WO2000059618A1 - Verfahren zur besiedlung von substraten mit biologischen zellen und dafür verwendbare besiedlungsvorrichtungen - Google Patents

Verfahren zur besiedlung von substraten mit biologischen zellen und dafür verwendbare besiedlungsvorrichtungen Download PDF

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WO2000059618A1
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substrate
container
cells
settlement
colonization
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Augustinus Bader
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Augustinus Bader
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/48—Holding appliances; Racks; Supports
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/10—Rotating vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the invention relates to a method for settling
  • substrates or matrices with cells are suitable as substrates.
  • substrates of natural origin can include Be collagen substrates.
  • synthetic substrates can consist of biologically inert plastics. The substrates to be populated with living cells often have a net-like or sponge-like structure in order to facilitate the ingrowth of the cells.
  • the cells For colonization, the cells must be added to the substrate without being destroyed or damaged, and they must be applied to the substrate in such a way that they can grow. In most cases, a closed cell lawn will be sought.
  • the cells intended for colonization or detached elsewhere are generally in a culture medium.
  • the substrate is brought into contact with the cells in the culture medium, for example in a so-called roller bottle.
  • the roller bottle is rolled in a roller cabinet so that the substrate, the culture medium and the cells are kept in constant, not too violent, motion.
  • the problem with colonization is that on the one hand the substrate is to be flushed with the culture medium with the cells, because cells are to be constantly brought up to the substrate so that they grow there, on the other hand the flow or the rolling or swiveling movement within the bottle must not be so great that the freshly applied cells are sheared off again before the successful ingrowth.
  • the substrate should be accessible to the cells at all points, so it must not fold due to the rolling movement or contact the roller bottle body.
  • the invention is therefore based on the object of developing a colonization method and colonization devices which can be used therefor, with the aid of which colonization of a substrate can take place under optimal growth conditions.
  • the colonization device to be developed is to enable an effective colonization without the need for any equipment. Furthermore, the handling of the substrate should be safe and simple during the entire settlement process.
  • the colonization device should preferably be usable simultaneously as a vessel for sterilization, acellularization, storage, transport and cryopreservation. This is desirable in order to avoid an interruption of the sterile chain up to the end user.
  • This task is solved on the one hand by a method for colonizing substrates with biological cells,
  • a substrate held therein and cells intended for colonization are subjected to at least one colonization phase, during which the substrate is rotated in or with the device about at least one axis and the cells repeatedly in during the rotary movement Be brought into contact with the substrate
  • the substrate is subjected to at least one perfusion phase after or during one or more settlement phases, during which the substrate is perfused at least on regions of its outer or inner surface.
  • a settlement phase is understood to mean a phase during which cells are suitably supplied to the substrate with which the substrate is to be colonized.
  • Cells in a medium are preferably added to the substrate during a settlement phase or by spreading onto the substrate, introducing them into the substrate or coating the substrate with a mass (e.g. collagen) containing the cells.
  • a mass e.g. collagen
  • Factors or co-factors in particular growth factors or chemotactic factors, can be added to the cells.
  • a perfusion phase is understood to mean a phase during which the substrate is perfused, as corresponds to the customary use of the term "perfusion".
  • the substrate is preferably perfused with a liquid cell culture nutrient medium, blood or plasma, which in turn can be enriched with various substances.
  • the substrate can preferably be rotated simultaneously during the settlement phases in a superimposed rotary movement about at least two spatial axes. It can also be a randomly controlled rotary movement in all spatial directions, which in connection with the for the
  • the rotation of the substrate can take place in succession or alternately around the at least two spatial axes during the settlement phases.
  • the method can also be designed in such a way that the substrate is subjected to an additional resting phase after at least one settlement phase, during which there is no rotation and no perfusion.
  • a resting phase can be interposed in order to give the fully or partially populated substrate a stress-free consolidation phase during which the cell lawn can consolidate or also reorganize internally.
  • the intermittent perfusion also enables the formation of multiple layer structures; For this purpose, for example, in several settlement phases in a row e.g. first connective tissue cells, smooth muscle cells and then endothelial cells are given up, perfusion phases being switched on between the individual colonization phases. This allows the subsequent cell type to be applied to structures that are already structured and differentiated according to the tissue.
  • the colonization with fibroblasts / smooth muscle cells can be carried out over days and weeks until the endothelial turf is finally grown within a few hours to days.
  • the endothelial cells can advantageously be stored cryopreserved, so that they do not experience an unnecessary culture period.
  • the matrix-forming cells can be added again several times.
  • a repeated application of cells alternating with perifusion phases is possible. This means a change from rotational movements of the settlement device to perfusions in the idle state.
  • the settlement device can remain stationary vertically but also horizontally and in any other position. This is important when creating heart valves, a pulsation operation described in more detail below preferably taking place in a vertical position of the heart valve. Gravity enables the flap angel to close spontaneously after the pulsation phase has ended.
  • the method can comprise further phases with additional method steps for the treatment of the already populated, partially populated or not yet populated substrate.
  • additional method steps for the treatment of the already populated, partially populated or not yet populated substrate For example, an upstream azellularization of the substrate to be populated, one or more rinsing phases, sterilization and / or various gassings can be included in the overall process without the bioreactor having to be opened and the substrate having to be moved.
  • auxiliary substances such as e.g. Hydrogels
  • a collagen matrix type I or mixtures with other matrix components
  • a fibrinogen or fibronectin mixture with cells can be applied, with a tube outside and / or inside. This can be done by brushing on or dripping on.
  • VEGF or PDGF for example, can be applied as cell type-specific growth factors and chemotactic factors. In this way, gradients can be built up for the passage of connective tissue cells. If different cell types are cultivated in the different chambers, the medium can be adapted to the corresponding cell types.
  • Perfusion can preferably be pulsed. This measure serves to simulate physiological conditions in an even more lifelike manner.
  • smooth muscle cells in particular react to pulsatile pressures, so that a method developed in this way is suitable, for example, for colonization with smooth muscle cells.
  • the settlement device described in more detail below is particularly suitable for this, since the substrate can be brought into different positions by changing the position of the device. In addition, the substrate is given enough space for flexible volume changes (to larger or smaller volumes).
  • the method according to the invention allows the substrate to be populated with different cells in certain regions, if this is desired for the respective substrate.
  • This is possible in particular - as will be described below - with the settlement devices specially developed for this method, in which several separate chambers or compartments are formed adjacent to the substrate, which are acted upon separately with different media or settlement culture solutions and also separately can be perfused.
  • it is also possible to protect the substrate in areas, e.g. cover or tie off, and then treat different areas one by one in different steps.
  • the substrate can also be populated in succession with different cells, as a result of which several layers with different cells could be formed on the substrate.
  • the substrate used which, as already described above, is preferably flat or tubular, can itself have inner chambers or can be double-walled or multi-walled. It can also be porous or sponge-shaped so that cells can settle in the pores or channels of this material.
  • the substrate can consist of a biological material of natural origin (xenogeneic, allogeneic, autologous), of reproduced biological materials, synthetic proteins, eg collagen, of biopolymers, polymers, textile plastics or solids.
  • the substrate can also be a porous or sponge-like solid, for example an inorganic solid with a pumice structure. Such solids would be suitable, inter alia, for the production of bone prostheses.
  • the solid substrate could be in the form of a piece or a tube. In general, the substrates can have any shape as long as they are suitable for flow around (possibly inside and outside) when settling.
  • the substrate can be cryopreserved by introducing cooling liquid or gases such as, in particular, nitrogen.
  • a settlement device which comprises a container and a clamping device arranged therein for a device to be settled
  • Substrate exists, wherein the clamping device is designed such that, in cooperation with the clamped substrate within the container, at least two essentially liquid-separating or controlled liquid transfer chambers are formed on opposite sides of the clamped substrate, and the at least one each Has liquid inlet and outlet for each of the chambers formed.
  • the container of the populating device should be shaped in such a way that the substrate can be freely washed around by the culture medium when it is clamped in the clamping device.
  • the substrate can be attached to the holder (s) in any suitable manner, for example tied, clipped or sewn on.
  • the shape of the container and the clamping device must be adapted to each other.
  • the container can consist of a vessel with a lid, the lid being connected to the clamping device and both together being able to form a removable insert.
  • a removable insert simplifies the handling of the substrate before and after the settlement.
  • the substrate ie, for example, the finished implant
  • the substrate does not have to be touched or removed from stationary reactor parts that would be difficult to access inside the reactor.
  • a disadvantageous assembly / disassembly of the substrate to be populated on fixed, non-removable housing parts is avoided. This considerably facilitates both handling and use after transport to the end user under sterile conditions, for example in the operating room by the doctor before implantation.
  • the substrate removed from the reactor with the clamping device is freely accessible, remains stabilized for the time being and - depending on the fastening mechanism - can be removed very easily
  • the insert is then designed in such a way that the clamping device lies against the inside of the container such that two liquid-separating chambers are formed on the opposite sides of the clamped substrate. It should be possible to work with separate media or cells in the different chambers. Of course, the same cells and / or media can also be used on both sides of the substrate, or inside and outside.
  • a major advantage of the apparatus results from the fact that multiple (also different) cells can be flushed through and that it is possible to switch between colonization and perfusion phases without having to open the reactor.
  • a targeted liquid transfer through the substrate may also be desirable, particularly with organic substrates.
  • the substrate to be populated complements the application so that one or more chamber partitions are formed.
  • the clamping device can also be designed for clamping a plurality of substrates, in which case several chambers are then formed. Each of the chambers formed is preferably equipped with liquid inflow and outflow.
  • the substrate itself can likewise already be multi-chambered, in particular double or multi-walled with lumens between the walls.
  • the clamping device - preferably on one of the substrate holders - at least one further inlet and / or outlet for the introduction of medium, cells and / or material into at least one inner chamber thereof has double or multi-walled substrate.
  • the clamping device can be adapted accordingly, for example branched on one of the holders for the production of a Y prosthesis.
  • the container can also be opened or dismantled in a suitable manner, so that the substrate clamped in the clamping device can be introduced into and removed from the settlement device as easily as possible.
  • the container of the settlement device itself is preferably designed so that it can be rolled or swiveled, so that it can be placed in a thermostatted rolling cabinet during the entire settlement time or for certain settlement steps.
  • the settlement device can be cylindrical, for example. This is particularly advantageous if a tubular substrate, such as a heart valve or another tubular vessel, is to be populated. This embodiment is explained in more detail in the description of the figures.
  • the clamping device is preferably arranged essentially transversely to a preferred direction of movement of a liquid medium contained therein, which is predetermined by a rolling or swiveling movement of the container.
  • the clamping device can preferably be arranged with respect to the inlets and outlets in such a way that a flow direction of the liquid medium through the reactor which is predetermined by the inlets and outlets runs along or within the clamped substrate.
  • the clamping device can consist of at least one frame-shaped holder. The frame-shaped holder would then preferably be attached laterally to an insertion part, which at the same time forms a lid for a box-shaped container.
  • the frame When inserting the insert with the frame-shaped holder, the frame should lie against the inside of the box-shaped container on three sides, while the fourth side is connected to the lid fastened to the insert. This results in three chambers within the container, each of which must be provided with an inlet and outlet for liquid medium. These supply and discharge lines can be routed through the cover of the insert. Since a box-shaped container itself cannot be rolled, it would be placed in a holder for use in the roll cabinet. Such an arrangement is described below.
  • the clamping device can also consist of two ring-shaped holders for the substrate, which are mechanically firmly connected to one another, for example by rods.
  • the rollable or swiveling container can also be spherical or spherical in shape, for further degrees of freedom in the
  • deflection knobs can also be provided on the spherical container (or the spherical holder, see below), as a result of which the rolling direction is changed even more frequently in a random manner during treatment in a rolling cabinet or a corresponding apparatus, and rotation and pivoting in all spatial directions is possible is.
  • the container can be made of a rigid or a flexible material. The latter brings the advantage that it allows a somewhat variable volume, so that the substrate e.g. can expand even more under pressure.
  • the Chambers be equipped with one or more gas supply and gas discharge lines.
  • the gas supply and discharge lines can be in the form of hoses that run along the walls and are made of gas-permeable materials, such as silicone. These allow gases to be added to or withdrawn from the culture medium during colonization.
  • the gas exchange can - alternatively or additionally - also be made possible by gas-permeable outer walls of the container of the settlement device.
  • the walls of the container can be formed from a PTFE film or a silicone film or contain inserts made from these structures or gas-permeable materials.
  • the wall structures can also be formed from sintered metal or a microporous ceramic or porous glass.
  • This porous support structure can be coated with a gas permeable layer, e.g. a film made of plastic (e.g. PTFE, silicone).
  • gas-permeable membranes or foils integrated in the wall structures of the housing of the colonization device is that the ambient atmosphere in the incubator (conventional roller cabinet or equipment provided for this purpose) is used directly for oxygen exchange and, via a carbon dioxide phase, also for pH regulation in the culture medium can be used. It is important here that the settlement compartments (chambers) of a three-dimensional structure used (e.g. a vessel or heart valve) are simultaneously provided with a culture reservoir and an oxygenation function.
  • a three-dimensional structure used e.g. a vessel or heart valve
  • the inflows and outflows of the nutrient medium or the gas supply and discharge lines can be connected to the colonization device with rotatable couplings, which would make it possible for the colonization to be carried out while the colonization device is rolling in a specially designed rolling cabinet.
  • the lines connected via the coupling could be made concentric.
  • certain internals it is possible for certain internals to be arranged in the interior of the container, which conduct the liquid medium in the desired manner as it flows through the reactor. This can be webs or hoses arranged on the inner wall of the container. Suitable internals in the broader sense are known from reactor construction for other purposes.
  • the reactor vessel can also be provided or connected with devices for heating or cooling known as such. For example, Heating wires for tempering the medium must be embedded in the outer wall of the reactor.
  • the reactor vessel can also be encased for holding a heating or cooling medium, such as water.
  • the culture medium which in one embodiment contains the cells to be colonized, is passed through the inlets and outlets.
  • a certain amount of cells can also be specified in the reactor, in which case only the pure culture medium circulates.
  • the inlets and outlets will preferably be provided with filters to prevent the cells from being washed out unintentionally.
  • closures are provided on the inlets and outlets in order to be able to close the individual chambers.
  • the recirculation of cells is preferably avoided in the method according to the invention. In contrast to the earlier river settlement, the cells are kept above the substrate.
  • the substrate is held in a clamping device during the colonization, so that it is freely accessible from the desired sides for the culture medium and the cells and does not collapse or stick together.
  • the holder serves to insert the substrate within the preferably removable insert into and remove it from the reactor.
  • the removable insert thus serves at the same time an improved handling of the substrate, for example immediately afterwards the settlement can be immersed in a liquid, treated or preserved in any other way.
  • intermediate pieces made of e.g. tubes or funnels made of silicone or other preferably elastic plastics are reinforced with fibers. These can be displaceable with regard to bridging distances as well as shortenings.
  • the clamping device is arranged essentially transversely to a preferred direction of movement of the liquid medium which is predetermined by the rolling or pivoting movement of the container or the container which is still held in the holder described below.
  • “Substantially transverse” is intended to mean that the substrate is arranged by means of the clamping device in such a way that the moving liquid medium, i.e. the cell suspension in culture medium, by the rolling or swiveling continuously "thrown" onto the substrate at an angle between approximately 30 and 150 ° to the axis of rotation of the rolling or swiveling movement, i.e. is brought into contact with it again and again.
  • the preferred direction of movement of the liquid medium is considered, neglecting a possibly (but not necessarily) simultaneous flow of the liquid medium along the clamped substrate.
  • the rollable or swiveling container i.e. the colonization device as a whole, placed in a rolling cabinet or an apparatus for swiveling or in comparable devices with a corresponding function and rolled or swiveled there in order to move the culture medium and the cells suspended therein relative to the clamped substrate.
  • the settlement device is treated in the rolling cabinet in the same way as a roller bottle, ie rotated and tempered if necessary.
  • another pre direction are used, which is suitable to move the settlement device in the desired manner.
  • This can also be a separate device specially provided for this purpose.
  • the rolling cabinet or the equipment can also provide a specific atmosphere (oxygen, carbon dioxide).
  • the culture medium or cell suspension flowing through the reactor through the liquid inflow and outflow or even through several inflows and outflows does not have to take place during the entire settlement process. It can also be particularly expedient to stop this flow temporarily - for example while rolling in a rolling cabinet or during treatment in a device for the corresponding purpose.
  • the inflows and outflows can be temporarily disconnected or closed with taps.
  • the culture medium - with or without cells - can at least temporarily be circulated through the inflows and outflows. As a result, cells that could not grow in the first run are offered again to the substrate.
  • the cells that have not yet grown in the culture medium are first fed to the substrate with the longitudinal flow through the inlet and secondly distributed along the substrate.
  • the distribution "transversely" to this longitudinal direction takes place essentially by the rolling or swiveling movement, both movements being able to overlap and then interact.
  • the rolling or pivoting motion may be overlaid with other types of motion for the purpose of repeatedly contacting and distributing the cells to the substrate, e.g. with a shaking motion.
  • a flow can be set along the substrate enables a uniform supply of cells to all locations on the substrate.
  • the flow rate can be adjusted so that the transport of the cells does not hinder their ingrowth if possible. Waxing can also be promoted by the fact that the cultural media flow is stopped for a time, so that the cells just above the substrate remain there for a time and have the opportunity to grow or grow.
  • the invention further comprises an arrangement of a settlement device as described above and a rollable bracket.
  • the bracket is used to hold a non-rollable container, e.g. to be able to treat a box-shaped container in a rolling cabinet or to introduce additional directions of movement.
  • the axis of rotation of the rollable holder and a longitudinal axis of the substrate clamped in the clamping device of the settlement device preferably run at an angle to one another.
  • a rotationally symmetrical body can be used as the holder for the aforementioned arrangement, which has one or more recesses or receptacles for a settlement device, as described above.
  • This rotationally symmetrical body can be made of a suitable material, e.g. Glass, plastic or metal exist.
  • the bracket may consist of a ball with a tubular passage.
  • a cylindrical reaction container can then be inserted into this tubular passage (there can also be several tubes for several containers), and the ball can be placed in a roller cabinet after disconnecting the inlets and outlets from the populating device, so that the substrate is turned in all directions while rolling.
  • the holder can also consist of a cylindrical body or frame in which a tubular passage is arranged obliquely to the cylinder axis.
  • the populating device is also suitable for serving as a transport and storage container for the fully populated substrate. This prevents the sensitive, populated substrate from continuing to handled telbar, for example, would have to be removed from the culture solution. Rather, it can remain in the settlement device until use.
  • the inlets and outlets as well as gas supply and discharge lines can be disconnected for transport purposes. Otherwise, it is possible to leave the populated substrate in the desired (constantly renewable) medium under an arbitrary atmosphere.
  • the substrate can also be cooled in the colonization device.
  • cooling liquids or gases such as nitrogen
  • cryopreservation of a populated or not populated substrate can be achieved.
  • cryopreservation can also be carried out before the substrate is populated. This can e.g. be connected to a sterilization phase.
  • an additional chamber with at least one inlet and outlet can be formed on the inner wall of the container of the settlement device with the aid of a microporous partition.
  • Several chambers can also be formed in the same way. Special media or cultures (so-called feeder cultures) can be kept in these chambers which supply one or more colonization chambers of the device with certain nutrients or factors.
  • Fig. 1 shows a cylindrical two-chamber colonization device for a tubular substrate in a longitudinal section in an exploded view
  • Fig. 2 shows a device, as shown in Figure 1 Darge, with an additional chamber formed by a porous partition on the inside of the container; 3 shows a cylindrical two-chamber colonization device for a double-walled tubular substrate in a representation corresponding to FIG. 1;
  • Fig. 4 shows a multi-walled substrate in longitudinal section
  • Fig. 5 shows a partial view of a Einspannvorrich device for a branched substrate (also in
  • FIG. 6 shows a cross section through a box-shaped settlement device with a frame-shaped clamping device
  • Fig. 7 shows a holder for a cylindrical populating device according to the invention
  • Fig. 1 shows a first embodiment of the invention in longitudinal section in an exploded view. It is a cylindrical settlement device which is designed for the settlement of a tubular substrate, designated B in the drawing.
  • the container 10 consists of two container parts 10a, 10b, which are not put together in the illustration.
  • the liquid inlet 16a simultaneously forms a first annular or tubular holder 12a for the substrate in the interior of the device.
  • the second annular holder 12b is connected to the container lid 10b via rods 30 and thus mechanically fixed to the first holder 12a.
  • the brackets 12a, 12b together form the clamping device for the tubular substrate B, a heart valve.
  • the holder 12b seals via the sealing ring 40 against the inner wall of the container part 10a and the drain 16b. Equal- in time the container 10 is closed from the container parts 10a and 10b and sealed with the seal 42. This creates, with the participation of the clamped substrate B, two chambers, one inside the tubular substrate B and one around the substrate.
  • the cell suspension and / or the culture medium is supplied through the inlet 16a, runs inside through the annular holders 12a and 12b and the substrate and is removed again through the outlet 16b.
  • Inlet 16a and outlet 16b are kept closed during the settlement phase. After the settlement phase has ended, the medium is discharged again via process 16b.
  • the cell suspension and / or the culture medium for colonizing the outer surface of the substrate is fed through the inlet 16a ', is distributed in the interior of the container around the substrate B and is removed again via the outlet 16b'. Otherwise, the settlement takes place as already described.
  • the two separate chambers or compartments can be perfused separately.
  • the perfusion can take place with different growth factors and concentration, so that different media can be offered specific to the cell type and internal gradients can be formed. Settlement and perfusion phases can alternate without having to open the reactor.
  • the insert with the substrate can be pulled out as a drawer when the cover is removed.
  • the handling of the finished substrate, or here heart valve implant, is thereby considerably simplified, and the safety with regard to sterility and integrity of the substrate is increased.
  • FIG. 2 shows a device as shown in FIG. 1, in which an additional chamber is separated by an additional microporous partition wall 20 on the inner wall of the cylindrical container 10a, ie inside the cylinder jacket.
  • This additional chamber can be filled with the desired medium through at least one inlet 18a and at least one outlet 18b. be sent.
  • the microporous partition can consist, for example, of a silicone film, of PTFE, sintered glass, polycarbonate, cellulose, polyamides or other plastics.
  • FIG. 3 shows a cylindrical two-chamber colonization device 10 for a double-walled tubular substrate B 1 .
  • the settlement reactor is largely the same as the example shown in FIG. 1, the same reference symbols denoting the same components.
  • the difference from the colonization device from FIG. 1 is that this reactor is suitable for an at least double-walled substrate and has two additional inlets and outlets 19a, 19b, with the aid of which a medium or material enters a lumen between the walls of the double-walled one Substrate B 'can be introduced.
  • These inlets / outlets 19a / 19b are arranged on one holder 12a of the clamping device.
  • the holders 12a and 12b hold the tubular, but double-walled substrate at both ends, the end of the substrate being combined or bound together on the holder 12b, while on the holder 12a the feed and discharge 19a, 19b between the two walls of the substrate is introduced.
  • the interior of the substrate can then be supplied with the desired medium or material as well as with other cells.
  • FIG. 4 shows a further exemplary embodiment of such a multi-walled substrate B '- in the present case it is a three-walled substrate.
  • the substrate here can preferably also be a synthetic substrate.
  • the inner wall of the present substrate was designated 1B.
  • Two further shells 2b are arranged above them, holding any materials or cells in layers on the inner substrate.
  • the substrate is brought together at its ends, so that it is fastened together on the brackets 12a, 12b, not shown. Communication with the nutrient or settlement medium therefore does not take place via the inlets and outlets 19a, 19b as in FIG. 3, but rather by means of diffusion transverse to the direction of flow.
  • cells 3B are shown which are inserted into and onto the substrate.
  • Substrate structure enables significantly thicker substrates, so that, for example, tissues can develop capillary-like under the local differentiation pressure.
  • the substrate could consist of a solid, in particular a solid, inorganic material.
  • a solid, inorganic solid material a calcium-containing solid material, particularly a tri-calcium phosphate-containing solid material, e.g. may be used as sintered or glued pressed granulate.
  • material can be introduced very well into the porous wall structure of the solid using the bioreactor according to the invention.
  • a major advantage of bioreactor technology is that the products intended as implants are only removed from the bioreactor in the operating room immediately before implantation, so that a closed, sterile patient is treated from the first treatment of the substrate to the implantation of the populated substrate Handling is guaranteed.
  • Tubular bone implants can be produced particularly advantageously in the bioreactor according to the invention, since it is possible to colonize the interior of the tube separately from the exterior of the tube.
  • FIG. 5 shows a partial view of a clamping device for a branched substrate, which itself is also shown in a partial view.
  • the holder 12b of the clamping device branches into the tubular holder sections 12c, 12d and 12e, which each hold one branch of a Y prosthesis B '' - in the present case with one end branched into three branches. Otherwise, can the device, as shown in Figures 1 to 3, be formed.
  • FIG. 6 shows a further exemplary embodiment of a colonization device comprising a box-shaped container 10a with a rectangular lid 10b.
  • a frame-shaped clamping device 12 is arranged in this container 10 and is firmly connected to the lid 10b.
  • the insert consisting of the clamping device and the lid is sealed against the container 10a with the aid of the seals 42, the seal 42a being a U-shaped seal which runs around the frame-shaped clamping device 12 inside the container and which can be profiled in a suitable manner.
  • two liquid-separating ' closed chambers are formed within the settlement device, one above and one below the substrate.
  • an internal liquid transfer between the chambers can take place and may be desired. In this way it can be achieved that oxygenated medium can also get into the internal structures during the rolling phase of the settlement device.
  • Each of the chambers is equipped with a liquid inlet 16a, 16a 'and with a liquid outlet 16b, 16b'.
  • gas supply and discharge lines can be provided, which are not shown here. As long as the reactor is rolled during the settlement, the feed and discharge lines 16a, 16a ', 16b, 16b' are disconnected. If this is not desired, rotatable couplings are provided. However, the procedure is usually gradual.
  • FIG. 7 shows a suitable rollable holder 100, in which the settlement device 10 can also be pivoted in a roll cabinet during the settlement.
  • the 100 consists of two panes 110 made of glass or plexiglass, which are provided with two openings 120 eccentrically.
  • the openings 120 are best oval or cylindrical in section; the In this example, disks 110 are circular, but can also be shaped differently, for example elliptically.
  • the disks 110 are connected by a plurality of rods 130, but they could also be connected by a closed cylinder jacket. The connection of the disks 110 is selected such that the openings 120 are opposite one another offset from the projection.
  • a tube 140 is inserted between the openings 120, into which the settlement device 10 can be inserted.
  • the longitudinal axis of the settlement device then extends obliquely to the longitudinal axis of the cylindrical holder 100 as a whole. Together with the settlement device 10, the holder 100 forms an arrangement which can be inserted into a rolling cabinet.
  • the populating device When treated in a rolling cabinet, the populating device is subjected to a rolling movement about its longitudinal axis and at the same time a swiveling movement transverse to its longitudinal axis.
  • the culture medium can be brought into contact with the substrate in a particularly intensive and uniformly distributed manner.
  • the side walls of the devices shown in the figures can e.g. consist of gas-permeable PTFE or silicone foils in order to improve the oxygen supply during perfusion-free settlement phases.
  • a constant gas exchange or a temporary deliberate oxygenation with oxygen or oxygen mixture significantly increases the adhesion efficiency (up to 100-200%) during the rolling phase.
  • the substrate is optimally supplied with oxygen at all times (roll phase and perfusion phase). Due to the circulation, the used medium continuously reaches the oxygenating reactor walls.

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Abstract

Das Besiedlungsverfahren für die Besiedlung eines Substrates mit lebenden Zellen sieht eine Besiedlung mit wenigstens einer Besiedlungsphase und wenigstens einer Perifusionsphase vor. Während der Besiedlungsphase kann das Substrat mit der Zellsuspension durch ständiges Drehen in verschiedene Raumrichtungen in Kontakt gehalten werden. Die zugehörige Besiedlungsvorrichtung (10) besteht aus einem rollbaren Behälter (10a) und einem darin angeordneten herausnehmbaren Einsatz mit einer Einspannvorrichtung (12) für das zu besiedelnde Substrat, z.B. eine Kunststoff- oder Collagenmatrix. Der Einsatz ist so ausgebildet, dass unter Zusammenwirken mit dem eingespannten Substrat innerhalb des Behälters zwei flüssigkeitsdichte Kammern auf entgegengesetzten Seiten des eingespannten Substrats gebildet werden, um eine getrennte Besiedlung beider Substratseiten zu ermöglichen. Die Behälterkammern sind mit Flüssigkeitszu- und -abläufen (16) und ggf. Gaszu- und -abführleitungen versehen. Der rollbare Besiedlungsreaktor (10) wird für bestimmte Phasen der Besiedlung in einen Rollschrank eingelegt.

Description

Verfahren zur Besiedlung von Substraten mit biologischen Zellen und dafür verwendbare Besiedlungsvorrichtungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Besiedlung von
Substraten mit lebenden biologischen Zellen und dafür verwendbare Besiedlungsvorrichtungen.
Es ist für verschiedene Zwecke erwünscht, Substrate bzw. Ma- trizes mit Zellen zu besiedeln, die dann auf diesen Substraten aufwachsen sollen. Als Substrate kommen sowohl solche natürlichen Ursprungs als auch synthetische Substrate in Frage. Beispiele für Substrate natürlichen Ursprungs können u.a. Collagensubstrate sein. Synthetische Substrate können beispielswei- se aus biologisch inerten Kunststoffen bestehen. Die mit lebenden Zellen zu besiedelnden Substrate haben häufig eine netz- oder schwammartige Struktur, um das Einwachsen der Zellen zu erleichtern.
Für die Besiedlung müssen die Zellen dem Substrat zugeführt werden, ohne dass sie zerstört oder beschädigt würden, und sie müssen so auf das Substrat aufgebracht werden, dass es zu einem Anwachsen kommen kann. In den meisten Fällen wird ein geschlossener Zellrasen angestrebt werden.
Die für die Besiedlung vorgesehenen gezüchteten oder andernorts abgelösten Zellen befinden sich im allgemeinen in einem Kulturmedium. Bei herkömmlichen Besiedlungsverfahren, die hauptsächlich im Labormaßstab stattfinden, wird das Substrat mit den in dem Kulturmedium befindlichen Zellen beispielsweise in einer sogenannten Rollflasche in Kontakt gebracht. Die Rollflasche wird in einem Rollschrank gerollt, so dass das Substrat, das Kulturmedium und die Zellen in ständiger nicht zu heftiger Bewegung gehalten werden.
Bei der Besiedlung besteht das Problem, dass das Substrat einerseits von dem Kulturmedium mit den Zellen umspült werden soll, denn es sollen ständig Zellen an das Substrat herangetragen werden, damit sie dort einwachsen, andererseits jedoch darf die Strömung oder die Roll- oder Schwenkbewegung innerhalb der Flasche nicht so groß sein, dass die frisch aufgebrachten Zellen noch vor dem erfolgreichen Einwachsen wieder abgeschert werden. Darüberhinaus besteht auch das Problem, dass das Substrat für die Zellen an allen Stellen erreichbar sein soll, es darf sich also nicht durch die Rollbewegung falten oder an den Rollflaschenkörper anlegen.
Bei bisherigen Besiedlungsversuchen gelang es wenig bis gar nicht, eine normale Differenzierung der anwachsenden Zellen zu erreichen. Die künstlich besiedelten Substrate unterscheiden sich daher in der Struktur ihrer Zellschichten von den natürlichen Vorbildern.
Ein weiterer Nachteil bisheriger Besiedlungsverfahren war, dass eine vollständige Konfluenz des Endothelzellrasens bei bioartifiziellen Gefäßen nicht ausgebildet werden konnte.
Es wäre daher wünschenswert, wenn ein Verfahren entwickelt werden könnte, bei dem die bei der Besiedlung verwendeten Zellen durch die Kulturbedingungen in die Lage versetzt werden gewebetypische Zellverbände und eine physiologische Differenzierung auszubilden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Besiedlungsverfahren und dafür verwendbare Besiedlungsvorrichtungen zu entwickeln, mit Hilfe dessen/derer die Besiedlung eines Substrats unter optimalen Anwachsbedingungen erfolgen kann. Die zu entwickelnde Besiedlungsvorrichtung soll apparativ un- aufwendig eine effektive Besiedlung ermöglichen. Ferner soll die Handhabung des Substrats während des gesamten Besiedlungsverfahrens sicher und einfach sein.
Die Besiedlungsvorrichtung soll vorzugsweise gleichzeitig als Gefäß für Sterilisation, Azellularisierung, Lagerung, Transport und Kryokonservierung verwendbar sein. Dies ist erwünscht, um eine Unterbrechung der Sterilkette bis zum Endanwender zu vermeiden. Gelöst wird diese Aufgabe einerseits durch ein Verfahren zur Besiedlung von Substraten mit biologischen Zellen,
- bei welchem innerhalb einer Vorrichtung ein darin gehalter- tes Substrat sowie für die Besiedlung vorgesehene Zellen we- nigstens einer Besiedlungsphase unterworfen werden, während welcher das Substrat in oder mit der Vorrichtung um wenigstens eine Achse gedreht wird und die Zellen während der Drehbewegung immer wieder in Kontakt mit dem Substrat gebracht werden,
- und bei welchem das Substrat nach oder während einer oder mehreren Besiedlungsphasen wenigstens einer Perfusionsphase unterworfen wird, während welcher das Substrat wenigstens an Bereichen seiner äußeren oder inneren Oberfläche perfundiert wird.
Unter einer Besiedlungsphase wird nach dem Verständnis dieser Erfindung eine solche Phase verstanden, während derer dem Substrat in geeigneter Weise Zellen zugeführt werden, mit denen das Substrat besiedelt werden soll.
Vorzugsweise werden dem Substrat während einer Besiedlungsphase Zellen in einem Medium zugeführt oder durch Aufstreichen auf das Substrat, Einbringen in das Substrat oder Beschichten des Substrates mit einer die Zellen enthaltenden Masse (z.B. Kollagen) vorgelegt.
Dabei können den Zellen Faktoren oder Co-Faktoren, insbesondere Wachstumsfaktoren oder chemotaktische Faktoren beigegeben werden.
Unter einer Perfusionsphase wird nach dem Verständnis dieser Erfindung eine solche Phase verstanden, während derer das Substrat perfundiert wird, wie dies dem üblichen fachsprachlichen Gebrauch des Begriffs "Perfusion" entspricht. Vorzugsweise wird das Substrat mit einem flüssigen Zellkultur- Nährmedium, Blut oder Plasma, die wiederum mit verschiedenen Stoffen angereichert sein können, perfundiert.
Innerhalb des Verfahrens können mehrere Besiedlungs- und Perfusionsphasen miteinander abwechseln, vorzugsweise alternie- rend. Während eine Durchführung der Besiedlungsphasen in ähnlicher Weise bereits bekannt war, wurde überraschenderweise gefunden, dass ein Einbeziehen ein oder mehrerer Perfusionsphasen in den Verfahrensablauf das Besiedlungsergebnis deutlich verbessert. Mit Hilfe der Perfusionsphasen werden quasi-physiologische Bedingungen simuliert, die für die Ausbildung einer normalen Zelldifferenzierung wesentlich sind. Scherstress, der durch die Perfusion in gezieltem Umfang eingeführt wird, differenziert Endothelzellen. Glatte Muskelzel- len reagieren auf pulsatile Drücke, die ebenfalls während der Perfusion erzeugt werden können. Während der Perfusion können Sauerstoff und Nährstoffe herangeführt sowie Druckbelastungen ausgeübt werden. Physiologische Druckschwankungen wie sie in vivo zwischen Systole und Diastole entstehen sind von besonde- rer Bedeutung für die Orientierung der neugebildeten Zellen (der extrazellularen Matrix) und Ausbildung einer normalen Stabilität und Druckbelastbarkeit.
In Br. J. Surg. 1991, Vol. 78, 878-882, wurde bereits die Be- Siedlung eines synthetischen röhrenförmigen Gefäßes auf seiner Innenseite beschrieben. Die Besiedlung erfolgte mit Aliquots einer Endothelzellensuspension unter Drehen des Gefäßes. Dabei war festgestellt worden, dass die Besiedlung des mit Fibro- nectin beschichteten PTFE-Gefäßes wesentlich in ihrer Haltbar- keit gegenüber pulsierend fließendem Blut verbessert werden konnte, wenn anstelle eines kurzen (20-minütigen) Besiedlungszyklus ' ein langer Zyklus über Nacht in einem Rollschrank verwendet wurde. Es wurde dort jedoch nicht erkannt, dass eine gezielte Perfusion des besiedelten Gefäßes das Besiedlungser- gebnis selbst verbessern kann. Weiterhin ist das zugehörige Gerät nur um seine eigene Achse drehbar und nicht in vielen Raumrichtungen. Zusätzlich ist die Aufnahme und die Entfernung des Gefäßes sehr umständlich, da an beiden Enden Kappen entfernt werden müssen. Bei der Herausnahme des fertig besiedel- ten Gefäßes besteht die Gefahr, dass die Struktur unsteril wird, denn es sind einige umständliche Manipulationen erfor¬ derlich, um das Gefäß aus dem Reaktor zu entfernen. Vorzugsweise kann die Drehung des Substrats während der Besiedlungsphasen in einer überlagerten Drehbewegung um wenigstens zwei Raumachsen gleichzeitig erfolgen. Dabei kann es sich auch um eine zufallsgesteuerte Drehbewegung in alle Raum- richtungen handeln, worauf in Zusammenhang mit den für das
Verfahren geeigneten Besiedlungsvorrichtungen noch eingegangen werden wird.
Alternativ kann die Drehung des Substrates während der Besied- lungsphasen um wenigstens zwei Raumachsen nacheinander oder alternierend erfolgen.
Das Verfahren kann auch so ausgestaltet sein, dass das Substrat nach wenigstens einer Besiedlungsphase einer zusätz- liehen Ruhephase unterworfen wird, während derer keine Drehung und keine Perfusion erfolgt. Eine solche Ruhephase kann zwischengeschaltet werden, um dem vollständig oder teilweise besiedelten Substrat eine belastungsfreie Konsolidierungsphase zu gönnen, während derer der Zellrasen sich festigen oder auch intern umorganisieren kann.
Die intermittierende Perfusion ermöglicht auch die Ausbildung von mehreren Schichtstrukturen; hierfür werden beispielsweise in mehreren Besiedlungsphasen hintereinander z.B. zuerst Bin- degewebszellen, glatte Muskelzellen und dann Endothelzellen aufgegeben, wobei zwischen den einzelnen Besiedlungsphasen Perfusionsphasen eingeschaltet werden Dadurch kann die Aufgabe des jeweils nachfolgenden Zelltyps auf bereits strukturierte und gewebetypisch differenzierte Verbände erfolgen.
Die Besiedlung mit Fibroblasten/glatten Muskelzellen kann über Tage und Wochen geführt werden, bis schließlich der Endothel- rasen innerhalb weniger Stunden bis zu Tagen gezüchtet wird. Die Endothelzellen können zwischenzeitlich vorteilhaft kryo- konserviert gelagert werden, so dass sie keine unnötige Kulturdauer erfahren.
Zusätzlich können die matrixbildenden Zellen mehrfach erneut hinzugegeben werden. Eine wiederholte Applikation von Zellen alternierend mit Perifusionsphasen ist möglich. Dies bedeutet einen Wechsel von Rotationsbewegungen der Besiedlungsvorrichtung zu Perfusionen im ruhenden Betrieb. Die Besiedlungsvorrichtung kann hierzu vertikal aber auch horizontal sowie in beliebigen anderen Positionen stationär verbleiben. Dies ist von Bedeutung bei der Erstellung von Herzklappen, wobei ein nachfolgend näher beschriebener Pulsationsbetrieb vorzugsweise in einer vertikalten Position der Herzklappe erfolgt. Hierbei ist durch die Schwerkraft ein spontaner Schluß der Klappense- gel nach Beendigung der Pulsationsphase möglich.
Ferner kann das Verfahren weitere Phasen mit zusätzlchen Verfahrensschritten zur Behandlung des bereits besiedelten, teilweise besiedelten oder noch nicht besiedelten Substrats umfas- sen. Beispielsweise kann eine vorgeschaltete Azellularisierung des zu besiedelnden Substrates, ein oder mehrere Spülphasen, eine Sterilisierung und/oder verschiedene Begasungen in das Gesamtverfahren einbezogen sein, ohne dass der Bioreaktor geöffnet und das Substrat umgesetzt werden müßte.
In Weiterbildung der Erfindung kann zwischendurch die Applikation von Wachstumsfaktoren oder Zellen eingebettet in Hilfssubstanzen wie z.B. Hydrogelen erfolgen. Es kann z.B., insbesondere bei der Besiedlung einer Röhre, eine Kollagenmatrix (Typ I oder Mixturen mit anderen Matrixkomponenten) oder auch ein Fibrinogen oder Fibronektingemisch mit Zellen aufgegeben werden, bei einer Röhre außen und/oder innen. Dies kann durch Aufstreichen oder Auftropfen geschehen. Als zelltypspezifische Wachstumsfaktoren und chemotaktische Faktoren können bei- spielsweise VEGF oder PDGF appliziert werden. Hierdurch können Gradienten für das Durchwandern von Bindgewebszellen aufgebaut werden. Soweit in den verschiedenen Kammern unterschiedliche Zelltypen kultiviert werden, kann das Medium den entsprechenden Zelltypen angepasst werden.
Für die Sterilisationsphase oder Lagerphase können Unterbrechungen mit oder ohne vorausgehende oder nachfolgende Kryokon- servierungsschritte erfolgen. Die Perfusion kann vorzugsweise pulsierend erfolgen. Diese Maßnahme dient zur noch naturgetreueren Simulation physiologischer Bedingungen. Wie schon erwähnt reagieren insbesondere glatte Muskelzellen auf pulsatile Drücke, so dass sich ein derart weitergebildetes Verfahren beispielsweise für eine Besiedlung mit glatten Muskelzellen anbietet. Die nachfolgend näher beschriebene Besiedlungsvorrichtung ist hierfür besonders geeignet, da das Substrat im Inneren durch Veränderung der Position der Vorrichtung in verschiedene Stellungen ge- bracht werden kann. Außerdem wird dem Substrat genügend Raum für flexible Volumenänderungen (zu größerem oder kleinerem Volumen) gegeben.
Schließlich kann das Substrat durch das erfindungsgemäße Ver- fahren bereichsweise mit verschiedenen Zellen besiedelt werden, sofern dies für das jeweilige Substrat gewünscht wird. Dies ist insbesondere - wie nachfolgend noch beschrieben - mit den besonders für dieses Verfahren entwickelten Besiedlungsvorrichtungen möglich, bei denen angrenzend an das Substrat mehrere voneinander getrennte Kammern oder Komparti ente gebildet werden, die getrennt mit verschiedenen Medien oder Be- siedlungs-Kulturlösungen beaufschlagt sowie auch getrennt perfundiert werden können. Ersatzweise ist es jedoch auch möglich, das Substrat bereichsweise zu schützen, z.B. abzudecken oder abzubinden, und dann verschiedene Bereiche nacheinander in verschiedenen Schritten zu behandeln.
Das Substrat kann falls gewünscht auch nacheinander mit verschiedenen Zellen besiedelt werden, wodurch auf dem Substrat mehrere Schichten mit verschiedenen Zellen gebildet werden könnten .
Das eingesetzte Substrat, das wie weiter oben bereits beschrieben vorzugsweise flächig oder röhrenförmig ist, kann selbst Innenkammern besitzen oder kann doppel- oder mehrwandig sein. Es kann auch porös oder schwammförmig sein, so dass sich Zellen in den Poren oder Kanälen dieses Materials absetzen können . Das Substrat kann aus einem biologischen Material natürlichen Ursprungs (xenogen, allogen, autolog) bestehen, aus nachgebildeten biologischen Materialien, synthetischen Proteinen, z.B. Kollagen, aus Biopolymeren, Polymeren, textilen Kunststoffen oder Feststoffen. Das Substrat kann auch ein poröser oder schwammartiger Feststoff sein, z.B. ein anorganischer Feststoff in Bimstein-Struktur . Derartige Feststoffe wären u.a. für die Herstellung von Knochenprothesen geeignet. Das FeststoffSubstrat könnte dabei stückig oder röhrenförmig ausgebil- det sein. Generell können die Substrate eine beliebige Form besitzen, solange diese für ein Umströmen (ggf. innen und außen) beim Besiedeln geeignet sind.
Das Substrat kann, falls gewünscht, durch Einleiten von Kühl- flüssigkeit oder Gasen wie insbesondere Stickstoff, kryokon- serviert werden.
Weiterhin wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch eine Besiedlungsvorrichtung gelöst, die aus einem Behälter und einer dar- in angeordneten Einspannvorrichtung für ein zu besiedelndes
Substrat besteht, wobei die Einspannvorrichtung so ausgebildet ist, dass unter Zusammenwirken mit dem eingespannten Substrat innerhalb des Behälters wenigstens zwei im wesentlichen flüs- sigkeitstrennende oder einen kontrollierten Flüssigkeitstrans- fer ermöglichende Kammern auf entgegengesetzten Seiten des eingespannten Substrates gebildet werden, und die außerdem wenigstens je einen Flüssigkeitszu- und -ablauf für jede der gebildeten Kammern besitzt.
Der Behälter der Besiedlungsvorrichtung sollte so geformt sein, dass das Substrat von dem Kulturmedium frei umspült werden kann, wenn es in der Einspannvorrichtung eingespannt ist. Das Substrat kann dabei an der oder den Halterungen in jeder geeigneten Weise befestigt sein, z.B. angebunden, angeklammert oder angenäht. Die Form von Behälter und Einspannvorrichtung muß aufeinander angepaßt sein. Beispielsweise kann der Behälter aus einem Gefäß mit einem Deckel bestehen, wobei der Dek- kel mit der Einspannvorrichtung verbunden ist und beides zusammen einen herausnehmbaren Einsatz bilden kann. Durch einen herausnehmbaren Einsatz wird die Handhabung des Substrats vor und nach der Besiedlung vereinfacht. Beim Herausnehmen des Einsatzes aus dem Reaktor muss das Substrat (d.h. z.B. das fertige Implantat) nicht berührt oder von feststehenden Reaktorteilen entfernt werden, die im Reaktorinneren schlecht zugänglich wären. Eine nachteilige Montage/Demontage des zu besiedelnden Substrates an fixen, nicht herausnehmbaren Gehäuseteilen wird somit vermieden. Dies erleichtert erheblich sowohl die Handhabung als auch die Verwendung nach dem Transport zum Endanwender unter sterilen Bedingungen, z.B. im Operationssaal durch den Arzt vor Implantation. Das mit der Einspannvorrichtung aus dem Reaktor herausgenommene Substrat ist frei zugänglich, bleibt vorerst stabilisiert, und kann - je nach Befestigungsmechanismus - sehr einfach abgenommen
(abgebunden, abgeklemmt, abgeschnitten) werden. Die sterile Handhabung des fertig besiedelten Substrats, bzw. Implantats wird dadurch erheblich vereinfacht.
Der Einsatz ist dann in der Weise ausgebildet, dass die Einspannvorrichtung so am Behälterinneren anliegt, dass auf den entgegengesetzten Seiten des eingespannten Substrats jeweils zwei flüssigkeitstrennende Kammern gebildet werden. In den verschiedenen Kammern soll mit getrennten Medien oder Zellen gearbeitet werden können. Selbstverständlich kann auch auf beiden Seiten des Substrates, bzw. innen und außen, mit gleichen Zellen und/oder Medien gearbeitet werden. Ein wesentlicher Vorteil der Apparatur ergibt sich daraus, dass mehrfach (auch verschiedene) Zellen durchgespült werden können und dass zwischen Besiedlungs- und Perfusionsphasen gewechselt werden kann, ohne dass der Reaktor geöffnet werden üsste. Es kann auch ein gezielter Flüssigkeitstransfer durch das Substrat erwünscht sein, insbesondere bei organischen Substraten. Das zu besiedelnde Substrat ergänzt den Einsatz so, dass ein oder mehrere Kammertrennwände gebildet werden. Die Einspannvorrichtung kann auch für das Einspannen mehrerer Substrate ausgebildet sein, wobei dann mehrere Kammern gebildet werden. Jede der gebildeten Kammern ist vorzugsweise mit Flüssigkeitszu- und - ablauf ausgestattet Ebenso kann das Substrat selbst bereits mehrkammrig sein, insbesondere doppel- oder mehrwandig mit Lumina zwischen den Wandungen. In diesem Fall kann in Weiterbildung der Erfindung vorgesehen sein, dass die Einspannvorrichtung - vorzugsweise an einer der Substrat-Halterungen - wenig- stens einen weiteren Zu- und/oder Ablauf für das Einbringen von Medium, Zellen und/oder Material in wenigstens eine Innenkammer dieses doppel- oder mehrwandigen Substrates aufweist.
Falls die Herstellung eines verzweigten Substrates gewünscht ist, kann die Einspannvorrichtung entsprechend angepasst sein, beispielsweise an einer der Halterungen verzweigt für die Herstellung einer Y-Prothese.
Alternativ kann der Behälter auch aufklappbar oder auf geeig- nete Weise demontierbar sein, damit das in der Einspannvorrichtung eingespannte Substrat möglichst problemlos in die Besiedlungsvorrichtung eingebracht und aus dieser wieder entfernt werden kann.
Vorzugsweise ist der Behälter der Besiedlungsvorrichtung selbst roll- oder schwenkbar ausgebildet, so dass er während der gesamten Besiedlungszeit oder für bestimmte Besiedlungsschritte in einen thermostatisierten Rollschrank eingelegt werden kann. Hierfür kann die Besiedlungsvorrichtung bei- spielsweise zylindrisch ausgebildet sein. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn ein röhrenförmiges Substrat, wie eine Herzklappe oder ein anderes röhrenförmiges Gefäß besiedelt werden soll. Diese Ausführungsform wird in der Figurenbeschreibung noch näher erläutert.
Allgemein ist die Einspannvorrichtung vorzugsweise im wesentlichen quer zu einer durch eine Roll- oder Schwenkbewegung des Behälters vorgegebenen Vorzugsbewegungsrichtung eines darin befindlichen flüssigen Mediums angeordnet. Die Einspannvor- richtung kann dabei vorzugsweise in Bezug auf die Zu- und Abläufe so angeordnet sein, dass eine durch die Zu- und Abläufe vorgegebenen Strömungsrichtung des flüssigen Mediums durch den Reaktor längs oder innerhalb des eingespannten Substrats verläuft. Für flache Substrate, beispielsweise Hautstücke, kann die Einspannvorrichtung aus wenigstens einer rahmenförmigen Halterung bestehen. Die rahmenförmige Halterung wäre dann vorzugsweise seitlich an einem Einschubteil befestigt, das gleichzeitig einen Deckel für einen kastenförmigen Behälter bildet. Bei Einsetzen des Einsatzes mit der rahmenförmigen Halterung sollte der Rahmen an drei Seiten innen an dem kastenförmigen Behälter anliegen, während die vierte Seite mit dem am Einsatz befe- stigten Deckel verbunden ist. Hierdurch ergeben sich innerhalb des Behälters drei Kammern, die jeweils mit einer Zu- und Ableitung für flüssiges Medium versehen sein müssen. Diese Zu- und Ableitungen können über den Deckel des Einsatzes geführt werden. Da ein kastenförmiger Behälter selbst nicht rollbar ist, würde dieser für den Einsatz im Rollschrank in eine Halterung eingesetzt. Eine derartige Anordnung ist weiter unten beschrieben.
Die Einspannvorrichtung kann alternativ auch aus zwei ringför- migen Halterungen für das Substrat bestehen, die mechanisch fest untereinander verbunden sind, beispielsweise durch Stangen.
Der roll- oder schwenkbare Behälter kann auch kugelförmig oder kugelähnlich geformt sein, um weitere Freiheitsgrade bei der
Bewegung im Rollschrank zu ermöglichen. Dabei können zusäzlich noch Auslenknoppen an dem kugelförmigen Behälter (bzw. der kugelförmigen Halterung, siehe unten) vorgesehen sein, wodurch die Rollrichtung bei Behandlung in einem Rollschrank oder ei- nem entsprechenden Apparat noch häufiger zufallsgesteuert geändert wird und ein Drehen und Schwenken in allen Raumrichtungen möglich ist. Der Behälter kann aus einem starren oder einem flexiblen Material sein. Letzteres bringt u.a. den Vorteil mit sich, dass es ein in gewissem Umfang variables Volumen zu- lässt, so dass sich das Substrat z.B. bei Druckbelastung noch stärker ausdehnen kann.
Zusätzlich zu den Flüssigkeitszu- und ablaufen, durch die bei Besiedlung das Medium mit den Zellen geführt wird, können die Kammern mit ein oder mehreren Gaszu- und Gasabführleitungen ausgestattet sein. Die Gas- zu und Abführleitungen können die Form von Schläuchen haben, die an den Wänden entlang geführt werden und aus gaspermeablen Materialien bestehen, wie z.B. Silikon. Durch diese können dem Kulturmedium während der Besiedlung Gase zugeführt werden bzw. von diesem abgezogen werden. Der Gasaustausch kann jedoch - ersatzweise oder zusätzlich - auch durch gasdurchlässige Außenwände des Behälters der Besiedlungsvorrichtung ermöglicht werden.
Hierzu können die Wände des Behälters aus einer PTFE-Folie oder einer Silikonfolie gebildet sein oder Einsätze aus diesen Strukturen oder gaspermeablen Materialien enthalten. Die Wandstrukturen können auch aus Sintermetall bzw. einer mikroporö- sen Keramik oder porösem Glas gebildet sein. Diese poröse Trägerstruktur kann mit einer gaspermeablen Schicht, z.B. einer Folie aus Kunststoff (z.B. PTFE, Silikon) überzogen sein.
Ein Vorteil der in die Wandstrukturen des Gehäuses der Besied- lungsvorrichtung integrierten gaspermeablen Membranen oder Folien ist, dass die Umgebungsatmosphäre im Brutschrank (herkömmlicher Rollschrank oder gesondert dafür vorgesehene Apparatur) direkt für den Sauerstoffaustausch und über eine Kohlendioxid-Phase auch für die pH-Regulation in dem Kulturme- dium eingesetzt werden kann. Von Bedeutung hierbei ist, dass somit den Besiedlungskompartimenten (-kammern) einer eingesetzten dreidimensionalen Struktur (z.B. Gefäß oder Herzklappe) gleichzeitig ein Kulturreservoir und eine Oxygenierungs- funktion zur Verfügung steht.
Die Zu- und Abläufe des Nährmediums bzw. die Gaszu- und - Abführleitungen können an dem Besiedlungsvorrichtung mit drehbaren Kupplungen angeschlossen sein, wodurch es ermöglicht würde, dass die Besiedlung währdend des Rollens des Besied- lungsvorrichtungs in einem besonders hierfür ausgelegten Rollschrank durchgeführt werden kann. Hierfür könnten die über die Kupplung angeschlossenen Leitungen konzentrisch ausgeführt sein . Schließlich ist es in Weiterbildung der Erfindung möglich, dass im Inneren des Behälters bestimmte Einbauten angeordnet sind, die das flüssige Medium, während es durch den Reaktor strömt, in gewünschter Weise leiten. Hierbei kann es sich um an der Behälterinnenwand angeordnete Stege oder Schläuche handeln. Geeignete Einbauten im weiteren Sinne sind aus dem Reaktorbau für andere Zwecke bekannt.
Der Reaktorbehälter kann auch mit als solches bekannten Vor- richtungen zum Heizen oder Kühlen versehen oder verbunden sein. So können z.B. in die Außenwand des Reaktors Heizdrähte zum Temperieren des Mediums eingelassen sein. Auch kann der Reaktorbehälter für die Aufnahme eines Heiz- oder Kühlmediums, wie z.B Wasser ummantelt sein.
Über die Zu- und Abläufe wird das Kulturmedium durch den Reaktor geleitet, das in einer Ausführungsform die zu besiedelnden Zellen enthält. Alternativ kann auch eine bestimmte Menge an Zellen in dem Reaktor vorgegeben werden, wobei dann nur das reine Kulturmedium umläuft. Die Zu- und Abläufe werden vorzugsweise mit Filtern versehen sein, um ein ungewolltes Ausschwämmen der Zellen zu verhindern. Zusätzlich sind an den Zu- und Abläufen Verschlüsse (Absperrventile) vorgesehen, um die einzelnen Kammern verschließen zu können. Die Rezirkulation von Zellen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise vermieden. Im Gegensatz zu der früheren Flußbesiedlung werden hier die Zellen über dem Substrat gehalten.
Wie bereits oben geschildert, befindet sich im Inneren des Be- hälters eine Einspannvorrichtung für das zu besiedelnde
Substrat. Das Substrat wird während der Besiedlung in einer Einspannvorrichtung gehaltert, damit es von den gewünschten Seiten für das Kulturmedium und die Zellen frei zungänglich ist und nicht in sich zusammenfällt oder aneinander verklebt. Gleichzeitig dient die Halterung dazu, das Substrat innerhalb des vorzugsweise herausnehmbaren Einsatzes in den Reaktor einzuführen und aus diesem wieder zu entnehmen. Der herausnehmbare Einsatz dient damit gleichzeitig einer verbesserten Handhabung des Substrats, das darin beispielsweise unmittelbar nach der Besiedlung in eine Flüssigkeit eingelegt, in sonstiger Weise behandelt oder konserviert werden kann.
Da das zu besiedelnde Substrat die Fläche zwischen Zu- und Ab- lauf innerhalb der Einspannvorrichtung kontinuierlich verbinden muß, können zusätzlich zur Längen- und Größenadaption Zwischenstücke aus z.B. mit Fasern armierten Röhren oder Trichtern aus Silikon oder anderen vorzugsweise elastischen Kunststoffen eingebracht werden. Diese können verschieblich hin- sichtlich Distanzuberbruckungen als auch Verkürzungen sein.
Die Einspannvorrichtung ist erfindungsgemäß im wesentlichen quer zu einer durch die Roll- oder Schwenkbewegung des Behälters bzw. des in der unten noch beschriebenen Halterung gehal- terten Behälters vorgegebene Vorzugsbewegungsrichtung des flüssigen Mediums angeordnet. "Im wesentlichen quer" soll bedeuten, dass das Substrat mit Hilfe der Einspannvorrichtung so angeordnet ist, dass das bewegte flüssige Medium, d.h. die Zellsuspension in Kulturmedium, durch das Rollen oder Schwen- ken stetig in einem Winkel zwischen etwa 30 und 150° zur Drehachse der Roll- oder Schwenkbewegung auf das Substrat "aufgeworfen", d.h. mit diesem immer wieder in Kontakt gebracht wird. Dabei wird die Vorzugsbewegungsrichtung des flüssigen Mediums unter Vernachlässigung einer womöglich (aber nicht zwingend) gleichzeitigen Strömung des flüssigen Mediums längs des eingespannten Substrats betrachtet.
Bei der Besiedlung, d.h. zumindest während bestimmter Besiedlungsperioden, wird der roll- oder schwenkbare Behälter, d.h. die Besiedlungsvorrichtung im Ganzen, in einen Rollschrank oder eine Apparatur zum Schwenken oder in vergleichbare Vorrichtungen mit entsprechender Funktion eingebracht und dort gerollt oder geschwenkt, um das Kulturmedium und die darin suspendierten Zellen relativ zu dem eingespannten Substrat zu bewegen.
Die Besiedlungsvorrichtung wird in dem Rollschrank ebenso wie eine Rollflasche behandelt, d.h. gedreht und ggf. temperiert. Anstelle des Rollschrankes kann jedoch auch eine andere Vor- richtung verwendet werden, die geeignet ist, die Besiedlungsvorrichtung in der gewünschten Weise zu bewegen. Dies kann auch eine speziell für diesen Zweck vorgesehene gesonderte Apparatur sein. Der Rollschrank bzw. die Apparatur können auch eine spezifische Atmosphäre (Sauerstoff, Kohlendioxid) zur Verfügung stellen.
Das Durchströmen des Reaktors mit Kulturmedium bzw. Zellsuspension durch den Flüssigkeitszu- und -ablauf oder auch durch mehrere Zu- und Abläufe muß nicht während des gesamten Besiedlungsvorgangs erfolgen. Es kann auch besonders zweckmäßig sein, diesen Strom zeitweilig - beispielsweise während des Rollens im Rollschrank oder der Behandlung in einer Vorrichtung zu dem entsprechenden Zweck - anzuhalten. Hierzu können die Zu- und Abläufe zeitweilig abgeklemmt oder mit Hähnen verschlossen werden.
Das Kulturmedium kann - mit oder ohne Zellen - wenigstens zeitweilig durch die Zu- und Abläufe im Kreis geführt werden. Hierdurch werden Zellen, die im ersten Durchgang nicht anwachsen konnten, dem Substrat nochmals angeboten.
Die in dem Kulturmedium beweglichen noch nicht angewachsenen Zellen werden mit dem Längsstrom durch den Zulauf dem Substrat einerseits zugeführt und zweitens längs des Substrates verteilt. Die Verteilung "quer" zu dieser Längsrichtung erfolgt dagegen im wesentlichen durch die Roll- oder Schwenkbewegung, wobei beide Bewegungen sich überlagern können und dann zusammenwirken. Die Roll- oder Schwenkbewegung kann für den Zweck, die Zellen immer wieder mit dem Substrat in Kontakt zu bringen und auf diesem zu verteilen, noch mit anderen Arten der Bewegung überlagert sein, z.B. mit einer Rüttelbewegung.
Dadurch, dass eine Strömung entlang des Substrats eingestellt werden kann, wird eine gleichmäßige Zufuhr von Zellen zu allen Stellen des Substrats ermöglicht. Die Strömungsgeschwindigkeit kann so eingestellt werden, dass der Transport der Zellen, deren Einwachsen nach Möglichkeit nicht behindert. Das Einwachsen kann auch dadurch begünstigt werden, dass der Kulturmedi- umstrom eine Zeit lang angehalten wird, so dass die gerade über dem Substrat befindlichen Zellen dort eine Zeit verbleiben und Gelegenheit haben an- bzw. einzuwachsen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin eine Anordnung aus einer Besiedlungsvorrichtung wie vorstehend beschrieben und einer rollbar ausgebildeten Halterung. Die Halterung wird verwendet, um einen als solchen nicht rollbar Behälter, wie z.B. einen kastenförmigen Behälter in einem Rollschrank behandeln zu kön- nen, oder um zusätzliche Bewegungsrichtungen einzuführen. Vorzugsweise verlaufen die Rotationsachse der rollbaren Halterung und eine Längsachse des in der Einspannvorrichtung des Besied- lungsvorrichtungs eingespannten Substrats in einem Winkel zueinander.
Als Halterung für die vorgenannte Anordnung kann ein rotationssymmetrischer Körper verwendet werden, der eine oder mehrere Ausnehmung(en) oder Aufnahme (n) für eine Besiedlungsvorrichtung, wie vorstehend beschrieben, aufweist. Dieser rotati- onssymmetrische Körper kann aus einem geeigneten Material, wie z.B. Glas, Kunststoff oder Metall bestehen. Beispielsweise kann die Halterung aus einer Kugel mit einem röhrenförmigen Durchlaß bestehen. In diesen röhrenförmigen Durchlaß kann dann ein zylinderförmiger Reaktionsbehälter eingesetzt werden (es können auch mehrere Röhren für mehrere Behälter vorhanden sein), und die Kugel kann, nach Abklemmen der Zu- und Abführungen von der Besiedlungsvorrichtung, in einen Rollschrank eingelegt werden, so dass das Substrat während des Rollens in alle Richtungen gewendet wird. Die Halterung kann auch aus ei- nem zylinderförmigen Körper oder Gestell bestehen, in dem ein röhrenförmiger Durchlaß schräg zur Zylinderachse angeordnet ist. Bei Rollen der Besiedlungsvorrichtung in dieser Halterung wird der Behälter und damit das Substrat einer zusätzlichen Schwenkbewegung quer zu seiner Längsachse unterworfen.
Nach Besiedlung des Substrates ist die Besiedlungsvorrichtung auch geeignet, um als Transport- und Lagerbehälter für das fertig besiedelte Substrat zu dienen. Hierdurch wird vermieden, dass das empfindliche besiedelte Substrat weiter unmit- telbar gehandhabt, z.B. aus der Kulturlösung entnommen werden müßte. Es kann vielmehr bis zum Gebrauch in der Besiedlungε- vorrichtung verbleiben. Die Zu- und Abläufe sowie Gaszu- und - abführ-leitungen können für Transportzwecke abgeklemmt werden. Ansonsten ist es möglich, das besiedelte Substrat in dem gewünschten (ständig erneuerbaren) Medium unter einer beliebig wählbaren Atmosphäre zu belassen.
Das Substrat kann auch in der Besiedlungsvorrichtung gekühlt werden. Durch Einleiten von Kühlflüssigkeiten bzw. -gasen (wie z.B. Stickstoff) in zumindest eine oder besser gleichzeitig alle Kammern kann eine Kryokonservierung eines besiedelten oder noch nicht besiedelten Substrates erreicht werden. Für Lagerungszwecke kann eine Kryokonservierung auch vor Besied- lung des Substrates erfolgen. Dies kann z.B. an eine Sterilisationsphase angeschlossen werden.
An der Innenwand des Behälters der Besiedlungsvorrichtung kann in Weiterbildung der Erfindung mit Hilfe einer mikroporösen Trennwand eine zusätzliche Kammer mit wenigstens einem Zu- und Ablauf gebildet werden. Auf gleiche Weise können auch mehrere Kammern gebildet werden. In diesen Kammern können besondere Medien oder Kulturen (sog. feeder-Kulturen) vorgehalten werden, die eine oder mehrere Besiedlungskammern der Vorrichtung mit bestimmten Nährstoffen oder Faktoren versorgen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Fig. 1 zeigt eine zylindrische Zweikammer-Besiedlungsvorrichtung für ein röhrenförmiges Substrat in einem Längsschnitt in Explosionsdarstellung;
Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung, wie in Figur 1 darge stellt, mit einer zusätzlichen durch eine poröse Trennwand an der Behälterinnenseite ausgebildeten Kammer; Fig. 3 zeigt eine zylindrische Zweikammer-Besiedlungsvorrichtung für ein doppelwandiges röhrenförmiges Substrat in einer Fig. 1 entsprechenden Darstellung;
Fig. 4 zeigt ein mehrwandiges Substrat im Längsschnitt
(ohne den Reaktor) ;
Fig. 5 zeigt eine Teilansicht einer Einspannvorrich tung für ein verzweigtes Substrat (ebenfalls in
Teilansicht dargestellt;
Fig. 6 zeigt einen Querschnitt durch eine kastenförmigen Besiedlungsvorrichtung mit einer rah- menförmigen Einspannvorrichtung;
Fig. 7 zeigt eine Halterung für eine zylindrische Besiedlungsvorrichtung nach der Erfindung
Fig. 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung im Längsschnitt in einer Explosionsdarstellung. Es handelt sich um eine zylinderför ige Besiedlungsvorrichtung, die für die Besiedlung eines röhrenförmigen Substrates, in der Zeichnung mit B bezeichnet, ausgebildet ist. Der Behälter 10 besteht aus zwei Behälterteilen 10a, 10b, die in der Darstellung nicht zusammengesteckt sind. Der Flüssigkeitszulauf 16a bildet im Inneren der Vorrichtung gleichzeitig eine erste ring- bzw. röhrenförmige Halterung 12a für das Substrat. Die zweite ringför- mige Halterung 12b ist über Stangen 30 mit dem Behälterdeckel 10b und damit mechanisch fest mit der ersten Halterung 12a verbunden. Die Halterungen 12a, 12b bilden zusammen die Einspannvorrichtung für das röhrenförmige Substrat B, eine Herzklappe. Beim Zusammenschieben der Behälterteile 10a und 10b dichtet die Halterung 12b über den Dichtungsring 40 gegen die Innenwand des Behälterteils 10a und den Abfluß 16b ab. Gleich- zeitig wird der Behälter 10 aus den Behälterteilen 10a und 10b geschlossen und mit der Dichtung 42 abgedichtet. Hierdurch entstehen, unter Mitwirkung des eingespannten Substrates B, zwei Kammern, eine im Innern des röhrenförmigen Substrates B und eine um das Substrat herum. Für ein Zuführen von Zellen zum Substratinneren wird die Zellsuspension und/oder das Kulturmedium durch den Zulauf 16a zugeführt, läuft innen durch die ringförmigen Halterungen 12a und 12b sowie das Substrat und wird durch den Ablauf 16b wieder abgeführt. Während der Besiedlungsphase werden der Zulauf 16a und der Ablauf 16b geschlossen gehalten. Nach Beendigung der Besiedlungsphase wird das Medium über den Ablauf 16b wieder abgeführt. Die Zellsuspension und/oder das Kulturmedium für die Besiedlung der äußeren Oberfläche des Substrats wird durch den Zulauf 16a' zuge- führt, verteilt sich im Behälterinneren um das Substrat B herum und wird über den Ablauf 16b' wieder abgeführt. Ansonsten erfolgt die Besiedlung wie bereits beschrieben.
Während der Perfusionsphase können die beiden getrennten Kam- mern bzw. Kompartimente getrennt perfundiert werden. Die Perfusion kann mit unterschiedlichen Wachstumsfaktoren und Konzentration erfolgen, so dass unterschiedliche Medien zelltyp- spezifisch angeboten werden und interne Gradienten ausgebildet werden können. Besiedlungs- und Perfusionsphasen können sich abwechseln, ohne dass der Reaktor geöffnet werden müsste.
Am Ende der Behandlung kann der Einsatz mit dem Substrat beim Abnehmen des Deckels insgesamt herausgezogen werden wie eine Schublade. Die Handhabung des fertigen Substrats, bzw. hier Herzklappen-Implantats wird dadurch erheblich vereinfacht, und die Sicherheit bezüglich Sterilität und Unversehrtheit des Substrats erhöht.
Figur 2 zeigt eine Vorrichtung wie in Figur 1 gezeigt, bei der an der Innenwand des zylindrischen Behälters 10a, d.h. innerhalb des Zylindermantels, durch eine zusätzliche mikroporöse Trennwand 20 eine zusätzliche Kammer abgetrennt ist. Diese zusätzliche Kammer kann durch wenigstens einen Zulauf 18a und wenigstens einen Ablauf 18b mit dem gewünschten Medium be- schickt werden. Mittels der mikroporösen Trennwand besteht ein Austausch zwischen der zusätzlichen Kammer und dem Behälterinneren. Innerhalb der zusätzlichen Kammer könnten daher Nährstoffe oder bestirnte Gase erzeugt werden, die dann durch Kom- munikation mit dem Behälterinneren einem Substrat zugeführt werden können. Die mikroporöse Trennwand kann z.B. aus einer Silikonfolie, aus PTFE, Sinterglas, Polycarbonat, Cellulose, Polyamiden oder anderen Kunststoffen bestehen.
Figur 3 zeigt eine zylindrische Zweikammer- Besiedlungsvorrichtung 10 für ein doppelwandiges röhrenförmiges Substrat B1. Der Besiedlungsreaktor gleicht weitgehend dem in Figur 1 gezeigten Beispiel, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Bauteile bezeichnen. Der Unterschied zu der Besied- lungsvorrichtung aus Figur 1 besteht darin, dass dieser Reaktor für ein wenigstens doppelwandiges Substrat geeignet ist und zwei zusätzliche Zu- und Abläufe 19a, 19b aufweist, mit deren Hilfe ein Medium oder Material in ein Lumen zwischen die Wände des doppelwandigen Substrates B' eingeführt werden kann. Diese Zuläufe/Abläufe 19a/19b sind an der einen Halterung 12a der Einspannvorrichtung angeordnet. Die Halterungen 12a und 12b haltern das röhrenförmige, jedoch doppelwandige Substrat an beiden Enden, wobei das Substratende an der Halterung 12b zusammengefaßt bzw. zusammengebunden ist, während an der Hal- terung 12a die Zu- und Abführung 19a, 19b zwischen die beiden Wände des Substrates eingeführt wird. Das Innere des Substrats kann dann mit dem gewünschten Medium oder Material sowie auch mit weiteren Zellen versorgt werden.
Figur 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines solchen mehrwandigen Substrates B ' - im vorliegenden Fall handelt es sich um ein dreiwandiges Substrat. Das Substrat kann hier vorzugsweise auch ein synthetisches Substrat sein. Im vorliegenden Beispiel wurde die innere Wandung des vorliegenden Substrates mit 1B bezeichnet. Darüber sind zwei weitere Hüllen 2b angeordnet, die beliebige Materialien oder Zellen in Schichten auf dem inneren Substrat halten. Das Substrat ist hier an seinen Enden zusammengeführt, so dass es gemeinsam auf den nicht dargestellten Halterungen 12a, 12b befestigt wird. Die Kommunikation mit dem Nähr- oder Besiedlungsmedium erfolgt daher nicht wie in Figur 3 über die Zu- und Abläufe 19a, 19b, sondern mittels Diffusion quer zur Strömungsrichtung. In diesem Beispiel sind Zellen 3B gezeigt, die in und auf das Substrat ein- bzw. aufgebracht sind. Die mehrschichtige
SubstratStruktur ermöglicht deutlich dickere Substrate, so dass sich beispielsweise Gewebe unter dem lokalen Differenzierungsdruck naturähnlich kapillarisiert ausbilden können.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel könnte das Substrat aus einem festen, insbesondere einem festen anorganschen Material bestehen. Zum Beispiel kann als anorganisches Feststoffmateri- al ein calciumhaltiges Feststoffmaterial, insbesondere tri- calciumphosphathaltiges Feststoffmaterial, z.B. als ggf. gesintertes oder geklebtes Pressgranulat verwendet werden. Gerade in ein solches poröses Feststoffmaterial kann mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor sehr gut Material in die poröse Wandstruktur des Feststoffs eingebracht werden.
Ein großer Vorteil der Bioreaktortechnik besteht in jedem Falle darin, dass die als Implantate vorgesehenen Produkte erst im Operationssaal unmittelbar vor der Implantation aus dem Bioreaktor entnommen werden, so dass von der ersten Behandlung des Substrats bis zur Implantation des besiedelten Substrats in einem Patienten eine geschlossene sterile Handhabung gewährleistet ist.
Besonders vorteilhaft können in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor röhrenförmige Knochenimplantate hergestellt werden, da ei- ne Besiedlung des Röhreninneren getrennt vom Röhrenäußeren möglich ist.
Figur 5 zeigt eine Teilansicht einer Einspannvorrichtung für ein verzweigtes Substrat, das selbst ebenfalls in einer Teilansicht dargestellt ist. Die Halterung 12b der Einspannvorrichtung verzweigt sich im vorliegenden Fall in die röhrenförmigen Halterungsabschnitte 12c, 12d und 12e, die jeweils einen Zweig einer Y-Prothese B' ' - im vorliegenden Falle mit einem in drei Äste verzweigten Ende - haltern. Im übrigen kann die Vorrichtung, wie in den Figuren 1 bis 3 dargestellt, ausgebildet sein.
Figur 6 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eine Besied- lungsvorrichtung aus einem kastenförmigen Behälter 10a mit rechteckigem Deckel 10b. In diesem Behälter 10 ist eine rah- menförmige Einspannvorrichtung 12 angeordnet, die mit dem Dek- kel 10b fest verbunden ist. Das Abdichten des Einsatzes aus Einspannvorrichtung und Deckel gegen den Behälter 10a erfolgt mit Hilfe der Dichtungen 42, wobei die Dichtung 42a eine im Behälterinneren um die rahmenförmige Einspannvorrichtung 12 umlaufende U-förmige Dichtung ist, die in geeigneter Weise profiliert sein kann. Im zusammengebauten Zustand werden innerhalb des Besiedlungsvorrichtungs zwei flüssigkeitstrennende' geschlossene Kammern gebildet, eine oberhalb und eine unterhalb des Substrates.
In Abhängigkeit der Porosität des zu besiedelnden Substrates kann ein interner Flüssigkeitstransfer zwischen den Kammern erfolgen und gewünscht sein. Hierdurch kann erreicht werden, dass oxygeniertes Medium während der Rollphase der Besiedlungsvorrichtung auch in die Innenstrukturen gelangen kann.
Jede der Kammern ist mit einem Flüssigkeitszulauf 16a, 16a' und mit einem Flüssigkeitsablauf 16b, 16b' ausgestattet. Zusätzlich können Gaszu- und Abführungsleitungen vorgesehen sein, die hier nicht dargestellt sind. Solange der Reaktor während der Besiedlung gerollt wird, werden die Zu- und Abführleitungen 16a, 16a', 16b, 16b' abgeklemmt. Ist dies nicht gewünscht so sind drehbare Kupplungen vorgesehen. Üblicherweise wird jedoch stufenweise vorgegangen.
Figur 7 zeigt eine geeignete rollbare Halterung 100, in der die Besiedlungsvorrichtung 10 während der Besiedlung in einem Rollschrank zusätzlich geschwenkt werden kann. Die Halterung
100 besteht aus zwei Scheiben 110 aus Glas oder Plexiglas, die azentrisch mit zwei Öffnungen 120 versehen sind. Für den Einsatz einer zylindrischen Besiedlungsvorrichtung 10 sind die Öffnungen 120 am besten oval oder zylinderschnittförmig; die Scheiben 110 sind in diesem Beispiel kreisförmig, können jedoch auch anders, z.B. eliptisch, geformt sein. Die Scheiben 110 sind im vorliegenden Beispiel durch mehrere Stangen 130 verbunden, sie könnten jedoch auch durch einen geschlossenen Zylindermantel verbunden sein. Die Verbindung der Scheiben 110 ist so gewählt, dass sich die Öffnungen 120 in Projektion versetzt gegenüberliegen. Zwischen den Öffnungen 120 ist eine Röhre 140 eingesetzt, in die die Besiedlungsvorrichtung 10 eingeschoben werden kann. Die Längsachse der in der Zeichnung nicht dargestellten Besiedlungsvorrichtung verläuft dann schräg zur Längsachse der insgesamt zylindrischen Halterung 100. Die Halterung 100 bildet mit der Besiedlungsvorrichtung 10 zusammen eine Anordnung, die in einen Rollschrank eingelegt werden kann. Bei Behandlung im Rollschrank wird die Besied- lungsvorrichtung einer Rollbewegung um ihre Längsachse und gleichzeitig einer Schwenkbewegung quer zu ihrer Längsachse ausgesetzt. Hierdurch kann das Kulturmedium besonders intensiv und gleichmäßig verteilt mit dem Substrat in Kontakt gebracht werden .
Die Seitenwände der in den Figuren gezeigten Vorrichtungen (zylindermantelförmige, rechteckige, kugelförmige Außenwände) können z.B. aus gasdurchlässigen PTFE- oder Silikonfolien bestehen, um eine Verbesserung der SauerstoffVersorgung während perfusionsfreier Besiedlungsphasen zu erreichen. Ein ständiger Gasaustausch oder eine zeitweilige bewußte Oxygenierung mit Sauerstoff oder Sauerstoffgemisch erhöht erheblich die Adhäsionseffizienz (bis 100-200 %) während der Rollphase. Somit wird das Substrat zu allen Zeiten (Rollphase und Perfusionsphase) optimal mit Sauerstoff versorgt. Durch die Umwälzung gelangt verbrauchtes Medium kontinuierlich an die oxygenierenden Reaktorwände .

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Besiedlung von Substraten mit biologischen Zellen, - bei welchem innerhalb einer Vorrichtung ein darin gehalter- tes Substrat sowie für die Besiedlung vorgesehene Zellen wenigstens einer Besiedlungsphase unterworfen werden, während welcher das Substrat in oder mit der Vorrichtung um wenigstens eine Achse gedreht wird und die Zellen während der Drehbewe- gung immer wieder in Kontakt mit dem Substrat gebracht werden, - und bei welchem das Substrat nach oder während einer oder mehreren Beεiedlungsphasen wenigstens einer Perfusionsphase unterworfen wird, während welcher das Substrat wenigstens an Bereichen seiner äußeren oder inneren Oberfläche perfundiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während einer Besiedlungsphase Zellen in einem Medium zugeführt oder durch Aufstreichen auf das Substrat, Einbringen in das Substrat oder Beschichten des Substrates mit einer die Zellen enthaltenden Masse vorgelegt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass den Zellen Faktoren oder Co-Faktoren, insbesondere Wachstumsfakto- ren oder chemotaktische Faktoren beigegeben werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass während einer Perfusionsphase das Substrat mit einem flüssigen Medium, vorzugsweise einem Zellkultur-Nährme- dium oder Blut, perfundiert wird.
5.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Drehung in einer überlagerten Drehbewegung um wenigstens zwei Raumachsen gleichzeitig erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Drehung um wenigstens zwei Raumachsen nacheinander oder alternierend erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Besiedlungs- und Perfusionsphasen alternierend erfolgen.
8. Verf hren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat nach wenigstens einer Besiedlungsphase einer zusätzlichen Ruhephase unterworfen wird, während derer keine Drehung und keine Perfusion erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weitere Phasen mit zusätzlichen Verfahrensschritten zur Behandlung des bereits besiedelten, teilweise besiedelten oder noch nicht besiedelten Substrats umfaßt .
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusion pulsierend erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat bereichsweise mit verschiede- nen Zellen besiedelt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat nacheinander oder an verschiedenen Positionen mit unterschiedlichen Zellen besiedelt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat in der zur Behandlung dienenden Vorrichtung zusätzlich azellularisiert und/oder sterili¬ siert und/oder transportiert und/oder gelagert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass das besiedelte, unbesiedelte oder teilweise besiedelte Substrat durch Einleitung von Kühlflüsεigkeit oder Gasen, wie insbesondere Stickstoff, zeitweise kryokonserviert wird.
15. Besiedlungsvorrichtung (10), bestehend aus
- einem Behälter (10a,b) und
- einer darin angeordneten Einspannvorrichtung (12) für ein zu besiedelndes Substrat, die so ausgebildet ist, dass unter Zusammenwirken mit dem eingespannten Substrat innerhalb des Behälters wenigstens zwei im wesentlichen flüssigkeits- trennende oder einen kontrollierten Flüssigkeitstransfer ermöglichende Kammern auf entgegengesetzten Seiten des eingespannten Substrates gebildet werden, - und mit wenigstens je einem Flüssigkeitszu- und -ablauf (16a, 16a', 16b, 16b') für jede der gebildeten Kammern.
16. Besiedlungsvorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspannvorrichtung (12) in einem herausnehmbaren Behältereinsatz (10b) angeordnet ist, so dass das Substrat mit der Einspannvorrichtung (12) in den Behälter (10a) eingesetzt und aus diesem wieder entfernt werden kann.
17. Besiedlungsvorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (10a,b) rollbar ausgebildet ist.
18. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder die mehreren Einspannvorrichtung(en) (12) im wesentlichen quer zu einer durch eine Rollbewegung des Behälters vorgegebene Vorzugsbewegungsrichtung eines darin befindlichen flüssigen Mediums angeordnet ist (sind).
19. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspannvorrichtung in Bezug auf die Zu- und Abläufe (16a, 16a', 16b, 16b') so angeordnet ist, dass eine durch die Zu- und Abläufe vorgegebene Strömungsrichtung des flüssigen Mediums durch den Reaktor längs des eingspannten Substrates verläuft.
20. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspannvorrichtung (12) aus wenigstens einer rahmenförmigen Halterung besteht.
21. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspannvorrichtung wenigstens eine verzweigte Halterung für die Herstellung einer Y- Prothese aufweist.
22. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspannvorrichtung, vorzugsweise an einer Halterung, wenigstens einen weiteren Zu- und/oder Ablauf für das Einbringen von Medium, Zellen und/oder Material in wenigstens eine Innenkammer eines doppel- oder mehrwandigen Substrates aufweist.
23. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der rollbare Behälter (10a,b) zy- linderförmig ist.
24. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der rollbare Behälter (10a,b) kugelförmig oder kugelähnlich geformt ist.
25. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Kammer zusätzlich eine oder mehrere Gaszu- und -abführleitungen umfaßt.
26. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zu- und Abläufe und ggf. die Gaszu- und -abführleitungen über drehbare Kupplungen angeschlossen sind.
27. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Besiedlungsvorrichtungs- Behälter (10a,b) aus gasdurchlässigen Wänden besteht.
28. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass Einbauten im Innern des Behälters angeordnet sind, die das flüssige Medium, während es durch den Reaktor strömt, in gewünschter Weise leiten, wobei die Einbauten vorzugsweise an der Behälterinnenwand angeordnet sind.
29. Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass an der Innenwand des Behälters
(10) mit Hilfe einer mikroporösen Trennwand (20) eine zusätzliche Kammer mit wenigstens einem Zu- und Ablauf (18a, 18b) gebildet wird.
30. Anordnung aus einer Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 29 und einer rollbar ausgebildeten Halterung (100) .
31. Anordnung nach Anspruch 30, wobei die Rotationsachse der rollbaren Halterung (100) und eine Längsachse des in der Einspannvorrichtung (12) der Besiedlungsvorrichtung eingespannten Substrats in einem Winkel zueinander stehen.
32. Verwendung der Besiedlungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 29 als Transport- und Lagerbehälter für ein besiedeltes Substrat.
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