WO2000060112A1 - Procede de quantification de triglycerides contenus dans des lipoproteines a tres faible densite et dans des lipoproteines a densite moyenne - Google Patents

Procede de quantification de triglycerides contenus dans des lipoproteines a tres faible densite et dans des lipoproteines a densite moyenne Download PDF

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WO2000060112A1
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density lipoprotein
triglyceride
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low
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PCT/JP2000/002114
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Inventor
Masahiko Okada
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Masahiko Okada
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides

Definitions

  • the present invention relates to a method and a reagent for selectively quantifying triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein which are important for clinical diagnosis of arteriosclerosis.
  • Cholesterol and triglycerides are essential nutrients for living organisms. Because they are poorly soluble in water, they are wrapped in amphiphilic membranes (as lipoproteins) and are present in the blood.
  • Lipoproteins include chylomicron, very low density lipoprotein (Very Low Density L ipoprotei n '; VLDL), intermediate density lipoprotein (Interme diate Density L ipoprotein; IDL), low specific lipoprotein (Low Density Lipoprotein; LDL) and High Density Lipoprotein (HDL), which form a complex metabolic system.
  • VLDL Very Low Density L ipoprotei n '
  • IDL Interme diate Density L ipoprotein
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • HDL High Density Lipoprotein
  • Each lipoprotein contains cholesterol and triglyceride.
  • VLD and IDL are mainly composed of triglyceride and are deeply involved in the development of arteriosclerosis. Therefore, it is useful to fractionate and quantify VLDL and IDL triglycerides.
  • total triglyceride LDL cholesterol and total serum triglyceride (hereinafter referred to as total triglyceride) are HDL cholesterol has also been shown to act suppressively.
  • Triglycerides are almost absent in LDL and HDL, mostly , VLDL and IDL.
  • triglyceride in serum is first decomposed into glycerol with lipoprotein lipase, which is then converted to glycerol-3-phosphate with glycerol kinase, and then dihydroxyacetone with glycerol-3-phosphate oxidase.
  • the generated hydrogen peroxide is colorimetrically determined using a peroxidase system.
  • VLDL Methods and reagents for selectively quantifying triglyceride contained in IDL
  • Disclosure of the invention is to establish a method and a reagent for selectively quantifying triglyceride contained in a very low density lipoprotein and / or an intermediate density lipoprotein in a sample.
  • An object of the present invention is to establish a method and a reagent for selectively quantifying triglyceride contained in specific gravity lipoprotein and / or intermediate specific gravity lipoprotein.
  • the present invention includes the following inventions.
  • An enzyme that catalyzes a series of reactions that form hydrogen peroxide or reduced coenzyme from tridaliceride in the presence of a selective reaction promoting substance on the test sample, and the hydrogen peroxide or reduced form produced A method for selectively quantifying triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein, in which a coenzyme is measured.
  • triglycerides contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and Z or medium-density lipoprotein are selectively extracted from triglyceride in the presence of a selective reaction promoting substance.
  • a series of reactions that produce reduced coenzymes are reacted with an enzyme that catalyzes Eliminate triglycerides contained in lipoproteins other than proteins,
  • the remaining triglyceride is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or a reduced coenzyme from triglyceride, thereby producing ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate specific gravity.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or a reduced coenzyme from triglyceride, thereby producing ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate specific gravity.
  • the selective reaction-promoting substance to be present in the first step selectively converts triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein from triglyceride to hydrogen peroxide.
  • the method according to the above (5) wherein the reaction is carried out with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing a reduced coenzyme.
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein is selectively passed over triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance at least one selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein.
  • Ultra-low-density lipoprotein and intermediate-density lipoprotein by selectively reacting triglyceride contained in lipoprotein with a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride Elimination of triglycerides contained in lipoproteins selected from the group consisting of uromicrons, low-density lipoproteins and high-density lipoproteins (provided that triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins and those contained in intermediate-density lipoproteins) Do not delete both triglycerides)
  • tridaliceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein is selectively removed from triglyceride with hydrogen peroxide or reduction.
  • a selective reaction promoting substance of the remaining triglycerides
  • tridaliceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein is selectively removed from triglyceride with hydrogen peroxide or reduction.
  • a selective reaction promoting substance present in the first step and a selective reaction promoting substance present in the second step are the following combinations (i) to (iii):
  • a series of methods for selectively producing triglyceride contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride A selective reaction promoting substance capable of eliminating the triglyceride contained in a lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein by reacting with an enzyme catalyzing the reaction ,
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance capable of reacting with
  • Triglycerides contained in at least one kind of lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins are selectively removed from triglycerides.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme By reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme, the lipoprotein contained in the lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein Before being included in triglycerides and intermediate-density lipoproteins A selective reaction promoting substance capable of eliminating triglycerides,
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance capable of reacting with an enzyme that catalyzes the above reaction;
  • the triglyceride, and a selective reaction promoting substance capable of eliminating the triglyceride contained in the ultra-low density lipoprotein By reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate more hydrogen peroxide or reduced coenzyme, it is included in lipoproteins selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein.
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein and / or high-density lipoprotein that selectively reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • Triglyceride, triglyceride contained in intermediate-density lipoprotein, and in some cases triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein are subjected to a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction promoter capable of reacting with the catalyzing enzyme
  • the test sample may contain at least one selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein.
  • the method according to any one of the above (1) to (11).
  • reaction auxiliary substance is polyadione, a halogen ion, a metal ion or lectin.
  • Ultra-low density liposome in a sample containing (i) a selective reaction promoting substance, and (ii) an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the selective reaction promoting substance selectively selects triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and lipoproteins other than intermediate or low-density lipoprotein, and converts hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride. React with an enzyme that catalyzes a series of reactions to be produced,
  • the reagent according to the above (16) or (17) which eliminates triglycerides contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein.
  • the reagent comprises the first reagent and the second reagent, and the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low density lipoprotein and / or intermediate density lipoprotein. Is selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, thereby producing lipoproteins other than ultra-low density lipoprotein and / or intermediate density lipoprotein. To delete the tridary cerides contained in the
  • the selective reaction promoting substance contained in the second reagent selectively removes hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride by selectively using triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein.
  • the reagent comprises the first reagent and the second reagent, and the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is ultra-low-density lipoprotein, intermediate-density lipoprotein, chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein.
  • Triglyceride contained in at least one kind of lipoprotein selected from the group consisting of specific gravity lipoprotein is selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the selective reaction promoting substance contained in the first reagent and the selective reaction promoting substance contained in the second reagent are the following combinations (i) to (iii):
  • the first reagent contained in chylomicron, low-density lipoprotein, and no or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • Triglyceride and triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein are reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance that can be used;
  • Triglycerides contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins are selectively removed from triglycerides.
  • the triglyceride contained in a lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen oxide or reduced coenzyme.
  • a selective reaction promoting substance capable of eliminating the triglyceride contained in the intermediate specific gravity lipoprotein is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen oxide or reduced coenzyme.
  • the first reagent contained in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • a selective reaction promoter capable of reacting with the catalyzing enzyme
  • the first reagent contained in chylomicron, low-density lipoprotein and no or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride Triglyceride and intermediate specific gravity
  • the triglyceride contained in the lipoprotein and, in some cases, the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein are reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction enhancer that can be
  • Enzymes that catalyze a series of reactions to generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride are (i) lipoprotein lipase, (ii) glycerol kinase, and (iii) glycerol.
  • the test sample may contain at least one selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein.
  • the reagent according to any one of the above (16) to (27).
  • reaction auxiliary substance is a polyanion, a halogen ion, a metal ion or lectin.
  • Lipoprotein ribose glycerol kinase, glycerol 13-phosphate oxidase (or glycerol 13-phosphate dehydrogenase), etc.
  • a cationic, anionic, or nonionic surfactant can be used to act on the force of ilomicron, low density lipoprotein, and high lipoprotein.
  • the method of the present invention for selectively quantifying triglyceride contained in an ultra-low-density lipoprotein and / or an intermediate-density lipoprotein is characterized in that a test sample contains peroxidized triglyceride in the presence of a selective reaction promoting substance.
  • An enzyme catalyzing a series of reactions for producing hydrogen or reduced coenzyme is acted on, and the resulting hydrogen peroxide or reduced coenzyme is measured.
  • the selective reaction-promoting substance is for selectively quantifying triglyceride contained in lipoprotein of very low specific gravity and / or lipoprotein of intermediate specific gravity.
  • One aspect of the method of the present invention is that, in the method of the present invention, in the presence of a selective reaction-promoting substance, selectively low-density lipoprotein and triglyceride contained in Z or intermediate-density lipoprotein are selectively used. Then, by reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, ultra-low density lipoprotein and In this method, the quantification of triglyceride contained in lipoproteins and Z or intermediate specific gravity is selectively performed. (First method of the present invention)
  • the selective reaction promoting substance is a series of substances that selectively produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride by selectively using triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein.
  • the reaction is intended to react with an enzyme that catalyzes the t
  • selective reaction promoting substance when performing quantitative in two stages of the first and second stages, selective reaction promoting substance may be present in the first stage, the It may be present in two stages, or it may be present in the first and second stages. In each case, a similar effect can be obtained.
  • a plurality of types of selective reaction promoting substances can be used in combination at the same time.
  • triglycerides contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein in the presence of a selective reaction promoting substance are selectively converted into triglycerides.
  • the triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein is eliminated by reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate more hydrogen peroxide or reduced coenzyme ( Disassembly).
  • the remaining triglyceride is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, thereby obtaining an ultra-low-density lipoprotein and a non-specific lipoprotein.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, thereby obtaining an ultra-low-density lipoprotein and a non-specific lipoprotein.
  • the quantification of triglyceride contained in the intermediate specific gravity lipoprotein is selectively performed.
  • the selective reaction promoting substance to be present in the first step is selectively oxidized from triglyceride to triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low density lipoprotein and / or intermediate density lipoprotein. It reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen or reduced coenzyme.
  • a selective reaction promoting substance different from the selective reaction promoting substance may be present together with the selective reaction promoting substance present in the first step.
  • the selective reaction promoting substance different from the selective reaction promoting substance that was present in the first step selectively removes triglyceride contained in ultra-low density lipoprotein and Z or intermediate density lipoprotein. It is preferred to react with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • a selective reaction-promoting substance a group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein
  • a selective reaction-promoting substance a group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and / or the intermediate-density lipoprotein among the remaining tridaricerides is selectively converted into triglyceride.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce more hydrogen peroxide or reduced coenzyme the quantification of triglyceride contained in ultra-low density lipoprotein and / or intermediate density lipoprotein can be selectively performed. It is what you do. (Third method of the present invention)
  • the selective reaction promoting substance to be present in the first step and the selective reaction promoting substance to be present in the second step can be selected from the following combinations (i) to (iii). '
  • triglyceride contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein and produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride Reaction with an enzyme that catalyzes a series of reactions to be performed, thereby selectively removing the triglyceride contained in lipoproteins selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein. Accelerator substance.
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Triglyceride, and triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein are converted into an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance that can be reacted.
  • Triglycerides contained in at least one kind of lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins are selectively removed from triglycerides.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme By reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme, the lipoprotein contained in the lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein A selective reaction promoting substance capable of eliminating triglyceride and triglyceride described above contained in intermediate-density lipoprotein.
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Triglyceride and triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein, and in some cases, medium-density lipoprotein A selective reaction promoting substance capable of reacting the contained triglyceride with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • the first stage it is included in chylomicron, low-density lipoprotein, and no or high-density lipoprotein that selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins and, in some cases, triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins may be used to produce hydrogen peroxide or reduced coenzymes from the triglycerides.
  • a selective reaction promoting substance that can be reacted with an enzyme that catalyzes the above reaction.
  • a series of reactions for generating hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride depends on the presence of triglyceride. Any reaction can be used as long as it can produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme, and it may be a single reaction or a plurality of reactions. Such reactions include, for example, the action of lipoprotein tin lipase on the lipoprotein triglyceride in the sample, which decomposes the triglyceride into one molecule of glycerol and three molecules of fatty acids, and then reacts with the glycerol.
  • Adenosine triphosphate (ATP) is converted to glycerol-3-phosphate and adenosine diphosphate (ADP) by the catalysis of glycerol kinase, and this glycerol monophosphate is converted to glycerol-3-phosphate oxidase.
  • a series of reactions that catalyze the conversion to dihydroxyacetone-13-phosphate and generate hydrogen peroxide can be cited.
  • lipoprotein lipase is allowed to act on the lipoprotein triglyceride in the sample to decompose this triglyceride into one molecule of glycerol and three molecules of fatty acids, and then the glycerol and adenosine triphosphate (ATP) ) Is converted to glycerol 3-phosphate and adenosine diphosphate (ADP) by the catalysis of glycerol kinase, and this glycerol-3-phosphate is converted to nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form) [NAD +] Glycerol-3-phosphate dehydrogenase in the presence of glycerol to convert to dihydroxyacetone phosphate and to produce nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form) [NADH].
  • ATP glycerol and adenosine triphosphate
  • ADP adenosine diphosphat
  • glycerol contained in the sample should be added to glycerol kinase and glycerol in advance.
  • a series of reactions for eliminating this glycerol may be carried out by the action of 13-phosphate oxidase, furthermore, by the use of lipase or peroxidase.
  • nicotinamide adenine dinucleotide reduced coenzyme
  • NADH reduced
  • NADPH reduced form
  • the enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride is a catalyst that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Any lipoprotein lipase and glycerol kinase may be used, and examples thereof include dalicerol-3-phosphate oxidase and glycerol-3-phosphate dehydrogenase.
  • These enzymes include, for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants, and those prepared by genetic recombination. it can.
  • the concentration at which these enzymes are present depends on the type and origin of the enzyme, the type of selective reaction promoting substance, or the mixing ratio of the first and second reagents. What is necessary is just to exist in the density
  • lipoprotein lipase is preferably present at a concentration of 1 to 10,000,000 units / 1, particularly preferably at a concentration of 100 to 1,000,000 units71. .
  • glycerol kinase is usually preferably present at a concentration of 0.01 to 500,000 units, and particularly preferably at a concentration of 10 to 10,000 units / 1.
  • Glycerol-13-phosphate oxidase is usually preferably present at a concentration of 1 to 500,000 units, particularly preferably 100 to 50,000 units 1.
  • the activity value of the enzyme originally differs depending on the activity measurement method, and even if the same activity measurement method and the same enzyme are used, they may differ depending on the origin of the enzyme or the degree of purification.
  • Substances required for this reaction include, for example, adenosine triphosphate (ATP) or a salt thereof, magnesium ion, or oxidized coenzyme.
  • concentration of adenosine triphosphate or a salt thereof is preferably 0.001 to 50 gZl, particularly preferably 0.01 to 10 gZ1.
  • Magnesium ions may be used in the form of a salt with a halogen ion or an organic acid, and usually, it is preferably present at a concentration of 0.001 to 10 OmM, and 0.01 to 5 OmM. It is particularly preferred that it be present at a concentration of
  • oxidized coenzyme examples include nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form) [NAD + (oxidized form)] or nicotinamide doadenine dinucleotide phosphoric acid (oxidized form) [NADP + (oxidized form)] Can be mentioned.
  • the measurement of the generated hydrogen peroxide or reduced coenzyme may be performed by any method capable of measuring the amount of hydrogen peroxide or reduced coenzyme generated by the enzyme. It may be.
  • the hydrogen peroxide itself may be measured using a hydrogen peroxide electrode or the like, or another signal is derived from hydrogen peroxide, and this signal is measured. Is also good.
  • a chromogen is oxidized to generate a dye, and the absorbance of the generated dye is measured. Reaction using a Trinder reaction system.
  • Peroxidase is derived from microorganisms such as bacteria or mold, And those derived from plants such as horseradish and horseradish, or those prepared by genetic recombination.
  • the concentration of peroxidase is preferably 30 units or more and Z1 or more.
  • Examples of the chromogen in the Trinder reaction system include 4-aminoantipyrine and phenol or a derivative thereof, or a combination of 4-aminoantipyrine and an aniline derivative.
  • 4-aminoantipyrine is preferably present at a concentration of 0.001 to 501, and particularly preferably at a concentration of 0.01 to 101.
  • phenol derivative examples include 4-monochlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-trichlorophenol, and salts thereof. .
  • aniline derivatives examples include N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -13,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (HDAPS), N-ethylethyl N- (2-hydroxy-13-sulfopropyl) -1,3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-13,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-ethyl-N- ( 2-Hydroxy-1,3-sulfopropyl) 1,3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxy-4-fluoroaline (FDAP S ), N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl-3,5-dimethyloxydiline (CEDB), N-e
  • these phenols or derivatives thereof, or aniline derivatives are preferably present at a concentration of 0.001 to 50 gZl, particularly preferably at a concentration of 0.01 to 10 g.
  • the reduced coenzyme itself may be measured by measuring the absorbance at 340 nm or the like, or another signal may be derived from the reduced coenzyme to measure this signal. May be.
  • a tetrazolium salt is reduced in the presence of diaphorase or 1-methoxy-phenazine methosulfate to form a dye.
  • the reaction may be exemplified by the reaction of measuring the amount of the compound.
  • triglycerides contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein are selectively used in the presence of a selective reaction promoting substance. Then, by reacting it with an enzyme that catalyzes a series of reactions to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, the amount of lipoproteins contained in lipoproteins other than ultra-low density lipoprotein and / or intermediate density lipoprotein is reduced. Erase (decompose) reglyceride.
  • an ultra-low density lipoprotein, an intermediate density lipoprotein, a chylomicron, a low density lipoprotein, and a high density lipoprotein are used.
  • a selective reaction promoting substance By selectively reacting triglyceride contained in at least one lipoprotein selected from the group with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, it is Low specific gravity
  • the triglyceride contained in the lipoprotein selected from the group consisting of lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein is eliminated (decomposed). (However, neither triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein nor triglyceride contained in intermediate-density lipoprotein is eliminated.)
  • compositions are performed by reacting a sample with an enzyme that catalyzes a series of reactions that form hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride in the presence of a selective reaction promoting substance.
  • Toriguriserai Doyori for more information on hydrogen peroxide or a series of reactions to produce reduced coenzyme, c hydrogen peroxide or reduced coenzyme formed by the reaction of the erase (decomposition) is as already described, the first It is preferable to erase in the first stage without carrying up to two stages.
  • hydrogen peroxide for example, it can be eliminated (decomposed) by the presence of catalase or peroxidase.
  • Catalase may be, for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants, those prepared by genetic recombination, and the like.
  • the concentration in which the catalase is present is preferably at least 100 units Z1.
  • the first step it is necessary to eliminate the hydrogen peroxide generated by the hydrogenase, and then in the second step, it is necessary to inhibit the activity of the power tarase so that it does not work.
  • This can be achieved by the presence in the second stage of a substance that inhibits the activity of the enzyme, such as sodium azide.
  • Peroxidase is, for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants such as horseradish, or those prepared by genetic recombination. Can be used.
  • the concentration of peroxidase is preferably 30 units or more.
  • the pH at which the sample and the reagent are mixed and quantified is preferably in the range of pH 5 to 10, and particularly preferably in the range of pH 5.5 to 9.0.
  • the pH of the first step may be set so that the pH of the second step falls within the above-mentioned pH range.
  • a buffer When a buffer is used, it is preferable to use a buffer such that the pH at the time of quantification is in the above-mentioned pH range.
  • MES MES
  • Bis-Tris Bis-Tris propane
  • ADA PIPES
  • ACES OPSO
  • MOPS MOPS
  • BES TES
  • HEPES DIP SO
  • TAP SO P ⁇ PS ⁇
  • HEPE S HEP P SO
  • EPPS T ricine
  • Bicine TAP S
  • CHE S phosphoric acid, phosphate, boric acid, borate, glycine, glycylglycine, imidazole, or tris ( (Hydroxymethyl) aminomethane [Tris] and the like.
  • the method for quantification according to the present invention is a method for quantifying triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein, by adding hydrogen peroxide to triglyceride in the presence of a selective reaction promoting substance.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing reduced coenzyme is acted on to measure the produced hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • the quantitative operation of the method of the present invention is performed in a single step (one-step method, 1-step method). (Reagent system), or may be carried out by a method performed in multiple steps such as two steps (multi-step method, multi-reagent system).
  • the method for initiating the quantitative reaction may be any of a method of adding a substrate or a substance essential for the quantitative reaction, and a method of adding a sample.
  • the temperature during the quantification operation is set to a temperature within a range where the quantitation reaction proceeds at 30 ° (: or 37 ° C) and the reaction components such as enzymes involved in the quantification reaction do not become inactivated or deteriorate by heat. do it.
  • the measurement of the generated hydrogen peroxide or reduced coenzyme may be performed by any method such as a reaction rate method (rate method) or an end point method (endpoint method).
  • the measurement of the absorbance or the like may be performed at only one wavelength, or may be performed at two wavelengths.
  • the method of quantification may be either a manual method or a method using an apparatus such as an automatic analyzer.
  • an automatic analyzer for a clinical test can be mentioned.
  • automatic analyzers for clinical testing include continuous-flow or flow-type automatic analyzers, such as continuous flow or flow injection type, closed type 'batch type, open type' batch type, and pack type.
  • Discrete type automatic analyzers such as a centrifugal type or a centrifugal type, and dry chemistry type automatic analyzers such as a film type or a test piece type may be used.
  • the reagent to be quantified of the present invention is placed in a container suitable for the device to be used.
  • the container containing the reagent is placed in a predetermined position on the device.
  • the sample to be quantified in a container suitable for the measuring device and place it in the specified position. If the device is an automatic analyzer for clinical tests, input and set the reagents to be used and the quantification conditions (quantification parameters) for the sample to be quantified.
  • each of the sample and reagent is pipetted (probe) or dispensed into a reaction cell (reaction cuvette) using a tube, etc., mixed, contacted, and kept at a constant temperature. Then, the absorbance at a specified wavelength of the reaction solution of the sample and the reagent in the reaction cell (reaction cuvette) is measured at a specified time.
  • each of the sample and the first reagent is a reaction cell (reaction cuvette) using a pipette (probe) or a tube. , Mix, contact and keep the temperature constant.
  • the second reagent is dispensed to the reaction solution in the reaction cell (reaction cuvette) using a pipe (probe) or tube, mixed, and brought into contact with each other under constant temperature conditions. keep.
  • the absorbance at a specified wavelength is measured at a specified time for a reaction solution of the sample in the reaction cell (reaction cuvette) with the first and second reagents.
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein in the sample was determined. It is obtained by calculating the concentration of
  • the reagent for selectively quantifying triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein in the sample of the present invention includes (i) a selective reaction promoting substance, and (ii) triglyceride. It contains enzymes that catalyze a series of reactions that produce more hydrogen peroxide or reduced coenzymes.
  • the selective reaction-promoting substance is for selectively quantifying triglyceride contained in lipoprotein of very low specific gravity and Z or intermediate specific lipoprotein.
  • Embodiment 1 1 [First reagent of the present invention]
  • the selective reaction promoting substance contained in the reagent of the present invention selectively contains triglyceride contained in ultra-low density lipoprotein and Z or intermediate density lipoprotein. It reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the selective reaction promoting substance may be contained in the first reagent, may be contained in the second reagent, or It may be contained in the first reagent and the second reagent, and in each case, the same effect can be obtained, and plural kinds of selective reaction promoting substances may be used in combination at the same time. it can.
  • reagent of the present invention includes the following reagents.
  • the reagent comprises a first reagent and a second reagent
  • the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is a lipoprotein other than an ultra-low-density lipoprotein and ⁇ or an intermediate-density lipoprotein.
  • the contained triglyceride is selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride, thereby producing a lipoprotein other than ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein. It removes (decomposes) triglycerides contained in lipoproteins. (Second reagent of the present invention)
  • the second reagent may contain a selective reaction promoting substance different from the selective reaction promoting substance together with the selective reaction promoting substance contained in the first reagent.
  • the selective reaction promoting substance contained in the second reagent which is different from the selective reaction promoting substance contained in the first reagent, is triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and the ⁇ or intermediate-specific-density lipoprotein. Is selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride. Is preferred.
  • reagent of the present invention examples include the following reagents.
  • the reagent comprises a first reagent and a second reagent
  • the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is an ultra-low-density lipoprotein, an intermediate-density riboprotein, a force uromicron, a low-density lipoprotein.
  • At least one lipoprotein selected from the group consisting of protein and high-density lipoprotein selectively catalyzes a series of reactions that produce triglyceride and hydrogen peroxide or reduced coenzyme Reacts with enzymes, thereby eliminating the triglyceride contained in lipoproteins selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein. ). (However, neither triglyceride contained in the very low density lipoprotein nor triglyceride contained in the intermediate density lipoprotein is eliminated.)
  • the selective reaction promoting substance contained in the second reagent selectively removes triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and triglyceride contained in the intermediate or specific gravity lipoprotein among the remaining tridaricerides, It reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce more hydrogen peroxide or reduced coenzyme. (Third reagent of the present invention)
  • the selective reaction accelerating substance contained in the first reagent and the selective reaction accelerating substance contained in the second reagent can be selected from the following combinations (i) to (iii).
  • triglycerides contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • a lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein
  • a selective reaction promoting substance capable of eliminating the triglyceride contained in a lipoprotein selected from the group consisting of:
  • chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride Of triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and Z or intermediate-density lipoprotein with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction promoter that can be
  • the triglyceride contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and triglyceride contained in the intermediate-density lipoprotein, are selectively removed from triglyceride.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme By reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme, the lipoprotein contained in the lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein A selective reaction promoting substance capable of eliminating triglyceride and triglyceride described above contained in intermediate-density lipoprotein.
  • the first reagent contained in chylomicron, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride
  • Triglyceride, triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein, and in some cases triglyceride contained in intermediate-density lipoprotein may be converted into a series of triglycerides to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • a selective reaction promoting substance that can be reacted with an enzyme that catalyzes the above reaction.
  • Triglycerides contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and triglycerides contained in ultra-low-density lipoprotein are selectively removed from triglycerides.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme By reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme, the lipoprotein contained in the lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein A selective reaction promoting substance capable of eliminating triglyceride contained in triglyceride and ultra-low-density lipoprotein.
  • chylomicron, low-density lipoprotein and ⁇ or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride And a triglyceride contained in an intermediate-density lipoprotein, and in some cases, a triglyceride contained in an ultra-low-density lipoprotein, to produce hydrogen peroxide or a reduced coenzyme from the triglyceride.
  • a selective reaction promoting substance that can be reacted with an enzyme that catalyzes the above reaction.
  • a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride A series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride in the reagent of the present invention requires that triglyceride be present. Any reaction can be used as long as it can generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme, and it may be a single reaction or a plurality of reactions. Good.
  • Such reactions include, for example, the action of lipoprotein lipase on triglycerides of lipoproteins in a sample to decompose the triglycerides into one molecule of glycerol and three molecules of fatty acids.
  • Glycerol kinase catalyzes the conversion of triphosphate (AT ⁇ ) to glycerol-13-phosphate and adenosine diphosphate (ADP).
  • a series of reactions that convert dihydroxyacetone-13-phosphate to hydrogen peroxide and generate hydrogen peroxide by the catalysis of glycerol 1-phosphate 3-oxidase can be mentioned.
  • lipoprotein lipase acts on triglycerides of lipoproteins in a sample to decompose the triglycerides into one molecule of glycerol and three molecules of fatty acids.
  • ATP glycerol-13-phosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • glycerol-13-phosphate is converted to nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form) [NAD +
  • 3-hydroxyphosphate dehydrogenase catalyzes the conversion to dihydroxyacetone-3-phosphate and produces nicotinamide adodenine dinucleotide (reduced form) [NADH]. Reactions and the like can also be mentioned.
  • glycerol contained in the sample should be added to glycerol kinase and glycerol in advance.
  • a series of reactions that eliminate this glycerol may be carried out by the action of 3-phosphate oxidase, and furthermore, a hydrolase or the like.
  • Examples of the reduced coenzyme include nicotinamide adenine dinucleotide (reduced) [NADH (reduced)], nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced) [NADPH (reduced)] and the like. be able to.
  • the enzyme that catalyzes a series of reactions for generating hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride is a catalyst that catalyzes a series of reactions for generating hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride. Anything Examples thereof include lipoprotein lipase and glycerol kinase, and glycerol-3-phosphate oxidase or glycerol monophosphate 3-phosphate dehydrogenase.
  • These enzymes include, for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants, and those prepared by genetic recombination. it can.
  • the concentration of these enzymes in the reagents depends on the type and origin of the enzymes, the type of the selective reaction promoting substance, or the mixing ratio of the first and second reagents. What is necessary is just to make it contain in the density
  • lipoprotein lipase is preferably contained at a concentration of 1 to 10,000,000 units, particularly preferably 100 to 1,000,000,000 units. preferable.
  • glycerol kinase is usually preferably contained at a concentration of 0.01 to 500,000 units 71, and particularly preferably at a concentration of 10 to 10,000 units Z1.
  • glycerol-13-phosphate oxidase is preferably contained at a concentration of 1 to 500,000 units, particularly preferably 100 to 50,000 units.
  • the activity value of the enzyme originally differs depending on the activity measurement method, and even if the same activity measurement method and the same enzyme are used, they may differ depending on the origin of the enzyme or the degree of purification.
  • reagent of the present invention necessary substances other than the above-mentioned enzymes in a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride are included.
  • Substances required for this reaction include, for example, adenosine triphosphate (ATP) And its salts, magnesium ions, and oxidized coenzymes.
  • concentration at which adenosine triphosphate or a salt thereof is contained is usually preferably 0.001 to 50 gZl, and particularly preferably 0.01 to 10 gZ1.
  • Magnesium ions may be used in the form of a salt with a halogen ion or an organic acid. Usually, magnesium ions are preferably contained at a concentration of 0.001 to 10 OmM, and 0.01 to 5 OmM. It is particularly preferred that the compound be contained at a concentration of
  • oxidized coenzyme examples include nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form) [NAD + (oxidized form)] or nicotinamide doadenine dinucleotide phosphate (oxidized form) [NADP + (oxidized form) ] Etc. can be mentioned.
  • the amount of hydrogen peroxide or reduced coenzyme produced is measured by a method capable of measuring the amount of hydrogen peroxide or reduced coenzyme produced by the enzyme. Any method may be used as long as it is used.
  • the hydrogen peroxide itself may be measured using a hydrogen peroxide electrode or the like, or another signal is derived from hydrogen peroxide, and this signal is measured. Is also good.
  • a chromogen is oxidized to generate a dye, and the absorbance of the generated dye is measured. Reaction using a Trinder reaction system.
  • the reduced coenzyme itself may be measured by measuring the absorbance at 340 nm or the like, or another signal may be derived from the reduced coenzyme to measure this signal. May be.
  • a dye is formed by reducing tetrazolium salt in the presence of diaphorase or 1-methoxyphenazine methosulfate. Let me measure the reaction Can be mentioned.
  • the reagent comprises the first reagent and the second reagent
  • the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is a substance other than ultra-low density lipoprotein and Z or intermediate density lipoprotein.
  • the triglyceride contained in the lipoprotein is selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or a reduced coenzyme from triglyceride, whereby the ultra-low density lipoprotein and It eliminates (decomposes) triglycerides contained in lipoproteins other than medium-density lipoprotein.
  • the reagent comprises the first reagent and the second reagent
  • the selective reaction promoting substance contained in the first reagent is an ultra-low specific gravity lipoprotein, an intermediate specific gravity lipoprotein, Triglyceride contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of micron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein is selectively produced from triglyceride to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • the triglyceride contained in the lipoprotein selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein; This is to erase (decompose) the code. (However, neither triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein nor triglyceride contained in intermediate-density lipoprotein is eliminated.)
  • compositions are performed by reacting the sample with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride in the presence of the selective reaction promoting substance contained in the first reagent.
  • the power of the reaction is as described above in detail for a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from this tridaliside.
  • the hydrogen peroxide or reduced coenzyme produced by this elimination (decomposition) reaction is erased in the first step of mixing and reacting the sample and the first reagent, and is retained until the second step of mixing the second reagent. It is preferable not to rub.
  • hydrogen peroxide generated in the first step can be eliminated (decomposed) by including hydrogen peroxide or peroxidase in the first reagent. Can be.
  • enzyme for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants, and those prepared by genetic recombination can be used. .
  • the concentration of the enzyme to be added is preferably 100 units / 1 or more.
  • Peroxidases derived from microorganisms such as bacteria or mold, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants such as horseradish, or those prepared by genetic recombination, etc. Can be.
  • the concentration of peroxidase is preferably 30 units / 1 or more.
  • a reduced coenzyme it can be eliminated (decomposed) by, for example, including a dehydrogenase having the reduced coenzyme as a coenzyme in the first reagent.
  • the reagent to be quantified of the present invention contains (i) a selective reaction promoting substance, and (ii) an enzyme which catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the reagent of the present invention also contains a substance necessary for a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride by the enzyme.
  • Examples of substances necessary for this reaction include peroxidase (POD), a chromogen in a Trinder reaction system, a reduced coenzyme, and a buffer.
  • POD peroxidase
  • peroxidase for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans or pests, those derived from plants such as horseradish, or those prepared by genetic recombination can be used. .
  • concentration of peroxidase is preferably 30 units Z1 or more.
  • Examples of the chromogen in the Trinder reaction system include 4-aminoantipyrine and phenol or a derivative thereof, or a combination of 4-aminoantipyrine and an aniline derivative.
  • the 4-aminoantipyrine is preferably contained at a concentration of 0.001 to 50 gZ1, particularly preferably at a concentration of 0.01 to 101 gZ1.
  • phenol derivatives include 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-trichlorophenol, and salts thereof. .
  • aniline derivatives include N- (2-hydroxy-13-sulfopropyl) -13,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-sulfopropyl-13,
  • ALOS N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aniline
  • ALP S N- (3-sulfopropyl) aniline
  • HALP S N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl)
  • MAOS N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) — 3,5-Dimethylaniline
  • MAOS N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) — 3,5-Dimethylaniline
  • MAOS N-ethyl-N_ (2-hydroxy-3-sulfopropyl)
  • TOOS N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl-3-methylethylaniline
  • CEMO N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl 3-methoxyaniline
  • these phenols or derivatives thereof or aniline derivatives are preferably contained at a concentration of 0.001 to 50 gZ1, and particularly preferably at a concentration of 0.01 to 10 1.
  • the pH at which the sample and the reagent are mixed and quantified is preferably in the range of pH 5 to 10, and particularly preferably in the range of pH 5.5 to 9.0.
  • the reagent comprises the first reagent and the second reagent
  • the first reagent and the first reagent are mixed so that the pH after mixing the sample and the first reagent and further mixing the second reagent is within the above-mentioned pH range.
  • the pH of the second reagent may be set.
  • a buffer When a buffer is contained, it is preferable to include a buffer such that the pH at the time of quantification is within the above-mentioned pH range.
  • MES MES
  • Bis-Tris Bis-Tris propane
  • ADA PIPES
  • ACES PIPES
  • ACES MOPSO
  • MOPS MOPS
  • BES TES
  • HEPES DIPSO
  • TAPSO P ⁇ PS ⁇
  • HEPE S HEPP S ⁇
  • EPP S T ricine
  • Bicine TAP S
  • CHE S phosphoric acid, phosphate, boric acid, borate, glycine, glycylglycine, imidazole, Or tris (hydroxymethyl) aminomethane [Tris].
  • the reagent of the present invention further includes other enzymes, substrates of other enzymes, other coenzymes, metal ions such as alkali metal salts or alkaline earth metal salts or salts containing the same, chelating agents, albumin Preservatives such as proteins such as sodium azide, antibiotics, or synthetic antibacterial agents, stabilizers such as saccharides or high molecular compounds, activators, and interfering substances contained in samples such as ascorbate oxidase Substances related to elimination or effect suppression, excipients, or other reagent components can be appropriately contained as necessary.
  • the reagent of the present invention may be a single reagent or, if necessary, two or more reagents; it may be configured to contain this reagent component.
  • the test sample may contain triglycerides contained in the ultra-low-density lipoprotein and / or the intermediate-specific-density lipoprotein. Any substance may be used as long as the amount of triglyceride contained in the protein is to be determined.
  • the test sample is preferably a sample which may contain at least one selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein.
  • Such substances include body fluids of human or animal blood, serum, plasma, etc .; extracts of human or animal organs or muscles; extracts of human or animal feces; extracts of cells or bacterial cells Or an extract of a plant.
  • the main lipoproteins include chylomicron, very low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, low density lipoprotein, and high density lipoprotein.
  • lipoproteins other than these five main types of lipoproteins.
  • triglyceride contained in the very low density lipoprotein is synonymous with triglyceride contained in the lipoproteins other than the intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein, and high density lipoprotein. I do.
  • triglyceride contained in intermediate-density lipoprotein is synonymous with triglyceride contained in lipoproteins other than ultra-low-density lipoprotein, chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein.
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and the intermediate-density lipoprotein is synonymous with the triglyceride contained in lipoproteins other than chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein.
  • the selective reaction promoting substance is for selectively quantifying triglyceride contained in a very low density lipoprotein and / or an intermediate density lipoprotein in a sample.
  • Examples of the selective reaction promoting substance in the method and the reagent of the present invention include the following a) to i).
  • Triglycerides contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein are selectively selected from triglycerides. Reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the enzyme.
  • the triglyceride contained in the lipoprotein selected from the group consisting of ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, chylomicron, low density lipoprotein and high density lipoprotein is eliminated.
  • the triglyceride contained in the riboprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein is eliminated.
  • chiromiclone, low-density lipoprotein and Z or high-density lipoprotein selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for generating hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the triglyceride contained in the protein and the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and Z or the intermediate-density lipoprotein are used to catalyze a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the triglyceride. What reacts with enzymes.
  • chiromiclone, low-density lipoprotein and Z or high-specific gravity selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Triglycerides contained in lipoproteins and triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins, and in some cases, triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins can be converted to hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the above-mentioned triglycerides. It reacts with enzymes that catalyze a series of reactions that produce
  • triglycerides contained in at least one lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein One that selectively reacts triglyceride contained in a poprotein with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • the tridaglyceride contained in the lipoprotein selected from the group consisting of chylomicron, low-density lipoprotein and high-density lipoprotein, and the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein are eliminated.
  • chiromiclone, low-density lipoprotein and Z or high-specific gravity selectively reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • Triglycerides contained in lipoproteins, triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins, and, in some cases, triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins can be converted to hydrogen peroxide or reduced coenzyme from the above-mentioned triglycerides. It reacts with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce
  • lipoproteins such as ultra-low-density lipoprotein, intermediate-density lipoprotein, chylomicron (hereinafter sometimes referred to as “CM”), low-density lipoprotein, or high-density lipoprotein in the presence of a selective reaction promoting substance Triglyceride power
  • CM chylomicron
  • triglyceride contained in each lipoprotein can be reacted with the enzyme.
  • Table 1 shows the types of selective reaction promoting substances.
  • the selective selection of type 10 in Table 1 was carried out.
  • a reaction promoting substance may be present (or contained).
  • a type 2 selective reaction promoting substance may be present (or contained).
  • the selective reaction promoting substance of Eve 3 may be present (or contained).
  • the selective reaction promoting substance when the quantification is performed in two stages, the first stage and the second stage, the selective reaction promoting substance may be present in the first stage or in the second stage. Or may be present in the first and second stages. In either case, Similar effects can be obtained.
  • the selective reaction promoting substance may be contained in the first reagent, may be present in the second reagent, or It may be contained in the reagent and the second reagent. In each case, a similar effect can be obtained.
  • a plurality of types of selective reaction promoting substances can be combined and used (or included) at the same time.
  • a selective reaction promoting substance of type 10 is present (or contained). A similar effect can be obtained.
  • the type 2 selective reaction promoting substance and the Z or type 3 selective reaction promoting substance A promoting substance may be added (or contained).
  • the first step (or the first reagent) is used to determine the amount of triglyceride contained in the very low density lipoprotein and the intermediate density lipoprotein.
  • the selective reaction promoting substance of type 21 in Table 1 may be present (or contained).
  • a type 29 selective reaction promoting substance may be present (or contained) in the first step (or the first reagent).
  • a selective reaction promoting substance of type 28 may be present (or contained) in the first step (or the first reagent).
  • the selective reaction promoting substance different from this selective reaction promoting substance together with the selective reaction promoting substance present (or contained) in the first step (or the first reagent) is used.
  • a substance may be present (or contained).
  • an example of a combination of selective reaction promoting substances is described below.
  • a type 21 selective reaction promoting substance is present (or contained) in the first step (or first reagent).
  • a selective reaction promoting substance of type 10 may be present (or contained).
  • triglyceride contained in chylomicron and low density lipoprotein contained in chylomicron in the presence of a type 21 selective reaction promoting substance Triglyceride contained in high-density lipoprotein and triglyceride contained in high-density lipoprotein are eliminated by reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein remaining in the unremoved and low-density lipoprotein and triglyceride contained in the intermediate-density lipoprotein remain in the second step (or after addition of the second reagent).
  • triglyceride is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme, and the resulting hydrogen peroxide or reduced coenzyme is produced. Perform the measurement.
  • the type 21 selective reaction promoting substance in order to quantify triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein, the type 21 selective reaction promoting substance must be present (or contained) in the first step (or the first reagent), and the second step (Or the second reagent) may be made to contain (or contain) a type 2 selective reaction promoting substance.
  • a type 29 selective reaction promoting substance is present
  • a type 2 and Z or type 10 selective reaction promoting substance is present in the second step (or the second reagent). May be present (or contained).
  • the type 21 selective reaction promoting substance is present (or contained) in the first step (or the first reagent), and the second step (or In the second reagent), a selective reaction promoting substance of type 3 may be present (or contained).
  • a selective reaction promoting substance of type 28 is present (or contained), and in the second step (or second reagent), selection of type 3 and / or type 10 is performed. What is necessary is just to make (or contain) a chemical reaction promoting substance.
  • a plurality of types of selective reaction promoting substances can be combined and used (or included) at the same time.
  • the presence (or containing) of a type 21 selective reaction promoting substance by combining and presenting (or containing) a type 1 selective reaction promoting substance of Table 1 and a type 15 selective reaction promoting substance.
  • a similar effect can be obtained.
  • the type 1 selective reaction promoting substance and / or the type 15 selective It may be present (or contained) by adding a reaction promoting substance or the like.
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and the intermediate-density lipoprotein is present in the first step (the first step).
  • the first step the first step
  • the second step the second step
  • the selective reaction promoting substance may be present (or contained) in a combination of the types shown in Table 2.
  • V L D L medium density lipoprotein
  • IDL medium density lipoprotein
  • C chiromiclone
  • L D L low density lipoprotein
  • H high density lipoprotein
  • the second stage is a selective reaction to the presence of the second stage.
  • the type 9 selective reaction promoting substance is present (or contained) in the first step (or the first reagent), and the type 27 selective reaction promoting substance is present in the second step (or the second reagent).
  • the first step or after mixing the sample and the first reagent
  • triglyceride contained in chylomicron in the presence of a type 9 selective reaction promoting substance, and Triglyceride contained in the high-density lipoprotein is eliminated by reacting with an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride.
  • tridaliceride contained in the ultra-low-density lipoprotein triglyceride contained in the intermediate-density lipoprotein, and triglyceride contained in the low-density lipoprotein remain without being erased.
  • triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins and intermediate-density lipoproteins are contained in the presence of a type 27 selective reaction promoting substance.
  • Triglyceride is reacted with an enzyme that catalyzes a series of reactions that produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride, and the resulting hydrogen peroxide or reduced coenzyme is measured.
  • the type 27 selective reaction promoting substance that is present (or contained) in the second step (second reagent) is contained in toridaricelide and intermediate specific gravity lipoprotein contained in ultra-low density lipoprotein. Not only the triglycerides described above, but also the triglycerides contained in the chylomicron and the triglycerides contained in the high-density lipoprotein can be reacted with the enzyme. In the presence of the type 9 selective reaction enhancer (after the addition of the sample and the first reagent), the tridarylide contained in chylomicron and the triglyceride contained in the high-density lipoprotein are already eliminated and do not exist.
  • a type 27 selective reaction promoting substance is present in the second step (or after the addition of the second reagent), Does not measure triglycerides contained in high-density lipoproteins and triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins. Only triglyceride can be quantified. To quantify triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein, it must be present in the first step (contained in the first reagent).
  • Selective reaction promoting substance and present in the second step (contained in the second reagent)
  • the selective reaction accelerating substance may be present (or contained) in a combination of the types shown in Table 3.
  • P TJP 211 In the third method (or third reagent) of the present invention described above, a plurality of types of selective reaction promoting substances may be combined and used (or contained) at the same time.
  • a selective reaction promoting substance of type 15 by combining and presenting (or containing) a selective reaction promoting substance of type 4 and a selective reaction promoting substance of type 5 in Table 1 A similar effect can be obtained.
  • the selective reaction promoting substance of type 1 and / or the selective reaction promoting substance of type 15 together with the selective reaction promoting substance of type 28 may be added (or contained) by adding substances.
  • the selective reaction promoting substance include a surfactant, polyoxyalkylene or a derivative thereof, or a polysaccharide or a derivative thereof.
  • surfactant examples include a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene polyols, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl phenyl formaldehyde condensates, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, and n- Butyl- ⁇ -D-thiodarcoside ( ⁇ -heptyl- ⁇ _D-thiodarco pyranoside, n_heptyl- / 3-D-thioglucopyranoside) and the like.
  • the number of moles of polyoxyalkylene added to the polyoxyalkylene polyol or the like is preferably in the range of 5 to 1,000, and particularly preferably in the range of 10 to 500. Further, the number of moles of ethylene oxide added to the polyoxyethylene alkyl ethers or polyoxyethylene alkyl phenyl formaldehyde condensate is preferably in the range of 5 to 1,000, and particularly preferably in the range of 5 to 500. .
  • the number of moles of the added oxide is preferably in the range of 5 to 1,000, and particularly preferably in the range of 5 to 500.
  • amphoteric surfactant examples include 3-[(3-Cholamidopropy1) dimethy1ammmonio "—2—hydroxyprropanesucifoncicad (CHAPSO).
  • polyoxyalkylene or a derivative thereof examples include polyoxyethylene (polyethylene glycol) or a derivative thereof, and polyoxypropylene (polypropylene glycol) or a derivative thereof.
  • the number of moles of the polyoxyalkylene added is preferably in the range of 5 to 1,000, particularly preferably in the range of 10 to 500.
  • polysaccharide or a derivative thereof examples include cyclodextrin or a derivative thereof, dextran sulfate or a derivative thereof, dextran or a derivative thereof, and heparin or a derivative thereof.
  • cyclodextrin examples include ⁇ -cyclodextrin, j3-cyclodextrin, and arcyclodextrin.
  • cyclodextrin derivatives include, for example, those in which the hydroxyl group of paracyclodextrin, 3-cyclodextrin, or arcyclodextrin is substituted with a hydroxypropyl group, a maltosyl group, a hydroxybutyl group, a getylaminoethyl group, or the like. Or a crosslinked product of these cyclodextrins or derivatives thereof.
  • Dextran sulfate or a derivative thereof preferably has a molecular weight in the range of 1,000 to 5,000, 000, 000, and preferably has a molecular weight in the range of 5,000 to 1.00, 0000, 000. Particularly preferred.
  • Table 5 shows more specific examples of these selective reaction promoting substances.
  • the selective reaction promoting substance may be present (or contained) by combining a plurality of types.
  • the concentration at which the selective reaction promoting substance is present (or contained) depends on the type of selective reaction promoting substance, the type and origin of the enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from triglyceride. It depends on the concentration of triglyceride contained in the lipoprotein in the sample or the mixing ratio of the first and second reagents. Usually, it may be present (or contained) at a concentration of 0.001 to 10%, and preferably present (or contained) at a concentration of 0.01 to 5%. .
  • a reaction auxiliary substance may be present (or contained) together with the selective reaction promoting substance.
  • this reaction auxiliary substance By the presence (or inclusion) of this reaction auxiliary substance, the function of the selective reaction promoting substance in promoting the selective reaction can be enhanced.
  • reaction auxiliary substance examples include polyadione, halogen ion, metal ion, and lectin.
  • Examples of the polyanion include phosphorus tungsten.
  • Examples of the halogen ion include a chlor ion.
  • Examples of the metal ions include copper ions and divalent metal ions such as manganese ions.
  • lectins examples include lentil lectin and the like. These reaction auxiliary substances may be present (or contained) by combining a plurality of types.
  • FIGURES Figure 1 shows the results of quantification of triglyceride contained in four types of lipoprotein fractions using n-heptyl- / 3-D-thiodarcoside as a selective reaction promoting substance. is there.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of quantification of triglycerides contained in five types of lipoprotein fractions using Sanix FA-103 as a selective reaction promoting substance.
  • Figure 3 shows the Hitachi 7150 automatic analysis when triglycerides contained in five types of lipoprotein fractions were quantified using Sanix FA-103 as a selective reaction promoting substance. It is a figure showing a reaction time course of a device.
  • Figure 4 is a diagram showing the reaction time course of the Hitachi 710 Model Automatic Analyzer when triglyceride contained in five types of lipoprotein fractions was quantified using a total triglyceride quantification reagent. is there.
  • This description includes part or all of the contents as disclosed in the description and Z or drawings of Japanese Patent Application No. 11-128994 and PCT / JP99 / 06723, which are the basis of the priority of the present application.
  • Triglyceride in the purified lipoprotein fraction was quantified by the method and the reagent of the present invention using n-heptyl-3-D-thiodarcoside as a selective reaction promoting substance.
  • glycerol kinase 1.0 unit Zml, glycerol-13-phosphate oxidase 8.0 unit Zml, powerase, adenosine_3-phosphate 4. lmmol / l, N— (3 , 5-dimethoxyphenyl) 1 N '-succinyl ethylenediamine sodium 0.94 mmol Zl, n-heptyl / 3-D-h
  • a combination of 0.4% odorcoside and Good buffer (pH 6.0) was prepared.
  • a mixture of lipoprotein lipase 2.0 units Zml, peroxidase, and 4-aminoantipyrine 2.5 mmol / good buffer was prepared.
  • serum 31 and the first reagent 300, '1 were placed in a test tube at 37 ° C, reacted for 5 minutes, and then the second reagent 1001 was added.
  • the absorbance of the reaction solution was measured at a wavelength of 600 nm.
  • a triglyceride value was calculated using a calibration curve prepared in advance.
  • blood was collected using a blood collection tube containing an anticoagulant, and four types of lipoproteins, chylomicron, ultra-low-density lipoprotein and intermediate-density lipoprotein, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein were collected by density gradient centrifugation. Lipoprotein was separated.
  • the four samples were quantified by this method and total triglyceride was quantified by a commercially available reagent kit (Demina Mina LTG-II; manufactured by Kyowa Medex), and the ratio between the two was determined.
  • a commercially available reagent kit (Demina Mina LTG-II; manufactured by Kyowa Medex), and the ratio between the two was determined.
  • toridaricelide in chylomicron, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein can be selectively decomposed by reaction.
  • Triglyceride in the purified lipoprotein fraction was quantified by the method and the reagent of the present invention using various selective reaction promoting substances.
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C.).
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C).
  • fractions of five types of lipoproteins having different specific gravities of chylomicron, ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, low density lipoprotein, and high density lipoprotein were obtained. Minutes. These five fractions were subjected to quantification as samples.
  • the measurement of triglyceride in the lipoprotein fraction was performed using the Hitachi 7150 automatic analyzer (Hitachi, Ltd.) according to the following procedure.
  • the first reagent (A) 2501 of the above 1 (1) was added and heated at 37 ° C for 5 minutes.
  • the absorbance of the reaction mixture after 5 minutes at 37 ° C was measured by two-wavelength analysis with a main wavelength of 600 nm and a subwavelength of 700 nm.
  • the absorbance was determined by subtracting the absorbance measured by the same method using saline as the sample from the absorbance measured by the above method using each lipoprotein fraction as the sample. Value.
  • the measured value of the absorbance when using the reagent of the present invention was determined by using the total triglyceride quantification reagent (C and D). ) was used to determine the value obtained by dividing the measured value of the absorbance. This value is shown in Table 6.
  • CM chylomicron VLDL: very low density lipoprotein
  • IDL medium density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • Selective reaction promoters that react only triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins are dextran sulfate-500, 0.001 and 0.5%, r-CD 0.1. % And hydroxypropyl CD 0.1 and 0.5%.
  • Selective reaction promoting substances for reacting triglycerides contained in chylomicrons and ultra-low-density lipoprotein were sarcosinate CN-1000.1 and 0.5%.
  • Selective reaction promoting substances (type 7) for reacting triglycerides contained in chylomicron and intermediate-density lipoproteins are PEG 1,000 000 0.1%, PEG 1, 540 0.1 and 0.5%, PEG 6, 000 0.1 and 0.5%, PEG 10 000 0.1%, PEG2 000 0.5, Pull mouth nick L- 3 40.1%, Pull mouth nick L- 44 0.1 % And POE-p-toluene sulfoamide ⁇ . 1%.
  • Selective reaction promoting substances for reacting triglycerides contained in very low density lipoproteins and intermediate density lipoproteins are available from Sannics FA-1030.2, 0.4, 0.5 and 0.6%, PEG 20,000 0.1%, getylaminoethyl / 3-CD 0.1%, and hydroxypropyl mono-CD 0.1%.
  • the selective reaction promoting substance (type 14) for reacting the triglyceride contained in the medium-density lipoprotein and the high-density lipoprotein was KF-350.1%.
  • the selective reaction promoting substances (type 15) for reacting triglycerides contained in low-density lipoprotein and high-density lipoprotein are Emulgen 9110.1%, BL-9EX0.1% and Power Tall NP—720 at 0.1 and 0.5% H
  • Selective accelerators for reacting triglycerides contained in chylomicron, ultra-low-density riboprotein, and intermediate-density lipoprotein are Sannics FA-1030.1%, PEG 2,000 0.5%, PEG10,000 0.5%, POE-p-toluenesulfonamide 0.5%, -CD, hydroxybutyl-a_CD, maltosyl_3-CD, hydroxybutyl-3 / 3-CD 0.1% and 0.5% of CD3 and hydroxypropyl- / 3-CD, water-soluble] 3-cyclodextrin polymer 0.1%, getylaminoethyl-] 3_CD, CDCD, and hydroxy 0.5% of propyl- ⁇ -CD.
  • Selective reaction enhancers that react triglycerides contained in ultra-low-density lipoprotein, intermediate-density lipoprotein, and high-density lipoprotein are TMH-7EX 0.1%, Sannics GP-400 It was 0.1%, and the pull mouth nick L-44 was 0.5%.
  • the selectivity-enhancing substance (type 25) for reacting toridariselide contained in the medium-density lipoprotein, the low-density lipoprotein, and the high-density lipoprotein was EMULGEN 9110.5%.
  • a selective reaction promoting substance that reacts triglycerides contained in chylomicron, ultra-low-density lipoprotein, intermediate-density lipoprotein, and low-density lipoprotein, and Sanix FA — 1 03 0.8%.
  • Selective reaction promoting substances that react triglycerides contained in very low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, low density lipoprotein, and high density lipoprotein are NP-10.1 and 0.1. 5%, Sannics GP _ 400 0.5%, and OP-10.00.1 and 0.5%.
  • Selective reaction promoting substance (type 31) that reacts with triglyceride contained in all lipoproteins of chylomicron, ultra-low-density lipoprotein, intermediate-density lipoprotein, low-density lipoprotein, and high-density lipoprotein are: TMH-7 EX 0.5%, ⁇ -70.1%, Adeletor SO-1 200.1%, OP-80.5%, BT-9 EX 0,1 and 0.5 %, Tween 20.5%, and Sanix FA -It was 103 1%.
  • the presence or inclusion of a selective reaction promoting substance alone or in combination can reduce the amount of lipoprotein contained in ultra-low density lipoprotein and Z or intermediate density lipoprotein. It was confirmed that Liglyceride can be selectively quantified.
  • each selective reaction promoting substance that has been examined here and whose type as a selective reaction promoting substance has been identified is referred to as “4 How to use each type of selective reaction promoting substance” (see “Embodiments of the Invention”).
  • the presence or content of quantification with the presence or presence of lipoprotein and / or ultra-low density lipoprotein Triglycerides contained in intermediate-density lipoproteins can be selectively quantified.
  • Sanix FA-103 0, 2, 0.4 which is a type 10 selective reaction promoting substance that reacts toridariselide contained in very low density lipoprotein and intermediate density lipoprotein, 0.5 or 0.6%, PEG 20,000
  • Triglyceride in the purified lipoprotein fraction was quantified by the method and the reagent of the present invention using Sanix FA_103 as a selective reaction promoting substance.
  • Sanix FA-103 was used as a selective reaction promoting substance, and its concentration was 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, or 1.0% (w / v). Other than the above, the same reagent components and concentrations as those of the first reagent (A) of the present invention in 1 (1) of Example 2 were used, and five types of first reagents containing Sanix FA_103 were prepared. Was. 2. Preparation of the second reagent containing Sanix FA-103
  • Sanix FA-103 was used as a selective reaction promoting substance, and its concentration was 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, or 1.0% (w / v). Except for the above, the preparation was carried out with the same reagent components and concentrations as the second reagent (B) of the present invention in (2) of Example 2 above, and the five types of the second reagent containing Sanix FA-103 were used. Was prepared.
  • Example 2-3 The five types of lipoprotein fractions prepared in the same manner as in Example 2-3 were used as samples, and the respective Sannicks FA-103-containing first and second reagents were used to prepare Examples 2-4. In the same manner as described above, triglyceride in each lipoprotein fraction was quantified.
  • the first reagent (C) of the total triglyceride quantification reagent of 2 (1) of Example 2 and the total tridary cell lye of (2) (2) of Example 2 were used.
  • the second reagent (D) a quantitative reagent for tridaliceride in each lipoprotein fraction was determined.
  • the measured value of the absorbance when using the Sanix FA-103-containing reagent was The value obtained by dividing the measured value of the absorbance when the total triglyceride quantitative reagents (C and D) were used was determined.
  • the vertical axis represents the value obtained by dividing the measured absorbance when using the Sanix FA-103 containing reagent by the measured absorbance when using the total triglyceride quantitative reagent.
  • the horizontal axis represents the concentration [% (w / v)] of Sanix FA-103 contained in the reagent containing Sanix FA-103 of the present invention.
  • CM chylomicron
  • VLDL very low density lipoprotein
  • IDL Intermediate density lipoprotein
  • LDL Low density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • Table 7 and Figure 2 the presence (containment) of lipoprotein at concentrations of up to 0.8% (w / v) of Sanix FA-103 It can be seen that the ultra-low density lipoprotein and Z or intermediate density lipoprotein can be selectively quantified.
  • the quantification method and the quantification reagent of the present invention can selectively quantify triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein.
  • each lipoprotein was purified using the Sanix FA-103-containing reagent of the present invention (having a Sanix FA-103 content of 0.4% (w / v)).
  • Figure 3 shows the reaction time course of the Hitachi 71500 automatic analyzer when the amount was determined.
  • FIG. 4 shows the reaction time course of the Hitachi 71500 type automatic analyzer when the lipoprotein fractions were quantified using the total triglyceride quantification reagents (C and D) in Example 2 described above. Was.
  • the vertical axis represents the absorbance (600 nm main wavelength, 700 nm sub-wavelength).
  • the horizontal axis indicates the photometric points of the analyzer, and the measurement is performed at 50 points during a reaction time of about 10 minutes.
  • Figure 4 shows that the total triglyceride quantification reagent contains tridaliceride in lipoproteins. The results show that there is no selectivity for triglycerides contained in all lipoproteins.
  • Fig. 3 tridaliceride contained in the ultra-low-density lipoprotein among the lipoproteins selectively reacts, and Sannics FA-103 is contained in the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein.
  • Fig. 3 tridaliceride contained in the ultra-low-density lipoprotein among the lipoproteins selectively reacts
  • Sannics FA-103 is contained in the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein.
  • the method and reagent of the present invention for selectively quantifying triglyceride contained in ultra-low-density lipoprotein and / or intermediate-density lipoprotein do not require complicated pretreatment such as centrifugation and precipitation, and are suitable for automated clinical testing. Data that is applicable to analyzers and is useful for the prevention and treatment of arteriosclerosis can be obtained simply and accurately.

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Description

明 細 書 超低比重リポ蛋白及び中間比重リボ蛋白の卜リグリセライ ド定量方法 技術分野
本発明は、 動脈硬化症の臨床診断に重要な超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比 重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの選択的定量方法及び選択的定量試薬に 関する。 背景技術
コレステロールやトリグリセライ ドは生体にとって必須の栄養素である。 これ らは、 水に溶け難いため、 両親媒性の膜に包まれて （リポ蛋白として） 血液中に 存在している。
リポ蛋白には、 カイロミクロン、 超低比重リポ蛋白 （Ve r y L ow De n s i t y L i p o p r o t e i n'; VLDL) 、 中間比重リポ蛋白 （ I n t e rme d i a t e D e n s i t y L i p o p r o t e i n ; I DL) 、 低比 リポ蛋白 （L ow D e n s i t y L i p o p r o t e i n ; LDL) 、 高比重 リポ蛋白 （H i g h D e n s i t y L i o p r o t e i n ； HDL) などの 種類があり、 複雑な代謝系を形成している。
各リポ蛋白ともコレステロールと卜リグリセライ ドを含有している力 VLD と I DLに関しては卜リグリセライ ドが主成分であり、 かつ動脈硬化症の発生 に深く関わっている。 したがって、 VL D Lと I D Lのトリグリセライ ドを分別 定量することは有用である。
動脈硬化症の発生に関与する諸要因を調べたいくつかの大規模追跡調査によれ ば、 LDLコレステロールと、 血清中トリグリセライ ドの総量 （以下、 総卜リグ リセライ ドと呼ぶ） は促進的に、 また HD Lコレステロールは抑制的に作用する ことが証明されている。
卜リグリセライ ドは L D Lと H D Lにはほとんどなく、 大部分が力イロミクロ ン、 VLDL及び I DLに含まれている。
一方、 カイロミクロン中の卜リグリセライ ドは動脈硬化症の危険因子ではない ことが示されている。
したがって、 カイロミクロンだけを排除し、 他のリポ蛋白中のトリグリセライ ドを定量しても一応の目的は達せられる。
各種リポ蛋白を分別せずに総トリグリセライ ドを定量する方法はすでに存在し， 広く使われている （He n r y、 J . B. 、 C l i n i c a l D i a g n o s i s a n d Ma n a g eme n t b y L a b o r a t o r y Me t h o d, P h i l a d e l p h i a : W. B . S a u d e r s、 p p. 1 9 6— 1 9 8) 。
これらの方法は、 血清中のトリグリセライ ドをまずリポプロテインリパーゼで グリセロールに分解し、 次にこれをグリセロールキナーゼでグリセロール— 3 - リン酸に変化させ、 更にグリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼでジヒドロキシ アセトン— 3—リン酸に変え、 その時生成される過酸化水素をペルォキシダ一ゼ 系で発色定量するものである。
また、 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼの代りにグリセ口一ルー 3 -リ ン酸デヒドロゲナーゼを作用させて、 生成した NADHを定量する方法もある。 これらは、 広く酵素的測定法と呼ばれている。
一方、 LDL又は HDLに特定の界面活性剤と添加剤を選択的に作用させ、 そ こに含まれるコレステロールを定量する方法もすでに知られており （例えば、 特 開平 9一 3 1 3200号公報及び特開平 9— 285298号公報） 、 臨床検査な どの目的で広く使われている。
しかし、 VLDL、 I D Lに選択的に作用するか、 又はカイロミクロン、 LD L、 HDLを排除するような試薬の組み合わせはまだ知られておらず、 したがつ て前 2者のリポ蛋白 （VLDL、 I DL) に含まれる卜リグリセライ ドを選択的 に定量する方法及び試薬はこれまでに開示されていない。 発明の開示 本発明により解決しょうとする課題は、 試料中の超低比重リポ蛋白及び/又は 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量する方法及び試薬 の確立である。
より具体的には、 超遠心分離機による分離操作等の繁雑な操作を必要とせず、 汎用されている自動分析装置への適用が可能であって、 簡便かつ正確に定量が行 える、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量する方法及び試薬を確立することである。
本発明は、 以下の発明を包含する。
( 1 ) 被検試料に、 選択的反応促進物質の存在下、 トリダリセライ ドより過酸化 水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、 生成 する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中 間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量する方法。
( 2 ) 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量するためのものである前記 （ 1 ) に記 載の方法。
( 3 ) 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ 蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素 又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることによ り、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド の定量を選択的に行う前記 （1 ) 又は （2 ) に記載の方法。
( 4 ) 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還 元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記
( 3 ) に記載の方法。
( 5 ) 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び Z 又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ 蛋白以外のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを消去し、
第 2段階として、 残存する卜リグリセライ ドを、 卜リグリセライ ドより過酸化 水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させること により、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリダリセラ イ ドの定量を選択的に行う前記 （1 ) 又は （2 ) に記載の方法。
( 6 ) 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及 び/又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的 に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 を触媒する酵素と反応させるものである前記 （5 ) に記載の方法。
( 7 ) 第 2段階において、 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とともにこ の選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在させる前記 （5 ) 又 は （6 ) に記載の方法。
( 8 ) 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質 力 超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド を選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記 （7 ) に記載の方法。
( 9 ) 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白、 中間 比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群 から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 力 イロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ 蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去し （但し、 超低比重リポ蛋白に含ま れるトリグリセライ ド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの両方 の消去は行わない） 、
第 2段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 残存するトリグリセライ ドの うち超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリダリセライ ド を選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及び/又は 中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの定量を選択的に行う前記 （ 1 ) 又は （2 ) に記載の方法。
( 1 0 ) 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質と、 第 2段階において 存在させる選択的反応促進物質が、 下記の組み合わせ （i ) 〜 （i i i ) ：
( i )
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質 ；
( i i )
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記の卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質；
( i i i )
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び/又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質；
のいずれかである前記 （9 ) に記載の方法。
( 1 1 ) トリダリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素が、 U) リポプロテインリパーゼ、 （ii)グリセロールキナー ゼ、 並びに（iii)グリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダーゼ及びグリセロール一 3 一リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方である前記 （ 1) 〜 （1 0) のいずれ かに記載の方法。
(1 2) 被検試料が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含 む可能性のあるものである前記 （1) 〜 （1 1) のいずれかに記載の方法。
(1 3) 選択的反応促進物質が、 界面活性剤、 ポリオキシアルキレン若しくはそ の誘導体、 又は多糖類若しくはその誘導体である前記 （1) ~ (1 2) のいずれ かに記載の方法。
( 1 4) 選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる前記 （ 1 ) 〜 (1 3) のいずれかに記載の方法。
(1 5) 反応補助物質が、 ポリア二オン、 ハロゲンイオン、 金属イオン又はレク チンである前記 （14) に記載の方法。
( 1 6) (i)選択的反応促進物質、 及び（ii) トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有する、 試料中の超 低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択 的に定量するための試薬。
(1 7) 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白 に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に定量するためのものである前記 （ 1 6) に記載の試薬。
(1 8) 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白 に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである前 記 （1 6) 又は （1 7) に記載の試薬。
( 1 9) 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白 以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより 過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含 まれる卜リグリセライ ドを消去するものである前記 （16) 又は （17) に記載 の試薬。
(20) 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 1試薬 に含有されるものである前記 （16) 〜 （19) のいずれかに記載の試薬。
(21) 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 2試薬 に含有されるものである前記 （16) 〜 （19) のいずれかに記載の試薬。
(22) 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 1試薬 及び第 2試薬に含有されるものである前記 （16) 〜 （19) のいずれかに記載 の試薬。
(23) 第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 第 1試薬に含有される選 択的反応促進物質と同じ又は異なる選択的反応促進物質である前記 （22) に記 載の試薬。
(24) 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬に含有される選択的反 応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還 元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超 低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリダリ セライ ドを消去するものであって、
第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中 間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより 過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ るものである前記 （16) 又は （17) に記載の試薬。
(25) 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬に含有される選択的反 応促進物質が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重 リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白 に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高 比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリダリセライ ド を消去するものであり （但し、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及 び中間比重リポ蛋白に含まれる 卜リグリセライドの両方の消去は行わない） 、 第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 残存するトリグリセライ ドのう ち超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを 選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連 の反応を触媒する酵素と反応させるものである前記 （1 6 ) 又は （1 7 ) に記載 の試薬。
( 2 6 ) 第 1試薬において含有させる選択的反応促進物質と、 第 2試薬において 含有させる選択的反応促進物質が、 下記の組み合わせ （i) 〜 （i i i ) ：
( i )
第丄 式架：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記卜リグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質、
第 2試薬：
第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ボ蛋白及びノ又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
( i i)
第 1試薬： カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより， カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2試薬 ：
第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリダリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質；
( i i i )
第 1試薬：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリダリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記卜リグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2試薬：
第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及びノ又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質 ；
のいずれかである前記 （2 5) に記載の試薬。
(2 7) 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素が、 （i)リポプロテインリパーゼ、 （ii)グリセロールキナー ゼ、 並びに（iii)グリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼ及びグリセロール— 3 一リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方である前記 （ 1 6) 〜 （2 6) のいず れかに記載の試薬。
(2 8) 被検試料が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含 む可能性のあるものである前記 （1 6) 〜 （2 7) のいずれかに記載の試薬。
(2 9) 選択的反応促進物質が、 界面活性剤、 ポリオキシアルキレン若しくはそ の誘導体、 又は多糖類若しくはその誘導体である前記 （ 1 6) 〜 （2 8) のいず れかに記載の試薬。
(3 0) 選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる前記 （ 1 6) 〜 (2 9) のいずれかに記載の試薬。
(3 1 ) 反応補助物質が、 ポリア二オン、 ハロゲンイオン、 金属イオン又はレク チンである前記 （30) に記載の試薬。
(3 2) リポプロテインリパーゼ、 グリセロールキナーゼ、 グリセロール一 3— リン酸ォキシダーゼ （又はグリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナーゼ） などを 組み合わせて血清中のトリグリセライ ドを定量する酵素比色法において、 陽ィォ ン性、 陰イオン性、 又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、 超低 比重リポ蛋白 （中間比重リポ蛋白も性状が類似しているためこれに含める） 中の トリダリセライ ドを選択的に定量する方法。
(3 3) リポプロテインリバ一ゼ、 グリセロールキナーゼ、 グリセロール一 3— リン酸ォキシダーゼ （又はグリセロール一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ） などを 組み合わせて血清中の卜リグリセライ ドを定量する酵素的測定法において、 陽ィ オン性、 陰イオン性、 又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、 力 イロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白中の卜リグリセライ ドを選 択的に反応分解させ、 その後、 超低比重リポ蛋白 （中間比重リポ蛋白も性状が類 似しているためこれに含める） 中のトリグリセライ ドを定量する方法。
( 3 4 ) 前記 （3 2 ) に記載の超低比重リポ蛋白中卜リグリセライ ド定量方法に おいて、 同リポ蛋白と界面活性剤との選択性を促進するポリア二オン、 2価金属 イオン、 又は糖を添加する方法。
( 3 5 ) 前記 （3 3 ) に記載の超低比重リポ蛋白中トリグリセライ ド定量方法に おいて、 カイロミクロン、 L D L及び H D Lと界面活性剤との選択性を促進する ポリア二オン、 2価金属イオン、 又は糖を添加する方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
I . 定量する方法
1 . 定量する方法 ·総論
本発明の超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセ ライ ドを選択的に定量する方法は、 被検試料に、 選択的反応促進物質の存在下、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素を作用させ、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行うこと よりなる。
この本発明の方法において、 選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に定量するためのも のである。
2 . 定量の方法の態様
① 態様— 1 〔本発明の第 1の方法〕
本発明の方法の態様の一つは、 前記本発明の方法において、 選択的反応促進物 質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リダリ セライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及 び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの定量を選択的に行うも のである。 （本発明の第 1の方法）
この際、 選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである t なお、 定量を第 1段階と第 2段階の 2段階に分けて行うとき、 選択的反応促進 物質は、 第 1段階に存在させてもよく、 第 2段階に存在させてもよく、 又は第 1 段階及び第 2段階に存在させてもよい。 いずれの場合も、 同様の効果を得ること ができる。
また、 複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、 同時に存在させて使用 することもできる。
② 態様一 2 〔本発明の第 2の方法〕
また、 本発明の方法の態様の別なものとして、 以下の方法を挙げることができ る。
前記本発明の方法において、 まず、 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存 在下、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる トリグリセライドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リ ポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライド を消去 （分解） する。
次に、 第 2段階として、 残存するトリグリセライ ドを、 卜リグリセライ ドより 過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ ることにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグ リセライ ドの定量を選択的に行うものである。 （本発明の第 2の方法）
この際、 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋 白及び/又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選 択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素と反応させるものである。 なお、 第 2段階において、 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とともに この選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在させてもよい。 この場合、 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促 進物質は、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセ ライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成さ せる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものであることが好ましい。
③ 態様一 3 〔本発明の第 3の方法〕
更に、 本発明の方法の態様の他のものとして、 以下の方法を挙げることができ る。
前記本発明の方法において、 まず、 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存 在下、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれ るトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重 リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ 蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去 (分解） する。 （但し、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及び中間 比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの両方の消去は行わない。 ）
次に、 第 2段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 残存するトリダリセラ ィ ドのうち超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセ ライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成さ せる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及び /又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの定量を選択的に行うもの である。 （本発明の第 3の方法）
この際、 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質と、 第 2段階におい て存在させる選択的反応促進物質は、 下記の （i ) 〜 （i i i ) の組み合わせより選 択することもできる。 '
(0 第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質。
第 2段階：
第 1段階において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
( i i )
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記卜リグリセライ ドを、 消去することができる選択的反応促進物質。
第 2段階：
第 1段階において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを、 前記の卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質。
( i i i)
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記卜リグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質。
第 2段階：
第 1段階において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及びノ又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質。 -
3 . トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 を触媒する酵素
① トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 本発明の方法における、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応は、 トリグリセライ ドが存在することにより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させることができる反応であれば、 どのようなものでもよ く、 一つの反応からなるものでもよく、 また、 複数の反応からなるものであって ちょい。 このような反応としては、 例えば、 試料中のリポ蛋白のトリグリセライ ドにリ ポプ口ティンリパーゼを作用させ、 この卜リグリセライ ドを 1分子のグリセロー ルと 3分子の脂肪酸に分解し、 その後このグリセロールとアデノシン三リン酸 ( A T P ) をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール— 3—リン酸 とアデノシン二リン酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセ口一ルー 3—リン酸を グリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼの触媒作用によりジヒドロキシァセトン 一 3—リン酸に変えるとともに過酸化水素を生じさせる、 一連の反応を挙げるこ とができる。
また、 他の例として、 試料中のリポ蛋白のトリグリセライ ドにリポプロテイン リパーゼを作用させ、 このトリグリセライ ドを 1分子のグリセロールと 3分子の 脂肪酸に分解し、 その後このグリセロールとアデノシン三リン酸 （A T P ) をグ リセロールキナーゼの触媒作用によりグリセ口一ルー 3—リン酸とアデノシン二 リン酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセロール— 3—リン酸をニコチンアミド アデニンジヌクレオチド （酸化型） 〔N A D +〕 の存在下、 グリセロール— 3— リン酸デヒドロゲナ一ゼの触媒作用によりジヒドロキシァセトンリン酸に変える とともにニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （還元型） 〔N A D H〕 を生じ させる、 一連の反応等をも挙げることができる。
なお、 前記のグリセロールキナーゼを用いる反応においては、 グリセロールが 試料に含まれると定量値に正の誤差が生じる場合があるので、 これを防ぐため、 予め、 試料に含まれるグリセロールに、 グリセロールキナーゼ及びグリセロール 一 3—リン酸ォキシダーゼ、 更に力タラ一ゼ又はペルォキシダーゼを作用させて、 このグリセロールを消去する一連の反応を行わせてもよい。
ここで、 力タラ一ゼを用いるとき、 消去反応終了後トリダリセライ ドの定量を 行う際には、 アジ化ナ卜リゥムなどの力夕ラーゼの活性を阻害する物質等を存在 させて、 生成した過酸化水素がカタラーゼにより消去 （分解） されないようにす る必要がある。
なお、 還元型補酵素としては、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （還元 型） 〔N A D H (還元型） 〕 、 又はニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン 酸 （還元型） 〔NADPH (還元型） 〕 等を挙げることができる。
② 酵素
本発明の方法において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応を触媒する酵素は、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒するものであればいかなるものでも よいが、 例えば、 リポプロテインリパーゼ及びグリセロールキナーゼ、 更にダリ セロール一 3—リン酸ォキシダーゼ又はグリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナ —ゼ等を挙げることができる。
これらの酵素は、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト若 しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法によ り調製したもの等を用いることができる。
これらの酵素を存在させる濃度であるが、 酵素の種類及び由来、 選択的反応促 進物質の種類、 又は第 1試薬と第 2試薬の混合比率等により異なるので、 一概に は言えず、 適宜その条件に適した濃度で存在させればよい。
なお、 通常、 リポプロテインリパーゼは、 1〜： 1 0, 000, 000単位 / 1 の濃度で存在させることが好ましく、 1 00〜 1， 000， 000単位71の濃 度で存在させることが特に好ましい。
また、 グリセロールキナーゼは、 通常、 0. 0 1〜500， 000単位 1の 濃度で存在させることが好ましく、 1 0〜 1 0, 0 00単位 / 1の濃度で存在さ せることが特に好ましい。
そして、 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼは、 通常、 1〜500， 00 0単位ノ 1の濃度で存在させることが好ましく、 1 00〜50， 000単位 1 の濃度で存在させることが特に好ましい。
なお、 本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等に より異なるものでもある。
よって、 先に記載した各酵素の濃度範囲を外れる酵素濃度 （酵素活性値） だか らといって、 本発明の効果が得られないというものではない。 ③ 酵素以外の物質
この本発明の方法におけるトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素 を生成させる一連の反応において、 前記の酵素以外にも必要な物質があれば存在 させる。
この反応に必要な物質としては、 例えば、 アデノシン三リン酸 （ATP) 若し くはその塩、 マグネシウムイオン、 又は酸化型補酵素等を挙げることができる。 アデノシン三リン酸又はその塩を存在させる濃度は、 通常、 0. 00 1〜50 gZ lが好ましく、 0. 0 1〜； 10 gZ 1が特に好ましい。
マグネシゥムイオンは、 ハロゲンィオン又は有機酸などとの塩の形態のものを 用いればよく、 通常、 0. 00 1〜 10 OmMの濃度で存在させることが好まし く、 0. 0 1〜 5 OmMの濃度で存在させることが特に好ましい。
酸化型補酵素としては、 例えば、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （酸 化型） 〔NAD+ (酸化型） 〕 、 又はニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリ ン酸 （酸化型） 〔NADP+ (酸化型） 〕 等を挙げることができる。
4. 過酸化水素又は還元型補酵素の測定
本発明の定量する方法における、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定 は、 前記の酵素により生成した過酸化水素又は還元型補酵素の量を測定すること ができる方法であればいかなる方法であってもよい。
例えば、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素から、 何かしらのシグナルを導 き出す方法等を挙げることができる。
より具体的には、 過酸化水素の測定においては、 過酸化水素電極等により過酸 化水素自体を測定してもよく、 又は過酸化水素から別のシグナルを導き出し、 こ のシグナルを測定してもよい。
この過酸化水素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、 例えば、 ペルォキシダーゼ （POD) の存在のもとに、 色原体を酸化させ色素を生成させ て、 この生成した色素の吸光度などを測定する、 トリンダー反応系を利用する反 応等を挙げることができる。
ペルォキシダーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒ ト若しくはゥシなどの動物由来のもの、 西洋ヮサビなどの植物由来のもの、 又は 遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルォキシダーゼを存在させる濃度は、 通常、 30単位 Z 1以上とするこ とが好ましい。
トリンダー反応系における色原体としては、 例えば、 4ーァミノアンチピリン とフエノール若しくはその誘導体、 又は 4—ァミノアンチピリンとァニリン誘導 体との組み合わせ等を挙げることができる。
4一ァミノアンチピリンは、 通常、 0. 00 1〜 50 1の濃度で存在させ ることが好ましく、 0. 0 1〜 1 0 1の濃度で存在させることが特に好まし い。
フエノールの誘導体としては、 例えば、 4一クロ口フエノール、 2, 4—ジク ロロフエノール、 2, 4—ジブロモフエノール、 若しくは 2， 4， 6—トリクロ 口フエノール、 又はこれらの塩等を挙げることができる。
ァニリン誘導体としては、 例えば、 N— (2—ヒドロキシー 3 _スルホプロピ ル） 一 3， 5—ジメトキシァニリン （HDAOS) 、 N—スルホプロピル— 3， 5—ジメトキシァニリン （HDAP S) 、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3， 5—ジメ トキシァニリン （DAOS) 、 N—ェチル 一 N—スルホプロピル一 3， 5—ジメ トキシァニリン （DAP S) 、 N—ェチル -N- ( 2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3， 5—ジメトキシ— 4ーフ ルォロア二リン （FDAOS) 、 N—ェチルー N—スルホプロピル— 3， 5—ジ メ トキシ— 4 _フルォロア二リン （FDAP S) 、 N- (2—カルボキシェチ ル） —N—ェチル— 3， 5—ジメ卜キシァ二リン （CEDB) 、 N—ェチルー N 一 （ 2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） — 3—メ 卜キシァニリン （ADO S) 、 N—ェチル— N— （3—スルホプロピル） 一 3—メ トキシァニリン （AD P S) 、 _ェチル_ ^— ( 2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） ァニリン (ALOS) 、 N—ェチル— N— (3—スルホプロピル） ァニリン （ALP S) 、 N— （3—スルホプロピル） ァニリン （HAL P S) 、 N—ェチルー N— (2— ヒドロキシ一 3 _スルホプロピル） 一 3， 5—ジメチルァニリン （MAOS) 、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル） 一 3， 5—ジメチルァニリン （MAP S) 、 N—ェチル— N_ (2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） 一 3—メ卜キ シァニリン （TOOS) 、 N— （2—カルボキシェチル） 一 N—ェチルー 3—メ チルァ二リン （CEMB) 、 若しくは N— (2—カルボキシェチル） — N—エヂ ルー 3—メ トキシァニリン （CEMO) 、 又はこれらの塩等を挙げることができ る。
これらのフエノール若しくはその誘導体、 又はァニリン誘導体は、 通常、 0. 00 1〜50 gZ lの濃度で存在させることが好ましく、 0. 0 1〜 1 0 g の濃度で存在させることが特に好ましい。
また、 還元型補酵素の測定においては、 還元型補酵素自体を 340 nmなどに おける吸光度を測ることなどにより測定してもよく、 又は還元型補酵素から別の シグナルを導き出し、 このシグナルを測定してもよい。
この還元型補酵素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、 例えば， ジァホラ一ゼ又は 1ーメトキシーフエナジンメトサルフエ一トなどの存在のもと に、 テトラゾリゥム塩などを還元させ色素を生成させて、 これを測定する反応等 を挙げることができる。
5. 消去反応
本発明の第 2の方法においては、 第 1段階で、 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる卜リグ リセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生 成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白 及び/又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの消去 (分解） を行う。
また、 本発明の第 3の方法においては、 第 1段階で、 選択的反応促進物質の存 在下、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれ るトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重 リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ 蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドの消去 (分解） を行う。 （但し、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及び中 間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの両方の消去は行わない。 ）
これらの消去 （分解） は、 選択的反応促進物質の存在下、 試料を、 トリグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより行う力 このトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応についての詳細は、 既に記述したとおりである c この消去 （分解） の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素は、 第 2 段階まで持ちこさずに、 第 1段階において消去することが好ましい。
過酸化水素の場合は、 例えば、 カタラーゼ又はペルォキシダーゼ等を存在させ ることにより、 消去 （分解） することができる。
カタラーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト若し くはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法により 調製したもの等を用いることができる。
このカタラーゼを存在させる濃度は、 通常、 1 0 0単位 Z 1以上とすることが 好ましい。
そして、 第 1段階において力夕ラーゼにより生成した過酸化水素を消去した後、 第 2段階においては力タラ一ゼの活性を阻害して働かないようにする必要がある。 これは、 アジ化ナトリウムなどの力タラ一ゼの活性を阻害する物質を、 第 2段 階において存在させることにより、 達成することができる。
また、 ペルォキシダ一ゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のも の、 ヒト若しくはゥシなどの動物由来のもの、 西洋ヮサビなどの植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルォキシダーゼを存在させる濃度は、 通常、 3 0単位ノ 1以上とするこ とが好ましい。
還元型補酵素の場合は、 例えば、 この還元型補酵素を補酵素とする脱水素酵素 を存在させることにより消去 （分解） することができる。 6. 他の物質
本発明の定量する方法においては、 必要に応じて、 更に、 緩衝剤、 他の酵素、 他の酵素の基質、 他の補酵素、 アルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩など の金属イオン若しくはこれを含む塩、 キレート剤、 アルブミンなどのタンパク質、 アジ化ナトリウム、 抗生物質、 若しくは合成抗菌剤などの防腐剤、 糖類若しくは 高分子化合物などの安定化剤、 活性化剤、 ァスコルビン酸ォキシダーゼなどの試 料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質、 賦形剤、 又 は他の試薬成分等を適宜必要に応じて存在させることができる。
本発明の試薬において、 試料と試薬を混合して定量を行う際の PHは、 pH5 〜 1 0の範囲であることが好ましく、 pH5. 5〜9. 0の範囲であることが特 に好ましい。
定量を第 1段階及び第 2段階より行うときは、 第 2段階の p Hが前記の p Hの 範囲となるように、 第 1段階の pHを設定してもよい。
緩衝剤を存在させる場合は、 定量を行う際の p Hが前記の pHの範囲となるよ うな緩衝剤を存在させることが好ましい。
例えば、 MES、 B i s— T r i s、 B i s— T r i sプロパン、 ADA、 P I PE S、 ACE S, O P S O , MOP S、 BE S、 TE S、 HEPES、 D I P SO, TAP SO, P〇P S〇、 HEPE S、 HEP P SO、 E P P S、 T r i c i n e、 B i c i n e、 TAP S, CHE S、 リン酸、 リン酸塩、 ホウ酸、 ホウ酸塩、 グリシン、 グリシルグリシン、 イミ ·ダゾ一ル、 又はトリス （ヒドロキ シメチル） ァミノメタン 〔T r i s〕 等を挙げることができる。
5. 定量する方法の手順
本発明の定量する方法は、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含 まれるトリグリセライ ドの定量を行おうとする試料に、 選択的反応促進物質の存 在下、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反 応を触媒する酵素を作用させ、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行 うものである。
この本発明の方法の定量操作は、 一段階のみにて行う方法 （ 1ステップ法、 1 試薬系） で実施してもよく、 又は二段階等の複数段階により行う方法 （多ステツ プ法、 多試薬系） で実施してもよい。
定量反応の開始方法は基質若しくは定量反応に必須な物質を加えることにより 行う方法、 又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよい。 定量操作時の温度は、 3 0 ° (：、 又は 3 7 °C等定量反応が進行し、 かつ定量反応 に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、 又は変質しない範囲内の温度を設定 すればよい。
また、 本発明の方法において、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定は、 反応速度法 （レート法） 、 又は終点法 （エンドポイント法） 等のいずれの方法に よるものでもよい。
生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定において、 吸光度等の測定により これを行う場合、 測定波長は測定する物質に応じて、 紫外部、 可視部、 又は赤外 部の適当な波長を使用すればよい。
なお、 吸光度等の測定は、 一波長のみの測定でもよく、 又は二波長による測定 でもよい。
本発明の方法において、 定量の手法は用手法、 又は自動分析装置などの装置に よる方法のいずれをも用いることができる。
この装置としては、 例えば、 臨床検査用の自動分析装置等を挙げることができ る。
この臨床検査用の自動分析装置の例として、 コンティ二ユアスフロー式若しく はフロ一^ rンジェクション式などのフロ一方式の自動分析装置、 クローズドタイ プ 'バッチ式、 オープンタイプ 'バッチ式、 パック式若しくは遠心式などのディ スクリート方式の自動分析装置、 又はフィルム式、 若しくは試験片式などのドラ ィケミストリ一方式の自動分析装置等を挙げることができる。
装置により定量を行う手順の一例を以下に示す。
まず、 本発明の定量する試薬を、 使用する装置に適合した容器に入れる。
この試薬が入った容器を装置の所定の位置に置く。
また、 定量を行う試料も測定装置に適合した容器に入れ、 所定の位置に置く。 装置が臨床検査用の自動分析装置の場合は、 使用する試薬、 及び定量を行おう とする試料等についての定量条件 （定量パラメ一夕） 等を装置に入力し、 設定す る。
そして、 定量を開始する。
通常は、 試料と試薬のそれぞれをピペッ ト （プローブ） 又はチューブ等で反応 セル （反応キュベッ ト） に分注し、 混合、 接触させ、 温度一定の条件下に保つ。 そして、 この反応セル （反応キュべッ ト） 内の試料と試薬との反応液について、 規定波長の吸光度を定められた時間に測定する。
また、 例えば、 試薬が第 1試薬と第 2試薬の 2試薬からなる場合は、 まず、 試 料と試薬の第 1試薬のそれぞれをピペッ ト （プローブ） 、 又はチューブ等で反応 セル （反応キュベット） に分注し、 混合、 接触させ、 温度一定の条件下に保つ。 次に、 この反応セル （反応キュベッ ト） 内の反応液に、 試薬の第 2試薬をピぺ ッ ト （プローブ） 又はチューブ等で分注し、 混合、 接触させて、 温度一定の条件 下に保つ。
そして、 この反応セル （反応キュベッ ト） 内の試料と試薬の第 1試薬及び第 2 試薬との反応液について、 規定波長の吸光度を定められた時間に測定する。
ここで得られた吸光度と濃度既知のトリグリセライ ド試料 （標準液） の吸光度 〔検量線〕 を比較することにより、 試料中の超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比 重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの濃度を算出して得る。
Π . 定量する試薬
1 . 定量する試薬 ·総論
本発明の試料中の超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜 リグリセライ ドを選択的に定量するための試薬は、 （i)選択的反応促進物質、 及 び（i i) トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反 応を触媒する酵素を含有するものである。
この本発明の試薬において、 選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白及び Z 又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量するためのも のである。 2 . 試薬の態様
① 態様一 1 〔本発明の第 1の試薬〕
本発明の試薬の態様の一つは、 前記本発明の試薬において含有させる選択的反 応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生 成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。 （本発明の第 1の なお、 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなるとき、 選択的反応促進物質は、 第 1試薬に含有させてもよく、 第 2試薬に含有させてもよく、 又は第 1試薬及び第 2試薬に含有させてもよい。 いずれの場合も、 同様の効果を得ることができる。 また、 複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、 同時に含有させて使用 することもできる。
② 態様一 2 〔本発明の第 2の試薬〕
また、 本発明の試薬の態様の別なものとして、 以下の試薬を挙げることができ る。
前記本発明の試薬において、 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬 に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Ζ又は中間比重リポ 蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ド より過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応 させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋 白に含まれるトリグリセライドを消去 （分解） するものである。 （本発明の第 2 の試薬）
なお、 第 2試薬において、 第 1試薬に含有させた選択的反応促進物質とともに この選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を含有させてもよい。 この場合、 第 2試薬に含有させる、 第 1試薬に含有させた選択的反応促進物質 とは異なる選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白及び Ζ又は中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである ことが好ましい。
③ 態様一 3 〔本発明の第 3の試薬〕
更に、 本発明の試薬の態様の他のものとして、 以下の試薬を挙げることができ る。
前記本発明の試薬において、 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬 に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リボ蛋白、 力 イロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少な くとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に、 トリグリセライ ドょり過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反 応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる 前記トリグリセライ ドを消去 （分解） するものである。 （但し、 超低比重リポ蛋 白に含まれる卜リグリセライ ド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの両方の消去は行わない。 ）
そして、 第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 残存するトリダリセラ ィ ドのうち超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセ ライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成さ せる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである。 （本発明の第 3の試 薬）
この際、 第 1試薬において含有させる選択的反応促進物質と、 第 2試薬におい て含有させる選択的反応促進物質は、 下記の Π ) 〜 （i i i ) の組み合わせより選 択することもできる。
( i )
第 1試薬：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リボ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質。
第 2試薬：
第 1試薬において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質。
( i i)
第 1試薬：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記卜リグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質。 第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質。
( i i i )
1試桌： カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記卜リグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質。
- δ式 ：
第 1試薬において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Ζ又は高比重リポ蛋白に含まれるトリダリセライ ド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質。
3 . トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 を触媒する酵素
① トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 本発明の試薬における、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応は、 卜リグリセライ ドが存在することにより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させることができる反応であれば、 どのようなものでもよ く、 一つの反応からなるものでもよく、 また、 複数の反応からなるものであって もよい。
このような反応としては、 例えば、 試料中のリポ蛋白の卜リグリセライ ドにリ ポプロティンリパーゼを作用させ、 このトリグリセライ ドを 1分子のグリセロー ルと 3分子の脂肪酸に分解し、 その後このグリセロールとアデノシン三リン酸 ( A T Ρ ) をグリセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール一 3—リン酸 とアデノシン二リン酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセロール一 3—リン酸を グリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトン 一 3—リン酸に変えるとともに過酸化水素を生じさせる、 一連の反応を挙げるこ とができる。
また、 他の例として、 試料中のリポ蛋白の卜リグリセライ ドにリポプロテイン リパーゼを作用させ、 この卜リグリセライ ドを 1分子のグリセロールと 3分子の 脂肪酸に分解し、 その後このグリセロールとアデノシン三リン酸 （A T P ) をグ リセロールキナーゼの触媒作用によりグリセロール一 3—リン酸とアデノシン二 リン酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセロール一 3—リン酸をニコチンアミ ド アデニンジヌクレオチド （酸化型） 〔N A D +〕 の存在下、 グリセ口一ルー 3— リン酸デヒドロゲナ一ゼの触媒作用によりジヒドロキシァセトン— 3—リン酸に 変えるとともにニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （還元型） 〔N A D H〕 を生じさせる、 一連の反応等をも挙げることができる。
なお、 前記のグリセロールキナーゼを用いる反応においては、 グリセロールが 試料に含まれると定量値に正の誤差が生じる場合があるので、 これを防ぐため、 予め、 試料に含まれるグリセロールに、 グリセロールキナーゼ及びグリセロール — 3—リン酸ォキシダーゼ、 更に力夕ラーゼ又は等を作用させて、 このグリセ口 ールを消去する一連の反応を行わせてもよい。
ここで、 カタラーゼを用いるとき、 消去反応終了後卜リグリセライ ドの定量を 行う際には、 アジ化ナ卜リゥムなどの力夕ラーゼの活性を阻害する物質等を第 2 試薬に含有させて、 生成した過酸化水素が力夕ラーゼにより消去 （分解） されな いようにする必要がある。
なお、 還元型補酵素としては、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （還元 型） 〔N A D H (還元型） 〕 、 又はニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン 酸 （還元型） [ N A D P H (還元型） 〕 等を挙げることができる。
② 酵素
本発明の試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応を触媒する酵素は、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒するものであればいかなるものでも よいが、 例えば、 リポプロテインリパーゼ及びグリセロールキナーゼ、 更にグリ セロール— 3—リン酸ォキシダーゼ又はグリセ口一ルー 3—リン酸デヒドロゲナ —ゼ等を挙げることができる。
これらの酵素は、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト若 しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法によ り調製したもの等を用いることができる。
これらの酵素を試薬に含有させる濃度であるが、 酵素の種類及び由来、 選択的 反応促進物質の種類、 又は第 1試薬と第 2試薬の混合比率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した濃度で含有させればよい。
なお、 通常、 リポプロテインリパーゼは、 1〜 1 0, 000, 000単位ノ 1 の濃度で含有させることが好ましく、 1 00〜 1， 00 0， 000単位ノ 1の濃 度で含有させることが特に好ましい。
また、 グリセロールキナーゼは、 通常、 0. 0 1〜500, 000単位71の 濃度で含有させることが好ましく、 1 0〜 1 0， 000単位 Z 1の濃度で含有さ せることが特に好ましい。
そして、 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼは、 通常、 1〜500, 00 0単位ノ 1の濃度で含有させることが好ましく、 1 00〜50， 000単位ノ 1 の濃度で含有させることが特に好ましい。
なお、 本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等に より異なるものでもある。
よって、 先に記載した各酵素の濃度範囲を外れる酵素濃度 （酵素活性値） だか らといって、 本発明の効果が得られないというものではない。
③ 酵素以外の物質
この本発明の試薬において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応における、 前記の酵素以外にも必要な物質があれば含 有させる。
この反応に必要な物質としては、 例えば、 アデノシン三リン酸 （ATP) 若し くはその塩、 マグネシウムイオン、 又は酸化型補酵素等を挙げることができる。 アデノシン三リン酸又はその塩を含有させる濃度は、 通常、 0. 00 1〜50 gZ lが好ましく、 0. 0 1〜 1 0 gZ 1が特に好ましい。
マグネシウムイオンは、 ハロゲンイオン又は有機酸などとの塩の形態のものを 用いればよく、 通常、 0. 00 1〜 1 0 OmMの濃度で含有させることが好まし く、 0. 0 1〜5 OmMの濃度で含有させることが特に好ましい。
酸化型補酵素としては、 例えば、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （酸 化型） 〔NAD+ (酸化型） 〕 、 又はニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリ ン酸 （酸化型） 〔NADP+ (酸化型） 〕 等を挙げることができる。
4. 過酸化水素又は還元型補酵素の測定
本発明の定量する試薬においては、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測 定は、 前記の酵素により生成した過酸化水素又は還元型補酵素の量を測定するこ とができる方法であればいかなる方法を用いたものであってもよい。
例えば、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素から、 何かしらのシグナルを導 き出す方法等を挙げることができる。
より具体的には、 過酸化水素の測定においては、 過酸化水素電極等により過酸 化水素自体を測定してもよく、 又は過酸化水素から別のシグナルを導き出し、 こ のシグナルを測定してもよい。
この過酸化水素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、 例えば、 ペルォキシダーゼ （POD) の存在のもとに、 色原体を酸化させ色素を生成させ て、 この生成した色素の吸光度などを測定する、 トリンダー反応系を利用する反 応等を挙げることができる。
また、 還元型補酵素の測定においては、 還元型補酵素自体を 340 nmなどに おける吸光度を測ることなどにより測定してもよく、 又は還元型補酵素から別の シグナルを導き出し、 このシグナルを測定してもよい。
この還元型補酵素から別のシグナルを導き出し測定する方法としては、 例えば、 ジァホラーゼ又は 1ーメ トキシーフエナジンメ トサルフエ一卜などの存在のもと に、 テ卜ラゾリゥム塩などを還元させ色素を生成させて， これを測定する反応等 を挙げることができる。
5 . 消去反応
本発明の第 2の試薬においては、 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1 試薬に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重 リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセラ ィ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と 反応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白以外のリ ポ蛋白に含まれる卜リグリセライドを消去 （分解） するものである。
また、 本発明の第 3の試薬においては、 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ 蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ば れる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 卜リグ リセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する 酵素と反応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミ クロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に 含まれる前記トリグリセライ ドを消去 （分解） するものである。 （但し、 超低比 重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライ ドの両方の消去は行わない。 ）
これらの消去 （分解） は、 第 1試薬に含有させた選択的反応促進物質の存在下、 試料を、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素と反応させることにより行う力 このトリダリセライ ドより 過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応についての詳細は、 既に記 述したとおりである。
この消去 （分解） の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素は、 試料 と第 1試薬を混合し反応させる第 1段階において消去して、 更に第 2試薬を混合 させる第 2段階まで持ちこさないことが好ましい。
過酸化水素の場合は、 例えば、 力夕ラーゼ又はペルォキシダーゼ等を第 1試薬 に含有させることにより、 第 1段階で発生した過酸化水素を消去 （分解） するこ とができる。
力夕ラーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト若し くはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法により 調製したもの等を用いることができる。
この力夕ラーゼを含有させる濃度は、 通常、 1 0 0単位 / 1以上とすることが 好ましい。
そして、 第 1段階において力夕ラーゼにより生成した過酸化水素を消去した後、 第 2段階においては力夕ラーゼの活性を阻害して働かないようにする必要がある これは、 アジ化ナトリウムなどの力夕ラーゼの活性を阻害する物質を、 第 2試 薬に含有させること等により、 達成することができる。
また、 ペルォキシダーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のも の、 ヒト若しくはゥシなどの動物由来のもの、 西洋ヮサビなどの植物由来のもの、 又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルォキシダーゼを含有させる濃度は、 通常、 3 0単位 / 1以上とするこ とが好ましい。
還元型補酵素の場合は、 例えば、 この還元型補酵素を補酵素とする脱水素酵素 を第 1試薬に含有させること等により消去 （分解） することができる。
6 . 試薬の組成
本発明の定量する試薬は、 （i)選択的反応促進物質、 及び（i i) トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含 有するものである。
本発明の試薬においては、 前記の酵素によるトリグリセライ ドより過酸化水素 又は還元型補酵素を生成させる一連の反応に必要な物質をも含有させる。
この反応に必要な物質として、 ペルォキシダーゼ （P O D ) 、 トリンダー反応 系における色原体、 還元型補酵素、 又は緩衝剤等を例示することができる。
ペルォキシダーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒ ト若しくはゥシなどの動物由来のもの、 西洋ヮサビなどの植物由来のもの、 又は 遺伝子組み換え法により調製したもの等を用いることができる。 このペルォキシダーゼを含有させる濃度は、 通常、 30単位 Z 1以上とするこ とが好ましい。
トリンダー反応系における色原体としては、 例えば、 4ーァミノアンチピリン とフエノール若しくはその誘導体、 又は 4—ァミノアンチピリンとァニリン誘導 体との組み合わせ等を挙げることができる。
4一ァミノアンチピリンは、 通常、 0. 00 1〜 50 gZ 1の濃度で含有させ ることが好ましく、 0. 0 1〜 1 0 1の濃度で含有させることが特に好まし い。
フエノールの誘導体としては、 例えば、 4—クロ口フエノール、 2, 4—ジク ロロフエノール、 2， 4一ジブロモフエノール、 若しくは 2， 4, 6—トリクロ 口フエノール、 又はこれらの塩等を挙げることができる。
ァニリン誘導体としては、 例えば、 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピ ル） 一 3， 5—ジメ トキシァニリン （HDAOS) 、 N—スルホプロピル一 3，
5—ジメトキシァニリン （HDAP S) 、 N—ェチル一 N— （2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） — 3， 5—ジメトキシァニリン （DAOS) 、 N—ェチル —N—スルホプロピル一 3， 5—ジメトキシァニリン （DAP S) 、 N—ェチル -N- ( 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ 卜キシー 4ーフ ルォロア二リン （FDAOS) 、 N—ェチル—N—スルホプロピル一 3 , 5—ジ メ トキシ— 4—フルォロア二リン （FDAP S) 、 N- (2—カルボキシェチ ル） —N—ェチルー 3， 5—ジメトキシァニリン （CEDB) 、 N—ェチルー N 一 （ 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） _ 3—メ トキシァニリン （ADO S) 、 N—ェチル _N— （3—スルホプロピル） 一 3—メ トキシァニリン （AD P S) 、 N—ェチル— N— （ 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） ァニリン
(ALOS) 、 N—ェチル— N— (3—スルホプロピル） ァニリン （ALP S) 、 N— （3—スルホプロピル） ァニリン （HALP S) 、 N—ェチル— N— （2— ヒドロキシー 3—スルホプロピル） — 3, 5—ジメチルァニリン （MAOS) 、 N—ェチルー N— （3—スルホプロピル） — 3， 5—ジメチルァニリン （MAP S) 、 N—ェチルー N_ ( 2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） 一 3—メ 卜キ シァニリン （TOOS) 、 N- (2—カルボキシェチル） 一 N—ェチルー 3—メ チルァ二リン （CEMB) 、 若しくは N— （2—カルボキシェチル） 一 N—ェチ ルー 3—メ トキシァニリン （CEMO) 、 又はこれらの塩等を挙げることができ る。
これらのフエノール若しくはその誘導体、 又はァニリン誘導体は、 通常、 0. 00 1〜50 gZ 1の濃度で含有させることが好ましく、 0. 0 1〜 1 0 ノ 1 の濃度で含有させることが特に好ましい。
本発明の試薬において、 試料と試薬を混合して定量を行う際の PHは、 pH5 〜 1 0の範囲であることが好ましく、 pH5. 5〜9. 0の範囲であることが特 に好ましい。
試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなるときは、 試料と第 1試薬を混合し、 更に 第 2試薬を混合した後の p Hが前記の p Hの範囲となるように、 第 1試薬及び第 2試薬の pHを設定してもよい。
緩衝剤を含有させる場合は、 定量を行う際の p Hが前記の pHの範囲となるよ うな緩衝剤を含有させることが好ましい。
例えば、 MES、 B i s— T r i s、 B i s— T r i sプロパン、 ADA、 P I PE S、 ACE S, MOP SO, MOP S, BE S、 TE S、 HE PE S、 D I P SO, TAP SO、 P〇P S〇、 HEPE S、 HEPP S〇、 E PP S、 T r i c i n e、 B i c i n e、 TAP S, CHE S、 リン酸、 リン酸塩、 ホウ酸、 ホウ酸塩、 グリシン、 グリシルグリシン、 イミダゾ一ル、 又はトリス （ヒドロキ シメチル） ァミノメタン 〔T r i s〕 等を挙げることができる。
本発明の試薬には、 更に、 他の酵素、 他の酵素の基質、 他の補酵素、 アルカリ 金属塩若しくはアル力リ土類金属塩などの金属イオン若しくはこれを含む塩、 キ レート剤、 アルブミンなどのタンパク質、 アジ化ナトリウム、 抗生物質、 若しく は合成抗菌剤などの防腐剤、 糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、 活性化 剤、 ァスコルビン酸ォキシダーゼなどの試料中に含まれる測定妨害物質の消去若 しくは影響抑制に関わる物質、 陚形剤、 又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて 含有させることができる。 本発明の試薬は、 1試薬のものでもよいが、 要に応じて 2試薬以上;こ試薬成 分を含有させて構成してもよい。
ΙΠ . 本発明の方法及び試薬に共通する事項
1 . 被検試料
本発明の方法及び試薬において、 被検試料は、 超低比重リポ蛋白及び/又は中 間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドが存在する可能性があり、 超低比重 リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ドの定量を行お うとするものであれば、 どのようなものでもよい。
この被検試料としては、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロ ン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種 を含む可能性のあるものが好ましい。
特に、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リボ蛋白を含む可能性のあるもの が好ましい。
このようなものの例として、 ヒ卜又は動物の血液、 血清、 血漿等の体液； ヒト 若しくは動物の臓器又は筋肉等の抽出液； ヒト又は動物の糞便の抽出液；細胞又 は菌体の抽出液； あるいは植物の抽出液等を挙げることができる。
2 . リポ蛋白
本明細書において、 リポ蛋白としては、 主要な、 カイロミクロン、 超低比重リ ポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白について記載 している。
しかしながら、 厳密には、 これらの主要な 5種類のリポ蛋白以外のリポ蛋白も 存在する。
よって、 本明細書において、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドは、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白以外 のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドと同義とする。
また、 中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドは、 超低比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれ るトリグリセライ ドと同義とする。 そして、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド は、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含 まれるトリグリセライ ドと同義とする。
3 . 選択的反応促進物質
① 選択的反応促進物質
本発明の方法及び試薬において、 選択的反応促進物質は、 試料中の超低比重リ ポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量 するためのものである。
② 選択的反応促進物質の例示
この本発明の方法及び試薬における選択的反応促進物質の例として、 次の a ) 〜 i ) のものを挙げる。
a ) 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる 一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
b ) 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドは消去される。
c ) 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれ るトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
これにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重 リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記ト リグリセライ ドは消去される。
(但し、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及び中間比重リポ蛋白 に含まれるトリグリセライ ドの両方の消去は行わないもの。 ） d ) カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ば れる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグ リセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する 酵素と反応させるもの。
これにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群 から選ばれるリボ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドが消去される。
e ) 前記 d ) の消去処理において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミク ロン、 低比重リポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライド、 並びに超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記の卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。
f ) カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ば れる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水 素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。 これにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群 から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれる前記トリグリセライ ドは消去される。
g ) 前記 f ) の消去処理において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミク ロン、 低比重リポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては中間 比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸 化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるも の。
h ) カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ば れる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重リ ポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水 素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるもの。 これにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群 から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリダリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれる前記卜リグリセライ ドは消去される。
i ) 前記 h ) の消去処理において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミク ロン、 低比重リポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては超低 比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸 化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応ざせるも の。
③ 選択的反応促進物質の反応促進性によるタイプ分け
選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロ ミクロン （以下、 場合により 「C M」 という。 ） 、 低比重リポ蛋白、 又は高比重 リポ蛋白の各リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド力 トリグリセライ ドより過 酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応する場 合、 各々のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを前記酵素と反応させることが できる選択的反応促進物質のタイプを表 1に示した。
表 1 各タイプ可溶化剤の各種リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドとの反応性 のパターン 〔計 3 1通り〕
I - 「 1種類のリポ蛋白と反応の場合」 （5通り ； 1〜5 )
タイプ C M V L D L I P L L P L H D L
1 C M
2 V L D L
3 I D L
4 L D L
5 H D L Π. 「2種類のリポ蛋白と反応の場合」 （ 1 0通り ； 6〜 1 5 ) タイプ CAl VLDL I— D L LD L — HDL .
6 CM VLDL
7 CM I D L
8 CM LDL
9 CM HDL
1 0 VLDL I D L
1 1 VLDL LD L
1 2 VLDL HDL 1 3 I D L LD L
1 4 I D L HDL 1 0 LD L HDL
ΙΠ. 「3種類のリポ蛋白と反応の場合」 （1 0通り ； 1 6〜 2 5 タイプ CM VLDL I DL _ LDL — HDL —
1 6 CM VLDL I D L
1 7 CM VLDL LD L
1 8 CM VLDL HDL 1 9 CM I D L LD L
2 0 CM I D L HD L 2 1 CM LD L HDL 2 2 VLDL I D L LD L
2 3 VLDL I D L HDL 2 4 VLDL LDL HDL 2 5 I D L LD L HD L IV. 「4種類のリポ蛋白と反応の場合」 （5通り ； 26〜30)
タイプ CM VLDL I DL LDL HDL
26 CM VLD L I D L LD L
27 C M VLDL I D L HDL
28 CM VLDL LDL HD L
29 CM I D L LDL HDL
30 VLDL I D L LDL HD L
V. 「 5種類のリボ蛋白と反応の場合」 (1通り ； 3 1)
タイプ CM VLDL ■ I D L LDL HDL
3 1 CM VLDL I D L LDL HDL この表より分かるように、 反応促進性により分類した選択的反応促進物質の夕 ィプは、 タイプ 1〜タイプ 3 1までの 3 1通りである。
④ 各タイプ選択的反応促進物質の使用方法
本発明の方法 （又は試薬） において、 前記③の表 1でタイプ分けした選択的反 応促進物質を、 どのように使用することができるかについて、 以下説明する。 a) 本発明の第 1の方法 （又は第 1の試薬） の場合
前記の本発明の第 1の方法 （又は第 1の試薬） の場合、 超低比重リポ蛋白及び 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 表 1における タイプ 1 0の選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させればよい。
また、 超低比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを定量するのには、 タイ プ 2の選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させればよい。
そして、 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 夕 イブ 3の選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させればよい。
なお、 これらの場合、 定量を第 1段階と第 2段階の 2段階に分けて行うとき、 前記の選択的反応促進物質は、 第 1段階に存在させてもよく、 第 2段階に存在さ せてもよく、 又は第 1段階及び第 2段階に存在させてもよい。 いずれの場合も、 同様の効果を得ることができる。
同様に、 定量の試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなるとき、 前記の選択的反応 促進物質は、 第 1試薬に含有させてもよく、 第 2試薬に存在させてもよく、 又は 第 1試薬及び第 2試薬に含有させてもよい。 いずれの場合も、 同様の効果を得る ことができる。
また、 複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、 同時に存在 （又は含 有） させて使用することもできる。
例えば、 表 1のタイプ 2の選択的反応促進物質とタイプ 3の選択的反応促進物 質を組み合わせて存在 （又は含有） させることにより、 タイプ 1 0の選択的反応 促進物質を存在 （又は含有） させるのと、 同様の効果を得ることができる。
そして、 例えば、 タイプ 1 0の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、 タイプ 1 0の選択的反応促進物質とともに、 タイプ 2の選択的反応促進物質及び Z又はタイプ 3の選択的反応促進物質を加えて存在 （又は含有） させてもよい。 b ) 本発明の第 2の方法 （又は第 2の試薬） の場合
前記の本発明の第 2の方法 （又は第 2の試薬） の場合、 超低比重リポ蛋白及び 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを定量するのには、 第 1段階 （又 は第 1試薬） において、 表 1 におけるタイプ 2 1の選択的反応促進物質を存在 (又は含有） させればよい。
また、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1 段階 （又は第 1試薬） において、 タイプ 2 9の選択的反応促進物質を存在 （又は 含有） させればよい。
そして、 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1段階 （又は第 1試薬） において、 タイプ 2 8の選択的反応促進物質を存在 （又 は含有） させればよい。
また、 第 2段階 （又は第 2試薬） において、 第 1段階 （又は第 1試薬） に存在 (又は含有） させた選択的反応促進物質とともにこの選択的反応促進物質とは異 なる選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させてもよいが、 この場合の、 選択 的反応促進物質の組み合わせの一例を以下に記載する。 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量す るのには、 第 1段階 （又は第 1試薬） においてタイプ 2 1の選択的反応促進物質 を存在 （又は含有） させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） においてタイプ 1 0の選択 的反応促進物質を存在 （又は含有） させればよい。
この場合、 第 1段階 （又は試料と第 1試薬の混合後） においてはタイプ 2 1の 選択的反応促進物質の存在下、 カイロミクロンに含まれているトリグリセライ ド、 低比重リポ蛋白に含まれている卜リグリセライ ド、 及び高比重リポ蛋白に含まれ ている卜リグリセライ ドが、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素 を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応し、 消去される。
ここで消去されずに残存する超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライ ド、 及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライ ドを、 第 2段階 （又は 第 2試薬の添加後） において、 タイプ 1 0の選択的反応促進物質の存在下、 トリ グリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒す る酵素と反応させ、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う。
また、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1 段階 （又は第 1試薬） においてタイプ 2 1の選択的反応促進物質を存在 （又は含 有） させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） においてタイプ 2の選択的反応促進物質を 存在 （又は含有） させればよい。 あるいは、 第 1段階 （又は第 1試薬） において タイプ 2 9の選択的反応促進物質を存在させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） におい てタイプ 2及び Z又はタイプ 1 0の選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させ ればよい。
そして、 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1段階 （又は第 1試薬） においてタイプ 2 1の選択的反応促進物質を存在 （又は 含有） させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） においてタイプ 3の選択的反応促進物質 を存在 （又は含有） させればよい。 あるいは、 第 1段階 （又は第 1試薬） におい てタイプ 2 8の選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） においてタイプ 3及び/又はタイプ 1 0の選択的反応促進物質を存在 (又は含有） させればよい。 また、 複数種類の選択的反応促進物質を組み合わせて、 同時に存在 （又は含 有） させて使用することもできる。
例えば、 表 1のタイプ 1の選択的反応促進物質とタイプ 1 5の選択的反応促進 物質を組み合わせて存在 （又は含有） させることにより、 タイプ 2 1の選択的反 応促進物質を存在 （又は含有） させるのと、 同様の効果を得ることができる。 そして、 例えば、 タイプ 2 8の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、 タイプ 2 8の選択的反応促進物質とともに、 タイプ 1の選択的反応促進物質及び /又はタイプ 1 5の選択的反応促進物質等を加えて存在 （又は含有） させてもよ い。
c ) 本発明の第 3の方法 （又は第 3の試薬） の場合
前記の本発明の第 3の方法 （又は第 3の試薬） の場合、 超低比重リポ蛋白及び 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1段階に存 在させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質と第 2段階に存在させる
(第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質を、 表 2に示したタイプの組み合 わせで存在 （又は含有） させればよい。
すなわち、 この表において、 「〇」 で示された欄における、 「第 1段階に存在 させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 と 「第 2段階に 存在させる （第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 の組み合わ せで存在 （又は含有） させればよい。
なお、 この表において、 1〜3 1までの選択的反応促進物質の夕イブを示した 欄に記載した文字は、 そのタイプの選択的反応促進物質が反応を促進するトリグ リセライ ドを含むリポ蛋白の種類を表す。 すなわち、 「V」 は超低比重リポ蛋白
( V L D L ) を、 「 I」 は中間比重リポ蛋白 （ I D L ) を、 「C」 はカイロミク ロンを、 「L」 は低比重リポ蛋白 （L D L ) を、 そして 「H」 は高比重リポ蛋白
(H D D を表す （以下の表 3及び表 4においても同じ。 ） 。 表 2 第 1段階に存在させる 〔第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ
第段階存在にせ轼蘂含第有せ選択的るに 2さ反応進物 Sさる促の 2イタ
1 2 3 4 5 6 7 8 θ 10 11 12 13 14 1 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
(c) (V) a) (し） (H) (CV) (C!) (CD (CH) (VI) (VU鶴 ίΐϋ OH) (LH) (CVI) (CVL) (CVH) (CIL) (CIH) (CLH) (VIL) (V)H) (VLH) (1LH) (CVIL) (CVIH) (CVLH) (CILH) (VILH) (CV1LH)
(c)
2 (V)
3 (I)
4 (L)
5 (H)
g (CV)
7 (CI)
o D
a u n
i n u 〇 〇 〇 〇 〇
10 (VH)
1 Q (IL)
id (IH)
15 (LH)
16 (CVI) 〇 〇 〇 〇
17 (CVL)
18 (CVH)
19 (GIL)
20 (CIH)
21 (CLH)
22 (VIL) 〇 〇 o 〇
23 (VIH) 〇 〇 o o
24 (VLH)
25 OLH)
26 (CVIL) 〇 o
27 (CVIH) 〇 o
28 (CVLH)
29 (C1LH)
30 (V H) o o
31 (CV1LH) o
冽えば、 第 1段階 （又は第 1試薬） においてタイプ 9の選択的反応促進物質を 存在 （又は含有） させ、 第 2段階 （又は第 2試薬） においてタイプ 2 7の選択的 反応促進物質を存在 （又は含有） させて定量を行う場合、 第 1段階 （又は試料と 第 1試薬の混合後） においてはタイプ 9の選択的反応促進物質の存在下、 カイロ ミクロンに含まれているトリグリセライ ド、 及び高比重リポ蛋白に含まれている トリグリセライ ドが、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と反応し、 消去される。
ここでは、 超低比重リポ蛋白に含まれているトリダリセライ ド、 中間比重リポ 蛋白に含まれている卜リグリセライ ド、 及び低比重リポ蛋白に含まれている卜リ グリセライドが消去されずに残存する。
第 2段階 （又は第 2試薬の添加後） において、 タイプ 2 7の選択的反応促進物 質の存在下、 超低比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライ ド、 及び中間比重 リポ蛋白に含まれている卜リグリセライ ドを、 卜リグリセライ ドより過酸化水素 又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 生成する 過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う。
なお、 この第 2段階 （第 2試薬） において存在 （又は含有） させるタイプ 2 7 の選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白に含まれているトリダリセライ ド、 及び中間比重リポ蛋白に含まれているトリグリセライ ドだけではなく、 カイロミ クロンに含まれているトリグリセライ ド、 及び高比重リポ蛋白に含まれている卜 リグリセライ ドも前記酵素と反応させることができるものであるが、 第 1段階 (又は試料と第 1試薬の添加後） においてタイプ 9の選択的反応促進物質の存在 下、 カイロミクロンに含まれているトリダリセライ ド、 及び高比重リポ蛋白に含 まれているトリグリセライ ドは既に消去され存在しないので、 第 2段階 （又は第 2試薬添加後） でタイプ 2 7の選択的反応促進物質を存在させても、 カイロミク ロンに含まれているトリグリセライ ド、 及び高比重リポ蛋白に含まれているトリ グリセライ ドを測り込んでしまうことはなく、 超低比重リポ蛋白に含まれている リグリセライド、 及び中間比重リポ蛋白に含まれている卜リグリセライ ドだけ を定量することができる。 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量するのには、 第 1段階に 存在させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質と第 2段階に存在させ る （第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質を、 表 3に示したタイプの組み 合わせで存在 （又は含有） させればよい。
すなわち、 この表において、 「〇」 で示された欄における、 「第 1段階に存在 させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 と 「第 2段階に 存在させる （第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 の組み合わ せで存在 （又は含有） させればよい。
表 3
第段階存在にせ試 (第薬含せに有 S択さる的応促進 2る反物 » 2さ<のプイタ 第 1段階に存在させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ
Figure imgf000051_0001
そして、 中間比重リポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ドを定量するのには、 第
1段階に存在させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質と第 2段階に 存在させる （第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質を、 表 4に示したタイ プの組み合わせで存在 （又は含有） させればよい。
すなわち、 この表において、 「〇」 で示された欄における、 「第 1段階に存在 させる （第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 と 「第 2段階に 存在させる （第 2試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ」 の組み合わ せで存在 （又は含有） させればよい。
表 4 階在第段存せ試含に (第薬に有せ Sる択的進 2さる反応促物 2さ賃のプタイ 第 1段階に存在させる (第 1試薬に含有させる） 選択的反応促進物質のタイプ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
(C) (V) (I) (U (H) (cv) (CI) (CU (CH) (V!) (VU (VH) (IU (IH) (LH) (CM) (CVL) (CVH) (GIL) (CIH) (CLH) ( IU (VIH) (VLH) (ILH) (CVIU (CVIH) (CVLH) (CILH) (VILH) (CVILH) t (C)
2 (V)
3 (I) 〇 〇 〇 〇 O 〇 〇 〇 〇 〇 o 〇 〇
4 CU
5 (H)
6 (CV)
7 (CI) 〇 〇 O 〇 〇 〇 〇 〇
8 (CL)
9 CCH)
10 (VI) 〇 〇 O O o o o
11 (VU
12 (VH)
13 (IU 〇 O 〇 〇 o 〇 o o
14 (1H) 〇 o 〇 〇 〇 〇 〇 〇
15 (LH)
16 (CVI) 〇 o 〇 〇
17 (CVU
18 (CVH)
19 (CIL) 〇 〇 〇 o
20 (CIH) o o U Ό
21 (CLH)
22 (VIU 〇 o 〇 〇
23 (V1H) 〇 〇 o 〇
24 (VLH)
25 (ILH) o o 〇 〇
26 (CVIL) o O
27 (CVIH) 〇 〇
28 (CVLH)
29 (C!LH) 〇 O
30 (VILH) o O
31 (CV!LH) 〇
P TJP 211 以上の本発明の第 3の方法 （又は第 3の試薬） においても、 複数種類の選択的 反応促進物質を組み合わせて、 同時に存在 （又は含有） させて使用することもで さる。
例えば、 表 1のタイプ 4の選択的反応促進物質とタイプ 5の選択的反応促進物 質を組み合わせて存在 （又は含有） させることにより、 タイプ 1 5の選択的反応 促進物質を存在 （又は含有） させるのと、 同様の効果を得ることができる。
そして、 例えば、 タイプ 28の選択的反応促進物質と同様の効果を得るのに、 タイプ 28の選択的反応促進物質とともに、 タイプ 1の選択的反応促進物質及び /又はタイプ 1 5の選択的反応促進物質等を加えて存在 （又は含有） させてもよ い。
⑤ 選択的反応促進物質の具体例
本発明の方法 （本発明の試薬） において、 選択的反応促進物質の具体例として、 界面活性剤、 ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体、 又は多糖類若しくはそ の誘導体等を挙げることができる。
界面活性剤としては、 非イオン性界面活性剤、 陽イオン性界面活性剤、 陰ィォ ン性界面活性剤、 又は両性界面活性剤を挙げることができる。
非イオン性界面活性剤としては、 例えば、 ポリオキシアルキレンポリオール類、 ポリォキシエチレンアルキルエーテル類、 ポリォキシエチレンアルキルフエニル ホルムアルデヒド縮合物、 ポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル類、 又 は n—へプチルー β一 D—チォダルコシド （η—へプチルー β _D—チォダルコ ピラノシド、 n_He p t y l— /3— D— t h i o g l u c o p y r a n o s i d e) 等を挙げることができる。
ポリォキシアルキレンポリオール等におけるポリォキシアルキレンの付加モル 数は、 5〜1, 000の範囲が好ましく、 10〜 500の範囲が特に好ましい。 また、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、 又はポリオキシエチレンアル キルフエニルホルムアルデヒド縮合物等におけるエチレンォキサイ ドの付加モル 数は、 5〜1, 000の範囲が好ましく、 5〜 500の範囲が特に好ましい。
そして、 ポリォキシエチレンアルキルフエ二ルェ一テル類等におけるエチレン オキサイ ドの付加モル数は、 5〜 1 , 0 0 0の範囲が好ましく、 5〜5 0 0の範 囲が特に好ましい。
両性界面活性剤としては、 例えば、 3— [ (3 -C h o l am i d o p r o p y 1 ) d i m e t h y 1 a mm o n i o」 — 2— h y d r o xy p r o p a n e s u l f o n i c a c i d (CHAP S O) 等を挙げることができる。
また、 ポリオキシアルキレン若しくはその誘導体としては、 例えば、 ポリオキ シエチレン （ポリエチレングリコール） 若しくはその誘導体、 又はポリオキシプ ロピレン （ポリプロピレングリコール） 若しくはその誘導体等を挙げることがで きる。
このポリオキシアルキレンの付加モル数は、 5〜 1， 000の範囲が好ましく、 1 0〜5 0 0の範囲が特に好ましい。
多糖類若しくはその誘導体としては、 例えば、 シクロデキストリン若しくはそ の誘導体、 デキス卜ランサルフェイ ト若しくはその誘導体、 デキストラン若しく はその誘導体、 へパリン若しくはその誘導体等を挙げることができる。
シクロデキス卜リンとしては、 α—シクロデキストリン、 j3—シクロデキス卜 リン、 又はアーシクロデキストリンを挙げることができる。
また、 シクロデキストリン誘導体としては、 例えば、 ひーシクロデキストリン、 3—シクロデキストリン、 又はアーシクロデキストリンの水酸基が、 ヒドロキシ プロピル基、 マルトシル基、 ヒドロキシブチル基、 ジェチルアミノエチル基など で置換されたもの、 又はこれらのシクロデキストリン若しくはその誘導体の架橋 物等を挙げることができる。
デキストランサルフェイト若しくはその誘導体は、 分子量が 1 , 00 0〜5， 00 0, 0 0 0の範囲のものが好ましく、 分子量が 5， 0 00〜 1， 0 0 0， 0 00の範囲のものが特に好ましい。
これらの選択的反応促進物質のより詳細な具体例を、 表 5に示した。 表 5
Figure imgf000056_0001
Ρ0Ε:ポリオキシエチレン 先に述べたように、 選択的反応促進物質は、 複数種類のものを組み合わせて、 存在 （又は含有） させてもよい。
選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させる濃度は、 選択的反応促進物質の 種類、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反 応を触媒する酵素の種類及び由来、 試料中のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの濃度、 又は第 1試薬と第 2試薬の混合比率等により異なるので、 一概には言 えず、 適宜その条件に適した濃度で存在 （又は含有） させればよいが、 通常は、 0 . 0 0 1〜 1 0 %の濃度で存在 （又は含有） させればよく、 0 . 0 1〜 5 %の 濃度で存在 （又は含有） させることが好ましい。
4 . 反応補助物質
本発明の方法 （本発明の試薬） には、 選択的反応促進物質とともに反応補助物 質を存在 （又は含有） させてもよい。
この反応補助物質の存在 （又は含有） により、 選択的反応促進物質の選択的反 応促進の働きを高めることができる。
反応補助物質の具体例として、 ポリア二オン、 ハロゲンイオン、 金属イオン、 又はレクチン等を挙げることができる。
ポリア二オンとしては、 例えば、 リンタングステン等を挙げることができる。 ハロゲンイオンとしては、 例えば、 クロールイオン等を挙げることができる。 金属イオンとしては、 例えば、 銅イオン、 又はマンガンイオンなどの 2価金属 イオン等を挙げることができる。
レクチンとしては、 例えば、 レンズマメレクチン等を挙げることができる。 これらの反応補助物質は、 複数種類のものを組み合わせて、 存在 （又は含有） させてもよい。
反応補助物質を存在 （又は含有） させる濃度は、 選択的反応促進物質の場合と 同様に各種条件により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した濃度 で存在 （又は含有） させればよい。 図面の簡単な説明 図 1は、 選択的反応促進物質として n—へプチルー /3— D—チォダルコシドを 用いて、 4種類のリポ蛋白画分に含まれる卜リグリセライ ドの定量を行ったとき の結果を示した図である。
図 2は、 選択的反応促進物質としてサンニックス FA— 1 0 3を用いて、 5種 類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライ ドの定量を行ったときの結果を示し た図である。
図 3は、 選択的反応促進物質としてサンニックス FA— 1 0 3を用いて、 5種 類のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライ ドの定量を行ったときの、 日立 7 1 5 0形自動分析装置の反応タイムコースを示した図である。
図 4は、 総トリグリセライ ド定量試薬により、 5種類のリポ蛋白画分に含まれ るトリグリセライ ドの定量を行ったときの、 日立 7 1 5 0形自動分析装置の反応 タイムコースを示した図である。 本明細書は本願の優先権の基礎である特願平 11一 128994号及び PCT/JP99/06723 号の明細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。
〔実施例 1〕 本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中のトリグセライ ド の定量— 1
選択的反応促進物質として、 n—へプチルー 3— D—チォダルコシドを用いた 本発明の方法及び試薬にて、 精製リポ蛋白画分中のトリグリセライ ドの定量を行 つた。
第 1試薬として、 グリセロールキナーゼ 1. 0単位 Zm l、 グリセロール一 3 —リン酸ォキシダーゼ 8. 0単位 Zm l 、 力夕ラーゼ、 アデノシン _ 3—リン酸 4. l mmo l / l 、 N— ( 3， 5—ジメ トキシフエ二ル） 一 N' —サクシニル エチレンジァミンナトリウム 0. 9 4mm o l Z l 、 n—へプチルー /3— D—チ ォダルコシド 0. 4 %、 グッド緩衝液 （pH 6. 0) を合わせたもの用意した。 また第 2試薬として、 リポプロテインリパーゼ 2. 0単位 Zm l、 ペルォキシ ダ一ゼ、 4ーァミノアンチピリン 2. 5mmo 1 / グッド緩衝液を合わせた ものを用意した。
実際の測定では、 3 7 °Cにした試験管に血清 3 1 と第 1試薬 3 0 0 ,' 1 を入 れ 5分反応させ、 次に第 2試薬 1 0 0 1 を加えた。
その直後と 5分後に波長 600 nmで反応液の吸光度を測定した。
この値を基に、 予め作成しておいた検量線を用いて、 トリグリセライ ド値を算 出した。
一方、 凝固阻止剤を入れた採血管で血液を採取し、 密度勾配遠心法にてカイロ ミクロン、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 並びに高 比重リポ蛋白の 4種類のリポ蛋白を分離した。
この 4つの試料に対して、 本法による定量と市販の試薬キッ ト （デ夕ミナ一 L TG- I I ； 協和メデックス社製） による総トリグリセライ ドの定量を行い、 両者の比を求めた。
この結果を図 1に示す。
本発明によって、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白中の トリダリセライ ドが選択的に反応分解できることが示されている。
〔実施例 2〕 本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中の卜リグセライ ド の定量一 2
各種の選択的反応促進物質を用い、 本発明の方法及び試薬にて、 精製リポ蛋白 画分中の卜リグリセライ ドの定量を行った。
1. 本発明の試薬の調製
( 1 ) 第 1試薬 （A) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (2 0°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2一モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 5 Ommo 1 / 1 N- ( 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） — 3， 5ージメ 卜キシァニリン トリウム [HDAOS] (色原体） 1. 5 mm o 1 / グリセロールキナーゼ 1 50単位/ グリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼ 3 , 000単位 Z アデノシン三リン酸ナ卜リゥム 0. 5 mm o 1 Z 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mm o 1 Z 力夕ラーゼ 100， 000単位/ 反応促進物質 〔物質名及び濃度は表 6に記載〕
(2) 第 2試薬 （B) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるよう iこ純水に溶解し、 pH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 50 mm o 1 / 1
4ーァミノアンチピリン 0. 7 5 mm o 1 / 1 ペルォキシダーゼ 600単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 1 20, 000単位 1 アジ化ナトリウム 0. 1 % 反応促進物質 〔物質名及び濃度は表 6に記載〕
2. 総卜リグリセライ ド定量試薬 （対照） の調製
(1) 第 1試薬 （C) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるよう（ ：純水に溶解し、 pH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 50 mm o 1 z 1
N- (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） 一 3, 5ージメ トキシァニリンナ トリウム [HDAOS] (色原体） 1. 5 mm o 1 / 1 グリセロールキナーゼ 1 50単位/ 1 グリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダ一ゼ 3， 000単位/ 1 アデノシン三リン酸ナトリゥム 0. 5 mm o \ / \ 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mm o 1 / 1 カタラーゼ 1 00， 000単位 Z 1 アデ力ノール B— 795 (旭電化工業） 0. 5 % (w/v) (2) 第 2試薬 （D) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 50 mm o 1 / 1 4ーァミノアンチピリン 0. 75 mm o \ / \ ペル才キシダーゼ 600単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 1 20 , 000単位ノ 1 アジ化ナトリウム 0. 1 % アデ力ノール B— 795 (旭電化工業） 0. 5 % (w/v)
3. 精製リポ蛋白画分の調製
実施例 1と同様に密度勾配遠心法を用いて、 カイロミクロン、 超低比重リポ蛋 白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白の 5種類の比重の 異なるリポ蛋白の画分をそれぞれ得た。 これらの 5種類の画分を試料として定量 に供した。
4. リポ蛋白画分中の卜リグリセライ ドの定量
リポ蛋白画分中のトリグリセライ ドの測定は、 以下に示す手順で日立 7 1 50 形自動分析装置 （日立製作所） を用いて行った。
前記 3で調製した各リポ蛋白画分の 3 1に、 前記 1の （ 1 ) の本発明の第 1 試薬 （A) 250 1を添加し、 37°Cで 5分間加温した。
本発明の第 1試薬 （A) 添加 5分後に、 前記 1の （2) の第 2試薬 （B) 1 2 5 11 Lを添加した。
この反応混液の 37°C、 5分後の吸光度を、 主波長 600 nm、 副波長 700 nmの二波長分析により測定した。 なお、 吸光度は、 試料として各リポ蛋白画分を用いて前記の方法で測定した吸 光度から、 試料として生理食塩水を用いて同様の方法で測定した吸光度を差し引 いた値を、 吸光度の測定値とした。
前記の方法と同様にし、 前記 2の （ 1 ) の総トリグリセライ ド定量試薬の第 1 試薬 （C) 、 及び前記 2の （ 2 ) の総トリグリセライ ド定量試薬の第 2試薬 (D) を用いて、 前記 3で調製した各リポ蛋白画分中の卜リグリセライ ドの定量 を行った。
本発明の試薬に含有させた各々の選択的反応促進物質の効果を確かめるため、 本発明の試薬 （A及び B) を用いたときの吸光度の測定値を、 総トリグリセライ ド定量試薬 （C及び D) を用いたときの吸光度の測定値で除した値を求めた。 この値を表 6に示した。
表 6
CM:カイロミクロン VLDL:超低比重リポ蛋白 IDL:中間比重リポ蛋白 LDL:低比重リポ蛋白
Figure imgf000063_0001
HDL:高比重リポ蛋白 表 6の結果より、 カイロミクロンに含まれる卜リグリセライ ドだけを反応させ る選択的反応促進物質 （タイプ 1 ) は、 ー 700 0. 1 %であった。
超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドだけを反応させる選択的反応促 進物質 （タイプ 2) は、 デキストラン硫酸〜 50 0 , 0 0 0 0· 1及び 0. 5 %、 r - CD 0. 1 %、 並びにヒドロキシプロピル一了一 CD 0. 1及び 0. 5 %であった。
高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドだけを反応させる選択的反応促進 物質 （タイプ 5) は、 R— 1 020 0. 1及び 0. 5 %、 並びにプル口ニック P— 85 0. 1 %であった。
カイロミクロン及び超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを反応させ る選択的反応促進物質 （タイプ 6) は、 サルコシネート CN— 1 00 0. 1及 び 0. 5%であった。
カイロミクロン及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを反応させ る選択的反応促進物質 （タイプ 7) は、 PEG 1 , 000 0. 1 %、 PEG 1 , 540 0. 1及び 0. 5 %、 PEG 6, 000 0. 1及び 0. 5 %、 PEG 1 0， 000 0. 1 %、 PEG20, 000 0. 5 , プル口ニック L— 3 4 0. 1 %、 プル口ニック L— 44 0. 1 %、 並びに POE— p—トルエン スルホアミ ド ◦. 1 %であった。
超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを反応さ せる選択的反応促進物質 （タイプ 1 0) は、 サンニックス FA— 1 03 0. 2、 0. 4、 0. 5及び 0. 6 %、 P E G 20 , 000 0. 1 %、 ジェチルァミノ ェチルー /3— CD 0. 1 %、 並びにヒドロキシプロピル一ひ一 CD 0. 1 % であった。
中間比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを反応させ る選択的反応促進物質 （タイプ 14) は、 KF— 35 1 0. 1 %であった。
低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを反応させる 選択的反応促進物質 （タイプ 1 5 ) は、 ェマルゲン 9 1 1 0. 1 %、 BL— 9 EX 0. 1 %、 並びにアデ力 トール NP— 720 0. 1及び 0. 5 %であつ チ
カイロミクロン、 超低比重リボ蛋白、 及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライ ドを反応させる選択的反応促進物質 （タイプ 1 6) は、 サンニックス F A - 1 03 0. 1 %、 P E G 2 , 000 0. 5 %、 P E G 1 0 , 000 0. 5 %、 POE— p—トルエンスルホアミ ド 0. 5 %、 - CD, ヒドロキシブ チル— a_CD、 マルトシル _ 3— CD、 ヒドロキシプチルー /3— CD及びヒド ロキシプロピル— /3— CDの 0. 1及び 0. 5 %、 水溶性 ]3—シクロデキストリ ンポリマー 0. 1 %、 ジェチルアミノエチルー ]3 _CD、 ァ— CD、 並びにヒ ドロキシプロピル— α— CDの 0. 5%であった。
超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライ ドを反応させる選択的反応促進物質 （タイプ 23) は、 TMH— 7 EX 0. 1 %、 サンニックス GP— 400 0. 1 %、 及びプル口ニック L一 44 0. 5 %であった。
中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリダリ セライ ドを反応させる選択的反応促進物質 （タイプ 25) は、 ェマルゲン 9 1 1 0. 5 %であった。
カイロミクロン、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 及び低比重リポ蛋白 に含まれるトリグリセライ ドを反応させる選択的反応促進物質 （タイプ 26) は、 Twe e n 20 0. 1 %、 及びサンニックス F A— 1 03 0. 8 %であった。 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白 に含まれるトリグリセライ ドを反応させる選択的反応促進物質 （タイプ 30) は、 NP— 1 0 0. 1及び 0. 5 %、 サンニックス GP _ 400 0. 5 %、 並び に OP— 1 0 0. 1及び 0. 5%であった。
カイロミクロン、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白、 及 び高比重リポ蛋白の全てのリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドに反応する、 選 択的反応促進物質 （タイプ 3 1 ) は、 TMH— 7 EX 0· 5 %、 ΒΤ— 7 0. 1 %、 アデ力トール SO— 1 20 0. 1 %、 O P - 8 0. 5 %、 BT— 9 E X 0, 1及び 0. 5 %、 T w e e n 2 0 0. 5 %、 並びにサンニックス FA - 1 03 1 %であった。
これらの結果から、 本発明の定量する方法及び定量する試薬において、 選択的 反応促進物質を単独若しくは組み合わせて存在又は含有させることによって、 超 低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択 的に定量することができることが確かめられた。
すなわち、 ここで検討して選択的反応促進物質としてのタイプが判明した各々 の選択的反応促進物質を、 先の 「④ 各タイプ選択的反応促進物質の使用方法」 ( 「発明の実施の形態」 の 「本発明の方法及び試薬に共通する事項」 の 「3. 選 択的反応促進物質」 ） の記載に従って、 存在又は含有させて定量を行うことによ り、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド を選択的に定量できるのである。
一例を挙げれば、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリダリ セライ ドを反応させる、 タイプ 10の選択的反応促進物質である、 サンニックス FA— 1 03 0, 2、 0. 4、 0. 5若しくは 0. 6%、 P E G 20 , 000
0. 1 %、 ジェチルアミノエチル— /3— CD 0. 1 %、 又はヒドロキシプロピ ルーひ — CD 0. 1 %を存在又は含有させることにより、 超低比重リポ蛋白及 び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量できることが分 かる。
〔実施例 3〕 本発明の方法及び試薬による精製リポ蛋白画分中の卜リグセライ ド の定量一 3
選択的反応促進物質として、 サンニックス FA_ 1 03を用いた本発明の方法 及び試薬にて、 精製リポ蛋白画分中の卜リグリセライ ドの定量を行った。
1. サンニックス FA— 1 03含有第 1試薬の調製
選択的反応促進物質として、 サンニックス F A— 1 03を用い、 その含有濃度 を、 0. 2、 0. 4、 0. 6、 0. 8、 又は 1. 0 % (w/ v) としたこと以外 は、 前記実施例 2の 1の （1) の本発明の第 1試薬 （A) と同じ試薬成分及び濃 度として調製を行い、 5種類のサンニックス FA_ 1 03含有第 1試薬を調製し た。 2. サンニックス FA— 1 0 3含有第 2試薬の調製
選択的反応促進物質として、 サンニックス FA— 1 0 3を用い、 その含有濃度 を、 0. 2、 0. 4、 0. 6、 0. 8、 又は 1. 0 % (w/v) としたこと以外 は、 前記実施例 2の 1の （2) の本発明の第 2試薬 （B) と同じ試薬成分及び濃 度として調製を行い、 5種類のサンニックス FA— 1 0 3含有第 2試薬を調製し た。
前記実施例 2の 3と同様の手法で調製した 5種類のリポ蛋白画分を試料とし、 各サンニックス F A— 1 0 3含有第 1試薬及び第 2試薬を用いて、 前記実施例 2 の 4と同様に各リポ蛋白画分中の卜リグリセライ ドの定量を行った。
また、 この定量の方法と同様にし、 前記実施例 2の 2の （1 ) の総トリグリセ ライ ド定量試薬の第 1試薬 （C) 、 及び前記実施例 2の 2の （2) の総トリダリ セライ ド定量試薬の第 2試薬 （D) を用いて、 各リポ蛋白画分中のトリダリセラ ィドの定量を行った。
本発明のサンニックス F A— 1 0 3含有試薬に含有させた各々の選択的反応促 進物質の効果を確かめるため、 サンニックス FA— 1 0 3含有試薬を用いたとき の吸光度の測定値を、 総トリグリセライ ド定量試薬 （C及び D) を用いたときの 吸光度の測定値で除した値を求めた。
この値を表 7及び図 2に示した。
なお、 この図において、 縦軸はサンニックス FA— 1 0 3含有試薬を用いたと きの吸光度の測定値を、 総トリグリセライ ド定量試薬を用いたときの吸光度の測 定値で除した値を表し、 横軸は本発明のサンニックス F A— 1 0 3含有試薬に含 有させたサンニックス FA— 1 0 3の濃度 〔％ (w/v) 〕 を表す。
表 7 濃度％ 選択的反応促進物質 試料（リボ蛋白画分）
CM VLDL IDL し し HDL 総トリグリセライド測定試薬 (対照） 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
0.2 0.17 0.99 0.54 0.26 0.13
0.4 0.20 1.05 0.69 0.45 0.22
0.6 サンニックス FA - 103 0.30 1.04 0.81 0.51 0.32
0.8 0.53 1.05 0.90 0.62 0.40
1 0.92 1.03 1.04 1.03 1.03
CM:カイロミクロン
VLDL:超低比重リポ蛋白
IDL:中間比重リポ蛋白
LDL:低比重リポ蛋白
HDL:高比重リポ蛋白 表 7及び図 2より、 サンニックス F A— 1 0 3の濃度が 0 . 8 % ( w / v ) ま での濃度において、 同物質の存在 （含有） により、 リポ蛋白のうち超低比重リポ 蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白を選択的に定量できることが分かる。
特に、 0 . 2 % ( w/ v ) の濃度においては、 選択性が顕著である。
以上の結果よりも、 本発明の定量する方法及び定量する試薬は、 超低比重リポ 蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量す ることができることが確かめられた。
なお、 本実施例において、 本発明のサンニックス F A— 1 0 3含有試薬 〔サン ニックス F A— 1 0 3含有濃度が 0 . 4 % ( w/ v ) のもの〕 を用いて各リポ蛋 白画分を定量した時の、 日立 7 1 5 0形自動分析装置の反応タイムコースを図 3 に示した。
また、 前記実施例 2において、 総トリグリセライ ド定量試薬 （C及び D ) を用 いて各リポ蛋白画分を定量した時の、 日立 7 1 5 0形自動分析装置の反応タイム コースを図 4に示した。
これらの図において、 縦軸は吸光度 （主波長 6 0 0 n m、 副波長 7 0 0 n m) を示す。 また、 横軸は同分析装置の測光ポイントを示し、 反応時間約 1 0分間を 5 0ポイントで測定を行っているものである。
図 4には、 総トリグリセライ ド定量試薬には、 リポ蛋白中のトリダリセライ ド に対する選択性はなく、 全てのリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを定量して いることが示されている。
それに対して図 3では、 リポ蛋白のうち超低比重リポ蛋白に含まれるトリダリ セライ ドが選択的に反応しており、 サンニックス F A— 1 0 3が超低比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に反応させ、 定量することができる選択 的反応促進物質であることが示されている。
これらの図からも、 選択的反応促進物質を存在させる又は含有する本発明の定 量する方法及び定量する試薬は、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白 に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量できることが分かる。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明の、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリ セライ ドを選択的に定量する方法及び試薬は、 遠心や沈殿などの煩雑な前処置が 必要なく、 臨床検査用自動分析装置に適用可能であり、 動脈硬化症の予防と治療 に有用なデータを、 簡便かつ正確に得ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 被検試料に、 選択的反応促進物質の存在下、 トリダリセライ ドより過酸化水 素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を作用させ、 生成す る過酸化水素又は還元型補酵素の測定を行う、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間 比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量する方法。
2 . 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含 まれる卜リグリセライ ドを選択的に定量するためのものである請求の範囲第 1項 記載の方法。
3 . 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの定 量を選択的に行う請求の範囲第 1項記載の方法。
4 . 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含 まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである請求の 範囲第 3項記載の方法。
5 . 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及びノ又 は中間比重リボ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 ト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋 白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを消去し、
第 2段階として、 残存するトリグリセライ ドを、 トリダリセライ ドより過酸化 水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させること により、 超低比重リポ蛋白及び/又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリダリセラ ィ ドの定量を選択的に行う請求の範囲第 1項記載の方法。
6 . 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び /又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれる 卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素と反応させるものである請求の範囲第 5項記載の方法。
7 . 第 2段階において、 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とともにこの 選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質を存在させる請求の範囲第 5 項記載の方法。
8 . 第 1段階に存在させた選択的反応促進物質とは異なる選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選 択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素と反応させるものである請求の範囲第 7項記載の方法。
9 . 第 1段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白、 中間比 重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群か ら選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 力 イロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ 蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去し （但し、 超低比重リポ蛋白に含ま れる卜リグリセライ ド及び中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドの両方 の消去は行わない） 、
第 2段階として、 選択的反応促進物質の存在下、 残存する卜リグリセライ ドの うち超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド を選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は 中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドの定量を選択的に行う請求の範囲 1記載の方法。
1 0 . 第 1段階において存在させる選択的反応促進物質と、 第 2段階において存 在させる選択的反応促進物質が、 下記の組み合わせ （i ) 〜 （i i i ) ：
( i) 第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び/又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質；
( i i)
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び/又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれるトリダリセライ ド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質 ；
( i i i )
第 1段階：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2段階：
第 1段階において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び 又は高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを、 前記のトリグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質； .
のいずれかである請求の範囲第 9項記載の方法。
1 1 . トリダリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反 応を触媒する酵素が、 （i )リポプロテインリパーゼ、 （i i )グリセロールキナーゼ、 並びに（i i i)グリセロール— 3—リン酸ォキシダ一ゼ及びグリセロール— 3—リ ン酸デヒドロゲナ一ゼのいずれか一方である請求の範囲第 1項記載の方法。
1 2 . 被検試料が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低 比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む 可能性のあるものである請求の範囲第 1項記載の方法。
1 3 . 選択的反応促進物質が、 界面活性剤、 ポリオキシアルキレン若しくはその 誘導体、 又は多糖類若しくはその誘導体である請求の範囲第 1項記載の方法。
1 4 . 選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる請求の範囲第 1項 記載の方法。
1 5 . 反応補助物質が、 ポリア二オン、 ハロゲンイオン、 金属イオン又はレクチ ンである請求の範囲第 1 4項記載の方法。
1 6 . ( i)選択的反応促進物質、 及び（i i) 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を含有する、 試料中の超低 比重リポ蛋白及び 又は中間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的 に定量するための試薬。
1 7 . 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを選択的に定量するためのものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
1 8 . 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還 元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させるものである請求 の範囲第 1 6項記載の試薬。
1 9 . 選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以 外のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過 酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超低比重リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含 まれるトリグリセライ ドを消去するものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 0 . 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 1試薬に 含有されるものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 1 . 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 2試薬に 含有されるものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 2 . 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 選択的反応促進物質が第 1試薬及 び第 2試薬に含有されるものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 3 . 第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 第 1試薬に含有される選択 的反応促進物質と同じ又は異なる選択的反応促進物質である請求の範囲第 2 2項 記載の試薬。
2 4 . 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬に含有される選択的反応 促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含 まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超低 比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるトリグリセ ライ ドを消去するものであって、
第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 超低比重リポ蛋白及び/又は中 間比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセライ ドより 過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ るものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 5 . 試薬が第 1試薬及び第 2試薬よりなり、 第 1試薬に含有される選択的反応 促進物質が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種のリポ蛋白に 含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還 元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させ、 これにより、 超 低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比 重リポ蛋白からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを 消去するものであり （但し、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド及び 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドの両方の消去は行わない） 、 第 2試薬に含有される選択的反応促進物質が、 残存するトリダリセライ ドのう ち超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを 選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連 の反応を触媒する酵素と反応させるものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 6 . 第 1試薬において含有させる選択的反応促進物質と、 第 2試薬において含 有させる選択的反応促進物質が、 下記の組み合わせ （i ) 〜 （i i i ) ： ( i )
第 1試薬：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 卜リグリセ ライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白 からなる群から選ばれるリポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ドを消去するこ とができる選択的反応促進物質、
第 2試薬：
第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び 又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白及びノ又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ドを、 前記のト リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素と反応させることができる選択的反応促進物質：
( i i)
sit ：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記卜リグリセライ ド、 並びに中間比重リポ蛋白に含まれる前 記トリグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 2試薬：
第 1試薬において、 トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに超低比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライド、 更に場合によっては中間比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記の卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質 ；
( i i i)
1 式 ：
カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる 少なくとも 1種のリポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋 白に含まれる卜リグリセライ ドを選択的に、 トリグリセライ ドより過酸化水素又 は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることにより、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれるリ ポ蛋白に含まれる前記トリグリセライ ド、 並びに超低比重リポ蛋白に含まれる前 記卜リグリセライ ドを消去することができる選択的反応促進物質、
第 Δ s式架：
第 1試薬において、 卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素と選択的に反応したカイロミクロン、 低比重リ ポ蛋白及び Z又は高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライ ド、 並びに中間比重 リポ蛋白に含まれる卜リグリセライ ド、 更に場合によっては超低比重リポ蛋白に 含まれる卜リグリセライ ドを、 前記の卜リグリセライ ドより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素と反応させることができる選択 的反応促進物質；
のいずれかである請求の範囲第 2 5項記載の試薬。
2 7 . トリグリセライ ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反 応を触媒する酵素が、 Π)リポプロテインリパーゼ、 （i i)グリセロールキナーゼ、 並びに（i i i)グリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼ及びグリセロール一 3—リ ン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方である請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 8 . 被検試料が、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 カイロミクロン、 低 比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む 可能性のあるものである請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
2 9 . 選択的反応促進物質が、 界面活性剤、 ポリオキシアルキレン若しくはその 誘導体、 又は多糖類若しくはその誘導体である請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
3 0 . 選択的反応促進物質とともに反応補助物質を存在させる請求の範囲第 1 6 項記載の試薬。
3 1 . 反応補助物質が、 ポリア二オン、 ハロゲンイオン、 金属イオン又はレクチ ンである請求の範囲第 3 0項記載の試薬。
3 2 . リポプロテインリパーゼ、 グリセロールキナーゼ、 グリセロール— 3 —リ ン酸ォキシダーゼ （又はグリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナーゼ） などを組 み合わせて血清中のトリグリセライ ドを定量する酵素比色法において、 陽イオン 性、 陰イオン性、 又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、 超低比 重リポ蛋白 （中間比重リポ蛋白も性状が類似しているためこれに含める） 中の卜 リグリセライ ドを選択的に定量する方法。
3 3 . リポプロテインリパーゼ、 グリセロールキナーゼ、 グリセロール— 3—リ ン酸ォキシダーゼ （又はグリセロール— 3—リン酸デヒドロゲナーゼ） などを組 み合わせて血清中のトリグリセライ ドを定量する酵素的測定法において、 陽ィォ ン性、 陰イオン性、 又は非イオン性の界面活性剤を作用させることにより、 カイ 口ミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白中のトリグリセライ ドを選択 的に反応分解させ、 その後、 超低比重リポ蛋白 （中間比重リポ蛋白も性状が類似 しているためこれに含める） 中の卜リグリセライ ドを定量する方法。
3 4 . 請求の範囲第 3 2項記載の超低比重リポ蛋白中トリグリセライ ド定量方法 において、 同リポ蛋白と界面活性剤との選択性を促進するポリア二オン、 2価金 属イオン、 又は糖を添加する方法。
3 5 . 請求の範囲第 3 3項記載の超低比重リポ蛋白中トリグリセライ ド定量方法 において、 カイロミクロン、 L D L及び H D Lと界面活性剤との選択性を促進す るポリア二オン、 2価金属イオン、 又は糖を添加する方法。
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