WO2001004299A1 - Facteur regulant l'agglutination de la proteine beta-amyloide - Google Patents

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WO2001004299A1
WO2001004299A1 PCT/JP2000/004515 JP0004515W WO0104299A1 WO 2001004299 A1 WO2001004299 A1 WO 2001004299A1 JP 0004515 W JP0004515 W JP 0004515W WO 0104299 A1 WO0104299 A1 WO 0104299A1
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protein
polynucleotide
present
seq
expression
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PCT/JP2000/004515
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Toshio Ota
Takao Isogai
Tetsuo Nishikawa
Yuri Kawai
Mayako Yamazaki
Susumu Satoh
Hiroyuki Arakawa
Masahiko Morita
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Helix Research Institute
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a protein that suppresses or promotes aggregation and deposition of amyloid protein (hereinafter, also referred to as ⁇ ), a polynucleotide encoding the protein, a method for producing the protein using the polynucleotide, and a method for producing the same.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to an expression system involved in the production and a method for screening a compound that suppresses or promotes aggregation of amiloid 3 protein using the expression system.
  • the present invention also relates to a method for treating and preventing Alzheimer's disease using a protein obtained by the above method or a compound obtained by screening. Background art
  • Alzheimer's disease is a disease with impaired cognitive function and is characterized by the appearance of numerous senile plaques and neurofibrillary tangles along with loss of nerve cells.
  • Senile plaques are detected from the earliest stages of the onset process, and are not seen in other neurodegenerative diseases and have high disease specificity.
  • Amyloid iS protein is a major component of the senile plaque and forms an amyloid fiber having a ⁇ -sheet structure.
  • ⁇ is a polypeptide composed of about 40 amino acid residues and having a molecular weight of about 400. Highly cohesive, easily forms fibers and insolubilizes.
  • the major molecular species are ⁇ / 340, which ends with the 40th amino acid residue valine, and A42, which is 2 residues longer.
  • a j3 is normally degraded and does not accumulate in the brain, but its degradation ability decreases with aging and accumulation occurs, which causes neurological dysfunction and neuronal cell death, eventually leading to dementia and Alzheimer's disease It is said that.
  • Various genetic analyzes, molecular biology and neuropharmacology studies have led to the cause of this Alzheimer's disease.
  • the “amyloid hypothesis” has been advocated. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a protein that suppresses or promotes aggregation and deposition of amyloid protein and a polynucleotide encoding the same. Further, a method or substance that suppresses or promotes aggregation and deposition of amiloid; 3 protein The finding is to provide a method for treating Alzheimer's disease.
  • the inventors of the present invention have found that polynucleotides encoding secretory or membrane-bound proteins that suppress or promote amyloid / 3 protein aggregation from neural progenitor cells. And completed the present invention.
  • a polynucleotide encoding a protein that suppresses or promotes aggregation of the amyloid 3 protein according to any of (a) to (e) below.
  • [4] A protein that suppresses or promotes aggregation of amyloid 3 protein, which is encoded by a polynucleotide originating from the same gene as the polynucleotide of [1] in molecular evolution.
  • [5] A vector comprising the polynucleotide of any one of [1] and [2].
  • An immunoassay method comprising a step of observing an immunological reaction between the peptide or protein of [3] and the antibody of [9].
  • a candidate compound is brought into contact with a protein encoded by the polynucleotide of [1] or a cell that expresses the protein to induce aggregation or deposition of amyloid i3 protein.
  • a method for screening a compound that regulates the expression of a protein encoded by the polynucleotide of [1], comprising the following steps:
  • step (3) selecting a candidate substance that increases or decreases reporter activity in step (2) compared to a control
  • a method for detecting Alzheimer's disease comprising the following steps.
  • a step of associating the change in the expression state of the polynucleotide with Alhaima disease The protein of the present invention that suppresses or promotes amyloid protein aggregation and the polynucleotide encoding the protein are all or a part of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9. Having the following sequence:
  • the form of the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the protein of the present invention, and includes cDNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, and the like. Further, as long as it can encode the protein of the present invention, a polynucleotide having an arbitrary nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention can be obtained by a hybridization method using the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 or a part thereof as a probe. It can be isolated by a conventional method such as a PCR method using a primer designed based on the nucleotide sequence information.
  • the protein that suppresses or promotes aggregation of the amyloid protein which is the protein of the present invention, includes, for example, the sequence of the open reading frame of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 It can be obtained by expressing in a transformant transformed with an expression vector.
  • These expressed proteins can be purified and isolated from a culture solution or a cell fraction by a conventional method. Specific examples of the method for purification and isolation include the following methods. First, cells or supernatant are collected by a conventional method such as filtration and centrifugation, and for the cells, the cell wall and / or cell membrane of the cells is treated with, for example, ultrasound and / or lysozyme to obtain a cell membrane fraction.
  • the obtained cell membrane fraction is dissolved in an appropriate aqueous solution.
  • the protein of the present invention is isolated and purified from the supernatant or the cell membrane fraction according to a conventional method generally used for purifying and isolating natural or synthetic proteins. Isolation and purification methods include dialysis, gel filtration, and affinity using a monoclonal antibody against the protein of the present invention or a partial peptide thereof. Column chromatography, column chromatography on a suitable adsorbent, high performance liquid chromatography and the like are exemplified.
  • the present invention also includes a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the above-described protein.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has an activity of suppressing or promoting the aggregation of amyloid 5 protein.
  • the activity of inhibiting or promoting amyloid protein aggregation can be confirmed, for example, by the method shown in Examples. That is, A and its fragments have the property of easily aggregating under certain conditions. Under these conditions, by adding the test protein, if the protein has the property of promoting A5 aggregation, the property can be grasped as A3 aggregation. .
  • a fragment consisting of the amino acid sequence at the N-terminal position 1-28 of A ⁇ has been used in this kind of test as a partial peptide having A? Aggregation activity (Methods in Enzymology Vol. 309, 274). -284, 1999). Aggregation of A? Can be detected optically. Alternatively, it can be confirmed with a microscope after staining with Congoles or the like.
  • a method for introducing a mutation into an amino acid sequence in a protein for example, site-specific It can be prepared using a mutagenesis method (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)).
  • Such proteins may also be caused by amino acid mutations in nature.
  • the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10, or SEQ ID NO: 1, 3, Amino acid sequence of the protein encoded by 5, 7, or 9), where one or more amino acids differ due to substitution, deletion, insertion and / or addition, etc. Protein is also included.
  • a plurality of amino acids SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10, or SEQ ID NO: 1, 3, Amino acid sequence of the protein encoded by 5, 7, or 9
  • the number and location of amino acid mutations in a protein are not limited as long as the function is maintained.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
  • the present invention includes a case where a plurality of amino acid mutations are substituted as a plurality of amino acids.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are all classified as non-polar amino acids, and are considered to have similar properties to each other.
  • examples of the non-charger include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu.
  • Examples of the basic amino acid include Lys, Arg, and His.
  • a protein functionally equivalent to the protein identified in this example can also be isolated using a hybridization technique or a gene amplification technique well known to those skilled in the art. That is, those skilled in the art can use the hybridization technique (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4) to identify in this example.
  • a polynucleotide having high homology to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9) or a part thereof is isolated based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9) of the polynucleotide encoding the isolated protein.
  • the present invention also includes proteins encoded by polynucleotides that hybridize with polynucleotides encoding these proteins, as long as they have the same function as the proteins identified in this example.
  • Organisms that isolate functionally equivalent proteins include, for example, human and mouse. Vertebrates such as butterflies, rats, magpies, magpies, magpies, etc., but are not limited thereto. From these animals, a gene originating from a gene that is identical in molecular evolution to a gene of a protein that suppresses or promotes amyloid /? Protein aggregation according to the present invention can be isolated.
  • the expression "originating from the same gene in molecular evolution” means that the gene of the present invention in humans is considered to have a molecular evolution by analyzing its polynucleotide base sequence and analyzing its physiological role. Genes that are reasonably judged to have evolved from the same gene. Such genes maintain a high degree of homology in their nucleotide sequences.
  • the stringent conditions for hybridization to isolate a polynucleotide encoding a functionally equivalent protein are usually ⁇ lxSS 0.1% SDS, 37 ° C
  • the more severe condition is about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and the more severe condition is about 0.1xSSC, O.SDS, 65 ° C; Yes, isolation of polynucleotides having higher homology to the probe sequence can be expected as hybridization conditions become more stringent.
  • the combination of the above SSC, SDS, and temperature conditions is merely an example, and those skilled in the art will recognize the above or other factors (eg, probe concentration, probe) that determine the stringency of the hybridization. , And the hybridization reaction time, etc.) can be used to realize the same stringency as above.
  • the protein isolated using such a hybridization technique is the protein of the present invention described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 or SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9
  • the protein usually has a higher homology in its amino acid sequence or the nucleotide sequence encoding the protein.
  • High homology means at least 60% or better It preferably refers to 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence identity.
  • the homology can be identified using the BLAST2 search algorithm (Altschul, SF et al, 1997, Gapped BLAST and PS I-BLAST: a new generation oi protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Can be determined.
  • PCR gene amplification technology
  • Primers are designed based on a part of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9), and a polynucleotide fragment having high homology to these polynucleotide sequences or a part thereof is isolated. Based on this, it is also possible to obtain a protein functionally equivalent to the protein identified in this example.
  • the present invention also relates to a partial peptide of the protein of the present invention, and a polynucleotide encoded by the partial peptide.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids or more, more preferably 12 amino acids or more, more preferably 15 amino acids or more.
  • the partial peptide of the present invention is produced, for example, by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the present invention also provides an expression vector containing any one of the polynucleotides. Furthermore, the present invention provides a method for culturing a transformant which retains the polynucleotide or any of the expression vectors, and a transformant thereof, and isolating the protein of the present invention from the culture.
  • the present invention relates to a method for producing a protein which suppresses or promotes aggregation of amyloid 5 protein, or a method for producing a partial peptide thereof. Further, the present invention provides a protein produced by the above method, or a partial peptide thereof. Things.
  • polypeptides When polypeptides are produced by genetic recombination techniques, the type and degree of glycosylation of the target polypeptide can be obtained depending on the type of host cell, and the so-called secretion of polypeptides
  • the terminal (N-terminal and / or C-terminal) amino acid sequence of the precursor polypeptide expressed in the host cell is processed by signal peptide, etc., and various terminal amino acid sequences are converted. It is well known to those skilled in the art that a polypeptide having the same can be obtained. Therefore, it is easily understood by those skilled in the art that such a polypeptide is also included in the scope of the protein of the present invention.
  • the present invention also includes an expression vector constructed by a method known in the art based on the polynucleotide sequence of the present invention.
  • Microbial cells that can be used to express a polynucleotide encoding the protein of the present invention include, for example, prokaryotic bacteria [Escherichia coli and Bacillus subtilis] and eukaryotic yeast [ For example, baker's yeast (Saccaromyces cerevisiae)].
  • Mammalian cells include cultured human cells and cultured animal cells. Furthermore, cultured plant cells can also be used. Examples of microorganisms include bacteria belonging to the genus Escherichia (eg, E. coli HBlOl ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. coli MM294 ATCC 31446, E.
  • mammalian cells include human fetal kidney-derived HE There are K293 cells, mouse L920 cells and Chinese Hamster-Ovali (CHO) cells.
  • the expression vector is at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, and a termination codon. And self-replicatable units (units).
  • the expression vector should include at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, and a stop codon. It is preferably composed of don.
  • enhancer sequences, 5,-and 3'-non-coding regions, polyadenylation sites and self-replicatable units of the proteins of the invention may also be inserted.
  • the above self-replicatable unit preferably contains a transformant selection marker (for example, ampicillin resistance).
  • a transformant selection marker for example, ampicillin resistance
  • promoter is used to refer to the promoter
  • Examples of such promoters include the conventional promoter's overnight region (eg, lactose operon, PL-promoter, trp-promoter, etc.).
  • One example of a promoter used in an expression vector with an yeast host is the pho5 promoter.
  • a basic amino acid having an affinity for a metal ion chelate can be added to any terminal in the protein of the present invention.
  • PCR can be performed at any end of the target gene by performing PCR using a primer having a base sequence having a continuous base sequence encoding the desired amino acid added to the 5 ′ side. Oligopeptides can be added.
  • Basic amino acids include histidine, lysine, Guinine and the like can be used.
  • promoters used for expression vectors in mammalian cells include HTLV-LTR promoter, SV40 early and late promoter, CMV promoter—Mice, and mouse 'meta-mouth thionein I (MMT).
  • MMT mouse 'meta-mouth thionein I
  • -One example is Promo.
  • An example of a preferred initiation codon is methionine codon (ATG).
  • a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained, for example, by partial or total synthesis using an MA synthesizer. Alternatively, it can be obtained from a human cDNA library using a probe or primer set based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9.
  • genomic DNA must be processed as usual (eg, digestion with restriction enzymes, dephosphorylation with bacterial alkaline phosphatase, phosphorylation with T4 polynucleotide kinase, ligation with T4 DNA ligase).
  • a genomic DNA encoding the protein of the present invention can be prepared.
  • the transcription start site of the gene of the present invention in the genome can be clarified, and the expression control region located further upstream can be specified.
  • Control regions such as promoters and enhancers that control the expression of the gene encoding the protein of the present invention are useful as target regions for detecting abnormal expression of the protein of the present invention.
  • the expression can be controlled by decoy nucleic acid drugs targeting these regions.
  • the host cells of the present invention also include cells of interest for use in analyzing the function of the protein of the present invention and screening for its function inhibitor or function promoter using this protein.
  • Transduction of vectors into host cells can be performed, for example, by calcium phosphate precipitation or electropulse perforation (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), the ribofectamine method, the microinjection method, and the like.
  • Preparation of the protein of the present invention from a transformant can be carried out by using a protein separation / purification method known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9, or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof.
  • the “complementary strand” refers to one strand of the double-stranded polynucleotide composed of ⁇ ⁇ : ⁇ ( ⁇ : ⁇ ) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • “complementary” is not limited to a sequence completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, and more preferably 90%. More preferably, it should have 95% or more homology on the base sequence.
  • the algorithm for determining homology may be the one described in this specification.
  • Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting and isolating DNA or RNA encoding the protein of the present invention, and as a primer for amplifying the polynucleotide of the present invention. It is. When used as a primer, it usually has a chain length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 35 bp. When used as a probe, a polynucleotide having at least a part or all of the sequence of the polynucleotide of the present invention and having a chain length of at least 15 bp is used. When used as a primer, the 3'-side region must be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence or a tag can be added to the 5'-side.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for testing and diagnosing abnormalities of the protein of the present invention.
  • abnormal expression can be examined by Northern hybridization or RT-PCR using the polynucleotide of the present invention as a probe or primer.
  • expression Includes transcription and / or translation.
  • the use of an antibody against the protein of the present invention described below enables examination / diagnosis of gene expression at the translation level.
  • a polynucleotide encoding the protein of the present invention and its expression control region are amplified by genomic DNA-PCR or RT-PCR by polymerase chain reaction (PCR) using the polynucleotide of the present invention as a primer, and RFLP Sequence abnormalities can be inspected and diagnosed by methods such as analysis, SSCP, and sequencing.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 or a complementary strand thereof includes the protein of the present invention.
  • antisense polynucleotides for suppressing the expression of E. coli has a chain length of at least 15 bp or more, preferably 100 bp, more preferably 500 bp or more, and usually has a chain length of 3000 bp or less, preferably 2000 bp or less in order to cause an antisense effect. Having.
  • Such antisense polynucleotides can also be applied to gene therapy for diseases caused by abnormalities (functional abnormality or abnormal expression) of the protein of the present invention.
  • abnormalities functional abnormality or abnormal expression
  • aggregation and deposition of amyloid 5 protein is thought to trigger and lead to brain neuronal cell death and neuronal dysfunction. Therefore, if the expression of the protein that promotes aggregation of the amyloid ⁇ protein of the present invention can be inhibited, it can be used for treating or preventing the onset of Alzheimer's disease.
  • the expression of the protein of the present invention that suppresses the aggregation of amyloid protein can be inhibited, the aggregation of amyloid protein can be promoted to create an Alheimer's model.
  • the antisense polynucleotide is, for example, the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9. Based on the sequence information of Reochido Hosuhorochioe Ichito method (Stein, 1988 Physicoch emical properties of phosphorothioate o ⁇ igodeoxynucleotides.
  • Nucle ic Acids Res 16, 3209-21 (1988)) c of the present invention can be prepared by such When polynucleotides or antisense polynucleotides are used for gene therapy, for example, viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, and non-viral vectors such as ribosomes, etc. Is used to administer to patients by the ex vivo method or the in vivo method.
  • viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors
  • non-viral vectors such as ribosomes, etc.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a part thereof having antigen-binding properties. Also includes all classes of antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody of the present invention can be obtained by synthesizing the protein or partial peptide of the present invention and immunizing rabbits (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12-11.13)
  • mice are immunized with the protein or partial peptide of the present invention, and spleen cells are It can be obtained from hybridoma cells obtained by cell fusion of myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4 to 11.11).
  • Antibodies that bind to the protein of the present invention may be used for, for example, inspection and diagnosis of abnormal expression or structural abnormality of the protein of the present invention, in addition to purification of the protein of the present invention.
  • proteins are extracted from tissues, blood, or cells, and abnormalities in expression and structure are detected through detection of the proteins of the present invention by methods such as Western blotting, immunoprecipitation, and ELISA. Inspection / presence can be diagnosed.
  • An antibody that binds to the protein of the present invention may be used for purposes such as treatment of a disease associated with the protein of the present invention.
  • human antibodies or humanized antibodies are preferred because of their low immunogenicity.
  • a human antibody is a mouse in which the immune system is replaced with that of a human (see, for example, “Functional transplant of megaoase human immunoglobul in loc i recapitulates human antibody response in mice, Mendez, M.J. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-156 ”).
  • a humanized antibody can be prepared by genetic recombination using the hypervariable region of a monoclonal antibody (Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)).
  • the protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, 3 or 7 has the activity of inhibiting the aggregation of amide /? Protein as shown in the Examples, and is used in patients with Alzheimer's disease. , Its expression level is decreasing. Therefore, enhancing the expression of these proteins suppresses amyloid protein aggregation and is effective for treating and preventing the onset of Alzheimer's disease. Furthermore, these proteins and their functionally equivalent proteins can themselves be used as therapeutic and preventive agents for Alzheimer's disease.
  • the protein encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 5 or 9 has the activity of promoting the aggregation of amiide /? Protein as shown in the Examples, and in Alzheimer's disease patients, Its expression level is increasing. Therefore, by reducing the expression of these proteins, the aggregation of the amyloid 5 protein is suppressed, which is effective for the treatment and prevention of Alzheimer's disease.
  • the protein of the present invention may be used for other amyloidosis, specifically, Schizophrenia and related neuropathy, rheumatoid arthritis, tuberculosis, leprosy, bronchiectasis, systemic lupus erythematosus (SLE), dialysis amyloidosis, diabetic amyloidosis, atrial amyloidosis, etc. It is expected to be related to the disease of the present invention, and can be used as an agent for treating and preventing the onset of these diseases, or for screening of a therapeutic / prophylactic agent.
  • amyloidosis specifically, Schizophrenia and related neuropathy, rheumatoid arthritis, tuberculosis, leprosy, bronchiectasis, systemic lupus erythematosus (SLE), dialysis amyloidosis, diabetic amyloidosis, atrial amyloidosis, etc. It
  • the present invention also provides a method for screening a compound that regulates the activity of the protein of the present invention. Since the protein of the present invention suppresses or promotes amyloid /? Protein aggregation, the compound that regulates the expression of the product of the gene regulates amyloid protein aggregation to treat or prevent Alzheimer's disease. It is useful as a drug to do.
  • the screening method is as follows.
  • the candidate compound is brought into contact with the protein of the present invention or a cell expressing the protein of the present invention under conditions under which amyloid protein aggregation occurs, and a candidate compound that suppresses aggregation of the amyloid 3 protein is selected.
  • a solution containing the amyloid /? Protein (A540, A542, A528, etc.) is added to a solution of the protein of the present invention, for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or Or a protein functionally equivalent to the protein, or a protein functionally equivalent to the protein, or a cell expressing these proteins, or a candidate compound, and then aggregates the protein.
  • the fluorescent intensity can be measured using a fluorescent dye that binds to the aggregated amyloid protein, for example, thioflavin-T.
  • the present invention relates to a method for screening a compound that regulates the expression of a protein encoded by the polynucleotide of the present invention, comprising the following steps.
  • step (3) selecting a candidate substance that increases or decreases reporter activity in step (2) compared to a control
  • control region of the gene is cloned from chromosomal DNA, and a reporter gene (eg, luciferase, galactosidase, GFP (Green Fluorescent Protein)) is placed downstream of the control region gene.
  • a reporter gene eg, luciferase, galactosidase, GFP (Green Fluorescent Protein)
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 It can be cloned by known methods.
  • the S1 mapping method is known as a method for identifying the transcription start site (“Isolation of transcription regulatory region” and “Identification and purification of transcription control factor”, “Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol”) , Shujunsha 1993, p362 -374).
  • the expression control region DNA of the gene is obtained by adding a human chromosome library (genomic library) to the 5 'end of the gene at 15 to 100 bp, preferably 30 to 5 Obp as probe DNA. It is cloned as a gene clone containing an expression control region by screening using the gene. The clones obtained in this way are often 5 ' Includes untranslated regions.
  • the 5 'end of these clones is shortened or fragmented by exonuclease treatment or the like.
  • the minimum unit required to maintain the activity of the expression control region can be obtained (deletion study) .
  • a program for predicting the gene expression control region using a neural network is known (htD: //www-fruittf1v.ora/seatools/promoter.html, Reese, MG).
  • an expression plasmid in which a reporter gene is functionally linked is prepared downstream of the thus isolated control region gene, and the expression plasmid is introduced into appropriate cells.
  • the functional linkage means that the two are linked so that activation of the expression control region initiates transcription of a reporter gene.
  • the reporter gene any gene can be used as long as it encodes a protein whose activation of the expression control region can be observed as gene expression.
  • Genes such as luciferase, ⁇ -galactosidase, and GFP (Green Fluorescent Protein) are commonly used as reporter genes.
  • the cell into which the vector is introduced for example, an animal cell in which the gene has been deleted can be used.
  • animal cells from which the gene has been deleted are transformed with the present expression plasmid.
  • Expression of the repo overnight gene due to transcriptional activity of the control region is detected as color development or luminescence.
  • the cell line is seeded in a 96-well multiplate, and a compound to be screened is added to each well, whereby a compound that suppresses or promotes the expression of the expression product of the gene is obtained.
  • a method for selecting a compound for example, when GFP is used as the reporter gene, the selection can be made by comparing the luminescence of GFP with and without the addition of the drug.
  • the comparison suggests a case where the luminescence amount ratio is 2 times or more or 1/2 or less, preferably 5 times or 1/5 or less, more preferably 10 times or more or 1/10 or less.
  • This method can be used for both eukaryotic and prokaryotic organisms, as long as it is a host that causes the expression of repo-only genes in animal cells as well as in similar systems.
  • test sample used for the screening includes, for example, a cell extract, an expression product of a gene library, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, a natural compound, and the like.
  • the test samples described here are examples, and the present invention is not limited to these specific examples.
  • the compound isolated by this screening is a candidate for a compound (agonist, angiogonist) that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • it is a candidate for a compound that inhibits the interaction of the protein of the present invention with a molecule that interacts with the protein.
  • These compounds are expected to be applied as pharmaceuticals for preventing or treating the protein-related diseases of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical use of the compound obtainable by the screening of the present invention. That is, the present invention relates to use in treating or preventing Alzheimer's disease or controlling amyloid i3 protein aggregation, which contains a compound obtainable by the screening as a main component.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for Alzheimer's disease and a preventive agent for the onset of the disease, characterized by containing these compounds as main components.
  • the compounds obtained by the screening method of the present invention include other amyloidosis, specifically, schizophrenia and related neuropathy, rheumatoid arthritis, tuberculosis, leprosy, bronchiectasis. , SLE, dialysis amyloidosis, diabetic amyloidosis, atrial amyloidosis, etc. It can also be used for screening prophylactic agents.
  • the proteins, nucleotides, antibodies and compounds isolated by the above screening of the present invention are useful for regulating amyloid / 3 protein aggregation.
  • they can be used as pharmaceuticals themselves, but they can also be formulated and used by known pharmaceutical methods.
  • it may be used in the form of a formulation by appropriately combining with a pharmacologically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent and the like.
  • Administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the method of administration, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • gene therapy may be performed by incorporating the polynucleotide into a vector for gene therapy.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the protein of the present invention is expected to have a physiological activity in addition to the activity of inhibiting or promoting amyloid protein aggregation. They can be determined using the following methods.
  • the protein of the present invention is a secreted protein or a membrane protein, and its amino acid sequence has been clarified, it can be expressed as a recombinant by applying an appropriate expression system, or it can be expressed as a recombinant protein.
  • an antibody that specifically recognizes amidate it is possible to analyze whether or not it has a biological activity other than the activity of suppressing or promoting the aggregation of amyloid protein.
  • the protein of the present invention is described in, for example, “Glycobiology” (M. Fukuda, A. Kobata, 1993) and “Growth Factoers” (I. McKay, I. Leigh, 1993) of “The Practical Approach Seriesj (IRL PRESS)”. , Extracellular Matrix (MAHaralson, JRHassell ed., 1995), or Glycoprotein Analysis in Biomedicine (Elizabeth F. Hounse 11, 1993) of the Series of Method in Molecular Biology (Humana Press). Thus, the biological activity of each protein can be analyzed. Or "The Biochemical Society of Japan, New Chemistry Laboratory Course, 7 Growth Differentiation Factors and Their Receptors” (published in 1991). Tokyo Chemical Co., Ltd.
  • a novel ligand-receptor relationship can be found by screening the membrane protein provided by the present invention based on the binding activity to a known ligand ⁇ receptor. Screening can be performed according to a known method.
  • cells expressing the receptor of the protein of the present invention can be screened as follows. That is, (a) a step of contacting a test cell sample with the protein of the present invention or its partial peptide, and (b) a step of selecting cells that bind to the protein or its partial peptide. It is possible to screen for the receptor.
  • This screening can be performed, for example, as follows. First, the protein of the present invention is expressed to obtain a purified recombinant protein. Next, the purified protein is labeled, binding assays are performed on various cell lines or primary cultured cells, and cells expressing the receptor are selected based on the assay (Honjo, Arai, Taniguchi, Muramatsu ed. Experimental course 7 Growth differentiation factor and its receptor P203-236 (1991) Tokyo Chemical Dojin). Is a label, other RI labels such as 125 1, enzymes (alkaline phosphatase, etc.) label are possible. It is also conceivable that the protein of the present invention is used without labeling and the antibody against the protein of the present invention is labeled and used for detection. Cells expressing the receptor for the protein of the present invention obtained by the above-described screening can be used for screening for agonist to antagonist of the receptor as described later.
  • a receptor for the protein of the present invention and its receptor If cells expressing the same are obtained, compounds that inhibit the binding of the protein of the present invention to its receptor or a cell that expresses the receptor can be used as an index, such as a receptor agonist or antagonist. G) can be screened.
  • This screening method comprises the steps of (a) contacting the protein of the present invention with a receptor for the protein or a cell expressing the receptor in the presence of a test sample; (b) Detecting the binding activity to the body or cells expressing the receptor; and (c) selecting a compound that reduces the binding activity as compared to the case where the binding activity is detected in the absence of the test sample; including.
  • Test samples used for screening include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
  • the compound isolated by the above-described screening using the binding activity to the protein of the present invention as an index can also be used as a test sample.
  • the compound isolated by this screening is a candidate for the receptor of the protein of the present invention. Based on changes in intracellular signals such as phosphorylation due to decreased binding activity between the protein of the present invention and its receptor, the obtained compound is an agonist or an antagonist of the receptor of the protein of the present invention. It can be determined whether there is.
  • the compound obtained is a molecule that interacts with the protein of the present invention in vivo.
  • secreted proteins they may be factors that control cell states such as cell proliferation and differentiation.
  • factors that control new cell states By adding the secreted protein provided by the present invention to a certain kind of cells, if the cell state changes such as cell proliferation and differentiation and the activation of specific genes in the cell are screened, It is possible.
  • This screening can be performed, for example, as follows. First, the protein of the present invention is expressed to obtain a purified recombinant protein. Next, the purified protein is added to various cell lines or primary culture cells, and cell changes such as proliferation and differentiation are examined. Alternatively, induction of a gene that is known to act on a specific change in the state of a cell is detected based on the amount of mRNA and the amount of protein. Alternatively, detection is based on the amount of a substance (such as a low molecular compound) in a cell that has been changed by the action of a gene product (protein) that is known to act on a specific change in the state of a cell.
  • a substance such as a low molecular compound
  • the protein according to the present invention controls the cell state and function by such screening
  • the protein of the present invention may be modified as it is or partially suitable for a related disease.
  • application to pharmaceuticals is conceivable.
  • the secretory protein provided by the present invention is used for screening based on the binding activity to a known ligand ⁇ receptor, a new ligand-receptor can be obtained. It is possible to find the relationship between the two, and it is possible to determine agonist and antagonist in the same manner.
  • the compound thus obtained is also a candidate for a compound that inhibits the interaction with a molecule (including a receptor) that interacts with the protein of the present invention in vivo. These compounds can be applied to preventive or therapeutic drugs for diseases associated with the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is expressed to obtain a purified recombinant protein.
  • the affected proteins and genes are purified and screened based on their binding.
  • screening is performed by adding compounds that are candidates for the inhibitor in advance and then observing the change in their binding.
  • Compounds obtained by such screening are considered to be applied to pharmaceuticals for diseases associated with the protein according to the present invention.
  • the regulatory factor obtained by screening is a protein, similarly, if there is a compound that has no intrinsic effect on the expression and activity of the protein, the compound is related to the protein according to the present invention. It can be applied to medicines for diseases.
  • the secretory protein or membrane protein according to the present invention has activity as an enzyme
  • a compound is added to the protein provided by the present invention under appropriate conditions, and the activity of the protein is determined by using the change in the compound as an indicator. Can be clarified. Screening of a compound that inhibits the activity of the protein according to the present invention is also possible using this activity as an index.
  • This screening can be performed, for example, as follows. First, the protein of the present invention is expressed to obtain a purified recombinant protein. Next, a compound is added to the purified protein, and the amount of the compound and the amount of the reaction product are determined. Alternatively, a candidate compound for the inhibitor is added in advance, and then a compound (substrate) that reacts with the purified protein is added, and changes in the amount of the substrate and the amount of the reaction product are examined.
  • the compound obtained by such screening is considered to be applied to a drug for a disease associated with the protein of the present invention.
  • the secretory protein or membrane protein of the present invention is a novel disease-related protein depends on the protein of the present invention in addition to the above. It can be obtained by examining the correlation between a specific disease and the expression level or activity of a protein using a protein specific recognition antibody. An analysis can be performed with reference to "Molecular Diagnosis of Genetic Diseases” (edited by Rob Elles, 1996) by Method in Molecular Biology J (Humana Press), Inc. An antibody that binds to the protein of the present invention is: In addition to the purification of the protein of the present invention, it may be used, for example, for testing and diagnosing abnormal expression or structural abnormality of the protein of the present invention. By extracting the protein and detecting the protein of the present invention by a method such as Western blotting, immunoprecipitation, or ELISA, the presence or absence of abnormal expression or structure can be examined.
  • a method such as Western blotting, immunoprecipitation, or ELISA
  • the present invention relates to a method for detecting Alzheimer's disease, comprising the following steps.
  • a polynucleotide set forth as at least one SEQ ID NO selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9 Measuring the expression state of
  • the expression status of the polynucleotide can be determined by analyzing any step of the process in which the gene is transcribed into mRNA and translated into protein. More specifically, for example, by measuring mRNA consisting of the nucleotide sequence as the polynucleotide, You can know the state. mRNA can be measured by a known technique such as Northern hybridization RT-PCR. Alternatively, by measuring a protein comprising the amino acid sequence encoded by the polynucleotide or a fragment thereof, the state of translation into the protein can be known. Proteins can be measured by various methods such as the "Estanblot method" using an antibody recognizing the protein.
  • the test method according to the present invention can be performed on a blood sample or a cerebrospinal fluid sample of a patient. Alternatively, hippocampal tissue removed by necropsy can be targeted.
  • hippocampal tissue removed by necropsy can be targeted.
  • an in situ hybridization / histoimmunological analysis technique is used.
  • if the expression status of PSEC256 is increased as compared with the result in the case where there is no abnormality in the brain, it can be associated with Alzheimer's disease.
  • PSEC0012, PSEC0220, PSEC0242, or the like is observed, it can be linked to Alzheimer's disease.
  • the present invention also relates to a reagent for clarifying the expression state of the polynucleotide of the present invention. More specifically, the present invention relates to the use of a polynucleotide having a length of at least 15 bases complementary to the polynucleotide of the present invention or a complementary strand thereof for the detection of the polynucleotide of the present invention. About. Alternatively, the present invention relates to use of an antibody recognizing the protein of the present invention for detecting the protein. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • NT-2 neural progenitor cells purchased from stratagene
  • retinoic acid using teratocarcinoma cells derived from human fetal testis
  • cultured cells were prepared under the following conditions.
  • NT2RM1 Culture of NT-2 cells without retinoic acid induction
  • poly (A) + RNA was purified on oligo dT cellulose.
  • a cDNA library was prepared from each poly (A) + RNA by the oligo cap method [M. Maruyaraa and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)].
  • 01 igo-cap linker (agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg / rooster cl column number: 11) and Oligo dT primer (gcggctgaag acggcctatg tggccttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttZ sequence number: 12)
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • TAP tobacco Acid Phosphatase
  • clones with an input cDNA size of 1 kb or less for NT2RM1, PLACE1, and HEMBA1 and clones with an input cDNA size of 2 kb or less for NT2RP3
  • DNA sequencing reagent Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamme Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit or 'BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit. Kit, PE Biosystems
  • the sequencing reaction according to the manual and then the DNA base sequence was analyzed using a DNA sequencer (ABI PRISM 377, PE Biosystems).
  • An oligocap high-length cDNA library other than NT2RM1 was prepared using the expression vector PME18SFL3 capable of expression in eukaryotic cells.
  • the SRa promoter and SV40 small t intron are integrated upstream of the cloning site, and the SV40 polyA additional signal sequence site is inserted downstream thereof.
  • the cloning site of PME18SFL3 is an asymmetric Dralll site, and a complementary Sfil site is added to the end of the cDNA fragment, so that the cloned cDNA fragment is unidirectional downstream of the SRa promoter. It is inserted in sex.
  • the gene in a clone containing the full-length cDNA, the gene can be transiently expressed by directly introducing the obtained plasmid into COS cells. That is, it is very easy to experimentally analyze it as a gene product protein or as its biological activity.
  • the total length of the 5'-end of the cDNA of the library It was determined in the following way. For all clones where the known human mRNA and 5'-end sequence in the public database match, the 5'-end is longer than the known mRNA sequence in the public database, and the 5'-end is shorter but translation starts. Codons were judged to be “full length” if they had one, and "non-full length” if they did not contain the translation initiation codon.
  • the total length of the 5'-end of the cDNA clones in each library [number of full-length clones Z (number of full-length clones + number of non-full-length clones)] was determined by comparing with human known mRNA (NT2RM1: 69%; NT2RP3). PLACE1: 68%; HEMBA1: 53%). From this result, it was found that the full length ratio of the 5'-end sequence was very high.
  • HEMBA1 PSEC0220
  • NT2RM1 PSEC0012
  • NT2RP3 PSEC0242, PSEC0256
  • nucleotide sequence of the full-length cDNA and the deduced amino acid sequence of the clone selected in this manner were determined.
  • the nucleotide sequence was determined by combining the following three methods, completely overlapping the nucleotide sequences determined by each method, and determining the final definitive nucleotide sequence.
  • PSEC0012, PSEC0129, and PSEC0220 were predicted to be secretory proteins or membrane proteins with a signal sequence at the N-terminus, and full-length cDNA clones.
  • PSEC0242 and PSEC02 56 has no signal sequence at the N-terminus, but is a membrane protein, and was predicted to be a full-length cDNA clone, provided that PSEC242 starts translation from the third ATG.
  • a signal sequence could be found at the N-terminus.
  • PSEC0242 No. 3 ATG, ATGpr10.82, SP-Yes, 0RF 171-1343 391 aa, Sign al peptide 24;
  • Presence or absence of signal sequence or signal sequence prediction results using PS0RT, membrane protein prediction results using MEM STAT and S0SUI
  • PSEC0012 // C-NT2R 1000853 // 1499 // 183 // 1 // 0.82 // 125/183 (68.3%) aa i dentity to fugu putative protein 2 (PUT2).
  • PSEC0129 // C-PLACE1004170 // 1828 // 135 // 1 // 0.94 // 1564/1615 (96%) simi larity to human chromosome 16ql3 / 21 BAC clone CIT987SK- A-152E5 PSEC0220 // C-HEMBA1005301 // 1584 // 365 // 1 // 0.94 // 354/365 (96%) aa ide ntity to mouse WNT-6 protein precursor; 1084/1310 (82%) similarity to mouse Wnt-6 mRNA
  • PSEC0242 // C-NT2RP3000266 // 3017 // 401 // 1 // 0.90 // No & transmembrane // 242/242 (100%) simirality to human Newcastle disease virus inducib le protein mRNA, partial 3 'UTR region; 85/341 (24%) aa identity to human myosin heavy chain.
  • COS cells (6 million cells / dish) were seeded, and the expression plasmid (10 // g) obtained in Example 1 was added together with LIPOFECTAMINE (Gibco BRL) (10 xl), and the gene was transferred to C0S7 cells. Introduced. Expression of the gene thus produced
  • the recombinant cells to be cultured were cultured in D-MEM, 10% FCS, Pc. Sra. (+) Medium for 3 days. After the culture, the culture supernatant was collected as a supernatant fraction.
  • the protein that promotes or suppresses amyloid / 3 protein aggregation was screened using the supernatant described in Example 5.
  • the test basically followed the method 4 described in Methods in Enzyraology Volume 309 (1999) p 274-284 i.
  • 3 protein has the same aggregating ability as that of A ⁇ 1-2 from the N-terminal to 28 residues of A, instead of using A40 and A342, which are normally present in vivo. 8 was used for the test.
  • PSEC0012 expression supernatant of clone of sequence 1 2 4%
  • PSEC0220 expression supernatant of clone of sequence 5
  • PSEC0242 expression supernatant of clone of sequence 76%
  • PSEC0256 expression supernatant of clone of sequence 9 4 6 0%
  • the expressed proteins of the clones containing the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1, 3, and 7 in the sequence listing suppressed the aggregation of the amyloid / 3 protein, and expressed the clones containing the polynucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 9 of the sequence listing.
  • the protein promoted aggregation of the amyloid 3 protein.
  • Hippocampus cDNA (No. 0550903) of an Alzheimer's patient (60 years old) and hippocampus cDNA of a normal person (28 years old) (No. 0510069) were purchased and used from BioChain Institute Inc.
  • the expression level was analyzed using PRISM 7700 of PE Applied Biosystems according to the protocol for quantitative PCR using SYBR Green (P / N 4304965).
  • the following four sets of primers were used for PCR.
  • PSEC012-894F GTGGATGCGATCTGTCTCTCC (SEQ ID NO: 15)
  • PSEC012-1049R TGCAGAAAGGAACACATGCTG (SEQ ID NO: 16)
  • PSEC129-190F CTTCCATGCTTCAGCTGTGG (SEQ ID NO: 17)
  • PSEC129-340R GCCCTGGTCTGTATACCTGGG (SEQ ID NO: 18)
  • PSEC242-599F CTACGACCTGAGCCAGTGCA (SEQ ID NO: 19)
  • PSEC242-749R GAGGGCTTGGAGCTGCTGT (SEQ ID NO: 20)
  • PSEC256-1502F GCATTCTACGGGCTGGTCC (SEQ ID NO: 21)
  • PSEC256-1652R GGGTTGCCTGGTCCGTATT (SEQ ID NO: 22)
  • a protein that suppresses or promotes aggregation and deposition of amyloid i3 protein and a polynucleotide encoding the same are provided.
  • the protein of the present invention and a polynucleotide encoding the same are useful as a medicament for treating or preventing Alzheimer's disease and other diseases, and for diagnosing these diseases.
  • the present invention also makes it possible to screen compounds that inhibit or promote amyloid; 3 protein aggregation.
  • the screening of the present invention is expected to develop an effective Alzheimer's therapeutic agent that suppresses amyloid 3 aggregation.

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Description

明細書 アミロイ ド 蛋白凝集調節因子
技術分野
本発明は、 アミロイ ド 蛋白 （以下 Α ともいう） の凝集、 沈着を抑制 または促進するタンパク質、 該タンパク質をコ一ドするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを用いた該タンパク質の製造方法、 並びにそれらの製 造に関わる発現系、 該発現系を用いたァミロイ ド 3蛋白の凝集を抑制また は促進する化合物のスク リーニング方法に関する。 また、 本発明は上記方 法により得られるタンパク質もしくはスク リーニングにより得られる化合 物を用いるアルツハイマー病の治療ならびに予防方法等に関する。 背景技術
アルツハイマー病は、 認知機能の障害を伴う疾患で、 神経細胞の消失と ともに多数の老人斑、神経原線維変化の出現を特徴と している。老人班は、 発症過程の最も早い時期から検出され、 他の神経変性疾患では見られず疾 患特異性は高い。 アミロイ ド iS蛋白は老人班を構成する主要成分であり、 βシート構造をもつァミロイ ド繊維を形成する。 Α βは約 4 0個のァミノ 酸残基からなる分子量約 4 0 0 0のポリぺプチドである。 凝集性が高く、 容易に繊維を形成して不溶化する。 その主要分子種と して 4 0番目のアミ ノ酸残基バリンで終わる Α /3 4 0 と更に 2残基長い A 4 2がある。 A j3 は通常は分解され脳内に蓄積しないが、 老化と共に分解能力が低下して蓄 積がおこり、 これが元で神経機能不全や神経細胞死が起こり、 最終的に痴 呆ゃアルツハイマー病が発症するといわれている。 種々の遺伝子解析や分 子生物学的 ·神経薬理学的研究により このアルツハイマー病の疾患の原因 と して 「アミロイ ド仮説」 が唱えられている。 発明の開示
本発明の目的は、 アミロイ ド 蛋白の凝集、 沈着を抑制または促進する タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドを提供するとともに. さらにはァミロイ ド ;3蛋白の凝集、 沈着を抑制または促進する方法または 物質を見いだすことによ り、 アルツハイマー病の治療の方法を提供するこ とである。
本願発明者らは、 上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、 神 経前駆細胞より、 アミロイ ド /3蛋白の凝集を抑制または促進する分泌また は膜結合型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを見いだし、 本発明 を完成した。
すなわち、 本発明は以下に示す通りである。
〔 1〕 下記 （a ) から （e ) のいずれかに記載のアミロイ ド ]3蛋白の凝集 を抑制または促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号： 1， 3 , 5 , 7 , および 9のいずれかに記載の塩基配 列を含むポリヌクレオチド、
( b ) 配列番号： 2 , 4 , 6， 8， および 1 0のいずれかに記載のアミ ノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
( c ) 配列番号： 2， 4 , 6 , 8 , および 1 0のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 お よび/または付加したアミノ酸からなるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチド、
( d) 配列番号： 1 , 3， 5 , 7 , および 9のいずれかに記載の塩基配 列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイプリ ダイズするポリヌクレオチド、 ( e ) 配列番号： 1 , 3， 5， 7 , および 9のいずれかに記載の塩基配 列において、 少なく とも （ 1 ) 6 0%のホモロジ一、 （2) 7 0%のホ モロジ一、 （ 3) 8 0 %のホモロジ一、 （4) 9 0 %のホモロジ一、 また は （ 5) 9 5 %のホモロジ一を有するポリヌクレオチド、
〔2〕 〔 1〕 のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の部分 ぺプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔3〕 〔 1〕 および 〔2〕 のいずれかに記載のポリヌクレオチドによって コ一ドされるぺプチドまたはタンパク質。
〔4〕 〔 1〕 のポリヌクレオチドと分子進化上、 同一の遺伝子を起源とす るポリヌクレオチドによってコードされる、アミロイ ド ]3蛋白の凝集を 抑制または促進するタンパク質。
〔5〕 〔1〕 および 〔2〕 のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベ クタ一。
〔6〕 〔 1〕 および 〔2〕 のいずれかに記載のポリヌクレオチド、 または
〔5〕 のベクターを保持する形質転換体。
〔7〕 〔6〕の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、 〔3〕 のぺプチドまたはタンパク質の製造方法。
〔8〕 〔 1〕 および 〔2〕 のいずれかに記載のポリヌクレオチド、 または その相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なく とも 1 5塩基の長さを 有するポリヌクレオチド。
〔9〕 〔3〕 のペプチドまたはタンパク質に対する抗体。
〔 1 0〕 〔 3〕 のペプチドまたはタンパク質と 〔9〕 の抗体の免疫学 的な反応を観察する工程を含む、 免疫学的測定方法。
〔 1 1〕 アミロイ ド ]3蛋白の存在下、 〔 1〕 のポリヌクレオチドによ つてコードされるタンパク質または該タンパク質を発現する細胞に候 補化合物を接触させ、アミロイ ド i3蛋白の凝集または沈着を調節する候 補化合物を選択することを特徴とする、 〔 1〕 のポリヌクレオチドによ つてコードされるタンパク質の活性を制御する化合物をスクリーニン グする方法。
〔 1 2〕 次の工程を含む、 〔 1〕 のポリヌクレオチドによってコード されるタンパク質の発現を制御する化合物をスクリ一ユングする方法。
(1) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 およ び配列番号： 9から選択されるいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝 子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子 を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポータ一遺伝子の活性を測定する工程、 および
(3) 対照と比較して、工程 (2)におけるレポーター活性を増加または減少 させる候補物質を選択する工程
〔 1 3〕 〔 1 1〕 および 〔 1 2〕 のいずれかに記載の方法で得ること ができる化合物を含有する医薬。
〔 1 4〕 〔 3〕 および 〔4〕 のいずれかに記載のペプチドまたはタン パク質を含有する医薬。 '
〔 1 5〕 〔 1〕 のポリヌクレオチドのタンパク質コード配列に対する アンチセンスポリヌク レオチドを含有する医薬。
[ 1 6] アルツハイマー病の予防剤または治療剤である、 〔 1 3〕 お よび 〔 1 4〕 のいずれかに記載の医薬。
[ 1 7] 次の工程を含む、 アルツハイマー病の検出方法。
( 1 ) 〔 1〕 のポリヌク レオチドの発現状態を測定する工程、
( 2) ( 1 ) の測定結果を正常な状態における前記ポリヌクレオチドの 発現状態と比較する工程、
( 3) 比較の結果、 前記ポリヌク レオチドの発現状態の変化をアルッハ イマ一病と関連付ける工程 本発明のアミロイ ド ?蛋白の凝集を抑制または促進するタンパク質およ び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 配列番号： 1、 3、 5、 7、 または 9で示される配列の全部またはその一部の配列を有する。
本発明のポリヌクレオチ ドとしては、 本発明のタンパク質をコードしう るものであれば、 その形態に特に制限はなく、 cDNAの他、 ゲノム DNA、 化 学合成 DNA なども含まれる。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる限 り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチ ドが 含まれる。 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 上記の ように、 配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9に記載のポリヌクレオチド配 列もしくはその一部をプローブとしたハイプリダイゼ一ション法ゃこれら ポリヌクレオチド配列の情報に基づき設計したプライマ一を用いた PCR法 等の常法により単離することが可能である。
本発明のタンパク質であるアミロイ ド ?蛋白の凝集を抑制または促進す るタンパク質は、 例えば配列番号 ： 1、 3、 5、 7、 または 9で示される 配列のオープンリ一ディ ングフレームの配列を含む発現ベクターで形質転 換した形質転換体で発現させることにより得ることができる。 これらの発 現タンパク質は、 培養液または細胞画分より常法により精製 ·単離するこ とができる。 精製 · 単離するための方法として、 具体的には、 例えば、 以 下の方法が挙げられる。 まず、 濾過および遠心等の常法により細胞または 上清を集め、 細胞については当該細胞の細胞壁および/または細胞膜を、 例えば超音波および/またはライソザィムで処理して細胞膜画分を得る。 次に、 得られる細胞膜画分を適当な水溶液に溶解する。 そして該上清もし くは該細胞膜画分から、 天然または合成夕ンパク質を精製並びに単離する ために一般に用いられる常法に従って本発明のタンパク質を単離、 精製す る。 単離、 精製方法としては、 透析、 ゲル濾過、 本発明のタンパク質また はその部分ぺプチドに対するモノクローナル抗体を用いたァフィ二ティー カラムクロマトグラフィー、 適当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィ 一、 高速液体クロマトグラフィーなどが例示される。
また、 本発明には、 上記のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコ —ドするポリヌクレオチドが含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 対 象となるタンパク質が、 アミロイ ド 5蛋白の凝集を抑制または促進する活 性を有することを意味する。 アミロイ ド ?蛋白の凝集を抑制または促進す る活性は、 たとえば実施例に示すような方法により確認することができる。 すなわち、 A やその断片は特定の条件下では凝集しやすい性質を持つ ている。 このような条件のもとで、 被検蛋白質を添加することにより、 も しもその蛋白質が A 5の凝集を促進する性質を持っていれば、 A 3の凝集 としてその性質を捉えることができる。 たとえば A ^の N末端側 1— 2 8 位のアミノ酸配列からなる断片は、 A ?の凝集活性を備えた部分べプチド としてこの種の試験に用いられている（Methods in Enzymology Vol .309, 274-284, 1999 )。 A ?の凝集は光学的に検出することができる。 あるいは コンゴ一レツ ド等による染色後に顕微鏡で確認することもできる。
これら本実施例において/?アミロイ ド凝集試験に用いられたタンパク質 と機能的に同等なタンパク質は、 当業者であれば、 例えば、 タンパク質中 のアミノ酸配列に変異を導入する方法 （例えば、 部位特異的変異誘発法 (Current Protocols in Molecular Biology edit . Ausubel et al . ( 1987) Publ ish. Jhon Wily & Sons Section 8. 1-8.5 ) ) を利用して調製すること ができる。 また、 このようなタンパク質は、 自然界におけるアミノ酸の変 異により生じることもある。 本発明には、 このように本実施例において同 定されたタンパク質と同等の機能を有する限り、 そのアミノ酸配列 （配列 番号 ： 2、 4、 6、 8または 1 0、 あるいは配列番号 1、 3、 5、 7また は 9でコードされるタンパク質のアミノ酸配列） において 1もしくは複数 のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入および/もしくは付加などにより異なる夕 ンパク質も含まれる。 本発明において複数のアミノ酸とは、
タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、 その機能が保持さ れる限り制限はない。 変異数は、 典型的には、 全アミノ酸の 10 %以内であ り、 好ましくは全アミノ酸の 5 %以内であり、 さらに好ましくは全アミノ酸 の 1 %以内である。あるいは本発明には複数のアミノ酸として数個のァミノ 酸の変異を置換する場合が含まれる。 数個とは、 たとえば 5、 更には 4ま たは 3、 あるいは 2、 更には 1のアミノ酸を言う。置換されるアミノ酸は、 タンパク質の機能の保持の観点から、 置換前のアミノ酸と似た性質を有す るアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu, I le、 Pro, Met, Phe、 Trpは、 共に非極性アミノ酸に分類されるため、 互いに似た性質を有 すると考えられる。 また、 非荷電性としては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Ginが挙げられる。 また、 酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Gluが 挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。
また、 本実施例において同定されたタンパク質と機能的に同等なタンパ ク質は、 当業者に周知のハイプリダイゼ一ション技術あるいは遺伝子増幅 技術を利用して単離することも可能である。 即ち、 当業者であれば、 ハイ ブ ダイゼ一ション技術 ( Current Protocols in Molecular Biology edit . Ausube l et al . ( 1987) Publish. Jhon Wi ly & Sons Section 6.3- 6.4)を 用いて本実施例において同定されたタンパク質をコ一ドするポリヌクレオ チドの塩基配列 （配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9 ) またはその一部を もとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、 該ポリヌクレオ チドから機能的に同等なタンパク質を得ることは、 通常行いうることであ る。 本発明には、 本実施例において同定されたタンパク質と同等の機能を 有する限り、 これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイプリ ダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質も含まれる。 機能的に同等なタンパク質を単離する生物としては、 例えば、 ヒ ト、 マウ ス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ブ夕、 ゥシ等の脊椎動物が挙げられるが、 これらに 制限されない。 これらの動物からは、 本発明によるアミロイ ド/?蛋白の凝 集を抑制または促進するタンパク質の遺伝子と分子進化上同一の遺伝子を 起源とする遺伝子を単離することができる。 なお本発明において 「分子進 化上同一の遺伝子を起源とする」 とは、 そのポリヌクレオチド塩基配列分 析、 生理学的役割等の解析により、 分子進化上、 ヒ トにおける本発明の遺 伝子と同一の遺伝子を起源として進化してきたと合理的に判断される遺伝 子を言う。 このような遺伝子は、 その塩基配列において、 高度な相同性を 維持している。
機能的に同等な夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離するた めのハイブリダイゼーションのス ト リンジェン 卜な条件は、 通常は洗浄の ための条件として 「lxSS 0. 1% SDS、 37°C」 程度であり、 より厳しい条件 としては 「0.5xSSC、 0. 1% SDS, 42°C」 程度であり、 さらに厳しい条件とし ては 「0. 1xSSC、 O . SDS、 65°C；」 程度であり、 ハイブリダィゼーシヨンの 条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチ ドの単離を期待しうる。 但し、 上記 SSC、 SDSおよび温度の条件の組み合わ せは例示であり、 当業者であれば、 ハイブリダィゼーシヨンのス トリンジ エンシーを決定する上記若しくは他の要素 （例えば、 プローブ濃度、 プロ —ブの長さ、 ハイブリダィゼーシヨン反応時間など） を適宜組み合わせる ことにより、 上記と同様のス ト リンジヱンシーを実現することが可能であ る。
このようなハイプリダイゼーション技術を利用して単離されるタンパク 質は、 配列番号 ： 2、 4、 6、 8または 1 0に記載の本発明のタンパク質 または配列番号 1、 3、 5、 7または 9でコードされるタンパク質と比較 して、 通常、 そのアミノ酸配列または該タンパク質をコードする塩基配列 において高い相同性を有する。 高い相同性とは、 少なく とも 60%以上、 好 ましくは 70 %以上、 さらに好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90 %以 上、 最も好ましくは 95 %以上の配列の同一性を指す。 相同性の特定は、 BLAST2検索アルゴリズム （Altschul , S . F. et al , 1997, Gapped BLAST and PS I - BLAST : a new generation oi protein database search programs , Nucleic Ac ids Res . 25 : 3389-3402) を用いて決定することができる。
また、 遺伝子増幅技術 ( PCR) ( Current protocols in Molecular Biology edit . Ausubel et al . ( 1987) Publ ish. John Wi ley & Sons Section 6. 1-6.4) を用いて、 本実施例において同定されたポリヌクレオチド配列（配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9 ) の一部をもとにプライマーを設計し、 これらポ リヌクレオチド配列またはその一部と相同性の高いポリヌクレオチド断片 を単離して、 これをもとに本実施例において同定されたタンパク質と機能 的に同等なタンパク質を得ることも可能である。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質の部分ペプチド、 および該部分べ プチドのコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の部分べプチドは、 少なく とも 7アミノ酸、 好ましくは 9ァミノ酸以上、 より好ましくは 12ァ ミノ酸以上、 より好ましくは 15アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。 本 発明の部分ペプチドは、 例えば、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成 法、 あるいは本発明の夕ンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することに よって製造する。
また本発明は、 前記ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現べクタ 一を提供するものである。 さらに、 本発明は、 前記ポリヌクレオチド、 あ るいは前記いずれかの発現べクタ一を保持する形質転換体、 並びにその形 質転換体を培養し、 その培養物から本発明の夕ンパク質を単離することか らなる、 アミロイ ド 5蛋白の凝集を抑制または促進するタンパク質、 ある いはその部分べプチドの製造方法に関するものである。 さらに本発明は、 上記の方法で製造されたタンパク質、 あるいはその部分ぺプチドを提供す るものである。
遺伝子組換え手法でポリぺプチ ドを生産する場合、 宿主細胞の種類によ り、 目的ポリぺプチ ドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得ら れることや、 いわゆるポリペプチ ドの分泌生産法において、 宿主細胞中で 発現された前駆体ポリペプチ ドの末端（ N—末端および/または C—末端） ァミノ酸配列がシグナル · ぺプチダ一ゼ等によりプロセヅシングを受け、 種々の末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周 知である。 従って、 そのようなポリペプチドも本発明のタンパク質の範囲 に含まれることは、 当業者ならば容易に理解し得ることである。
下記実施例には、 発現べクタ一として哺乳類動物細胞内で機能するべク 夕一の構築例のみが示されている。 しかしながら、 本発明のタンパク質を コードするポリヌクレオチドが閧示されている結果、 これらに基づいて、 酵母等の真菌類、 並びに原核性細胞宿主に導入したとき、 該宿主に本発明 のタンパク質を発現、 産生させ得る発現ベクターを構築することは、 当業 者にとって容易である。 従って、 本発明は、 本発明のポリヌクレオチド配 列に基づき、 当該技術分野既知の方法で構築される発現べクタ一をも包含 するものである。
本発明のタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを発現させるために 用い得る微生物細胞には、 例えば、 原核性の細菌 [大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（Bacillus subtilis)] および真核性の酵母 [例えばパン酵 母菌（ Saccaromyces cerevisiae)] がある。 また、 哺乳類細胞には培養ヒ ト細胞および培養動物細胞が含まれる。さらには培養植物細胞も用い得る。 微生物の例としてはェシエリキア属に属する細菌 （例えば E .coliHBlOl ATCC 33694、 E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. coli MM294 ATCC 31446, E. coli DHl ATCC 33849等） およびパン酵母 （例えば S. cerevisiae AH22 ATCC 38626等） がある。 哺乳動物細胞の例としてはヒ ト胎児腎臓由来 H E K 2 9 3細胞、 マウス L 9 2 9細胞およびチャイニーズ 'ハムスター · ォ バリ一（ C H O )細胞等がある。
通常、 原核生物である細菌、 特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、 発現べクタ一は少なく ともプロモーター、 開始コ ドン、 本発明のタンパク 質のアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチ ド、 終止コ ドンおよび自己 複製可能ュニッ ト（単位）から構成される。 真核生物、 即ち酵母や哺乳動物 細胞を宿主細胞として用いる場合、 発現べクタ一は、 少なく ともプロモ一 夕一、 開始コ ドン、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチ ドおよび終止コ ドンから構成されるのが好ましい。 さらにェン ハンサ一配列、 本発明のタンパク質の 5，—および 3 '—非コード領域、 ポ リアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
上記の自己複製可能単位は、 形質転換体の選択マーカー （たとえば、 ァ ンピシリン耐性） を含有していることが好ましい。 細菌を宿主とする発現 ベクターの場合、 プロモーターという語句は、 プロモー夕一、 オペレータ
—およびシャイン—ダルガーノ ( SD) 配列（たとえば AAGG等）からなるプロ モ一夕一 . オペレーター領域を意味する。 そのようなプロモーターの例と しては、 慣用のプロモーター ' ォペレ一夕一領域 （たとえば、 ラク トース オペロン、 P L—プロモー夕一、 trp—プロモーター等） が挙げられる。 酵 母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモ一夕一の例としては pho5 プロモーターが挙げられる。 更に、 精製を容易に行うことを目的として、 金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性ァミノ酸を、 本発明の夕 ンパク質におけるいずれかの末端に付加することができる。
塩基性アミノ酸を付加する場合には、 所望のアミノ酸をコードする塩基 配列が連続した塩基配列を 5'側に付加したプライマーを用いて、 PCR を行 えば、 目的とする遺伝子の任意の末端に、 オリゴペプチ ドを付加すること ができる。 塩基性アミノ酸としては、 ヒスチジン、 リジン、 あるいはアル ギニンなどを用いることができる。
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモー夕一の例とし ては、 HTLV-LTRプロモー夕一、 SV40初期および後期プロモ一夕一、 CMVプ ロモ—夕—、 マウス 'メタ口チォネイン I (MMT) -プロモ一夕一等が挙げら れる。 好ましい閧始コ ドンの例としてメチォニンコ ドン （ATG) が挙げられ る。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドは、 たとえば、 MA合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって 得ることができる。あるいは、 ヒ ト cDNAライブラリ一より、配列番号： 1、 3、 5、 7または 9に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやブラ イマ一を用いて取得することができる。 更に、 ゲノム D N Aを常法通り処 理する （たとえば、 制限酵素による消化、 細菌アルカリホスファタ一ゼに よる脱燐酸化、 T4ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、 T4 DNA リガ一 ゼを用いたライゲーシヨン） ことによって、 本発明のタンパク質をコード するゲノム DNA を調製することができる。 更にこのようにして取得したゲ ノム DNA を利用し、 ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を明らか にし、 より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。 本発明 のタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモ一夕一やェンハ ンサ一等の制御領域は、 本発明のタンパク質の発現異常を検出するための 標的領域として有用である。 あるいは、 これらの領域を標的とするデコイ 核酸医薬などにより、 発現制御を実現することができる。
また、 本発明の宿主細胞には、 本発明のタンパク質の機能解析やこの夕 ンパク質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤のスクリーニングのため に用いる目的の細胞も含まれる。 宿主細胞へのベクター導入は、 例えば、 リ ン酸カルシウム沈殿法、 電気パルス穿孔法 （Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al . ( 1987) Publ ish. John Wi ley & Sons . Sect ion 9 . 1- 9. 9 )、 リボフヱクタミン法、 マイクロインジェクショ ン法などの方法で行うことが可能である。 形質転換体からの本発明のタン パク質の調製は、 当業者に公知のタンパク質の分離 ·精製法を利用して行 なうことができる。
本発明はまた、 配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9に記載の塩基配列か らなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレ ォチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、 Α : Τ( Α : ϋ)、 G : C の塩基対からなる 2 本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の 鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なく とも 15個の連続したヌクレオチ ド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なく とも 70% 、 好まし くは少なく とも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上の 塩基配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するためのアルゴリズ ムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチ ドは、 本発明のタンパク質をコードする DNA や RNA を検出、 単離するためのプロ一ブとして、 また、 本発明のポリヌク レオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。 プライマーとして用いる場合には、 通常、 15bp〜； 100bp、 好ましくは 15bp 〜35bpの鎖長を有する。 また、 プローブとして用いる場合には、 本発明の ポリヌクレオチ ドの少なく とも一部若しくは全部の配列を有し、 少なく と も 15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。 プライマーとして用いる 場合、 3'側の領域は相補的である必要があるが、 5'側には制限酵素認識配 列やタグなどを付加することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のタンパク質の異常を検査 ·診断 するために利用することができる。 例えば、 本発明のポリヌクレオチドを プローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダィゼ一シヨンや RT-PCRにより、 発現異常を検査することができる。 本発明において 「発現」 とは、 転写および/または翻訳が含まれる。 本発明のポリヌクレオチドを用 いた発現の解析により、 遺伝子の転写レベルでの発現を検査 ·診断するこ とができる。 また、 後述の本発明のタンパク質に対する抗体を用いれば、 遺伝子の翻訳レベルでの発現を検査 ·診断することができる。 また、 本発 明のポリヌクレオチ ドをプライマ一として用いたポリメラーゼ連鎖反応 ( PCR )によりゲノム DNA-PCRや RT-PCR により本発明のタンパク質をコード するポリヌクレオチドやその発現制御領域を増幅し、 RFLP解析、 SSCP、 シ 一クェンシング等の方法により、 配列の異常を検査 ·診断することができ る。
また、 「配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9に記載の塩基配列からなるポ リヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なく とも 15ヌクレオチドを 含むポリヌクレオチ ド」 には、 本発明のタンパク質の発現を抑制するため のアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。 アンチセンスポリヌクレオ チドは、 アンチセンス効果を引き起こすために、 少なく とも 15bp以上、 好 ましくは 100bp、 さらに好ましくは 500bp以上の鎖長を有し、 通常、 3000bp 以内、 好ましくは 2000bp以内の鎖長を有する。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドには、 本発明のタンパク質の 異常 （機能異常や発現異常） などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も 考えられる。 具体的には、 アルツハイマー病においては、 アミロイ ド 5蛋 白の凝集 ·沈着が引き金となり脳神経細胞死や神経機能不全へ導く と考え られている。 従って、 本発明のアミロイ ド^蛋白の凝集を促進するタンパ ク質の発現を阻害できれば、 アルツハイマー病の治療または発症の予防に 用いることができる。 また、 本発明のアミロイ ド ?蛋白の凝集を抑制する タンパク質の発現を阻害できれば、 アミロイ ド ?蛋白の凝集を促進しアル ッハイマーのモデルを作成することができる。 該アンチセンスポリヌクレ ォチドは、 例えば、 配列番号 ： 1、 3、 5、 7または 9に記載のポリヌク レオチドの配列情報を基にホスホロチォェ一ト法（Stein, 1988 Physicoch emical properties of phosphorothioate o丄 igodeoxynucleotides. Nucle ic Acids Res 16, 3209-21 ( 1988))などにより調製することが可能である c 本発明のポリヌクレオチ ドまたはアンチセンスポリヌクレオチ ドは、 遺 伝子治療に用いる場合には、 例えば、 レ トロウイルスベクター、 アデノウ ィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクタ一などのウィルスベクターや リボソームなどの非ウィルスベクタ一などを利用して、 ex vivo法や in vivo 法などにより患者へ投与を行う。
本発明は、 また、 本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。 本発 明の抗体の形態には特に制限はなく、 ポリクローナル抗体やモノクロ一ナ ル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。 また、 全ての クラスの抗体が含まれる。 さらに、 本発明の抗体には、 ヒ ト化抗体などの 特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、 ポリクロ一ナル抗体の場合には、 本発明の蛋白質また は部分べプチドを合成して家兎に免疫することにより得ることが可能であ り (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12〜11.13)、 一方、 モノクロ一 ナル抗体の場合には、 本発明の蛋白質または部分べプチドを用いてマウス を免疫し、 脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイプリ ドーマ細胞の 中から得ることができる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4〜11.11)。 本発明のタンパク質に結合する抗体は、 本発明のタンパク質の精製に加 え、 例えば、 これらタンパク質の発現異常や構造異常の検査 ，診断に利用 することも考えられる。 具体的には、 例えば組織、 血液、 または細胞など からタンパク質を抽出し、 ウエスタンブロッテイ ング、 免疫沈降、 ELISA 等の方法による本発明のタンパク質の検出を通して、 発現や構造の異常の 有無を検査 ·診断することができる。
本発明のタンパク質に結合する抗体は、 本発明のタンパク質に関連した 疾患の治療などの目的に利用することも考えられる。 抗体を患者の治療目 的で用いる場合には、 ヒ ト抗体またはヒ ト化抗体が免疫原性の少ない点で 好ましい。 ヒ ト抗体は、 免疫系をヒ 卜のものと入れ換えたマウス （例えば、 「 Functional transplant of megaoase human immunoglobul in loc i recapitulates human antibody response in mice , Mendez , M. J . et al . ( 1997 ) Nat . Genet . 15 : 146-156」 参照） に免疫することによ り調製する ことができる。 また、 ヒ ト化抗体は、 モノクローナル抗体の超可変領域を 用いた遺伝子組み換えに よって調製する こ とができる（Methods in Enzymology 203， 99-121 ( 1991 ) )。
本発明のタンパク質のうち、 配列番号 ： 1、 3または 7のポリヌクレオ チドによりコ一ドされるタンパク質は、 実施例において示すようにアミ口 イ ド/?蛋白の凝集抑制活性を持ち、 アルツハイマー病患者においては、 そ の発現量は減少している。 従って、 これらのタンパク質の発現を増強する ことにより、 アミロイ ド ?蛋白の凝集を抑制しアルヅハイマ一病の治療及 び発症の予防に有効である。 さらに、 これらのタンパク質およびその機能 的に同等なタンパク質は、 それ自身でアルツハイマー病の治療及び発症の 予防剤として使用することもできる。
また、 本発明のタンパク質のうち、 配列番号 ： 5または 9のポリヌクレ ォチドによりコードされたタンパク質は実施例において示すようにアミ口 イ ド/?蛋白の凝集促進活性を持ち、 アルツハイマー病患者においては、 そ の発現量は増加している。 従って、 これらのタンパク質の発現を減少させ ることにより、 アミロイ ド 5蛋白の凝集を抑えアルヅハイマー病の治療及 び発症の予防に有効である。
さらに、 本発明の夕ンパク質は、他のアミロイ ドーシス症、具体的には、 精神分裂病およびそれに関連した神経障害、 慢性関節リウマチ、 結核、 ら い病、 気管支拡張症、 全身性エリテマトーデス （ S L E )、 透析アミロイ ド 一シス症、 糖尿性アミロイ ドーシス症、 心房性アミロイ ドーシス症等の疾 患に関係すると期待され、 これらの疾患の治療及び発症の予防剤として、 または治療 ·予防剤のスクリ一ニングにも使用できる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質の活性を調節する化合物のスクリ —ニング方法を提供する。 本発明のタンパク質はアミロイ ド/?蛋白の凝集 を抑制または促進することから、 当該遺伝子の産物の発現を調節する化合 物はアミロイ ド ?蛋白の凝集を調節することにより、 アルヅハイマー病を 治療または予防する薬剤として有用である。 このスクリ一ニング方法は、 以下のとおりである。
アミロイ ド ?蛋白の凝集が生じる条件下で、 本発明のタンパク質または 本発明のタンパク質を発現する細胞に候補化合物を接触させ、 アミロイ ド 3蛋白の凝集を抑制する候補化合物を選択する。
より具体的には、 アミロイ ド/?蛋白 （A 5 4 0、 A 5 4 2、 A 5 2 8等） を含む溶液に、 本発明のタンパク質、 例えば配列番号 ： 1、 3、 5、 7ま たは 9のヌクレオチドがコードしているタンパク質、 または該夕ンパク質 と機能的に同等なタンパク質、 あるいはこれらの夕ンパク質を発現してい る細胞、 並びに候補化合物をインキユーべーシヨンし、 さらにその凝集度 合いを測定するために、 例えば凝集したアミロイ ド ?蛋白に結合する蛍光 色素、 例えば thioflavin- Tを用いその蛍光強度を測定することができる。 本発明のタンパク質のうち、 配列番号 ： 1、 3または 7のポリヌクレオ チドによりコードされたタンパク質の発現を増加させることにより、 アミ ロイ ド ?蛋白の凝集を抑制しアルツハイマー病の治療及び発症の予防に有 効である。 さらに、 配列番号 ： 5または 9のポリヌクレオチドによりコー ドされたタンパク質の発現を減少させることにより、 アミロイ ド 5蛋白の 凝集を抑えアルツハイマー病の治療及び発症の予防に有効である。従って、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現制御を調節する化合物はァ ルツハイマ一病の治療及び発症の予防剤として有用である。 すなわち本発 明は、 次の工程を含む、 本発明のポリヌクレオチドによってコードされる タンパク質の発現を制御する化合物をスクリ一二ングする方法に関する。
( 1 ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、 その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを導入し た細胞と候補物質を接触させる工程、
( 2) 前記レポ一ター遺伝子の活性を測定する工程、 および
( 3 ) 対照と比較して、工程（2)におけるレポ ター活性を増加または減少 させる候補物質を選択する工程
本発明のスクリ一二ングのために、 当該遺伝子の制御領域を染色体 DNAか らクローニングし、 本制御領域遺伝子の下流にレポーター遺伝子 （例えば ルシフヱラ一ゼ、 ガラク トシダ一ゼ、 GFP (Green Fluorescent Protein) など） を結合させた発現プラスミ ドを作製する。 配列番号： 1、 配列番号 ： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 および配列番号： 9からなる群のいず れかに記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域は、染色体 DNAから公 知の方法によってクローニングすることができる。 たとえば S1マッビング 法が転写開始点の特定方法と して公知である （ 「転写調節領域の単離」 お よび 「転写制御因子の同定と精製」 、 「細胞工学 別冊 8 新細胞工学実験プ 口 トコール」 、 東京大学医科学研究所制癌研究部編 秀潤社 1993年、 p362 -374) 。 一般に当該遺伝子の発現制御領域 DNAは、 ヒ ト染色体ライブラリ ― (genomic library) を、 当該遺伝子の 5 '末端の 1 5〜； 1 0 0 bp、 好 ましくは 3 0〜 5 Obpをプローブ DNAに用いてスクリ一ユングすることに より、 発現制御領域を含む遺伝子クローンとしてクローニングされる。 こ のようにして得られたクローンはしばしば 1 0 kbp以上の当該遺伝子の 5' 非翻訳領域を包含している。 そこで、 これらのクローンの 5'末端をェキソ ヌク レアーゼ処理などによって短縮化、 あるいは断片化する。 短縮された 発現制御領域を含む配列でレポーター遺伝子の発現の強さや発現の制御に ついての評価を行うことによって、 発現制御領域の活性維持のための最小 必要単位を得ることができる （deletion study)。 また、 遺伝子の発現制 御領域を Neural Network を用いて予測するプログラムが公知である（ h t D： / / www - f rui t f 1 v . o r a/ s ea tools /promoter . html , Reese, M . G . , et al, "Large Scale Sequencing Spesif ic Neural Network s for Promoter and Splice Site Recognition" Bio computing： Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, edited by Law rence Hunter and Terri E . Klein , World Scientific Publi shing Co, Singapore , January 2-7 , 1996)。 ある！/ヽま Promot er S canのような転写因子結合配列を検索して発現制御領域を予測するプログ ラムを用い活性の最小単位を予測することも行われている（http: //bios ci . cbs . umn . edu/ software /pros can/ Dromoterscan . htm, Pres tr idge, D.S. 1995, Prediction of Pol ェェ Promoter Sequence u sing Transcription Facter Binding Sites . J . Mol . Biol . 24 9: 923— 932)。 また、 予測されたコアのき分を中心に deletion study を実施することもできる。
このようにして単離された本制御領域遺伝子の下流に、 レポ一ター遺伝 子を機能的に結合させた発現プラスミ ドを作製し、 本発現プラスミ ドを適 当な細胞に導入する。 本発明において、 機能的な結合とは、 前記発現制御 領域の活性化によって、 レポ一ター遺伝子の転写が開始されるように両者 を結合することを意味する。 レポーター遺伝子には、 前記発現制御領域の 活性化を遺伝子の発現と して観察することができる蛋白質をコードするも のであれば任意の遺伝子を利用することができる。 具体的には、 例えばル シフェラーゼ、 β ガラク トシダーゼ、 GFP (Green Fluorescent Protein) などの遺伝子がレポーター遺伝子と して一般に用いられる。 べクターを導 入する細胞には、 例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞を用いることが できる。 次に本発現プラスミ ドにて例えば当該遺伝子を欠失させた動物細 胞を形質転換させる。 制御領域の転写活性によるレポ一夕一遺伝子の発現 は発色あるいは発光等として検出される。 このような条件下で本細胞株を 96 ウェルマルチプレートに播種し、 スクリ一ニングの対象となる化合物を 各ゥエルに加えることにより、 当該遺伝子の発現産物の発現を抑制あるい は促進する化合物が容易に選択可能である。 化合物の選択法としては例え ば、 レポーター遺伝子として GFP を用いた場合、 薬物を加えない状態およ び加える場合での GFPの発光量の比較を行うことにより選択が可能である。 比較とは 2倍以上もしくは 1/2以下、 好ましくは 5倍もしくは 1/5以下、 より好ましくは 10倍以上もしくは 1 /10以下の発光量比を示す場合のこと を示唆している。 本方法は動物細胞ばかりでなく同様なシステムでレポ一 夕一遺伝子の発現を引き起こすような宿主であれば、 真核生物 ·原核生物 を問わず用いることが可能である。
スクリーニングに用いる被検試料としては、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝 子ライブラ リーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合 物などが挙げられる。 ここに記載した被検試料は例示であり、 これらの具 体例に制限されない。
このスク リーニングにより単離される化合物は、 本発明のタンパク質の 活性を促進または阻害する化合物 （ァゴ二ス ト、 アン夕ゴニス ト） の候補 となる。 また、 生体内において、 本発明のタンパク質とこれと相互作用す る分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。 これら化合物は、 本発明の夕ンパク質が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応 用が考えられる。 更に本発明は、 本発明のスクリーニングによって得ることができる化合 物の医薬用途に関する。 すなわち本発明は、 前記スクリーニングによって 得ることができる化合物を主成分として含有する、 アルツハイマー病の治 療及び発症の予防またはアミロイ ド i3蛋白の凝集の制御における使用に関 する。 あるいは本発明は、 これらの化合物を主成分として含有することを 特徴とする、 アルツハイマー病の治療剤及び発症の予防剤に関する。 さら に、 本願発明の前記スクリーニング法で得られた化合物は、 他のアミロイ ドーシス症、 具体的には、 精神分裂病およびそれに関連した神経障害、 慢 性関節リウマチ、 結核、 らい病、 気管支拡張症、 S L E、 透析アミロイ ド 一シス症、 糖尿性アミロイ ド一シス症、 心房性アミロイ ド一シス症等の疾 患に関係すると期待され、 これらの疾患の治療及び発症の予防剤として、 または治療 · 予防剤のスクリーニングにも使用できる。
本発明のタンパク質、 ヌクレオチド、 抗体および上記スクリーニングに より単離される化合物は、 アミロイ ド /3蛋白の凝集を調節するために有用 である。 これらを医薬品として用いる場合には、 それ自体を医薬品として 用いることも可能であるが、 公知の製剤学的方法により製剤化して用いる ことも可能である。 例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体 的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤などと適宜組み合 わせて製剤化して用いることが考えられる。 患者への投与は、 例えば、 動 脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者で あれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が ポリヌクレオチドによりコードされうるものであれば、 該ポリヌクレオチ ドを遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当 業者であれば適宜選択することが可能である。 本発明のタンパク質は、 アミロイ ド ?蛋白の凝集の抑制または促進活性 の他に、 生理活性を持つことが予測される。 それらは、 以下の様な方法を 用いて決定することができる。 本発明のタンパク質は、 分泌タンパク質あ るいは膜夕ンパク質であり、 そのアミノ酸配列が明らかとなっていること から、 適当な発現系を適用して組み換え体として発現させることにより、 あるいは、 そのタンパクを特異的に認識する抗体を用いることで、 アミ口 ィ ド ?蛋白の凝集を抑制または促進する活性以外の生物学的活性を持つか どうかも解析することが可能である。
本発明のタンパク質は、 例えば 「The Practical Approach Seriesj ( IRL PRESS 社）の 『Glycobiology』 （M.Fukuda, A.Kobata 編、 1993)、 『Growth Factoers』 (I. McKay, I.Leigh 編、 1993)、 『 Extracellular Matrix』 (M.A.Haralson, J.R.Hassell 編、 1995)、 または、 「Method in Molecular Biology」 (Humana Press 社 )シ リ ーズの 『 Glycoprotein Analysis in Biomedicine』 （Elizabeth F.Hounse 11編、 1993)にもとづいて、 それぞれの タンパク質の生物学的活性の解析が可能である。 あるいは 「日本生化学会 編 新生化学実験講座 7増殖分化因子とその受容体」 （1991年発行） 東京化 学同人社や 「Methods in Enzymologyj Academic Press 社の. Volume 296 Neurotranmitter Transporters, Volume 294 Ion Channels (Part C), Volume 293 Ion Channels (Part B)， Volume 292 ABC Transporters, Volume 288 Chemokine Receptors, Volume 287 Chemokines, Volume 248 Proteolytic Enzymes, Volume 245 Extracellular Matrix Components, Volume 244 Proteolytic Enzymes, Volume 230 Guide to Techniques in Glycobiology, Volume 198 Peptide Growth Factors, Volume 192 Biomembranes, Volume 191 Biomembranes, Volume 149 Drug and Enzyme Targeting等の開示（こ基づレヽ て、 分泌夕ンパク質や膜夕ンパク質に関連する生物学的活性を解析するこ ともできる。 分泌夕ンパク質、 あるいは膜夕ンパク質を用いた機能の解析に基づいて、 例えば以下のようにして医薬品開発を行うことができる。
膜タンパク質の場合、 細胞上に発現して受容体やリガンドと して機能す るタンパク質である可能性が高い。 したがって、 本発明によって提供され る膜タンパク質を、 公知のリガンドゃ受容体との結合活性に基づいてスク リ一二ングすれば、 新たなリガンドー受容体の関係を見出すことができる。 スクリ一ユングは公知の方法に従って行うことができる。
例えば、 以下のようにして本発明のタンパク質の受容体を発現する細胞 をスクリーニングすることができる。 すなわち、 （ a ) 本発明のタンパク質 またはその部分ペプチドに被検細胞試料を接触させる工程、 および （b ) 該タンパク質またはその部分ぺプチドに結合する細胞を選択する工程、 と によって特定のタンパク質に結合する受容体のスク リ一エングが可能であ る。
このスク リーニングは、 例えば、 以下のように行うことが可能である。 まず、 本発明のタンパク質を発現させ組換えタンパク質の精製品を取得す る。 次いで、 その精製タンパク質を標識し、 各種細胞株または初代培養細 胞に対して結合ァッセィを行い、 これにより受容体を発現している細胞を 選定する （本庶 ·新井 · 谷口 ·村松編 新生化学実験講座 7 増殖分化因子 とその受容体 P203 - 236 ( 1991) 東京化学同人）。 標識と しては、 1251などの RI標識のほか、 酵素 （アルカリホスファターゼ等） 標識も可能である。 ま た、 本発明のタンパク質を標識せずに用いて、 本発明のタンパク質に対す る抗体を標識して用いて検出することも考えられる。 上記スクリ一二ング により得られた本発明のタンパク質の受容体を発現する細胞は、 後述する ように該受容体のァゴニス トゃアンタゴニス トのスクリーニングに用いる ことが可能である。
上記のスクリ一ユングにより本発明のタンパク質の受容体やその受容体 を発現する細胞が得られれば、 本発明のタンパク質とその受容体または該 受容体を発現する細胞との結合活性を指標に、 両者の結合を阻害する化合 物 （例えば、 受容体ァゴニス トやアンタゴニス ト） のスク リーニングが可 能となる。
このスク リーニング方法は、 （ a ) 被検試料の存在下で、 本発明のタンパ ク質を該タンパク質の受容体または該受容体を発現する細胞に接触させる 工程、 （ b ) 該タンパク質とその受容体または該受容体を発現する細胞との 結合活性を検出する工程、 および （ c ) 被検試料非存在下において検出し た場合と比較して、 該結合活性を低下させる化合物を選択する工程、 を含 む。
スク リーニングに用いる被検試料と しては、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝 子ライブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合 物などが挙げられるが、 これらに制限されない。 また、 本発明のタンパク 質との結合活性を指標と した上記のスク リ一ユングにより単離された化合 物を被検試料として用いることも可能である。
このスク リーニングにより単離される化合物は、 本発明のタンパク質の 受容体のァゴニス トゃアンタゴニス トの候補となる。 本発明のタンパク質 とその受容体との結合活性の低下によるリン酸化などの細胞内シグナルの 変化をもとに、 得られた化合物が本発明のタンパク質の受容体のァゴニス トであるかアンタゴニス トであるかを判定することができる。 また、 得ら れる化合物は、 生体内において、 本発明のタンパク質と相互作用する分子
(受容体も含む） との該相互作用を阻害する化合物の候補ともなる。 これら 化合物は、 本発明のタンパク質が関連する疾患の予防薬や治療薬への応用 が考えられる。
分泌タンパク質の場合、 細胞の増殖 · 分化などの細胞状態を制御する因 子の可能性がある。 新たな細胞状態を制御する因子を見いだすためには、 ある種の細胞に、 本発明によって提供される分泌タンパク質を加えること によって、 細胞の増殖 · 分化などの細胞状態変化や、 細胞内の特定の遺伝 子の活性化を指標にスクリ一二ングすれば可能である。
このスク リーニングは、 例えば、 以下のように行うことが可能である。 まず、 本発明のタンパク質を発現させ組換えタンパク質の精製品を取得す る。 次いで、 その精製タンパク質を、 各種細胞株または初代培養細胞に添 加して、 増殖 · 分化などの細胞の変化を調べる。 または、 ある特定の細胞 状態変化に作用することが知られている遺伝子の誘導を mRNA量、 タンパク 質量で検出する。 あるいはある特定の細胞状態変化に作用することが知ら れている遺伝子産物 （タンパク質） の働きにより変化した細胞内の物質 （低 分子化合物など） 量で検出する。
このようなスク リ一二ングにより、 本発明によるタンパク質が細胞状態、 機能を制御するとなれば、本発明のタンパク質は、関連した疾患に対して、 そのまま、 あるいは一部適した状態に改変して、 医薬品への応用が考えら れる。
また、 先に膜タンパクについて記述したように、 本発明によって提供さ れる分泌タンパク質を用いて、 公知のリガンドゃ受容体との結合活性に基 づいてスク リ一ユングすれば、 新たなリガンドー受容体の関係を見出すこ とができ、同様の方法でァゴニス ト、アンタゴニス トの判定が可能となる。 こう して得られる化合物は、 生体内において、 本発明のタンパク質と相互 作用する分子（受容体も含む） との該相互作用を阻害する化合物の候補とも なる。 これら化合物は、 本発明のタンパク質が関連する疾患の予防薬や治 療薬への応用が考えられる。
あるいは、 このようなスク リーニングにより影響を受けたタンパク質や 遺伝子が疾患に関連していた場合、 本発明によるタンパク質を利用し、 直 接的に、 または、 間接的に、 その発現や活性調節を行う化合物、 遺伝子の スクリ一ユングが可能となる。
例えば、 まず、 本発明のタンパク質を発現させ組換えタンパク質の精製 品を取得する。 次に影響を受けたタンパク質や遺伝子を精製し、 その結合 に基づいてスク リーニングを行う。 または、 予め阻害剤の候補となる化合 物を加えておいた後、 それら結合の変化を観察することによってスク リー ニングを行う。 このようなスク リーニングによって得られた化合物は、 本 発明によるタンパク質が関連した疾患に対して医薬品への応用が考えられ る。 スク リ一二ングによって得られた制御因子がタンパク質であっても、 同様に、 そのタンパク質の発現 · 活性に本来ない影響を与える化合物があ れば、 その化合物は、 本発明によるタンパク質が関連した疾患に対して医 薬品への応用が考えられる。
本発明による分泌タンパク質、 あるいは膜タンパク質が酵素と しての活 性を有するとなれば、 本発明によって提供されるタンパク質に化合物を適 当な条件下で添加し、 化合物の変化を指標としてその活性を明らかにする ことができる。 また、 この活性を指標に本発明によるタンパク質の活性を 阻害する化合物のスクリ一二ングも可能である。
このスク リーニングは、 例えば、 以下のように行うことが可能である。 まず、 本発明のタンパク質を発現させ組換えタンパク質の精製品を取得す る。 次いで、 その精製タンパク質に、 化合物を添加して、 化合物量および 反応生成物量を調べる。 または、 予め阻害剤の候補となる化合物を加えて おいた後、 精製タンパク質と反応する化合物 （基質） を加えて、 その基質 量および反応生成物量の変化を調べる。
このようなスク リーニングにより、 得られた化合物は、 本発明のタンパ ク質が関連した疾患に対して、 医薬品への応用が考えられる。
本発明の分泌タンパク質、 あるいは膜タンパク質が、 新たな疾患関連タ ンパク質であるかどうかは、 上記に挙げた以外にも、 本発明によるタンパ ク質の特異認識抗体を用いて、 特定の疾患とタンパク質の発現量や活性と の相関を調べるこ とによ り知るこ とができる。 あるレ、は、 「 Method in Molecular BiologyJ (Humana Press社)ンリーズの『Molecular Diagnosis of Genetic Diseases』 （Rob Elles編、 1996) を参考に解析が可能である。 本発明のタンパク質に結合する抗体は、 本発明のタンパク質の精製に加 え、 例えば、 本発明のタンパク質の発現異常や構造異常の検査 ·診断に利 用すること も考えられる。 具体的には、 例えば組織、 血液、 または細胞な どからタンパク質を抽出し、 ウェスタンブロッティング、 免疫沈降、 ELISA 等の方法による本発明のタンパク質の検出を通して、 発現や構造の異常の 有無を検査 ■診断することができる。
更に本発明のポリヌクレオチドは、 アルツハイマー病患者の海馬におい て発現の異常が観察された。 したがって、 本発明のポリヌクレオチドの発 現状態を測定することによって、 アルツハイマー病を検出することができ る。 すなわち本発明は、 以下の工程を含む、 アルツハイマー病の検出方法 に関する。
( 1 ) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 およ び配列番号： 9からなる群から選択された少なく とも 1つの配列番号と し て記載のポリヌクレオチドの発現状態を測定する工程、
( 2) ( 1 ) の測定結果を正常な状態における前記ポリヌクレオチドの発現 状態と比較する工程、
(3) 比較の結果、 前記ポリヌク レオチドの発現状態の変化をァルツハイ マー病と関連付ける工程
本発明において、 前記ポリヌク レオチドの発現状態は、 遺伝子が mRNAに 転写され、 蛋白質に翻訳される工程のいずれかの段階を解析することによ つて明らかにすることができる。 より具体的には、 たとえば前記塩基配列 からなる mRNAを前記ポリヌクレオチドとして測定することにより、転写状 態を知ることができる。 mRNAは、ノーザンハイブリダイゼーションゃ RT - PCR 等の公知の手法によって測定することができる。 あるいは、 前記ポリヌク レオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質やその断片を 測定すれば、 蛋白質への翻訳の状態を知ることができる。 蛋白質はそれを 認識する抗体を用いたゥエスタンブロッ ト法ゃ各種のィムノアッセィによ つて測定することができる。 本発明による検査方法は、 患者の血液試料や 髄液試料を対象と して実施することができる。 あるいは、 剖検によって採 取された海馬組織を対象とすることもできる。 組織標本を試料と して本発 明のポリヌクレオチドの発現状態を観察するには、 インサイチュハイプリ ダイゼーションゃ組織免疫学的な解析手法が利用される。 本発明のポリヌ クレオチドの発現状態を解析し、 たとえば PSEC256 の発現状態が脳に異常 が無い場合の結果と比較して亢進していればァルツハイマー病と関連付け ることができる。 また、 PSEC0012、 PSEC0220、 あるいは PSEC0242等の発現 の抑制が観察されるときには、 アルツハイマー病と関連付けることができ る。
本発明はまた、 これら本発明のポリヌクレオチドの発現状態を明らかに するための試薬に関する。 より具体的には、 本発明は、 本発明のポリヌク レオチドまたはその相補鎖に相補的な少なく とも 1 5塩基の長さを持つポ リヌクレオチドの、 本発明のポリヌクレオチドの検出のための使用に関す る。 あるいは本発明は、 本発明の蛋白質を認識する抗体の、 この蛋白質の 検出のための使用に関する。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例と して更に具体的に説明するが、 本発明は該実施例 に限定されるものではない。
実施例 1 アミロイ ド ]3蛋白の凝集、 沈着を促進または抑制するタンパク 質をコードする cDNAのクローニング
ヒ ト胎児精巣由来のテラ トカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により 神経細胞に分化可能な NT-2 神経前駆細胞（stratagene 社より購入）を用い た。添付マニュアルに従って、次の条件で培養細胞を調製した。
( 1 ) NT- 2細胞をレチノイン酸で誘導しないで培養 （NT2RM1)
( 3 ) NT- 2 細胞を培養後、 レチノイン酸を添加して誘導後、 2 週間培養
(NT2RP3)
これらの培養細胞をそれぞれ集めて、 文献 （ Sambrook, E. F. Fritsch & T. aniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press 1989) 記載の方法により raRNA を抽出した。 さらに、 ォ リ ゴ dTセルロースで poly(A) +RNAを精製した。
同様に、ヒ ト胎盤組織（PLACE1)、 ヒ ト胎児より脳を多く含む組織（HEMBA1) より、 文献 ( J. Sambrook, E. F. rritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989) 己載の方 法により mRNA を抽出した。 さらに、 オリ ゴ dT セルロースで poly(A)+RNA を精製した。
それぞれの poly(A)+RNA よ りオリ ゴキャップ法 [M. Maruyaraa and S. Sugano, Gene, 138： 171-174 (1994)]により cDNAライブラリ一を作成した。 01 igo-cap linker (agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg/酉 cl列番亏 : 1 1 ) お よ びオ リ ゴ dT プラ イ マ ー (gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt ttZ配列番号： 1 2)を用いて文献 [鈴木'菅野， タンパク質 核 酸 酵素， 41: 197-201 (1996)、 Y. Suzuki et al.， Gene, 200： 149-156 (1997)]の記載にしたがって BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase) 処理、 TAP (Tobacco Acid Phosphatase) 処理、 RNAライゲーシヨ ン、 第一鎖 cDNA の合成と RNA の除去を行った。 次いで、 5' (agcatcgagt cggccttgtt gZ配 列番号： 1 3 )と 3' (gcggctgaag acggcctatg tZ配列番号： 1 4 )の PCRプ ライマーを用 ヽ PCR (polymerase chain reaction);こよ り 2本鎖 cDNA ίこ変 換し、 Sfil切断した。次いで、 Dralllで切断したべクター pUC19FL3 (NT2RM1) または pME18SFL3 (GenBank AB009864, Expression vector) (NT2RP3, PLACE L HEMBA1) に cDNAの方向性を決めてクローニングし、 cDNAライブラリ一を作 成した。これらより得たクローンのプラスミ ド DNAにつレヽて、 NT2RM1、PLACE1、 HEMBA1については、揷入 cDNAサイズが 1 kb以下のクローンを、また、 NT2RP3 については、 揷入 cDNAサイズが 2 kb以下のクローンを除いた後、 cDNAの 5'端と 3'端の塩基配列を DNAシーケンシング試薬 （Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React ion Kit, dRhodamme Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit または ' BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製) を用レヽ、 マニュ アルに従ってシーケンシング反応後、 DNAシーケンサー （ABI PRISM 377， PE Biosystems社製） で DNA塩基配列を解析した。
NT2RM1以外のオリゴキヤップ高全長率 cDNAライブラリ一は、真核細胞で の発現が可能な発現べクター PME18SFL3を用いて作製した。 pME18SFL3には クローニング部位の上流に SRaプロモーターと SV40 small tイントロンが 組み込まれており、 またその下流には SV40ポリ A付加シグナル配列部位が 挿入されている。 PME18SFL3のクローン化部位は非対称性の Dralllサイ ト となっており、cDNA断片の末端にはこれと相補的な Sfil部位を付加してい るので、クローン化した cDNA断片は SRaプロモーターの下流に一方向性に 挿入される。 したがって、 全長 cDNAを含むクローンでは、 得られたプラス ミ ドをそのまま COS 細胞に導入することにより、 一過的に遺伝子を発現さ せることが可能である。 すなわち、 非常に容易に、 遺伝子産物であるタン パク質として、 あるいはそれらの生物学的活性と して実験的に解析するこ とが可能となっている。
オリゴキャップ法で作製したライブラリ一の cDNAの 5'-末端の全長率を 次の方法で、 求めた。 公共データベース中のヒ ト既知 mRNA と 5' -末端配列 がー致する全クローンについて、 公共データベース中の既知 mRNA配列より 長く 5' -末端が伸びている場合と 5' -末端は短いが翻訳開始コ ドンは有して いる場合を 「全長」 と判断し、 翻訳開始コ ドンを含んでいない場合を 「非 全長」 と判断した。 各ライブラリーでの cDNAクローンの 5' -末端の全長率 [全長クローン数 Z (全長クローン数 +非全長クローン数） ] をヒ ト既知 mRNA と比較することにより求めた （NT2RM1 ： 69% ； NT2RP3 ： 61% ； PLACE1 ： 68%； HEMBA1 ： 53%)。 この結果より、 5' -端配列の全長率が非常に高いこと が分かった。
cDNAライブラリーとクローンとの関係は次のとおりである。
HEMBA1 ： PSEC0220
NT2RM1 ： PSEC0012
NT2RP3： PSEC0242、 PSEC0256
PLACE1 ： PSEC0129
更にこう して選択したクローンについて、 全長 cDNAの塩基配列、 並びに 推定アミノ酸配列を決定した。 塩基配列は、 次に示す 3種の方法を組み合 わせ、 各方法によって決定した塩基配列を完全にオーバーラップさせ、 最 終的な確定塩基配列を決定した。
( 1 ) Li cor DNAシーケンサーを用いた cDNA挿入断片両末端からの口ング リードシーケンス （Licorシーケンサー （ァロカ社販売） のマニュアルに従 つてシーケンシング反応後、 Li cor シーケンサーで DNA塩基配列を解析し た）、
( 2 ) AT2 トランスポゾン試験管内転移を用いた Primer Is land法によるネ ステツ ドシーケンス [ S. E. Devine and J. D. Boeke, Nuc l e i c Ac i ds Re s. , 22： 3765-3772, ( 1994) ] (PE Biosysteras社製のキッ トとマ二ユアノレに したがってクローンを取得後、 PE Bi osystems社製の DNAシーケンシング試 薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応し、 ABI PRISM 377で DNA塩基 配列を解析した）
( 3 ) カスタム合成 DNA プライマーを用いたダイデォキシターミネータ一 法によるプライマーウォーキング（カスタム合成 DNAプライマーをもちい P E Biosystems社製の DNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシ一ケ ンシング反応し、 ABI PRISM 377で DNA塩基配列を解析した）
得られた酉己歹 (J iこつレヽて、 ATGpr [A. A. Salamov, T. Ni shikawa, M. B. S windel l s, Bioinf orraat ics, 14： 384-390 ( 1998)； http : //www. hri. co. jp /atgpr/]と PSORT による角军析および GenBankや SwissProt に対する BLAST 解析を行った。 これらの配列について、 ATGpr と PS0RTによる解析および G enBankや Swi ssProtに対する BLAST解析を行った。 ほとんどのクローンが N-末端にシグナル配列をもつ分泌蛋白質、 または膜蛋白質であると推定さ れた。 PSEC0242 と PSEC0256は、 PS0RTでシグナル配列が検出されなかった 力 S、 S0SUI により transmembrane hel ixの存在が認められ、膜蛋白質である と推定された。 以上の解析により、 PSEC0012、 PSEC0129, および PSEC0220 は、 分泌蛋白質、 または膜蛋白質で N-末端にシグナル配列が存在し、 全長 cDNAクローンであると予測された。 また PSEC0242 と PSEC0256は、 N-末端 にシグナル配列は存在しないが膜蛋白質であり、全長 cDNAクローンである と予測された。 なお PSEC242は、 3番目の ATGから翻訳がはじまるとすると
「N-末端にシグナル配列を見出すことができた。
PSEC0242 : No. 3 ATG, ATGpr 1 0. 82， SP - Yes， 0RF 171-1343 391 aa, Sign al pept ide 24；
以上の結果を、 次に示す。 クローン名の後ろに〃で区切って次のデータを 記載した。
クローン名〃
cDNAのサイズ〃 推定ァミノ酸配列の構成ァミノ酸数〃
N末端から数えた ATGの数〃
最大 ATGprl値〃
シグナル配列の有無、 あるいは PS0RTによるシグナル配列の予測結果、 MEM STAT と S0SUIによる膜蛋白質の予測結果〃
ァノテーシヨン
PSEC0012//C-NT2R 1000853//1499//183//1//0.82//125/183 (68.3%) aa i dentity to fugu putative protein 2 (PUT2) .
PSEC0129//C-PLACE1004170//1828//135//1//0.94//1564/1615 (96%) simi larity to human chromosome 16ql3/21 BAC clone CIT987SK- A - 152E5 PSEC0220//C-HEMBA1005301//1584//365//1//0.94//354/365 (96%) aa ide ntity to mouse WNT - 6 protein precursor； 1084/1310 (82%) similarity to mouse Wnt-6 mRNA
PSEC0242//C-NT2RP3000266//3017//401//1//0.90//No & transmembrane// 242/242 (100%) simiral ity to human Newcastle disease virus inducib le protein mRNA, partial 3' UTR region; 85/341 (24%) aa identity t o human myosin heavy chain.
PSEC0256//C-NT2RP3003549//3520//612//1//0.89//No & transmembrane// 97/362 (26%) aa identity to rat cadherin-6 precursor; 1174/1394 (8 4%) similarity to mRNA for KIAA0345 実施例 5 アミロイ ド ;3蛋白の凝集を抑制または促進するタンパク質の発 現
COS細胞 （600万 cells / dish) を播種し、 実施例 1で得られた発現プラ スミ ド （10 // g) を LIPOFECTAMINE (Gibco BRL社製） （10 x l) とともに加え、 C0S7細胞に遺伝子を導入した。 この様にして作製された当該遺伝子を発現 する組換え細胞を D- MEM， 10% FCS, Pc. Sra. (+)培地により 3日間培養を行 つた。 培養後培養上清を上清画分として回収した。
実施例 6 アミロイ ド ;3の凝集反応
アミロイ ド /3蛋白の凝集を促進または抑制するタンパク質を、 実施例 5 記載の上清を用いてスク リーニングを行った。 試験は基本的に Methods in Enzyraology Volume 309(1999) p 274— 284 iこ記載の方法 4こ従った。 アミロイ ド |3蛋白は、 生体内で通常存在する A 4 0及び A 3 4 2を用いる代わり に同様の凝集能を有するとされる A の N末端から 2 8残基までの A β 1 - 2 8を用いて試験を行った。 下記の様な実験を行い 1 0 8クローンから 凝集促進作用または抑制作用の強い 5クローンを選択した。 試験方法およ び選択した 5クローンの活性を以下に示した。
(試験方法） 1 mMの合成 Aj3 1- 28 (Bachem社） 3 1 に上記実施例 2に 記載の発現上清 1 7 μ 1 を添加し、 3 0 0 tnM 酢酸ナトリ ゥム緩衝液 （pH 5.2) 1 0 1 を加え反応を開始させた。 24時間後、 反応サンプル 5 1 に 10 uM thiof lavin-T Un 50mM potassium phosphate) 200 μ. 1 をカロえた。 凝集した Α/3を蛍光強度を測定 (excitation 450 nra, emission 482 nm) す ることにより求めた。 対照は発現上清の代わりに合成 A i3 4 0— 1 (Α β 4 0の逆配列べプチド） を 100 μ Μになるように加えた。 結果は、 Α 4 0 一 1の添加による A jS 1 - 2 8の凝集による蛍光強度 1 0 0 %と して、 そ の相対的な蛍光強度を下表に示した。
表 1. A ]3 4 0— 1の添加による A ]3 1 - 2 8の凝集による蛍光強度変化 タンパク質 蛍光強度
PSEC0012(配列 1のクローンの発現上清） 2 4 %
PSEC0129(配列 3のクローンの発現上清） 2 4 %
PSEC0220(配列 5のクローンの発現上清） 2 5 0 %
PSEC0242(配列 7のクローンの発現上清） 1 6 %
PSEC0256(配列 9のクローンの発現上清） 4 6 0 % 配列表の配列番号 1、 3、 7のポリヌクレオチドを含むクローンの発現 したタンパク質は、 アミロイ ド /3蛋白の凝集を抑制し、 配列表の配列番号 5、 9のポリヌクレオチドを含むクローンの発現したタンパク質は、 アミ ロイ ド 3蛋白の凝集を促進した。
さらに、 Congo Redで染色して凝集した合成 A/3の沈着を顕鏡下による目 視で確認した。 実施例 6 アルツハイマー病患者での遺伝子発現解析
正常人とアルツハイマー患者での該遺伝子の発現量を比較した。 それぞ れのクローンについて下記のプライマーを作成して、海馬 cDNAを template にして定量的 P C Rにより行った。 アルツハイマー患者 （60歳） の海馬 c DNA (No. 0550903)と正常人 （28歳） の海馬 c DNA (No. 0510069) は BioChain Institute Inc.より購入して使用した。 発現量を解析は、 PE Applied Biosystems社の PRISM 7700 を使用し、 SYBR Greenを用いた定量 的 P C Rのプロトコール （P/N 4304965) に従って行った。 P CRに用いた プライマ一は、 次の 4セットである。
PSEC012-894F:GTGGATGCGATCTGTCTCTCC (配列番号： 1 5)
PSEC012-1049R:TGCAGAAAGGAACACATGCTG (配列番号： 1 6)
PSEC129-190F： CTTCCATGCTTCAGCTGTGG (配列番号 : 1 7)
PSEC129-340R:GCCCTGGTCTGTATACCTGGG (配列番号： 1 8)
PSEC242-599F： CTACGACCTGAGCCAGTGCA (配列番号： 1 9)
PSEC242-749R:GAGGGCTTGGAGCTGCTGT (配列番号 : 2 0)
PSEC256-1502F： GCATTCTACGGGCTGGTCC (配列番号： 2 1 )
PSEC256-1652R:GGGTTGCCTGGTCCGTATT (配列番号 : 2 2)
アルツハイマー患者での発現量は、 正常人に比べて、 PSEC012では 1/2、 PSEC129では 1/10、 PSEC242では 1/9に減少していた。 逆に、 PSEC256 では、 アルツハイマー患者での発現量は 1.5倍に上昇していた。
産業上の利用の可能性
本発明により、 アミロイ ド i3蛋白の凝集、 沈着を抑制または促進するタ ンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドが提供された。 本発明 のタンパク質およびそれをコ一ドするポリヌクレオチドは、 アルッハイマ 一病を含む疾患の治療や予防のための医薬と して、 またこれら疾患の診断 に有用である。 また、 本発明によりアミロイ ド ;3蛋白の凝集を抑制または 促進する化合物のスク リ一ユングが可能となった。 本発明のスク リーニン グにより、 アミ ロイ ド 3の凝集を抑制する有効なアルツハイマー治療薬が 開発されることが期待される。

Claims

請求の範囲
1.下記 （ a ) から （ e ) のいずれかに記載のァミロイ ド iS蛋白の凝集を抑 制または促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号： 1 , 3， 5 , 7， および 9のいずれかに記載の塩基配 列を含むポリヌクレオチド、
( b ) 配列番号： 2 , 4， 6， 8， および 1 0のいずれかに記載のアミ ノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
( c ) 配列番号： 2 , 4， 6 , 8 , および 1 0のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 お よび Zまたは付加したアミノ酸からなるタンパク質をコ一ドするポリ ヌク レオチド、
( d ) 配列番号： 1 , 3， 5， 7， および 9のいずれかに記載の塩基配 列からなるポリヌクレオチドとス トリンジヱントな条件下でハイプリ ダイズするポリヌクレオチド、
( e ) 配列番号： 1 , 3 , 5 , 7， および 9のいずれかに記載の塩基配 列において、 少なく とも （ 1 ) 6 0 %のホモロジ一、 （2) 7 0 %のホ モロジ一、 （ 3 ) 8 0 %のホモロジ一、 （ 4 ) 9 0 %のホモロジ一、 また は （5 ) 9 5 %のホモロジ一を有するポリヌクレオチド、
2.請求項 1に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質 の部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチド。
3.請求項 1および請求項 2のいずれかに記載のポリヌクレオチドによつ てコードされるぺプチドまたはタンパク質。
4.請求項 1に記載のポリヌクレオチドと分子進化上、同一の遺伝子を起源 とするポリヌク レオチドによってコードされる、アミロイ ド 蛋白の凝 集を抑制または促進するタンパク質。 請求項 1および請求項 2のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む べク々一。 請求項 1および請求項 2のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または 請求項 5に記載のベクターを保持する形質転換体。
請求項 6に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む. 請求項 3に記載のぺプチドまたはタンパク質の製造方法。
請求項 1および請求項 2のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または その相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なく とも 1 5塩基の長さを 有するポリヌク レオチド。
請求項 3に記載のぺプチドまたはタンパク質に対する抗体。
. 請求項 3に記載のペプチドまたはタンパク質と請求項 9に記載の抗 体の免疫学的な反応を観察する工程を含む、 免疫学的測定方法。
. アミロイ ド 3蛋白の存在下、 請求項 1に記載のポリヌクレオチドに よってコードされるタンパク質または該タンパク質を発現する細胞に 候補化合物を接触させ、アミロイ ド 蛋白の凝集または沈着を調節する 候補化合物を選択することを特徴とする、請求項 1に記載のポリヌク レ ォチドによってコードされるタンパク質の活性を制御する化合物をス クリ一二ングする方法。 . 次の工程を含む、 請求項 1に記載のポリヌクレオチドによってコー ドされるタンパク質の発現を制御する化合物をスクリ一二ングする方 法。
(1) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号 ： 5、 配列番号： 7、 およ び配列番号： 9から選択されるいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝 子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子 を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、 および (3) 対照と比較して、工程 (2)におけるレポーター活性を増加または減少 させる候補物質を選択する工程
3. 請求項 1 1および請求項 1 2のいずれかに記載の方法で得ることが できる化合物を含有する医薬。
4. 請求項 3および請求項 4のいずれかに記載のペプチドまたはタンパ ク質を含有する医薬。
5. 請求項 1に記載のポリヌク レオチドのタンパク質コード配列に対す るアンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬。
6. アルツハイマー病の予防剤または治療剤である、 請求項 1 3および 請求項 1 4のいずれかに記載の医薬。
7. 次の工程を含む、 アルツハイマー病の検出方法。
( 1 ) 請求項 1に記載のポリヌク レオチドの発現状態を測定する工程、
(2) ( 1 ) の測定結果を正常な状態における前記ポリヌクレオチドの 発現状態と比較する工程、
( 3) 比較の結果、 前記ポリヌク レオチドの発現状態の変化をアルッハ イマ一病と関連付ける工程
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