WO2000078926A1

WO2000078926A1 - Micro-organisme transforme et procede de production de d-aminoacylase

Info

Publication number: WO2000078926A1
Application number: PCT/JP2000/003932
Authority: WO
Inventors: Ken-Ichi Takeuchi; Yoshinao Koide; Yoshihiko Hirose; Mitsuaki Moriguchi; Kimiyasu Isobe
Original assignee: Amano Enzyme Inc.
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2000-12-28
Also published as: DE60042741D1; US6943004B1; JP2001000185A; EP1188823B1; EP1188823A1; JP4327301B2; EP1188823A4; CN1514876A; CN100335615C

Description

明細書発明の名称形質転換微生物、 D—アミノアシラーゼの製造方法技術分野

本発明は、 D—アミノアシラーゼ及び L—アミノアシラーゼのうち、 D— ァミノアシラーゼのみを選択的に生産させる D—アミノアシラーゼ産生遺伝子を亜鉛耐性微生物に導入してなる形質転換微生物、及び該形質転換微生物を利用した D—アミノアシラーゼの製造方法に関する。背景技術

D—アミノアシラーゼは、抗生物質の側鎖ゃぺプチド医薬品等の用途に求められる光学的純度の高い D—アミノ酸の製造等のために産業上有用な酵素である。

従来、 D—アミノアシラーゼと L一アミノアシラーゼを同時に生産する微生物として、ケミカル ' アンド ' フアルマシューティカル ' プリ亍ン

( Chemical and Pharmaceutical Bui letinn) 26, 2698 (1978)にはシユードモナス ■ エスピー（ Pseudomonas sp. ) AAA6029 株が開示されている。又、特開昭 5 3— 5 9 0 9 2号公報には、ストレプトミセス ' オリバセウス

( Streptomyces o! ibaceus ) S ' 62等の放線菌カ開示されてし、る。これらの微生物を利用した場合、 D—アミノアシラーゼの生産能力はさておき、光学異性体である D—アミノアシラーゼと L—アミノアシラーゼとを同時に生産してしまうため、両者を分離すると言う煩雑で高コストな操作を余儀無くされる欠点がある。

—方、 D—アミノアシラーゼのみを選択的に生産する微生物として、例えば特開平 1 — 5 4 8 8号公報には、アルカリゲネス ■ デニトリフィカンス ' サブスヒ一シース - キシ口一スォキシタンス ( A I ca I i genes den i tr i f i cans subsp. xylosoxydans) Ml— 4株が開示されている。この菌株を利用した場合、

D—アミノアシラーゼと L—アミノアシラーゼの分離と言う面倒がないものの. D —ァミノアシラーゼの生産能力が不十分であった。しかも特開平 1 _ 5 4 8 8号公報では、 D —ァミノアシラーゼ産生遺伝子の塩基配列が解明されていないため、 D—アミノアシラーゼの生産能力を向上させるための遺伝子の改変，高生産性の形質転換微生物の創製等を図ることができなかった。

以上の点に鑑み、本願発明者である森口らは、アルカリゲネス，キシロースォキシダンス ■ サブスピーシーズ ■ キシロースォキシダンス（ A I ca I i genes xy I osoxyda ns subsp. xy I osoxydans ) A— 6株力有する D —アミノアシラーゼ産生遺伝子の構造を解明し、配列表の配列番号 1 に係る塩基配列を示した。さらに、この D—アミノアシラーゼ産生遺伝子に一定の改変を加えることにより、形質転換微生物の D —アミノアシラーゼ生産能力を顕著に向上させることに成功した（Pr ote i n Exp r ess i on a nd Pu r i f i cat i on 7 , 395-399 ( 1 996) ) ₀ 発明の開示

その後の研究により、上記 D—アミノアシラーゼ産生遺伝子を導入した各種の形質転換微生物は、亜鉛イオンを含む培地において D —ァミノアシラーゼ生産能力が大きく向上することが分かった。特に、その亜鉛イオン濃度を一定の範囲に制御すると生産能力の向上が著しいことも分かった。

更に上記の効果は宿主微生物の種類によって度合いが大きく異なり、効果の大きい宿主微生物は、一般的に形質転換前においても亜鉛耐性を示すことが分かった。この亜鉛耐性とは、菌体量（A 6 6 0 n m ) を以て測定される繁殖能力が亜鉛イオン添加によって阻害され難いことを言う。

上記の知見から、次の①， ②の事項を指摘できる。即ち、 ①配列表の配列番号 1 に示す D —アミノアシラーゼ産生遺伝子を持つ形質転換微生物は、理由は明確ではないが、一定量の亜鉛イオンの存在により発現が増強される。 ②亜鉛イオンは通常の微生物に対して阻害的に働くと考えられることから、亜鉛ィオンの効果を充分に確保するためには、元々亜鉛耐性を備えた微生物を、遺伝子導入の宿主として選択する必婁がある。

以上の点に基づき、本発明は、 D —アミノアシラーゼ産生遺伝子を用いて形質転換された微生物であって、培地への亜鉛イオンの添加により、 D —アミノアシラーゼ生産能力が更に大きく増強され得るものを提供する。又、本発明は、上記の形質転換微生物を利用した D—アミノアシラーゼの製造方法を提供する。本発明の形質転換微生物は、亜飴イオンの存在により遺伝子産物の発現が増強される D —ァミノアシラーゼ産生遺伝子を亜鉛耐性を示す宿主微生物に導入し、亜鉛イオンを含む培地における D—アミノアシラーゼ高生産性形質を獲得させた微生物である。この形質転換微生物は、 D —アミノアシラーゼ産生遺伝子で形質転換された微生物であって、培地への亜鉛イオンの添加により D— アミノアシラーゼ生産能力が最大限に増強され得る。

本発明の形質転換微生物において、より好ましくは、上記 D—アミノアシラーゼ産生遺伝子が配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有するか、又は配列表の配列番号 1 に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると共に D—アミノアシラーゼを有効にコードする塩基配列を有する。配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有する D —ァミノアシラーゼ産生遺伝子は、亜鉛イオンの存在によリ著しく遺伝子産物の発現が増強される遺伝子であることが確認されている。又、配列表の配列番号 1 に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズすると共に D —アミノアシラーゼを有効にコードする塩基配列を有するものも、同様の特徴を期待できる。

本発明の形質転換微生物において、更に好ましくは、宿主微生物が大腸菌である。大腸菌は亜鉛耐性を備えることが確認された。又、大腸菌はその菌学的性質や生理的性質、培養条件や管理条件等が周知されている。従って、 D— アミノアシラーゼの高効率生産を、容易な生産管理の下に行える。

本発明の形質転換微生物において、更に好ましくは、宿主微生物へ導入される D —アミノアシラーゼ産生遺伝子に対して、次の（ 1 ) 及び/又は（ 2 ) の改変を行う。（ 1 ) リボソーム結合領域に特定塩基配列（G A A G G A ) を設計して、遺伝子の翻訳開始点上流 9塩基の位置に導入することにより、翻訳効率の向上を図る改変。この改変により、 D —アミノアシラーゼ産生遺伝子の翻訳効率が向上する。（ 2 ) 大腸菌の H i n d I I I認識部位を遺伝子の上流と下流に作成し、該遺伝子を純化して切り出し発現ベクターへ連結することによリ、遺伝子の発現効率の向上を図る改変。この改変により、 D—アミノアシラ一ゼ産生遺伝子の発現効率が向上する。

本発明に係る形質転換微生物を得るための宿主微生物としては、亜鉛耐性の微生物が用いられる。より具体的に言えば、菌体量（A 6 6 0 n m ) の増加又は減少を以て測定される培地中での繁殖能力が、亜鉛イオン添加によって余リ阻害されない微生物が用いられる。亜鉛耐性の一つの判断基準として、当該微生物の亜鉛無添加培地における菌体量（A 6 6 0 n m ) に対して、亜鉛

2 m M添加の同一条件培地における菌体量が増加又は 1 0 %以内の減少にとどまること、が挙げられる。あるいは、亜鉛 5 m M添加の同一条件培地における上記菌体量が増加又は 2 0 0/0以内の減少にとどまること、が挙げられる。

宿主微生物の分類上の種類は限定されないが、一般的には、形態学的性質や生理学的性質が良く知られ、その培養条件や管理条件が周知である宿主微生物が好ましい。かかる宿主微生物の好適例として、大腸菌（ Esche r i c i a co l i ) を挙げることができる。反面、前記 A— 6株を含むアルカリゲネス ■ キシロースォキシダンス種の微生物は、大腸菌と比較すると亜鉛耐性を備えていない。

宿主微生物に対する D _アミノアシラーゼ産生遺伝子の導入手段は特段に限定されず、例えば、プラスミドに連結して導入する方法や、パクテリオファージ D N Aに連結して導入する方法等を必要に応じて任意に選択すれば良い。

本発明に係る D—ァミノアシラーゼ産生遺伝子は、 D—アミノアシラーゼ及び L一アミノアシラーゼのうち D—アミノアシラーゼのみを選択的に生産させる遺伝子であって、培地中の亜鉛イオンの存在によリその活性発現が増強されるタイプのものである。このような D—アミノアシラーゼ産生遺伝子であることが確認された好適な一例として、配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有するものを挙げることができる。又、配列表の配列番号 1 に示す塩基配列とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズすると共に、 D—アミノアシラーゼを有効にコードする塩基配列を有するものも好適であるが、実際に培地中の亜鉛イオンによリ活性発現が増強されないものは除かれる。

配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有する D _アミノアシラーゼ産生遺伝子は、前記アルカリゲネス · キシロースォキシダンス ■ サブスピーシーズ ' キシロースォキシダンス A— 6株から取得された。この A— 6株は、自然界の土壌よリスクリーニングによって得られた D —アミノアシラーゼ産生菌である _c 本発明の D —アミノアシラーゼの製造方法は、上記したいずれかの形質転換微生物を亜鉛イオンを含む培地で培養し、培養物から D —アミノアシラーゼを取得する方法である。亜鉛イオンは、例えば塩化亜鉛，硫酸亜鉛等の亜鉛化合物を培地に適量添加することにより与えることができる。この方法により、 D —アミノアシラーゼを高効率に製造することができる。

本発明の D —アミノアシラーゼの製造方法において、より好ましくは、上記培地に含まれる亜鉛イオン濃度を 0 . 1 ~ 1 0 m Mに制御する。この方法により、培地中の亜鉛イオン濃度が最適化され、 D —アミノアシラーゼをとリゎけ高効率に製造することができる。

D —アミノアシラーゼの製造方法に関し、上記以外の点の実施方法や実施条件は特段に限定されないが、 t a cプロモーターの誘導物質（例えば、イソプロピルチオガラクトシド（ I P T G ) 、ラクト一ス等）を誘導物質とする栄養培地中で培養を行うことが好ましい。更にその際のラクトース濃度を 0 . 1 〜 1 %程度としておくこと等も好ましい。図面の簡単な説明

第 1 図は D—アミノアシラーゼ産生遺伝子を連結するために用いたプラスミドを概念化して示す図である。第 2図は D —アミノアシラーゼ産生遺伝子を連結したプラスミドを概念化して示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明を実施するための最良の形態を比較例と共に説明する。本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではない。

(遺伝子の取得と塩基配列の決定）

アル力リゲネス ■ キシロースォキシダンス ■ サブスピーシーズ ■ キシロースォキシダンス A— 6株から得た染色体 D N Aを制限酵素 Sau3AI で部分分解し、 2〜 9 K bの D N A断片を分取した。得られた D N A断片を公知のプラスミド pUG118 の BainHI認識部位に挿入連結した。この連結プラスミドによリ大腸菌 J M 1 0 9を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換株を得た。こうして得られた形質転換株の中から、 D—アミノアシラーゼのみを選択的に生産する能力を持つ株を得た。この能力を持つ形質転換株は、 5. 8 K bの揷入断片を持つプラスミドを保持していた。

上記プラスミド中の 5. 8 K bの挿入断片をトリムダウンして、 D—アミノアシラーゼ産生遺伝子の位置を推定した。そして、約 2. O K bの D N Aについて、常法に従い、配列表の配列番号 1 に示すような塩基配列を決定した。配列表には、対応するアミノ酸配列も付記する。その結果、 A T Gから始まる 1 4 5 2ヌクレオチドからなるオープンリーディングフレーム（O R F ) を確認した。

(遺伝子の改変）

上記の 5. 8 K bの挿入断片を持つプラスミドから、 BamHI- Hindi I I消化により 4 K bの D N A断片を切り出し、公知のプラスミド pUG118 と連結することにより連結プラスミド PAND118を作製し、これを錡型として、プライマーを用いた部分特異的変異により、リボソームバインディングサイト（ R B S ) を改変したプラスミド PANSD1 を作製した。

次に、上記プラスミド PANSD1 を錶型とし、プライマ一を用いた部分特異的変異により、上記 R B Sの直上流には EcoRIの認識部位を、又、 O R Fの直下流には Hindi I I認識部位を、それぞれ作成してなるプラスミド pANSDIHE を得た。

更にプラスミド pANSDIHE を制限酵素 EcoR卜 Hindi I Iで消化して得た 1 . 8 K bの D N A断片を、図 1 に示すプラスミド pKK223-3 の EcoRI -Hindi I I部位に挿入連結して、図 2に示すプラスミド pKNSD2 を得た。

(形質転換大腸菌）

大腸菌（Eschericia col i ) K 1 2株由来の株を宿主として、 D . Η Α Ν Α

H A Νの方法（DNA cloning Vol.1 109- 136 1985) によりプラスミド D N Aを導入し、形質転換大腸菌 E. col i TGI/pKNSD2を得た。

(遺伝子取得源菌株の亜鉛耐性)

前記のアル力リゲネス ■ キシロースォキシダンス ■ サブスピーシーズ ■ キシロースォキシダンス A— 6株を、リン酸一カリウム 0. 2 %，リン酸二カリゥム 0. 2 % , ポリペプトン 2 % , 硫酸マグネシウム 0. 0 1 %及びグリセリン 1 %を含み、 p H 7. 2である亜鉛無添加培地、及びこれと同一組成の培地にそれぞれ 0. 2 mM， 2. O mM及び 5. 0 m Mの濃度に酸化亜鉛を添加した亜鈴添加培地において 3 0° C、 2 4時間培養した。培養後、菌体量（A 6 6 0 n m) を測定することにより、その亜鉛耐性を評価した。その際、培養後の培地 p Hも測定した。その結果を表 1 における ΓΑ— 6菌 J と表記した欄に示す。

【表 1 】

表 1 より、亜鉛無添加培地における A - 6株の菌体量に対して、亜鉛添加培地における A— 6株の菌体量は顕著に減少しており（ 2. O mMの亜鉛添加培地において約 3 5 %、 5. 0 m Mの亜鉛添加培地において約 6 0 %の減少）、上記 A— 6株が亜鉛耐性ではないことが分かる。 (宿主菌の亜鉛耐性）

宿主菌として用いた上記大腸菌 K 1 2株由来の株に対しても、上記の A— 6株と同様の組成の培地を用いて、同様に菌体量（A 6 6 0 n m) を測定することにより、その亜鉛耐性を評価した。その結果を表 1 における「 T G 1 (宿主菌） J と表記した欄に示す。

表 1 より、亜鉛無添加培地における宿主菌の菌体量に対して、亜鉛添加培地における宿主菌の菌体量は余り減少せず（ 2. 0 mMの亜鉛添加培地において約 3 %、 5. 0 mMの亜鉛添加培地において約 1 2 %の減少。 0. 2 mMの亜鉛添加培地においては却って増加している）、上記宿主菌が亜鉛耐性であることが分かる。

(形質転換大腸菌の亜鉛耐性）

形質転換大腸菌 E. col i TG1/pKNSD2に対しても、上記の A— 6株と同様の組成の培地を用いて、同様に菌体量（A 6 6 0 n m) を測定することにより、その亜鉛耐性を評価した。その結果を表 1 における「_PKNSD2/TG1 (組換え菌）」と表記した欄に示す。

表 1 より、亜鉛無添加培地における形質転換大腸菌の菌体量に対して、亜鉛添加培地における形質転換大腸菌の菌体量は余り減少せず（ 2. O mMの亜鉛添加培地において約 5 %、 5. 0 m Mの亜鉛添加培地において約 1 5 %の減少。 0. 2 mMの亜鉛添加培地においては却って増加している）、上記形質転換大腸菌が亜鉛耐性であることが分かる。

(形質転換大腸菌に対する亜鉛添加効果）

形質転換大腸菌 E. col i TG1/pKNSD2を、パクトトリプトン 1 %，パクトィ一ストエキス 0. 5 %, 塩化ナトリウム 0. 5 %及びアンピシリン 1 0 0〃 g /m I を含む p H 7. 0の培地において 3 0 ° Cで 1 6時間の前培養を行った。

続いて、前培養後の形質転換大腸菌を、リン酸一カリウム 0. 2 <½, リン酸二カリウム 0. 2 % , ポリペプトン 2⁰/₀，硫酸マグネシウム 0. 0 1 %, グリセリン 1 %及び誘導剤としてのラクトース 0. 1 %を含み、 ρ Η 7. 0である亜鉛無添加培地、及びこれと同一組成の培地にそれぞれ 0. 2 mM及び

2. 0 mMの濃度に酸化亜鉛を添加した培地において、 3 0 ° Cで 2 4時間の本培養を行った。又、培養液のブロスァゥト P Hと、培養液（ A 6 6 0 n m) D—アミノアシラーゼ酵素活性（U m L ) を測定した。

その結果、亜鉛無添加培地では酵素活性が 2 1 . 7 8 U /m L (ブロスァゥト p H 5. 0 5 ) であったのに対して、 0. 2 m Mの亜鉛添加培地においては 5 8. 8 5 U /m L (ブロスアウト p H 5. 0 3 ) 、 2. O mMの亜鉛添加培地においては 1 0 9. 7 9 U/m L (ブロスアウト p H 5. 1 1 ) の酵素活性を示した。従って、少なくとも一定の濃度範囲における亜鉛イオンの添加によって、 D—ァミノアシラーゼ生産能力が顕著に向上することを確認した。

又、比較のために、前記 A— 6株を上記の前培養用の培地（但しアンピシリンは無添加）において同上の条件で前培養し、更に、誘導剤を上記ラクトース 0. 1 %から N—ァセチル一 D , L—ロイシン 0. 1 %に変更した以外は上記の本培養用の培地と同じ組成の培地において同上の条件で本培養を行った。そして、培養液のブロスアウト p Hと、培養液（A 6 6 0 n m) D—アミノアシラーゼ酵素活性（ UZm L ) を測定した。

その結果、亜鉛無添加培地では酵素活性が 0. 2 9 U Zm L (ブロスァゥト p H 7. 4 7 ) であったのに対して、 0. 2 mMの亜鉛添加培地においては 0. 1 2 U /m L (ブロスアウト p H 7. 4 8 ) 、 2. O mMの亜鉛添加培地においては 0. 2 9 U m L (ブロスアウト p H 7. 4 3 ) の酵素活性を示した。従って、亜鉛イオンの添加による D—アミノアシラーゼ生産能力の向上効果を認めることができなかった。産業上の利用可能性

以上のように、本発明の形質転換微生物を用いることによって、産業上有用な酵素である D—アミノアシラーゼを選択的に、かつ高効率に生産することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 亜鉛イオンの存在によリ遺伝子産物の発現が増強される D—アミノアシラ一ゼ産生遺伝子を亜鉛耐性を示す宿主微生物に導入し、亜鉛イオンを含む培地における D—ァミノアシラーゼ高生産性形質を獲得させた形質転換微生物。

2 . 前記 D—アミノアシラーゼ産生遺伝子が、配列表の配列番号 1 に示す塩基配列を有するか、又は配列表の配列番号 1 に示す塩基配列とストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズすると共に D—アミノアシラーゼを有効にコードする塩基配列を有するものである請求の範囲第 1項記載の形質転換微生物。

3 . 亜鉛イオンの存在により遺伝子産物の発現が増強される D—アミノアシラ一ゼ産生遺伝子を亜鉛耐性を示す宿主微生物に導入してなる形質転換微生物を. 亜鉛イオンを含む培地で培養し、培養物から D—アミノアシラーゼを取得する D—アミノアシラーゼの製造方法。

4 . 前記培地に含まれる亜鉛イオン濃度を 0 . 1 〜 1 0 m Mに制御する請求の範囲第 3項記載の D—アミノアシラーゼの製造方法。