WO2001002542A1 - Procede de production d'acide l-amine - Google Patents

Procede de production d'acide l-amine Download PDF

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WO2001002542A1
WO2001002542A1 PCT/JP2000/004342 JP0004342W WO0102542A1 WO 2001002542 A1 WO2001002542 A1 WO 2001002542A1 JP 0004342 W JP0004342 W JP 0004342W WO 0102542 A1 WO0102542 A1 WO 0102542A1
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WO
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lysine
phosphate isomerase
glucose
producing
acid
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PCT/JP2000/004342
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French (fr)
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Masakazu Sugimoto
Hisao Ito
Osamu Kurahashi
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an L-amino acid by a fermentation method, and more particularly to a method for producing L-lysine and L-glutamic acid.
  • L-Lysine is widely used as a feed additive
  • L-glutamine is widely used as a seasoning material.
  • L-amino acids such as L-lysine and L-glutamic acid have been produced using a coryneform bacterium belonging to the genus Brevipacterium and Corynepacterium which has the ability to produce these L-amino acids. It is produced industrially by fermentation. For these coryneform bacteria, strains isolated from the natural world or artificial mutants of the strains are used in order to improve productivity.
  • diaminobi Improvement of L-lysine production ability by successively amplifying or introducing the methacrylate dehydrogenase gene (ddh) (or tetrahydroxypicolinate succinylase gene (dapD) and succinyldiaminopimephosphate deacylase gene (dapE)) Is known (W0 95/16042).
  • ddh methacrylate dehydrogenase gene
  • dapD tetrahydroxypicolinate succinylase gene
  • dapE succinyldiaminopimephosphate deacylase gene
  • JP-A-63-214189 discloses that L-glutamic acid dehydrogenase gene, isocitrate dehydrogenase gene, aconitate hydratase gene, and citrate synthase gene are amplified or introduced. —Techniques for increasing the ability to produce glutamic acid have been disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an L-amino acid such as L-lysine or L-glucaminic acid by a fermentation method which has been further improved, and a strain used therefor.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, introduced a gene encoding glucose 6-phosphate isomerase into a coryneform bacterium to enhance the activity of glucose 6-phosphate isomerase. As a result, they have found that the production of L-lysine or L-glutamic acid can be increased, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a coryneform bacterium having enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity in a cell and L-amino acid producing ability (1) A coryneform bacterium having enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity in a cell and L-amino acid producing ability.
  • the coryneform bacterium according to any one of (1) to (4) is cultured in a medium, L-amino acids are produced and accumulated in the culture, and L-amino acids are collected from the culture. Method for producing L-amino acid.
  • the coryneform bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having an ability to produce L-amino acid and having enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity in cells.
  • the L-amino acid include L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-isoleucine, L-serine and the like. Among these, L-lysine and L-glutamic acid are preferred.
  • embodiments of the present invention will be described mainly with respect to a coryneform bacterium having an L-lysine-producing ability or an L-glutamic acid-producing ability. The same applies to those located downstream of pyruvate carboxylase.
  • the coryneform bacterium referred to in the present invention is a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p. 599 (1974). Aerobic, gram-positive, non-acid-fast, non-spore-forming bacillus that was previously classified into the genus Brevipacterium but is now integrated into the genus Corynebacterium. Inc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 55 (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevipacterium and Microbatterium which are very closely related to the genus Corynebacterium. Examples of the strain of coryneform bacterium suitably used for the production of L-lysine or L-glutamic acid include, for example, those shown below.
  • Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) These can be obtained, for example, from the American Culture, Evening Eve, Culture Collection. That is, a registration number corresponding to each microorganism is assigned, and the microorganism can be ordered by referring to this registration number. The registration number corresponding to each microorganism is found in the American Type Culture Collection collection. In addition, AJ12340 shares are Deposited at the Technical Research Institute under the Budapest Treaty.
  • mutants having L-lysine-producing ability or L-glutamic acid-producing ability derived from these strains can also be used in the present invention.
  • Such human mutants include the following. S— (2-aminoethyl) one cysteine
  • AEC Resistant mutant strains
  • Brevipacterium. Lactofermentum AJ11082 NRL B-11470
  • JP-B-56-1914 JP-B-56-1915
  • JP-B-57- No. 157 No. 57-14158
  • No. 57-30474 No. 58-10075
  • No. 59-4993 No. 61-35840
  • No. 62-24074 No. 62-36673 Nos. 5-11958, 7-1112437 and 7-112438
  • L-lysine-producing mutants JP-A-55-9784 and JP-A-56-8692
  • L-lysine-producing mutants that are sensitive to fluoropyruvate or a temperature of 34 ° C or higher JP-A-55-9784) -9783, JP-A-53-86090
  • resistant to ethylene glycol resistant to ethylene glycol and produces L-lysine Production mutants of the genus Brevipacterium or Corynepacterium (US Patent No. 4411997).
  • Examples of coryneform bacteria having L-threonine-producing ability include Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (see US Pat. No. 5,188,949) and L-isoleucine-producing ability.
  • Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (see US Pat. No. 5,188,949) and L-isoleucine-producing ability.
  • As a coryneform bacterium having the above, Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP-759) (see US Pat. No. 4,656,135) and the like can be mentioned.
  • “the ability to produce L-amino acid such as L-lysine” means that when a coryneform bacterium is cultured in a medium, a significant amount of L-amino acid such as L-lysine is accumulated in the medium.
  • a gene fragment encoding glucose 6-phosphate isomerase is ligated to a vector that functions in the bacterium, preferably a multicopy type vector.
  • Recombinant DNA may be prepared and introduced into a coryneform bacterium capable of producing L-lysine or L-glucamic acid for transformation.
  • An increase in the copy number of the gene encoding glucose 6-phosphate isomerase in the cells of the transformed strain results in enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity.
  • Glucose 6-phosphate isomerase is encoded by the pgi gene in Escherichia coli.
  • glucose 6-phosphate isomerase gene a gene of a coryneform bacterium or a gene derived from another organism such as a bacterium belonging to the genus Escherichia can be used.
  • the nucleotide sequence of the pgi gene of Escherichia coli has already been elucidated (Froman, BE et al., Mol. Gen. Genet. 217, 126-131 (1989), Genbank / EMBL / DDBJ accetion No. X15196). Therefore, using a primer prepared based on the nucleotide sequence, for example, a primer shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the Sequence Listing, a PCR method (PCR: polymerase chain reaction; , TJ et al; Trends Genet. 5, 185 (1989)) to obtain the pgi gene. Genes encoding glucose 6-phosphate isomerase of other microorganisms such as coryneform bacteria can be obtained in a similar manner.
  • Chromosomal DNA is obtained from bacteria that are DNA donors, for example, by the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963), Bioengineering Experiments, Japan Biotechnology Society, 97 Pp. 98, Baifukan, 19992).
  • a vector capable of autonomous replication in the cells of Escherichia coli and / or coryneform bacteria a recombinant DNA is prepared and introduced into Escherichia coli cells. Subsequent operations become difficult.
  • a vector capable of autonomously replicating in Escherichia coli cells a brassmid vector is preferable, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable.
  • pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010 and the like are preferable. No.
  • Examples of vectors capable of autonomous replication in coryneform bacterium cells include PAM330 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699), pHM1519 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895), and the like.
  • PAM330 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-67699
  • pHM1519 see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77895
  • autologous expression is possible in both Escherichia coli and coryneform bacteria. It can be used as any shuttle vector that is not replicable. The following are examples of such shuttle vectors.
  • Microorganisms carrying the respective vectors and the accession numbers of the international depository organizations are shown in parentheses.
  • PAJ611 Escherichia 'Kori AJ11884 (FERM BP-138)
  • PAJ3148 Lineah's, terrier ',, rutamiku SR8203 (ATCC39137)
  • PAJ440 C Chills, Chillis, AJ11901 (FERM BP-140)
  • cells of DNA-receiving bacteria such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, can be transformed into protoplasts or thueroblasts that readily incorporate the recombinant DNA and the recombinant DNA can be obtained.
  • Methods for introduction into DNA recipients (Chang, S. and Choen, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M ⁇ , Ward, JMand Hopwood, 0. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, JBand Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)).
  • the transformation method used in the examples of the present invention is the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • Enhancement of the activity encoding glucose 6-phosphate isomerase can also be achieved by causing multiple copies of the gene encoding glucose 6-phosphate isomerase to be present on the chromosome DNA of the host.
  • a sequence that exists in multiple copies on the chromosomal DNA is used as a target. Performed by homologous recombination.
  • repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used.
  • a gene encoding glucose 6-phosphate isomerase is mounted on a transposon, transferred, and multiple copies are introduced into chromosomal DNA. It is also possible. Either method increases the copy number of the gene encoding glucose 6-phosphate isomerase in the transformed strain, resulting in enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity.
  • Enhancement of glucose 6-phosphate isomerase activity can be achieved not only by the above-described gene amplification, but also by using an expression regulatory sequence such as a promoter of a gene encoding glucose 6-phosphate isomerase on chromosomal DNA or plasmid. Replace with a powerful one This is also achieved.
  • a promoter of a gene encoding glucose 6-phosphate isomerase on chromosomal DNA or plasmid.
  • the lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter of lambda phage, PL promoter, etc. are known as strong promoters. These substitutions throughout the promoter enhance glucose 6-phosphate isomerase activity by enhancing expression of the gene encoding glucose 6-phosphate isomerase.
  • the coryneform bacterium of the present invention enhances its enzymatic activity by enhancing other amino acid biosynthetic pathways or enzymatic genes such as glycolysis in addition to glucose 6-phosphate isomerase activity. May be augmented.
  • genes that can be used for the production of L-lysine include aspartokinase subunit protein and / or subunit which have substantially eliminated synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine.
  • Protein-encoding gene W094 / 25605 international publication pamphlet
  • coryneform bacteria-derived wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene Japanese Patent Laid-Open No. 60-87788
  • coryneform bacteria-derived wild-type dihydrodipicolinic acid synthesis Genes encoding enzymes (Japanese Patent Publication No. 6-55149) are known.
  • genes that can be used for the production of L-glutamic acid include glycolytic phosphofructokinase (PFK, JP-A-63-102692), and phosphoenolpyruvate in the anaplerotic pathway.
  • Carboxylase PEPC, JP-A-60-87788, JP-A-62-55089
  • citrate synthase of the TCA cycle CS, JP-A-62-215585, JP-A-63 — 1 16886
  • aconitic acid hydra-type enzyme ACO, JP-A-62-294086
  • ICDH isocitrate dehydrogenase
  • JP-A-62-166890 JP-A-63-94086
  • GDH glutamate dehydrogenase which catalyzes an amination reaction
  • an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than the amino acid by branching off from the L-amino acid biosynthetic pathway may be reduced or defective.
  • homoserine dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than L-lysine by branching off from the biosynthetic pathway of L-lysine (see WO95 / 23864).
  • Enzymes that catalyze the reaction that branches off from the L-glutamic acid biosynthetic pathway to generate compounds other than L-glutamic acid include ketoglutarate dehydrogenase (hiKGDH), isoquenate lyase, and phosphorus.
  • Acetyl transferase acetate kinase, acetate hydroxy acid synthase, acetate lactate synthase, acetyl formate transferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrroline Dehydrogenase, and the like.
  • the biotin action inhibitor can be added to a medium containing an excess amount of biotin.
  • L-glutamic acid can be produced in the absence of E. coli (see W096 / 06180).
  • An example of such a coryneform bacterium is Brevipacterium 'lactofermentum AJ13029 described in W096 / 06180.
  • AJ13029 strain was deposited on September 2, 1994, with the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal code 305-8566, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the accession number FERM P-14501. It was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 1, 1995, and given accession number FERM BP-5189.
  • a coryneform bacterium capable of producing L-lysine and L-glutamic acid is subjected to a temperature-sensitive mutation against a biotin-inhibiting substance, so that the biotin-inhibiting substance can be expressed in a medium containing an excessive amount of biotin.
  • L-Lysine and L-glutamic acid can be produced simultaneously in the absence (see W096 / 06180).
  • Examples of such a strain include Brevipacterium lactofu amentum AJ12993 strain described in W096 / 06180.
  • the same stock was registered with the National Institute of Bioscience and Human Technology (Postal Code 305-8566, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under the accession number FERM P-14348. And transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on August 1, 1995, and given accession number FERM BP-5188.
  • the phrase “enhanced activity” of an enzyme generally means that the enzyme activity in a cell is higher than that of a wild-type strain, and is modified by a gene recombination technique or the like. When a strain with enhanced enzyme activity is obtained, it means that the enzyme activity in the cell is higher than that of the strain before modification. Also, “reduced activity” of an enzyme usually means that the enzyme activity in a cell is lower than that of a wild-type strain. However, when a strain whose enzyme activity is reduced by modification by genetic recombination technology or the like is obtained, it means that the enzyme activity in the cell is lower than that of the strain before modification.
  • L-amino acid When a coryneform bacterium having enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity and capable of producing L-amino acid is cultured in a suitable medium, the L-amino acid accumulates in the medium.
  • L-lysine accumulates in the culture medium if the cholesterol-type bacterium having enhanced glucose 6-phosphate isomerase activity and capable of producing monolysine acid is cultured in a suitable medium.
  • L-glucamic acid accumulates in the medium.
  • L-lysine and L-glucamate can be added to the culture medium. To accumulate.
  • the L-lysine-producing bacterium may be cultured under L-glucamic acid production conditions, or the L-lysine-producing ability may be reduced.
  • a coryneform bacterium having an ability to produce L-glutamic acid may be mixed and cultured (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-37993).
  • the medium used to produce L-amino acids using the microorganism of the present invention is a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic micronutrients as required.
  • Carbon sources include glucose, lactose, galactose, fructose, sucrose, molasses, carbohydrates such as starch hydrolysates, alcohols such as ethanolinositol, acetic acid, fumaric acid, and citric acid.
  • organic acids such as succinic acid.
  • Nitrogen sources include ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate and other inorganic ammonium salts, ammonia, peptone, meat extract, yeast extract, yeast extract, corn steep liquor, soy hydrolyzate, etc.
  • Organic nitrogen, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. can be used.
  • Potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manga A small amount of ion or the like is added.
  • organic trace nutrients it is desirable to include a required substance such as vitamin B1 or a yeast extract in an appropriate amount as necessary.
  • the culture is preferably carried out for 16 to 72 hours under aerobic conditions such as shaking culture and aeration / agitation culture.
  • the culture temperature is controlled to 30 to 45, and the pH is controlled to 5 to 9 during the culture.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used.
  • L-amino acid can be collected from the fermentation liquor in the same manner as in the usual L-amino acid production method.
  • L-lysine can be usually carried out by combining an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • the method for collecting L-glutamic acid may be a conventional method, for example, an ion exchange resin method, a crystallization method, or the like.
  • L-glutamic acid may be adsorbed and separated by an anion exchange resin, or may be neutralized and crystallized.
  • the nucleotide sequence of the pgi gene of Escherichia coli has already been elucidated (Froman, BE et al., Mol. Gen. Genet. 217, 126-131 (1989), Genbank / EMBL / DDBJ accetion No. X15196). ). Based on the reported nucleotide sequence, the primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the Sequence Listing were synthesized, and the pyruvate dehydrogenase gene was amplified by PCR using the chromosomal DNA of Escherichia coli JM109 strain as type III. .
  • SEQ ID NO: 1 is the first to the 24th of the base sequence of the pgi gene described in Froman, BE et al., Mol. Gen. Gen et. 217, 126-131 (1989).
  • SEQ ID NO: 2 corresponds to a sequence extending from the 2573th to the 2550th base.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, ligated with plasmid pHC4 cut with Smal (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-7491) and a ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Transformation was performed using a competent cell of E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and an L medium containing 5 ⁇ g / ml of chloramphenicol (10 g / L of paktotripton, 5 g / L of bacteriost extract, NaCl 5 g / L, agar 15 g / L, pH 7.2), and after overnight culture, appeared white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformed strains. A plasmid was extracted from the obtained transformant to obtain a plasmid pHC4pgi in which the pgi gene was linked to a vector.
  • Escherichia coli holding pHC4 was named Private Nampa AJ12617, and on April 24, 1999, the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566) Deposited in Ibaraki Prefecture, Tsukuba (1-3, Higashi 1-chome) under accession number FE RM P-122 15 and transferred to an international deposit based on the Budapest Convention on August 26, 1999, accession number. FERM BP—3532 is granted.
  • the glucose in the JM109 strain and the JM109 strain carrying pHC4pgi were 6-Phosphate isomers were determined by the method described in Muramatsu, N. and Nosoh, Y., Arch. Biochem. Biophys. 144, 245-252 (1971).
  • the JM109 strain carrying pHC4 pgi exhibited glucose 15-phosphate isomerase activity about 15 times that of the JM109 strain not carrying pHC4 pgi, indicating that the pgi gene was expressed. It was confirmed.
  • Brevibacterium lactofermentum AJ13029 was transformed with plasmid pHC4pgi by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791), and the resulting corrected paper (Rule 91) A transformed strain was obtained.
  • culture for producing L-glucamic acid was performed as follows.
  • AJ13029 / pHC4pgi strain obtained by culturing in a CM2B plate medium containing 5 zg / ml chloramphenicol was transformed into L-glucamine containing the following composition containing 5 g / ml chloramphenicol.
  • An acid production medium was inoculated, cultured at 31.5 ° C with shaking, and shake-cultured until the sugar in the medium was consumed.
  • the obtained culture was inoculated into a medium having the same composition in an amount of 5%, and cultured at 37 ° C with shaking until the sugar in the medium was consumed.
  • a strain obtained by transforming a plasmid pHC4 which can be autonomously replicated by a corynebacterium bacterium already obtained, into the corynebacterium bacterium AJ13029 by the electric pulse method, and culturing in the same manner as described above did.
  • the AJ11082 / pHC4pgi strain obtained by culturing in a CM2B plate medium containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol was transformed into L-lysine with the following composition containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the medium was inoculated and shake-cultured at 31.5 ° C until the sugar in the medium was consumed.
  • a strain obtained by transforming the previously obtained Brasmid pHC4 capable of autonomously replicating with Corynebacterium bacterium AJ11082 strain by the electric pulse method was cultured in the same manner as described above.
  • Lactofamentum AJ11082 was established on January 31, 1981 at the Agricultural Research Culture Collection, America, Illinois, United States. 5 (1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA) and deposited under accession number NRRL B-11470.
  • Protein hydrolyzate (bean concentrate) 30 ml 50 g calcium carbonate
  • Brevipacterium 'Lactofermeenum AJ12993 was transformed with the plasmid pHC4pgi by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791) to obtain the obtained transformant.
  • culture for producing L-lysine and L-glucamic acid was performed as follows.
  • the cells of the AJ12993 / pHC4pgi strain obtained by culturing in a CM2B plate medium containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol were produced using the L-lysine production method containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • the medium was inoculated and cultured at 31.5 ° C.
  • the culture temperature was shifted to 34, and the culture was performed with shaking until the sugar in the medium was consumed.
  • a strain obtained by transforming a plasmid PHC4 capable of autonomously replicating with a previously obtained corynebacterium bacterium into the corynebacterium bacterium AJ12993 by an electric pulse method was cultured in the same manner as described above.
  • L-amino acid such as L-lysine or L-glucamic acid

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Description

明細 :
L一アミノ酸の製造法 技術分野 本発明は、 発酵法による L一アミノ酸の製造法、 特に L—リジン及び Lーグル 夕ミン酸の製造法に関する。 L—リジンは飼料添加物等として、 L—グルタミン ¾は調味料原料等として広く用いられている。
Ft景技術 従来、 L—リジン及び L一グルタミン酸等の L—アミノ酸は、 これらの Lーァ ミノ酸生産能を有するブレビパクテリゥム属ゃコリネパクテリゥム属に属するコ リネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。 これらのコリネ型細菌は、 生産性を向上させるために、 自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株 が用いられている。
また、 組換え D N A技術により L一アミノ酸の生合成酵素活性を増強すること ：ニよって、 L一アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。 例 えば、 L一リジン生産能を有するコリネ型細菌において、 L—リジン及び Lース レオニンによるフィードバック阻害が解除されたァスパルトキナーゼをコ一ドす る遺伝子 （変異型 lysC ) 、 ジヒ ドロジピコリン酸レダクタ一ゼ遺伝子 （dapB) 、 ジヒ ドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子 （dapA) 、 ジアミノピメ リン酸デカルボ キシラーゼ遺伝子 （lysA) 、 及びジァミノピメ リン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子 ( ddh) (W096/40934) 、 iysA及び ddh (特開平 9— 322774号） 、 lysCヽ lysA及びホ スホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 （ppC) (特開平 10- 165180号） 、 変異型 lysC、 dapB、 dapA、 lysA及びァスパラギン酸アミノ トランスフェラーゼ遺 伝子 （aspC ) (特開平 10-215883号） を導入することにより、 同細菌の L—リジン 生産能が向上することが知られている。
また、 ェシエリヒア属細菌においては、 dapA、 変異型 lysC、 dapB、 ジアミノ ビ メ リン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子 （ddh) (又はテトラヒ ドロジピコリン酸スクシ 二ラーゼ遺伝子 （dapD ) 及びスクシ二ルジアミノピメ リン酸デアシラーゼ遺伝子 ( dapE ) ) を順次増幅又は導入すると L—リジン生産能が向上することが知られ ている （W0 95/16042 ) 。 尚、 W0 95八 6042ではテトラヒ ドロジピコリン酸スクシ ニラ一ゼがスクシニルジアミノビメ リ ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。 一方、 コリネパクテリゥム属またはブレビパクテリゥム属細菌において、 ェシ エリヒア · コリ又はコリネバクテリゥム · グル夕ミクム由来のクェン酸シン夕一 ゼをコ一ドする遺伝子の導入が、 L—グル夕ミン酸生産能の増強に効果的であつ たことが報告されている （特公平 7- 121228号） 。 また、 特開昭 61 -268185号公報に は、 コリネパクテリゥム属細菌由来のグル夕 ミン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子を含 む組換え体 D N Aを保有した細胞が開示されている。 さらに、 特開昭 63-214189号 公報には、 グルタ ミン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子、 イソクェン酸デヒ ドロゲナー ゼ遺伝子、 アコニッ ト酸ヒ ドラターゼ遺伝子、 及びクェン酸シンターゼ遺伝子を 増幅又は導入することによって、 L—グルタミン酸の生産能を増加させる技術が 開示されている。
しかし、 グルコース 6 _リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の構造はコ リネ型細菌では報告されておらず、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコ一 ドする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用することも知られていない。 発明の開示 本発明は、 従来よりもさらに改良された発酵法による Lーリジン又は L—グル 夕 ミン酸等の L一アミノ酸の製造法、 及びそれに用いる菌株を提供することを課 題とする。
本発明者等は、 上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 グルコース 6—リン酸ィソメラーゼをコードする遺伝子をコリネ型細菌に導入し、 グルコ ース 6—リン酸イソメラーゼ活性を増強することにより、 L—リジン又は L— グルタ ミン酸の生産量を增大させることができることを見出し、 本発明を完成す るに至った。 すなわち本発明は、 以下のとおりである。
( 1) 細胞中のグルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強され、 かつ L一 アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
(2) 前記 L—アミノ酸が、 L—リジン及び L一グルタミン酸から選ばれる ( 1 ) のコリネ型細菌。
(3) 前記グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞内 のグルコース 6—リン酸ィソメラ一ゼをコ一ドする遺伝子のコピー数を高める ことによるものである前記 （ 1 ) のコリネ型細菌。
(4) 前記グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子がェシエリ ヒア属細菌由来である （3) のコリネ型細菌。
(5) 前記 （ 1 ) 〜 （4) のいずれかのコリネ型細菌を培地に培養し、 該培養物 中に L—アミノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物から L—アミノ酸を採取すること を特徴とする L一アミノ酸の製造法。
( 6 ) 前記 L—アミノ酸が、 L—リジン及び L—グルタミン酸から選ばれる (5) の方法。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、 L一アミノ酸生産能を有し、 細胞中のグルコース 6—リン酸ィソメラーゼ活性が増強されたコリネ型細菌である。 L一アミノ酸と しては、 L—リジン、 L一グルタ ミン酸、 Lースレオニン、 L一イソロイシン、 Lーセリン等が挙げられる。 これらの中では、 L一リジン及び L一グルタミン酸 が好ましい。 以下、 本発明の実施の形態を、 主として L—リジン生産能又は L一 グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説明するが、 本発明は、 目的 とする L—アミノ酸固有の生合成系がホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼよりも下流に位置するものについては同様に適用され得る。 本発明でいうコリネ型細菌は、 バージ一ズ · マニュアル · ォブ . デ夕一ミネィ ティフ クテリオロジ一 (Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology) 第 8版 599頁 （1974) に定義されている一群の微生物であり、 好気性、 グラム陽性、 非抗酸性で、 胞子形成能を有しない桿菌であり、 従来ブレビパクテリゥム属に分 類されていたが現在コリネバクテリゥム属細菌として統合された細菌を含み （In t . J. Syst . Bacteriol . , 41， 55 ( 1981 ) ) 、 またコリネバクテリウム属と非常 に近縁なブレビパクテリゥム属細菌及びミクロバテリゥム属細菌を含む。 Lーリ ジン又は L一グル夕ミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株として は、 例えば以下に示すものが挙げられる。
コリネバクテリゥム · ァセ トァシドフィルム ATCC13870
コリネパクテリゥム · ァセ トグル夕ミクム ATCC15806
コリネパクテリゥム ， カルナェ ATCC15991
コリネバクテリウム · グルタミクム ATCC13032
(ブレビバクテリゥム · ディバリカタム） ATCC14020
(ブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム） ATCC13869
(コリネバクテリゥム · リ リウム） ATCC15990
(ブレビバクテリゥム · フラバム） ATCC14067
コリネバクテリゥム メフセ 3—フ ATCC17965
ブレビパクテリゥム サヅカロリティクム ATCC14066
ブレビパクテリゥム インマリオフィルム ATCC14068
ブレビパクテリゥム ロゼゥム ATCC13825
ブレビパクテリゥム チォゲ二夕リス ATCC19240
ミクロバクテリゥム アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリゥム サーモアミノゲネス AJ12340( FERM BP-1539 ) これらを入手するには、 例えばァメ リカン · 夕イブ · カルチャー · コレクショ ンより分譲を受けることができる。 すなわち、 各微生物ごとに対応する登録番号 が付与されており、 この登録番号を引用して分譲を受けることができる。 各微生 物に対応する登録番号はァメ リカン · タイプ · カルチャー . コレクションのカ夕 ログに記載されている。 また、 AJ12340株は、 通商産業省工業技術院生命工学工業 技術研究所にブダぺスト条約に基づいて寄託されている。
また、 上記菌株以外にも、 これらの菌株から誘導された L—リジン生産能又は L一グルタミン酸生産能を有する変異株等も、 本発明に利用できる。 この様な人 ェ変異株としては次の様なものがある。 S— （ 2—アミノエチル） 一システィン
(以下、 「AEC」 と略記する） 耐性変異株 （例えば、 ブレビパクテリゥム . ラクト フアーメンタム AJ11082 ( NRRL B-11470 ) 、 特公昭 56- 1914号、 特公昭 56-1915号、 特公昭 57- 157号、 特公昭 57- 14158号、 特公昭 57- 30474号、 特公昭 58- 10075号、 特公昭 59- 4993号、 特公昭 61-35840号、 特公昭 62- 24074号、 特公昭 62- 36673号、 特 公平 5- 11958号、 特公平 7- 112437号、 特公平 7- 112438号参照） 、 その成長に Lーホ モセリン等のアミノ酸を必要とする変異株 （特公昭 48-28078号、 特公昭 56- 6499 号） 、 AECに耐性を示し、 更に L—ロイシン、 L—ホモセリン、 L一プロリン、 L —セリン、 L一アルギニン、 L—ァラニン、 L—パリン等のアミノ酸を要求する 変異株 （米国特許第 3708395号及び第 3825472号） 、 D L—ひ—アミノー ε—カブ ロラクタム、 ひ一アミノーラウリルラクタム、 ァスパラギン酸一アナログ、 スル ファ剤、 キノイ ド、 Ν—ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱炭酸酵素 （デカルボキシラーゼ） または呼吸系酵素阻害剤の耐性 を示す L一リジン生産変異株 （特開昭 50- 53588号、 特開昭 50-31093号、 特開昭 52 -102498号、 特開昭 53-9394号、 特開昭 53- 86089号、 特開昭 55-9783号、 特開昭 55- 9759号、 特開昭 56-32995号、 特開昭 56-39778号、 特公昭 53- 43591号、 特公昭 53-1 833号） 、 イノシトールまたは酢酸を要求する L一リジン生産変異株 （特開昭 55 - 9784号、 特開昭 56- 8692号） 、 フルォロピルビン酸または 34°C以上の温度に対して 感受性を示す L一リジン生産変異株 （特開昭 55- 9783号、 特開昭 53-86090号） 、 ェ チレングリコールに耐性を示し、 L—リジンを生産するブレビパクテリゥム属ま たはコリネパクテリゥム属の生産変異株 （米国特許第 4411997号） 。
また、 L—スレオニン生産能を有するコリネ型細菌としては、 コリネパクテリ ゥム · ァセ トァシドフィラム AJ12318 ( FERM BP- 1172 ) (米国特許第 5， 188， 949号参 照） 等が、 L—イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌としてはブレビバクテ リウム . フラバム AJ12149 ( FERM BP- 759 ) (米国特許第 4，656， 135号参照） 等が挙 げられる。 なお、 本明細書において 「L—リジン等の L一アミノ酸生産能」 とは、 コリネ 型細菌を培地に培養したときに、 培地中に有意な量の L—リジン等の L一アミノ 酸を蓄積する能力、 又は菌体中の L—リジン等のアミノ酸含量を増加させる能力 をいう。
< 2 >グルコース 6—リン酸イソメラ一ゼ活性の増強
コリネ型細菌細胞中のグルコース 6—リン酸ィソメラーゼ活性を増強するに は、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子断片を、 該細菌で 機能するベクター、 好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換え D NAを作製し、 これを L一リジン又は L—グル夕ミン酸生産能を有するコリネ型 細菌に導入して形質転換すればよい。 形質転換株の細胞内のグルコース 6—リ ン酸ィソメラーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強される。 グルコース 6—リン酸イソメラー ゼは、 ェシエリヒア · コリでは pgi遺伝子にコードされている。
グルコース 6—リン酸イソメラーゼ遺伝子は、 コリネ型細菌の遺伝子を用い ることも、 ェシエリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用するこ とができる。
ェシエリヒア ' コリの pgi遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている （Froma n， B.E. et al . , Mol. Gen. Genet. 217, 126-131(1989), Genbank/EMBL/DDBJ acc etion No. X15196) ので、 その塩基配列に基づいて作製したプライマー、 例えば 配列表配列番号 1及び 2に示すプライマーを用いて、 ェシエリヒア . コリ染色体 DNAを銪型とする P CR法 （P CR ： polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends Genet. 5， 185(1989)参照） によって、 pgi遺伝子を取得するこ とができる。 コリネ型細菌等の他の微生物のグルコース 6—リン酸イソメラー ゼをコードする遺伝子も、 同様にして取得され得る。
染色体 DNAは、 D N A供与体である細菌から、 例えば、 斎藤、 三浦の方法 (H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963), 生物工学実験書 日本生物工学会編、 97〜 98頁、 培風館、 1 992年参照） 等により調製する ことができる。
P C R法により増幅されたグルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードする 遺伝子は、 ェシヱリヒア ' コリ及び/又はコリネ型細菌の細胞内において自律複 製可能なベクタ一 DN Aに接続して組換え DN Aを調製し、 これをェシエリヒア •コリ細胞に導入しておくと、 後の操作がしゃすくなる。 ェシエリヒア 'コリ細 胞内において自律複製可能なベクターとしては、 ブラスミ ドベクターが好ましく、 宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010等が挙げられる。
コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、 PAM330 (特 開昭 58- 67699号公報参照） 、 pHM1519 (特開昭 58-77895号公報参照） 等が挙げられ る。 また、 これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ ドを自律複製可能に する能力を持つ DN A断片を取り出し、 前記ェシェリヒア · コリ用のベクターに 挿入すると、 ェシエリヒア · コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわ ゆるシャトルベクターとして使用することができる。 このようなシャ トルべクタ 一としては、 以下のものが挙げられる。 尚、 それそれのベクターを保持する微生 物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
PAJ655 Iシエリヒア'コリ AJ11882(FERM BP- 136)
コリネハ、、クテリゥム'ク、、ルタミクム SR8201(ATCC39135)
PAJ1844 ェシヱリヒア ·]リ AJ11883(FERM BP-137)
コリネハ'、クテリゥム，ク、、ルタミクム SR8202(ATCC39136)
PAJ611 ェシエリヒア 'コリ AJ11884(FERM BP- 138)
PAJ3148 ]リネハ '、クテリゥム'ク、、ルタミクム SR8203(ATCC39137)
PAJ440 ハ、、チルス ·Γフ、、チリス AJ11901(FERM BP- 140)
pHC4 Iシエリヒア ·]リ AJ12617(FERM BP- 3532)
グルコース 6—リン酸ィソメラーゼをコ一ドする遺伝子とコリネ型細菌で機 能するベクターを連結して組み換え D NAを調製するには、 グルコース 6—リ ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを 切断する。 連結は、 T 4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ る。
上記のように調製した組み換え D N Aをコリネ型細菌に導入するには、 これま でに報告されている形質転換法に従って行えばよい。 例えば、 ェシヱリヒア ' コ リ K一 12について報告されているような、 受容菌細胞を塩化カルシウムで処 理して DN Αの透過性を増す方法 (Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) があり、 バチルス 'ズブチリスについて報告されているような、 増 殖段階の細胞からコンビテン トセルを調製して DNAを導入する方法 （ Duncan, C.H. , Wilson, G. A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)) がある。 あるいは、 バ チルス 'ズプチリス、 放線菌類及び酵母について知られているような、 DNA受 容菌の細胞を、 組換え DN Aを容易に取り込むプロトプラス トまたはスフエロプ ラストの状態にして組換え DN Aを DN A受容菌に導入する方法 （ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168， 111 (1979);Bibb，M丄， Ward, J.M.and H opwood，0. A.， Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A. ,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)) も応用できる。 本発明の実施例で 用いた形質転換の方法は、 電気パルス法 （特開平 2— 20779 1号公報参照） である。
グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードする活性の増強は、 グルコース 6—リン酸ィソメラーゼをコードする遺伝子を上記宿主の染色体 D N A上に多 コピー存在させることによつても達成できる。 コリネ型細菌に属する微生物の染 色体 D N A上にグルコース 6—リン酸ィソメラーゼをコ一ドする遺伝子を多コ ピーで導入するには、 染色体 D N A上に多コピー存在する配列を標的に利用して 相同組換えにより行う。 染色体 D N A上に多コピー存在する配列としては、 レぺ ティティブ DN A、 転移因子の端部に存在するィンバーティッド · リピートが利 用できる。 あるいは、 特開平 2— 1 09985号公報に開示されているように、 グルコース 6—リン酸イソメラ一ゼをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭 載してこれを転移させて染色体 D N A上に多コピー導入することも可能である。 いずれの方法によっても形質転換株内のグルコース 6—リン酸ィソメラ一ゼを コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、 グルコース 6—リン酸イソメラ ーゼ活性が増強される。
グルコース 6—リン酸イソメラ一ゼ活性の増強は、 上記の遺伝子増幅による 以外に、 染色体 DNA上又はプラスミ ド上のグルコース 6—リン酸イソメラ一 ゼをコードする遺伝子のプロモータ一等の発現調節配列を強力なものに置換する ことによつても達成される。 たとえば、 l a cプロモーター、 t rpプロモー夕 一、 t r cプロモー夕一、 t a cプロモーター、 ラムダファージの P Rプロモー 夕一、 P Lプロモーター等が強力なプロモー夕一として知られている。 これらの プロモ一夕一への置換により、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードす る遺伝子の発現が強化されることによってグルコース 6—リン酸イソメラーゼ 活性が増強される。
また、 本発明のコリネ型細菌は、 グルコース 6 _リン酸イソメラ一ゼ活性に 加えて、 他のアミノ酸生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することによ つて、 それらの酵素活性が増強されてもよい。 例えば、 L—リジンの製造に利用 可能な遺伝子の例としては、 L—リジン及び Lースレオニンによる相乗的なフィ 一ドバック阻害が実質的に解除されたァスパルトキナーゼひサブュニッ ト蛋白質 又は/?サブュニット蛋白質をコードする遺伝子 （W094/25605国際公開パンフレッ ト） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼ遺伝子 （特開昭 60-87788号公報） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジ ピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子 （特公平 6-55149号公報） 等が知られてい る。
また、 L一グルタミン酸の製造に利用可能な遺伝子の例としては、 解糖系のホ スフォフルク トキナーゼ （P FK、 特開昭 6 3— 1 0 2692号） 、 アナプレロ ティ ック経路のホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ （PEP C、 特開昭 60— 87788号、 特開昭 62— 5 5 089号） 、 T C A回路のクェン酸合成 酵素 （C S、 特開昭 62— 2 0 1 585号、 特開昭 6 3— 1 1 9688号） 、 ァ コニッ ト酸ヒドラ夕一ゼ （ACO、 特開昭 6 2— 2 94086号） 、 イソクェン 酸デヒドロゲナーゼ （ I CDH、 特開昭 62— 1 66890号、 特開昭 63 - 2 1 4 1 89号） 、 アミノ化反応を触媒するグル夕ミン酸デヒドロゲナ一ゼ （GD H、 特開昭 6 1— 268 1 85号） 等がある。
さらに、 L—アミノ酸の生合成経路から分岐して同ァミノ酸以外の化合物を生 成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。 例えば、 L 一リジンの生合成経路から分岐して L一リジン以外の化合物を生成する反応を触 媒する酵素としては、 ホモセリンデヒドロゲナーゼがある （W0 95/23864参照） 。 また、 L—グルタミン酸の生合成経路から分岐して L一グル夕ミン酸以外の化合 物を生成する反応を触媒する酵素としては、 ひケ トグルタール酸デヒドロゲナー ゼ （ひ K G D H ) 、 イソクェン酸リアーゼ、 リン酸ァセチルトランスフェラ一ゼ、 酢酸キナーゼ、 ァセトヒドロキシ酸シン夕一ゼ、 ァセト乳酸シン夕ーゼ、 ギ酸ァ セチルトランスフェラ一ゼ、 乳酸デヒドロゲナ一ゼ、 グルタミン酸デカルボキシ ラ一ゼ、 1 一ピロリンデヒドロゲナ一ゼ、 等がある。
さらに、 L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、 界面活性剤等のビ ォチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、 過剰量のビ ォチンを含有する培地中にてピオチン作用抑制物質の非存在下で L一グル夕ミン 酸を生産させることができる （W096/06180号参照） 。 このようなコリネ型細菌と しては、 W096/06180号に記載されているブレビパクテリゥム ' ラクトファーメン タム AJ13029が挙げられる。 AJ13029株は、 1994年 9月 2日付けで工業技術院生命 工学工業技術研究所 （郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3 号） に、 受託番号 FERM P- 14501として寄託され、 1 9 9 5年 8月 1日にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 5189が付与されている。 また、 L—リジン及び L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、 ピオ チン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、 過剰量のピオ チンを含有する培地中にてピオチン作用抑制物質の非存在下で Lーリジン及び L 一グルタミン酸を同時生産させることができる （W096/06180号参照） 。 このよう な菌株としては、 W096/06180号に記載されているブレビパクテリゥム · ラクトフ アーメンタム AJ12993株が挙げられる。 同株は 1 9 9 4年 6月 3日付けで工業技術 院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305-8566 曰本国茨城県つくば市東一丁目 1 番 3号） に、 受託番号 FERM P- 14348で寄託され、 1 9 9 5年 8月 1日にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 受託番号 FERM BP- 5188が付与されている。 なお、 本明細書において、 酵素の 「活性が増強されている」 とは、 通常には、 野生株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味し、 遺伝子組換え技術等に よる改変によりその酵素活性が増強された菌株を得た場合には、 改変前の菌株よ りも細胞内のその酵素活性が高いことを意味する。 また、 酵素の 「活性が低下し ている」 とは、 通常には、 野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味 し、 遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場 合には、 改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。
< 3 > L—アミノ酸の生産
グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強され、 かつ L一アミノ酸生産 能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 同 L—アミノ酸が培地に蓄 積する。 ί列えば、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強され、 かっし 一リジン酸生産能を有するコ リネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 L—リジン が培地に蓄積する。 また、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強され、 かつ L—グル夕 ミン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、 L—グル夕ミン酸が培地に蓄積する。
さらに、 グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性が増強され、 かつ Lーリジ ン及び L—グル夕 ミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、 L一 リジン及び L—グル夕 ミン酸が培地に蓄積する。 Lーリジンと L一グル夕ミン酸 を同時に酸酵生産する場合には、 Lーリジン生産菌を L—グル夕 ミン酸の生産条 件下で培養してもよいし、 あるいは L—リジン生産能を有するコリネ型細菌と L —グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を混合培養してもよい （特開平 5— 3 7 9 3号公報） 。
本発明の微生物を用いて L一アミノ酸を製造するのに用いる培地は、 炭素源、 窒素源、 無機ィォン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培 地である。 炭素源としては、 グルコース、 ラク ト一ス、 ガラク トース、 フラク ト ース、 シュクロース、 廃糖蜜、 澱粉加水分解物などの炭水化物、 エタノールゃィ ノシトールなどのアルコール類、 酢酸、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有 機酸類を用いることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、 アンモニア、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 酵母エキス、 コーン . スティープ ' リカー、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いること ができる。
無機イオンとしては、 リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガ ンイオン等が少量添加される。 有機微量栄養素としては、 ビタミン B 1などの要 求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は、 振とう培養、 通気撹拌培養等による好気的条件下で 1 6〜72時間実 施するのがよく、 培養温度は30 〜45 に、 培養中 pHは 5〜9に制御する。 尚、 pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、 更にアンモ ニァガス等を使用することができる。
発酵液からの L一アミノ酸の採取は、 通常の L—アミノ酸の製造法と同様にし て行うことができる。 例えば、 L一リジンは、 通常イオン交換樹脂法、 沈澱法そ の他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。 また、 L—グルタミン 酸を採取する方法も常法によって行えばよく、 例えばイオン交換樹脂法、 晶析法 等によることができる。 具体的には、 L一グルタミン酸を陰イオン交換樹脂によ り吸着、 分離させるか、 または中和晶析させればよい。 L一リジン及び Lーグル 夕ミン酸の両方を製造する場合、 これらを混合物として用いる場合には、 これら のァミノ酸を相互に分離することは不要である。 実施例 以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
く 1〉ェシエリヒア 'コリ JM109株の pgi遺伝子のクロ一ニング
ェシエリヒア ' コリの pgi遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている （Froma n, B.E. et al.， Mol. Gen. Genet. 217, 126-131(1989), Genbank/EMBL/DDBJ acc etion No. X15196) 。 報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号 1及び 2に示すプライマ一を合成し、 ェシェリヒア · コリ JM109株の染色体 D N Aを铸型 にして P CR法によりピルビン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子を増幅した。
合成したプライマーの内、 配列番号 1は、 Froman, B.E. et al., Mol. Gen. Gen et. 217, 126- 131(1989)に記載されている pgi遺伝子の塩基配列の 1番目から 24 番目の塩基に至る配列に相当し、 配列番号 2は、 25 73番目から 25 50番目 の塩基に至る配列に相当する。
ェシヱリヒア · コリ JM109株の染色体 D NAの調製は常法によった （生物工学実 験書、 日本生物工学会編、 97〜98頁、 培風館、 1 992年） 。 また、 P CR 反応は、 P CR法最前線 （関谷剛男ほか編、 共立出版社、 1 989年） 185頁 に記載されている標準反応条件を用いた。
生成した P C R産物を常法により精製後、 Smalで切断したプラスミ ド pHC 4 (特開平 5— 749 1号参照） と、 ライゲーシヨンキッ ト （宝酒造社製） を用い て連結した後、 ェシエリヒア ' コリ JM109のコンビテン トセル （宝酒造社製） を用 いて形質転換を行い、 クロラムフエ二コール 5〃g/mlを含む L培地 （パク ト ト リ プトン 10g/L、 バク トイース トエキス トラク ト 5g/L、 NaCl 5g/L、 寒天 15g/L、 pH 7.2) に塗布し、 一晩培養後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、 単コロニー分 離し、 形質転換株を得た。 取得した形質転換体よりブラスミ ドを抽出し、 ベクタ —に pgi遺伝子が結合したブラスミ ド pHC 4 p g iを得た。
p H C 4を保持するェシエリヒア ' コ リは、 プライベートナンパ一 AJ12617と命 名され、 1 99 1年 4月 24日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所 （郵便番号 305-8566 曰本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） に受託番号 FE RM P— 122 15として寄託され、 1 99 1年 8月 26日に、 ブタペス ト条 約に基く国際寄託に移管され、 受託番号 FERM B P— 3532が付与されて いる。
次に、 クローニングされた D N A断片がグルコース 6—リン酸イソメラーゼ 活性を有するタンパク質をコードしていることを確認するため、 JM 1 09株及 び、 p H C 4 p g iを保持する JM 1 09株のグルコース 6—リン酸イソメラ —セ活个玍を、 Muramatsu, N. and Nosoh, Y.， Arch. Biochem. Biophys. 144， 24 5-252 ( 1971)に記載の方法により測定した。 その結果、 pHC4 p g iを保持す る JM 109株は、 pHC4 p g iを保持しない J M 1 09株の約 1 5倍のグル コース 6—リン酸イソメラーゼ活性を示すことから、 pgi遺伝子が発現している ことを確認した。
く 2 >コリネ型細菌の L—グル夕 ミン酸生産株への pHC4 p g iの導入と L— グル夕 ミン酸生産
ブレビバクテリゥム . ラク トファーメン夕ム AJ13029を電気パルス法 （特開平 2 -207791号公報参照） によりブラスミ ド p H C 4 p g iで形質転換し、 得られた形 訂正された用紙 （規則 91) 質転換株を得た。 得られた形質転換株 AJ13029/pHC4pgiを用いて L—グル夕ミン酸 生産のための培養を以下のように行った。 5 zg/mlのクロラムフエ二コールを含む C M 2 Bプレート培地にて培養して得た AJ13029/pHC4pgi株の菌体を、 5 g/mlの クロラムフエ二コールを含む下記組成を有する L一グル夕ミン酸生産培地に接種 し、 31.5°Cにて搌とう培養し、 培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 得 られた培養物を、 同じ組成の培地に 5 %量接種し、 37°Cにて培地中の糖が消費さ れるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネバクテリゥム属細菌 AJ1302 9株に、 既に取得されているコリネバクテリゥム属細菌で自律複製可能なブラスミ ド p H C 4を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。 〔Lーグルタミン酸生産培地〕
下記成分 （ 1 L中） を溶解し、 K0Hで pH8.0に調製し、 115°Cで 15分殺菌する。 グルコース 150g
K H 2 P 0 4 2g
Figure imgf000015_0001
大豆蛋白加水分解液 50nd
ピオチン 2mg
サイアミン塩酸塩 3mg
培養終了後、 培養液中の L一グル夕ミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテツ クアナライザー A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を表 1に示した。 表 1 菌 株 L一グルタミン酸生成量（g/L )
AJ13029/pHC4 2 1 . 0
AJ13029/pHC4pgi 2 3 . 5 く 3〉コリネ型細菌の L—リジン生産株への pHC4pgiの導入と Lーリジン生産 ブレビパクテリゥム . ラクトファ一メン夕ム AJ11082を電気パルス法 （特開平 2 -207791号公報参照） によりプラスミ ド pHC4pgiで形質転換し、 得られた形質転換 株を得た。 得られた形質転換株 AJ11082/pHC4pgiを用いて L—リジン生産のための 培養を以下のように行った。 5〃g/mlのクロラムフエ二コールを含む CM2 Bプレ 一ト培地にて培養して得た AJ11082/pHC4pgi株の菌体を、 5〃 g/mlのクロラムフエ 二コールを含む下記組成の Lーリジン生産培地に接種し、 31.5°Cにて培地中の糖 が消費されるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネパクテリゥム属細 菌 AJ11082株に、 既に取得されているコリネバクテリゥム属細菌で自律複製可能な ブラスミ ド pHC4を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養 した。
ブレビパクテリゥム . ラクトフアーメンタム AJ11082は、 1981年 1月 31日に農学 研究菌培養収集所 （Agricultural Research Culture Collection, ァメリカ合衆 国 イ リノイ州 6 1 6 0 4ピオリア ノースュニバ一シティ通り 1 8 1 5 (1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A.)) に国際寄託され、 受 託番号 NRRL B-11470が付与されている。
〔Lーリジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分 （ 1 L中） を溶解し、 K0Hで pH8,0に調製し、 11 5 °Cで 15分殺菌した後、 別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを 50 g加える。
グルコース 100 g
Figure imgf000016_0001
ピオチン 500 g
チアミン 2000 jug
Figure imgf000016_0002
ニコチンアミ ド 5 mg
蛋白質加水分解物 （豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
培養終了後、 培養液中の L一グル夕ミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテツ クアナライザ一 A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を表 2に示した。 表 2 囷 株 Lーリジン生成量（g/L )
AJ11082/pHC4 2 9 . 1
AJU082/pHC4pgi 3 3 . 4
く 4〉コリネ型細菌の L—リジン及び L—グルタミン酸生産株への pHC4pgiの導入 と L—リジン及び L一グル夕ミン酸同時生産
ブレビパクテリゥム 'ラクトファ一メン夕ム AJ12993を電気パルス法 （特開平 2 -207791号公報参照） によりブラスミ ド pHC4pgiで形質転換し、 得られた形質転換 株を得た。 得られた形質転換株 AJ12993/pHC4pgiを用いて Lーリジン及び L—グル 夕ミン酸生産のための培養を以下のように行った。 5〃g/mlのクロラムフエニコー ルを含む C M 2 Bプレート培地にて培養して得た AJ12993/pHC4pgi株の菌体を、 5 〃g/mlのクロラムフエ二コールを含む前記 L一リジン生産培地に接種して 31 . 5°C にて培養した。 培養を開始してから 1 2時間後に培養温度を 3 4てにシフトし、 培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。 コントロールとしてコリネバクテ リゥム属細菌 AJ12993株に、 既に取得されているコリネバクテリゥム属細菌で自律 複製可能なプラスミ ド PHC4を電気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様 にして培養した。
培養終了後、 培養液中の Lーリジン及び L一グルタミン酸蓄積量を旭化成工業 社製バイオテヅクアナライザ一 A S— 2 1 0により測定した。 このときの結果を 表 3に示した。 表 3 株 Lーリジン生成量（g/L) L—グルタミン酸生成量 (g/L)
AJ12993/pHC4 1 0. 0 18. 9
AJ12993/pHC4pgi 12. 1 20. 8
産業上の利用可能性 本発明により、 コリネ型細菌の L—リジン又は L一グル夕ミン酸等の L一アミ ノ酸の生産能を向上させることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 細胞中のグルコース 6—リン酸イソメラ一ゼ活性が増強され、 かつ L— アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
2 . 前記 L—アミノ酸が、 L一リジン、 L—グルタミン酸、 Lースレオニン、 L—イソロイシン、 Lーセリンから選ばれる請求項 1記載のコリネ型細菌。
3 . 前記グルコース 6—リン酸イソメラーゼ活性の増強が、 前記細菌細胞内 のグルコース 6—リン酸ィソメラーゼをコ一ドする遺伝子のコピー数を高める ことによるものである請求項 1記載のコリネ型細菌。
4 . 前記グルコース 6—リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子がェシエリ ヒア属細菌由来である請求項 3記載のコリネ型細菌。
5 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、 該培 養物中に L—アミノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物から L—アミノ酸を採取する ことを特徴とする L一アミノ酸の製造法。
6 . 前記 L一アミノ酸が、 L一リジン、 L一グルタミン酸、 Lースレオニン、 L—イソロイシン、 Lーセリンから選ばれる請求項 5記載の方法。
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