DE19913934C1 - Verfahren zur Herstellung einer zufallsgesprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung einer zufallsgeprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA, das darauf beruht, daß bei der Synthese des ersten cDNA-Strangs von einer RNA oder einem (m)RNA-Gemisch aus einer Probe ein einzelsträngiges Oligonucleotidgemisch angelagert wird, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufallssequenzen, vorzugsweise mit einer Länge von 4 bis 10 Nucleotiden, aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease, die überstehende Enden erzeugt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zufallsgeprimten, für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA, das darauf beruht, daß bei der Syn­ these des ersten cDNA-Strangs von einer RNA oder einem (m)RNA-Gemisch aus einer Probe ein einzelsträngiges Oligonucleotidgemisch angelagert wird, wobei das Oligonu­ cleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufallssequenzen auf­ weist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erken­ nungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist.

Die Herstellung von qualitativ hochwertigen Genbibliotheken ist ein zentraler Punkt bei der Analyse der Erbinformationen von Organismen. Durch die Einführung von Expres­ sionsvektoren, die die Herstellung von rekombinanten Proteinen erlauben, ist die Erzeu­ gung solcher Genbanken ebenfalls von zentralem Interesse. Bei der von mRNA ausge­ henden Herstellung von Genbanken (cDNA-Banken) gibt es im Prinzip zwei unterschiedli­ che Ansätze zur Überführung der mRNA in cDNA. Entweder werden Oligo(dT)-Primer eingesetzt, wobei die Konvertierung der mRNA zu cDNA am 3'-Ende des Gens startet, oder es wird ein Gemisch von Oligonucleotiden als Primer verwendet, die eine Zufalls­ sequenz besitzen ("random-priming") (Koike et al. (1987), Nucleic Acids Research 15, S. 2499). Diese zufälligen Sequenzen zielen nicht auf den poly(A)-Schwanz der mRNA, sondern sie bedingen den Start der cDNA-Synthese an einer zufälligen Position innerhalb der mRNA.

Bisher war es möglich, Oligo(dT)-geprimte cDNA in einer gerichteten Weise in ent­ sprechende Vektoren zu inserieren (direktionelles Clonieren). Dies bedeutet, daß bei der Ligation der cDNA in einen Vektor die gewünschte Richtung der Integration der cDNA festgelegt werden kann. Eine direktionelle Clonierung hat bei der Herstellung des Ligationsprodukts deutliche Vorteile, da beispielsweise die Rate nicht-rekombinanter Vektormoleküle deutlich geringer ist. Weitere Vorteile liegen in der vereinfachten Analyse der resultierenden Clone. Insbesondere bei der Clonierung in Expressions­ vektoren liegen die Vorteile einer direktionellen Clonierung auf der Hand: Aufgrund der Tatsache, daß die cDNA-Fragmente ausschließlich in der Leserichtung in den Vektor inseriert werden können (und deren Orientierung nicht dem Zufallsprinzip unterliegt wie bei der ungerichteten Clonierung), verringert sich die Zahl der zu analysierenden Clone, wodurch die gesamte Analyse beschleunigt wird. Allerdings war bisher eine direktionelle Clonierung von zufallsgeprimter cDNA nicht möglich.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Her­ stellung einer zufallsgeprimten cDNA zur Verfügung zu stellen, das eine gerichtete Clonierung erlaubt.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß für die Synthese des ersten cDNA- Strangs ein Oligonucleotidgemisch verwendet wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufallssequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erken­ nungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Die Zufallssequenzen am 3'- Ende des Oligonucleotidgemischs bewirken ein zufälliges Anlagern der Oligonucleotid­ moleküle an die mRNA. Da diese Moleküle als Startpunkte für die Synthese des ersten cDNA-Strangs durch die Reverse Transkriptase dienen, kann die cDNA-Synthese, statistisch verteilt, an jedem beliebigen Punkt an einem RNA-Molekül beginnen. Der erste Strang der cDNA wird dann durch den Einsatz von z. B. E. coli DNA-Polymerase, RNaseH und E. coli Ligase in ein doppelsträngiges Produkt überführt. Dabei wird auch der, die Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym aufweisende 5'-Anteil der Oligonu­ cleotidmoleküle am 5'-Ende der cDNA in die doppelsträngige Form überführt. In einem weiteren Schritt werden dann Adaptor-DNA-Moleküle (synthetische doppelsträngige DNA-Moleküle) an beide glatten Enden der cDNA-Fragmente ligiert. Das Adaptor-DNA- Molekül besitzt beispielsweise ein glattes Ende und ein überstehendes Ende, das nicht phosphoryliert ist. Dadurch werden die Adaptor-DNA-Moleküle gerichtet an die cDNA ligiert (d. h. mit dem glatten Ende). Da das überstehende Ende nicht phosphoryliert ist, kommt es nicht zur Multimerbildung von Adaptor-DNA-Molekülen. Im nächsten Schritt wird die mit den Adaptor-DNA-Molekülen versehene cDNA mit dem entsprechenden Restriktionsenzym, das vorzugsweise im CpG-Island schneidet, geschnitten. Weist beispielsweise das Oligonucleotidgemisch in seinem 5'-Anteil die Sequenz CGGCCG auf, wird mit der Restriktionsendonuclease EagI geschnitten (EagI besitzt die Erken­ nungssequenz C ↓ GGCCG). Danach ist die modifizierte cDNA fertig zur gerichteten Clonierung: Die einzelnen cDNA-Moleküle besitzen jetzt zwei verschiedene, nicht kompatible Enden. An einem Ende befindet sich das durch das Restriktionsenzym definierte überstehende Ende (beispielsweise im Fall von EagI GGCC) und am anderen Ende das durch das Adaptor-DNA-Molekül definierte überstehende Ende, beispielsweise GATC, TCGA, AATT etc. Hier sind alle überstehenden Enden denkbar, die nicht mit dem anderen, durch das Restriktionsenzym erzeugten Ende kompatibel sind. Durch das Vorhandensein der beiden unterschiedlichen Enden kann nach entsprechender Vor­ bereitung des Vektors (d. h. beispielsweise nach Herausschneiden eines Polylinker­ fragments aus dem Vektor so, daß der linearisierte Vektor zwei unterschiedliche, mit den jeweiligen Enden der modifizierten cDNA kompatible Enden aufweist) die cDNA in der gewünschten Orientierung eincloniert werden.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer für eine gerichtete Clonierung geeigneten zufallsgeprimten DNA, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Anlagerung eines einzelsträngigen Oligonucleotidgemischs an eine RNA oder ein aus einer Probe erhaltenes (m)RNA-Gemisch, wobei das Oligonucleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufallssequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonu­ clease aufweist;
• b) Durchführung einer durch dieses Oligonucleotidgemisch gesteuerten Polymerisa­ tionsreaktion zur Synthese des ersten cDNA-Strangs;
• c) Durchführung einer weiteren Polymerisationsreaktion zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA;
• d) Ligation von Adaptor-DNA-Molekülen an beide Enden der in Schritt (c) erhaltenen cDNA; und
• e) Schneiden der in Schritt (d) erhaltenen cDNA-Moleküle mit einer, den die Erken­ nungsstelle im 5'-Anteil des Oligonucleotidgemischs erkennenden Restriktions­ endonuclease, wobei eine cDNA erhalten wird, deren eines Ende durch die Sequenz des Adaptor-DNA-Moleküls definiert ist, das andere Ende durch die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease, die durch den 5'-Anteil des Oligonucleotidgemisches bestimmt wird, und wobei mindestens ein Ende ein überstehendes Ende ist.

Dabei kann das RNA-Gemisch aus einer beliebigen Probe stammen, beispielsweise viraler, bakterieller, tierischer oder pflanzlicher Art sein. Zur Herstellung der für eine gerichtete Clonierung geeigneten cDNA kann die aus der Probe isolierte Gesamt-RNA verwendet werden, vorzugsweise wird jedoch vor der cDNA-Synthese die mRNA- Fraktion angereichert. Hierzu wird beispielsweise auf die folgenden Literaturstellen verwiesen, die die Isolierung von Gesamt-RNA und/oder von polyA + RNA beschreiben: Birnboim et al, 1988, Nucleic Acids Research 16, S. 1487; Chomczynski et al., 1987, Anal. Biochem. 162, S. 156-159; Aviv et al., 1972, PNAS 69, S. 1408 (insbesondere polyA + RNA). Essentiell ist, daß die RNA frei von RNasen oder Enzyminhibitoren ist.

Bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßigen Oligonucleotidgemisch handelt es sich um ein Gemisch von Oligonucleotidmolekülen, das dadurch gekenn­ zeichnet ist, daß der 3'-Anteil der Moleküle Zufallssequenzen (N) mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist. Dabei kann sich die Nucleinsäuresequenz mit der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonu­ clease direkt an die Zufallssequenz anschließen, kann aber auch durch (ein) weitere(s) Nucleotid(e) von dieser getrennt sein. In der 5'-Richtung von der Sequenz können sich ebenfalls ein oder mehrere Nucleotide anschließen. Vorzugsweise schließt sich die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease direkt an die Zufallssequenz an und weist an ihrem 5'-Ende keine weiteren Nucleotide auf. Die Herstellung der syn­ thetischen Oligonukleotide erfolgt im allgemeinen in 3' → 5'-Richtung. Dabei wird die zufällige Basenabfolge der Zufallssequenz zuerst erstellt. Es handelt sich dabei um eine chemische Kopplung der einzelnen Basen. Die Herstellung der Oligonukleotide erfolgt nach üblichen Verfahren, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Spezielle Reini­ gungsschritte, z. B. HPLC oder PAGE sind nicht notwendig, aber können ggf. statt­ finden, falls eine verbesserte Qualität der Oligonukleotide gewünscht ist. Die Poolgröße des Oligonukleotidgemischs ist von der Anzahl der als zufällig definierten Basen ab­ hängig. Wird die Länge der Zufallssequenz auf vier Basen beschränkt, so wird ein Gemisch von 256 verschiedenen Oligonukleotiden eingesetzt. Steigert man die Länge der Zufallssequenzen auf fünf oder sechs Basen, so kommen 1024 bzw. 4096 ver­ schiedene Oligonukleotide zum Einsatz.

Die Durchführung der weiteren Schritte (b) bis (e) kann durch auf diesem Gebiet be­ kannten Verfahren erfolgen, beispielsweise entsprechend den in den nachstehenden Beispielen angegebenen Verfahren. Die so erhaltene, modifizierte cDNA kann direkt zur gerichteten Clonierung in einen entsprechend vorbereiteten Vektor verwendet werden. Im Prinzip kann jeder beliebige Clonierungsvektor, beispielsweise ein Expressionsvektor, verwendet werden, der so geschnitten werden kann, daß er zu der zu inserierenden cDNA kompatible Enden aufweist.

Durch das molekulare Verhältnis zwischen den RNA-Molekülen und Molekülen des Oligonucleotidgemischs während der Synthese des ersten Strangs der cDNA kann sowohl die Menge der herzustellenden cDNA als auch die durchschnittliche Länge der cDNA-Produkte reguliert werden.

Die Länge des 3'-Anteils der Moleküle des Oligonucleotidgemischs sollte mindestens 4 Basen betragen und kann bis zu 10 Basen sein, wobei eine Anzahl von 6 bis 8 als bevorzugt gilt.

Das Verhältnis zwischen unbestimmten Basen (Zufallssequenzen am 3'-Ende der Oligos) und definierten Basen (konstante Sequenz/en), die die Restriktionsschnittstelle definie­ ren) kann vom Fachmann gewählt werden, sollte bevorzugt aber bei 1 : 1 liegen, wobei auch eine Verschiebung des Verhältnisses zu Gunsten der unbestimmten Basen vor­ teilhaft sein kann.

Im allgemeinen ist es sinnvoll, solche Restriktionsenzyme zu verwenden, die in der zu klonierenden cDNA selten schneiden. Dies hängt von der Basenkomposition der jeweils transkribierten Sequenzen ab. Bevorzugt sind solche Restriktionsenzyme, die mit hoher Spezifität ihre Erkennungssequenz schneiden und nahe des Endes einer Doppelstrang- DNA effektiv schneiden. Für die DNA höherer Säuger ist es vorteilhaft, eine Erkennungs­ stelle für eine Restriktionsendonuclease, die überstehende Enden erzeugt und im CpG- Island schneidet, zu verwenden. Dies sind beispielsweise die Restriktionsenzyme EagI, Sal I und Mlu I. In diesem Fall können Adaptor-DNA-Moleküle mit einem glatten oder (nicht kompatiblen) überstehenden Ende verwendet werden. Es kann aber auch eine Erkennungsstelle für eine glatte Enden produzierende Restriktionsendonuclease ver­ wendet werden, in diesem Fall müssen jedoch dann die Adaptor-DNA-Moleküle über­ stehende Enden liefern.

In einer ganz bevorzugten Ausführungsform wird eine Erkennungsstelle für eine Restrik­ tionsendonuclease verwendet, die ein überstehendes 5'-Ende erzeugt.

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease eine Länge von mindestens 6 Nucleotiden (N₆). Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, daß eine solche Erkennungssequenz auch innerhalb der cDNA-Moleküle zufällig vorkommt, was dazu führen würde, daß bei Schritt (e) auch innerhalb der cDNA-Moleküle geschnitten würde, was nicht gewünscht ist. Es ist aber erfindungsgemäß auch möglich, daß die Sequenz für die Restriktionsendonuklease nur aus 4 oder 5 Nukleotiden besteht. Nach oben unterliegt die Anzahl der Basen keiner Beschränkung.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Erkennungsstelle des Oligonucleotidgemischs CGGCCG, die von der Restriktions­ endonuclease EagI erkannt wird.

Vorzugsweise weisen die Adaptor-DNA-Moleküle ein glattes und ein unphosphoryliertes überstehendes Ende auf. Besonders bevorzugt sind Adaptor-DNA-Moleküle, bei denen das überstehende Ende 5'-GATC, 5'-TCGA oder 5'-AATT ist.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, der das vorstehend beschriebene Oligonucleotidgemisch enthält. Der Kit kann weitere Bestandteile enthalten, die beispielsweise zur Durch­ führung der gesamten cDNA-Synthese und/oder dem Schneiden der mit Adaptor-DNA- Molekülen versehenen cDNA benötigt werden.

Als Matrize für die cDNA-Synthese wird RNA, vorzugsweise poly(A)RNA verwendet. Die beschriebenen Oligonucleotide lagern sich sequenzunspezifisch, also zufällig an die RNA-Matrize an. Dabei ist es nicht nötig, daß der Sequenzanteil, der für die einzuführen­ de Restriktionsschnittstelle codiert (bevorzugt: CGGCCG), eine komplementäre Sequenz auf der RNA-Matrize findet. Es erfolgt die Erststrangsynthese der cDNA mittels einer Polymerase, die einen Primer als Startpunkt benötigt. Die Zweitstrangsynthese erfolgt beispielsweise durch ein Enzymgemisch aus E. coli-DNA-Polymerase, E. coli-Ligase und RNaseH. Dabei werden RNA-Bruchstücke als Startpunkte genutzt, die durch RNaseH erzeugt wurden. Dabei wird auch der synthetische Anteil des cDNA-Erststrangs ver­ doppelt. Dies ist in dem in der Fig. 1 gezeigten bevorzugten Fall der N₆-Anteil und die CGGCCG-Sequenz. Es erfolgt die Ligation eines Adaptors an beide Enden, der beispiels­ weise über ein phosphoryliertes glattes Ende und ein nicht-phosphoryliertes überstehen­ des Ende verfügt. Dabei hängt die Sequenz des Überhangs von der Sequenz der Vektor­ schnittstelle ab, in die die cDNA-Fragmente cloniert werden sollen, und schließlich wird mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten, die die Erkennungssequenz (bevorzugt: CGGCCG) schneidet, die intern vorliegt, flankiert von der cDNA-Sequenz auf der einen Seite und dem Adaptor auf der anderen Seite. Durch Schneiden der Erkennungssequenz wird der Adaptor abgetrennt und es wird ein zweiter Überhang erzeugt, der mit dem Überhang, der durch den Adaptor zur Verfügung gestellt wird, nicht kompatibel ist. Dadurch entsteht ein DNA-Molekül mit zwei unterschiedlichen Termini, was die gerich­ tete Clonierung erlaubt.

Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand von Fig. 1 verdeutlicht, wobei diese zeigt:

Fig. 1: Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens

• 1. Als Matrize dient RNA, bevorzugt polyA + RNA
• 2. Die Oligonukleotide lagern sich sequenzunspezifisch, also zufällig an die Matrize an. Dabei ist es nicht nötig, daß der Sequenzteil, welcher für die Restriktionsschnittstelle kodiert (hier: CGGCCG) einen komplementären Sequenzanteil auf der Matrize findet. Je nach molarem Verhältnis von Oligonukleotiden zu Matrizenmole­ külen können sich unterschiedlich viele Oligonukleotidmoleküle an einem Matrizenstrang anlagern.
• 3. Die Erststrangsynthese der cDNA wird durch eine reverse Trans­ kriptase katalysiert, die einen Primer (hier die Oligonukleotide) als Startpunkt benötigt
• 4. Die Zweitstrangsynthese wird durch ein Enzymgemisch von E. coli DNA-Polymerase, E. coli Ligase und RNase H katalysiert und nutzt RNA-Bruchstücke, die durch die RNase H erzeugt werden, als Startpunkte. Dabei wird auch der synthetische Anteil des cDNA- Einzelstrangs (N₆ und die CGGCCG-Sequenz) verdoppelt.
• 5. Es folgt die Ligation eines Adaptors, der über ein phosphoryliertes, glattes Ende und ein Ende mit einem Überhang (nicht phosphory­ liert) verfügt. Dabei ist der Überhang abhängig von der Vektor­ schnittstelle in welche die cDNA-Fragmente später kloniert werden sollen. Der Überhang sollte kompatibel sein. Durch die Ligation werden Adaptormoleküle an beide Enden der cDNA-Fragmente angehängt.
• 6. Einsatz der Restriktionsendonuklease EagI, wobei die Erkennungs­ sequenz (hier: CGGCCG) nicht direkt terminal in dem DNA-Frag­ ment liegt, sondern intern, flankiert von der cDNA auf der einen Seite und dem Adaptor auf der anderen Seite. Unter diesen Bedin­ gungen schneidet das Restriktionsenzym innerhalb seiner Erken­ nungssequenz, schneidet den Adaptor ab und generiert einen zweiten Überhang, der mit dem Überhang, welcher durch den Adaptor zur Verfügung gestellt wird, nicht kompatibel ist.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1: Isolation von polyA + RNA

RNA/DNA-Extraktion aus eukaryontischen Zellen: Ein Stück frische Rattenleber in 10 ml eiskaltes PBS geben und abschaben, mit 10 ml PBS nachspülen, Suspensionskulturen durch Zentrifugieren pelletieren (1200 Upm, 10 Min. 4°C). Pellet in 10 ml eiskaltem PBS resuspendieren. Zellen pelletieren durch Zentrifugieren bei 1800 Upm, 10 Min, 4°C., Pellet in 640 µl RNA-Extraktionspuffer (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris/Cl (pH 8,6), 0,5% NP-40, auffüllen auf 10 ml mit H₂O) resuspendieren und 5 Min. auf Eis inkubieren. 5 Min. in gekühlter Zentrifuge bei 15000 rpm zentrifugieren. Die RNA ist nun im Überstand (die DNA ist im Pellet). Den Überstand in zwei Eppendorf- Cups geben, 20 µl 20% SDS zugeben, mischen und ggf. bei -80°C einfrieren oder mit der Zugabe von 40 µl Proteinase K (10 mg/ml) fortfahren. 30 Min. bei 56°C inkubieren. 2 × mit 750 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahieren (1 Min. vortexen und bei 4°C zur Phasentrennung zentrifugieren: 5 Min, 15000 Upm). Wäßrige Phase in 2 Aliquots in Eppendorf-Cups geben. RNA mit 0,1 Vol. NaAc (3 M, pH 5,2) und 3 Vol. EtOH fällen und gut mischen. 10 Min. auf Eis inkubieren und mind. 30 Min. bei 4°C und 15000 Upm abzentrifugieren. RNA mit 1 ml 70% EtOH waschen und in 50 µl DEPC- Wasser resuspendieren, bei -80°C lagern. Die Ausbeute liegt bei 100-400 µg Gesamt- RNA.

Vorbereitung für Oligo-dT-Säulen: Es werden 100 mg Oligo-(dT)-Cellulose pro 1 mg Gesamt-RNA benötigt. Die Säulen sind erhältlich von Fa. BioRAD, Polypropylen Econo- Säulen, 11 ml, # 731-1550 oder Fa. Pierce, Einmal-Polypropylen-Säule, 6 ml, # 29920. Oligo-(dT)-Cellulose ist erhältlich von Fa. Pharmacia, Oligo-(dT)-Cellulose Typ 7, # 27- 5543-02 oder Fa. Boehringer Mannheim, # 808 229. Die Oligo-dT-Cellulose wird wie folgt vorbereitet: 1) Zugabe von Oligo-dT in TE-Puffer für 30 Min. (1 g in 10 ml TE); 2) Abzentrifugieren 10 Min., 4000 Upm; 3) Equilibrieren der Oligo-dT-Cellulose in 10 ml 1 × BP500 (10 mM Tris/Cl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, H₂O auf 1 Liter, pH sollte um 7,5 sein) für 30 Min. auf einem langsamen Schüttler, 4) Abzen­ trifugieren für 10 Min., 4000 Upm; 5) Resuspendieren der Oligo-dT-Cellulose in 10 ml 1 × BP500.

Isolation von polyA + RNA: Aufnehmen der RNA auf 1 µg/µl mit H₂O und Denaturieren für 5 min. bei 65°C. Auf Eis kühlen und 1 Vol. 2 × BP500 hinzufügen. Zufügen einer entsprechenden Menge an Oligo-(dT)-Cellulose und Inkubieren für mehr als 2 Stunden auf einem Überkopf-Rotierer. Beladen einer Säule mit Fritte mit Glaskügelchen. Über­ führen der Oligo-(dT)-Cellulose, an die die RNA gebunden hat, in die Säule. Absetzenlas­ sen der Oligo-(dT)-Cellulose für 15-30 Min.. Waschen mit 5 Vol. 1 × BP500 und mit 4 Vol. 1 × BP100 (10 mM Tris/Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, H₂O auf 1 Liter, pH sollte um 7,5 sein). Dreimaliges Eluieren mit 1 ml TE in ein 15 ml Falcon- Röhrchen, das mit 3 M NaAc (pH 4,8) und 6 ml EtOH gefüllt ist. Sorgfältig präzipitieren. Resuspendieren in 10-50 µl H₂O (für 0,2-1 mg Gesamt-RNA als Startmaterial).

Beispiel 2: Synthese des ersten cDNA-Strangs

Zu 1 µg mRNA aus Rattenleber in 10 µl TE-Puffer wurden 2 µl (125 ng/µl) Oligonukleo­ tidgemisch (Pool von 4096 verschiedenen Oligonukleotide für Zufallshexamere mit jeweils CGGCCG [ergibt EagI-Schnittstelle] am 5'-Ende) gegeben. Danach wurde 10 min. auf 70°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und kurz abzentrifugiert. Danach wurde nach­ einander folgendes zugegeben: 4 µl 5 × Puffer für die Erststrangsynthese (250 mM Tris/Cl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 2 µl 0,1 M DTT, 1 µl dNTPs (jeweils 10 mM) und 2 µl "Superscript II RT (Fa. Life Technologies BRL). Danach wurde kurz gevortext, abzentrifugiert und bei 37°C 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Abkühlen auf Eis gestoppt.

Beispiel 3: Synthese des zweiten cDNA-Strangs

Unmittelbar nach Beendigung der Synthese des ersten cDNA-Strangs erfolgte die Synthese des zweiten Strangs. Dazu wurde zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Reak­ tionsgemisch nacheinander folgendes gegeben: 93 µl Wasser, 0,25 µl [alpha-³²P]dCTP, 30 µl 5 × Puffer für den zweiten Strang (100 mM Tris/Cl (pH 6,9), 450 mM KCl, 23 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 750 µM β-NAD⁺, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 3 µl dNTPs, 1 µl E. coli DNA- Ligase, 1 µl E. coli DNA-Polymerase und 1 µl E. coli Rnase H. Danach wurde vorsichtig gemischt und 2 Stunden bei 16°C inkubiert, wobei darauf geachtet wurde, daß die Temperatur nie unter diesen Wert absank. Dann wurden 2 µl T4 DNA-Polymerase zugegeben und es erfolgte für weitere 5 min. eine Inkubation bei der vorstehend angegebenen Temperatur. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gestellt und es wurden 10 µl 0,5 M EDTA zugegeben. Für die Analyse der Reaktion wurden 10 µl für eine Agarose-Gelelektrophorese entnommen. Zu dem Rest wurden 150 µl Phenol/- Chloroform/Isoamylalkohol gegeben, danach wurde gründlich gevortext und im An­ schluß daran zur Phasentrennung 5 min. bei 15.000 × g zentrifugiert. 130 µl der wässrigen Phase wurden abgenommen und dazu wurden 70 µl 7,5 M (NH)₄Ac und 500 µl (-20°C) Alkohol gegeben. Dann wurde gevortext und 20 min. bei 15.000 UpM zentrifugiert. Schließlich wurde mit 800 µl 70% kaltem (-20°C) Alkohol gewaschen und 10 min. bei 37°C getrocknet.

Aliquots der doppelsträngigen cDNA wurden auf einem analytischen Agarosegel (1,5%, Anfärbung mit EtBr) zusammen mit DNA-Größenmarkern II und VI (Boehringer Mann­ heim) analysiert. Die Größe der synthetisierten cDNA-Moleküle bzw. die Größenver­ teilung wurden, wenn die Konzentration für eine Sichtbarmachung durch Anfärbung mit EtBr zu gering war, mittels Radioautographie (Expositiondauer: 1-3 Tage) bestimmt.

Beispiel 4: Herstellung von Adaptor-DNA-Molekülen

Zur Kinasierung des unteren Strangs wurde auf Eis folgendes zusammengemischt: 2 nmol des Oligonucleotids für den unteren Strang (CGG ACG CGT GGG) in 50 µl Wasser, 7 µl 10 × Kinase-Puffer (100 mM Tris/Cl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 500 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol), 7 µl 10 mM ATP und 6 µl T4 DNA-Polynucleotidkinase (10 E/µl; Fa. New England Biolabs). Danach wurde 30 min. bei 37°C inkubiert, dann das Enzym 10 min. bei 70°C (oder 5 min. bei 90°C) inaktiviert. Zur Anlagerung des oberen Strangs wurde das vorstehende Reaktionsgemisch mit dem inaktivierten Enzym auf Eis gestellt und danach wurde eine äquimolare Menge (2 nmol) des Oligonucleotids für den oberen Strang (TCG ACC CAC GCG TCC G) zugegeben. Es wurde 5 min. bei 90°C denaturiert und dann ließ man das Gemisch durch Abschalten des Heizblocks langsam auf Raum­ temperatur abkühlen. Danach wurde die Konzentration der Adaptor-DNA-Moleküle mit 20 pmol/µl bestimmt.

Beispiel 5: Anlagerung der Adaptor-DNA-Moleküle an doppelsträngige cDNA

Die in Beispiel 3 erhaltene doppelsträngige cDNA wurde in 40 µl Lösung mit den Adaptor-DNA-Molekülen gemäß Beispiel 4 (20 pmol/l) resuspendiert und danach wurde auf Eis folgendes zugesetzt: 12 µl 5 × T4 Ligase-Puffer (250 mM Tris/Cl (pH 7,6), 50 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25% PEG8000), 3 µl Wasser und 5 µl T4 DNA- Ligase. Es wurde vorsichtig gemischt und mindestens 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Danach wurden 60 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol zugegeben, darauf wurde gevortext und 5 min. bei Raumtemperatur und mit 15.000 UpM abzentrifugiert. 45 µl der wässrigen Phase wurden entnommen und zu diesen wurden 25 µl (NH)₄Ac und 150 µl kalter (-20°C) Alkohol gegeben. Nach Vortexen wurde sofort 20 min. bei Raumtempe­ ratur abzentrifugiert (15.000 UpM). Schließlich wurde das Pellet mit 70% kaltem (-­ 20°C) kaltem Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet und in 20 µl Wasser resuspendiert.

Beispiel 6: Restriktionsspaltung

Die Restriktionsspaltung der in Beispiel 5 erhaltenen cDNA mit ligierten Adaptor-DNA- Molekülen erfolgte dadurch, daß zu einer 30 µl-Reaktion auf Eis folgendes gegeben wurde: 3 µl 10 × "roter Puffer" (New England Biolabs), 4 µl Wasser und 3 µl EagI (10 E/µl; New England Biolabs). Danach wurde gemischt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde das Gemisch auf Eis gestellt und es wurden 4 µl 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0), 115 µl TE-Puffer und 150 µl Phenol/Chloroform/Isoamylakohol zugegeben. Nach gründlichem Vortexen wurde 5 min. bei 15.000 × g zentrifugiert. Zu 140 µl der wäss­ rigen Phase wurden 70 µl (NH)₄Ac und 500 µl kalter (-20°C) Alkohol gegeben. Nach Vortexen wurde sofort 20 min. bei Raumtemperatur abzentrifugiert (15.000 UpM). Schließlich wurde das Pellet mit 800 µl 70% kaltem (-20°C) kaltem Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet und in 30 µl 10 mM Tris/Cl (pH-Wert 7,5), 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl (TEN₂₅) resuspendiert.

Beispiel 7: Selektion nach Größe

Die ein Beispiel 6 erhaltene, geschnittene cDNA wurde auf ein Volumen von 30 µl (10 mM Tris/Cl (pH-Wert 7,5), 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl (TEN₂₅)) gebracht. Alle folgen­ den Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Sephacryl S 500-HR-Säulen (1 ml; BRL) wurden 4 × mit jeweils 0,8 ml TEN₂₅ etwa 10 bis 15 min. gewaschen, dann das 30 µl Gemisch mit der cDNA aufgetragen. Nach Eindringenlassen in die Säule wurden dann 100 l TEN₂₅ durchlaufengelassen und danach wurde mit TEN₂₅ eluiert, wobei insgesamt 25 Fraktionen zu jeweils 25 l in Reaktionsgefäßen gesammelt wurden. Die Radioaktivität der einzelnen Fraktionen wurde in einem Scintillationszähler ("Cherenkov"-Zählung) bestimmt und die ersten drei Fraktionen, die Radioaktivtät enthielten, wurden für die Herstellung einer cDNA-Bank verwendet. Die vereinten Fraktionen wurden durch Zugabe von 5 µl tRNA-Lösung (5 mg/ml) und 0,5 Volumina (NH)₄Ac und 3 Volumina kaltem (-­ 20°C) Alkohol präzipitiert. Danach wurde 20 min. abzentrifugiert. Schließlich wurde das Pellet mit 70% kaltem (-20°C) Alkohol gewaschen, 10 min. bei 37°C getrocknet, in 10 µl TE-Puffer resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 8: Insertion der cDNA in einen Vektor

Im pQE30-Vektor (Fa. Qiagen) wurde eine Modifikation vorgenommen. Zwischen die vorhandenen Restriktionsstellen von BamHI (GGA TCC) und Hind III (AAG CTT) wurde folgende Sequenz eingefügt: TATTTAGGTG ACACTATAGA ATCGTCGACC TGCAA­ GATCT GCGGCCGCTC CCTATAGTGA GTCGTATT (die Klonierungstellen, die für die Ligation der cDNA verwendet wurden, sind unterstrichen; SaII: GTCGAC und NotI GCGGCCGC). 2,5 µg dieser Plasmid-DNA (pQE30NST) wurden mit SaII und 2,5 µg Plas­ mid-DNA mit EagI in jeweils 25 µl Restriktionspuffer 2 Stunden bei 37°C vollständig ge­ schnitten. Danach wurden die beiden Reaktionsgemische vermischt und Folgendes zugegeben: 5 µl 10 × BM-Puffer (500 mM Tris-Cl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 1 M NaCl, 10 mM Dithiothreitol), nochmals jeweils 20 E SaII und EagI. Es wurde mit Wasser auf 100 µl aufgefüllt und nochmals 2-4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das vollständig ge­ schnittene Plasmid wurde mit Tip20 (Qiagen) gereinigt. Die Säule wurde mit 5 ml QB2- Puffer (Fa. Qiagen) gewaschen, wobei der ausgeschnittene Teil des Plasmid-Polylinkers eluiert wird. Das Plasmid wurde dann mit QF-Puffer (Fa. Qiagen) eluiert, mit Isopropanol präzipitiert, mit 70% Alkohol gewaschen und 10 min. an der Luft getrocknet. Danach wurde das Pellet in 50 µl Wasser resupendiert, auf einem Minigel hinsichtlich der DNA- Konzentration überprüft und anschließend auf 10 ng/ml verdünnt. Danach wurden 50 ng Vektor-DNA in einem sterilen Reaktionsgefäß mit 100 ng der wie vorstehend be­ schrieben präparierten doppelsträngigen cDNA vermischt, mit Wasser wurde auf ein Endvolumen von 7 µl verdünnt und das Gemisch wurde dann 5 min. bei 45°C inkubiert.

Auf Eis wurde dann Folgendes zugegeben: 1 µl 10 × T4 DNA-Ligase-Puffer, 1 µl T4 DNA-Ligase und 1 µl 5 mM ATP. Danach wurde 16 Stunden bei 16°C inkubiert. Da­ neben wurden Kontrollreaktionen (nur Vektor-DNA bzw. nur cDNA) durchgeführt. Für die Transformation von kompetenten Zellen wurde jeweils 1 µl Ligationsgemisch verwendet.

Beispiel 9: Transformation kompetenter Zellen

Herstellung kompetenter Zellen: 1 ml Übernachtkultur wurde in 100 ml LB-Medium inokuliert und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Geerntet wurde in der Logphase (OD₆₀₀ = 0,3-0,4) durch abzentrifugieren (10 min.) bei 4°C und 3.600 UpM. Das Pellet wurde in 50 ml 100 mM CaCl₂ (eiskalt) resupendiert, 30 min. auf Eis stehen gelassen und dann wie vorstehend beschrieben abzentrifugiert. Die Resuspension erfolgte in 5 ml 100 mM CaCl₂ (eiskalt). Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C. Für die einzelnen Trans­ formationen wurden jeweils 200 µl-Aliquots verwendet.

Transformation der kompetenten Zellen: 200 µl-Aliquots der kompetenten Zellen aus Schritt (a) wurden in vorgekühlte 15 ml-Plastikröhrchen (Falcon) gegeben. Dazu wurden dann 3,4 µl β-Mercaptoethanol (1,44 M) bis zu einer Endkonzentration von 25 mM gegeben. Die Zellen und der β-Mercaptoethanol wurden dann kräftig vermischt. Danach wurde 10 min. auf Eis inkubiert und im Anschluß daran wurde 1 µl Ligationsgemisch gegeben. Es wurde weitere 30 min. auf Eis stehen gelassen und danach erfolgte ein Hitzeschock (30 Sek. bei 42°C). Es wurden dann 0,8 ml SOC-Medium (zu 950 ml deionisiertem Wasser hinzufügen: 20 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Yeast-Extrakt, 0,5 g NaCl, bis zu Lösung der Substanzen schütteln und weiter hinzufügen: 1 ml 2,5 M KCl, auf pH 7,0 mit 5 M NaOH einstellen (ca. 0,2 ml), auf 1 Liter vor dem Autoklavieren auffüllen. Vor dem Gebrauch zugeben: 10 ml 1 M MgCl₂ und 20 ml 1 M Glucose (ca. 20% Glucose; sterilisiert durch Sterilfiltrieren durch einen 0,2 µm Filter)) zugegeben und die Inkubation erfolgte auf einem Schüttler (250 UpM) 30 bis 60 min. bei 37°C. 25 µl bzw. 250 µl des Transformationsgemisches wurden auf LB/Amp(100 g/ml)-Platten ausplattiert.

Ergebnis: Es wurden 48 Kolonien der Transformation näher analysiert. Dazu wurden Übernachtkulturen in 1,25 ml LB-Medium angegelegt, jeweils ausgehend von einer Einzelkolonie. Die Plasmid-DNA wurde anschließend mit Hilfe einer Standardplasmid- Isolierungsmethode ("Alkaline Lysis Method", Sambrook et al, 1989). Die Klone wurden jeweils vom 5'-Ende her nach einer Standardmethode ("Dye Terminator Sequencing", Fa. ABI) sequenziert. Dazu wurde der Primer "Typ III/IV" der Fa. Qiagen verwendet. In keinem Fall wurde dabei ein invertiertes Insert gefunden. Alle Inserts der Klone waren in der gewünschten 5' → 3' Orientierung in den Vektor einkloniert.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung einer für eine gerichtete Clonierung geeigneten zufalls­ geprimten DNA, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Anlagerung eines einzelsträngigen Oligonucleotidgemischs an eine RNA oder ein aus einer Probe erhaltenes (m)RNA-Gemisch, wobei das Oligonu­ cleotidgemisch dadurch gekennzeichnet ist, daß der 3'-Anteil Zufalls­ sequenzen mit einer Länge von mindestens 4 Nucleotiden aufweist und der 5'-Anteil, wenn er in einen Doppelstrang überführt wird, eine Erken­ nungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweist;
• b) Durchführung einer durch dieses Oligonucleotidgemisch gesteuerten Polymerisationsreaktion zur Synthese des ersten cDNA-Strangs;
• c) Durchführung einer weiteren Polymerisationsreaktion zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA;
• d) Ligation von Adaptor-DNA-Molekülen an beide Enden der in Schritt (c) erhaltenen cDNA; und
• e) Schneiden der in Schritt (d) erhaltenen cDNA-Moleküle mit einer, den die Erkennungsstelle im 5'-Anteil des Oligonucleotidgemischs erkennenden Restriktionsendonuclease,

wobei eine cDNA erhalten wird, deren eines Ende durch die Sequenz des Adap­ tor-DNA-Moleküls definiert ist, das andere Ende durch die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease, die durch den 5'-Anteil des Oligonucleotidgemi­ sches bestimmt wird, und wobei mindestens ein Ende ein überstehendes Ende ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Länge der Zufallssequenz im 3'-Anteil des Oligonucleotidgemischs 4 bis 10 Nucleotide ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease um eine Erkennungsstelle für eine Restriktions­ endonuclease handelt, die überstehende Enden erzeugt.

4. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das überstehende Ende ein überstehendes 5'-Ende ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease eine Länge von 4-8 Nucleotiden, bevorzugt 6 Nukleoti­ den, hat.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Erkennungsstelle CGGCCG ist und von der Restriktionsendonuclease EagI erkannt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Adaptor-DNA-Moleküle ein glattes und ein unphosphoryliertes überstehendes Ende aufweisen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das überstehende Ende der Adaptor-DNA- Moleküle 5'-GATC, 5'-TCGA oder 5'-AATT ist.

9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ein in den Ansprüchen 1 bis 6 definiertes Oligonucleotidgemisch enthaltend.