WO2000067743A1 - Phagocyte radicalaire - Google Patents

Description

明 細 書 ラジカルスカベンジャ一

技術分野

本発明は、 エリスリ トールを含み、 医薬、 食品、 又は化粧品などの分野におい て利用可能なラジカルスカベンジャーに関するものである。 背景技術

生体内ラジカルとして、 酸化還元系の代謝中間体として生成するラジカルや、 放射線又は紫外線などによって生じるラジカルなどが存在しており、 代表的なラ ジカルとして、 スーパーォキシドア二オン（0₂— )、 ヒ ドロキシルラジカル（Η0· )な どの活性酸素の存在が知られている。 活性酸素は、 ウィルスや病原菌に対する生 体の重要な防御機構のほか、 スーパーォキシドア二オンなどがホルモンの生合成 や遺伝子発現に必須の役割を果たしているが、 その反面、 スーパ一ォキシドア二 オンゃヒドロキシルラジカルのように、 それ自体がラジカルである活性酸素や、 過酸化水素や一重項酸素 0₂)のようにラジカルの発生源となる活性酸素が過剰 に生じた場合、 脂質、 蛋白質、 核酸などの生体成分と反応して細胞膜の損傷、 蛋 白質の変性、 遺伝子変異などを引き起こし、 その結果、 生体機能が損傷されて癌 などの様々な疾患や老化が生じることが知られている。 活性酸素の関与が指摘さ れている疾患としては、 例えば、 炎症性の細胞障害、 糖尿病性疾患 （腎症、 網膜 症、 神経障害）、 ァテローム硬化、 アルツハイマー症、 パーキンソン病、 癌、 虚血 —再灌流障害、腎不全、心筋梗塞などがある （Hogg， N. Free Radicals in Disease : Seminars in Reproductive Endocrinology, vol .16, No. 4， 1998)。

このような生体内ラジカルを捕捉して安定化させる性質 （本明細書において、 この性質を 「ラジカル消去能」 と呼ぶことがある。） をもつ物質は、 ラジカルスカ ベンジャーと呼ばれており、 生体内物質のなかではスーパ一ォキシドデスムター ゼ、 グル夕チオンペルォキシダ一ゼ、 力タラ一ゼなどの酵素、 ピリルビン、尿酸、 ビタミン E、 カロテノィ ドなどがラジカルスカベンジャ一として作用することが 知られている。 また、 生体内物質以外の試薬では、 イソフラボノイ ド、 フエノー ル類、 ァスコルビン酸などが活性酸素に対して消去作用を有することが知られて いる （長野ら， フアルマシア， 27, pp.231-233, 1991 )。

なお、特表昭 61-502821号公報には、糖アルコール、具体的にはマンニトール、 ソルビトール、 及びキシリ トールがヒドロキシルラジカル捕獲剤として使用でき ることが記載されているが、 エリスリ トールがラジカル捕捉能を有することは記 載されていない。 また、 特開平 11-124310号公報にはエリスリ トールなどの多価 アルコールが活性酸素 · フリーラジカルによる光毒性を抑制すると記載されてい るが、 この刊行物には上記抑制作用の機序について示唆ないし教示はなく、 エリ スリ トールのラジカル消去能は示唆されていない。 発明の開示

本発明の課題は、 生体内ラジカル、 特に、 活性酸素中で最も高い反応速度を有 し、 生体内に除去機構のないヒドロキシルラジカルなどに対して効率的にラジカ ル消去能を発揮することができ、 医薬の有効成分、 医薬の製剤用添加物、 生体試 料の保存剤、 又は食品、 食品添加物、 化粧品などに利用可能なラジカルスカベン ジャーを提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 エリスリ トール の非代謝性で易吸収及び易排泄の特性により、 生体内のラジカルを効率的に消去 することができ、 安全で効果的なラジカルスカベンジャーとして有用であること を見出した。 本発明は、 上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、 本発明は、 エリスリ トールを含むラジカルスカベンジャーを提供す るものである。 本発明の好ましい態様によれば、 捕捉対象となるラジカルが活性 酸素、 好ましくはヒドロキシルラジカルである上記ラジカルスカベンジャーが提 供される。 本発明のラジカルスカベンジャーは、 医薬の有効成分、 医薬の製剤の ために用いる製剤用添加物、 生体試料の保存剤、 食品、 食品添加物、 又は化粧品 などの用途に用いることができる。 本発明のラジカルスカベンジャーを有効成分 として含む医薬は、 生体内ラジカルが関与する疾病の予防及び/又は治療に有用 である。

別の観点からは、 本発明により、 エリスリ トールのラジカルスカベンジャーと しての使用；生体内ラジカルの消去方法であって、 有効量のエリスリ トールをヒ トを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；及び、 生体内ラジカルが関与す る疾病の予防及び/又は治療方法であって、 予防及び/又は治療有効量のェリス リ トールをヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。 図面の簡単な説明

第 1図は、 本発明のラジカルスカベンジャーのヒドロキシルラジカル消去能を 電子スピン共鳴（ESR) スピントラップ法で測定した結果を示した図である。左側 のスぺクトルはエリスリ トール（本発明）、右側のスぺクトルはグルコース（対照） の結果を示す。各スぺクトル中、左右の 2つのピークはマンガンマ一力一を示し、 中央の 4つのピークは DMP0- 0Hを示す。 発明を実施するための最良の形態

本発明で使用されるエリスリ トール （erythritol ：エリ トリッ ト、 エリ トリ ト —ル、 エリ トロールと呼ばれる場合もある） は meso-エリスリ トールであり、 甘 味料として市販されているものを用いることができる。

本発明のラジカルス力べンジャ一の利用形態は特に限定されず、 種々のラジカ ルを対象として、 生体内及び生体外で利用することができる。 本発明のラジカル スカベンジャーが消去可能なラジカルとしては、 ス一パーォキシドア二オン（0₂—)、 ヒドロキシルラジカル（Η0· )、ヒドロペルォキシラジカル（Η00· )などの活性酸素の ほか、 脂質ペルォキシラジカル、 脂質アルコキシラジカルなどを挙げることがで きるが、 これらに限定されることはない。 活性酸素は本発明のラジカルスカベン ジャーの好適な消去対象である。 特に好ましい消去対象は、 ヒドロキシルラジカ ルである。

本発明のラジカルスカベンジャ一を医薬として用いる場合には、 有効成分であ るエリスリ トールを経口的又は非経口的に投与することができる。 非経口投与と しては、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内、 静脈内、 及び点眼などの投与経路を挙 げることができる。エリスリ トールを医薬として単独で投与することもできるが、 エリスリ トールとともに製剤用添加物を用いて、 適宜の形態の医薬組成物を製造 して投与してもよい。 経口投与に適する医薬組成物としては、 例えば、 錠剤、 顆 粒剤、 細粒剤、 散剤、 シロップ剤、 溶液剤、 カプセル剤、 又は懸濁剤などを挙げ ることができる。 非経口投与に適する製剤の例としては、 例えば、 注射剤、 点滴 剤、 吸入剤、 噴霧剤、 坐剤、 経皮吸収剤、 経粘膜吸収剤などを挙げることができ る。 このような医薬組成物のほか、 エリスリ トールを医薬としてドリンク剤、 健 康飲料、 清涼飲料、 健康食品などに配合してもよい。

製剤用添加物としては、 例えば、 安定化剤、 界面活性剤、 可塑剤、 滑沢剤、 可 溶化剤、 緩衝剤、 甘味剤、 基剤、 吸着剤、 矯味剤、 結合剤、 懸濁化剤、 光沢化剤、 コーディング剤、 着香剤 ·香料、 湿潤剤、 湿潤調節剤、 充填剤、 消泡剤、 咀嚼剤、 清涼化剤、 着色剤、 糖衣剤、 等張化剤、 pH調節剤、 軟化剤、 乳化剤、 粘着剤、 粘 着増強剤、 粘稠剤、 粘稠化剤、 発泡剤、 賦形剤、 分散剤、 噴射剤、 崩壊剤、 崩壊 補助剤、 芳香剤、 防湿剤、 防腐剤、 保存剤、 無痛化剤、 溶剤、 溶解剤、 溶解補助 剤、 流動化剤などを挙げることができ、 これらを 2種以上組み合わせて用いても よい。 これらの製剤用添加物の具体例は、 例えば、 医薬品添加物事典 （日本医薬 品添加剤協会編集、 薬事日報社発行） に説明されているので、 当業者は医薬組成 物の形態に応じて適宜の製剤用添加物を選択し、 当業界で汎用の方法に従って所 望の形態の医薬組成物を製造することができる。

本発明のラジカルスカベンジャーを有効成分として含む医薬は、 生体内ラジカ ルが関与する各種の疾患の予防及び/又は治療に有用である。 生体内ラジカルの うち、 活性酸素が関与する疾患としては、 例えば、 脳、 神経疾患 （ァルツハイマ 一病、パーキンソン病、脳血管障害など)、肺疾患（肺酸素中毒、呼吸促迫症候群、 気道過敏症など)、心筋虚血一再灌流障害、心筋梗塞、血管系疾患（動脈硬化など)、 消化管粘膜障害 （消化器潰瘍など)、 肝疾患、 腎疾患 （腎炎、 腎不全など)、 眼疾 患（白内障、 網膜疾患など)、 皮膚疾患（皮膚炎、 光過敏症など)、 糖尿病性疾患、 免疫疾患 （エイズ、 自己免疫疾患など)、 及び癌などを挙げることができる。 本発 明の医薬は、 これらの疾患の予防及び/又は治療のために有用である。 これらの 疾患のほか、 本発明の医薬を老化防止剤として用いることも可能である。

医薬の投与量及び投与頻度は特に限定されず、 予防及び/又は治療すべき疾患 の種類、 投与経路、 患者の年齢及び体重、 症状、 並びに疾患の重篤度などの種々 の条件に応じて適宜選択することが可能である。 例えば、 成人一日あたり、 体重

1 Kgに対して 100~3，000 mg程度を一日一回又は数日から数週間に一回の割合 で投与することができるが、 投与量及び投与頻度はこの特定の例に限定されるこ とはない。 また、 本発明の医薬は他の医薬の有効成分と組み合わせて用いること ができる。

本発明のラジカルスカベンジャーを製剤用添加物として用いることにより、 医 薬の有効成分と活性酸素ラジカルとの反応による有効成分量の減少を防止するこ とができ、 光や熱などに対する製剤安定性を高めることができる。 一般的には、 医薬の有効成分とともに、 上記に例示した製剤用添加物の 1種又は 2種以上と本 発明のラジカルスカベンジャーとを用いて医薬組成物を製造するのが好ましい。 本発明のラジカルスカベンジャーを製剤用添加物として用いる場合の配合量は特 に限定されず、 有効成分である医薬の種類や製剤形態に応じて適宜の配合量を決 定することができるが、 通常は、 医薬の有効成分の重量に対して 0. 1〜1 , 000 倍 程度である。

また、 本発明のラジカルスカベンジャーを生体から分離 ·採取された生体試料 の保存剤として用いることもできる。 生体試料としては、 血液、 尿などのほか、 病理組織や検査のための摘出組織などを挙げることができるが、 これらに限定さ れることはない。 例えば、 採血管に本発明のラジカルスカベンジャーを予め加え ておくことにより、 血液試料に対する活性酸素の影響を排除することができ、 正 確な臨床検査及び診断が可能になる。

本発明のラジカルスカベンジャーを食品又は化粧品中に配合することにより、 活性酸素などのラジカルによる食品又は化粧品の品質劣化を防止することができ る。食品としては、 野菜、 肉類、 魚類、穀類などの生鮮食品のほか、 調理済食品、 菓子類、 低カロリー甘味組成物、 清涼飲料水などの加工食品を挙げることができ る。 食用油の酸化防止剤として配合することも可能である。 生鮮食品又は加工食 品の種類は特に限定されず、 種々の食品に配合することが可能である。 加工食品 のうち、 甘味を付加することが好適な食品、 例えば、 ジャム、 ミルク、 ョーグル ト、 チューインガム、 清涼飲料水などには、 本発明のラジカルスカベンジャーを 特に好適に配合することができる。 さらに、 甘味料として用いる場合には、 食品 自体として用いることも可能である。 本発明のラジカルスカベンジャーの有効成 分であるエリスリ トールは、 生体内で代謝されにくく、 かつ、 経口投与した場合 には消化管内で容易に吸収されやすい (Oku T. , Recent Res. Devel . , Nutrition, 1, pp.1-13, 1996 )。 従って、 生体内のラジカルを消去する目的で使用する場合に 有利である。

なお、 本明細書の実施例には、 本発明のラジカルスカベンジャーのラジカル消 去能の試験方法が詳細に開示されているので、 当業者は、 実施例の具体的説明を 参照することにより、 本発明のラジカルスカベンジャーを医薬の有効成分、 製剤 用添加物、 生体試料の保存剤、 食品、 食品添加物、 又は化粧品などの種々の目的 で使用するにあたって、 適宜の使用量を容易に決定することが可能である。 実施例

以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。 以下の実施例中で使用したエリスリ トールは いずれも日研化学株式会社製である。

例 1 ： ヒドロキシルラジカル消去能

本発明のラジカルスカベンジャーのヒドロキシルラジカル消去能を、 デォキシ W リボース法 (Hal l iwel l , FEBS Lett. , 128， pp.347-352, 1981 )の一部を変更した 方法で検討した。 ヒドロキシルラジカルとデォキシリボースとの反応で生じるマ ロンジアルデヒド（ MDA )を低い pHでチオノ レビツール酸と加熱して着色産物を生 成するが、 この反応系にラジカルスカベンジャーが共存すると、 ヒドロキシルラ ジカルが消去されて MDAの生成が抑制される。 本試験方法では、 エリスリ トール の存在下又は非存在下で MDAの生成抑制量を求め、 エリスリ トールのヒドロキシ ルラジ力ル消去能を検討した。

最終濃度が 50 mM リン酸緩衝液（pH 7.0 )、 60 mM NaCU 及び 10 mMデォキシリ ボースとなるように反応液を調製し、エリスリ トールを最終濃度が 0.05%、 0.5%、 及び 5%となるように加え、最後に 25〃Mとなるように硫酸第一鉄アンモニゥムを 添加して、 37°Cで 15分間反応させた。 反応終了後、 反応液 1 mlに 0.6%チォバル ビッ一ル酸 1 ml及び 3.5%卜リクロロ酢酸 1 ml を添加し、 混合物を攪拌した後 に 100°Cで 10分間加熱した。 この反応液を 10分間水冷し、 532 nmでの吸光度を 測定した。 MDA生成抑制率（％)は下式より算出した： 100—"(吸光度 （エリスリ トー ル添加） ÷吸光度 （エリスリ トール無添加） x l00}。

この結果、エリスリ トール 0.05 濃度では MDA抑制率 44.6%、 0. 5%濃度では抑制 率 81.8%、 5 農度では抑制率 88.4%であり、 0.5%以上の濃度でエリスリ トールがヒ ドロキシルラジカルをほぼ完全に消去していることが明らかとなった。 対照とし てグルコースを用いて同様に MDA生成抑制率を測定したところ、 0.05%濃度では抑 制率 21.6%、 0.5 濃度では抑制率 64.3%、 5%濃度では抑制率 59.9%であった。 例 2 ： ヒドロキシルラジカル消去能

エリスリ トールの存在下又は非存在下でフェントン反応（Fenton 反応： ¾0₂ + Fe²⁺ 'OH+OIT +Fe )により発生させたヒドロキシルラジカルにより、リノール酸 の過酸化反応を惹起し、 反応の進行を経時的に共役ジェンの生成として 234 nm における吸光度で測定した。

( 1 )リノール酸ミセルの作成 リノール酸を 30 mM (pH 11 )に攪拌しながら加え、 IN HC1で pH 7に調製し、 2.8 mg/ml ( 10 mM)のミセルを作成した。 このミセル 1 mLに 0.8% Lubrol PX ( Sigma 社） 1 mLを加えた後、 30 mM NaCl (pH 7)で全量を 10 mMとし、 1 mMミセルとし て使用した。

(2 )共役ジェンの測定

l mMリノール酸ミセル 2 mLに、 各被験物質を最終濃度が l〜50 mMになるよう に 20〜100〃Lの容量で加え、 さらに 10 mM H₂0₂ 20〃Lを加えた。 続いて、 16 mM FeCl₂ 10/LL を加えてリノール酸の過酸化反応を惹起させ、 反応の進行を経時的 に共役ジェンの生成として 234 nmにおける吸光度変化を分光光度計 （日立、 557 型二次波長分光光度計） を用いて測定した。 反応は 37°Cで行った。 被験物質のか わりに蒸留水を加えたものをコントロールとし、 コントロールの吸光度を 100と した時の、 吸光度の低減をその被験物質の阻害率 ）とした。 この結果、 エリスリ トール 1 mM濃度では阻害率 3.4%、 5 mM濃度では阻害率 18.0%、 10 #1濃度では 阻害率 18.2%、 50 mM濃度では阻害率 26.6%であった。 例 3 ： クチナシ黄色素の安定化

エリスリ トールの色素安定化作用を検討した。 色素としてクチナシ黄色素を用 い、 10%のエリスリ トールの存在下又は非存在下に、 室温で蛍光灯（3, 000 lux)を 照射して色素残存率を測定した。 色素濃度は 0.05 とし、 反応液組成は 0. 01 M クェン酸一クェン酸 Na緩衝液で pH調整した。色素残存率は、最大吸収波長 440 nm での吸光度を測定し、スタート時の吸光度を 100とし、下式より算出した。 （吸光 度 ÷スタート時の吸光度） X 100

この結果、 PH3.5における色素残存率は 1日後に 60.0%、 2日後に 35. 0%であつ た。エリスリ トールの非存在下では 1日後に 46.2%、 2日後に 20.8%であった （遮 光時の残存率は 1日後に 89.0%、 2日後に 79.2%であった。） 同様の試験を pH6.0 で行ったところ、エリスリ トールの存在下における色素残存率は 10日後に 71.6%、 20 日後に 48. 5%であった。 エリスリ トールの非存在下における色素残存率は 10 日後に 57.9%、 20日後に 29.5%であった （遮光時の残存率は 10日後に 91.1°ん 20 曰後に 79.0%であった。)

また、 10%のエリスリ トールの存在下又は非存在下で、遮光下に lO ppmの Fe( I I ) イオン （硫酸第一鉄イオン） を反応液（0.01 クェン酸一クェン酸 Na緩衝液、 PH6.0 )に添加し、室温で遮光下に 1日保存した後の色素残存量を測定したところ、 エリスリ トールの存在下における色素残存率は 84.2%であり、 エリスリ トールの 非存在下における色素残存率は 32.7%であった。 Fe( I I )無添加の場合の残存率は 90.0%であった。 例 4 ： リボフラビンの安定化

10%のエリスリ トールの存在下又は非存在下に、 室温でリボフラビン水溶液

(0.004%、 0.01 Mクェン酸一クェン酸 Na緩衝液、 pH6.0) に蛍光灯（3, 000 lux) を照射して 1日後のリボフラビンの残存率を測定した。 エリスリ トールの存在下 におけるリボフラビン残存率は 36.8%であり、 エリスリ トールの非存在下におけ るリボフラビン残存率は 13.1%であった。 （遮光下での残存率は 104.0%であつ た。） 残存率は、 最大吸収波長 450 nmでの吸光度を測定し、 下式より算出した。

(吸光度 ÷ス夕一卜時の吸光度） X 100 例 5 ： ヒドロキシルラジカル消去能

本発明のラジカルスカベンジャーのヒドロキシルラジカル消去能を、 電子スピ ン共鳴 （ESR) スピントラップ法で検討した。 フェントン反応（H₂0₂ +Fe²⁺→'0H + 0H-+Fe³⁺)で生じるヒドロキシルラジカルを、 スピン卜ラップ剤として 5, 5-ジメ チル-卜ピロリン- N-ォキシド （DMP0) を用い DMP0-0Hスペクトル強度を指標とし た。

22 mL溶液中で最終濃度が 0.034 mM硫酸第一鉄及び 8 mM DMP0となるように反 応液を調製し、 エリスリ トールを最終濃度が 0.01%、 0.05% 0. 1%及び 0.5%となる ように加え、 最後に 0.34 mM過酸化水素を添加した。 室温条件下、 反応 60秒後に 測定を開始した。 ESR装置としては日本電子 JEOL JES-REIXを使用した。 ヒドロ キシルラジカル消去率（％)は下式より算出した： 100— { (エリスリ トール添加によ る DMP0-0Hスぺク トルのピークの高さ ÷マンガンマ一カーのピークの高さ） X100 ÷ (エリスリ トール無添加による DMP0-0Hスペクトルのピークの高さ ÷マンガン マーカ一のピークの高さ） X100}。 対照としてグルコースを用いて同様の試験を 行った。 結果を図 1に示す。 DMP0- 0H のスぺクトル強度がエリスリ トール 0.01% 濃度では 49.1%、 0.05%濃度では 71.4%、 0.1%濃度では 81.9%、 0.5%濃度では 92.1% 抑制されており、 グルコースに比較して顕著なラジカル消去能が認められた。 例 6 ：好中球生存率におけるラジカル消去能

フェントン反応（H₂0₂ +Fe²⁺ .OH+OiT+Fe³ ) で生じるヒドロキシルラジカルに より死滅するラッ ト好中球の生存率におけるエリスリ トールの効果を検討した。 0.39 mLハンクス液に最終濃度として 1〜300 mMとなるようにエリスリ トールを 添加した。 この 0.39 mLハンクス液に、 好中球懸濁ハンクス液 0.10 mL (細胞数 約 5X10⁶個/ mL) を添加し、 37°C下で 10分間ィンキュベートした。ついで 100 mM 硫酸第一鉄 0.005 mLを添加'混和し、直ちに 100 mM過酸化水素 0.005 mLを添加 · 混和した。 37°C下で 3時間インキュベート後に 0.4%トリパンブルー染色液にて染 色し、 好中球の生死を光学顕微鏡下で計測した。 フェントン反応を惹起した好中 球の生存率は 33.5% (無添加群）であった。エリスリ トール lmM、 10mM、 100 mM, 及び 300mMの添加により好中球の生存率はそれそれ 39.2%、 46.5%、 48.2%、 及び 63.6%となり、 生存率の上昇が認められ、 エリスリ トール 100 mM添加群は無添加 群と比較して Pく 0.05(studentttest)で有意差が認められ、 エリスリ トール 300 mM添加群は無添加群と比較して p<0.01(studentt test)で有意差が認められた。 産業上の利用可能性

本発明のラジカルス力べンジャ一は効率的に活性酸素などのラジカルを消去す ることができる。 エリスリ トールはヒトの生体内ではエネルギー源としてほとん ど利用されず、 易吸収、 易排泄の特性をもつことから、 血中を循環してラジカル スカベンジャーとして作用した後、 生体外に排泄される。 従って、 本発明のラジ カルス力ベンジャーは、医薬の有効成分、製剤用添加物、食品添加物、健康食品、 又は化粧品などとして利用することが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . エリスリ トールを含むラジカルスカベンジャー。

2 . 請求の範囲第 1項に記載のラジカルスカベンジャーを有効成分として含み、 生体内ラジカルが関与する疾病の予防及び/又は治療に用いるための医薬。

3 . 製剤用添加物又は生体試料の保存剤として用いる請求の範囲第 1項に記載の ラジカルスカベンジャー。

4 . 食品、 食品添加物、 又は化粧品として用いる請求の範囲第 1項に記載のラジ カルス力ベンジャー。

5 . 捕捉対象のラジカルが活性酸素である請求の範囲第 1項から第 4項のいずれ か 1項に記載のラジカルスカベンジャー。

6 . 捕捉対象のラジカルがヒドロキシルラジカルである請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のラジカルスカベンジャー。

7 . 請求の範囲第 2項に記載の医薬の製造のためのエリスリ トールの使用。

8 . 生体内ラジカルの消去方法であって、 有効量のエリスリ トールをヒトを含む 哺乳類動物に投与する工程を含む方法。

9 . 生体内ラジカルが関与する疾病の予防及び/又は治療方法であって、 予防及 び/又は治療有効量のエリスリ トールをヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を 含む方法。