ES2260012T3

ES2260012T3 - Metodo para la inoculacion en multiples capas de substratos con celulas biologicas y dispositivos de inoculacion que se pueden utilizar para ello.

Info

Publication number: ES2260012T3
Application number: ES00931008T
Authority: ES
Inventors: Augustinus Bader
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-07
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: JP4855580B2; CY1106093T1; PT1083984E; ATE319514T1; DE50012366D1; DK1083984T3; DE19915610A1; US6379956B1; EP1083984A1; JP2002540780A; WO2000059618A1; EP1083984B1

Abstract

Un método para la inoculación en capas múltiples de substratos (B) con células biológicas (3B), en el que, en el dispositivo (10), un substrato en él contenido y las células (3B) para la inoculación, se someten a, al menos, una fase de inoculación, durante la cual el substrato (B) se hace rotar sobre, al menos, un eje con o en el dispositivo (1), y las células (3B) se hacen entrar en contacto de manera repetida con el substrato (B) durante el movimiento rotatorio, caracterizado porque - el substrato (B) se somete, después o durante una o más fases de inoculación, a, al menos, una fase de perfusión, durante la cual, el substrato (B) se prefunde, al menos, en áreas de su superficie exterior o interior.

Description

Método para la inoculación en múltiples capas de substratos con células biológicas y dispositivos de inoculación que se pueden utilizar para ello.

La presente invención trata de un método para inocular en múltiple capas substratos con células biológicas vivas y de dispositivos de inoculación que se pueden utilizar para ello.

Se desea inocular substratos o matrices con células que deben luego crecer en esos substratos para diversos fines. Se consideran tanto los substratos de origen natural, como los de origen sintético. Ejemplos de substratos de origen natural pueden ser, por ejemplo, los substratos de colágeno. Los substratos sintéticos pueden ser, por ejemplo, plásticos biológicamente inertes. Los substratos a inocular con células vivas presentan, a menudo, una estructura reticular o esponjosa para facilitar el crecimiento de las células en ellos.

Para llevar a cabo la inoculación, las células se deben llevar al substrato sin ser dañadas o destruidas; y se deben aplicar al substrato de manera que pueda tener lugar el crecimiento. En la mayoría de los casos, se intenta conseguir un césped celular cerrado.

Las células cultivadas, o las células extraídas de otra parte, se encuentran por lo general en un medio de cultivo. En los procesos de inoculación habituales, realizados generalmente en laboratorios, el substrato se pone en contacto con las células en el medio de cultivo, por ejemplo, en una matraz de giro. la matraz de giro se hace girar en una incubadora rodadora, de manera que el substrato, el medio de cultivo y las células se mantengan en constante, aunque no excesivo, movimiento vigoroso.

Con la inoculación se presenta el problema de que el substrato se debe hacer salir mediante el medio de cultivo con las células, ya que las células se deben transportar continuamente hacia la superficie, pero, por otra parte, el flujo, o el movimiento de balanceo o el giro dentro de la matraz no debe ser lo suficientemente intenso como para que las recién aplicadas células se destruyan otra vez antes de que se puedan establecer con éxito. También se presenta el problema de que el substrato debería permanecer accesible a las células en todos los puntos. Por lo tanto no se debe doblar debido al movimiento de balanceo, o pegarse a la matraz de giro.

En experimentos de inoculación anteriores, había poca o ninguna capacidad para lograr la diferenciación normal de las células crecientes. Los substratos artificialmente inoculados son, por lo tanto, distintos a los precursores naturales en la estructura de sus capas celulares.

Otra desventaja de los métodos anteriores de inoculación es la de que la confluencia completa del césped celular endotelial no se podía desarrollar en recipientes bioartificiales.

Por lo tanto, resultaría deseable desarrollar un proceso en el que las células utilizadas para la inoculación se habilitaran por parte de las condiciones de cultivo para desarrollar colonias celulares típicas del tejido, y para desarrollar una diferenciación fisiológica.

Se conoce además por la EP-A-320441 un método y un dispositivo giratorio para el acondicionamiento de portadores sintéticos recubiertos con células biológicas. Los materiales de partida para este método, que no comprende ninguna fase de inoculación, son substratos en forma de substancias sintéticas elastómeras que ya se encuentran recubiertos con células epiteliales. El método implica una adhesión mejorada de las células al substrato sintético. El dispositivo no resulta funcionalmente adecuado para cultivar diferentes tipos de células por separado. La eliminación del substrato recubierto con el dispositivo se encuentra estructuralmente vinculada al incremento del riesgo de contaminación.

En la WO-A-93/01843 se describe un método de una sola fase y un dispositivo para inocular substratos con células biológicas. El dispositivo de inoculación consiste en un depósito y un dispositivo de sujeción que se encuentra dentro del primero y conectado a este de manera inseparable, para un substrato de cultivo. No resulta posible retirar de manera estéril el substrato recubierto del dispositivo.

La invención, por lo tanto, se basa en el objetivo de desarrollar un método de inoculación y medios de inoculación para este, con el cual un substrato se pueda inocular bajo condiciones óptimas de crecimiento. Los medios de inoculación a desarrollar deben proporcionar una inoculación eficaz sin aparatos costosos. Además, la manipulación del substrato debe ser fiable y sencilla durante todo el proceso de inoculación.

Los medios de inoculación se deberían, preferiblemente, utilizar simultáneamente como recipiente para la esterilización, la celularización, el almacenaje, el transporte y la crioconservación. Resulta conveniente no romper la cadena de esterización hasta la utilización final.

Este objetivo se logra mediante un método para inocular en capas substratos con células biológicas según las características de la reivindicación 1.

Por fase de inoculación se comprende, según la concepción de la presente invención, una fase de este tipo, en las que las células con la que el substrato se debe inocular, se le proporcionan al substrato de manera adecuada.

Preferiblemente, durante la fase de inoculación, las células se mueven al substrato en un medio o mediante la aplicación en el substrato, inserción en el substrato, o recubrimiento del substrato con un medio que contiene las células (por ejemplo, colágeno).

En este proceso las células se pueden proporcionar con factores o cofactores, especialmente con factores de crecimiento o factores quimiotácticos.

Por fase de perfusión se entiende, respecto a la presente invención, una fase durante la cual se perfunde el substrato, como en el uso terminológico experto habitual del concepto "perfusión". Preferiblemente, el substrato se perfunde con un medio líquido nutriente para el cultivo celular, sangre, o plasma, que se puede, a su vez, enriquecer con varias sustancias.

Las fases múltiples de inoculación y de perfusión se pueden intercambiar entre sí durante el proceso, preferiblemente de manera alternativa. Aunque ya se conocía la manera de llevar a cabo la fase de inoculación de una manera similar, se averiguó, asombrosamente, que la incorporación de unas o más fases de perfusión en el proceso mejora significativamente el resultado de la inoculación. El uso de fases de perfusión simula las condiciones quasifisiológicas que resultan importantes para el desarrollo de la diferenciación celular normal. La tensión de esquileo producida hasta lo previsto por la perfusión, distingue las células endoteliales. Las células lisas del músculo reaccionan a las presiones pulsátiles, que se pueden generar también durante la perfusión. El oxígeno y los alimentos se pueden proporcionar durante la perfusión, y se pueden aplicar tensiones de presión. Las fluctuaciones fisiológicas de la presión, como ocurre, por ejemplo, in vivo entre la sístole y el diástole, resulta particularmente importante para la orientación de las células recién formadas (de la matriz extracelular) y el desarrollo de la estabilidad normal y de la capacidad de soportar la tensión de la presión. La inoculación de un recipiente tubular sintético en su interior se ha descrito ya en Br. J. Surg. 1991, vol. 78, 878-882. La inoculación se realiza con las partes alícuotas de una suspensión de células endoteliales mientras se rota el recipiente. En ese trabajo se determinó que la inoculación del recipiente PTFE cubierto con fibronectina, se podía mejorar perceptiblemente en su capacidad para soportar la sangre fluyente de pulsación si, en lugar de un ciclo corto de inoculación (20 minutos), se hacía uso de un ciclo más largo durante la noche en una incubadora rotatoria. Sin embargo, no se reconoció que la perfusión intencionada del recipiente inoculado puede por sí mismo mejorar el resultado de la inoculación. Además, el dispositivo ahí descrito se podía rotar solamente sobre su propio eje y no en diversas direcciones espaciales. Además, el montaje y el desmontaje del recipiente resultaba intrincado, pues se debían retirar los casquillos de ambos extremos. Al retirar el recipiente inoculado ya acabado, se corría el riesgo de que la estructura llegará a desesterilizarse debido a las diversas manipulaciones intrínsecas para retirar el recipiente del reactor.

Resulta preferible que la rotación del substrato durante la fase de inoculación se realice en un movimiento rotatorio sobrepuesto sobre, al menos, dos ejes espaciales. También puede ser una rotación controlada de manera aleatoria en todas las direcciones espaciales, lo que se considerará en lo referente a los dispositivos para inocular adecuados para el proceso.

Alternativamente, la rotación del substrato durante las fases de inoculación puede ser alrededor de, al menos, dos ejes espaciales sucesivamente o alternativamente.

El proceso puede también establecerse de manera que el substrato se vea sometido a una fase de reposo suplementaria después de, al menos, una fase de inoculación. Tal fase de reposo se puede insertar para proporcionarle al substrato parcialmente o totalmente inoculado una fase de consolidación libre de tensión durante la cual el césped celular pueda consolidarse o incluso reorganizarse internamente.

La perfusión intermitente también permite el desarrollo de estructuras de múltiples capas. Eso se puede hacer, por ejemplo, en fases múltiples de inoculación, agregando en primer lugar las células del tejido conectivo, las células lisas de músculo, y luego las células endoteliales, con fases de perfusión entre las fases individuales de inoculación. Así, los siguientes tipos de célula se pueden aplicar a asociaciones ya estructuradas que se distinguen normalmente por el tejido.

La inoculación con fibroblastos/células lisas de músculo se puede realizar durante días y semanas hasta que finalmente los céspedes endoteliales se cultivan a lo largo de algunas horas o días. Las células endoteliales se pueden preservar de manera ventajosa en frío profundo mientras tanto, de modo que no experimenten una duración de cultivo innecesaria.

Además, las nuevas células formadoras de matriz se pueden agregar de manera repetida. Es posible una aplicación repetida de células alternando con fases de perfusión. Eso significa cambiar de movimientos rotatorios del dispositivo de inoculación a perfusiones en reposo. Para ello, el dispositivo de inoculación puede permanecer inmóvil en posición vertical, horizontal, o en cualquier otra posición. Esto es importante para producir las válvulas del corazón. Una operación de pulsación, que se describirá más detalladamente a continuación, se realiza de manera preferible en una posición vertical de la válvula del corazón. Así resulta posible el cierre espontáneo de la válvula debido a la gravedad, después de la terminación de la fase de pulsación.

Además, el proceso puede abarcar otras fases con pasos de proceso adicionales para la manipulación del substrato ya inoculado, parcialmente inoculado, o todavía sin inocular. Por ejemplo, se puede incluir en el proceso general, sin necesidad de abrir el birreactor y mover el substrato, la celularización preliminar del substrato a inocular, una o más fases de lavado, esterilización, y/o diversos absorciones de gases.

En el desarrollo adicional de la invención, se pueden añadir factores de crecimiento o células introducidas en sustancias auxiliares tales como hidrogeles. Especialmente para la inoculación de un tubo, se puede añadir una matriz de colágeno, por ejemplo (Tipo I o mezclas con otros componentes de la matriz) o una mezcla de fibrinógeno o de fibronectina con células, tanto externamente como internamente en el tubo. Eso se puede llevar a cabo mediante esparcimiento o goteo. Por ejemplo, se puede aplicar VEGF o PDGF como factores del crecimiento y factores quimiotácticos específicos para los tipos de célula. De esta manera, se pueden desarrollar gradientes para la migración de las células de tejido conectivo. Hasta el punto que se pueden cultivar diversos tipos de células en los diversos compartimientos, y el medio se puede adaptar a los correspondientes tipos de célula.

Para las fases de esterilización o de almacenaje se pueden llevar a cabo interrupciones con o sin fases previas o consecuentes de crioconservación.

La perfusión se puede realizar preferiblemente con pulsación. Este proceso sirve para proporcionar una simulación más natural de las condiciones fisiológicas. Como se ha dicho anteriormente, las células lisas del músculo, en particular, reaccionan a las presiones pulsátiles, de manera que se pueda ofrecer otro proceso de desarrollo, por ejemplo, para inocular con las células lisas del músculo. El dispositivo de inoculación que se describirá más adelante en más detalle, resulta especialmente adecuado para esto, ya que el substrato se puede mover hacia el interior alterando la posición del dispositivo en varios ajustes. El substrato también se ve previsto del espacio suficiente para los cambios flexibles de volumen (a volúmenes más grandes o más pequeños).

Finalmente, el substrato se puede inocular con diversas células en áreas específicas mediante el proceso de la invención, hasta el punto deseado para el substrato concreto. Eso resulta particularmente posible, como se describe más detalladamente a continuación, con el dispositivo de inoculación desarrollado especialmente para este proceso, con el cual se forman diferentes compartimientos múltiples o cámaras que se encuentran separados entre sí, bordeando el substrato, que se expone a diferentes medios o soluciones de cultivo de inoculación, y se pueden también perfundir por separado. Alternativamente, también resulta viable proteger regiones del substrato, es decir, cubrirlo o bloquearlo, y luego tratar diferentes regiones en diversos pasos.

Si se desea, el substrato se puede también inocular sucesivamente con diversas células, de manera que se formen capas múltiples con diversas células en el substrato.

El substrato usado, que es preferiblemente plano o tubular según lo descrito anteriormente o a continuación, puede presentar compartimientos internos o puede presentar una pared doble o múltiples paredes. También puede ser poroso o esponjoso, de modo que las células puedan asentarse en los poros o los canales de este material.

El substrato puede abarcar un material biológico de origen natural (xenogénico, alógeno, autólogo), materiales biológicos imitados, proteínas sintéticas como el colágeno, biopolímeros, polímeros, textiles sintéticos o sólidos. El substrato también puede ser un sólido poroso o esponjoso, como un sólido inorgánico con una estructura de piedra pómez. Tales sólidos resultarían adecuados para la producción de prótesis óseas, entre otras cosas. El substrato sólido se podía desarrollar en forma desigual o tubular. Por lo general, los substratos pueden presentar cualquier forma deseada, siempre que permitan la circulación por ellos (interna y externamente, si se deseara) en la inoculación.

El substrato puede, si se deseara, crioconservarse mediante la introducción de líquidos o gases fríos como, en particular, nitrógeno.

Además, el objeto de la invención se logra mediante dispositivo de inoculación según las características de la reivindicación 15.

El envase del dispositivo de inoculación debe formarse de modo que el substrato fluya libremente por el medio de cultivo cuando esté sujetado por los medios de sujeción. El substrato puede estar sujetado de cualquier manera conveniente al dispositivo de sujeción o los dispositivos de sujeción. Por ejemplo, puede encontrarse atado, fijado con abrazaderas o cosido. Las formas del envase y de los medios de sujeción deben encajar entre sí. Por ejemplo, el sostenedor puede abarcar un recipiente con una cubierta, con la cubierta conectada a los medios de sujeción, formando en común un dispositivo de inserción recambiable.

Un dispositivo de inserción recambiable simplifica la manipulación del substrato antes y después de la inoculación.

Cuando el dispositivo de inserción se retira del reactor, el substrato (es decir, por ejemplo, el implante acabado) no se debe tocar o quitar de las piezas fijas del reactor, que se encontraría difícilmente accesible dentro del reactor. Así se evita un montaje/desmontaje desventajoso del substrato que es inoculado como piezas fijas, inmovibles de la carcasa. Así se simplifica substancialmente la manipulación y el uso después del transporte hasta el usuario final bajo condiciones estériles, como podría ser en la cirugía por parte de un médico antes de la implantación. El substrato retirado del reactor con el medio de sujeción queda libremente accesible, permanece momentáneamente estabilizado, y se puede, dependiendo del medio de sujeción, retirarse de manera muy sencilla (desatándolo, desenclavándolo, cortándolo). Así se simplifica sustancialmente la manipulación estéril del substrato o del implante inoculado ya acabado.

El dispositivo de inserción se diseña de manera que el medio de sujeción yazca en el interior del envase, de modo que haya dos cámaras separadoras de líquido en los lados opuestos al substrato sostenido. El trabajo debe realizarse con medios o células separados en los diversos compartimientos. Obviamente, también se puede trabajar con las mismas células y/o medios en ambos lados del substrato, interno y externo. Una ventaja significativa del aparato se deriva del hecho de que las células (que pueden ser diferentes), se pueden hacer salir en varias ocasiones y que se puede alternar entre la fase de inoculación y la fase de perfusión sin tener que abrir el reactor. Puede también resultar deseable transferir el líquido deliberadamente a través del substrato, especialmente en el caso de substratos orgánicos. El substrato a inocular suplementa el dispositivo de inserción, de manera que se formen una o más paredes que dividan los compartimentos. Los medios de sujeción se pueden diseñar también para contener substratos múltiples, con la formación de compartimientos múltiples. Cada uno de los compartimientos formados se prevé preferiblemente con entradas y salidas para líquidos. Asimismo, el substrato en sí puede ya presentar compartimientos múltiples, particularmente de pared doble o de pared múltiple, con lúmenes entre las paredes. En este caso, el desarrollo adicional de la invención puede prever que los medios de sujeción, preferiblemente en uno de los sostenedores del substrato, tenga al menos o una entrada o una salida para añadir el medio, las células, y/o el material en, al menos, una cámara interna de dicho substrato de pared doble o de pared múltiple.

Si se desea producir un substrato ramificado, los medios de sujeción se pueden adaptar apropiadamente, por ejemplo, ramificado a uno de los sostenedores para producir una prótesis en Y.

Alternativamente, el sostenedor se puede doblar o desmontar de manera conveniente de manera que el substrato contenido en el medio de sujeción se pueda colocar en el dispositivo de inoculación, y volver a retirarse de este, con el mínimo de dificultades.

El sostenedor del dispositivo de inoculación en sí mismo se diseña preferiblemente de forma que se pueda rodar o girar, para que durante todo el tiempo de inoculación, o durante ciertos pasos de inoculación, se pueda insertar en una incubadora rotatoria termostática. Para este propósito, el dispositivo de inoculación puede, por ejemplo, ser de forma cilíndrica. Esto resulta particularmente ventajoso si un substrato tubular, como el de una válvula del corazón, u otra recipiente tubular, se debe inocular. Esta ejecución se explica más detalladamente en la descripción de las figuras.

Por lo general, el medio de sujeción se dispone preferiblemente de manera transversal a un movimiento preferido de un medio líquido contenido en él, mediante un movimiento rotatorio o pivotante. El medio de sujeción se puede disponer preferiblemente en relación a las entradas y las salidas, de manera que la dirección del flujo del medio líquido determinado por las entradas y las salidas, pase a través del reactor a lo largo o por el interior del substrato contenido.

Para los substratos planos, tales como porciones de piel, el medio de sujeción puede abarcar un montaje en forma de rejilla. El montaje en forma de rejilla se ubicaría preferiblemente de manera lateral a una pieza de inserción que de manera simultánea forme una cubierta para un sostenedor en forma de caja. Cuando el dispositivo de inserción en forma de rejilla se inserta, la rejilla debería tocar el depósito en forma de caja por tres lados, mientras que el cuarto lado se conecta a la tapa sujeta al dispositivo de inserción. Así se producen tres cámaras dentro del sostenedor, cada una de las cuales debe estar prevista de entradas y salidas para los medios líquidos. Estos conductos de entrada y de salida se pueden pasar a través de la tapa del dispositivo de inserción. Puesto que un envase en forma de caja no es rotable por sí mismo, se debería insertar dentro de un montaje para utilizarlo en una incubadora rotatoria. Tal tipo de disposición se describe con más detalle más adelante.

Los medios de sujeción pueden abarcar alternativamente dos sostenedores de forma anular para el substrato, que están conectados sólidamente de manera mecánica, por ejemplo mediante varillas.

El envase rotatorio o pivotable puede ser también de forma esférica o esferoidal para permitir más grados de libertad de movimiento en la incubadora rotatoria. Se pueden prever botones de desvío en el envase esférico (o el sostenedor esférico, ver abajo) para cambiar la dirección del balanceo con más frecuencia de manera aleatoria durante el tratamiento en una incubadora rotatoria o un aparato correspondiente, de modo que la rotación y el giro sean posibles en todas las direcciones espaciales. El envase se puede hacer de un material rígido o flexible. Una de las ventajas del último es que permite volúmenes variables, hasta cierto punto, de modo que el substrato se pueda expandir más fuertemente, bajo tensión de la presión, por ejemplo.

Además de las entradas y de las salidas para los líquidos a través de las cuales el medio con las células se pasa durante la inoculación, los compartimentos pueden tener unas o más entradas y salidas para el gas. Las entradas y las salidas para gas pueden tener la forma de tubos guiados a lo largo de las paredes y pueden estar formadas de membranas permeables al gas, como la silicona. Los gases se pueden introducir a través de ellas al medio de cultivo, o eliminarse, durante la inoculación. Se posibilita también el intercambio de gases, en vez de o además de los tubos por las paredes externas permeables al gas del envase del dispositivo de inoculación.

Para este propósito, las paredes del envase se pueden hacer de PTFE o de película de silicona, o pueden contener rellenos de estas estructuras o materiales permeables al gas. Las estructuras de la pared se pueden hacer de metal sinterizado, de cerámica microporosa, o de cristal poroso. Esta estructura portadora porosa se puede cubrir con una capa permeable al gas, como una película plástica (por ejemplo, PTFE, silicona).

Una ventaja de las membranas, o de la película, permeables al gas integrada en las estructuras de la pared de la carcasa del dispositivo de inoculación, es que la atmósfera ambiente en la incubadora (una incubadora rotatoria normal o un aparato fabricado especialmente para este propósito) se puede utilizar directamente para el intercambio de oxígeno y, con una fase de anhídrido carbónico, también para la regulación del pH en el medio de cultivo. Es importante aquí que, de esta manera, los compartimientos de inoculación (cámaras) estén simultáneamente disponibles como depósito de cultivo y como función de oxigenación para la estructura tridimensional insertada (como un recipiente o una válvula del corazón).

Las entradas y las salidas para el medio nutriente o las entradas y las salidas del gas, se pueden conectar con el dispositivo de inoculación con acopladores rotatorios, lo que permite que la inoculación se realice durante el balanceo del dispositivo de inoculación en una incubadora rotatoria diseñada especialmente para dicho propósito. Los conductos conectados a través del acoplador se pueden realizar de manera concéntrica para este fin.

Finalmente, resulta posible en otro desarrollo de la invención, que ciertos dispositivos de inserción se dispongan dentro del envase para dirigir el medio líquido de una manera deseada a medida que fluye por el reactor. Puede tratarse de barras o tubos dispuestos en la pared interna del envase. Dispositivos de inserción, en el sentido más amplio, se conocen por el diseño de reactores para otros propósitos.

El envase del reactor se puede prever también, o conectarse, con medios, conocidos en sí, para la calefacción o la refrigeración. Por ejemplo, se pueden insertar en la pared externa del reactor alambres de calefacción para templar el medio. El sostenedor del reactor puede también encamisarse para un medio de calefacción o un medio de refrigeración, por ejemplo el agua.

El medio de cultivo pasa a través de las entradas y de las salidas por el reactor, que en una ejecución contiene las células que son inoculadas. De manera alternativa, una cierta cantidad de células se puede colocar en el reactor, en cuyo caso solamente circula el medio de cultivo puro. Las entradas y las salidas se prevén preferiblemente con filtros para prevenir la eliminación indeseada de células. Además, se prevén entradas y salidas con sellos (válvulas de cierre), de modo que los compartimientos individuales se puedan cerrar. La recirculación de las células se evita preferiblemente mediante el proceso de la invención. En contraste con la inoculación de flujo anterior, en este caso las células se mantienen sobre el substrato.

Según lo señalado ya anteriormente, se encuentra un medio de sujeción en el interior del envase para el substrato a inocular. El substrato se contiene en un dispositivo de sujeción durante la inoculación, de modo que quede libremente accesible en los lados deseados para el medio de cultivo y las células, y no se doble o se pegue. Al mismo tiempo, el sostenedor actúa para introducir el substrato en el reactor mediante el dispositivo de inserción preferiblemente desprendible, y para quitarlo de nuevo. El dispositivo de inserción desprendible sirve así, al mismo tiempo, para la manipulación mejorada del substrato, que se inserta en ella, por ejemplo, inmediatamente después de la inoculación en un líquido, y se puede manipular o preservar de otras maneras.

Puesto que el substrato a inocular debe pegarse continuamente a la superficie entre la entrada y la salida dentro del medio de sujeción, resulta tambiénposible utilizar segmentos intermedios de, por ejemplo, tubos de fibra reforzada o embudos de silicona u otro material, preferiblemente elásticos, plásticos para que se adapten a la longitud y el tamaño. Se pueden mover para cubrir distancias o para acortar.

Según la presente invención el medio de sujeción se encuentra esencialmente transversal a una dirección de movimiento preferida establecida por el balanceo o el movimiento giratorio del sostenedor o del sostenedor montado en el montaje que se describe a continuación. Por "esencialmente transversal" se quiere decir que el medio líquido móvil, es decir, la suspensión celular en el medio de cultivo, "se lanza sobre" el substrato continuamente en un ángulo de entre 30º y 150º respecto al eje de rotación del movimiento de balanceo o del movimiento giratorio. Es decir, que se pone en contacto con el de manera repetida. En este caso, si se omite un flujo simultáneo, si fuera posible (pero no esencial), del medio líquido, a lo largo del substrato sostenido.

En la inoculación, es decir, durante, al menos, ciertos periodos de inoculación, el envase rotable o pivotable, es decir, el dispositivo de inoculación en su totalidad, se coloca en de una incubadora rotatoria o en un aparato de balanceo, o en un dispositivo comparable con funciones correspondientes, donde se hace rodar o se balancea para mover el medio de cultivo y las células suspendidas en él respecto al substrato contenido.

El dispositivo de inoculación es tratado como una matraz rotatoria en la incubadora rotatoria. Es decir, se rueda y, si se considera necesario, se controla la temperatura. En lugar de la incubadora rotatoria, no obstante, se puede utilizar cualquier otro dispositivo que resulte adecuado para mover el dispositivo de inoculación de la manera deseada. También puede tratarse de un aparato separado que se prevea especialmente para este propósito. La incubadora rotatoria o el aparato pueden prever además una atmósfera específica (oxígeno, anhídrido carbónico).

El paso de la suspensión del medio de cultivo o de la suspensión celular a través del reactor mediante la entrada y la salida de líquidos, o mediante las múltiples entradas y salidas, no tiene por qué producirse durante todo el proceso de inoculación. Puede también resultar particularmente adecuado detener el flujo durante un tiempo, por ejemplo, durante la rodadura en la incubadora rotatoria o durante el tratamiento en un dispositivo para el propósito correspondiente. Eso se puede realizar sujetando temporalmente las entradas y las salidas, o cerrándolas con válvulas.

El medio de cultivo, con o sin células, se puede recircular por lo menos temporalmente a través de las entradas y de las salidas. De esta manera, las células que no se pudieron unir en el de primer paso, pueden introducirse en el substrato.

Las células movibles en el medio de cultivo que todavía no se han unido al substrato, se llevan hasta el substrato a través de la entrada, y luego se distribuyen a lo largo del substrato. La distribución "transversal" a esta dirección longitudinal se realiza esencialmente mediante el movimiento de balanceo o el movimiento de giro. Ambos movimientos se pueden sobreponer, y luego pueden cooperar. El movimiento de balanceo o el movimiento de giro se pueden sobreponer a otros tipos de movimientos, como puede ser un movimiento vibratorio, con el fin de poner, de manera repetida, las células en contacto con el substrato y distribuirlas en este.

El hecho de que se pueda establecer un flujo a lo largo del substrato, posibilita una disposición uniformemente distribuida de las células por todos los puntos del substrato. La velocidad del flujo se puede establecer de modo que el transporte de las células no evite el crecimiento interno de las células, en la medida de lo posible. El crecimiento interno se puede promover también deteniendo el flujo del medio de cultivo temporalmente, de modo que las células queden directamente sobre el substrato durante un tiempo y tengan la oportunidad de unirse a este y crecer.

La presente invención abarca además una disposición de un dispositivo de inoculación como el descrito anteriormente y un sostenedor diseñado para que se pueda hacer rodar. Se utiliza el sostenedor para poder manejar los sostenedores que no son rotables en sí como, por ejemplo, un sostenedor en forma de caja, en una incubadora rotatoria, o para implementar direcciones adicionales de movimiento. Preferiblemente, el eje de rotación del sostenedor rotativo y un eje longitudinal del substrato contenido en el dispositivo de sujeción del dispositivo de inoculación, se encuentran en un determinado ángulo uno respecto al otro.

Un cuerpo simétrico que se puede rotar y que disponga de una o varias hendiduras o zócalos para un dispositivo de inoculación como el descrito anteriormente, se puede utilizar como sostenedor para la disposición descrita con anterioridad. Dicho cuerpo simétrico que se puede rotar se puede fabricar a partir de cualquier material adecuado como cristal, plástico o metal. Por ejemplo, el sostenedor puede abarcar una esfera con un paso tubular. Entonces un envase de reacción cilíndrico se puede insertar en ese paso tubular. (Puede haber tubos múltiples para envases múltiples). Entonces la esfera se puede colocar en una incubadora rotatoria después de afianzar con abrazaderas los conductos de entrada y de salida del dispositivo de inoculación, de manera que se le pueda dar vueltas al substrato en todas las direcciones durante el balanceo. El sostenedor puede abarcar un cuerpo o un marco cilíndrico en los cuales se coloque de manera oblicua un paso tubular respecto al eje del cilindro. Al hacer rodar el dispositivo de inoculación en este sostenedor, el sostenedor y, así, el substrato, se someten a un movimiento giratorio adicional, transversal a su eje longitudinal.

Después de la inoculación del substrato, el dispositivo de inoculación también resulta adecuado como envase de transporte y de almacenaje para el substrato ya inoculado. Así se evita una manipulación adicional directa del substrato inoculado sensible. Por ejemplo, no necesita retirarse de la solución de cultivo. De esa manera, puede permanecer en el dispositivo de inoculación hasta que se utilice. Las entradas y las salidas, y los conductos de entrada y salida del gas, se pueden bloquear para el transporte. También resulta viable dejar el substrato inoculado en el medio deseado (renovable continuadamente) bajo cualquier atmósfera deseada.

El substrato se puede también refrigerar en el dispositivo de inoculación. La preservación criogénica de un substrato inoculado o sin inocular se puede lograr introduciendo líquidos o gases de refrigeración (como nitrógeno) dentro de, al menos, una cámara, o, aún mejor, todas las cámaras al mismo tiempo. La preservación criogénica se puede realizar también para el almacenaje antes de la inoculación del substrato. Por ejemplo, esa fase se puede vincular a una fase de esterilización.

En otra ejecución de la invención, se puede formar un compartimiento adicional con, al menos, una entrada y una salida, en la pared interna del envase del dispositivo de inoculación, usando una pared divisoria microporosa. De la misma manera se pueden producir múltiples cámaras. Los medios o cultivos separados (cultivos de alimentación) que proveen uno o más compartimientos de inoculación en el dispositivo con nutrientes específicos o factores, se pueden conservar en esos compartimentos.

A continuación se aclarará con más detalle la invención según los ejemplos de ejecución:

Fig. 1 muestra un dispositivo de inoculación cilíndrico de dos compartimentos para un substrato tubular, en una sección longitudinal y una representación en detalle.

Fig. 2 muestra un dispositivo como el representado en la figura 1, con un compartimiento adicional en el lado interno del envase, formado por una pared divisoria porosa.

Fig. 3 muestra un dispositivo de inoculación cilíndrico de dos compartimentos para un substrato tubular de pared doble, en una representación correspondiente a la de la figura 1.

Fig. 4 muestra un substrato de pared múltiple en una sección longitudinal (sin el reactor).

Fig. 5 muestra una vista parcial de un dispositivo de sujeción para un substrato ramificado (también mostrado en vista parcial).

Fig. 6 muestra un perfil transversal a través de un dispositivo de inoculación en forma de caja con un dispositivote sujeción tipo marco.

Fig. 7 muestra un sostenedor para un dispositivo de inoculación cilíndrico según la invención.

La figura 1 muestra un primer ejemplo de ejecución de la invención en una sección longitudinal en una presentación detallada. Se trata de un dispositivo de inoculación cilíndrico diseñado para inocular un substrato tubular, señalado como B en el dibujo. El sostenedor 10 abarca dos piezas 10a, 10b del sostenedor, que no se encuentran unidas en el dibujo. La entrada para líquido 16a forma también, en el interior del dispositivo, un primer sostenedor de forma anular o tubular 12a para el substrato. El segundo sostenedor de forma anular 12b está conectado mediante las barras 30 a la cubierta 10b del envase, para conectarlo firmemente de manera mecánica al primer sostenedor 12a. Los sostenedores 12a y 12b forman en conjunto el dispositivo de sujeción para el substrato tubular B, una válvula del corazón. Cuando las piezas 10a y 10b del sostenedor se empujan juntas, el sostenedor 12b se sella contra la pared interna de la pieza del sostenedor 10a con el anillo de cierre 40 y la salida 16b se cierra. Al mismo tiempo, el sostenedor 10, formado por las piezas 10a y 10b del sostenedor, se cierra y se sella con el sello 42. Esto, con el substrato fijado B, forma dos compartimientos, uno en el interior del substrato tubular B, y uno alrededor del exterior del substrato. La suspensión de la célula y/o el medio de cultivo se introduce a través de la entrada 16a para proporcionarle las células al interior del substrato. Pasa por los sostenedores de forma anular 12a y 12b y el substrato y vuelve a salir a través de la salida 16b. La entrada 16a y la salida 16b se mantienen cerradas durante la fase de inoculación. Después de la terminación de la fase de inoculación, el medio se retira otra vez a través del salida 16b. La suspensión celular y/o el medio de cultivo para inocular la superficie externa del substrato, se agrega a través de la entrada 16a, se distribuye alrededor del substrato B dentro del envase, y retira de nuevo a través de la salida 16b. La inoculación se hace de otra manera según lo descrito previamente.

Durante la fase de perfusión, los dos compartimientos o cámaras separados, se pueden perfusionar por separado. La perfusión se puede realizar con varios factores del crecimiento y concentraciones, para poder proporcionar diversos medios específicos para el tipo de célula y se puedan producir gradientes internos. Las fases de inoculación y de perfusión se pueden alternar sin necesidad de abrir el reactor.

Al final del tratamiento, el dispositivo de inserción con el substrato se puede retirar por completo quitando la tapa, como un cajón. La manipulación del substrato acabado, como un implante de válvula del corazón en este caso, se simplifica sustancialmente así, y se incrementa la confiabilidad de la esterilidad y de la integridad del substrato.

La figura 2 muestra un dispositivo como el de la figura 1, en el cual un compartimiento adicional se divide mediante una pared divisoria microporosa 20 en la pared interna del envase cilíndrico 10a, es decir, dentro de la camisa cilíndrica. Este compartimiento adicional puede estar previsto con el medio deseado a través de, al menos, una entrada 18a y, al menos, una salida 18b. El intercambio entre el compartimiento adicional y el interior del envase, es proporcionado por la pared divisoria microporosa. Para este propósito, se pueden generar nutrientes o ciertos gases dentro del compartimiento añadido. Entonces se le pueden proporcionar al substrato mediante la comunicación con el interior del sostenedor. La pared divisoria microporosa se puede, por ejemplo, fabricar a partir de una película de silicona, de PTFE, de vidrio sinterizado, de policarbonato, de celulosa, de poliamidas, o de otros materiales sintéticos.

La figura 3 muestra un dispositivo de inoculación cilíndrico de dos compartimentos 10 para un substrato tubular B' de pared doble. El reactor de inoculación es muy similar al del ejemplo mostrado en la figura 1, y los números de referencia idénticos indican piezas idénticas. La diferencia del dispositivo de inoculación de la figura 1, es que este reactor resulta conveniente para un substrato de al menos dos paredes y presenta dos entradas y salidas 19a, 19b adicionales, mediante las cuales el medio o el material se puede introducir en un lumen entre las paredes del substrato B' de pared doble. Estas entradas/salidas 19a/19b se encuentran dispuestas en el sostenedor sencillo 12a del dispositivo de sujeción. Los sostenedores 12a y 12b sostienen el substrato tubular, pero de pared doble, en ambos extremos, con los extremos del substrato combinados o limitados uno respecto al otro en el sostenedor 12b, mientras que la entrada y la salida, 19a, 19b, se introducen entre las dos paredes del substrato en el sostenedor 12a. Entonces, el interior del substrato se puede proveer con el medio o el material deseado, o con más células.

La figura 4 muestra otro ejemplo de ejecución de un substrato B' de pared múltiple. En este caso el substrato es de pared triple. Aquí, el substrato puede preferiblemente ser un substrato sintético. En este ejemplo, la pared interna de este substrato se señala como 1B. Además, hay otros dos recubrimientos 2b que acogen cualquier material o célula en capas en el substrato interno. Aquí el substrato se combina en sus extremos, de modo que se monte en común en los sostenedores 12a, 12b no mostrados.

La comunicación con el medio nutriente o de inoculación no es como el mostrado en la figura 3, a través de las entradas y de las salidas 19a, 19b, sino por difusión transversal a la dirección del flujo. En este ejemplo, se muestran las células 3B, las cuales se aplican al y en el substrato. La estructura de múltiples capas del substrato posibilita substratos marcadamente más gruesos, de manera que, por ejemplo, los tejidos se puedan desarrollar con capilaridad como en la naturaleza bajo presión de diferenciación local.

En otro ejemplo de ejecución, el substrato podría abarcar un material sólido, especialmente un material sólido inorgánico. Por ejemplo, un material sólido que contenga calcio, particularmente un material sólido que contenga fosfato tricálcico, como una granulación comprimida posiblemente sinterizada o cementada, se puede utilizar como material sólido inorgánico. El material se puede implantar muy bien en la estructura porosa de la pared del sólido con un material sólido tan poroso, usando el bioreactor según la invención.

En cada caso, la tecnología del bioreactor cuenta la gran ventaja que los productos para los implantes se retiran del reactor solamente en la cirugía inmediatamente antes de la implantación, para asegurar una operación estéril cerrada desde la manipulación inicial del substrato hasta la implantación del substrato inoculado en un paciente.

Los implantes tubulares óseos se pueden producir de manera particularmente ventajosa en el bioreactor según la invención, ya que el interior del tubo se puede inocular por separado respecto al exterior del tubo.

La figura 5 muestra una vista parcial de un dispositivo de sujeción para un substrato ramificado, que también se muestra en una vista parcial. El sostenedor 12b del dispositivo de sujeción, se ramifica en este caso en las secciones tubulares 12c, 12d y 12e del sostenedor, cada una desarrollada como rama de la prótesis en Y B'', en este caso, con el dispositivo tal y como se muestra en las figuras de la 1 a la 3.

La figura 6 muestra otro ejemplo de ejecución de un dispositivo de inoculación que tiene un envase en forma de caja 10a con una tapa rectangular 10b. Dentro de este envase 10 se encuentra un dispositivo 12 tipo marco, que está firmemente conectado a la tapa 10b. El dispositivo de inserción, compuesto por el dispositivo de sujeción y la tapa, se sella contra el envase 10a mediante los sellos 42. El sello 42a es un sello en forma de U que rodea el dispositivo de sujeción 12 tipo marco dentro del envase, lo que se puede ver de manera adecuada en el perfil. En el estado montado, dos compartimientos cerrados separadores de líquido se forman en el interior del dispositivo de inoculación, uno por encima y otro por debajo del substrato.

La transferencia interna de fluido entre los compartimientos puede resultar deseable y posible, dependiendo de la porosidad del substrato que es inoculado. De esta manera, resulta viable para el medio oxigenado que se introduzca en la estructura interna durante la fase de giro del dispositivo de inoculación.

Cada uno de los compartimientos posee una entrada de líquido 16a, 16a' y una salida de líquido 16b, 16b'. también se puede prever entradas y salidas de gas, pero no se muestran aquí. Mientras el reactor rueda durante la inoculación, los conductos de entrada y de salida 16a, 16a', 16b, 16b' se cierran. Si no se pretende que así sea, se prevén acopladores de rotación. No obstante, por lo general el proceso se lleva a cabo en pasos.

La figura 7 muestra un sostenedor que se puede rotar adecuado 100 en el cual el dispositivo de inoculación 10 también se puede rotar en una incubadora rotatoria durante la inoculación. El sostenedor 100 abarca dos discos 110 del vidrio o de Plexiglás con dos aberturas excéntricas 120. Las aberturas 120 para la inserción de un dispositivo de inoculación cilíndrico 10 son, en el mejor caso, ovales o tienen forma de sección de un cilindro. En este ejemplo los discos 110 son circulares, pero pueden tener otras formas; por ejemplo, pueden ser elípticos. En este ejemplo los discos 110 se encuentran conectados mediante múltiples barras 130. Sin embargo, pueden estar también conectados mediante una camisa cilíndrica cerrada. El montaje de los discos 110 se elige de manera que las aberturas 120 se desplacen de manera opuesta en la proyección. Un tubo 140 se inserta entre las aberturas 120, por el que se puede insertar el dispositivo de inoculación 10. Entonces, el eje longitudinal del dispositivo de inoculación, no mostrado en el dibujo, se encuentra oblicuo al eje longitudinal del sostenedor cilíndrico total. El sostenedor 100, con el dispositivo de inoculación 10 compone una disposición que se puede colocar en una incubadora rotatoria. En el tratamiento en la incubadora rotatoria, el dispositivo de inoculación se expone a un movimiento rotatorio en su eje longitudinal y, simultáneamente, a un movimiento de giro transversal a su eje longitudinal. De esta manera, el medio de cultivo se puede distribuir y poner en contacto con el substrato, particularmente intenso y uniforme.

Los lados laterales de los dispositivos mostrados en las figuras (paredes exteriores en forma de camisa cilíndrica, rectangular o esférica) pueden, por ejemplo, esta constituidos por películas permeables al gas de PTFE o de silicona para mejorar el suministro de oxígeno durante las fases de inoculación de perfusión libre. El intercambio continuo de gas, o la oxigenación temporal deliberada con oxígeno o una mezcla de oxígeno, aumenta substancialmente la eficacia de la adherencia (hasta un 100-200%) durante la fase rotatoria. De esta manera, el substrato se ve siempre suministrado con oxígeno de manera óptima (fase rotatoria y fase de perfusión). Debido a el balanceo, el medio usado se mueve continuamente hacia la pared de oxigenación del reactor.

Claims

1. Un método para la inoculación en capas múltiples de substratos (B) con células biológicas (3B), en el que, en el dispositivo (10), un substrato en él contenido y las células (3B) para la inoculación, se someten a, al menos, una fase de inoculación, durante la cual el substrato (B) se hace rotar sobre, al menos, un eje con o en el dispositivo (1), y las células (3B) se hacen entrar en contacto de manera repetida con el substrato (B) durante el movimiento rotatorio, caracterizado porque

-: el substrato (B) se somete, después o durante una o más fases de inoculación, a, al menos, una fase de perfusión, durante la cual, el substrato (B) se prefunde, al menos, en áreas de su superficie exterior o interior.

2. Un método, según la reivindicación 1, caracterizado porque, durante la fase de inoculación, las células (3B) se suministran a un medio o se suministran mediante cepillado a un substrato (B), y por la introducción en el substrato (B) o el recubrimiento del substrato (B) con una composición que abarca las células (3B).

3. Un método, según la reivindicación 2, caracterizado porque a las células (3B) se les añaden factores o cofactores, en particular factores del crecimiento o factores quimiotácticos.

4. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 3,caracterizado porque, durante una fase de perfusión, el substrato (B) se perfusiona con un medio líquido, preferiblemente con un medio nutriente de cultivo celular o sangre.

5. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque la rotación tienen lugar de manera simultánea sobre, al menos, dos ejes espaciales en un movimiento rotacional superimpuesto.

6. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque la rotación tiene lugar de manera sucesiva o alternante sobre, al menos, dos ejes espaciales.

7. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque las fases de inoculación y de perfusión tienen lugar de manera alternada.

8. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 7, caracterizado porque el substrato (B) se somete, después de, al menos, una fase de inoculación, a una fase adicional de reposo durante la que no tiene lugar ni rotación ni perfusión.

9. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizado porque el método incluye otras fases con pasos adicionales del método para el tratamiento del substrato ya inoculado, parcialmente inoculado o por inocular.

10. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado porque la perfusión tiene lugar por pulsos.

11. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque el substrato (B) se inocula con diferentes células (3B) en diferente áreas.

12. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizado porque el substrato (B) se inocula con diferentes células (3B) de manera

\hbox{sucesiva}

o en diferentes posiciones.

13. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el substrato (B) se celulariza y/o esteriliza y/o transporta y/o almacena adicionalmente en un dispositivo (10) que sirve para el tratamiento.

14. Un método, según una de las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizado porque el substrato (B) inoculado, parcialmente inoculado o por inocular se crioconserva temporalmente mediante la introducción de líquido o gas refrigerante, como, en particular, nitrógeno.

15. Un dispositivo de inoculación (10) que comprende

-: un envase (10a,b) y

-: un dispositivo de sujeción (12) dispuesto en él para un substrato (B) a inocular, diseñado de tal manera que al menos dos compartimentos que, esencialmente, separan líquidos o facilitan la transferencia controlada de líquidos, se forman dentro del envase (10a,b) en los lados opuestos del substrato sujeto (B) en interacción con el substrato sujeto (B).

-: y tiene al menos una entrada y una salida para líquidos (16a, 16a', 16b, 16b') para cada una de las cámaras formadas,

caracterizado porque el dispositivo de fijación (12) se encuentra dispuesto en un dispositivo de inserción desprendible (10b), de manera que le substrato (B) con el dispositivo de sujeción (12) se pueda insertar en el envase (10a) y desprender de él de
nuevo.

16. Un dispositivo de inoculación (10), según la reivindicación 15, caracterizado porque el envase (10a,b) está diseñado para que se pueda rotar.

17. Un dispositivo de inoculación (10), según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el uno o más dispositivo de sujeción (12) se encuentra dispuesto esencialmente de manera transversal a una dirección de movimiento preferente, definida mediante un movimiento de rotación de un envase (10a,b), de un medio líquido contenido en él.

18. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 17, caracterizado porque el dispositivo de fijación (12) se encuentra dispuesto de tal manera que en relación con las aberturas de entrada y de salida (16a, 16a', 16b, 16b'), que una dirección de flujo, definida por las entradas y las salidas, del medio líquido, corre por el reactor a lo largo del substrato fijado (B).

19. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 18, caracterizado porque el dispositivo de fijación (12) consiste en, al menos, un sostenedor tipo cuadro.

20. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 18, caracterizado porque el dispositivo de fijación (12) posee, al menos, un sostenedor ramificado para la fabricación de prótesis en Y.

21. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 20, caracterizado porque el dispositivo de fijación (12) presenta, preferiblemente en un sostenedor, al menos una abertura de entrada y/o salida para la introducción de un medio, de células (3B) y/o de material en, al menos, una cámara interna de un substrato (B) de pared doble o múltiple.

22. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 21, caracterizado porque el envase (10a,b) rotatorio es de forma cilíndrica.

23. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 22, caracterizado porque el envase (10a,b) rotatorio es de forma esférica o esferoidal.

24. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 23, caracterizado porque al menos una cámara comprende, adicionalmente, uno o más conductos de entrada y de salida para gas.

25. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 24, caracterizado porque las entradas y las salidas y, en los casos en los que existan, los conductos de entrada y de salida de gas, se encuentran conectados mediante fijadores rotantes.

26. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 25, caracterizado porque el envase del dispositivo de inoculación (10a,b) abarca unos muros permeables al gas.

27. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 26, caracterizado porque los elementos internos que guían el medio líquido, a medida que fluye por el reactor, se encuentran dispuestos de la manera deseada en el interior del envase (10a,b), en el que los elementos internos se encuentran, preferiblemente, dispuestos en la pared interior del envase.

28. Un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 27, caracterizado porque se forma una cámara adicional, con al menos una entrada y una salida (18a, 18b), en la pared interior del envase (10a,b) con la ayuda de una pared divisoria microporosa (20).

29. Una disposición que comprende un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 28, y un sostenedor (100) diseñado para que se pueda rotar.

30. Una disposición, según la reivindicación 29, en la que el eje de rotación del sostenedor (100) rotante y un eje longitudinal del substrato (B) fijado al dispositivo de fijación (12) del dispositivo de inoculación (10), se encuentran en un ángulo uno respecto al otro.

31. Utilización de un dispositivo de inoculación (10), según una de las reivindicaciones de la 15 a la 28, como depósito de transporte y almacenaje para un substrato inoculado (B).