WO2000058458A2 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER ZUFALLSGEPRIMTEN, FÜR EINE GERICHTETE CLONIERUNG GEEIGNETEN cDNA - Google Patents

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER ZUFALLSGEPRIMTEN, FÜR EINE GERICHTETE CLONIERUNG GEEIGNETEN cDNA Download PDF

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WO2000058458A2
WO2000058458A2 PCT/DE2000/000878 DE0000878W WO0058458A2 WO 2000058458 A2 WO2000058458 A2 WO 2000058458A2 DE 0000878 W DE0000878 W DE 0000878W WO 0058458 A2 WO0058458 A2 WO 0058458A2
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Bernhard Korn
Stefan Wiemann
Annemarie Poustka
Caroline Diem
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
GÜNTHER, Stefan, Jens
DIEM, Paul
DIEM, Friederike
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a randomly primed cDNA suitable for directional cloning, which is based on the fact that a single-stranded oligonucleotide mixture is attached to the synthesis of the first cDNA strand from an RNA or a (m) RNA mixture from a sample
  • the oligonucleotide mixture is characterized in that the 3 ' portion has random sequences and the 5 ' portion, when converted to a double strand, has a recognition site for a restriction endonuclease.
  • oligo (dT) -primed cDNA in a directed manner into corresponding vectors (directional cloning).
  • directional cloning This means that the desired direction of integration of the cDNA can be determined when the cDNA is ligated into a vector.
  • Directional cloning has clear advantages in the production of the ligation product, since, for example, the rate of non-recombinant vector molecules is significantly lower. Further advantages are the simplified analysis of the resulting clones.
  • the method according to the invention is based on the fact that an oligonucleotide mixture is used for the synthesis of the first strand of cDNA, which is characterized in that the 3 ' portion has random sequences with a length of at least 4 nucleotides and the 5 ' portion if it is in a double strand is transferred, has a recognition site for a restriction endonuclease.
  • the random sequences at the 3 ' end of the oligonucleotide mixture cause the oligonucleotide molecules to be randomly attached to the mRNA.
  • the cDNA synthesis can start, randomly distributed, at any point on an RNA molecule.
  • the first strand of the cDNA is then converted into a double-stranded product using, for example, E. coli DNA polymerase, RNaseH and E. coli ligase.
  • the 5 ' portion of the oligonucleotide molecules which has the recognition site for a restriction enzyme is also converted into the double-stranded form at the 5 ' end of the cDNA.
  • adapter DNA molecules synthetic double-stranded DNA molecules
  • the adapter DNA molecule has a smooth end and a protruding end that is not phosphoryiated. This will ligate the adapter DNA molecules to the cDNA directed (ie, with the blunt end). Since the protruding end is not phosphoryiated, there is no multimer formation of adapter DNA molecules.
  • the cDNA provided with the adapter DNA molecules is cut with the corresponding restriction enzyme, which preferably cuts in the CpG island. For example, if the 5 'portion of the oligonucleotide mixture has the sequence CGGCCG, the restriction endonuclease is used to cut Eagl (Eagl has the recognition sequence CjGGCCG).
  • the modified cDNA is then ready for directional cloning: the individual cDNA molecules now have two different, incompatible ends. At one end there is the protruding end defined by the restriction enzyme (for example in the case of Eagl GGCC) and at the other end the protruding end defined by the adapter DNA molecule, for example GATC, TCGA, AATT etc. All protruding ends are conceivable here that are not compatible with the other end produced by the restriction enzyme.
  • the restriction enzyme for example in the case of Eagl GGCC
  • the adapter DNA molecule for example GATC, TCGA, AATT etc. All protruding ends are conceivable here that are not compatible with the other end produced by the restriction enzyme.
  • the cDNA can be in the desired Orientation cloned.
  • the present invention thus relates to a method for producing a randomly primed DNA suitable for directional cloning, which is characterized by the following steps:
  • oligonucleotide mixture (a) Attachment of a single-stranded oligonucleotide mixture to an RNA or an (m) RNA mixture obtained from a sample, the oligonucleotide mixture being characterized in that the 3 ' portion has random sequences with a length of at least 4 nucleotides and the 5 ' - Portion, when converted to a double strand, has a recognition site for a restriction endonuclease;
  • step (d) ligation of adapter DNA molecules to both ends of the cDNA obtained in step (c);
  • RNA mixture can originate from any sample, for example be viral, bacterial, animal or vegetable.
  • the total RNA isolated from the sample can be used to produce the cDNA suitable for directional cloning, but the mRNA fraction is preferably enriched before the cDNA synthesis.
  • the oligonucleotide mixture useful for the method according to the invention is a mixture of oligonucleotide molecules, which is characterized in that the 3 'part of the molecules has random sequences (N) with a length of at least 4 nucleotides and the 5 ' part if it is converted into a double strand which has a recognition site for a restriction endonuclease.
  • the nucleic acid sequence with the recognition site for the restriction endonuclease can connect directly to the random sequence, but can also be separated from it by a further nucleotide (s).
  • One or more nucleotides can also join in the 5 ' direction of the sequence.
  • the recognition sequence for the restriction endonuclease directly follows the random sequence and has no further nucleotides at its 5 ' end.
  • the synthetic oligonucleotides are generally produced in the 3 '->5' direction.
  • the random base sequence of the random sequence is created first. It is a chemical coupling of the individual bases.
  • the oligonucleotides are prepared by customary methods which are well known to the person skilled in the art. Special cleaning steps such as HPLC or PAGE are not necessary, but can take place if an improved quality of the oligonucleotides is desired.
  • the pool size of the oligonucleotide mixture depends on the number of bases defined as random.
  • the length of the random sequence is limited to four bases, a mixture of 256 different oligonucleotides is used. If one increases the length of the random sequences to five or six bases, 1024 or 4096 different oligonucleotides are used.
  • the further steps (b) to (e) can be carried out by methods known in this field, for example in accordance with the following Examples given procedures.
  • the modified cDNA obtained in this way can be used directly for directional cloning into a correspondingly prepared vector.
  • any cloning vector for example an expression vector, can be used which can be cut so that it has ends compatible with the cDNA to be inserted.
  • the molecular ratio between the RNA molecules and molecules of the oligonucleotide mixture during the synthesis of the first strand of the cDNA can regulate both the amount of the cDNA to be produced and the average length of the cDNA products.
  • the length of the 3 ' portion of the molecules of the oligonucleotide mixture should be at least 4 bases and can be up to 10 bases, a number from 6 to 8 being preferred.
  • the ratio between indefinite bases (random sequences at the 3 'end of the oligos) and defined bases (constant sequence (s) which define the restriction site) can be chosen by the person skilled in the art, but should preferably be 1: 1, with a shift of the Ratio in favor of indefinite bases can be advantageous.
  • restriction enzymes that rarely cut in the cDNA to be cloned. This depends on the base composition of the transcribed sequences.
  • Preferred restriction enzymes are those which cut their recognition sequence with high specificity and which effectively cut near the end of a double-stranded DNA.
  • a restriction endonuclease recognition site that creates protruding ends and cuts in the CpG island.
  • the restriction enzymes Eagl, Sal I and Mlu I are, for example, the restriction enzymes Eagl, Sal I and Mlu I.
  • adapter DNA molecules with a smooth or (incompatible) protruding end can be used.
  • a recognition site for a restriction endonuclease producing blunt ends can also be used, in which case, however, the adapter DNA molecules must then provide protruding ends.
  • a recognition site for a restriction uses endonuciease, which creates a protruding 5 ' end.
  • the recognition sequence for the restriction endonuclease has a length of at least 6 nucleotides (N 6 ). This reduces the likelihood that such a recognition sequence also occurs accidentally within the cDNA molecules, which would result in step (e) also cutting within the cDNA molecules, which is not desired.
  • the sequence for the restriction endonuclease consists of only 4 or 5 nucleotides. There is no upper limit on the number of bases.
  • the recognition site of the oligonucleotide mixture is CGGCCG, which is recognized by the restriction endonuclease Eagl.
  • the adapter DNA molecules preferably have a smooth and an unphosphorylated projecting end.
  • Adapter DNA molecules in which the projecting end is 5 ' -GATC, 5 ' -TCGA or 5 ' -AATT are particularly preferred.
  • the present invention relates to a kit for carrying out the method described above, which contains the oligonucleotide mixture described above.
  • the kit can contain further components which are required, for example, to carry out the entire cDNA synthesis and / or to cut the cDNA provided with adapter DNA molecules.
  • RNA preferably poly (A) RNA
  • the oligonucleotides described attach themselves to the RNA template in a sequence-nonspecific manner, that is to say randomly. It is not necessary that the sequence part coding for the restriction site to be introduced (preferably: CGGCCG) finds a complementary sequence on the RNA template.
  • the first strand synthesis of the cDNA takes place by means of a polymerase which requires a primer as the starting point.
  • the Zwertstrandsynthesis is carried out, for example, by an enzyme mixture of E. coli DNA polymerase, E. coli ligase and RNaseH. RNA fragments are used as starting points, which were generated by RNaseH.
  • the synthetic part of the first strand of cDNA is also doubled. In the preferred case shown in FIG. 1, this is the N 6 component and the CGGCCG sequence. It An adapter is ligated to both ends, which has, for example, a phosphorylated smooth end and a non-phosphorylated projecting end.
  • the sequence of the overhang depends on the sequence of the vector interface into which the cDNA fragments are to be cloned, and finally a cut is made with a restriction endonuclease that cuts the recognition sequence (preferably: CGGCCG) that is present internally, flanked by the cDNA Sequence on one side and the adapter on the other.
  • the recognition sequence preferably: CGGCCG
  • the adapter is separated and a second overhang is created which is incompatible with the overhang provided by the adapter. This creates a DNA molecule with two different terms, which allows directed cloning.
  • FIG. 1 Schematic representation of the method according to the invention
  • RNA is used as the template, preferably poly A + RNA
  • oligonucleotides attach themselves to the template in a sequence-unspecific manner. It is not necessary for the sequence part which codes for the restriction site (here: CGGCCG) to find a complementary sequence part on the template. Depending on the molar ratio of oligonucleotides to template molecules, different numbers of oligonucleotide molecules can attach to a template strand.
  • the first strand synthesis of the cDNA is catalyzed by a reverse transcriptase, which requires a primer (here the oligonucleotides) as the starting point
  • the second strand synthesis is catalyzed by an enzyme mixture of E. coli DNA polymerase, E. coli ligase and RNase H and uses RNA fragments generated by RNase H as starting points.
  • the synthetic part of the cDNA single strand (N 6 and the CGGCCG sequence) is also doubled.
  • Example 1 Isolation of polyA + RNA
  • RNA / DNA extraction from eukaryotic cells Put a piece of fresh rat liver in 10 ml ice-cold PBS and scrape it off, rinse with 10 ml PBS, pellet suspension cultures by centrifugation (1200 rpm, 10 min. 4 ° C). Resuspend the pellet in 10 ml ice-cold PBS.
  • RNA extraction buffer 140 mM NaCl, 1, 5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris / Cl (pH 8.6), 0.5% NP-40, make up to 10 ml with H 2 O
  • RNA extraction buffer 140 mM NaCl, 1, 5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris / Cl (pH 8.6), 0.5% NP-40, make up to 10 ml with H 2 O
  • RNA Incubate for 10 minutes on ice and centrifuge for at least 30 minutes at 4 ° C and 15000 rpm. Wash RNA with 1 ml 70% EtOH and resuspend in 50 ⁇ l DEPC water, store at -80 ° C. The yield is 100-400 ⁇ g total RNA.
  • oligo (dT) cellulose 100 mg per 1 mg total RNA are required.
  • the columns are available from BioRAD, polypropylene Econo columns, 11 ml, # 731-1550 or from Pierce, disposable polypropylene column, 6 ml, # 29920.
  • Oligo (dT) cellulose is available from Fa. Pharmacia, oligo (dT) cellulose type 7, # 27-5543-02 or Boehringer Mannheim, # 808 229.
  • the oligo-dT cellulose is as follows prepared: 1) addition of oligo-dT in TE buffer for 30 min.
  • Isolation of poly A + RNA Absorb the RNA to 1 ⁇ g / ⁇ l with H 2 0 and denaturate for 5 min. at 65 ° C. Cool on ice and add 1 volume 2x BP500. Add an appropriate amount of oligo (dT) cellulose and incubate for more than 2 hours on an overhead rotator. Load a column of frit with glass beads. Transfer the oligo (dT) cellulose to which the RNA has bound into the column. Allow the oligo (dT) cellulose to settle for 15-30 minutes. Wash with 5 vol. 1x BP500 and with 4 vol.
  • 1x BP100 (10 mM Tris / Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% SDS, H 2 O to 1 liter, pH should be around 7.5). Elute three times with 1 ml TE in a 15 ml Falcon tube filled with 3M NaAc (pH 4.8) and 6 ml EtOH. Precipitate carefully. Resuspend in 10-50 ⁇ l H 2 O (for 0.2-1 mg total RNA as starting material).
  • oligonucleotide mixture (pool of 4096 different oligonucleotides for random hexamers, each with CGGCCG [results in Eagl site] at the 5 ′ end) were added to 1 ⁇ g mRNA from rat liver in 10 ⁇ l TE buffer. Then 10 min. heated to 70 ° C, cooled on ice and centrifuged briefly.
  • the synthesis of the second strand took place.
  • the following was added in succession to the reaction mixture described in Example 2: 93 ⁇ l water, 0.25 ⁇ l [alpha- 32 P] dCTP, 30 ⁇ l ⁇ x buffer for the second strand (100 mM Tris / Cl (pH 6.9), 450 mM KCI, 23 mM MgCI 2 , 5 mM ATP, 750 ⁇ M ß-NAD + , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ), 3 ⁇ l dNTPs, 1 ⁇ l E.coli DNA- Ligase, 1 ul E.
  • the double-stranded cDNA obtained in Example 3 was in 40 ul solution with the adapter DNA molecules according to Example 4 (20 pmol / l) resuspended and then the following was added on ice: 12 l 5x T4 ligase buffer (250 mM Tris / Cl (pH 7.6), 50 mM MgCl 2 , 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25% PEG8000), 3 ul water and 5 ul T4 DNA ligase. It was mixed gently and incubated at 16 ° C for at least 16 hours. Then 60 ul phenol / chloroform / isoamyl alcohol were added, vortexing and 5 min. centrifuged at room temperature and at 15,000 rpm.
  • the restriction cleavage of the cDNA obtained in Example 5 with ligated adapter DNA molecules was carried out by adding the following to a 30 ⁇ l reaction on ice: 3 ⁇ l 10 ⁇ “red buffer” (New England Biolabs), 4 ⁇ l water and 3 ⁇ l Eagl (10 U / ⁇ l; New England Biolabs). The mixture was then mixed and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The mixture was then placed on ice and 4 ⁇ l 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 15 ⁇ l TE buffer and 150 ⁇ l phenol / chloroform / isoamyl alcohol were added. After thorough vortexing, 5 min. Centrifuged at 15,000 xg.
  • the cut cDNA obtained in Example 6 was brought to a volume of 30 ⁇ l (10 mM Tris / Cl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 25 mM NaCl (TEN 25 )). All of the following steps were performed on ice. Sephacryl S 500 HR columns (1 ml; BRL) were 4x with 0.8 ml TEN 25 for about 10 to 15 min. washed, then the 30 ul mixture with the cDNA applied. After penetration into the column, 100 l of TEN 25 were then passed through and then elution was carried out with TEN ⁇ , a total of 25 fractions of 25 l each being collected in reaction vessels.
  • the radioactivity of the individual fractions was determined in a scintillation counter ("Cherenkov" count) and the first three fractions containing radioactivity were used to prepare a cDNA library.
  • the combined fractions were removed by adding 5 ⁇ l tRNA solution (5th mg / ml) and 0.5 volumes (NH) 4 Ac and 3 volumes of cold (-20 ° C) alcohol precipitated. Then 20 min. centrifuged. Finally the pellet was washed with 70% cold (-20 ° C) alcohol, 10 min. dried at 37 ° C, resuspended in 10 ⁇ l TE buffer and stored at -20 ° C.
  • Example 8 Insertion of the cDNA into a vector
  • 2.5 ⁇ g of this plasmid DNA (pQE30NST) were completely cut with Sall and 2.5 ⁇ g plasmid DNA with Eagl in 25 ⁇ l restriction buffer for 2 hours at 37 ° C.
  • the two reaction mixtures were then mixed and the following was added: 5 ⁇ l of 10 ⁇ BM buffer (500 mM Tris-Cl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 1 M NaCl, 10 mM dithiothreitol), again 20 U Sall and Eagl each . It was made up to 100 ⁇ l with water and incubated again at 37 ° C. for 2-4 hours. The completely cut plasmid was cleaned with Tip20 (Qiagen). The column was washed with 5 ml of QB2 buffer (from Qiagen), the cut-out part of the plasmid polylinker being eluted.
  • the plasmid was then eluted with QF buffer (Qiagen), precipitated with isopropanol, washed with 70% alcohol and 10 min. air dried. The pellet was then resuspended in 50 ⁇ l of water, checked for the DNA concentration on a mini gel and then diluted to 10 ng / ml. Thereafter, 50 ng vector DNA was mixed in a sterile reaction vessel with 100 ng of the double-stranded cDNA prepared as described above, with water was diluted to a final volume of 7 ⁇ l and the mixture was then 5 min. incubated at 45 ° C.
  • QF buffer Qiagen
  • Transformation of the competent cells 200 ⁇ l aliquots of the competent cells from step (a) were placed in pre-cooled 15 ml plastic tubes (Falcon). 3.4 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol (1.44 M) were then added to a final concentration of 25 mM. The cells and the ß-mercaptoethanol were then mixed vigorously. Then 10 min. incubated on ice and then 1 ul ligation mixture was added. There was a further 30 min. Left on ice and then heat shocked (30 seconds at 42 ° C).

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung einer zufallsgeprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA, das darauf beruht, daß bei der Synthese des ersten cDNA-Strangs von einer RNA oder einem (m)RNA-Gemisch aus einer Probe ein einzelsträngiges Oligonucleotidgemisch angelagert wird, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufallssequenzen, vorzugsweise mit einer Länge von 4 bis 10 Nukleotiden, aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease, die überstehende Enden erzeugt.

Description

Verfahren zur Herstellung einer zufalisgeprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zufalisgeprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA, das darauf beruht, daß bei der Synthese des ersten cDNA-Strangs von einer RNA oder einem (m)RNA-Gemisch aus einer Probe ein einzelsträng iges Oligonucleotidgemisch angelagert wird, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3 '-Anteil Zufallssequenzen aufweist und der 5 '-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist.
Die Herstellung von qualitativ hochwertigen Genbibliotheken ist ein zentraler Punkt bei der Analyse der Erbinformationen von Organismen. Durch die Einführung von Expres- sionsvektoren, die die Herstellung von rekombinanten Proteinen erlauben, ist die Erzeugung solcher Genbanken ebenfalls von zentralem Interesse. Bei der von mRNA ausgehenden Herstellung von Genbanken (cDNA-Banken) gibt es im Prinzip zwei unterschiedliche Ansätze zur Überführung der mRNA in cDNA. Entweder werden Oligo(dT)-Primer eingesetzt, wobei die Konvertierung der mRNA zu cDNA am 3 '-Ende des Gens startet, oder es wird ein Gemisch von Oligonucleotiden als Primer verwendet, die eine Zufallssequenz besitzen ("random-priming") (Koike et al. (1987), Nucleic Acids Research 15, S. 2499). Diese zufälligen Sequenzen zielen nicht auf den poly(A)-Schwanz der mRNA, sondern sie bedingen den Start der cDNA-Synthese an einer zufälligen Position innerhalb der mRNA.
Bisher war es möglich, Oligo(dT)-geprimte cDNA in einer gerichteten Weise in entsprechende Vektoren zu inserieren (direktionelles Clonieren). Dies bedeutet, daß bei der Ligation der cDNA in einen Vektor die gewünschte Richtung der Integration der cDNA festgelegt werden kann. Eine direktioneile Clonierung hat bei der Herstellung des Liga- tionsprodukts deutliche Vorteile, da beispielsweise die Rate nicht-rekombinanter Vektormoleküle deutlich geringer ist. Weitere Vorteile liegen in der vereinfachten Analyse der resultierenden Clone. Insbesondere bei der Clonierung in Expressionsvelrtoren liegen die Vorteile einer direktioneilen Clonierung auf der Hand: Aufgrund der Tatsache, daß die cDNA-Fragmente ausschließlich in der Leserichtung in den Vektor inseriert werden können (und deren Orientierung nicht dem Zufallsprinzip unterliegt wie bei der ungerichteten Clonierung), verringert sich die Zahl der zu analysierenden Clone, wodurch die gesamte Analyse beschleunigt wird. Allerdings war bisher eine direktionelle Clonierung von zufalls- geprimter cDNA nicht möglich.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer zufalisgeprimten cDNA zur Verfügung zu stellen, das eine gerichtete Clonierung erlaubt.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß für die Synthese des ersten cDNA- Strangs ein Oligonucleotidgemisch verwendet wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3 ' -Anteil Zufallssequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5 '-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Die Zufallssequenzen am 3 '-Ende des Oligonucleo- tidgemischs bewirken ein zufälliges Anlagern der Oligonucleotidmoleküle an die mRNA. Da diese Moleküle als Startpunkte für die Synthese des ersten cDNA-Strangs durch die Reverse Transkriptase dienen, kann die cDNA-Synthese, statistisch verteilt, an jedem beliebigen Punkt an einem RNA-Molekül beginnen. Der erste Strang der cDNA wird dann durch den Einsatz von z.B. E.coli DNA-Polymerase, RNaseH und E.coli Ligase in ein doppelsträngiges Produkt überführt. Dabei wird auch der, die Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym aufweisende 5 '-Anteil der Oligonucleotidmoleküle am 5 '-Ende der cDNA in die doppelsträngige Form überführt. In einem weiteren Schritt werden dann Adaptor-DNA-Moleküle (synthetische doppelsträngige DNA-Moleküle) an beide glatten Enden der cDNA-Fragmente ligiert. Das Adaptor-DNA-Molekül besitzt beispielsweise ein glattes Ende und ein überstehendes Ende, das nicht phosphoryiiert ist. Dadurch werden die Adaptor-DNA-Moleküle gerichtet an die cDNA ligiert (d.h. mit dem glatten Ende). Da das überstehende Ende nicht phosphoryiiert ist, kommt es nicht zur Multimerbildung von Adaptor-DNA-Molekülen. Im nächsten Schritt wird die mit den Adaptor-DNA-Molekülen versehene cDNA mit dem entsprechenden Restriktionsenzym, das vorzugsweise im CpG- Island schneidet, geschnitten. Weist beispielsweise das Oligonucleotidgemisch in seinem 5 '-Anteil die Sequenz CGGCCG auf, wird mit der Restriktionsendonuclease Eagl geschnitten (Eagl besitzt die Erkennungssequenz CjGGCCG). Danach ist die modifizierte cDNA fertig zur gerichteten Clonierung: Die einzelnen cDNA-Moleküle besitzen jetzt zwei verschiedene, nicht kompatible Enden. An einem Ende befindet sich das durch das Restriktionsenzym definierte überstehende Ende (beispielsweise im Fall von Eagl GGCC) und am anderen Ende das durch das Adaptor-DNA-Molekül definierte überstehende Ende, beispielsweise GATC, TCGA, AATT etc. Hier sind alle überstehenden Enden denkbar, die nicht mit dem anderen, durch das Restriktionsenzym erzeugten Ende kompatibel sind. Durch das Vorhandensein der beiden unterschiedlichen Enden kann nach entsprechender Vorbereitung des Vektors (d.h. beispielsweise nach Herausschneiden eines Polylinker- fragments aus dem Vektor so, daß der linearisierte Vektor zwei unterschiedliche, mit den jeweiligen Enden der modifizierten cDNA kompatible Enden aufweist) die cDNA in der gewünschten Orientierung eincloniert werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer für eine gerichtete Clonierung geeigneten zufalisgeprimten DNA, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Anlagerung eines einzelsträngigen Oligonucleotidgemischs an eine RNA oder ein aus einer Probe erhaltenes (m)RNA-Gemisch, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3 '-Anteil Zufallssequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5 '-Anteil, wenn er in einen Doppel- ^strang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist;
(b) Durchführung einer durch dieses Oligonucleotidgemisch gesteuerten Poiymerisa- tionsreaktion zur Synthese des ersten cDNA-Strangs;
(c) Durchführung einer weiteren Polymerisationsreaktion zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA;
(d) Ligation von Adaptor-DNA-Molekülen an beide Enden der in Schritt (c) erhaltenen cDNA; und
(e) Schneiden der in Schritt (d) erhaltenen cDNA-Moleküle mit einer, den die Erkennungsstelle im 5 '-Anteil des Oligonucleotidgemischs erkennenden Restriktionsendonuclease, wobei eine cDNA erhalten wird, deren eines Ende durch die Sequenz des Adaptor-DNA-Moleküls definiert ist, das andere Ende durch die Erken- nungsstelie für die Restriktionsendonuclease, die durch den 5 '-Anteil des Oligonu- cleotidgemisches bestimmt wird, und wobei mindestens ein Ende ein überstehendes Ende ist. Dabei kann das RNA-Gemisch aus einer beliebigen Probe stammen, beispielsweise viraler, bakterieller, tierischer oder pflanzlicher Art sein. Zur Hersteilung der für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA kann die aus der Probe isolierte Gesamt-RNA verwendet werden, vorzugsweise wird jedoch vor der cDNA-Synthese die mRNA-Fraktion angereichert. Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Literaturstellen verwiesen, die die Isolierung von Gesamt-RNA und/oder von polyA+ RNA beschreiben: Birnboim et al, 1988, Nucleic Acids Research 16, S. 1487; Chomczynski et al., 1987, Anal. Biochem. 162, S. 156-159; Aviv et al., 1972, PNAS 69, S. 1408 (insbesondere polyA+ RNA). Essentiell ist, daß die RNA frei von RNasen oder Enzyminhibitoren ist.
Bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßigen Oligonucleotidgemisch handelt es sich um ein Gemisch von Oligonucleotidmolekülen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3 '-Anteil der Moleküle Zufallssequenzen (N) mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5 '-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Dabei kann sich die Nucleinsäuresequenz mit der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease direkt an die Zufallssequenz anschließen, kann aber auch durch (ein) weitere(s) Nucleotid(e) von dieser getrennt sein. In der 5 '-Richtung von der Sequenz können sich ebenfalls ein oder mehrere Nucleotide anschließen. Vorzugsweise schließt sich die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease direkt an die Zufallssequenz an und weist an ihrem 5 '-Ende keine weiteren Nucleotide auf. Die Herstellung der synthetischen Oligonukleotide erfolgt im allgemeinen in 3'-> 5'-Richtung. Dabei wird die zufällige Basenabfolge der Zufallssequenz zuerst erstellt. Es handelt sich dabei um eine chemische Kopplung der einzelnen Basen. Die Hersteilung der Oligonukleotide erfolgt nach üblichen Verfahren, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Spezielle Reinigungsschrrtte, z.B. HPLC oder PAGE sind nicht notwendig, aber können ggf. stattfinden, falls eine verbesserte Qualität der Oligonukleotide gewünscht ist. Die Poolgröße des Oligonukleotidgemischs ist von der Anzahl der als zufällig definierten Basen abhängig. Wird die Länge der Zufallssequenz auf vier Basen beschränkt, so wird ein Gemisch von 256 verschiedenen Oligonu- kleotiden eingesetzt. Steigert man die Länge der Zufallssequenzen auf fünf oder sechs Basen, so kommen 1024 bzw. 4096 verschiedene Oligonukleotide zum Einsatz.
Die Durchführung der weiteren Schritte (b) bis (e) kann durch auf diesem Gebiet bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise entsprechend den in den nachstehenden Beispielen angegebenen Verfahren. Die so erhaltene, modifizierte cDNA kann direkt zur gerichteten Clonierung in einen entsprechend vorbereiteten Vektor verwendet werden. Im Prinzip kann jeder beliebige Clonierungsvektor, beispielsweise ein Expressionsvektor, verwendet werden, der so geschnitten werden kann, daß er zu der zu inserierenden cDNA kompatible Enden aufweist.
Durch das molekulare Verhältnis zwischen den RNA-Molekülen und Molekülen des Oligonucleotidgemischs während der Synthese des ersten Strangs der cDNA kann sowohl die Menge der herzustellenden cDNA als auch die durchschnittliche Länge der cDNA- Produkte reguliert werden.
Die Länge des 3 '-Anteils der Moleküle des Oligonucleotidgemischs sollte mindestens 4 Basen betragen und kann bis zu 10 Basen sein, wobei eine Anzahl von 6 bis 8 als bevorzugt gilt.
Das Verhältnis zwischen unbestimmten Basen (Zufallssequenzen am 3'-Ende der Oligos) und definierten Basen (konstante Sequenz(en), die die Restriktionsschnittstelle definieren) kann vom Fachmann gewählt werden, sollte bevorzugt aber bei 1 :1 liegen, wobei auch eine Verschiebung des Verhältnisses zu Gunsten der unbestimmten Basen vorteilhaft sein kann.
Im allgemeinen ist es sinnvoll, solche Restriktionsenzyme zu verwenden, die in der zu klonierenden cDNA selten schneiden. Dies hängt von der Basenkomposition der jeweils transkribierten Sequenzen ab. Bevorzugt sind solche Restriktionsenzyme, die mit hoher Spezifität ihre Erkennungssequenz schneiden und nahe des Endes einer Doppelstrang- DNA effektiv schneiden. Für die DNA höherer Säuger ist es vorteilhaft, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease, die überstehende Enden erzeugt und im CpG- Island schneidet, zu verwenden. Dies sind beispielsweise die Restriktionsenzyme Eagl, Sal I und Mlu I. In diesem Fall können Adaptor-DNA-Moleküle mit einem glatten oder (nicht kompatiblen) überstehenden Ende verwendet werden. Es kann aber auch eine Erkennungsstelle für eine glatte Enden produzierende Restriktionsendonuclease verwendet werden, in diesem Fall müssen jedoch dann die Adaptor-DNA-Moleküle überstehende Enden liefern.
In einer ganz bevorzugten Ausführungsform wird eine Erkennungsstelle für eine Restrik- tionsendonuciease verwendet, die ein überstehendes 5 '-Ende erzeugt.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease eine Länge von mindestens 6 Nucleotiden (N6). Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, daß eine solche Erkennungssequenz auch innerhalb der cDNA-Moleküle zufällig vorkommt, was dazu führen würde, daß bei Schritt (e) auch innerhalb der cDNA-Moleküle geschnitten würde, was nicht gewünscht ist. Es ist aber erfindungsgemäß auch möglich, daß die Sequenz für die RestriWionsendonuklease nur aus 4 oder 5 Nukleotiden besteht. Nach oben unterliegt die Anzahl der Basen keiner Beschränkung.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Erkennungsstelle des Oligonucleotidgemischs CGGCCG, die von der Restriktionsendonuclease Eagl erkannt wird.
Vorzugsweise weisen die Adaptor-DNA-Moleküle ein glattes und ein unphosphoryliertes überstehendes Ende auf. Besonders bevorzugt sind Adaptor-DNA-Moleküle, bei denen das überstehende Ende 5'-GATC, 5 '-TCGA oder 5 '-AATT ist.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, der das vorstehend beschriebene Oligonucleotidgemisch enthält. Der Kit kann weitere Bestandteile enthalten, die beispielsweise zur Durchführung der gesamten cDNA-Synthese und/oder dem Schneiden der mit Adaptor-DNA-Molekülen versehenen cDNA benötigt werden.
Als Matrize für die cDNA-Synthese wird RNA, vorzugsweise poly(A)RNA verwendet. Die beschriebenen Oligonucleotide lagern sich sequenzunspezifisch, also zufällig an die RNA- Matrize an. Dabei ist es nicht nötig, daß der Sequenzanteil, der für die einzuführende Restriktionsschnittstelle codiert (bevorzugt: CGGCCG), eine komplementäre Sequenz auf der RNA-Matrize findet. Es erfolgt die Erststrangsynthese der cDNA mittels einer Polymera- se, die einen Primer als Startpunkt benötigt. Die Zwertstrangsynthese erfolgt beispielsweise durch ein Enzymgemisch aus E.coli-DNA-Polymerase, E.coli-Ligase und RNaseH. Dabei werden RNA-Bruchstücke als Startpunkte genutzt, die durch RNaseH erzeugt wurden. Dabei wird auch der synthetische Anteil des cDNA-Erststrangs verdoppelt. Dies ist in dem in der Figur 1 gezeigten bevorzugten Fall der N6-Anteil und die CGGCCG-Sequenz. Es erfolgt die Ligation eines Adaptors an beide Enden, der beispielsweise über ein phospho- ryliertes glattes Ende und ein nicht-phosphoryliertes überstehendes Ende verfügt. Dabei hängt die Sequenz des Überhangs von der Sequenz der Vektorschnittstelle ab, in die die cDNA-Fragmente cloniert werden sollen, und schließlich wird mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten, die die Erkennungssequenz (bevorzugt: CGGCCG) schneidet, die intern vorliegt, flankiert von der cDNA-Sequenz auf der einen Seite und dem Adaptor auf der anderen Seite. Durch Schneiden der Erkennungssequenz wird der Adaptor abgetrennt und es wird ein zweiter Überhang erzeugt, der mit dem Überhang, der durch den Adaptor zur Verfügung gestellt wird, nicht kompatibel ist. Dadurch entsteht ein DNA- Molekül mit zwei unterschiedlichen Termini, was die gerichtete Clonierung erlaubt.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand von Fig. 1 verdeutlicht, wobei diese zeigt: Fig. 1 : Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens
1) Als Matrize dient RNA, bevorzugt poly A+ RNA
2) Die Oligonukleotide lagern sich sequenzunspezifisch, also zufällig an die Matrize an. Dabei ist es nicht nötig, daß der Sequenzteil, welcher für die Restriktionsschnittstelle kodiert (hier: CGGCCG) eeinen komplementären Sequenzanteil auf der Matrize findet. Je nach molarem Verhältnis von Oligonukleotiden zu Matrizenmolekülen können sich unterschiedlich viele Oligonukleotidmoleküle an eeinem Matrizenstrang anlagern.
3) Die Erststrangsynthese der cDNA wird durch eine reverse Trans- kriptase katalysiert, die einen Primer (hier die Oligonukloetide) als Startpunkt benötigt
4) Die Zweitstrangsynthse wird durch ein Enzymgemisch von E. coli DNA-Polymerase, E. coli Ligase und RNase H katalysiert und nutzt RNA-Bruchstücke, die durch die RNase H erzeugt werden, als Startpunkte. Dabei wird auch der synthetische Anteil des cDNA-Einzel- strangs (N6 und die CGGCCG-Sequenz) verdoppelt.
5) Es folgt die Ligation eines Adaptors, der über ein phosphoryliertes, glattes Ende und ein Ende mit einem Überhang (nicht phosphoryiiert) verfügt. Dabei ist der Überhang abhängig von der Vektorschnittstelle in welche die cDNA-Fragmente später kloniert werden sollen. Der Überhang sollte kompatibel sein. Durch die Ligation werden Adaptormoleküie an beide Enden der cDNA-Fragmente angehängt. 6) Einsatz der Restriktionsendonuklease Eagl, wobei die Erkennungssequenz (hieπCGGCCG) nicht direkt terminal in dem DNA-Fragment leigt, sondern intern, flankiert von der cDNA auf der einen Seite und dem Adaptor auf der anderen Seite. Unter diesen Bedingungen schneidet das Restriktionsenzym innerhalb seiner Erkennungssequenz, schneidet den Adaptor ab und generiert einen zweiten Überhang, der mit dem Überhang, welcher durch den Adaptor zur Verfügung gestellt wird, nicht kompatibel ist.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Isolation von polyA+ RNA
RNA/DNA-Extraktion aus eukaryontischen Zellen: Ein Stück frische Rattenleber in 10 ml eiskaltes PBS geben und abschaben, mit 10 ml PBS nachspülen, Suspensionskulturen durch Zentrifugieren pelletieren (1200 Upm, 10 Min. 4°C). Pellet in 10 ml eiskaltem PBS resuspendieren. Zellen pelletieren durch Zentrifugieren bei 1800 Upm, 10 Min, 4°O, Pellet in 640 μl RNA-Extraktionspuffer (140 mM NaCI, 1 ,5 mM MgCI2, 10 mM Tris/Cl (pH 8,6), 0,5 % NP-40, auffüllen auf 10 ml mit H2O) resuspendieren und 5 Min. auf Eis inkubieren. 5 Min. in gekühlter Zentrifuge bei 15000 rpm zentrifugieren. Die RNA ist nun im Überstand (die DNA ist im Pellet). Den Überstand in zwei Eppendorf-Cups geben, 20 μl 20% SDS zugeben, mischen und ggf. bei -80°C einfrieren oder mit der Zugabe von 40 μl Proteinase K (1 0 mg/ml) fortfahren. 30 Min. bei 56°C inkubieren. 2x mit 750 μl Phe- noI/Chloroform/lsoamylalkohol extrahieren (1 Min. vortexen und bei 4°C zur Phasentrennung zentrifugieren: 5 Min, 15000 Upm). Wäßrige Phase in 2 Aliquots in Eppendorf- Cups geben. RNA mit 0,1 Vol. NaAc (3M, pH 5,2) und 3 Vol. EtOH fällen und gut mischen. 10 Min. auf Eis inkubieren und mind. 30 Min. bei 4°C und 15000 Upm abzentrifugieren. RNA mit 1 ml 70% EtOH waschen und in 50μl DEPC-Wasser resuspendieren, bei -80°C lagern. Die Ausbeute liegt bei 100-400 μg Gesamt-RNA.
Vorbereitung für Oliqo-dT-Säulen: Es werden 100 mg Oligo-(dT)-Cellulose pro 1 mg Gesamt-RNA benötigt. Die Säulen sind erhältlich von Fa. BioRAD, Polypropylen Econo- Säulen, 11 ml, # 731 -1550 oder Fa. Pierce, Einmal-Polypropylen-Säule, 6 ml, # 29920. Oligo-(dT)-Cellulose ist erhältlich von Fa. Pharmacia, Oligo-(dT)-Cellulose Typ 7, # 27- 5543-02 oder Fa. Boehringer Mannheim, # 808 229. Die Oligo-dT-Cellulose wird wie folgt vorbereitet: 1) Zugabe von Oligo-dT in TE-Puffer für 30 Min. (1 g in 10 ml TE); 2) Abzen- trifugieren 10 Min., 4000 Upm; 3) Equilibrieren der Oligo-dT-Cellulose in 10 ml 1x BP500 (10 mM Tris/Cl, pH 7,5, 500 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, H2O auf 1 Liter, pH sollte um 7,5 sein) für 30 Min. auf einem langsamen Schüttler, 4) Abzentrifugieren für 10 Min., 4000 Upm; 5) Resuspendieren der Oligo-dT-Cellulose in 10 ml 1x BP500.
Isolation von poly A+ RNA: Aufnehmen der RNA auf 1μg/μl mit H20 und Denaturieren für 5 min. bei 65°C. Auf Eis kühlen und 1 Vol. 2x BP500 hinzufügen. Zufügen einer entsprechenden Menge an Oligo-(dT)-Cellulose und Inkubieren für mehr als 2 Stunden auf einem Überkopf-Rotierer. Beladen einer Säule mit Fritte mit Glaskügelchen. Überführen der Oligo-(dT)-Cellulose, an die die RNA gebunden hat, in die Säule. Absetzenlassen der Oligo-(dT)-Cellulose für 15-30 Min.. Waschen mit 5 Vol. 1x BP500 und mit 4 Vol. 1x BP100 (10 mM Tris/Cl, pH 7,5, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, H2O auf 1 Liter, pH sollte um 7,5 sein). Dreimaliges Eluieren mit 1 ml TE in ein 15 ml Falcon-Röhrchen, das mit 3M NaAc (pH 4,8) und 6 ml EtOH gefüllt ist. Sorgfältig präzipitieren. Resuspendieren in 10-50 μl H2O (für 0,2 -1 mg Gesamt-RNA als Startmaterial).
Beispiel 2: Synthese des ersten cDNA-Strangs
Zu 1 μg mRNA aus Rattenleber in 10 μl TE-Puffer wurden 2 μl (125 ng/μl) Oligonukleo- tidgemisch (Pool von 4096 verschiedenen Oligonukleotide für Zufallshexamere mit jeweils CGGCCG [ergibt Eagl-Schnittstelle] am 5'-Ende) gegeben. Danach wurde 10 min. auf 70°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und kurz abzentrifugiert. Danach wurde nacheinander folgendes zugegeben: 4 μl δxPuffer für die Erststrangsynthese (250 mM Tris/Cl (pH 8,3), 375 mM KCI, 15 mM MgCy, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl dNTPs (jeweils 10 mM) und 2 μl "Super- script II RT (Fa. Life Technologies BRL). Danach wurde kurz gevortext, abzentrifugiert und bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Abkühlen auf Eis gestoppt.
Beispiel 3: Synthese des zweiten cDNA-Strangs
Unmittelbar nach Beendigung der Synthese des ersten cDNA-Strangs erfolgte die Synthese des zweiten Strangs. Dazu wurde zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionsgemisch nacheinander folgendes gegeben: 93 μl Wasser, 0,25 μl [alpha- 32P]dCTP, 30 μl δxPuffer für den zweiten Strang (100 mM Tris/Cl (pH 6,9), 450 mM KCI, 23 mM MgCI2, 5 mM ATP, 750 μM ß-NAD+, 50 mM (NH4)2SO4), 3 μl dNTPs, 1 μl E.coli DNA- Ligase, 1 μl E.coli DNA-Polymerase und 1 μl E.coli Rnase H. Danach wurde vorsichtig gemischt und 2 Stunden bei 16°C inkubiert, wobei darauf geachtet wurde, daß die Temperatur nie unter diesen Wert absank. Dann wurden 2 μl T4 DNA-Polymerase zugegeben und es erfolgte für weitere 5 min. eine Inkubation bei der vorstehend angegebenen Temperatur. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gestellt und es wurden 10 μl 0,5 M EDTA zugegeben. Für die Analyse der Reaktion wurden 10 μl für eine Agarose-Gelelektrophore- se entnommen. Zu dem Rest wurden 150 /il Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol gegeben, danach wurde gründlich gevortext und im Anschluß daran zur Phasentrennung 5 min. bei 15.000 x g zentrifugiert. 130 μl der wässrigen Phase wurden abgenommen und dazu wurden 70 μl 7,5 - (NH)4Ac und 500 μl (-20°C) Alkohol gegeben. Dann wurde gevortext und 20 min. bei 15.000 UpM zentrifugiert. Schließlich wurde mit 800 μl 70% kaltem (-20°C) Alkohol gewaschen und 10 min. bei 37°C getrocknet.
Aliquots der doppelsträngigen cDNA wurden auf einem analytischen Agarosegel (1 ,5%, Anfärbung mit EtBr) zusammen mit DNA-Größenmarkem II und VI (Boehringer Mannheim) analysiert. Die Größe der synthetisierten cDNA-Moleküle bzw. die Größenverteilung wurden, wenn die Konzentration für eine Sichtbarmachung durch Anfärbung mit EtBr zu gering war, mittels Radioautographie (Expositiondauer: 1 - 3 Tage) bestimmt.
Beispiel 4: Herstellung von Adaptor-DNA-Molekülen
Zur Kinasierung des unteren Strangs wurde auf Eis folgendes zusammengemischt: 2 nmol des Oligonucleotids für den unteren Strang (CGG ACG CGT GGG) in 50 μl Wasser, 7 μl 10x Kinase-Puffer (100 mM Tris/Cl (pH 7,5), 100 mM MgCI2, 500 mM NaCI, 10 mM Dithioth- reitol), 7 μl 10 mM ATP und 6 μl T4 DNA-Polynucleotidkinase (10 E/μl; Fa. New England Biolabs). Danach wurde 30 min. bei 37°C inkubiert, dann das Enzym 10 min. bei 70°C (oder 5 min. bei 90°C) inaktiviert. Zur Anlagerung des oberen Strangs wurde das vorstehende Reaktionsgemisch mit dem inaktivierten Enzym auf Eis gestellt und danach wurde eine äquimolare Menge (2 nmol) des Oligonucleotids für den oberen Strang (TCG ACC CAC GCG TCC G) zugegeben. Es wurde 5 min. bei 90°C denaturiert und dann ließ man das Gemisch durch Abschalten des Heizblocks langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Danach wurde die Konzentration der Adaptor-DNA-Moleküle mit 20 pmol/μl bestimmt.
Beispiel 5: Anlagerung der Adaptor-DNA-Moleküle an doppelsträngige cDNA
Die in Beispiel 3 erhaltene doppelsträngige cDNA wurde in 40 μl Lösung mit den Adaptor- DNA-Molekülen gemäß Beispiel 4 (20 pmol/l) resuspendiert und danach wurde auf Eis folgendes zugesetzt: 12 l 5x T4 Ligase-Puffer (250 mM Tris/Cl (pH 7,6), 50 mM MgCI2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25% PEG8000), 3 μl Wasser und 5 μl T4 DNA-Ligase. Es wurde vorsichtig gemischt und mindestens 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Danach wurden 60 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol zugegeben, darauf wurde gevortext und 5 min. bei Raumtemperatur und mit 15.000 UpM abzentrifugiert. 45 μl der wässrigen Phase wurden entnommen und zu diesen wurden 25 μl (NH)4Ac und 150 μl kalter (-20°C) Alkohol gegeben. Nach Vortexen wurde sofort 20 min. bei Raumtemperatur abzentrifugiert (15.000 UpM). Schließlich wurde das Pellet mit 70% kaltem (-20°C) kaltem Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet und in 20 μl Wasser resuspendiert.
Beispiel 6: Restriktionsspaltung
Die Restriktionsspaltung der in Beispiel 5 erhaltenen cDNA mit ligierten Adaptor-DNA- Molekülen erfolgte dadurch, daß zu einer 30μl-Reaktion auf Eis folgendes gegeben wurde: 3 μl 10x "roter Puffer" (New England Biolabs), 4 μl Wasser und 3 μl Eagl (10 E/μl; New England Biolabs). Danach wurde gemischt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde das Gemisch auf Eis gestellt und es wurden 4 μl 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0), 1 15 μl TE- Puffer und 150 μl Phenol/Chloroform/Isoamylakohol zugegeben. Nach gründlichem Vortexen wurde 5 min. bei 15.000 x g zentrifugiert. Zu 140 μl der wässrigen Phase wurden 70 μl (NH)4Ac und 500 μl kalter (-20°C) Alkohol gegeben. Nach Vortexen wurde sofort 20 min. bei Raumtemperatur abzentrifugiert (15.000 UpM). Schließlich wurde das Pellet mit 800 μl 70% kaltem (-20°C) kaltem Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet und in 30 μl 10 mM Tris/Cl (pH-Wert 7,5), 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCI (TEN25) resuspendiert.
Beispiel 7: Selektion nach Größe
Die ein Beispiel 6 erhaltene, geschnittene cDNA wurde auf ein Volumen von 30 μl (10 mM Tris/Cl (pH-Wert 7,5), 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCI (TEN25)) gebracht. Alle folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Sephacryl S 500-HR-Säulen (1 ml; BRL) wurden 4x mit jeweils 0,8 ml TEN25 etwa 10 bis 15 min. gewaschen, dann das 30 μl Gemisch mit der cDNA aufgetragen. Nach Eindringenlassen in die Säule wurden dann 100 I TEN25 durchlaufengelassen und danach wurde mit TEN^ eluiert, wobei insgesamt 25 FraWionen zu jeweils 25 I in Reaktionsgefäßen gesammelt wurden. Die Radioaktivität der einzelnen Fraktionen wurde in einem Scintillationszähler ("Cherenkov"-Zählung) bestimmt und die ersten drei Fraktionen, die Radioaktivtät enthielten, wurden für die Herstellung einer cDNA- Bank verwendet. Die vereinten Fraktionen wurden durch Zugabe von 5 μl tRNA-Lösung (5 mg/ml) und 0,5 Volumina (NH)4Ac und 3 Volumina kaltem (-20°C) Alkohol präzipitiert. Danach wurde 20 min. abzentrifugiert. Schließlich wurde das Pellet mit 70% kaltem (-20°C) Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet, in 10 μl TE-Puffer resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt.
Beispiel 8: Insertion der cDNA in einen Vektor
Im pQE30-Vektor (Fa. Qiagen) wurde eine Modifikation vorgenommen. Zwischen die vorhandenen Restriktionsstellen von BamHI (GGA TCC) und Hind III (AAG CTT) wurde folgende Sequenz eingefügt: TATTTAGGTG ACACTATAGA ATCGTCGACC TGCAAGATCT GCGGCCGCTC CCTATAGTGA GTCGTATT (die Klonierungstellen, die für die Ligation der cDNA verwendet wurden, sind unterstrichen; Sall: GTCGAC und Notl GCGGCCGC). 2,5 μg dieser Plasmid-DNA (pQE30NST) wurden mit Sall und 2,5 μg Plasmid-DNA mit Eagl in jeweils 25 μl Restriktionspuffer 2 Stunden bei 37°C vollständig geschnitten. Danach wurden die beiden Reaktionsgemische vermischt und Folgendes zugegeben: 5 μl 10x BM-Puffer (500 mM Tris-Cl (pH 7,5), 100 mM MgCI2, 1 M NaCI, 10 mM Dithiothreitol), nochmals jeweils 20 E Sall und Eagl. Es wurde mit Wasser auf 100 μl aufgefüllt und nochmals 2-4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das vollständig geschnittene Plasmid wurde mit Tip20 (Qiagen) gereinigt. Die Säule wurde mit 5 ml QB2-Puffer (Fa. Qiagen) gewaschen, wobei der ausgeschnittene Teil des Plasmid-Polylinkers eluiert wird. Das Plasmid wurde dann mit QF- Puffer (Fa. Qiagen) eluiert, mit Isopropanol präzipitiert, mit 70% Alkohol gewaschen und 10 min. an der Luft getrocknet. Danach wurde das Pellet in 50 μl Wasser resupendiert, auf einem Minigel hinsichtlich der DNA-Konzentration überprüft und anschließend auf 10 ng/ml verdünnt. Danach wurden 50 ng Vektor-DNA in einem sterilen Reaktionsgefäß mit 100 ng der wie vorstehend beschrieben präparierten doppelsträngigen cDNA vermischt, mit Wasser wurde auf ein Endvolumen von 7 μl verdünnt und das Gemisch wurde dann 5 min. bei 45°C inkubiert. Auf Eis wurde dann Folgendes zugegeben: 1 μl 10x T4 DNA-Ligase- Puffer, 1 μl T4 DNA-Ligase und 1 μl 5 mM ATP. Danach wurde 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Daneben wurden Kontrollreaktionen (nur Vektor-DNA bzw. nur cDNA) durchgeführt. Für die Transformation von kompetenten Zellen wurde jeweils 1 μl Ligations- gemisch verwendet.
Beispiel 9: Transformation kompetenter Zellen
Herstellung kompetenter Zellen: 1 ml Übernachtkultur wurde in 100 ml LB-Medium inokuliert und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Geerntet wurde in der Logphase (00600=0,3 - 0,4) durch abzentrifugieren (10 min.) bei 4°C und 3.600 UpM. Das Pellet wurde in 50 ml 100 mM CaCI2 (eiskalt) resupendiert, 30 min. auf Eis stehen gelassen und dann wie vorstehend beschrieben abzentrifugiert. Die Resuspension erfolgte in 5 ml 100 mM CaCI2 (eiskalt). Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C. Für die einzelnen Transformationen wurden jeweils 200 μl-Aliquots verwendet.
Transformation der kompetenten Zellen: 200 μl-Aliquots der kompetenten Zellen aus Schritt (a) wurden in vorgekühlte 15 ml-Plastikröhrchen (Falcon) gegeben. Dazu wurden dann 3,4 μl ß-Mercaptoethanol (1 ,44 M) bis zu einer Endkonzentration von 25 mM gegeben. Die Zellen und der ß-Mercaptoethanol wurden dann kräftig vermischt. Danach wurde 10 min. auf Eis inkubiert und im Anschluß daran wurde 1 μl Ligationsgemisch gegeben. Es wurde weitere 30 min. auf Eis stehen gelassen und danach erfolgte ein Hitzeschock (30 Sek. bei 42°C). Es wurden dann 0,8 ml SOC-Medium (zu 950 ml deionisiertem Wasser hinzufügen: 20 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Yeast-Extrakt, 0,5 g NaCI, bis zu Lösung der Substanzen schütteln und weiter hinzufügen: 1 ml 2,5 M KCI, auf pH 7,0 mit 5 M NaOH einstellen (ca. 0,2 ml), auf 1 Liter vor dem Autoklavieren auffüllen. Vor dem Gebrauch zugeben: 10 ml 1 M MgCI2 und 20 ml 1 M Glucose (ca. 20% Glucose; sterilisiert durch Sterilfiltrieren durch einen 0,2μm Filter)) zugegeben und die Inkubation erfolgte auf einem Schüttler (250 UpM) 30 bis 60 min. bei 37°C. 25 μl bzw. 250 μl des Transformationsgemisches wurden auf LB/Amp(100 g/ml)-Platten ausplattiert.
Ergebnis: Es wurden 48 Kolonien der Transformation näher analysiert. Dazu wurden Übernachtkulturen in 1 ,25 ml LB-Medium angegelegt, jeweils ausgehend von einer Einzelkolonie. Die Plasmid-DNA wurde anschließend mit Hilfe einer Standardplasmid- Isolierungsmethode ("Alkaline Lysis Method", Sambrook et al, 1989). Die Klone wurden jeweils vom 5'-Ende her nach einer Standard methode ("Dye Terminator Sequencing", Fa. ABI) sequenziert. Dazu wurde der Primer "Typ lll/IV" der Fa. Qiagen verwendet. In keinem Fall wurde dabei ein invertiertes Insert gefunden. Alle Inserts der Klone waren in der gewünschten 5'->3' Orientierung in den Vektor einkloniert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer für eine gerichtete Clonierung geeigneten zufalisgeprimten DNA, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Anlagerung eines einzelsträngigen Oligonucleotidgemischs an eine RNA oder ein aus einer Probe erhaltenes (m)RNA-Gemisch, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3 '-Anteil Zufallssequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5 '-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist;
(b) Durchführung einer durch dieses Oligonucleotidgemisch gesteuerten Polymerisationsreaktion zur Synthese des ersten cDNA-Strangs;
(c) Durchführung einer weiteren Polymerisationsreaktion zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA;
(d) Ligation von Adaptor-DNA-Molekülen an beide Enden der in Schritt (c) erhaltenen cDNA; und
(e) Schneiden der in Schritt (d) erhaltenen cDNA-Moleküle mit einer, den die Erkennungsstelle im 5 '-Anteil des Oligonucleotidgemischs erkennenden Restriktionsendonuclease, wobei eine cDNA erhalten wird, deren eines Ende durch die Sequenz des Adaptor- DNA-Moleküls definiert ist, das andere Ende durch die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease, die durch den 5 '-Anteil des Oligonucleotidgemisches bestimmt wird, und wobei mindestens ein Ende ein überstehendes Ende ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Länge der Zufallssequenz im 3 '-Anteil des Oligonucleotidgemischs 4 bis 10 Nucleotide ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease um eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease handelt, die überstehende Enden erzeugt.
4. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das überstehende Ende ein überstehendes 5'- Ende ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease eine Länge von 4-8 Nucleotiden, bevorzugt 6 Nukleotiden, hat.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Erkennungsstelle CGGCCG ist und von der Restriktionsendonuclease Eagl erkannt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Adaptor-DNA-Moleküle ein glattes und ein unphosphoryliertes überstehendes Ende aufweisen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das überstehende Ende der Adaptor-DNA- Moleküle 5'-GATC, 5 '-TCGA oder 5 '-AATT ist.
9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ein in den Ansprüchen 1 bis 6 definiertes Oligonucleotidgemisch enthaltend.
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