDNA3-TK-IRES-crmA (Fig. 10B) umfaßt Nukleinsäuresequenzen, die ein Suizidenzym wie beispielsweise die Thymidinkinase und ein Antiapoptosemolekül wie zum Beispiel crmA kodieren. Die Expression von crmA ist durch eine ERES-Sequenz in der Weise an die Expression von TK gekoppelt, daß crmA nur zusammen mit der TK exprimiert werden kann. Der Vektor basiert auf dem Klonierungsvektor pcDNA3 und die Klonierungsstrategie und die Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors ist vergleichbar mit der von pcDNA3-FasL-ERES-PLP. Der Bereich, der für die Thymidinkinase kodiert, wurde als erstes über die Schnittstellen für Hz«dIII und BamKl in den Vektor pcDNA3 einkloniert. Anschließend wurde das für crmA-kodierende Fragment über sie Schnittstellen von BamΑl und Xhol eingesetzt. Zuletzt wurde über die Erkennungssequenz für BamΑl das Nukleinsäurefragment, das die ERES umfaßt, zwischen FasL und PLP einkloniert. Die Nukleinsäuresequenzen der beiden Vektoren pcDNA3-FasL-ERES- crmA und pcDNA3-TK-ERES-PLP sind als SEQ ED NO: 1 bzw. SEQ ID NO:2 aufgeführt.

Claims

Patentansprüche
1. Ein Gentransfervektor, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend a) eine erste Nukleinsäuresequenz, kodierend für einen oder mehrere apoptoseauslösende(n) Liganden, b) eine zweite Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antigen(e) und gegebenenfalls, c) eine dritte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Antiapoptosemolekül(e), und gegebenenfalls d) eine vierte Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein oder mehrere Suizidenzym(e).
2. Gentransfervektor nach Ansprach 1, wobei die erste und zweite Nukleinsäuresequenz auf einem Nukleinsäuremolekül und die dritte und vierte Nukleinsäuresequenz auf einem weiteren Nukleinsäuremolekül, oder die ersten drei Nukleinsäuresequenzen, oder alle vier Nukleinsäuresequenzen, oder die ersten zwei und die vierte Nukleinsäuresequenzen auf einem Nukleinsäuremolekül vorkommen.
3. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die erste und zweite Nukleinsäuresequenz und/oder die dritte und vierte Nukleinsäuresequenz so funktional miteinander verbunden sind, daß die Expression der zweiten Nukleinsäuresequenz von der
Expression der ersten Nukleinsäuresequenz abhängig ist, und/oder daß die Expression der dritten Nukleinsäuresequenz von der Expression der vierten Nukleinsäuresequenz abhängig ist.
4. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Vektoren Viren, insbesondere Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Pockenviren, Alphaviren oder Heφesviren, oder Bakterien, insbesondere Listerien, Shigellen oder Salmonellen, oder Liposomen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, Bakteriophagen oder artifizielle Chromosomen sind.
Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste Nukleinsäuresequenz für CD95L/FasL/ApolL, TRAIL oder Apo3L kodiert.
Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zweite Nukleinsäuresequenz für ein oder mehrere Epitope des Myelin basischen Proteins, Myelin Proteolipid Proteins, Myelin Proteolipid Proteins, Myelin-assoziierten basischen Proteins auf Oligodendrozyten, Oligodendrozyten-spezifischen Proteins, Myelin-assoziierten Glykoproteins, Glykoproteins PO, peripheren Myelinproteins 22, pl70k/SAG, Schwann Cell Myelin Protein, Transaldolase, SlOOß, Alpha B Crystallin, 2',3'-cyclic Nucleotide 3'- Phosphodiesterase (CNP), GFAP, der α- oder ε-Untereinheiten des Acetylcholinrezeptors, Typ-II-Collagens, der Tyrosin-Phosphatase IA-2, Proinsulins, GAD65, Hsp60 oder ICA69 kodiert.
7. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die dritte Nukleinsäuresequenz für E3-14.7K, E3-14.5K, E3-10.4K, FLEP, vFLIP, MC159, MC160, BORFE2, E8 des Pferdeheφesvirus EHV-2, Kl 3 von HHV-8, ORF71 von Heφesvirus Saimiri, E1B-19K, LMP-1, LT-Protein von SV40, Polyomaproteine ST und MT, Inhibitoren von Caspasen oder Antisense-RNAs kodiert.
8. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die vierte Nukleinsäuresequenz für Thymidinkinase, Carboxylesterase, Cytosin-Desaminase, Carboxypeptidase G2, Cytochrom P450, Deoxycytidin-Kinase, Nitroreduktase, Purin- Nukleosid-Phosphorylase, Thymidin-Phosphorylase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-
Transferase, bakterielle Uracil-Phosphoribosyltransferase, Fusionsprotein aus der Cytosin- Deaminase und Uracil-Phosphoribosyltransferase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert.
9. Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ LD : 1 oder SEQ ID NO:2.
10. Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als therapeutisches Mittel.
11. Verwendung der Gentransfervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Prävention oder Therapie von Autoimmunerkrankungen, insbesondere rheumatoide Artritis, systemische Lupus Erythematodes, Sjögren-Syndrom,
Polymyositis, Dermatomyositis, Polymyalgica Rheumatica, Arteriitis Temporaiis, Spondylarthropathien, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, Zöliakie, Autoimmun-Hepatitis, Diabetes mellitus Typ I, Nebenniereninsuffizienz, Thyroiditis, Psoriasis, Dermatitis, Heφetiformis, Pemphigus Vulgaris, Alopezie, Multiple Sklerose, Myastenia Gravis, oder zur Prävention oder Therapie von chronisch entzündlichen Prozessen, die auf Immunpathogenese beruhen, insbesondere chronische Entzündungen nach viralen- oder bakteriellen Infektionen, insbesondere chronische Hepatitis bei Hepatitis-B-Vims- oder Hepatitis-C-Virus-Infektionen, oder Gehirnentzündung nach
Infektion mit dem Masem-Vims, oder zur Prävention oder Therapie von Transplantatabstoßungen.
12. Verwendung der Gentransfervektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur ex vivo Modifikation von tierischen oder Säugerzellen, insbesondere von humanen Zellen.
PCT/DE2000/003608 1999-10-12 2000-10-12 Gentransfervektoren zur therapie von autoimmunerkrankungen und erkrankungen mit immunpathogenese WO2001027254A2 (de)

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