WO2001004336A1 - Verfahren zur reduktion von keto-carbonsäuren und deren estern - Google Patents

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WO2001004336A1
WO2001004336A1 PCT/EP2000/006287 EP0006287W WO0104336A1 WO 2001004336 A1 WO2001004336 A1 WO 2001004336A1 EP 0006287 W EP0006287 W EP 0006287W WO 0104336 A1 WO0104336 A1 WO 0104336A1
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reduction
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carboxylic acids
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Michael Müller
Michael Wolberg
Werner Hummel
Christian Wandrey
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention accordingly relates to a process for the reduction of diketo or hydroxyketocarboxylic acids or their esters, which no longer has the disadvantages described.
  • Hydroxy groups are also to be understood here as hydroxyl groups masked with protective groups.
  • the invention is characterized by a process for the reduction of diketocarboxylic acids or hydroxyketocarboxylic acids or their esters, in which at least one keto group is converted to a hydroxyl group in the presence of Lactobacillus species.
  • a reduction to diols is carried out.
  • the process according to the present invention includes in particular the catalytic reduction of the prochiral 3,5-dioxocarboxylic acid derivatives according to formula 1:
  • R 1 , R 2 H or a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, cycloalkylalkyl, the components also being mono- or polysubstituted by heteroatoms, such as Si, N, P, O, S , F, Cl, Br or I substituted or completely replaced by heteroatoms.
  • R 3 H, metal cations or a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, cycloalkylalkyl, the components also being mono- or polysubstituted by heteroatoms, such as Si, N, P, O, S, F, Cl, Br or I can be substituted.
  • Y a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, cycloalkylalkyi, the components also being mono- or polysubstituted by heteroatoms, such as Si, N, P, 0, S, F, Cl, Br or I can be substituted.
  • halogens fluorine and chlorine are particularly preferred.
  • n 0-10.
  • Alkyl means both straight-chain and branched saturated carbon chains. Examples include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, t-butyl, pentyl, i-pentyl, n-hexyl, i-hexyl.
  • Alkenyl denotes straight-chain and branched unsaturated hydrocarbons, for which vinyl, 1-propenyl, allyl, butenyl, i-butenyl can be mentioned by way of example.
  • cycloalkyl encompasses saturated, ring-shaped hydrocarbon chains which consist of three, four, five, six or seven hydrocarbon atoms.
  • Cycloalkenyl refers to unsaturated, ring-shaped hydrocarbons with five, six, seven or eight carbon atoms.
  • Aryl includes aromatic systems, including heteroaromatics and substituted ones aromatic systems, such as B. to understand phenyl, p-methylphenyl or furanyl.
  • Aralkyl is to be understood as meaning aryl radicals which are attached via alkyl groups, e.g. B. a benzyl radical.
  • cycloalkylalkyl includes cycloalkyl radicals which are bonded via alkyl groups.
  • R 1 , R 2 , R 3 and Y have the same meaning as in formula 1.
  • ⁇ H or protective groups for the hydroxyl functions.
  • 3,5-dihydroxycarboxylic acid derivatives of the formula 5 shown below can be produced with the process according to the invention:
  • R 1 , R 2 , R 3 and Y have the same meaning as in formula 1.
  • ⁇ H or protective group for the hydroxy function.
  • Active ingredients, catalysts and inhibitors are used. Examples of these are HMG-CoA reductase inhibitors of the mevic acid type and
  • Lipstatin type lipase inhibitors Other natural or active ingredients require different configurations of the
  • the method according to the invention enables the reduction of 3.5-
  • Dioxocarboxylic acid derivatives the regioselective introduction of a hydroxy group in position C-3 or C-5 or C-3 and C-5, whereby a product with r configuration is obtained.
  • r configuration in Formula 3 is an example of the term r configuration in Formula 3:
  • This configuration is referred to below as the r configuration, regardless of Y.
  • the method according to the invention enables a targeted determination of the stereocenters in the positions C-2 and C-4 in the reduction of 3,5-dioxocarboxylic acid derivatives of the formula 2. This applies in particular to the case where R1 and R2 are different from H and R1 represents, for example, a methyl group. Both the enantiomeric purity and the diastereomeric purity are very high (> 95%).
  • the reduction process can also be used to produce mixtures which have compounds with different hydroxyl group contents.
  • the inventive method is carried out with Lactobacillus species.
  • Lactobacillus species In principle, all types of Lactobacillus can be considered. However, the use of Lactobacillus kefir and Lactobacillus brevis is particularly preferred.
  • An easily metabolizable carbon-containing substrate for example glucose
  • the cosubstrate can be used as the cosubstrate.
  • the reduction equivalents consumed in the implementation are supplied.
  • the reactions are carried out at temperatures from 10 to 50 ° C., preferably from 15 to 40 ° C.
  • the pH is 2 to 10, preferably between 4 and 8.
  • Any buffer substance customary in fermentation technology can be used to ensure a suitable pH. These are e.g. B. triethanolamine, phosphate buffer, phosphate-citrate buffer, 2-amino-2- (hydroxymethyl) -1, 3-propanediol buffer, 2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid buffer (MES) or Tris buffer.
  • the concentration ranges for the buffers are advantageously between 50 and 500 mmol / l. All known types of reactors can also be used as reactors. Both conventional stirred reactors and fixed bed reactors can be used.
  • Example 1 Production of Lactobacillus cells (Lactobacillus kefir)
  • Cells for reduction can be obtained by growing a Lactobacillus kefir stock culture (e.g. DSM 20587) in the following medium:
  • Example 2 Whole cell transformation of 6-chloro-3,5-dioxohexanoic acid te / - butyl ester (1) with Lactobacillus kefir
  • Diketo compound I is represented as described in M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19847302.2, 1998.
  • reaction mixture is stirred with a magnetic stirrer.
  • the diketo compound I is detected as furanone, as is the hydroxyketoester (R) - ⁇ (HCI elimination in the injector, see also formula IV).
  • the hydroxyketoester (S) -Il generates two signals by partial thermal lactone formation in the GC injector.
  • the dihydroxy compound (3f?, 5S) -IV is formed by microbial reduction of the intermediate hydroxyketones (S) -Il and (R) - ⁇ .
  • Working up After 12.5 h, the reaction is stopped by centrifuging off the cells. The cell pellets and the centrifugation supernatant are extracted separately from each other twice with ethyl acetate. After drying the combined organic phases with sodium sulfate and concentrating on a rotary evaporator, 44 mg of crude product are obtained.
  • Derivative (3R, 5S) -y is formed from the microbial reduction product (3R, 5S) -N, while the hydroxyketone (S) -Il reacts to the two stereoisomeric bisacylation products (S) -Vl and (S) -Vll.
  • the cyclic derivative VIII is formed from the furanone IX, the formation of which from the diketo compound I is known during the microbial reaction (by-product from intramolecular alkylation, see M. Woiberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19857302.2, 1998).
  • a derivative of the hydroxy keto ester (R) - ⁇ cannot be found in the crude product. This intermediate compound is completely converted to the dihydroxy compound (3R, 5S) -N in the reaction procedure chosen here (termination of the reaction after 12.5 h).
  • the retention times and mass spectra match the analog signals in the spectra of the raw product of the microbial reduction.
  • the NMR spectra of the crude product of the microbial reduction confirm the results of the GC-MS analyzes.
  • the 1 H-NMR spectrum shows a superimposition of the individual spectra of the compounds (S) -Il, (3f?, 5S) -IV- and IX, the signals of the hydroxyketone (S) -Il clearly dominating, while the signals of Furanons IX are only weakly visible.
  • the signals of the hydroxyl-bearing carbon atoms of the sy ⁇ isomer usually show a downfield shift relative to the analog signals of the antf isomer.
  • TsOH p-toluenesulfonic acid
  • racemic derivative rac-X (formula VIII), which is obtained from the hydroxyketoester rac-II using the same method, can be separated by HPLC with a chiral stationary phase.
  • the absolute configuration of the separated enantiomers is assigned by comparison with the retention time of an authentic sample of the lactone (S) -X, which is analogous to the racemic derivative rac-X from the 20
  • R 1 , R 2 H or a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl,
  • Components also one or more times with heteroatoms, such as Si, N, 22
  • P, O, S, F, Cl, Br or I can be substituted or completely replaced by heteroatoms.
  • R 3 H, metal cations or a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, cycloalkylalkyl, the components also being mono- or polysubstituted by heteroatoms, such as Si, N, P, O, S, F, Cl, Br or I can be substituted.
  • Y a component from the group alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, cycloalkylalkyi, the components also being mono- or polysubstituted by heteroatoms, such as Si, N, P, O, S, F, Cl, Br or I can be substituted.
  • n 0-10.
  • R 1 , R 2 , R 3 and Y have the same meaning as in formula 1.
  • R 1 , R 2 , R 3 and Y have the same meaning as in formula 1.
  • ⁇ H or protective groups for the hydroxy functions.
  • R 1 , R 2 , R 3 and Y have the same meaning as in formula 1.
  • ⁇ H or protective groups for the hydroxy functions.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion von Diketocarbonsäuren oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern, bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten wenigstens eine Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird.

Description

nicht immer eine ausreichende Enantiomerenreinheit. Die Produktausbeute und -qualität hängen stark vom verwendeten Stamm und den Anzuchtbedingungen ab.
Aus der europäischen Patentanmeldung 0569 998 A2 ist schließlich ein Verfahren bekannt, bei dem verschiedene Mikroorganismen zur Reduktion von Ethergruppen enthaltenden Diketoestern eingesetzt werden. Zu den nach der Beschreibung dieser Erfindung einsetzbaren Mikroorganismen zählen zahlreiche Hefen und Bakterien, jedoch nicht Lactobacillus-Arten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Reduktion von Diketo- oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern, das die geschilderten Nachteile nicht mehr aufweist. Unter Hydroxygruppen sind hier auch mit Schutzgruppen maskierte Hydroxygruppen zu verstehen.
Die Erfindung ist gekennzeichnet durch ein Verfahren zur Reduktion von Diketocarbonsäuren oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten wenigstens eine Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Reduktion zu Diolen durchgeführt. Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhaltet insbesondere die katalytische Reduktion der prochiralen 3,5-Dioxocarbonsäurenderivate gemäß Formel 1 :
Figure imgf000003_0001
A, B = C=0, CHOΣ, mit Σ = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion, wobei A und B gleich oder verschieden sein können. R1, R2 = H oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert oder vollständig durch Heteroatome ersetzt sein können. R3 = H, Metallkationen oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Y = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, P, 0, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Ausgeschlossen wird X-CH2-O-CH2-, wobei X = Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Aralkyl oder Cycloalkylalkyi sein kann. Unter den Halogenen sind Fluor und Chlor besonders bevorzugt. n = 0-10.
Unter Alkyl sind sowohl geradkettige als auch verzweigte gesättigte Kohlenstoff-Ketten zu verstehen. Beispielhaft können Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, t-Butyl, Pentyl, i-Pentyl, n-Hexyl, i-Hexyl genannt werden. Mit Alkenyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet, für die beispielhaft Vinyl, 1-Propenyl, Allyl, Butenyl, i-Butenyl genannt werden können.
Mit Alkinyl sind geradkettige und verzweigte ungesättigte Kohlenwasserstoffe bezeichnet, die wenigstens eine -C=C- Bindung enthalten, wie beispielsweise Ethinyl oder Propinyl. Von dem Begriff Cycloalkyl werden gesättigte, ringförmige Kohlenwasserstoff ketten umfaßt, die aus drei, vier, fünf, sechs oder sieben Kohlenwasserstoffatomen bestehen.
Cycloalkenyl bezeichnet ungesättigte, ringförmige Kohlenwasserstoffe, mit fünf, sechs, sieben oder acht Kohienstoffatomen. Unter Aryl sind aromatische Systeme, eingeschlossen Heteroaromaten und substituierte aromatische Systeme, wie z. B. Phenyl, p-Methylphenyl oder Furanyl zu verstehen.
Unter Aralkyl sind Arylreste zu verstehen, die über Alkylgruppen angebunden sind, z. B. ein Benzylrest.
Unter den Begriff Cycloalkylalkyi fallen Cycloalkyl reste, die über Alkylgruppen gebunden sind.
Ebenso sind Reaktionen der Verbindungen gemäß der Formeln 2, 3 und 4 möglich.
Figure imgf000005_0001
Formel 2
Figure imgf000005_0002
Hierbei haben R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1. Σ = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können demgemäß insbesondere 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate der im folgenden dargestellten Formel 5 erzeugt werden:
Figure imgf000006_0001
Hierbei haben R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1. Σ = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion.
Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Verfahren, im Gegensatz zum Stand der Technik, Verbindungen gemäß den Formeln 3 und 4 als Substrate umgesetzt werden.
Je nach Konfiguration an den Stereozentren C-3 und C-5 können die erfindungsgemäß hergestellten 3,5-Dihydroxycarbonsäurederivate der
Formel 5 zielgerichtet bei der Synthese chiraler Naturstoffe, Pharma- und
Agrowirkstoffe, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind HMG-CoA-Reduktase-lnhibitoren des Mevinsäure-Typs und
Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs. Andere Natur- oder Wirkstoffe verlangen andere Konfigurationen der
Stereogenen Zentren in Position C-3 und C-5. Auch dies ist mit der vorliegenden Erfindung möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht bei der Reduktion von 3,5-
Dioxocarbonsäurederivaten die regioselektive Einführung einer Hydroxygruppe in Position C-3 oder C-5 oder C-3 und C-5, wobei ein Produkt mit r-Konfiguration erhalten wird. Zu dem Begriff r-Konfiguration sei beispielhaft an Formel 3 folgendes ausgeführt:
In der Formel 3 tritt die OΣ-Gruppe in 5-Position aus der Papierebene hervor, während Y und die Kohlenstoffatome des Kohlenstoffgrundgerüstes in der Papierebene liegen:
Figure imgf000007_0001
Diese Konfiguration wird im folgenden unabhängig von Y als r- Konfiguration bezeichnet.
Ferner ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren bei der Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäurederivaten der Formel 2 eine gezielte Festlegung der Stereozentren in den Position C-2 und C-4. Dies gilt insbesondere für den Fall, daß R1 und R2 von H verschieden sind und R1 beispielsweise eine Methylgruppe darstellt. Sowohl die Enantiomerenreinheit als auch die Diastereomerenreinheit sind hierbei sehr hoch (> 95%).
Erfindungsgemäß können mit dem Reduktionsverfahren auch Gemische hergestellt werden, die Verbindungen mit unterschiedlichen Hydroxygruppen- Gehalten aufweisen. Beispiele hierfür sind Gemische, die aus Verbindungen der Formeln 3, 4 und 5 bestehen, wobei R1, R2 = H; Y = -CH3 oder -CH2CI und R3 = C(CH3)3.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Lactobacillus-Arten durchgeführt. In Betracht kommen grundsätzlich alle Lactobacillus-Arten. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung von Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter üblichen
Fermentationsbedingungen und in den üblichen Reaktoren durchgeführt werden.
Als Cosubstrat kann ein leicht metabolisierbares Kohlenstoff-haltiges Substrat, z.B. Glukose verwendet werden. Dadurch werden die bei der Umsetzung verbrauchten Reduktionsäquivalente nachgeliefert. Die Reaktionen werden erfindungsgemäß bei Temperaturen von 10 bis 50°C, bevorzugt von 15 bis 40°C durchgeführt.
Der pH-Wert liegt bei 2 bis 10, bevorzugt zwischen 4 und 8. Zur Sicherstellung eines geeigneten pH-Wertes kann jede in der Fermentationstechnik übliche Puffersubstanz eingesetzt werden. Dies sind z. B. Triethanolamin, Phosphat-Puffer, Phosphat-Citrat-Puffer, 2-Amino-2- (hydroxymethyl)-1 ,3-propandiol-Puffer, 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure- Puffer (MES) oder Tris-Puffer. Die Konzentrationsbereiche für die Puffer liegen vorteilhafterweise zwischen 50 und 500 mmol/l. Als Reaktoren können ebenfalls alle bekannten Reaktortypen Verwendung finden. So können sowohl herkömmliche Rührreaktoren als auch Festbettreaktoren eingesetzt werden.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens entfallen vor allem kostenintensive und umweltbelastende Racemat-, oder Diastereomeren- trennungen. Die in einer diastereoselektiven Synthese erforderliche Anbindung und Abspaltung einer stöchiometrischen Menge einer homochiralen Hilfsgruppe wird vermieden. Weiterhin ist das Kohlenstoffgerüst der Dihydroxycarbonsäureester in den
Ausgangsverbindungen bereits komplett, das heißt, die Stereozentren werden erst zu einem späteren Zeitpunkt in die Gesamtsynthesesequenz eingeführt. Dadurch wird der Verlust an homochiralem Material niedrig gehalten. Gleichzeitig werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr hohe Stereoselektivitäten erzielt. Durch die Verwendung ganzer Zellen entfällt außerdem die Notwendigkeit, zusätzlich kostenintensive Coenzyme und Coenzym-Regenerierungssysteme in die Reaktionen einzusetzen. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen gemäß den Formeln 1 bis 5 können insbesondere zur Herstellung von chiralen Naturstoffen, Pharma- und Agrowirkstoffen, Katalysatoren und Hemmstoffen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren des Mevinsäure-Typs und Lipase-Hemmer des Lipstatin-Typs. Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben:
Beispiel 1 : Herstellung von Lactobacillus-Zellen (Lactobacillus kefir)
Zellen für die Reduktion können erhalten werden, indem eine Stammkultur von Lactobacillus kefir (z.B. DSM 20587) in folgendem Medium vermehrt wird:
Pro 1 L: 10 g Caseinpepton, tryptisch verdaut; 10 g Fleischextrakt; 5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose; 1 g Tween 80; 2 g K2HPO4; 5 g Na-acetat; 2 g Diammoniumcitrat; 0,2 g MgS04 x 7 H20; 0,05 g MnSO4 x H20; pH = 6,2-6,5. Nach 24 Std. Wachstum werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Sie können durch Einfrieren gelagert werden.
Beispiel 2: Ganzzelltransformation von 6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-te/ - butylester (1) mit Lactobacillus kefir
Synthese der sekundären Alkohole (S)-Il, (R)-\\\ und (3R, 5S)-IV (Formelschema I)
Die im folgenden beschriebene Ganzzelltransformationen wird bei Raumtemperatur mit Zellen von Lactobacillus kefir durchgeführt, die wie unter Beispiel 1 beschrieben erhalten werden. Diketoverbindung I wird dargestellt wie beschrieben in M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19847302.2, 1998.
Figure imgf000010_0001
(S)-π
Figure imgf000010_0002
(R)-m (3R,5S)-TV
Abbildung 1
Durchführung der mikrobiellen Reduktion
In einem 50 ml Becherglas werden 0.61 g Feuchtzellmasse in 0.5 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM, pH 5.5) unter Rühren suspendiert. Von dieser Zeilsuspendion werden 0.9 ml mit 1 ml Glucose-Lösung (5 M, autoklaviert), 8 ml Phosphat-Citrat-Puffer (250 mM, pH 5.5) und 50 μl 6- Chlor-3,5-dioxo-hexansäure-tert-Butylester (I) versetzt. Das
Reaktionsgemisch wird mit einem Magnetrührer gerührt. 10
Reaktionskontrolle
Nach 1 h, 2 h, 6.5 h und 10.5 h werden Proben gezogen. Dazu gibt man 40 μl der Reaktionslösung zu 200 μl Essigsäureethylester, schüttelt aus und analysiert die organische Phase gaschromatographisch, wobei ein Quadrupol-Massenspektrometer mit Elektronenstoßionisation (70 eV) als Detektor zum Einsatz kommt (GC-MS-Koppiung).
GC-Kapillarsäule: HP-5MS (5% Phenyl-Methyl-Siloxan; 30.0 m x 250 μm x 0.25 μm nominal)
Temperaturprogramm: 1 min 60°C, dann auf 280°C (15°C/min) Gasfluß: 1.0 ml/min Helium Injektion: split 50 : 1
Retentionszeiten:
I: 8.21 min
(S)-Il: 8.10 und 8.84 min (s. u.)
(R)-\\\: 9.06 min
(3R5S)-IV: 9.26 min
Die Diketoverbindung I wird als Furanon nachgewiesen, ebenso der Hydroxyketoester (R)-\\\ (HCI-Abspaltung im Injektor, siehe auch Formelschema IV). Der Hydroxyketoester (S)-Il erzeugt durch partielle thermische Lactonbildung im GC-Injektor zwei Signale.
Anhand der Chromatogramme kann der Verlauf der mikrobiellen Reduktion verfolgt werden: In den ersten beiden Proben lassen sich wachsende Anteile der Hydroxyketone (S)-Il und (R)-\\\ erkennen, während in den zu späteren Zeitpunkten entnommenen Proben das Signal für die Dihydroxyverbindung (3f?,5S)-IV an Intensität gewinnt. Da gleichzeitig die Signale für die Hydroxyketone (S)-Il und (R)-\\\ wieder an Intensität verlieren, kann davon 11
ausgegangen werden, daß die Dihydroxyverbindung (3f?,5S)-IV durch mikrobielle Reduktion der intermediär auftretenden Hydroxyketone (S)-Il und (R)-\\\ gebildet wird. Aufarbeitung: Nach 12.5 h wird die Reaktion durch Abzentrifugieren der Zellen abgebrochen. Die Zellpellets und der Zentrifugationsüberstand werden getrennt voneinander je zweimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen mit Natriumsulfat und Einengen am Rotationsverdampfer werden 44 mg Rohprodukt erhalten.
Produktanalvtik a Bestimmung der Anteile der Reaktionsprodukte im Rohprodukt Für eine zerfallsfreie gaschromatographische Analyse (GC-MS, Methode s. o.) werden in einem 1.5 ml GC-Glasvial 1.5 mg des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion in 0.5 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 μl Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) und 10 μl Pyridin versetzt. Anschließend wird das Glasvial mit einem Septum verschlossen und 30 min bei 40°C aufbewahrt (Wasserbad).
Die nachfolgende GC-MS-Analyse ergibt vier Hauptsignale, die anhand der zugehörigen Massenspektren den Derivatisierungsprodukten (3R,5S)-V, (S)- VI, (S)-Vll, und VIII zugeordnet werden können (Formelschema II).
12
Figure imgf000013_0001
(3R,5S)-\ (S)-VI OTFAOTFA
TFA = Trifluoracetyl = — COCF3
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0003
Abbildung 2
Derivat (3R,5S)-y wird aus dem mikrobiellen Reduktionsprodukt (3R,5S)-N gebildet, während das Hydroxyketon (S)-Il zu den zwei stereoisomeren Bisacylierungsprodukten (S)-Vl und (S)-Vll reagiert. Das cyclische Derivat VIII bildet sich aus dem Furanon IX, dessen Formierung aus der Diketoverbindung I während der mikrobiellen Reaktion bekannt ist (Nebenprodukt durch intramolekulare Alkylierung, siehe M. Woiberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19857302.2, 1998). Ein Derivat des Hydroxyketoesters (R)-\\\ kann im Rohprodukt nicht gefunden werden. Diese intermediär auftretende Verbindung wird bei der hier gewählten Reaktionsführung (Abbruch der Reaktion nach 12.5 h) komplett zur Dihydroxyverbindung (3R,5S)-N umgesetzt.
Die Integration der vier Hauptsingnale im Gaschromatogramm ergibt folgende relative Intensitäten ((S)-Vl und (S)-Vll zusammengefaßt, Retentionszeiten in Klammern): 13
(3R5S)-V: 34% (8.14 min)
(S)-VI/(S)-VII: 61% (8.30/7.84 min)
VIII: 5% (6.85 min)
Bei der hier beschriebenen Reaktionsführung der mikrobiellen Reduktion erhält man somit ein Rohprodukt, das hauptsächlich aus dem Hydroxyketon (S)-Il besteht. Dieses Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s. u.).
Es ist zweifellos möglich durch Variationen der Reaktionsführung die Zusammensetzung des Rohproduktes zu beeinflussen.
Die soeben beschriebene Derivatisierung und GC-MS-Analyse wurde mit dem racemischen Hydroxyketoester rac-ll und dem Diastereomerengemisch der Dihydroxyverbindungen syn-/anti-N, welche durch eine unabhängige Synthese erhalten wurden (Formelschema III), überprüft.
14
Figure imgf000015_0001
anti-TV syn-IV= (3R,5S)-τV und (3S,5fl)-rv aπf/-IV= (3S,5S)-IVund (3fl,5fl)-IV (es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt)
Et = — CH2CH3 tßu = — C(CH3)3 syn : anti= 1.4 : 1.0 Abbildung 3
Die Retentionszeiten und Massenspektren dieser racemischen Proben stimmen mit den Retentionszeiten und Massenspektren der Produkte der mikrobiellen Reduktion überein. Gleiches gilt für die jeweiligen TFA-Derivate (Formelschem II).
Das Furanon IX wurde ebenfalls in einer unabhängigen Synthese dargestellt (Formelschema IV). 15
Figure imgf000016_0001
i: 250 mM Phosphat-Puffer pH 7.5/Ethanol (2 : 1 v/v); 20 h bei Raumtemperatur
Abbildung 4
Auch hier stimmen die Retentionszeiten und Massenspektren mit den analogen Signalen in den Spektren des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion überein.
b) Bestimmung des Diastereomerenverhältnisses
Die Diastereomere syn-IV und anti-N werden mit der verwendeten gaschromatographischen Methode nicht getrennt. Eine Grundlinientrennung kann allerdings nach Derivatisierung mit TFAA/Pyridin erreicht werden (Formelschema V).
Figure imgf000016_0002
syn-Y anti-
Diastereomerengemisch, trennbar mit GC (es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt)
Abbildung 5
Das polarere Isomer anti-V weist gegenüber dem syn-lsomer eine längere Retentionszeit auf. Beide Signale zeigen identische Massenspektren. 16
Angewendet auf das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion ergibt diese Methode für die Diastereomere syn-V und anti-V ein Verhältnis von 135 : 1. Die mikrobielle Reduktion liefert somit das syπ-lsomer in sehr hohem Überschuß. Dieses Ergebnis wird durch NMR-Spektroskopie bestätigt (s. u.). Für die TFA-Derivate der Produkte der nahezu unselektiven NaBH4- Reduktion (Formelschem III) ergibt die Integration der GC-Signale ein Verhältnis von 1.4 : 1.0.
c) NMR-Spektroskopie
Die NMR-Spektren des Rohprodukts der mikrobiellen Reduktion bestätigen die Ergebnisse der GC-MS-Analysen. Das 1H-NMR-Spektrum zeigt eine Überlagerung der einzelnen Spektren der Verbindungen (S)-Il, (3f?,5S)-IV- und IX, wobei die Signale des Hydroxyketons (S)-Il eindeutig dominieren, während die Signale des Furanons IX nur schwach zu sehen sind.
Hydroxyketoester (S)-Il:
1H-NMR (300 MHz, CDCI3, 22°C, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) δ: 4.31 (m, 1 H, CHOH), 3.6 (m, Feinstruktur nicht erkennbar durch Überlagerung mit Multiple« von Verbindung (3R,5S)-N; 2 x H6), 3.41 (s, 2H, H2), 2.90 (dd, J = 17.5, 5.0 Hz, 1 H, H4), 2.83 (dd, J = 17.5, 7.3 Hz, 1 H, H4), 1.46 (s, 3 x CH3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (3R,5S)-N und IX). Keto: Enol = ca. 95:5. 13C-NMR (75.5 MHz, CDCI3, es werden nur die Signale der Ketoform angegeben) δ:28.13 (OC(CH3)3), 46.57, 48.43, (C4, C6), 51.31 (C2), 67.58 (C5), 82.73 (OC(CH3)3), 166.22 (COOfBu), 202.93 (C3).
Dihydroxyverbindung (3R,5S)-N:
1H-NMR (300 MHz, CDCI3, 22°C) δ:4.22 (m, 1 H, H5), 4.05 (m, 1 H, H3), 3.6 (m, Feinstruktur nicht erkennbar durch Überlagerung mit Multiple« von Verbindung (S)-Il; 2 x H6), 2.43 (d, J = 6.3 Hz, 2H, H2), 1.70 (m, 2H, H4), 1.46 (s, 3 x CΗ3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (S)-\\ und IX). 3C-NMR (75.5 MHz, CDCI3) δ: 28.27 (OC(CH3)3), 39.45, 42.47 (C2, 17
C4), 49.17 (C6), 68.35 (C3), 71.57 (C5), 81.90 (OC(CH3)3), 172.21 (COOffiu).
Furanon IX:
1H-NMR (300 MHz, CDCI3, 22°C) δ:5.69 (s, 1 H, H3), 4.54 (s, 2H, H5), 3.48 (s. 2H, H6), 1.47 (s, 3 x CH3, Überlagerung mit analogem Signal der Verbindungen (S)-Il und (3R,5S)-N).
Die angegebenen Verschiebungen beziehen sich auf CHCI3 in CDCI3 (1H- NMR: δ = 7.27; 13C-NMR: δ= 77.23) und stimmen mit den Daten der auf unabhängigem Wege synthetisierten Vergleichsverbindungen rac-ll, syn/anti- IV und IX (Formelschema III) überein.
Die Signale der Dihydroxyverbindung anti-N, die sich von denen der stereoisomeren Verbindung syn-IV unterscheiden, können im 13C-NMR- Spektrum des Rohproduktes der mikrobiellen Reduktion nicht beobachtet werden. Dies ist ein weiterer Beweis für den sehr hohen Anteil des syn- Isomers (s.o.).
Dihydroxyverbindung anti-\\l (aus unabhängiger Synthese, siehe Formelschem III):
13C-NMR (75.5 MHz, CDCI3) δ: 28.27 (OC(CH3)3), 39.33, 42.22 (C2, C4), 49.60 (C6), 65.46 (C3), 68.94 (C5), 81.87 (OC(CH3)3), 172.54 (COOffiu).
Die Zuordnung der Signalsätze im 13C-NMR-Spektrum des Isomerengemisches syn-/anti-N zu den Diastereomeren erfolgt anhand der charakteristischen chemischen Verschiebung der Kohlenstoffatome C-3 und C-5 (Formelschema VI). 18
syn-TV anti-TV
Figure imgf000019_0001
71.57 68.35 68.94 65.46
13 C, -Kemresonanzen in ppm
(es ist nur jeweils eines der Enantiomere gezeigt) Abbildung 6
Bei der vorliegenden Verbindungsklasse (1 ,3-Diole) weisen die Signale der hydroxyltragenden Kohlenstoffatome des syπ-lsomers relativ zu den analogen Signalen des antf-lsomers für gewöhnlich eine Tieffeldverschiebung auf. Vergleiche hierzu: a) F. G. Kathawala et al., Helv. Chim. Acta 1986, 69, 803-805 b) K.-M. Chen et al., Tetrahedron Leu. 1987, 28, 155-158 c) C. Bonini et al., Gazz. Chem. Ital. 1991 , 121 , 75-80
Das 13 C/ -NMR-Spektrum des Rohproduktes belegt demnach, daß in der hier beschriebenen mikrobiellen Reduktion das syπ-lsomer gebildet wird.
d) Bestimmung der absoluten Konfiguration und der Enantiomerenreinheit Da die Konfiguration des Stereozentrums C-3 relativ zum Stereozentrum C-5 bereits durch die 13C-NMR-Spektroskopie aufgeklärt ist, beschränkt sich die weitere Analytik auf die Ermittlung der Konfiguration des Stereozentrums C- 5. Hierfür wird das Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion in das cyclische Derivat (S)-X überführt (Formelschema VII). 19
Figure imgf000020_0001
(Nebenprodukt IX nicht mit abgebildet)
TsOH = p-Toluolsulfonsäure
Figure imgf000020_0002
(S)-X
Abbildung 7
Das racemische Derivat rac-X (Formelschema VIII), welches mit der gleichen Methode aus dem Hydroxyketoester rac-ll erhalten wird, läßt sich durch HPLC mit chiraler stationärer Phase trennen.
HPLC-Bedingungen: Chiracel OB (DAISO);25°C; 1 ml/min i-Hexan/i-Propanol
(80 : 20); Detektion bei 210 nm.
Retentionszeiten:
(S)-X: 24.7 min
(R)-X: 21.5 min
Die Zuordnung der absoluten Konfiguration der getrennten Enantiomere erfolgt durch Vergleich mit der Retentionszeit einer authentischen Probe des Lactons (S)-X, das analog zum racemischen Derivat rac-X aus dem 20
Hydroxyketon (S)-\\ (>99% ee) hergestellt wird (Formelschema VIII). Das enantiomerenreine Hydroxyketon (S)-Il wird nach einer bekannten Vorschrift erhalten (M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Ger. Pat. Appl. 19857302.2, 1998).
Figure imgf000021_0001
rac-π rac-X
Figure imgf000021_0002
(S)-π (S)-X
> 99 % ee
Abbildung 8
Durch Intergration der Signale des Derivats (S)-X, welches aus dem Rohprodukt der mikrobiellen Reduktion hergestellt wurde (Formelschema VII), berechnet sich ein Enantiomerenüberschuß von 99.4%.
21
Patentansprüche
1. Verfahren zur Reduktion von Diketocarbonsäuren oder Hydroxyketocarbonsäuren oder deren Estern, bei dem in Gegenwart von Lactobacillus-Arten wenigstens eine Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß zu Diolen reduziert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß zu einem Gemisch aus Diolen und Monoalkoholen reduziert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel 1
Figure imgf000022_0001
umgesetzt werden, wobei
A, B = C=0, CHOΣ, mit Σ = H oder Schutzgruppe für die Hydroxyfunktion, wobei A und B gleich oder verschieden sein können.
R1, R2 = H oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl,
Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die
Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, 22
P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert oder vollständig durch Heteroatome ersetzt sein können.
R3 = H, Metallkationen oder eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können.
Y = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkylalkyi, wobei die Komponenten auch einfach oder mehrfach mit Heteroatomen, wie z.B. Si, N, P, O, S, F, Cl, Br oder I substituiert sein können. Ausgeschlossen wird X-CH2-O-CH2-, wobei X = Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Aralkyl oder Cycloalkylalkyi sein kann. n = 0-10.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel 2
Figure imgf000023_0001
eingesetzt werden, wobei R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel 3 23
Figure imgf000024_0001
oder deren Entantiomere eingesetzt werden, wobei R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben. Σ = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der Formel 4
Figure imgf000024_0002
oder deren Enantiomere eingesetzt werden, wobei R1, R2, R3 und Y dieselbe Bedeutung wie in Formel 1 haben. Σ = H oder Schutzgruppen für die Hydroxyfunktionen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis oder eine Mischkultur dieser Mikroorganismen eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert von 2 bis 10 durchgeführt wird. 24
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert von 4 bis 8 durchgeführt wird.
11. Verbindungen enthaltend wenigstens eine Hydroxygruppe hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 11 zur Herstellung von chiralen Naturstoffen, Pharma- und Agrowirkstoffen, Katalysatoren oder Hemmstoffen.
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